Способ лечения болезни альцгеймера

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА Изобретение относится к способу лечения болезни Альцгеймера. Способ включает внутривенное введение терапевтически эффективного количества эпотилона D пациенту, нуждающемуся в этом,причем вводимая пациенту накопленная месячная доза эпотилона D составляет от 0,01 до 5 мг/м 2. Способ обеспечивает хорошее проникновение в мозг эпотилона D, его длительное полувыведение из мозга и высокое избирательное задерживание в мозге, что обеспечивает эффективную терапию при лечении болезни Альцгеймера, не вызывая индуцированных лекарством побочных эффектов,которые потребовали бы прекратить лечение эпотилоном D. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к лечению болезни Альцгеймера с применением эпотилона D. Предпосылки создания изобретения Болезнь Альцгеймера (БА) является самой распространенной формой деменции, которой по оценкам специалистов в 2006 г. страдали 27 млн человек во всем мире. Наиболее известным фактором риска для БА является возраст, поскольку частота этого заболевания среди лиц в возрасте 85 лет и старше достигает 25-50%. Поскольку средний возраст населения увеличивается, можно ожидать экспоненциального роста числа пациентов с БА. Болезнь Альцгеймера является пятой из ведущих причин смертности у людей в возрасте 65 лет и старше, при этом большинство пациентов в конечном итоге нуждаются в сестринском уходе и обслуживании на дому или в лечебнице для престарелых. Вследствие этого БА имеет огромное экономическое влияние, например, по оценкам за 2005 г. прямые и непрямые затраты, связанные с этим заболеванием только в США составили 148 миллиардов долларов. Помимо экономических затрат БА оказывает разрушительное воздействие на пациентов и членов их семей, вызывая тяжелые эмоциональные страдания и панику. Диагноз вероятности БА у пациентов устанавливают при наличии пресенильной деменции с прогрессирующим ухудшением памяти и других когнитивных функций, исключив другие причины деменции. Диагноз БА можно подтвердить лишь посмертно, поскольку клинический диагноз основан на нейропатологии головного мозга, а специфический диагноз требует оценки мозговой ткани, включая наличие и концентрацию внеклеточных бляшек в мозге, внутриклеточных клубков и нейродегенерации мозга. Деменция также является необходимой частью диагноза, поскольку бляшки и клубки наблюдаются у когнитивно нормальных взрослых людей, хотя, как правило, в меньшей степени. Для лечения БА в настоящее время официально разрешено применение двух классов лекарств: ингибиторов холинэстеразы и антагонистов N-метил-D-аспарагиновой кислоты (HMDA). Несмотря на то что эти два класса терапевтических средств демонстрируют некоторую пользу на клиническом уровне,многие пациенты не реагируют на них, и эти лекарства всего лишь облегчают симптомы БА (например,спад когнитивной функции), не оказывая никакого влияния или оказывая незначительное влияние на прогрессирование болезни. По этим соображениям выявление терапевтических средств, модифицирующих течение этого разрушительного заболевания, является большой задачей, находящейся в центре внимания фармацевтической индустрии. Стабилизаторы микротубул были предложены в качестве терапевтических средств лечения таупатий, включая БА (см., например, Lee с соавт. (список ссылок, ниже. Патент США 5580898, зарегистрированный в мае 1994 г. и выданный 3 декабря 1996 г. группе авторов во главе с Trojanowski, предлагает использование паклитаксела (TAXOL) для лечения пациентов с БА посредством стабилизации микротубул. Было доказано, что паклитаксел является высокоэффективным стабилизатором микротубул при лечении раковых больных, однако при его рассмотрении в качестве терапевтического средства лечения БА (что будет описано ниже) были обнаружены такие проблемы, как проникновение в мозг и периферическая нейропатия, поэтому выяснилось, что терапия БА паклитакселом нежизнеспособна. В 1995 г. появилось сообщение о том, что эпотилон В проявляет стабилизирующее воздействие на микротубулы, сходное с эффектом паклитаксела (Bollag с соавт., 1995). Эпотилон А и эпотилон В представляют собой природные соединения, которые были выделены Hofle с соавт. из продуктов брожения,вызываемого микроорганизмом Sorangium cellulosum (например, WO 93/10121). Hofle с соавт. также были открыты 37 природных вариантов эпотилона и родственных соединений, вырабатываемых S. cellulosum и модифицированными штаммами, включая эпотилоны С, D, E, F и другие изомеры и варианты (например, патент США 6624310). Уникальные свойства природных эпотилонов породили большой интерес к их применению в качестве потенциальных противораковых лекарств. С момента открытия природных эпотилонов А и В прошло уже почти двадцать лет. В различных патентных заявках были раскрыты и описаны сотни аналогов эпотилона, а под заглавием эпотилоны в литературе опубликовано множество данных (см., например,Altmann с соавт., список ссылок, ниже, с. 396-423). Заявитель настоящей заявки разработал иксабепилон, полусинтетический аналог эпотилона В, для лечения рака. Иксабепилон имеет структурную формулу Химическое название иксабепилона (1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)-7,11-дигидрокси-8,8,10,12,16-пентаметил-3-[(1E)-1-метил-2-(2-метил-4-тиазолил)этенил]-17-окса-4-азабицикло[14.1.0]гептадекан-5,9-дион. См. также патент США 6605599, выданный компании Bristol-Myers Squibb (BMS). Иксабепилон является агентом, стабилизирующим микротубулы, применение которого было разрешено FDA для лечения метастатического рака молочной железы и который выпускается компанией BMS под торговым названием IXEMPRA. Изготовление иксабепилона описано в патентах США 6605599 и 7172884,включенных в этот документ в качестве ссылки. Другие природные эпотилоны и аналоги проходят интенсивные клинические испытания для лечения рака, включая эпотилон В (а/k/а патупилон или ЕРО-906) в испытаниях III фазы, проводимых компанией Novartis Pharma AG для лечения рака яичников, и сагопилон (или ZK-EPO), бензотиазолил 7 пропениловый синтетический аналог эпотилона В, в испытаниях II фазы, проводимых компанией BayerSchering AG для лечения различных раковых заболеваний, включая опухоли яичников, молочной железы, легких, предстательной железы и меланому. В 2007 г. в США было начало испытание II фазы с сагопилоном по лечению метастазов рака молочной железы в головной мозг. В дополнение к этому, аналог эпотилона D, KOS-1584, продвинулся до II фазы клинических испытаний, проводимых компанией KosanBiosciences, Inc. (ныне филиал BMS на правах полной собственности) по лечению немелкоклеточного рака легких и солидных опухолей, а эпотилон D продвинулся до II фазы клинических испытаний по лечению рака, проводимых компанией Kosan в сотрудничестве с Hoffmann-La Roche, Inc.; однако клинические испытания эпотилона D при лечении рака были прекращены в 2007 г. Структура эпотилона D может быть представлена следующей формулой: Соединение под названием эпотилон D было заявлено как патентоспособная композиция в заявке на патент США под серийным номером 09/313524 (Hofle с соавт.) и описано в патентах США 6242469 и 6284781 группой авторов Danishefsky с соавт. Заявитель настоящей заявки