Применение 2-(1-гидроксипентил)бензоат калия (dl-phpb) для предупреждения и лечения болезни альцгеймера

Настоящее изобретение относится к применению dl-2-(1-гидроксипентил)бензоата калия для получения лекарственных средств для предупреждения, ослабления и лечения старческого слабоумия или его симптомов. Изобретение также раскрывает применение фармацевтических композиций, содержащих dl-2-(1-гидроксипентил)бензоат калия в профилактически или терапевтически эффективной дозе и, при необходимости, фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ИНСТИТЬЮТ ОФ МЭТЭРИЯ МЕДИКА, ЧАЙНИЗ ЭКЭДЕМИ ОФ МЕДИКЛ САЙНСИЗ (CN) Область техники Изобретение касается предупреждения или лечения неврологических заболеваний, в частности старческого слабоумия. Изобретение относится к использованию dl-PHPB для предупреждения или лечения старческого слабоумия или его симптомов. Старческое слабоумие включает болезнь Альцгеймера,сосудистую деменцию и комбинацию обоих. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям для предупреждения или лечения старческого слабоумия, которые содержат dl-PHPB и фармацевтически приемлемые вспомогательные средства или переносчики. Фармацевтические композиции dlPHPB для производства выбираются из раствора, суспензии, эмульсии, таблетки, капсулы, порошка, с контролируемым или непрерывным высвобождением препарата. Изобретение также относится к способам предупреждения или лечения старческого слабоумия, включающим введение пациентам эффективной дозы dl-PHPB или содержащих dl-PHPB фармацевтических композиций. Способ введения пациентамdl-PHPB может включать внутриартериальное введение через катетер, оральное, местное, внутрикожное,внутримышечное, перитонеальное, подкожное, интраназальное и другие способы введения. Предпосылки создания изобретения Старческое слабоумие включает болезнь Альцгеймера (БА), сосудистую деменцию (СД) и комбинацию обоих. Старческое слабоумие является нейродегенеративным нарушением, которое характеризуется прогрессирующим нарушением когнитивных функций и памяти. Данное заболевание приходится больше всего на долю пожилых людей, в частности старше 60 лет. При этом заболевании способность помнить, думать, понимать, общаться и контролировать поведение прогрессирующе падает из-за дегенерации мозговой ткани. Много нейронов в этих участках мозга содержат большие нейрофибриллярные клубки и отложения в виде бета-амилоидных бляшек. В Китае коэффицент распространенности старческого слабоумия составляет 4% людей старше 65 лет. В мире существует около пятидесяти миллионов пациентов, страдающих старческим слабоумием. СД является нейродегенеративным нарушением, которое характеризуется нарушением мозгового кровообращения. В Европе и Америке пациенты с СД составляют 10-20% старческого слабоумия. В Азии случаев СД больше, например, в Японии и Китае. Китай входит в эру старения с пациентами, страдающими старческим слабоумием, количество которых увеличивается год за годом. Хроническая церебральная ишемия является главной причиной возникновения СД. Пациенты со старческим слабоумием страдают сами и также возлагают огромную нагрузку на их семьи и общество. В настоящее время не существует эффективных лекарственных препаратов для лечения старческого слабоумия. Таким образом, важным является определение и развитие эффективных лекарственных препаратов для контроля или лечения прогрессирующей БА или СД. 2-(1-Гидроксипентил)бензоат калия (dl-PHPB), полученный из 3-n-бутилфталида (NBP), является новым синтезированным соединением, которое находится на стадии разработки в качестве терапевтического средства при церебральной ишемии. dl-PHPB был получен от Department of Synthetic Pharmaceutical Chemistry of Chinese Academy of Medical Sciences с чистотой 99,9%. dl-PHPB изучен с помощью метода рентгеноструктурного анализа, ЯМР, МС, инфракрасных спектров и ВЭЖХ-УФ. Химическая структура данного соединения показана на фиг. 1. В PCT/CN02/1382682 представлено описание приготовления dl-PHPB с названием новые соли 2-(-гидроксипентил)бензойной кислоты, способы приготовления и применения этих солей. Информация об использовании dl-PHPB для предупреждения или лечения старческого слабоумия на сегодняшний день отсутствует. Подробное описание изобретения В одном аспекте изобретение относится к использованию dl-PHPB для предупреждения, ослабления или лечения старческого слабоумия или его симптомов. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям для предупреждения или лечения старческого слабоумия, которые содержат dl-PHPB и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества или переносчик. Использующееся здесь старческое слабоумие включает болезнь Альцгеймера (БА), сосудистую деменцию (СД) и состояния, объединяющие БА и СД. Симптомы старческого слабоумия могут включать нарушение памяти, нарушенное познание, нарушенный мыслительный процесс и нарушенную пространственную ориентацию. В третьем аспекте изобретение относится к применению dl-PHPB для предупреждения старческого слабоумия на самой ранней стадии возникновения изменений, проявляющихся в способности помнить,думать, понимать, общаться и контролировать прогрессирующее ухудшение поведения. Изобретение относится к применению dl-PHPB для ослабления старческого слабоумия, проявляющегося в развитии способности помнить, думать, понимать, общаться и контролировать прогрессирующее ухудшение поведения после его возникновения. Изобретение относится к применению dl-PHPB для лечения старческого слабоумия для ослабления симптомов, проявляющихся в способности помнить, думать, понимать, общаться и контролировать прогрессирующее ухудшение поведения после его возникновения. В четвертом аспекте изобретение относится к применению dl-PHPB для уменьшения повреждения,вызванного окислительным стрессом, улучшения функции холинергических нейронов, защиты нейронов и повышения уровня нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) в мозге. Изобретение относится к применению dl-PHPB для уменьшения повреждения, вызванного окислительным стрессом, что приводит к уменьшению накопления продукта перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид,МДА) и восстановлению окислительного баланса. Изобретение относится к применению dl-PHPB для улучшения функции нейронов, что приводит к усилению активности холинацетилтрансферазы (ChAT) и снижению активности ацетилхолинстеразы. В изобретении человек является критерием достижения оптимальных результатов. Старческое слабоумие является нейродегенеративным заболеванием, которое характеризуется нарушением познания, в частности кратковременной памяти, прогрессирующим ухудшением ощущения пространства. Старческое слабоумие вызвано разными причинами, такими как СД, нейрофибриллярные клубки и бета-амилоидные отложения, и другими, связанными с возрастом. Таким образом, в изобретении представлено три модели деменции: билатеральная окклюзия цервикальной сонной артерии для имитации клинической картины СД, когнитивное нарушение, индуцированное интрацеребровентрикулярной инъекцией бета-амилоидного пептида (25-35) у крыс для имитации клинической картины СД и ускоренное старение мышей (SAMP8) для имитации старения. dl-PHPB улучшил способность к обучению и памяти в тесте водного лабиринта Морриса, тесте Y-образного водного лабиринта и тесте избегания step down у крыс или мышей. Результаты показали, что dl-PHPB значительно уменьшает когнитивное нарушение в модели билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии (2-VO), модели интрацеребровентрикулярной инъекции бета-амилоидного пептида (25-35) и модели ускоренного старения мышей (SAMP8). Таким образом, dl-PHPB значительно уменьшает когнитивное нарушение в трех моделях деменции. Результаты показали, что dl-PHPB значительно уменьшает патологию мозговой ткани, индуцированную хронической церебральной ишемией, уменьшает активацию астроцитов и, кроме того, защищает нейроны и снижает уровень МДА, ингибирует повреждения, вызванные окислительным стрессом; усиливает активность ChAT, повышая уровень ацетилхолина и улучшая способность к обучению и памяти; повышает уровень BNDF при хронической церебральной ишемии. Таким образом, dl-PHPB может являться потенциальным лекарственным средством для предупреждения или лечения старческого слабоумия. Настоящее изобретение основано на открытии того, что в модели хронической церебральной ишемии кратковременная память, способность ориентации в пространстве улучшались с помощью dl-PHPB. СД является нейродегенеративным заболеванием, индуцированным нарушением мозгового кровообращения, сопровождающимся окклюзией сонной артерии или низкой инфузией и лакунарным церебральным инсультом. Снижение кровяного потока в мозг связано со старческой деменцией. Хроническая церебральная ишемия связана с уменьшением утилизации кислорода, глюкозы и других необходимых метаболитов, кроме того, индуцирует повреждение, связанное с окислительным стрессом, снижение функционирования митохондрий, снижение биосинтеза в нейронах, угнетение синаптической трансмиссии и развитие нейродегенеративных изменений. СД является нейродегенеративным заболеванием, которое характеризуется когнитивным нарушением, в частности прогрессирующим ухудшением кратковременной памяти, ощущения пространства. Тест водного лабиринта Морриса является типичным экспериментом для определения кратковременной памяти и способности к пространственному обучению у животных. В изобретении влияние dlPHPB на улучшение кратковременной памяти, способности к пространственному обучению определяли с помощью модели билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии (2-VO) у крыс. Результаты показали, что dl-PHPB значительно улучшает кратковременную память, способность к пространственному обучению в 2-VO модели у крыс. Через месяц после установления билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии крыс испытывали в тесте водного лабиринта Морриса на латентности спасения при нахождении платформы и количество пересечений точного положения прежней платформы во время тренировочного курса в водном лабиринте Морриса, с помощью которого оценивали способность к пространственному обучению и памяти. В испытании на поиск пути в водном лабиринте Морриса изучали латентности спасения, стратегию поиска и скорость плавания. Результаты показали, что dl-PHPB значительно улучшает способность к обучению и памяти у крыс при установлении билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии. Эффект уменьшения латентностей спасения в модели 2-VO крыс показал, что dl-PHPB значительно улучшает кратковременную память, способность к пространственному обучению 2-VO модели крыс. Результаты изучения стратегии поиска показали, что крысы, обработанные dl-PHPB, значительно увеличили количество плаваний по прямой линии и тенденцию стратегии, которая показала, что dl-PHPB значительно повышает способность к пространственному обучению моделей 2-VO крыс. Скорость крыс,-2 022309 обработанных dl-PHPB, не сильно отличалась от скорости крыс, обработанных солевым раствором, что свидетельствовало о том, что физическая сила крыс не влияет на улучшение памяти и способности к обучению. Результаты эксперимента показали, что dl-PHPB может предупреждать и лечить старческое слабоумие, в частности улучшать способность к пространственному обучению и кратковременной памяти при сосудистой деменции. После тренировочного курса испытания по обнаружению платформы проводили в водном лабиринте Морриса, в котором записывали время удерживания в памяти целевого квадранта и время первого пересечения положения удаленной платформы для определения у крыс способности к запоминанию положения платформы. Результаты показали, что крысы, обработанные dl-PHPB, значительно увеличили время удерживания в памяти целевого квадранта и уменьшили время первого пересечения положения платформы по сравнению с мышами, обработанными солевым раствором. Результаты показали, что dlPHPB может улучшать способность к пространственному обучению у 2-VO модели крыс. Эксперименты показали, что dl-PHPB может предупреждать и лечить старческое слабоумие, в частности улучшать способность к пространственному обучению и памяти при заболевании сосудистой деменцией. Для объяснения механизма действия dl-PHPB по предупреждению и лечению сосудистой деменции определяли показатели, относящиеся к повреждению, вызванному окислительным стрессом и холинергической системе, в частности активность супероксиддисмутазы (СОД), уровень малонового диальдегида (МДА) и активность холинацетилтрансферазы (ChAT) путем измерения в мозговой ткани у крыс, обработанных dl-PHPB. СОД является важным антиоксидантным ферментом in vivo, с действием по перехвату свободных радикалов и уменьшению повреждения, вызванного окислительным стрессом. МДА является важным продуктом перекисного окисления липидов. Активность СОД в мозге отражает уровень антиоксидантной защиты, в то время как уровень МДА отражает состояние перекисного окисления липидов. Через месяц после установления билатеральной закупорки цервикальной сонной артерии активность СОД и уровень МДА значительно возрастали в коре головного мозга по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором. Результаты показали, что dl-PHPB может уменьшать нарушение антиоксидантной защиты в головном мозге, тормозить липидное пероксидирование, восстанавливать окислительный баланс. dl-PHPB можно применять в качестве антиоксиданта и перехватчика свободных радикалов в тканях мозга. Ацетилхолин является важным нейротрансмиттером, индуцирующим сигнальную трансдукцию холинергических нейронов, и связан с обучением и памятью. Ацетилхолин синтезируется холинацетилтрансферазой (ChAT), активность ChAT отражает функцию холинергических нейронов. Через месяц после установления билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии активность ChAT значительно снизилась в гиппокампе. У крыс, обработанных dl-PHPB в течение 21 дней, значительно увеличилась активность ChAT и улучшилась функция холинергических нейронов. Результаты показали, что dl-PHPB можно использовать для усиления функции холинергических нейронов. Поведение крыс изменялось при билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии с последующей активацией глиальной клетки и изменением белого вещества и серого вещества. Кроме того, для дальнейшего прояснения механизма dl-PHPB для предупреждения и лечения старческого слабоумия патологию у крыс, обработанных dl-PHPB, исследовали иммуногистохимическим методом. Показатели включают окрашивание гематоксилин-эозином (НЕ) и по Клювер-Баррера, глиальный фибриллярный кислый протеин (GFAP) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF). Результаты показали, что повреждение нейронов в областях СА 1 и СА 3 значительно уменьшалось у крыс, обработанных dl-PHPB. Результат экспериментов показал, что dl-PHPB может защищать и лечить повреждение коры головного мозга и гиппокамп при билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии. Окрашивание по Клювер-Баррера может отражать завершение миелинизации в нейронах и патологические изменения нервных волокон. Формирование вакуоля мозолистого тела и нарушение зрительного тракта у крыс, обработанных dl-PHPB, значительно уменьшалась по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором. Результат экспериментов показал, что dl-PHPB может защищать от повреждения мозолистое тело и зрительный тракт при билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии. Действие GFAP в глиальной клетке определяли у крыс, обработанных dl-PHPB при билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии. Повреждения тканей мозга может являться основой для нарушения способности к пространственному обучению и памяти при билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии. Самой ранней фазой повреждения в ткани мозга является повреждение белого вещества с последующим увеличением астроцитов и активацией микроглии. Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) представляет собой белок промежуточного филамента (ПФ), который считается специфическим для астроцитов. В изобретении кора головного мозга, мозолистое тело, зрительный тракт и подобласть гиппокампа были выбраны для оценки действия dl-PHPB. В коре головного мозга экспрессия GFAP у крыс, обработанных солевым раствором, увеличивалась по сравнению с контрольной группой. Экспрессия GFAP у крыс, обработанных dl-PHPB в течение 21 дней, была значительно пониженной по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором. В гиппокампе экспрессия GFAP у крыс,обработанных солевым раствором, значительно увеличивалась по сравнению с контрольной группой. Экспрессия GFAP у крыс, обработанных dl-PHPB в течение 21 дней, также была значительно пониженной по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором. В мозолистом теле экспрессия GFAP у крыс, обработанных солевым раствором, значительно не изменялась по сравнению с контрольными крысами. Экспрессия GFAP у крыс, обработанных dl-PHPB в течение 21 дней, была пониженной по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором. В зрительных трактах экспрессия GFAP у крыс, обработанных солевым раствором, увеличивалась по сравнению с контрольной группой. Экспрессия GFAP у крыс, обработанных dl-PHPB в течение 21 дней, значительно уменьшалась по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором. В упомянутых выше экспериментах, dl-PHPB может значительно уменьшать повреждение ткани мозга при билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии, уменьшать активность астроцитов, особенно в гиппокампе, зрительных трактах и коре головного мозга. В результате окрашивания гематоксилин-эозином (НЕ) и по Клювер-Баррера экспрессия GFAP показала, что dl-PHPB можно использовать для приготовления лекарственных препаратов для защиты нейронов. В изобретении эффект экспрессии BDNF в ткани мозга определяли у крыс, обработанных dl-PHPB,при билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии. BDNF действует на определенные нейроны центральной нервной системы и периферической нервной системы, помогая поддерживать жизнеспособность существующих нейронов и содействуя росту и дифференциации новых нейронов и синапсов. В мозге BDNF является активным в гиппокампе, коре головного мозга и базальных отделах переднего мозга - областях, витальных для обучения, памяти и более высокого мышления. BDNF сам по себе играет важную роль в образовании долговременной памяти. Экспрессия BDNF увеличивалась на ранней стадии развития церебральной ишемии и уменьшалась в течение 24 ч после начала ишемии. Результаты иммуногистохимического исследования показали, что экспрессия BDNF в коре головного мозга или гиппокампе в группе, получающей носитель, была значительно пониженной по сравнению с контрольной группой. Экспрессия BDNF в коре головного мозга или гиппокампе крыс, обработанных dl-PHPB в течение 21 дней, была значительно увеличена по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором. Результаты показали, что dl-PHPB может увеличивать экспрессию BDNF в ткани мозга крыс при билатеральной окклюзии цервикальной сонной артерии. Результаты экспрессии BDNF показали, что dl-PHPB можно использовать для приготовления лекарственного препарата для защиты нейронов. В изобретении модель старческого слабоумия у крыс индуцировали с помощью бета-амилоида. dl-PHPB может улучшать память и способность к пространственному обучению у крыс, обработанных бета-амилоидом (2535). БА является важной причиной формирования нейродегенеративного нарушения, которое характеризуется когнитивным нарушением. Патологические изменения включают нейрофибриллярные клубки и бета-амилоидные отложения и другие изменения, связанные с возрастом. Амилоид бета (А или Абета) представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным элементом амилоидных бляшек в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера. Агрегаты А связаны с повреждением нервных клеток и формированием когнитивных нарушений. А (25-35) является важным токсичным пептидом А, токсичность А (25-35) аналогична или больше А (1-40) или А (142). Лабораторные исследования показали, что симптомы у крыс, обработанных интрацеребровентрикулярной (i.c.v.) инъекцией бета-амилоидного пептида (25-35), аналогичны клиническим проявлениям БА. В изобретении влияние dl-PHPB на улучшение кратковременной памяти, способности к пространственному обучению определяли у крыс, обработанных интрацеребровентикулярной (i.c.v.) инъекцией бета-амилоидного пептида (25-35). Результаты показали, что dl-PHPB значительно улучшает обучениепамять и способность к пространственному обучению у крыс, обработанных i.c.v. инъекцией. В тесте поиска платформы dl-PHPB значительно уменьшал латентности спасения крыс i.c.v. модели дозозависимым образом. Результаты показали, что dl-PHPB значительно улучшал обучение-память, способность к пространственному обучению крыс i.c.v. модели дозозависимым образом. Скорость плавания не отличалась между каждой группой в течение периода испытания. Результаты показали, что физическая сила крыс, обработанных интрацеребровентикулярной (i.c.v.) инъекцией бета-амилоидного пептида (25-35),не отличалась от контрольной группы. Результаты эксперимента показали, что dl-PHPB может предупреждать и лечить старческое слабоумие, в частности улучшать способность к кратковременной памяти при БА. Платформу пробного тестирования изучали в тесте водного лабиринта Морриса, в котором записывали время удерживания в памяти положения целевого квадранта и время первого пересечения положения удаленной платформы для определения способности запоминания крысами положения платформы. Результаты показали, что крысы, обработанные dl-PHPB, значительно увеличили время удержания в памяти целевого квадранта и уменьшили время первого пересечения положения платформы по сравнению с мышами, обработанными солевым раствором. Результаты показали, что dl-PHPB может улучшить способность к пространственному обучению у крыс i.c.v. модели дозозависимьм образом. Результаты экспериментов показали, что dl-PHPB может предупреждать и лечить старческое слабоумие, в частности улучшать способность к пространственному обучению и памяти при БА. Для прояснения механизма dl-PHPB по предупреждению и лечению БА определяли показатели, относящиеся к повреждению, вызванному окислительным стрессом, и холинергической системе, в частности активность супероксиддисмутазы (СОД), уровень МДА и активность ChAT путем измерения в ткани мозга у крыс, обработанных dl-PHPB. На 14 день после интрацеребровентикулярной (i.c.v.) инъекции бета-амилоидного пептида (25-35) активность СОД значительно выросла по сравнению с контрольными крысами. Но активность СОД значительно уменьшилась в коре головного мозга крыс, обработанных dl-PHPB в течение 14 дней, по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором. Результаты показали, что dl-PHPB может уменьшать активность СОД в коре головного мозга крыс i.c.v. модели дозозависимым образом. Через 14 дней после интрацеребровентикулярной (i.c.v.) инъекции бета-амилоидного пептида (2535) уровень МДА значительно вырос по сравнению с контрольными крысами. Но активность СОД значительно уменьшилась в коре головного мозга крыс, обработанных dl-PHPB в течение 14 дней, по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором. Результаты показали, что dl-PHPB может понижать уровень МДА в коре головного мозга крыс i.c.v. модели дозозависимым образом. Результаты показали, что dl-PHPB может ослаблять нарушение уровня антиокисления в мозге, уменьшать липидную пероксидацию, восстанавливать окислительный баланс. dl-PHPB можно использовать в качестве антиоксиданта и перехватчика свободных радикалов в ткани мозга. Активность ChAT значительно не изменилась у крыс, обработанных интрацеребровентикулярной(i.c.v.) инъекцией бета-амилоидного пептида (25-35), по сравнению с контрольными крысами. Но активность ChAT значительно выросла у крыс, обработанных dl-PHPB (39 мг/кг) в течение 14 дней, по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором. Результаты показали, что dl-PHPB можно использовать для усиления функции холинергических нейронов. Таким образом, dl-PHPB может значительно уменьшать активность СОД и уровень МДА в коре головного мозга при БА дозозависимым образом. Результаты показали, что dl-PHPB может ослаблять повреждение, вызванное окислительным стрессом, приводя к уменьшению липидных пероксидов (МДА), и восстанавливать окислительный баланс в ткани мозга. dl-PHPB может улучшать функцию нейронов,приводя к усилению активности ChAT при БА. В изобретении влияние dl-PHPB на улучшение кратковременной памяти, способности к пространственному обучению определяли у мышей линии Samp8. Мышей с ускоренным старением (SAM) можно разделить на два подтипа, которые называются подтип R и подтип Р. Клинические признаки мышейsamP включают истощение, пахилоз, нарушение поведения, сокращение периода выживаемости и т.