также проводил клиническую оценку BMS-310705 (соединение II в настоящем документе) для терапии рака. BMS-310705 был исследован в клиническом испытании I фазы по лечению рака яичников; он является аналогом аминоэпотилона F и имеет химическую структуру Соединение II (BMS 310705) было изготовлено в соответствии с описанием в патенте США 6262094, включенном в этот документ в качестве ссылки. Хотя некоторые соединения и аналоги эпотилона были клинически исследованы при лечении раковых заболеваний, очень трудно предсказать, будет ли противораковое лекарство эффективным при его применении для лечения нейродегенеративных заболеваний, включая БА. Существуют различные факторы, влияющие на эту непредсказуемость. Одним из таких факторов является то, что очень трудно достичь хорошего проникновения лекарства в мозг из-за наличия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Для соединения, потенциально полезного для лечения нейродегенеративных заболеваний мозга, необходимо, чтобы такое соединение проходило через ГЭБ, однако, поскольку функция ГЭБ заключается в защите мозга от поступающих извне веществ и токсинов, открытие полезного лекарства, способного хорошо проходить через ГЭБ, представляет собой серьезную проблему. В дополнение к этому, проникновение через ГЭБ считается нежелательным для противораковых лекарств (за исключением лекарств против раковых опухолей мозга). Для противоракового лекарства прохождения через ГЭБ обычно стараются избежать, тогда как для лекарства, предназначенного для лечения БА или других нейродегенеративных заболеваний мозга, хорошее проникновение через ГЭБ необходимо, чтобы соединение могло быть эффективным. Так, например, несмотря на то что паклитаксел является высокоэффективным противораковым лекарством, он не стал полезным средством для лечения заболеваний мозга, таких как БА, поскольку обладает очень низкой способностью проникновения в мозг через ГЭБ. Другие факторы, влияющие на непредсказуемость оценки полезности противораковых лекарств,особенно стабилизаторов микротубул, для лечения БА и других заболеваний мозга, включают способность лекарства проникать в мозг, задерживаться в мозге длительное время и избирательно накапливаться в мозге по сравнению с периферийными тканями. Эти параметры можно измерить, используя соотношения между мозгом и плазмой, период полувыведения из мозга и соотношение между количеством лекарства, задерживающегося в мозге и его количеством в периферических тканях (в особенности, в печени). В дополнение к этому, измерение проникновения в мозг, удержания и избирательного накопления в мозге для стабилизаторов микротубул сложно, поскольку эти соединения, как правило, быстро выводятся из плазмы, но медленнее выводятся из тканей, содержащих микротубулы, в связи с чем важно установить адекватное временное окно для сравнений уровня таких лекарств в плазме и тканях. Измерение со-2 021758 отношения между мозгом и периферическими тканями особенно важно, учитывая то обстоятельство, что агенты, стабилизирующие микротубулы, в определенных дозах высоко токсичны для периферических тканей: когда агенты, стабилизирующие микротубулы, например, паклитаксел, вводят в химиотерапевтических дозах, могут наблюдаться периферическая невропатия и другие побочные эффекты (Postma с соавт., 1999). Эти побочные эффекты могут быть приемлемыми при лечении раковых больных, но для больных, страдающих БА или другими заболеваниями мозга, существует другое терапевтическое окно и другой профиль приемлемых побочных эффектов. Другие проблемы, возникающие при рассмотрении потенциала применения противораковых лекарств для лечения нейродегенеративных заболеваний, включают способ введения и связанные с ними биологическую доступность и цитотоксичность. В патенте WO 2005/075023 А 1, опубликованном 30 января 2004 г. группой авторов Andrieux с соавт. из INSERM, высказано предположение о том, что некоторые эпотилоны и их аналоги, включая эпотилон А, В, С, D, Е и F, бензотиазолил и аналоги пиридилэпотилон В и D могут быть полезными при лечении заболеваний, связанных с дефектом взаимодействия нейронов, таких как шизофрения или аутизм. Однако позже Andrieux с соавт. отказались от этой идеи и стали высказываться против применения этих соединений для лечения БА, утверждая, что заболевания, связанные с дефектами взаимодействия нейронов (т.е. с заболеваниями, упоминаемыми в этой заявке) отличаются от заболеваний с прогрессирующей деменцией, таких как болезнь Альцгеймера, которые связаны с дегенерацией нейронов. В патентной заявке WO 03/074053 ('053), опубликованной 12 сентября 2003 г. группой авторовLichtner с соавт. из компании Schering AG, приведена широкая формула изобретения по применению обширного семейства соединений эпотилона и их синтетических аналогов для лечения рака мозга и других заболеваний мозга, включая первичные опухоли мозга, вторичные опухоли мозга, рассеянный склероз и БА. Lichtner с соавт. приводят в своей публикации некоторые данные по четырем соединениям, а именно по паклитакселу в сопоставлении с соединениями, поименованными в настоящем документе как соединение 1: 4,8-дигидрокси-16-(1-метил-2-(2-метил-4-тиазолил)этенил)-1-окса-7-(1-пропил)-5,5,9,13 тетраметилциклогексадек-13-ен-2,6-дион; соединение 2: дигидрокси-3-(1-метил-2-(2-метил-4-тиазолил)этенил)-10-пропил-8,8,12,16-тетраметил-4,17-диоксабицикло[14.1.0]гептадекан-5,9-дион и соединение 3: 7,11-дигидрокси-3-(2-метилбензотиазол-5-ил)-10-(проп-2-ен-1-ил)-8,8,12,16-тетраметил-4,17-диоксабицикло[14.1.0]гептадекан-5,9-дион (см. публикацию WO '053 на с. 21). Следует отметить, что Lichtner с соавт. приводят данные о концентрации трех указанных выше аналогов эпотилона в мозге и плазме, но только в периоды, не превышающие 40 мин. Lichtner с соавт. не смогли привести сравнительные данные с паклитакселом по уровням в мозге и плазме, поскольку у них уровень паклитаксела в мозге был ниже уровня выявления, а также не смогли привести данные по соотношению концентраций между мозгом и печенью, времени полувыведения или удержания в мозге для любого из соединений (например, по концентрации лекарства с ткани мозга на протяжении длинных периодов времени). Ввиду вышеупомянутого, в данной области техники сохраняется потребность в способах лечения таупатий, особенно болезни Альцгеймера. Сущность изобретения Авторы настоящего изобретения на основе многих исследований in vivo, включая поведенческие и невропатологические исследования, обнаружили, что эпотилон D достигает неожиданно выгодного профиля при лечении тау-ассоциированных заболеваний, включая БА. Авторы изобретения обнаружили, что эпотилон D демонстрирует замечательную комбинацию выгодных свойств, делающих это соединение особенно подходящим для лечения таких заболеваний. Эти свойства включают не только высокий уровень проникновения в мозг через ГЭБ, но и чрезвычайно длительный период полувыведения из мозга, а также удивительно высокую степень избирательного удержания в мозге по сравнению с уровнем этого лекарства в периферических тканях, особенно в печени, на протяжении длительных периодов времени. В дополнение к этому, авторы изобретения далее обнаружили, что удивительные терапевтические преимущества при лечении тау-ассоциированных заболеваний, особенно БА, могут быть достигнуты с применением низких доз эпотилона D, например таких доз, которые приблизительно в 100 раз меньше, чем дозы, обеспечивающие химиотерапевтический эффект. В результате этого авторы изобретения создали способы, которые основаны на введении пациентам эпотилона D при тау-ассоциированных заболеваниях, особенно при БА, и обеспечивают лечебный эффект, не вызывая индуцированных лекарством побочных эффектов и/или не создавая такой концентрации лекарства в плазме, которая потребовала бы прекратить лечение эпотилоном D. При назначении меньших доз, чем при химиотерапевтическом лечении,любые побочные эффекты в значительной мере уменьшаются по сравнению с теми побочными эффектами, которые индуцируются эпотилонами и их аналогами при лечении рака. Настоящее изобретение предлагает способ лечения болезни Альцгеймера с применением эпотилонаD, который демонстрирует удивительно благоприятный терапевтический профиль, включающий этап введения пациенту терапевтически эффективного количества эпотилона D. Способ лечения демонстрирует терапевтический профиль, включающий хорошее проникновение в мозг, длительный период полувыведения из мозга и избирательное задерживание в мозге (например, высокое соотношение концентраций между мозгом и печенью), как определено в настоящем документе. В соответствии изобретением способ лечения болезни Альцгеймера включает введение терапевтически эффективного количества эпотилона D больному, при этом эпотилон D вводят внутривенно, а накопленная доза эпотилона D в месячном цикле (т.е. общая доза соединения, введенная в течение одного месяца независимо от графика, например, еженедельно, каждые две недели, 3 недели введения, 1 неделя перерыва и т.д.) находится в диапазоне 0,01-5 мг/м 2. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана базовая схема эксперимента на мышах Tg4510 с использованием эпотилона D(соединение I). На фиг. 2 показаны результаты теста водного лабиринта Морриса (MWM) на мышах Tg4510 в возрасте 2,5 месяцев перед введением им доз эпотилона D (соединение I). На фиг. 3 показаны результаты теста водного лабиринта Морриса (MWM) на мышах Tg4510 в возрасте 4,5 месяцев через 2 месяца после введения доз эпотилона D (соединение I). На фиг. 4 показаны 18-часовые данные зондирования после 5 дней тренировки 4,5-месячных мышей Tg4510, которые в течение 2 месяцев получали дозы эпотилона D (соединение I). TQ означает целевой квадрант, AR означает соседний справа, AL означает соседний слева и ОР означает противоположный квадрант. Описаны две меры продуктивности, а именно % длины пути (А) и число пересечений платформы (В). На фиг. 5 показана оценка количества нейронов с участках гиппокампа СА 1 и СА 3 у мышей Tg4510 в возрасте 5,5 месяцев после лечения носителем, 1 мг/кг эпотилона D (соединение I) и 10 мг/кг эпотилонаD (соединение I). На фиг. 6 показано окрашивание фосфорилированного белка Tau в гиппокампе у мышей Tg4510,получавших наполнитель (контроль), 1 мг/кг эпотилона D (соединение I) и 10 мг/кг эпотилона D (соединение I). Показаны репрезентативные срезы от 3 мышей на группу. АТ 8-позитивное окрашивание представлено темно-серым и черным цветом. На фиг. 7 А-7 В показано окрашивание серебром по Gallyas нейрофибриллярных клубков у мышей(соединение I). Фиг. 7 А показывает репрезентативные микрофотографии кортикального окрашивания,где черные пятна серебра являются критерием позитивного окрашивания. У нетрансгенных мышей наблюдалось более светлое фоновое окрашивание и некоторое окрашивание кровеносных сосудов. Фиг. 7 В показывает количественную интерпретацию серебряного окрашивания как в коре, так и в гиппокампе. На фиг. 8A-8D показана концентрация соединения II (фиг. 8 А), иксабепилона (фиг. 8 В), паклитаксела (фиг. 8 С) и эпотилона D (соединение I) (фиг. 8D) в плазме, мозге и печени у мышей, получавших внутривенное введение с различными интервалами до 24 ч. На фиг. 9 показана концентрация эпотилона D (соединение I) и соединения III (как описано в настоящем документе в примере 7) в мозге после перорального введения (35 мг/кг) через некоторое время(от 5 до 24 ч) после введения дозы. На фиг. 10 показана концентрация эпотилона D в плазме, мозге и печени у мышей через некоторое время (до одной недели) после введения дозы. Сокращения Ниже приведены сокращенные обозначения различных терминов, употребляемых в настоящем описании изобретения. 3R = три повтора 4R = четыре повтора БА = болезнь Альцгеймера АРР = белок предшественник -амилоида ГЭБ = гематоэнцефалический барьерFDA = Государственное управление США по контролю за продуктами питания и лекарствамиLLQ = нижний предел количественных колебанийMWM = водный лабиринт Морриса нМ (нМ) = наномолярныйNQ = не поддается количественному определению, т.е.LLQ в одной или более точек сбора данныхTPGS = d-альфа-токоферил полиэтиленгликоль 1000 сукцинат Подробное описание изобретения Определения Термины около или приблизительно при использовании в настоящем документе означают вариабельность в пределах допустимого интервала стандартного отклонения для конкретной величины,что может определить средний специалист, учитывая суть проводимого измерения и инструмент, используемый для проведения этого измерения (т.е. ограничения системы измерений). Например, около может означать в пределах одного или более стандартных отклонений. Применительно к лекарственным рецептурам и дозировкам приблизительно может означать отклонение не более 10%, более предпочтительно не более 5%, еще более предпочтительно не более 2% от указанных величин. Термины по меньшей мере, х, х или более или х или больше, где х означает численную величину, используются в настоящем документе взаимозаменяемо, поскольку они имеют одинаковое значение. Терминологическое определение проникновение в мозг относится к способности вещества проходить через ГЭБ. Из-за быстрого периферического клиренса большинства агентов, стабилизирующих микротубулы, важно измерять соотношения концентраций между мозгом и плазмой в относительно коротком интервале времени после введения дозы, например приблизительно через 20 мин-1 ч после введения дозы, чтобы оценить проникновение в мозг как таковое. Соединение, имеющее хорошее проникновение в мозг, применительно к определению в настоящем документе, означает соединение, которое в интервале от 20 мин до 1 ч после введения дозы будет демонстрировать соотношение концентраций между мозгом и плазмой 0,5 или предпочтительнее более 0,8 или наиболее предпочтительно соотношение 1 или более (опять-таки, в интервале времени от 20 мин до 1 ч после введения дозы). При оценке того, соответствует ли соединение этому стандарту высокого соотношения концентраций между мозгом и плазмой (например, как это изложено в прилагаемой формуле изобретения), приходится полагаться на результаты исследований in vivo, проведенных на животных, поскольку ткань человеческого мозга не подлежит анализу на концентрацию лекарства. Термин когнитивные выгоды означает, что наблюдается или документально подтверждено улучшение когнитивной функции или уменьшение ее спада по меньшей мере у одного пациента, нуждающегося в лечении, что можно охарактеризовать когнитивными тестами, измеряемыми