д. Клинические признаки samR мышей аналогичны признакам нормальных мышей с нормальным процессом старения. Тип мышей samp включает 12 подтипов. Клинические признаки samP8 мышей главным образом включают повреждение памяти, вызванное процессом старения, и патологию подобласти ЦНС(такой как кора головного мозга и гиппокамп). Как сообщалось, нейрофибриллярные клубки вместе с бета-амилодными отложениями и изменения нейротрансмиттера были обнаружены у стареющих крыс,включая уменьшение ацетилхолина, увеличение опиоидных пептидов, -аминомасляной кислоты и 5 гидрокситриптамина в коре головного мозга или гиппакампе. Было обнаружено окислительное повреждение, сопровождающееся увеличением липидного пероксидирования в мозге, нарушением окислительно-восстановительной системы и дисфункцией митохондрии. Таким образом, SAMP8 могут имитировать сенильную деменцию, и ее патогенез включает недостаточную митохондриальную функцию в коре головного мозга, пониженную функцию холинергетического нерва и окислительный стресс. В изобретении влияние dl-PHPB на улучшение кратковременной памяти, способности к пространственному обучению определяли на мышах линии Samp8 с помощью теста избегания step down. Результаты показали, что dl-PHPB может улучшить способность пространственного обучения и памятиSAMP8 мышей. Результаты экспериментов показали, что dl-PHPB может предупреждать и лечить старческое слабоумие, в частности улучшать способность пространственного обучения и памяти при БА. Результаты теста на избегание step down показали, что крысы, обработанные dl-PHPB, значительно уменьшили время электроболевого воздействия на лапы и увеличили латентный период по сравнению с мышами, обработанными солевым раствором. Результаты экспериментов показали, что dl-PHPB может усиливать способность активной и пассивной реакции избегания, улучшать способность к обучению и памяти. Результаты показали, что dl-PHPB может предупреждать и лечить старческое слабоумие, в частности улучшать способность пространственного обучения и память при смешанной форме деменции. Водный лабиринт использовали для определения способности к кратковременной памяти и пространственному обучению у мышей. Латентный период спасения и количество ошибок столкновений с глухими концами использовали для оценки способности к обучению и памяти у мышей. В изобретении мыши, обработанные dl-РНРВ, показали более короткий латентный период спасения и меньшее количество ошибок столкновений с глухими концами по сравнению с мышами, обработанными солевым раствором. Результаты показали, что dl-PHPB может улучшать кратковременную память и способность к пространственному обучению у SAMP8 мышей дозозависимым образом. Результаты показали, что dlPHPB может предупреждать и лечить старческое слабоумие, в частности улучшать способность к про-5 022309 странственному обучению и памяти при смешанной форме деменции. Таким образом, механизм dl-PHPB состоит в предупреждении и лечении старческого слабоумия, в частности улучшения при смешанной форме деменции. Биохимические показатели, относящиеся к старению, обучению и памяти, определяли в мозге с помощью биохимического метода, включающего активность ChAT, AChE, СОД и уровень МДА. Результаты показали, что у SAMP8 мышей, обработанных dl-PHPB в течение 35 дней, значительно снижалась активность СОД (Р 0,05) и понижался уровень МДА (Р 0,05) в гиппокампе по сравнению с мышами, обработанными солевым раствором. Результаты показали, что dl-PHPB может уменьшать нарушение объема антиокисления в мозге, уменьшать липидное пероксидирование и восстанавливать окислительный баланс.Ach, один из ключевых нейротрансмиттеров в центральной нервной системе, опосредует сигнальный путь холинергического нерва и вовлечен в процесс обучения и памяти. Фермент холинацетилтрансфераза (ChAT) синтезирует Ach и фермент ацетилхолинстераза (AChE) гидролизует Ach, активности которых косвенно отражают содержание Ach и функцию холинергического нерва в мозге. После успешного применения в течение 35 дней гиппокампальная ChAT активность SAMP8 мышей в группах, обработанных РНРВ, статистически значительно увеличилась по сравнению с контрольной группой и проявила определенную дозозависимость, позволяя предположить, что РНРВ может уменьшать AChE активность в гиппокампе SAMP8 мышей. Таким образом, РНРВ повышает ChAT активность в гиппокампе у пациентов со смешанной формой деменции и уменьшает AChE активность в гиппокампе с определенной тенденцией, которая предполагает, что РНРВ может улучшать холинергическую функцию путем повышения содержания ACh в гиппокампе пациентов со смешанной формой деменции. Таким образом, РНРВ оказывает профилактическое, улучшающее и терапевтическое действие на сосудистую деменцию. Его множественное действие состоит в следующем: (1) РНРВ значительно уменьшает нарушение кратковременной памяти и памяти пространственного расположения; (2) РНРВ значительно уменьшает СОД активность, компенсаторно увеличиваясь в мозге пациента с сосудистой деменцией, и уровень продукта липидной пероксидации МДА, что указывает на способность РНРВ ингибировать повреждение нейронов, вызванное окислительным стрессом; (3) РНРВ повышает ChAT активность в мозге пациента с сосудистой деменцией, возможно индуцируя более высокий уровень ACh для улучшения обучения и памяти; (4) РНРВ уменьшает патологические изменения в головном мозге пациентов с сосудистой деменцией, включающие диффузные изменения белого вещества, вакуолизацию,увеличение числа глиальных клеток и аномальную морфологию нейронов, а также улучшает снижение нейротрофического фактора головного мозга, индуцированного ишемией мозга. При этом РНРВ обладает профилактическим, улучшающим и терапевтическим действием на деменцию Альцгеймера. Множественное действие РНРВ состоит в следующем: (1) РНРВ значительно улучшает обучение и память у пациентов с деменцией Альцгеймера; (2) РНРВ значительно ослабляет СОД активность, компенсаторно увеличиваясь в головном мозге пациента с деменцией Альцгеймера, и уровень продукта липидного пероксидирования МДА, что указывает на способность РНРВ ингибировать повреждение нейронов, вызванное окислительным стрессом, и защищать нейроны; (3) РНРВ увеличивает ChAT активность, кроме того, улучшая холинергическую функцию, которая помогает ослабить повреждения обучения и памяти у пациентов с деменцией Альцгеймера. Дополнительно, РНРВ оказывает профилактическое, улучшающее и терапевтическое действие на смешанную форму деменции. Множественное действие РНРВ состоит в следующем: (1) РНРВ значительно ослабляет нарушение кратковременной памяти и пространственной памяти; (2) РНРВ значительно ослабляет СОД активность, компенсаторно увеличиваясь в мозге пациентов со смешанной формой деменции, и уровень продукта липидного пероксидирования МДА, что указывает на способность РНРВ защищать нейроны от повреждения, вызванного окислительным стрессом; (3) РНРВ увеличивает ChAT активность и возможно снижает AchE активность в гиппокампе, что указывает на способность РНРВ ослаблять нарушение обучения и памяти у пациентов со смешанной формой деменцией возможно через усиление холинергических функций. Таким образом, РНРВ обладает терапевтическими эффектами в отношении деменции и благоприятными эффектами в отношении когнитивного нарушения, связанного с процессом старения, при этом механизм РНРВ вовлечен в уменьшение инсультов, вызванных окислительным стрессом в головном мозге, усиление функций в холинергическом нерве, увеличением мозгового фактора роста. С другой стороны, изобретение относится к лекарственным композициям, использующимся для предупреждения, смягчения и лечения признаков деменции, при этом лекарственные композиции включают РНРВ в дозах, эффективных для предупреждения или лечения, а также дополнительные и фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные средства. В изобретении лекарственные композиции могут быть приготовлены исходя из режима введения в виде следующих составов: растворов, суспензий, эмульсий, пилюль, капсул, порошков, составов с контролируемым или замедленным высвобождением. Режимы введения РНРВ составов, приготовленных известными в данной области способами, включают, но не ограничиваются этим, следующие режимы: парентеральный, пероральный, фокальный,-6 022309 внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, подкожный, интраназальный режим введения. РНРВ в изобретении может быть приготовлен известными в данной области способами. Дополнительные РНРВ составы в изобретении можно легко приготовить с одним или множеством фармацевтически приемлемых носителей и/или вспомогательных средств. Следовательно, РНРВ и его растворенные формы можно специально приготовить для ингаляционного, инсуффляционного (через рот или нос), перорального, буккального, парентерального или ректального введения. РНРВ составы могут быть приготовлены в виде раствора, суспензии, эмульсии, пилюль, капсул, порошка, составов с контролируемым или замедленным высвобождением. Эти составы содержат РНРВ в терапевтически-эффективной дозе, оптимизированной для чистой формы, и соответствующее количество носителя для обеспечения пациенту соответствующих условий введения. Состав должен соответствовать режиму введения. В изобретении очищенная форма РНРВ, как указано, относится к в основном чистому РНРВ, особенно с чистотой более 80%, оптимально чистому РНРВ с чистотой более 85%, особо оптимально чистому РНРВ с чистотой более 90%, даже более оптимально чистому РНРВ с чистотой более 98%. В целом,чистота РНРВ, как указано, находится в диапазоне от 95 до 99%. Парентеральное введение РНРВ композицию можно приготовить для парентерального введения путем вливания, например вливания в виде болюса. Состав для вливания находится в одной ампуле как одна единица состава или контейнере с множеством доз с дополнительными добавками консервантов. Парентеральный состав помещают в ампулы, одноразовые шприцы или контейнеры для множественных доз, изготовленные из стекла или пластика и др. Состав также может быть в форме суспензии, раствора или эмульсии, содержащей липофильные или гидрофильные носители и вспомогательные средства, такие как дефлокулянт,стабилизатор и/или диспергатор. Например, состав для парентерального введения является одним из видов стерильного введения суспензии с нетоксичными разбавителями или растворителями, пригодными для парентерального введения (например, раствор в 3-бутандиоле). Пригодные носители и доступные растворители включают воду,раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Дополнительно, стерильное и нелетучее масло обычно используют в качестве растворителей или среды для суспензии. С учетом этого можно использовать любое мягкое и нелетучее масло, включая синтетический моноглицерид и диглицерид. Более того,жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, также используются в парентеральных составах. Кроме того, РНРВ композицию можно также приготовить в порошковой форме, требующей восстановления соответствующим носителем, таким как апирогенная стерильная вода, перед введением. Например, пригодная для парентерального введения РНРВ композиция включает стерильный изотонический раствор, который содержит от 0,1 до 90 мас.% РНРВ на объем. Содержание РНРВ в растворе составляет примерно от 5 до 20%, оптимально от 5 до 17%, более оптимально от 8 до 14%, еще более оптимально до 10%. Составы в виде раствора или порошка могут содержать солюбилизатор и анестезирующее вещество местного действия, такое как лидокаин, для уменьшения боли в месте введения. В данной области известны другие способы парентерального введения, которые включены в объем настоящего изобретения. Оральное введение РНРВ композицию можно приготовить в форме таблетки или капсулы простыми способами с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, такими как адгезив, наполнитель, лубрикант и дезинтегратор.A. Адгезив Адгезивы включают, но не ограничиваются этим, маисовый крахмал, картофельный крахмал или другой крахмал, желатин, натуральную или синтетическую камедь, такую как аравийская камедь, альгин,альгиновую кислоту, другие альгинаты, порошковый трагант, гуаровую камедь, целлюлозу и ее производные (такие как этилцеллюлоза, ацетат целлюлозы, кальцийкарбоксиметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза), поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, прежелатинизированный крахмал, гидроксипропилметилцеллюлозу (например, Nos. 2208, 2906, 2910), микрокристаллическую целлюлозу и ее смеси. Соответствующий формат микрокристаллической целлюлозы, например, включает материал,продаваемый как AVICEL-PH-101, AVICEL-PH-103 и AVICEL-PH-105 (от компаний FMC Corporation,American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, Pennsylvania, USA). Примером пригодного адгезива является смесь микрокристаллической целлюлозы и натрийкарбоксиметилцеллюлозы, продаваемой какB. Наполнитель Наполнители включают, но не ограничиваются этим, тальк, лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, порошковую целлюлозу, декстраты, каолин, маннитол, кремниевую кислоту, сорбит, крахмал,прежелатинизированный крахмал и их смеси.C. Лубрикант Лубриканты включают, но не ограничиваются этим, стеарат кальция, стеарат магния, минеральное масло, светлое минеральное масло, глицерин, глюцитол, полиэтиленгликоль, другой этандиол, стеарин,-7 022309 лаурилсульфат натрия, тальк, гидрогенизированное растительное масло (такое как арахисовое масло,хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло, маисовое масло и соевое масло), стеарат цинка, земляное масло, этил лаурат, агар и их смеси. Другие лубриканты включают, например, твердый кремний (AEROSIL 200, Baltimore, Maryland, USA, W.R. Grace Co.), конденсированный аэрозоль оксида кремния (Deaussa Co. of Plano, Texas, USA), CAB-O-SIL (вид пирогенного кремнезема,продаваемого Cabot Co., Boston, Massachusetts, USA) и его смесь.D. Дезинтегратор Дезинтеграторы включают, но не ограничиваются этим, агар-агар, алгиновую кислоту, карбонат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, кроскармеллозу натрия, кросповидон, полакрилин калия,крахмал натрия гликолят, картофельный или маниоковый крахмал, другой крахмал, прежелатинизированный крахмал, глинистую почву, другой алгин, другую целлюлозу, камедь и их смеси. Произвольный способ покрытия в данной области может быть использован для таблеток или капсул. Если адгезивы и/или наполнители используются в РНРВ композиции, в целом, они составляют от 50 до 99 мас.