показателями глобальной функции и активностью в повседневной жизни и поведении. Обычно когнитивные выгоды оценивают по результатам когнитивных тестов, позволяющих измерить когнитивный спад у пациента или в группе больных. Примеры таких тестов включают когнитивные тесты типа ADAS-cog (шкала оценок для болезни Альцгеймера, когнитивная подшкала) и MMSE (краткая шкала оценки психического статуса),поведенческие тесты типа NPI (нейропсихиатрический реестр), тесты на активность в повседневной жизни типа ADCS-ADL (кооперативное исследование при болезни Альцгеймера - активность в повседневной жизни) и тесты на глобальную функцию, такие как CIBIC-плюс (впечатление об изменениях,основанное на интервью с клиницистом) и сумма ячеек CDR (клинический рейтинг деменции). Терминологическое определение длительные периоды времени при использовании в настоящем документе означает периоды времени длительностью 24 ч или более, обычно, от 24 до 76 ч. Терминологическое определение высокая степень избирательного удержания или высокое избирательное удержание при использовании в настоящем документе означает, что лекарство или соедине-5 021758 ние задерживается в одной ткани или одном органе, конкретно, в мозге, намного на более высоком уровне, чем в других тканях и органах, особенно в печени, по результатам измерений по истечении длительного периода времени после введения дозы препарата. В особой степени применительно к определению,данному в настоящем документе, высокая степень избирательного удержания означает, что концентрация лекарства в мозге в 4 раза или более раз превышает его концентрацию в печени через 24 ч или более после введения дозы, предпочтительнее, если этот коэффициент составляет 6 или более, и наиболее предпочтительно, если этот коэффициент составляет 8 или более через 24 ч или более после введения дозы. При оценке того, соответствует ли соединение этому стандарту высокого избирательного удержания (например, как это изложено в прилагаемой формуле изобретения), приходится полагаться на результаты исследований in vivo, проведенных на животных, поскольку ткань человеческого мозга не подлежит анализу на концентрацию лекарства. Влияние на основное заболевание означает улучшение измеряемых показателей биомаркеров и других параметров, ассоциированных с процессом заболевания, включая биохимические маркеры в спинномозговой жидкости или плазме, изменения объема мозга, изменения функции мозга по результатам функциональной визуализации и изменения гистопатологических и биохимических показателей,которые можно наблюдать при аутопсии. Типичные биомаркеры, которые могут использоваться в клинических исследованиях при БА, включают анализируемые вещества, измеряемые в спинномозговой жидкости, такие как белки Tau, фосфо-tau, бета-амилоид и изопростаны, а также модульности визуализации мозга, такие как ПЭТ ФДГ (позитронно-эмиссионная томография с использованием фтордезоксиглюкозы) и волюметрическая МРТ. Дополнительные биомаркеры, которые потенциально могут быть полезными, особенно при исследовании синаптической активности, включают, но, не ограничиваясь ими:GABA (ГАМК), нейропептид Y, альфа-синуклеин, нейрогранин и вазоактивный кишечный пептид, тубулин, фрагменты Tau, убиквитинированные белки, растворимые формы белка-предшественника амилоида, хромогранин В, 4-гидроксиноненал, нитротирозин и 8-гидроксидезоксигуангидин. Термин перемежающийся при использовании в отношении графика дозирования означает, что в графике введения доз есть нерегулярные перерывы. Например, согласно этому определению ежедневный, еженедельный, двухнедельный или ежемесячный график введения доз не считается перемежающимся, поскольку интервал между дозами в каждом случае регулярен и определяется циклом введения доз лекарства. Однако перемежающимся будет считаться более сложный график дозирования лекарства с одним или более нерегулярными интервалами, например, 5-дневный прием лекарства и 2-дневный перерыв или введение доз в 1-й, 8-й и 15-й день 30-девного цикла и т.д. Длительный период полувыведения или длительный период полувыведения из мозга при использовании в настоящем документе означает, что лекарство имеет период полувыведения 20 ч или более после введения дозы (что считается независимым от величины дозы), более предпочтительно 30 ч или более после введения дозы и наиболее предпочтительно 40 ч или более после введения дозы. Как и в отношении избирательной степени удержания, при определении того, имеет ли лекарство длительный период полувыведения из мозга, следует полагаться на результаты исследований in vivo на животных. Термин низкая доза при использовании в настоящем документе означает такую дозу соединения эпотилона D, которая значительно меньше дозы, вводимой для достижения химиотерапевтического эффекта (например, учитывая конкретный способ введения, клиническое испытание и/или эксперимент),предпочтительно дозу, которая в 10 раз меньше терапевтической дозы, более предпочтительно дозу, которая в 50 раз меньше, и еще более предпочтительно дозу, которая в 100 раз меньше химиотерапевтической дозы, т.е. меньше той дозы, которая ранее была расценена как химиотерапевтически эффективная при том же способе введения в таком же эксперименте, исследовании или клиническом испытании. Например, во II фазе клинических испытаний эпотилона D вводимая доза лекарства составляла 100 мг/м 2 при 90-минутном вливании один раз в неделю на протяжении трех недель из 4-недельного цикла (3 недели введения лекарства, 1 неделя пропуска), то есть общая накопленная доза составляла 300 мг/м 2 при введении каждые 4 недели. Низкая доза по отношению к этой дозе, использованной в клиническом испытании, в соответствии с данным выше определением будет означать накопленную в течение одного месяца дозу после ВВ вливания 30 мг/м 2 или менее, предпочтительнее дозу 6 мг/м 2 или менее и еще предпочтительнее дозу 3 мг/м или менее. Определение пациент, нуждающийся в лечении при использовании в настоящем документе включает применение эпотилона D: 1) для пациента с уже диагностированным тау-ассоциированным заболеванием (включая таупатию, особенно БА) на любой клинической стадии, включая пациентов в диапазоне от легкого когнитивного расстройства до выраженной деменции, и/или 2) для пациента, который имеет ранние или продромальные симптомы и признаки тау-ассоциированного заболевания (включая таупатию, особенно БА), и/или 3) для пациента, у которого была диагностирована предрасположенность к тауассоциированному заболеванию (включая таупатию, особенно БА) вследствие возраста, наследственных или других факторов, когда курс лечения медицински рекомендован для задержки начала или замедления прогрессирования, ухудшения или утяжеления симптомов/признаков заболевания. Определение статистически значимые когнитивные выгоды означает, что имеются когнитивные выгоды (например, улучшение когнитивной функции или уменьшение ее спада) после шестимесячногогодового периода лечения по меньшей мере у 10% или более пациентов, включенных в оценку, более предпочтительно по меньшей мере у 25% или более пациентов и еще более предпочтительно у 50% или более пациентов в клинической группе. Предпочтительно, чтобы оценивалось улучшение по сравнению с контрольной группой и при этом оно составляло по меньшей мере 10% (например, при оценке, основанной на сравнении балльных тестов между плацебо и контролем, при этом под улучшением подразумевается уменьшение когнитивного спада у пациента), более предпочтительно, чтобы наблюдаемая степень улучшения составляла 25% или более и наиболее предпочтительно 35% или более. Тау-ассоциированное заболевание при определении в настоящем документе означает заболевание, связанное с аномалиями белка Tau, а также заболевание, относящееся к таупатиям. Тауассоциированные заболевания включают, но не ограничиваясь ими, лобно-височную деменцию, включая подтип лобно-височной деменции и паркинсонизма, сцепленный с хромосомой 17 (FTDP-17), прогрессирующий надъядерный паралич, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Пика, болезнь агирофильных гранул, а также болезнь Паркинсона, синдром Дауна, постэнцефалический паркинсонизм, миотоническую дистрофию, болезнь Нимана-Пика С, пугилистическую деменцию, болезнь Блинта, прионные заболевания, боковой амиотрофический склероз, комплекс паркинсонизма-деменции Гуам, рассеянный склероз, глаукому, диабетическую ретинопатию и травматическое повреждение мозга, а также болезнь Гентингтона, болезнь диффузных телец Леви, болезнь Шарко-Мари-Тута, наследственную спастическую параплегию и множественную системную атрофию. Таупатия в соответствии с определением, данном в настоящем документе, означает нейродегенеративное заболевание, связанное с нейрофибриллярными формами белка Tau (клубками) в мозге. Эти заболевания включают БА, а также другие таупатии, включая, но не ограничиваясь ими, лобно-височную деменцию, в том числе, подтип лобно-височной деменции и паркинсонизма, сцепленный с хромосомой 17 (FTDP-17), прогрессирующий надъядерный паралич, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Пика и болезнь агирофильных гранул. Терапевтически эффективное количество эпотилона D означает количество эпотилона D, достаточное для(1) ослабления или облегчения по меньшей мере одного симптома тау-ассоциированного заболевания (предпочтительно таупатии и более предпочтительно БА), включая такие когнитивные функции как деменция, потеря памяти, ослабленное понимание, ловкость в делах повседневной жизни и/или центрально опосредованные эффекты, такие как моторные дефекты и зрение;(2) обратного развития, уменьшения, предупреждения, подавления или задержки начала или ухудшения потери когнитивной функции, связанной с тау-ассоциированным заболеванием (предпочтительно таупатией и более предпочтительно БА), и/или обратного развития, уменьшения, предупреждения, подавления или задержки начала или ухудшения одного или более центрально опосредованных эффектов указанного заболевания, включая моторные дефекты, зрение и так далее. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения фармацевтическое соединение эпотилона D терапевтически эффективно не только для ослабления или облегчения симптомов тау-ассоциированного заболевания (предпочтительно таупатии и более предпочтительно БА), но также эффективно в смысле воздействия на основное заболевание (т.е. заболевание, определенное выше). Альтернативные варианты осуществления изобретения Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эпотилон D, вводимый для лечения тау-ассоциированного заболевания, демонстрирует чрезвычайно высокую степень проникновения в мозг, длительный период полувыведения из мозга и избирательное удержание, особенно по сравнению с другими стабилизаторами микротубул. Далее авторы изобретения обнаружили, что заметно усиленные терапевтические эффекты при лечении тау-ассоциированных заболеваний (особенно таупатий и еще более специфично БА), достигаются при введении низких доз эпотилона D. Как таковые относительно низкие дозы эпотилона D можно вводить для эффективного лечения тау-ассоциированного заболевания, предпочтительно БА. Таким образом, авторы разработали способ лечения болезни Альцгеймера, основанный на введении эпотилона D больному, страдающему БА. Ожидается, что способ будет терапевтически эффективным при лечении БА у пациентов, вызывая при этом значительно менее выраженные и развивающиеся реже побочные эффекты по сравнению с побочными эффектами, которые обычно встречаются при введении пациентам стабилизаторов микротубул для химиотерапии. Те побочные эффекты, которые уменьшаются или устраняются, могут включать одно или более желудочно-кишечных расстройств(включая без ограничений тошноту, диарею, стоматит/мукозит, рвоту, анорексию, запор и/или абдоминальную боль), печеночную токсичность, нейтропению, лейкопению, миелосупрессию, алопецию, миалгию/артралгию, усталость, мышечно-скелетную боль, поражение ногтей, гипертермию, головную боль,шелушение кожи и/или нейросенсорные эффекты разного уровня. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления изобретения предлагается способ лечения болезни Альцгеймера, включающий этап введения терапевтически эффективного количества эпотилона D больному, при этом соединение эпотилона D имеет два или более свойства, выбранных из хо-7 021758 рошего проникновения в мозг, длинного периода полувыведения из мозга и высокой избирательной степени удержания, как определено в настоящем документе, более предпочтительно, если эпотилон D демонстрирует все три свойства, т.е. хорошее проникновение в мозг, длительный период полувыведения из мозга и высокую избирательную степень удержания, в соответствии с тем, как эти термины определены в настоящем документе. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения предлагается способ лечения болезни Альцгеймера, включающий этап введения терапевтически эффективного количества эпотилона D больному, при этом вводимое соединение эпотилона D имеет два или более свойства, выбранные из следующих свойств: проникновение в мозг 0,5 или более, более предпочтительно 0,8 или более, наиболее предпочтительно 1 или более при измерении в интервале от 20 мин до 1 ч после введения дозы; и/или период полувыведения из мозга по меньшей мере 24 ч, более предпочтительно по меньшей мере 30 ч и наиболее предпочтительно до 40 ч или более; и/или коэффициент избирательного удержания в мозге по сравнению с печенью по меньшей мере 4 через 24 ч или более после введения дозы, предпочтительнее 6 или более через 24 ч или более и наиболее предпочтительно 8 или более через 24 ч или более после введения дозы. В соответствии еще с одним вариантом осуществления изобретения предлагается способ лечения болезни Альцгеймера, включающий этап введения терапевтически эффективного количества эпотилонаD больному, при этом вводимое соединение эпотилона D имеет все три следующих свойства: проникновение в мозг 0,5 или более, более предпочтительно 0,8 или более, наиболее предпочтительно 1 или более при измерении в интервале от 20 мин до 1 ч после введения дозы; и/или период полувыведения из мозга по меньшей мере 24 ч, более предпочтительно по меньшей мере 30 ч и наиболее предпочтительно до 40 ч или более; и/или коэффициент избирательного удержания в мозге по сравнению с печенью по меньшей мере 4 через 24 ч или более после введения дозы, предпочтительнее 6 или более через 24 ч или более и наиболее предпочтительно 8 или более через 24 ч или более