% соединения. С одной стороны, примерно от 0,5 до 15 мас.% дезинтегратора, особенно от 1 до 15% дезинтегратора можно объединить с РНРВ. Лубрикант является дополнительным и его содержание составляет не более 1 мас.% РНРВ (способы приготовления твердых оральных составов и фармацевтически приемлемых добавок описаны в Marshall, Solid Oral Dosage Forms, Modern Pharmaceutics (Banker andRhodes, Eds.), 7: 359-427 (1979. Другие менее типовые составы хорошо известны в данной области. Составы раствора, сиропа или суспензии можно использовать для жидких композиций для перорального применения. Или жидкие композиции могут быть в форме сухого продукта и быть восстановленным с помощью воды или пригодного носителя перед применением. Данные жидкие композиции готовят простыми способами с помощью фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, таких как дефлоккулянт (например, сорбитовый сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированный пищевой жир), эмульгатор (например, лецитин или аравийская камедь), гидрофобный носитель (например, абрикосовое масло, масличный эфир, спирт или фракционированное растительное масло) и/или консерванты (например, метил р-гидроксибензоат, пропил р-гидроксибензоат или сорбиновая кислота). Дополнительно в эти составы могут быть добавлены буферная соль, вкусовая добавка, краситель, ароматизатор и подсластитель. Оральные составы можно также приготовить в виде лекарственной формы с контролируемым высвобождением лекарственного средства. Предпочтительно, чтобы оральная лекарственная форма содержала от 10 до 95% соединения. Дополнительно, в изобретении РНРВ композиция может быть также приготовлена в виде буккальной таблетки или таблетки для рассасывания. Другие режимы орального введения РНРВ известны опытным в данной области специалистам и включены в объем изобретения. Введение с контролируемым высвобождением Составы с контролируемым (замедленным) высвобождением разработаны для продления время действия и уменьшения частоты введения РНРВ. Этот вид состава также может оказывать влияние на начальное время или другие свойства, такие как уровень соединения в крови, тем самым воздействуя на возникновение побочных эффектов. Состав с контролируемым высвобождением разработан для начального высвобождения определенного количества РНРВ с целью достижения терапевтически необходимой эффективности, затем ступенчатого и последовательного высвобождения дополнительного количества РНРВ с целью поддержания терапевтического уровня в продолжительном курсе. Для сохранения приблизительно постоянным количества соединения, РНРВ высвобождается из состава с определенной скоростью для замещения метаболизированного РНРВ и/или секретированного в теле. Много индуцирующих факторов стимулируют контролируемое высвобождение РНРВ, такие как изменение рН, изменение температуры, фермент, вода и другие физиологические условия или молекулы. В системе с контролируемым высвобождением соединение может подаваться с помощью дозирующей помпы аналогично подаче инсулина или химиотерапевтического агента в целевой орган или опухоль. В системе РНРВ обычно объединяется с биологически разлагаемыми, биологически совместимыми полимерными имплантатами, при этом система характеризуются высвобождением РНРВ в выбранном месте при контроле времени. Примеры полимерных материалов включают полиангидрид, полиортоэфиры, полигликолевую кислоту, полилактовую кислоту, полиэтиленвинилацетат, а также его сополимеры и комбинации. К тому же, система с контролируемым высвобождением находится в зоне терапевтической цели, благодаря чему требуется только часть дозы, рассчитанной для всей массы тела. В изобретении РНРВ можно доставлять другими способами с контролируемым высвобождением или системами доставки лекарственного средства, известными опытным специалистам в данной области,которые включают, например, гидроксипропилметилцеллюлозу, другие полимерные матриксы, гель,проницаемую оболочку, системы инфильтрации, многослойное покрытие, частицы, липосомы, микросферы и т.п. или любую их комбинацию с разным соотношением компонентов смеси для обеспечения необходимого спектра высвобождения. Другие методы с контролируемым высвобождением РНРВ известны опытным специалистам и включены в объем изобретения. Введение ингаляцией РНРВ можно вводить в виде ингаляции с помощью разных устройств, легко доставляющих препарат в легкие пациента. Например, дозирующий ингалятор (MDI), содержащий в емкости пригодный газ-вытеснитель с низкой точкой кипения, такой как дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, диоксид углерода или другой пригодный газ, который напрямую доставляет соединение в легкие. MDI устройства могут быть получены от разных поставщиков, таких как 3 М Corporation, Aventis,Boehringer Ingleheim, Forest Laboratories, Glaxo-Wellcome, Schering Plough и Vectura. Кроме того, для доставки соединения можно также использовать ингалятор сухого порошка (DPI). Механизм действия DPI аппарата, в целом, состоит во вдыхании пациентом порошка в виде облака, образующегося при распылении препарата. DPI аппарат известен в данной области и доступен у многих поставщиков, таких как Fisons, Glaxo-Wellcome, Inhale Therapeutic, Systems, ML Laboratories, Qdose andVectura. Система для множественных доз DPI (MDDPI) позволяет осуществить доставку более одной терапевтической дозы. MDDPI аппарат доступен у многих компаний, таких как AstraZeneca, Glaxo Wellcome, IV АХ, Schering Plough, SkyePharma и Vectura. Например, желатиновые капсулы и картриджи для ингалятора и инжектора могут быть приготовлены в виде порошковой композиции, содержащей РНРВ и порошковые матриксы, пригодные для этой системы, такие как лактоза и крахмал. Другой вид аппарата относится к доставке соединений в легкие, например, капельно-жидкое устройство от компании Aradigm Corporation. Жидкое соединение распыляют с помощью маленького наконечника в системе распыления жидкости с прямым поступлением в легкие. Например, распыляющее устройство можно использовать для доставки соединений в легкие. С помощью ультразвуковой энергии жидкие соединения трансформируются в аэрозоль, состоящий из маленьких частиц, предназначенных для вдыхания. Примеры распылителей включают устройства, представленные компаниями Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltd, Aventis и Batelle Pulmonary Therapeutics. В другом варианте для доставки соединений в легкие используется электрогидродинамическое(EHD) аэрозольное устройство. Жидкий раствор или суспензия распыляются с помощью энергии в EHD аэрозольном устройстве. Когда соединение поступает в легкие через EHD аэрозольное устройство, электрохимические свойства состава соединения являются оптимизированными по важным параметрам. Оптимизация легко проводится опытными в данной области специалистами. Другие способы доставки в легкие РНРВ хорошо известны опытным специалистам в данной области и включены в объем данного изобретения. РНРВ состав, пригодный для распылителя, устройства с распылением жидкости и EHD аэрозольного устройства, в целом, состоит из РНРВ и фармацевтически приемлемых носителей. В иллюстративном варианте фармацевтически приемлемый носитель представляет собой жидкость, такую как спирт, вода,полиэтилегликоль или перфторуглерод. Дополнительно, свойства аэрозоля для раствора или суспензии,содержащей соединение, можно изменить путем добавления другого вещества. Например, вещество может быть жидкостью, такой как спирт, диол, полиэтиленгликоль, или жирными кислотами. Другие способы приготовления растворов или суспензий соединения, пригодных для аэрозольных устройств, хорошо известны опытным в данной области специалистам. Введение с помощью резервуара РНРВ также можно приготовить в виде состава для резервуара. Такой состав с пролонгированным действием вводится путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекции. Таким образом, соединение можно комбинировать с пригодными полимерными или гидрофобными материалами, такими как эмульсия в приемлемом масле или ионно-обменной смоле, или слабо растворимых производных, например, слаборастворимых солях. Другие способы резервуарного введения РНРВ хорошо известны опытным в данной области специалистам и включены в масштаб изобретения. Фокальное введение Для фокального введения РНРВ можно комбинировать с носителями таким образом, чтобы доставить эффективную дозу. Согласно требуемой активности эффективная доза варьируется от 10 мкМ до 1,0 мМ. В одном аспекте изобретения фокальное введение композиции соединения можно применять на кожу. Носители включают, но не ограничиваются мазью, кремом, желатином, пастой, пеной, аэрозолем,суппозитарием, прокладкой или карандашом-гелем. Фокальный состав может включать терапевтически эффективное количество соединения в офтальмологически приемлемых носителях, таких как буферный солевой раствор, минеральное масло, растительное масло, подобное кукурузному или арахисовому, вазелин, Miglyol 182, спиртовой раствор, липосомный или аналогичный липосомному продукт. Любое из этих соединений может также содержать консерванты, антиоксиданты, антибиотики, иммуносупрессанты и другие биологически или фармацевтически эффективные агенты без вредного действия на соединение. Другие способы фокального введения РНРВ хорошо известны опытным в данной области специалистам и включены в объем изобретения. Другие системы доставки Другие системы доставки хорошо известны опытным в данной области специалистам и могут ис-9 022309 пользоваться для доставки соединения изобретения. Более того, эти и другие системы доставки можно комбинировать или изменять для оптимизации введения РНРВ в изобретении. Изобретение также относится к способу предупреждения, облегчения и/или лечения деменции или симптомов, включающему терапевтически эффективную дозу РНРВ или содержащего РНРВ лекарственного состава, вводимого пациенту при необходимости. Режимы введения включают, но не ограничиваются парентеральным, пероральным, фокальным, внутрикожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, подкожным, интраназальным режимом. В изобретении указанная терапевтически эффективная доза РНРВ составляет факультативно от 0.5 до 200 мг/кг массы тела, оптимально 1-150 мг/кг массы тела, более предпочтительно 2-100 мг/кг массы тела, более предпочтительно 3-50 мг/кг массы тела, более предпочтительно 4-35 мг/кг массы тела и более предпочтительно 5-20 мг/кг массы тела. Принципы определения терапевтически эффективной дозы dl-PHPB В изобретении термин терапевтически эффективная доза означает, что необходимую терапевтически эффективную дозу РНРВ для пациента определяли исходя из заболевания и его распространенности. Например, дозу лекарства для предупреждения, ингибирования или, по меньшей мере, частичного ингибирования или предупреждения целевого заболевания или состояния. Токсичность и эффективность dl-PHPB определяли по значению LD50 (группам с 50% летальной дозой) и ED50 (группам с 50% эффективной дозой) с помощью