после введения дозы. В соответствии еще с одним вариантом осуществления изобретения предлагается способ лечения болезни Альцгеймера, включающий этап введения пациенту терапевтически эффективного количества эпотилона D, при этом способ терапевтически эффективен для лечения БА у пациента, не вызывая индуцированных лекарством побочных эффектов и/или не создавая такой концентрации лекарства в плазме,которая потребовала бы прекращения лечения указанным способом. Способ обеспечивает когнитивные выгоды, более предпочтительно статистически значимые когнитивные выгоды при лечении БА, не вызывая индуцированных лекарством побочных эффектов и/или не создавая такой концентрации лекарства в плазме, которая потребовала бы прекращения лечения указанным способом. Способ может оказывать влияние на основное заболевание, более предпочтительно статистически значимое влияние на основное заболевание, не вызывая индуцированных лекарством побочных эффектов и/или не создавая такой концентрации лекарства в плазме, которая потребовала бы прекращения лечения указанным способом; или при этом способ оказывает влияние на основное заболевание, обеспечивает когнитивные выгоды и/или терапевтически эффективен в других отношениях, не вызывая индуцированных лекарством побочных эффектов, таких как желудочно-кишечные расстройства, лейкопения и/или нейротоксичность, что потребовало бы прекращения лечения указанным способом. В соответствии еще с одним вариантом осуществления изобретения предлагается способ лечения болезни Альцгеймера, включающий этап введения терапевтически эффективного количества эпотилонаD больному, при этом доза эпотилона D является низкой дозой, как определено в настоящем документе. В соответствии еще с одним вариантом осуществления изобретения предлагается способ лечения болезни Альцгеймера, включающий этап введения терапевтически эффективного количества эпотилонаD больному, при этом доза эпотилона D находится в диапазоне 0,001-10 мг/м 2 или альтернативно в диапазоне 0,00003-0,3 мг/кг и вводится ежедневно, еженедельно или в перемежающемся цикле дозирования. Рассматривается такая ситуация, когда каждый из указанных выше способов по изобретению может быть скомбинирован с одним или более других способов по изобретению, и различные комбинации указанных выше способов по изобретению также рассматриваются в настоящем документе. Например, одна из комбинаций указанных выше способов по изобретению может включать способ лечения болезни Альцгеймера, включающий этап введения пациенту терапевтически эффективного количества эпотилона D,при этом способ терапевтически эффективен для лечения БА у пациента, не вызывая индуцированных лекарством побочных эффектов и/или не создавая таких уровней концентрации в плазме, которые потребовали бы прекращения лечения указанным способом; и при этом доза эпотилона представляет собой накопленную месячную дозу в диапазоне 0,001-5 мг/м 2, вводимую внутривенно; и/или при этом доза эпотилона составляет от 0,001 до 2 мг/м 2 и вводится РО ежедневно; и/или при этом дозу эпотилона D выбирают из любого предпочтительного диапазона, указанного выше для перорального или ВВ введения. Также рассматривается возможность комбинирования любого из упомянутых способов лечения с вариантом осуществления изобретения, подразумевающим применение эпотилона D для лечения таупатии, предпочтительно БА у пациента. Так, например, один из вариантов осуществления изобретения,включающий комбинацию указанных выше альтернативных вариантов осуществления изобретения,включает применение эпотилона D для лечения БА, при этом применение лекарства терапевтически эффективно для лечения БА, а эпотилон D вводят пациенту в дозе 0,001-10 мг/м 2 или альтернативно в дозе 0,00003-0,3 мг/кг ежедневно, еженедельно или в цикле перемежающегося дозирования. Еще один вариант осуществления изобретения включает применение эпотилона D для лечения таупатии, особенно БА,при этом эпотилон D вводят пациенту в низкой дозе, которая терапевтически эффективна, то есть способна воздействовать на основное заболевание и/или обеспечить когнитивные выгоды. Фармацевтическая композиция может включать эпотилон D и подходит для введения пациенту для лечения тау-ассоциированного заболевания, предпочтительно таупатии, более предпочтительно БА, при этом композиция включает дозовую единицу эпотилона В диапазоне 0,0001-10 мг/м 2, более предпочтительно 0,001-5 мг/м 2, предпочтительнее 0,001-3 мг/м 2, еще более предпочтительно 0,001-1 мг/м 2 и наиболее предпочтительно 0,001-0,5 мг/м 2. В соответствии еще с одним вариантом осуществления изобретения предлагается фармацевтическая композиция для ВВ введения пациенту, при этом указанная композиция пригодна для доставки накопленной месячной дозы эпотилона D в диапазоне 0,01-5 мг/м, предпочтительнее 0,01-3 мг/м 2, еще более предпочтительно 0,1-3 мг/м и наиболее предпочтительно 0,1-1 мг/м. Фармацевтическая композиция для введения пациенту может содержать эпотилон D в фармацевтически приемлемой системе растворителей, включающей приблизительно от 0 до 50% пропиленгликоля,приблизительно от 1 до 10 % TPGS, приблизительно от 0,5 до 10% этанола, приблизительно 0-90% воды и/или приблизительно от 5 до 85% PEG, например PEG-400. Полезность Таупатии Таупатии представляют собой нейродегенеративные заболевания, связанные с аномальными формами белка Tau в мозговой ткани. Болезнь Альцгеймера (БА) оказалась первым нейродегенеративным заболеванием, при котором была идентифицирована дисфункция белка Tau. Особенно следует отметить нейрофибриллярные клубки, содержащие фибриллярные, гиперфосфорилированные и конформационно измененные формы белка Tau, присутствие которых считается одним из критериев патологии при БА. Несколько позже были идентифицированы другие таупатии, включая подтип лобно-височной деменции и паркинсонизма, сцепленный с хромосомой 17 (FTDP-17), прогрессирующий надъядерный паралич,кортикобазальную дегенерацию, болезнь Пика и болезнь агирофильных гранул. В дополнение к этому,была выявлена ассоциация аномалий белка Tau (включая гиперфосфорилированный Tau, агрегаты Tau и/или ассоциацию с гаплотипом Tau Н 1/Н 1) с болезнью Паркинсона, синдромом Дауна, постэнцефалическим паркинсонизмом, миотонической дистрофией, болезнью Нимана-Пика С, пугилистической деменцией, болезнью Блинта, прионными заболеваниями, боковым амиотрофическим склерозом, комплексом паркинсонизма-деменции острова Гуам, рассеянным склерозом, глаукомой, диабетической ретинопатией и травматическим повреждением мозга (Avila с соавт., 2004; Bartosik-Psujek с соавт., 2006; Dickey с соавт., 2006; Wostyn с соавт., 2008). Белок Tau представляет собой протеин, ассоциированный с микротубулами (MAP), имеющий молекулярную массу от 50 до 75 кДа, который способен связываться с микротубулами (МТ) и стабилизировать их. Существует шесть вариантов первичной последовательности Tau, и эти варианты образуются за счет альтернативного сплайсинга (Lace с соавт., 2007). Сплайсированные варианты содержат ноль, одну или две (0N, 1N или 2N) N-концевые вставки в комбинации или с тремя повторами (3R) или четырьмя повторами (4R) домена, связывающегося с микротубулами. Повторяющиеся домены необходимы для стабилизации микротубул, тогда