стандартного фармацевтического подхода в клеточных культурах или экспериментальных животных. Терапевтический индекс dl-PHPB является соотношением между токсичностью и эффективностью терапевтической дозы, а именно соотношениемLD50/ED50. Данные, полученные в результате экспериментов с клеточной культурой и изучений животных,можно использовать для определения диапазона доз dl-PHPB для оптимизации дозы для человека и других млекопитающих с минимальной токсичностью или без токсичности, включая ED50 концентрацию в плазме или других биологических жидкостях. Диапазон доз dl-PHPB зависит от формы дозы и режима введения. В изобретении эффективная дозаdl-PHPB была установлена согласно дозе, определенной в результате экспериментов над животными. Доза dl-PHPB была разработана для достижения IC50 концентрации в плазме в моделях животных. Кроме того, эффективную дозу dl-PHPB можно определить более точно исходя из информации, полученной у человека и других млекопитающих. Уровень dl-PHPB в плазме можно измерить с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Эффективную дозу комбинированной однократной лекарственной формы dl-PHPB с фармацевтически приемлемыми носителями определяли с учетом организма хозяина, а также специфических и разных режимов доставки. Специалисты должны понимать, что содержание dl-PHPB в индивидуальной дозе каждого состава не требует достижения эффективной дозы само по себе, потому что было легко достигнуть требуемой дозы применением мультииндивидуальной дозы каждого состава. Доза dl-PHPB должна выбираться в зависимости от лекарственной формы, заболевания и конкретной цели, подлежащей решению специалистами в данной области. Программы доз dl-PHPB, которые использовали для лечения заболеваний, были выбраны для применения любой системы доставки dl-PHPB с учетом многочисленных факторов, включающих тип пациента, возраст, вес, пол, диету, состояние, режим введения и фармакологические факторы, такие как активность, эффективность, характеристика фармакокинетики и распределения токсикологии. Следовательно, фактическая программа доз dl-PHPB может различаться между пациентами. Термины и сокращенияdl-PHPB, PHPB представляет собой (-гидроксипентил)бензойной кислоты калиевая соль,СОД представляет собой супероксиддисмутазу,МДА представляет собой малондиальдегид,ChAT представляет собой холин ацетилтрансферазу,AChE представляет собой ацетилхолинестеразу,АТРаза представляет собой трифосфатфосфогидролазу. Описание фигур Фиг. 1. Влияние dl-PHPB на латентности спасения перманентных 2-VO крыс в тесте водного лабиринта. Величины представлены как среднееS.E.M. (N=17-20). P0,05, P0,01 v.s. ложнооперированная группа; Р 0,05 v.s. группа, получающая носитель (LSD тест). Фиг. 2. Типичные пути плывущих перманентных 2-VO крыс в водном лабиринте Морриса. А: периферийный режим; В: беспорядочный режим; С: направленный режим; D: линейный режим. Фиг. 3. Влияние dl-PHPB на время нахождения в квадранте платформы (А) и время первого пересечения платформы (В) перманентных 2-VO крыс в водном лабиринте Морриса после введения в течение 21 дней. Величины представлены как среднее S.E.M. (N=17-20). P0,05, P0,01 v.s. группа, получающая носитель (LSD тест). Фиг. 4. Влияние dl-PHPB на биохимические показатели тканей мозга перманентных 2-VO крыс. А: активность СОД в коре головного мозга; В: уровень МДА в коре головного мозга; С: активность ChAT в гиппокампе. Величины представлены как среднее S.E.M. (N=5-8). P0,001 v.s. ложнооперированная группа; Р 0,05, Р 0,01,Р 0,001 v.s.группа, получающая носитель (LSD тест). Фиг. 5. Влияние dl-PHPB на микрофотографиях окрашивания гематоксилином и эозином коры головного мозга перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 400 Х. Фиг. 6. Влияние dl-PHPB на микрофотографиях окрашивания гематоксилином и эозином области СА 1 гиппокампа перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 400 Х. Фиг. 7. Влияние dl-PHPB на микрофотографиях окрашивания гематоксилином и эозином области СА 3 гиппокампа перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 400 Х. Фиг. 8. Влияние dl-PHPB на микрофотографиях окрашивания луксолевым прочным синим по Клювер-Баррера мозолистого тела перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 400 Х. Фиг. 9. Влияние dl-PHPB на микрофотографиях окрашивания луксолевым прочным синим по Клювер-Баррера зрительного тракта перманентных оптических 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 400 Х. Фиг. 10. Влияние dl-PHPB на микрофотографиях иммуногистохимического окрашивания на GFAP в гиппокампе перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 200 Х. Фиг. 11. Влияние dl-PHPB на микрофотографиях иммуногистохимического окрашивания на GFAP в зрительных трактах перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 200 Х. Фиг. 12. Влияние dl-PHPB на активные астроциты в мозге перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. А: кора головного мозга, В: гиппокамп, С: мозолистое тело, D: зрительный тракт. Величины представлены как среднее S.Е.М. (N=4). P0,01 v.s. ложнооперированная группа; Р 0,05,Р 0,01 v.s. группа, получающая носитель (LSD тест). Фиг. 13. Влияние dl-PHPB на область и плотность BDNF в коре головного мозга перманентных 2VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 200 Х. Фиг. 14. Влияние dl-PHPB на микрофотографиях иммуногистохимического окрашивания на распределение и содержание GFAP в гиппокампальной СА 1 области перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 200 Х. А: ложнооперированная группа; В: группа, получающая носитель; С: группа, получающая 39 мг/кг РНРВ. Фиг. 15. Влияние dl-PHPB на микрофотографиях иммуногистохимического окрашивания на распределение и содержание GFAP в гиппокампальной СА 2 области перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 200 Х. А: ложнооперированная группа; В: группа, получающая носитель; С: группа, получающая 39 мг/кг РНРВ. Фиг. 16. Влияние dl-PHPB на микрофотографиях иммуногистохимического окрашивания на распределение и содержание GFAP в гиппокампальной СА 3 области перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Кратность увеличения 200 Х. А: ложнооперированная группа; В: группа, получающая носитель; С: группа, получающая 39 мг/кг РНРВ. Фиг. 17. Влияние dl-PHPB на содержание BDNF в ткани мозга перманентных 2-VO крыс после введения в течение 21 дней. Величины представлены как среднее S.E.M. (N=4). Р 0.05, v.s. ложнооперированная группа; Р 0,05, P0,01 v.s. группа, получающая носитель (LSD тест). Фиг. 18. Влияние dl-PHPB на латентности спасения у крыс с А(25-35)-индуцированной деменцией в водном лабиринте Морриса после введения. Величины представлены как среднее S.Е.М. (N=7-9). Р 0,05, v.s. ложнооперированная группа; Р 0,05, P0,01 v.s. группа, получающая носитель (LSD тест). Фиг. 19. Влияние dl-PHPB на время в целевом квадранте и первого пересечения платформы крыс с А(25-35)-индуцированной деменцией в модели водного лабиринта Морриса после введения. A: dl-PHPB увеличивает дозозависимым образом время в целевом квадранте крыс с деменцией по сравнению с крысами, получающими носитель; В: dl-PHPB имеет тенденцию к уменьшению времени первого пересечения платформы. Величины представлены как среднее S.Е.М. (N=7-9). Р 0,05 vs. ложнооперированная группа; Р 0,05 vs. группа, получающая носитель (LSD тест). Фиг. 20. Влияние dl-PHPB на биохимические показатели крыс с А(25-35)-индуцированной деменцией после введения в течение двух недель. А: СОД активность в коре головного мозга; В: МДА уровень в коре головного мозга; С: ChAT активность в коре головного мозга. Величины представлены как среднее S.Е.М. (N=7-9). Р 0,05 vs. ложнооперированная группа; Р 0,05, Р 0,01 vs. группа, получающая носитель (Dunnett или LSD тест). Фиг. 21. Влияние dl-PHPB на число электрошоков и латентность одиннадцатимесячных мышейSAMP8 в тесте избегания step down после введения в течение 30 дней. A: dl-PHPB понижает дозозависимым образом число электрошоков, полученных SAMP8; В: dl-PHPB увеличивает дозозависимым обра- 11022309 зом шоковую латентность SAMP8. Величины представлены как среднее S.Е.М. (N=11-14). Р 0,05,Р 0,01, Р 0,001 vs. контрольная группа (Dunnett тест). Фиг. 22. Влияние dl-PHPB на число столкновений SAMP8 с тупиком и латентностей обнаруженияSAMP8 ступенек в водном лабиринте после введения в течение 32-35 дней. А: число SAMP8 вхождений вход-выход; В: латентность SAMP8 обнаружения ступенек. Величины представлены как среднее S.E.M.(N=11-14). P0,05, P0,01 vs. контрольная группа (Dunnett тест). Фиг. 23. Влияние dl-PHPB на СОД активность и МДА уровень в тканях мозга SAMP8. А: СОД активность в гиппокампе; В: МДА уровень в гиппокампе. Величины представлены как среднее S.Е.М.(N=11-14). Р 0,05 vs. ложнооперированная группа; (LSD тест). Фиг. 24. Влияние dl-PHPB на ChAT и AChE активность в тканях мозга SAMP8. А: активность ChAT в гиппокампе; В: активность AChE в гиппокампе; С: ATPase активность митохондрии в коре головного мозга. Величины представлены как среднее S.Е.М. (N=11-14). Р 0,05 vs. ложнооперированная группа;(LSD тест). Фиг. 25. Планирование эксперимента и шкала примера 1. Фиг. 26. Планирование эксперимента и шкала примера 2. Фиг. 27. Планирование эксперимента и шкала примера 3. Особые варианты осуществления изобретения Осуществление изобретения не ограничивает применение изобретения. Пример 1. Изучение хронической церебральной ишемии у крыс: dl-PHPB улучшает кратковременную память и способность к пространственному обучению у крыс с хронической церебральной ишемией. 1. Материалы и способыdl-PHPB был предложен отделением медицинской синтетической химии нашего института с чистотой более чем 98,5%. dl-PHPB растворяли в дистиллированной воде. Таблетки пирацетама были приобретены у компании Tianjin Jinshi Pharmaceutical limited company. Уровни СОД, ChAT и МДА активности определяли с помощью коммерческих наборов для колориметрического анализа (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China). Содержание белка в супернатанте определяли по методу Бредфорд, используя БСА в качестве стандарта. Нейтральный красный и прочный синий были приобретены у компанииSigma. Карбонат лития был получен от компании Beijing Chemical reagent limited company. Triton X-100 получали от компании Zhongshan goldenbridge biotechnology со., LTD. Антитела к GFAP получали от компании Chemicon. Антитела к BDNF получали от компании Santa Cruz Biotechnology со., LTD. Другие реагенты получали от компании Zhongshan goldenbridge biotechnology со., LTD. 2. Оборудование Аппарат водного лабиринта был разработан Institute of Material Medica, Chinese Academy of MedicalSciences. Прибор для маркировки ферментов (MQX 200) был приобретен у компании Bio Tek Instruments. Машина парафинового среза (IR2135) была приобретена у компании German Leica со., LTD. Машина с термостатическим морозильным отделением (620-Е) была приобретена у компании UK Shandon со., LTD. Автоматическая микрофотографическая система (Nikon ECLIPSE 80i) была приобретена у компании Japanese Nikon Corportion. 3. Приготовление 2-VO модели крыс Хроническую церебральную гипоперфузию моделировали с помощью перманентной билатеральной окклюзии общей сонной артерии (2-VO) у взрослых крыс. Крыс анестезировали 10% трихлорацетальдегидом и в прямую кишку помещали термометр-щуп и отдельную нагревающую лампу, которую использовали для поддержания ректальной температуры на нормотермическом уровне. После срединного кожного разреза шеи общую сонную артерию обнажали и перевязывали 5-0 нейлоновой нитью. 4. Лечебная группа и введение лекарственного препарата Крыс разделяли на шесть экспериментальных групп произвольным образом (20 крыс/каждая группа): одна ложнооперированная группа, одна контрольная группа, получающая носитель, одна группа,обработанная пирацетамом (600 мг/кг), и три группы, обработанные dl-PHPB (13,39 и 129 мг/кг). Через 10 дней после установления 2-VO крысам перорально вводили лекарственные препараты и носитель в течение 21 дней (один раз/каждый день). Способность к пространственному обучению и памяти у крыс определяли с помощью водного лабиринта Морриса через 25-30 дней после операции. Тестирование в водном лабиринте Морриса начинали через 40 мин после обработки лекарственными препаратами. Биохимические и лабораторные исследования проводили позже (через 24 ч) после тестирования поведения. План эксперимента показан на фиг. 25. 5. Водный лабиринт Морриса Объекты тестировали в водном лабиринте Морриса. Данный тест основан на стандартном исследовании способности к пространственному обучению. Аппарат водного лабиринта состоял из круглого стального бассейна (120 см в диаметре, 60 см в высоту). Он был помещен в тускло освещенную, звуконепроницаемую комнату для тестирования. Многочисленные отдаленные метки вокруг комнаты (окно,кабинеты, мебель) сохраняли в том же положении на протяжении всего эксперимента. Воду заполняли на глубину 40 см при 251 С и делали мутной добавлением молочного порошка для предупреждения ви- 12022309 зуализации платформы. Прозрачную платформу (10 см в диаметре) помещали на 1,5 см ниже поверхности воды. Емкость разделяли на четыре квадранта с платформой в закрепленном положении в одном квадранте. Объекты помещали в лабиринт, лицом к стенке бассейна и давали две попытки в день, 60 с на попытку, для обнаружения скрытой платформы. Если объект обнаруживал платформу в течение 60 с,ему давали 10-секундный период для отдыха на платформе между попытками. Если основание не было обнаружено в течение предоставленного времени, объект помещали на платформу и оставляли на 10 с до следующей попытки. Латентность спасения (время достижения платформы) использовали для оценки восприимчивости задачи водного лабиринта. Сеансы повторяли в течение пяти последующих дней. На шестой день платформу удаляли и крысам давали возможность найти платформу в течение 60 с (пробный тест). Время в секторе платформы и латентное время для пересечения положения платформы записывали для измерения способности к пространственному обучению без влияния случайных встреч с платформой. Сеансы с водным лабиринтом Морриса записывали на видеокамеру для анализа в офф-лайне. 6. Биохимический анализ Биохимический анализ выполняли позже (через 24 ч) после теста на поведение. Восемь крыс в каждой группе анестезировали эфиром и умерщвляли. Мозги быстро удаляли и очищали ледяным солевым раствором. Затем теменную кору и гиппокапм изолировали. Для биохимического анализа ткани взвешивали и гомогенизировали в пропорции 1:9 (мас./об.) в ледяном солевом растворе. Гомогенизацию (IKA,Germany) проводили в течение 2 мин в ледяной ванне. После центрифугирования гомогената при 2,000 г в течение 10 мин при 4 С (Sigma, Germany) супернатант использовали для аналитических процедур. Уровни ChAT, СОД и активность МДА определяли с помощью коммерческих наборов для колориметрического анализа (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China). Содержание белка в супернатанте оределяли по методу Бредфорд с использованием БСА в качестве стандарта. 7. Гистопатология и иммуногистохимия Окрашивание гематоксилин-эозином и по Клювер-Баррера Четырех крыс в каждой группе анестезировали пентобарбиталом натрия (100 мг/кг, интраперитонеальная инъекция) и транскардиально перфузировали холодным солевым раствором с последующим 300 мл 4% параформальдегидом в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,4). После этих процедур мозги удаляли и хранили в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,4) с 4% параформальдегидом и 30% сахарозой при 4 С до полного уравновешивания. Затем их фиксировали при 4 С, дегидрировали и погружали в парафиновый блок. Корональные отделы в 8 мкм окрашивали гематоксилино-эозином и по Клювер-Баррера. Окрашивание антителами к GFAP и BDNF Способ фиксации ткани был описан выше. Несколько коронарных срезов (40 мкм) мозга рассекали через дорсальный гиппокамп на замораживающем микротоме и собирали в 6-ячеечные планшеты, содержащие 0,01 М БСА. Определение иммунореактивности к GFAP и BDNF проводили с использованием традиционного авидин-биотин-иммунопероксидазного метода. Для количественного анализа брали один из каждых пяти образцов непрерывного ряда кусочков ткани гиппокампа и кортикальной ткани и обрабатывали иммуногистохимически. Так, брали три предметных стекла от каждой крысы и считывали под объективом (1,6) микроскопа. Общее количество положительно окрашенных нейронов подсчитывали с помощью программного обеспечения Image-pro Plus 5.0 software. 8. Статистический анализ Результаты выражали как среднее SEM. Данные обучающего пробного теста в водном лабиринте Морриса анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для определения различия между группами и с течением времени. Апостериорный post hoc анализ методом Даннета использовали для анализа различия между двумя группами. Обучающий тест, биохимический анализ и иммуногистохимический анализ были статистически проанализированы с помощью двухфакторного анализа ANOVA с последующим post hoc методом Даннета. Результаты показали значительное различие при величине р меньше 0,05. Результаты 1. dl-PHPB значительно уменьшает нарушения пространственного обучения и пространственной оперативной памяти у крыс, индуцированные хронической церебральной гипоперфузией. Крысам вводили dl-PHPB ежедневно в течение 21 дней на 10 день после операции. Крыс тестировали в водном лабиринте Морриса через 25-30 дней после операции. Латентность спасения использовали для отражения картины когнитивности и пространственного обучения. Двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA с повторяемыми измерениями показал значительный суточный эффект на латентность спасения в группах, что свидетельствовало об улучшении характеристик у всей группы крыс за 5 дневный период обучения. Также, мы обнаружили значительный эффект лечения на латентность спасения.Post hoc анализ подтвердил внутреннюю валидность метода изучения. 2-VO крысы показали значительно большее время поиска платформы (латентность спасения), чем ложнооперированные крысы(р 0,01). Крысы, обработанные dl-PHPB, выполняли задание лучше на пятый день (как показано статистическим анализом), в то время как ложнооперированные крысы выполняли задание лучше со второго дня. Результаты показали, что хроническая церебральная гипоперфузия успешно индуцировала нарушение обучения. Во-вторых, было обнаружено, что крысы, обработанные 13 мг/кг dl-PHPB, не отличались от контрольных животных, получающих носитель. Эти результаты означают, что ежедневное введениеdl-PHPB в дозе 39 и 129 мг/кг значительно восстанавливает нарушение способности к обучению, вызванное хронической церебральной гипоперфузией, в латентности спасения в задаче водного лабиринта(фиг. 2, таблица). В день пробного обучения при перемещении платформы предполагали, что крысы, которые запомнили положение скрытой платформы, будут проводить основное время поиска платформы в целевом квадранте. 2-VO крысы провели меньше времени в квадранте платформы (Р 0,01) и больше времени потратили на пересечение положения платформы (Р 0,01), чем ложнооперированные животные. dl-PHPB(13 и 39 мг/кг) показал значительный благоприятный эффект по сравнению с 2-VO животными (фиг. 3 АВ). Эти результаты показали, что 2-VO крысы испытывали повреждение восприятия пространства и dlPHPB уменьшал повреждения обучения и памяти у 2-VO крыс. Влияние dl-PHPB на навигационное научение перманентных ВССАО крыс в тесте водного лабиринта Морриса Данные выражены количеством стратегий поиска (N=17-20), Р 0,01, v.s. ложнооперированная группа; М: периферийный режим, R: беспорядочный режим; Т: направленный режим; L: линейный режим. 2. Влияние dl-PHPB на СОД, ChAT активность и уровень МДА в ткани мозга перманентных ВССАО крыс СОД играет важную роль в сохранении окислительного баланса, является антиоксидантом с действием по перехвату свободных радикалов. Однако МДА является важным пероксидом. Активность СОД и уровень МДА отражали уровень антиокисления в ткани мозга. После поведенческого тестирования крыс умерщвляли и измеряли активности ChAT, СОД и МДА в коре головного мозга и гиппокампе. Результаты показаны на фиг. 4. В коре головного мозга 2-VO крыс СОД активность (77,398,70 U/mg белка) была заметно выше, чем у ложнооперированной группы (35,035,20 U/mg белка, Р 0,001), и уровень МДА повысился от 0,690,06 нмоль/мг белка в ложнооперированной группе до 1,310,22 нмоль/мг белка у 2VO крыс (Р 0,001). dl-РНРВ в дозе 13 и 39 мг/кг и 600 мг/кг пирацетама значительно облегчали увеличение СОД активности у 2-VO крыс. Между тем, обработка dl-PHPB в дозах 13, 39 и 129 мг/кг уменьшала МДА уровень в коре головного мозга 2-VO крыс. Однако, 600 мг/кг пирацетама не оказало значительного влияния на МДА в коре головного мозга 2-VO крыс. Более того, не наблюдалось значительного влияния dl-PHPB и пирацетама на СОД активность и МДА уровень в гиппокампе 2-VO крыс. Ацетилхолин является нейротрансмиттером в центральной нервной системе, опосредованным передачей импульсов холинергическими нервами. Ацетилхолин тесно связан с обучением и памятью и синтезируется с помощью ChAT. Таким образом, активность ChAT может косвенно отражать уровни ацетилхолина и отражать статус холинергической функции. У крыс с перманентной окклюзией билатеральной общей сонной артерии в течение 1 месяца ChAT активность значительно уменьшалась (снижение 24%) в гиппокампе 2-VO крыс по сравнению с ложнооперированной группой. После введения dlPHPB в дозе 129 мг/кг в течение 21 дней активность ChAT значительно увеличилась в гиппокампе(Р 0,05). Однако введение dl-PHPB в дозе 13, 39 мг/кг и 600 мг/кг пирацетама не оказало значительного влияния на активность ChAT в гиппокампе 2-VO крыс (фиг. 4 С). В коре головного мозга dl-PHPB и пирацетам не влияли на ChAT активность (данные не показаны). В заключение, dl-PHPB может понижать СОД активность и также снижать уровень МДА в коре головного мозга 2-VO крыс. Результаты показали, что dl-PHPB может ослаблять нарушение объема антиокисления в мозге, тормозить липидное пероксидирование и восстанавливать баланс окисления. Кроме того, dl-PHPB может улучшать ChAT активность и холинергическую функцию у 2-VO крыс. 3. Действие dl-PHPB на нейрональную морфологию у 2-VO крыс 1) Окрашивание гематоксилин-эозином (НЕ) При окрашивании гематоксилин-эозином (НЕ) в цитоплазме и ядре в разные цвета можно четко видеть общую форму клеток. Результаты исследования ложнооперированной группы показали сокращение кортикальных нервных клеток, глубокое окрашивание, ядро не четкое, изменения в гиппокампальных областях СА 1, СА 3 аналогичны, но в меньшей степени, область СА 2 гиппокампа не поражена. dl-PHPB в дозе 39 мг/кг может значительно улучшить кору головного мозга, форму нейронов в полях СА 1 и СА 3 гиппокампа. dl-PHPB в дозе 129 мг/кг может улучшить кору головного мозга и морфологические аномалии нейронов СА 1 поля гиппокампа, и dl-PHPB в дозе 13 мг/кг только минимально улучшает аномальную форму кортикальных нейронов (фиг. 5-7). Более того, dl-PHPB может защищать и оберегать кору головного мозга и нейроны гиппокампа от повреждения, вызванного хронической церебральной гипоперфузией. 2) Окрашивание по Клювер-Баррера Окрашивание по Клювер-Баррера может отражать морфологические изменения нейрональной миелиновой оболочки и отражать морфологические изменения нервных волокон. Было обнаружено, что мозолистое тело и зрительный тракт показали четкую вакуолизацию и повреждения нервных волокон у ложнооперированной группы. dl-PHPB значительно уменьшает патологическое повреждение мозолистого тела, уменьшает вакуолизацию и восстанавливает расположение нервных волокон, при этом самой сильной является доза 39 мг/кг dl-PHPB, средней 129 мг/кг dl-PHPB, самой слабой 13 мг/кг dl-PHPB (фиг. 8). dl-PHPB в дозе 39 мг/кг также уменьшает патологические изменения зрительного тракта (фиг. 9). Эти результаты предполагают, что dl-PHPB может значительно защищать от повреждения мозолистого тела и зрительный тракт у 2-VO крыс. 4. Влияние dl-PHPB на экспрессию GFAP-положительных астроцитов у 2-VO крыс Церебральное поражение, вызванное гипоперфузией, может являться основой для повреждения пространственного обучения и памяти. При этом вначале повреждение белого вещества сопровождается увеличением астроцитов и активацией микроглии. Иммуногистохимическое окрашивание на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) можно использовать для выявления активированных астроцитов. Делали 2-3 фото выбранных срезов в каждой области, записывали количество астроцитов на каждой микрофотографии с фиксированным размером и рассчитывали среднее значение для области. Для наблюдения было выбрано четыре области: кора головного мозга, мозолистое тело и зрительный тракт. Результаты показали, что количество GFAP-положительных клеток увеличивается в коре головного мозга 2-VO крыс (16,96,9), но статистически незначимо. Между тем, после введения в течение 21 дня dlPHPB и пирацетама GFAP-положительных клеток были значительно меньше, чем в группе, получающей носитель, в частности dl-PHPB в дозе 39 мг/кг показал самый значительный эффект (Р 0,01) (фиг. 12 А). В гиппокампе