как богатые пролином участки на любой стороне повторяющихся доменов нужны для связывания с микротубулами (Preuss с соавт., 1997). Повторяющиеся домены и богатые пролином участки фосфорилируются множественными киназами, что приводит к диссоциации белка Tau от микротубул. N-концевой участок Tau далеко выходит за поверхность микротубулы, где он, по мнению исследователей, помогает определять расстояние между микротубулами и связывать моторный белок динактин с микротубулами (Magnani с соавт., 2007). В нормальных клетках повторы Tau типа 3R и 4R представлены примерно в равной степени. Повтор Tau 4R связывается с микротубулами более крепко,чем 3R. Белок Tau наиболее обильно представлен в нейронах, где он преимущественно локализуется в аксонах. Белок Tau является основным протеином, ассоциированным с микротубулами в аксонах нейронов,тогда как семейство MAPI равномерно распределено в различных местах нейронов, а семейство МАР 2 преимущественно является соматодендритическим. Tau стабилизирует аксонные микротубулы, тем самым облегчая транспортировку белков, органелл, липидов, клеточных компонентов, нацеленных на разрушение, и клеточных сигнальных молекул, передающих сигналы в двух направлениях между телом клетки и синаптическими окончаниями. Дисфункция Tau создает помехи для транспортировки по аксонам и, следовательно, влияет на функционирование и выживание нейронов. Ген Tau может быть нокаутирован у мышей с незначительными последствиями, но, если выбывают два гена, Tau и MAP 1B, мыши с двойным генным нокаутом погибают на эмбриональной стадии развития. Оказывается, что альтерации в экспрессии некоторых генов MAP во многих случаях могут замещать друг друга, включая развитие(Avila с соавт., 2004). В некоторых случаях мутации в гене, кодирующем белок Tau (иногда упоминаемом под названием МАРТ), вызывают таупатии, особенно FTDP-17 и другие лобно-височные деменции. Многие мутацииFTDP-17 уменьшают связывание с микротубулами in vitro и/или увеличивают их склонность к образованию фибрилл (Lace с соавт., 2007). Другие мутации, ассоциированные с таупатиями, изменяют характер сплайсинга белка Tau, преимущественно создавая повторы Tau 3R или 4R. Еще один класс мутаций генаTau в его N-концевом участке изменяет способность связываться с динактином (Magnani с соавт., 2007). Все эти мутации потенциально способны нарушать нормальные функции белка Tau. В случае болезни Альцгеймера считается, что к аномалиям белка Tau приводит -амилоид (А). Хотя патологическим признаком таупатий являются клубки и другие агрегаты белка Tau, на основании некоторых данных можно предположить, что существует другая, пока не идентифицированная,растворимая форма белка Tau, обладающая нейротоксичностью. Данные, на основании которых можно считать, что белок Tau, агрегированный в нейрофибриллярные клубки, не является патогенным в прямом смысле этого слова, включают наблюдения на мозге человек и на мышиных моделях. Например, исследование разных участков мозга на разных стадиях болезни Альцгеймера привело к выводу о том, что нейроны способны выживать и функционировать с нейрофибриллярными клубками в течение десятилетий (Morsch с соавт., 1999). Таким же образом, трансгенные мыши с белком Tau человека (hTau) имеют клубки и тяжелую нейродегенерацию, но нейроны с клубками не демонстрируют избирательных признаков патологического расстройства и слишком малочисленны, чтобы объяснить драматическую потерю нейронов, наблюдаемую в этой модели (Andorfer с соавт., 2005). Линия мышей Tg4510, как трансгенная линия с индуцируемым белком Tau, проявляет драматическое и быстрое образование клубков, нейродегенерацию и дефекты поведения при индуцировании Tau-P301L (Santacruz с соавт., 2005). Если экспрессия Tau-P301L приостановлена, то нейродегенерация и когнитивный дефицит в значительной степени уменьшаются, но образование клубков продолжается. Дальнейшие исследования на этих мышах показали, что растворимые мультимеры Tau коррелируются с когнитивным дефицитом. Сходные мультимерыTau наблюдаются также в ткани мозга при FTDP-17 и БА (Berger с соавт., 2007). Наконец, при использовании трансгенных мышей с избыточной экспрессией мутантной формы белка предшественника амилоида (АРР) были получены данные о том, что нефибриллярный белок Tau вовлечен в дефектное поведение при БА (Roberson с соавт., 2007). Когда таких мышей АРР скрещивают с нокаутными мышами по гену Tau, у гибридных животных образуются амилоидные бляшки, но дефекты поведения и синаптические аномалии не развиваются. В этой линии АРР аномалии белка Tau не удается определить даже при наличии синаптических и поведенческих дефектов. Взятые вместе эти исследования показывают, что растворимая и не идентифицированная форма аномального белка Tau, вероятно, представляет собой нейротоксическую разновидность. Стабилизация микротубул при лечении таупатий Существуют две основные гипотезы о роли белка Tau в нейродегенеративных заболеваниях. Одна гипотеза постулирует, что аномальные формы белка Tau разрушают клеточную функцию, а другая гипотеза постулирует, что утрата функционального белка Tau приводит к дестабилизации микротубул (Avila с соавт., 2004; Lace с соавт., 2007). На основе второй гипотезы было высказано предположение о применении стабилизаторов микротубул в качестве лекарства для лечения таупатий (Lee с соавт., 1994; патент США 5580898). Неправильности и нарушения в аксональном транспорте были вовлечены во множество заболеваний в дополнение к тем заболеваниям, при которых идентифицированы аномалии белкаTau. К ним относятся болезнь Гентингтона, болезнь диффузных телец Леви, болезнь Шарко-Мари-Тута,наследственная спастическая параплегия и множественная системная атрофия (Roy с соавт., 2005). Для того чтобы проверить, способны ли стабилизаторы микротубул принести пользу мышам, которые избыточно экспрессируют белок Tau, трансгенных мышей PrP T44 Tau лечили паклитакселом (Zhang с соавт., 2005). Мыши PrP T44 избыточно экспрессируют нормальный белок человека Tau 0N3R в нейронах спинного мозга, и вследствие этой избыточной экспрессии у них развиваются моторные дефекты. Лечение паклитакселом в течение 3 месяцев уменьшало моторную дисфункцию и увеличивало количество микротубул и аксональный транспорт в вентральных корешках спинного мозга. Хотя паклитаксел плохо проникает в ЦНС, он оказался способным повлиять на эфферентные аксоны из нейронов вентрального рога спинного мозга, которые находятся извне гематоэнцефалического барьера. Интересно,что патология Tau в этой модели (сфероиды) не была затронута. Поскольку эта модель не демонстрирует потери нейронов, влияние стабилизаторов микротубул на выживание нейронов было невозможно оценить. В дополнение к этому, неясно могут ли моторные выгоды, наблюдаемые при лечении таупатии спинного мозга, преобразовываться в когнитивные выгоды при кортикально-гиппокампальной таупатии. Например, при скрещивании двух разных линий трансгенных мышей с таупатией и трансгенных мышей,которые избыточно экспрессируют киназу гликогенсинтазы 3 (Gsk3), были получены противоположные результаты. В модели таупатии спинного мозга бигенные животные Tau-Gsk3 проявляли уменьшенную патологию, тогда как в модели таупатии переднего мозга бигенные животные