количество GFAP-положительных клеток увеличились у 2-VO крыс (26,85,5) по сравнению с ложнооперированной группой (12,03,0, Р 0,01). Между тем, после введения в течение 21 дня dlPHPB и пирацетама количество GFAP-положительных клеток было значительно меньше, чем в группе,получающей носитель (Р 0,05 или Р 0,01), в частности dl-PHPB в дозе 39 мг, 129 мг/кг показал значительный эффект (Р 0,01) (фиг. 10 и 12 В). В мозолистом теле не было значительного различия между ложнооперированной группой и группой, получающей носитель, но dl-PHPB в дозе 39 мг/кг значительно понижал уровень GFAP-положительных клеток (Р 0,05) (фиг. 12 С). В зрительном тракте количествоGFAP-положительных клеток значительно увеличивалось у 2-VO крыс (4,40,7) по сравнению с ложнооперированной группой (0,80,3, Р 0,01). Между тем, после введения в течение 21 дней dl-PHPB в дозе 39 мг/кг и пирацетама GFAP-положительных клеток было значительно меньше, чем в группе, получающей носитель (Р 0,05 или Р 0,01) (фиг. 11 и 12D). Как описано выше, dl-PHPB может значительно уменьшать церебральное повреждение у 2-VO крыс и уменьшать количество активированных астроцитов, особенно в гиппокампе, зрительном тракте и коре головного мозга, и самым сильной является доза 39 мг/кг dl-PHPB, средней 129 мг/кг dl-PHPB, самой слабой 13 мг/кг dl-PHPB. 5. Влияние dl-PHPB на экспрессию BDNF у 2-VO крыс Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) может поддерживать выживаемость и развитие нейронов, присутствующих в нормальных тканях мозга животных, но также имеет высокую экспрессию на ранней стадии ишемии, хотя общая экспрессия снижается через 24 ч. Анализ с помощью иммуногистохимии уровня BDNF не показал значительного различия в коре головного мозга и гиппокампе у групп, обработанных препаратом, и группы, получающей носитель (данные не показаны). Однако на основании интенсивности окрашивания экспрессия BDNF была значительно снижена в коре головного мозга или гиппокампе у 2-VO крыс по сравнению с ложнооперированной группой. В коре головного мозга dl-PHPB может увеличивать экспрессию BDNF, при этом доза 39 мг/кг dl-PHPB является самой сильной, 129 мг/кг dl-PHPB средней, 13 мг/кг dl-PHPB самой слабой (фиг. 13 и 17). При введении dlPHPB в дозе 39 мг/кг значительно увеличивалась экспрессия BDNF (Р 0,05 или Р 0,01) в областях СА 1,СА 2, СА 3 гиппокампа, и при введении dl-PHPB в дозе 129 мг/кг отмечалась лишь тенденция к увеличению BDNF, которое являлось статистически незначимым (фиг. 14-17). Так как интенсивность окраски пропорциональна количеству BDNF, интенсивность окраски более точно отражает содержание BDNF,чем окрашенная область внутри определенного диапазона, не учитывающая глубину окраски. Эти результаты предполагают, что dl-PHPB может увеличивать уровни BDNF в ткани мозга 2-VO крыс. Пример 2. Изучение А(25-35)-индуцированной деменции у крыс: dl-PHPB улучшает память и способность к пространственному обучению А(25-35)-индуцированной деменции у крыс 1. Материалы и методыdl-PHPB был предложен департаментом медицинской синтетической химии нашего института. dl- 15022309PHPB растворяли в PBS. А(25-35) приобретали у компании SIGMA. Уровни СОД, ChAT и МДА активностей определяли с помощью коммерческих наборов для колориметрического анализа (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China). Содержание белка в супернатанте определяли методом Бредфорда с использованием BSA в качестве стандарта. 2. Оборудование Аппарат водного лабиринта был разработан Institute of Material Medica, Chinese Academy of MedicalSciences. Инструмент для маркировки ферментов (MQX 200) был приобретен у компании Bio Tek Instruments. Машина парафинового среза (IR2135) была приобретена у компании German Leica со., LTD. Машина с термостатическим морозильным отделением (620-Е) была приобретена у компании UK Shandon со., LTD. Автоматическая микрофотографическая система (Nikon ECLIPSE 80i) была приобретена у компании Japanese Nikon Corportion. 3. Создание модели А(25-35)-индуцированной деменции у крыс Модель А (25-35)-индуцированной деменции у 10-месячных крыс линии Male Wistar массой 600 г создавали медленной инъекцией 15 нмоль (объем 5 мкл) агрегатов А (25-35). Ложнооперированной группе вводили только PBS (объем 5 мкл). После операции животным вводили 200 000 единиц пенициллина в течение 4 дней интраперитонеально. 4. Лечебные группы и введение лекарственного препарата Крыс разделяли на четыре экспериментальные группы произвольным способом (10 крыс/каждая группа): ложнооперированная группа, контрольная группа, получающая носитель, и две группы, обработанные dl-PHPB (39 и 129 мг/кг). Через 1 день после операции крысам в течение 14 дней (один раз/каждый день) перорально вводили лекарственные препараты и носитель. Способность к пространственному обучению и памяти у крыс определяли с помощью водного лабиринта Морриса через 9-12 дней после операции. Тестирование водным лабиринтом Морриса проводили через 40 мин после обработки лекарственными препаратами. Биохимический и патологический анализы проводили позже (через 24 ч) после тестирования поведения. График эксперимента показан на фиг. 26. 5. Водный лабиринт Морриса Навигационный тест выполняли после ICV инфузии А (25-35) в течение 9-12 дней таким же методом, как описано ранее. На тринадцатый день платформу удаляли, и крысам позволяли искать платформу в течение 30 с (пробный тест). Фиксировали время пребывания крыс в квадранте платформы и латентный период пересечения расположения платформы для измерения способности к пространственному обучению без влияния случайных столкновений с платформой. 6. Биохимический анализ Методы аналогичны представленным ранее. 7. Статистический анализ Результаты выражали как среднее SEM. Данные обучающего пробного теста в водном лабиринте Морриса анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для определения различия между группами и с течением времени. Апостериорный post hoc анализ методом Даннета использовали для анализа различия между двумя группами. Обучающий тест, биохимический анализ и иммуногистохимический анализ были статистически проанализированы с помощью двухфакторного анализа ANOVA с последующим post hoc методом Даннета. Результаты показали значительное различие при величине р меньше 0,05. Результаты 1. dl-PHPB значительно уменьшал А (25-35)-индуцированные нарушения в пространственном обучении и кратковременной памяти у крыс. В навигационном тесте крыс обучали в течение 4 дней. Латентность каждой группы постепенно понижалась, что свидетельствовало о росте способности к запоминанию расположения скрытой платформы в каждой группе. В первый день не было значительного различия в каждой группе. Но тенденция к удлинению латентности спасения в группе, получающей носитель, была выше, чем в ложнооперированной группе. На второй день тенденция к сокращению латентности спасения в группе, обработанной dl-PHPB (39 мг/кг),была выше, чем в ложнооперированной группе (Р 0,05). С 3 по 4 день латентность спасения в группе,получающей носитель, была значительно длиннее, чем в ложнооперированной группе (Р 0,05). Однако латентность спасения в группе, обработанной dl-PHPB (129 мг/кг), была значительно короче, чем в группе, получающей носитель (Р 0,05 или Р 0,01). Латентность спасения в группе, обработанной dl-PHPB(39 мг/кг), была короче, чем в группе, получающей носитель. Результаты показали, что dl-PHPB может снижать латентность спасения в модели А (25-35)-индуцированной деменции дозозависимым образом. А именно dl-PHPB может улучшать способность к обучению и памяти в модели А (25-35)-индуцированной деменции (фиг. 18). За 4 дня обучения скорость плавания крыс в каждой группе значительно не отличалась (данные не показаны), свидетельствуя о том ICV инфузия А (25-35) не влияет на физическую силу крыс. Тест водного лабиринта может надежно отражать способность к обучению и памяти у животных. В пробном тесте животные группы, получающей носитель, показали значительно меньший процент времени пребывания в целевом квадранте (21,61,6%), чем ложнооперированная группа (32,84,0%,Р 0,05), и группа, обработанная dl-PHPB (129 мг/кг), показала значительное увеличение процента времени пребывания в целевом квадранте (30,22,5%) по сравнению с группой, получающей носитель(Р 0,05), при этом группа, обработанная dl-PHPB (39 мг/кг), показала тенденцию к более длинному времени пребывания (24,63,0%), чем группа, получающая носитель (фиг. 19 А). dl-PHPB может увеличивать процент времени пребывания в целевом квадранте дозозависимым образом. Животные группы, получающей носитель, показали тенденцию к более длительному времени первого пересечения положения платформы, чем ложнооперированная группа. По сравнению с ложнооперированной группой, обработанная dl-PHPB группа показала тенденцию к более короткому времени первого пересечения платформы. Если число животных в каждой группе увеличивали, время первого пересечения платформы может значительно различаться (фиг. 19 В). В заключение, dl-PHPB может ослаблять нарушение кратковременной памяти и пространственного обучения в модели А (25-35)-индуцированной деменции у крыс дозозависимым образом. 2. Влияние dl-PHPB на СОД, ChAT активность и МДА уровень клеток мозга при деменции крыс СОД играет важную роль в сохранении баланса свободных радикалов, может эффективно устранять свободные радикалы кислорода и снижать окислительное повреждение. МДА является важным пероксидом. Активность СОД может отражать уровень антиокисления в ткани мозга, в то время как уровень МДА в клетках мозга отражает состояние липидной пероксидации. Результаты показали, что СОД активность в модели А (25-35)-индуцированной деменции у крыс значительно выросла на 32%(286,818,3 U/mg белка) по сравнению с ложнооперированной группой (216,914,5 U/mg белка). После перорального введения dl-PHPB в дозах 39 мг/кг и 129 мг/кг в течение 2 недель СОД активность в коре головного мозга уменьшались до 238,232,7 и 185,221,6 U/mg белка, что значительно отличалось(Р 0,01) по сравнению с группой, получающей носитель. dl-PHPB может уменьшать кортикальную СОД активность дозозависимым образом (фиг. 20 А). В гиппокампе СОД активность в модели А (25-35)индуцированной деменции у крыс сильно не различалась, dl-PHPB значительно не улучшал СОД активность. В коре головного мозга уровень МДА в группе, получающей носитель (5,430,55 нмоль/мг белка),значительно увеличился по сравнению с ложнооперированной группой (3,690,52 нмоль/мг белка)(Р 0,05). После перорального введения dl-PHPB в дозах 39 мг/кг и 129 мг/кг в течение 2 недель, уровни МДА в коре головного мозга значительно уменьшались до 3,630,21 и 3,280,25 нмоль/мг белка по сравнению с ложнооперированной группой (Р 0,05 и Р 0,01). Результаты показали, что dl-PHPB может уменьшать кортикальный уровень МДА в модели А (25-35)-индуцированной деменции у крыс дозозависимым образом (фиг. 20 В). Ацетилхолин является нейторансмиттером в центральной нервной системе, опосредованным передачей импульсов холинергических нервов. Ацетилхолин тесно связан с обучением и памятью, и синтезируется с помощью ChAT. Таким образом, активность ChAT может косвенно отражать уровни ацетилхолина и отражать статус холинергической функции. У крыс в модели А (25-35)-индуцированной деменции кортикальная ChAT активность значительно не изменялась по сравнению с ложнооперированной группой. После введения в течение 2 недель dl-PHPB в дозе 39 мг/кг ChAT активность значительно повышалась (Р 0,05), доза 129 мг/кг также имеет сильную тенденцию к увеличению ChAT активности. Результаты показали, что dl-PHPB может улучшать ChAT активность в модели А (25-35)-индуцированной деменции у крыс (фиг. 20 С). В заключение, dl-PHPB может уменьшать СОД активность и уровень МДА в модели А (25-35)индуцированной деменции у крыс дозозависимым образом. dl-PHPB может снижать липидную пероксидацию, восстанавливать нормальное окисление тканей мозга и антиоксидантный гомеостаз. Кроме того,dl-PHPB может увеличивать ChAT активность и улучшать холинергическую функцию в коре головного мозга в модели А (25-35)-индуцированной деменции у крыс. Однако влияние dl-PHPB на кортикальнуюChAT активность у нормальных крыс требует дальнейшего изучения. Пример 3. Изучение мышей линии SAMP8: dl-PHPB улучшает способность к запоминанию и пространственному обучению мышей линии SAMP8 1. Материалы и методыdl-PHPB был предложен департаментом медицинской синтетической химии нашего института. dlPHPB растворяли в PBS. Уровни МДА, СОД, ChAT и ATPase активностей определяли с помощью коммерческих наборов для колориметрического анализа (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China). Содержание белка в супернатанте определяли методом Бредфорд с использованием BSA в качестве стандарта. 2. Оборудование Аппарат водного лабиринта и DTT-2 для прыжков были разработаны Institute of Material Medica,Chinese Academy of Medical Sciences. Инструмент для маркировки ферментов (MQX 200) был приобретен у компании Bio Tek Instruments. Машина парафинового среза (IR2135) была приобретена у компанииGerman Leica со., LTD. Машина с термостатическим морозильным отделением (620-Е) была приобретена у компании UK Shandon со., LTD. Автоматическая микрофотографическая система (Nikon ECLIPSE 80i) была приобретена у компании Japanese Nikon Corportion. 3. Животные 10-месячные самцы линии SAMP8, SPF группы были приобретены у компании Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. 4. Обрабатываемые группы и введение лекарственного препаратаSAMP8 были разделены на три экспериментальные группы произвольным способом: одна контрольная группа, получающая носитель, и две группы, обработанные dl-PHPB (50 и 160 мг/кг). Лекарственные препараты и носитель вводили перорально мышам SAMP8 в течение 35 дней (один раз/каждый день). Способность к пространственному обучению и памяти мышей SAMP8 определяли с помощью водного лабиринта Морриса и DTT-2 аппарата для прыжков через 31-35 дней. Тестирование проводили через 40 мин после обработки лекарственным препаратом. Биохимический и патологический анализы проводили позже (через 24 ч) после тестирования поведения. План эксперимента показан на фиг. 27. 5. Тест на избегание Step downStep downтест на избегание выполняли с использованием камеры для изучения поведения (2215 30 см каждая). Каждая камера для тестирования имеет 3 стенки черного цвета из плексигласа, прозрачную переднюю стенку из плексигласа, решетчатый металлический настил и изолированную платформу (3 см диаметр, 4 см высота), которая расположена в одном углу камеры для тестирования. Металлический настил соединен с выходными разъемами электростимулятора. Для сеанса привыкания каждую мышь осторожно помещали на изолированную платформу и позволяли изучить камеру для тестирования в течение 3 мин перед помещением обратно на платформу. Монофазные импульсы (1 мс, 1 Гц, 36VDC) непрерывно подавали в течение 5 мин во время обучения. Если мышь отступала с платформы на решетчатый настил, мышь подвергалась электрическому шоку до тех пор, пока она не вернется на платформу. Затем, через 24 ч после обучения, мышей помещали на платформу для оценки их долговременной памяти. Электрический шок поставляли в течение 5 мин и фиксировали латентность избегания на решетчатый настил четырьмя лапами в первый раз (латентность избегания) и количество ошибок, сопровождающихся шоком. 6. Водный лабиринт Водный лабиринт состоял из квадратной черной светонепроницаемой пластиковой камеры (8050 20 см), имеющей четыре глухих стороны и терминальную платформу. Когда черный пластиковый лист (1520 см) помещали в разные положения, были разные исходные точки и разное количество глухих сторон. Водный лабиринт заполняли водой при 251 до глубины 12 см. Мышей помещали в разные исходные точки, проводя эксперимент с разным числом глухих сторон. Фиксировали количество ошибок в глухой стороне и время достижения терминальной платформы (латентность спасения). Каждой мыши позволяли оставаться на платформе в течение 5 с и помещали в бассейн, давая 3 мин для нахождения терминальной платформы. Латентность спасения (время для достижения платформы) использовали для оценки выполнения задачи водного лабиринта. Сессии повторяли в течение 4 последовательных дней. 7. Биохимический анализ Способы, аналогичные предыдущим 8. Статистический анализ Результаты выражали как среднее SEM. Данные пробного тестирования в водном лабиринте Морриса анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для определения разницы между группами и с течением времени. Апостериорный post hoc тест методом Даннета использовали для оценки различия между двумя группами. Пробный заплыв, биохимический анализ и иммуногистохимический анализ были статистически анализированы с помощью двухфакторного анализа ANOVA с последующим post hoc тестом методом Даннета. Результаты показали значительное различие при величине р меньше 0,05. Результаты 1. dl-PHPB значительно уменьшал повреждения пространственного обучения и кратковременной памяти SAMP8Step down тест был типичным экспериментом для определения реакции избегания у животных. Реакцию избегания у животных оценивали на основании времени первого избегания (латентность избегания) и количества ошибок, сопровождающихся электрошоком. В первый день обучения dl-PHPB (50 и 160 мг/кг) может значительно уменьшить количество ошибок, сопровождающихся электрошоком(5,80,5, 4,90,5 Vs 8,30,6), дозозависимым образом (Р 0,01 и Р 0,001). На второй день dl-PHPB также значительно уменьшал число ошибок, сопровождаемых электрошоком (3,40,3, 2,10,3) по сравнению с группой, получающей носитель (4,60,3) (Р 0,05 и Р 0,01). Также, dl-PHPB может значительно увеличивать латентный период избегания (5,50,8, 10,22,4) дозозависимым образом по сравнению с группой,получающей носитель (0,70,2) (Р 0,01) (фиг. 21). Результаты экспериментов показали, что dl-PHPB (50 и 160 мг/кг) может усилить активную и пассивную реакцию избегания, улучшая способность к обучению и памяти. Тест водного лабиринта обычно используют для определения способности к кратковременной памяти и пространственному обучению у мышей. Способность к обучению и памяти оценивали на основании количества ошибок в глухой стороне и времени достижения терминальной платформы (латентность спасения). В этом исследовании первое и второе обучение и сессии тестирования включали 2 и 3 глухих стороны соответственно. Однако, существует четыре глухих стороны с третьего до пятого обучения и сессий тестирования. Во время первых трех обучений, dl-PHPB не оказал значительного влияния на количество ошибок SAMP8 в глухой стороне по сравнению с группой, получающей носитель. В последующих трех обучениях dl-РНРВ уменьшал количество ошибок в глухой стороне SAMP8 по сравнению с группой, получающей носитель. dl-PHPB значительно уменьшал количество ошибок в глухой сторонеSAMP8 в четвертом обучении по сравнению с группой, получающей носитель. В пятом тесте количество ошибок в глухой стороне у SAMP8, обработанных dl-PHPB (соответственно 3,10,9 и 2,70,3), было значительно меньше, чем у группы, получающей носитель (6,11,1) (Р 0,05). В первом и втором обучении латентный период реакции избегания каждой группы значительно не отличался. В третьем обучении dl-PHPB показал тенденцию к уменьшению латентного периода реакции избегания. Однако в четвертом обучении dl-PHPB в дозе 160 мг/кг значительно уменьшает латентное время реакции избегания (Р 0,05). В последнем тесте dl-PHPB в дозах 50 и 160 мг/кг значительно уменьшает латентное время реакции избегания (Р 0,01) по сравнению с группой, получающей носитель(фиг. 22). Таким образом, dl-PHPB может уменьшить нарушения пространственного обучения и памятиSAMP8. Таким образом, dl-PHPB в дозах 50 и 160 мг/кг может значительно улучшить кратковременную память и способность к пространственному обучению SAMP8 дозозависимым образом. 2. Влияние dl-PHPB на СОД активность и МДА уровень тканей мозга SAMP8 СОД играет важную роль в сохранении баланса свободных радикалов, может эффективно устранять свободные радикалы кислорода и уменьшать окислительное повреждение. МДА является важным пероксидом. Активность СОД может отражать уровень антиокисления в ткани мозга, в то время как уровень МДА в клетках мозга отражает степень липидной пероксидации. Результаты показали, что СОД активность SAMP8 составила 279,465,7 U/mg белка в гиппокампе. После перорального введения dl-PHPB в дозе 50 и 160 мг/кг в течение 35 дней, СОД активности в гиппокампе уменьшались до 156,27,8 и 158,711,4 U/mg белка, и обе имели значительное различие (Р 0,05) по сравнению с группой, получающей носитель. dl-PHPB может уменьшать СОД активность в гиппокампе дозозависимым образом (фиг. 23 А). В коре головного мозга СОД активность при обработке dl-PHPB в течение 35 дней значительно не улучшилась. После перорального введения dl-PHPB в дозах 50 и 160 мг/кг в течение 35 дней, уровни МДА в гиппокампе составили 1,230,05 и 1,260,09 нмоль/мг белка, уменьшенные на 35,3 и 33,7% по сравнению с SAMP8, но статистически незначительно (фиг. 23 В). В коре головного мозга уровень МДА при обработке dl-РНРВ в течение 35 дней значительно не улучшился (данные не показаны). Результаты показали, что dl-PHPB может уменьшать нарушение степени антиокисления в мозге,уменьшать образование липидной пероксидации и восстанавливать окислительный баланс. 3. Влияние dl-PHPB на ChAT и AChE активность тканей мозга и АТР уровень митохондрии в коре головного мозга SAMP8. Ацетилхолин является нейротрансмиттером в центральной нервной системе, опосредованным передачей импульсов холинергическим нервом. Ацетилхолин тесно связан с обучение и памятью, и синтезируется при участии ChAT. Таким образом, активность ChAT косвенно отражает уровни ацетилхолина и отражает состояние холинергической функции. После введения dl-PHPB в течение 35 дней значительно увеличилась ChAT активность (Р 0,05) в гиппокампе дозозависимым образом (фиг. 24 А). В коре головного мозга dl-PHPB значительно не улучшал ChAT активность (данные не показаны). Результаты показали, что dl-PHPB может улучшать ChAT активность SAMP 8 (фиг. 24 В). АТРаза митохондрий играет ключевую роль в функции митохондрий. После перорального введенияdl-PHPB в дозах 50 и 160 мг/кг в течение 35 дней, dl-PHPB в дозе 160 мг/кг значительно повысило АТРазную активность (9,820,51 U/mg белка) по сравнению с группой, получающей носитель (8,580,21U/mg белка). Однако введение dl-PHPB в дозе 50 мг/кг не показало значительного различия (фиг. 24 С). В заключение, dl-PHPB может увеличивать ChAT активность в гиппокампе SAMP8 дозозависимым образом. Результаты показали, что dl-PHPB может улучшать холинергическую функцию путем повышения содержания Ach у гиппокампе SAMP8. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение dl-2-(1-гидроксипентил)бензоата калия (РНРВ) для предупреждения, ослабления и лечения старческого слабоумия или его симптомов, где старческое слабоумие или его симптомы вклю- 19022309 чают потерю памяти, когнитивную дисфункцию, медленный мыслительный процесс или дезориентацию в пространстве. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что старческое слабоумие включает болезнь Альцгеймера, сосудистую деменцию или смешанную форму обоих типов. 3. Применение фармацевтической композиции, содержащей dl-2-(1-гидроксипентил)бензоат калия(РНРВ) в дозе, эффективной для предупреждения или лечения, а также фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные средства, для предупреждения, ослабления и лечения признаков слабоумия,которые включают потерю памяти, когнитивную дисфункцию, медленный мыслительный процесс или дезориентацию в пространстве. 4. Применение по п.3, отличающееся тем, что признаки слабоумия включают болезнь Альцгеймера,сосудистую деменцию или смешанную форму обоих. 5. Применение по п.3, где композиция может быть приготовлена в виде следующих составов на основе режима введения: раствор, суспензия, таблетка, капсула, порошок, препарат с контролируемым или замедленным высвобождением. 6. Способ предупреждения, ослабления и лечения признаков слабоумия, включающий введение dl2-(1-гидроксипентил)бензоата калия в дозе, эффективной для предупреждения или лечения. 7. Способ предупреждения, ослабления и лечения признаков слабоумия, включающий введение композиции, охарактеризованной в п.3. 8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что признаки слабоумия включают болезнь Альцгеймера, сосудистую деменцию или смешанную форму обоих. 9. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что признаки слабоумия включают потерю памяти, когнитивную дисфункцию, медленный мыслительный процесс или дезориентацию в пространстве. 10. Способ по п.6, отличающийся тем, что композицию вводят парентерально, орально, фокально,внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, интраназально. 11. Способ по п.6, отличающийся тем, что эффективная для лечения доза dl-2-(1-гидроксипентил)бензоата калия составляет от 0,5 до 200 мг/кг массы тела, оптимально 1-150 мг/кг массы тела,более предпочтительно 2-100 мг/кг массы тела, более предпочтительно 3-50 мг/кг массы тела, еще более предпочтительно 4-35 мг/кг массы тела и еще более предпочтительно 5-20 мг/кг массы тела.