Tau-Gsk3 проявляли усиленную патологию (Spittaels с соавт., 2000; Terwel с соавт., 2008). Стабилизация микротубул была предложена в качестве объяснения эффектов NAP, пептида с последовательностью NAPVSIPQ на нескольких животных моделях. В частности, NAP проявляет нейротрофическую, противовоспалительную, противоапоптотическую и нейропротективную активность во многих клеточных моделях и моделях in vivo, включая закупорку средней мозговой артерии (модель инсульта), травму головы, холинотоксические повреждения, старение и дефекты развития при фетальном алкогольном синдроме и у мышей с недостаточностью аполипопротеина Е (Gozes с соавт., 2006; Gozes,2007). Как и при таупатиях, введение NAP в течение 3 или 6 месяцев согласно опубликованным данным снижало уровень А, гипер-фосфорилированного Tau и саркозил-нерастворимого Tau, но увеличивало уровень растворимого Tau у мышей 3Tg (Matsuoka с соавт., 2007; Matsuoka с соавт., 2008). Мыши 3Tg избыточно экспрессируют АРР и Tau-P301L (Oddo с соавт., 2003). Механизм активности NAP определен не полностью, но существуют данные, основанные на связывании тубулина в NAP-аффинной колонке и влиянии на образование микротубул и/или стабилизацию в культивируемых нейронах, о том, что NAP связывается с микротубулами (Divinski с соавт., 2006). Также известно, что NAP подавляет агрегацию А, так что он может действовать впереди Tau в модели 3Tg. Вряд ли NAP действует как типичный агент, стабилизирующий микротубулы, поскольку он способен защищать крыс от индуцированной паклитакселом периферической невропатии (публикация патентной заявки США 2006/0247168 А 1). Когда агенты, стабилизирующие микротубулы, например паклитаксел, вводят в высоких химиотерапевтических дозах, часто развивается периферическая невропатия (Postma с соавт., 1999), которая считается результатом избыточной стабилизации и группирования микротубул в периферических нервах. Поскольку NAP предупреждает периферическую невропатию у крыс, индуцированную паклитакселом, вряд ли паклитаксел и NAP действуют через идентичные механизмы. Также имеются предположения о том, что стабилизаторы микротубул могут проявлять нейропротективные эффекты, на связанные с очевидной дисфункцией белка Tau. Соединения, стабилизирующие микротубулы, защищают культивируемые нейроны от многих токсических факторов, включая А 42,окислительный стресс от растворимого А 40, лизосомное разрушение, индуцированную кальцием токсичность и индуцированную глутаматом токсичность (Burke с соавт., 1994; Furukawa, 1995; Sponne с соавт., 2003; Michaelis с соавт., 2005; Butler с соавт., 2007). Высказана гипотеза о том, что микротубулы играют ключевую роль не только в механизмах транспортировки, но также в регуляции клеточных сигналов, особенно сигналов кальция, возможно, через фиксацию комплексов макромолекулярной сигнализации по соседству с плазматической мембраной (Michaelis с соавт., 2005). Также было показано, что агенты, стабилизирующие микротубулы, усиливают митохондриальную функцию, снижая выработку активных форм кислорода и увеличивая экспрессию генов окислительного фосфорилирования, участвующих в выработке АТФ (Wagner с соавт., 2008). Известно также, что агенты, стабилизирующие микротубулы, оказывают широкое влияние на клеточную сигнализацию во время разрыва митотического веретена в раковых клетках (Bergstralh с соавт., 2006). Стабилизаторы микротубул, проникающие в мозг Терапевтической мишенью для стабилизаторов микротубул при таупатиях и других нейродегенеративных заболеваниях являются микротубулы в мозге. Однако стабилизаторы микротубул могут оказывать токсическое воздействие на периферические ткани, в частности, подавляя пролиферацию клеток,особенно клеток желудочно-кишечного тракта и гемопоэтических клеток и вызывая периферическую невропатию. Поэтому очень желательно идентифицировать стабилизаторы микротубул, которые способны блестяще проникать в мозг и избирательно задерживаться в мозге по сравнению с периферическими тканями, доводя таким образом до максимума терапевтический индекс при таупатиях и других нейродегенеративных заболеваниях. Высоко желательным свойством является способность соединения связываться с мозговой тканью в большей степени и с более длинным периодом полувыведения, чем с периферийными тканями. Серия таксановых стабилизаторов микротубул является субстратом для транспортировщиков множественной лекарственной устойчивости, таких как Р-гликопротеин (PGP), АТФ-связывающая кассета,белок множественной лекарственной устойчивости и белок устойчивости к раку молочной железы. Эти транспортировщики множественной лекарственной устойчивости предупреждают накопление соединений в опухолевой и мозговой ткани. Многие лаборатории пытались синтезировать таксаны, которые не были бы субстратом для транспортировщиков множественной лекарственной устойчивости, особенно для PGP, но не добились больших успехов (Minderman с соавт., 2004; Rice с соавт., 2005; Ballatore с соавт., 2007). Также была предпринята попытка совместного введения ингибитора PGP с паклитакселом(Fellner с соавт., 2002). В результате этих усилий было показано, что некоторые таксаны проникают в мозг, то есть достигается, например, уровень паклитаксела в мозге приблизительно 1/30 по сравнению с почками при использовании ингибитора PGP, или уровень KU-237 в мозге в диапазоне мкм, но не более чем через 4 ч после введения (Michaelis, 2006). Следовательно, использование ингибиторов PGP не является впечатляющим способом для того, чтобы усилить проникновение таксанов в мозг. Способы приготовления и лекарственные составы Эпотилон D представляет собой известное соединение, которое было химически синтезировано denovo, а также было выделено из продуктов брожения штаммов Sorangium cellulosum как минорные продукты ферментации S. cellulosum. Общий синтез эпотилона D описан в патенте США 6242469, выданном Danishefsky с соавт., а дополнительные способы изготовления эпотилона D и других соединений эпотилона можно найти в патентах США 6204388, 6288237 и 6303342, патентном документе WO 03/072730, патенте США 6410301, патентной заявке США 2002/0137152 А 1, патенте США 6867333, опубликованной патентной заявке США 2006/004065, причем каждый из упомянутых источников включен в этот документ в качестве ссылки. Синтетические способы производства эпотилона D были охарактеризованы как непрактичные для полномасштабной фармацевтической разработки. Один альтернативный способ изготовления заключается в реализации крупномасштабного сбраживания эпотилона В, например, как это описано в патенте США 7172884 В 2, с применением улучшенных штаммов, способных обеспечить относительно высокий выход эпотилона В, а эпотилон В можно деэпоксидировать для получения эпотилона D. Способы деэпоксидирования хорошо известны, кроме того, их можно найти в патенте США 6965034 (WO 99/43653), выданном Danishefsky с соавт., особенно в том, что касается эпотилона D. Дальнейшие способы изготовления эпотилона D изложены в патентах США 6998256 В 2 и 7067286, Способы получения эпотилона D с использованием кристаллизации и/или посредством клеточной культуры в присутствии метилолеата, которые описывают биосинтетическую выработку эпотилона D с использованием штаммов Myxococcus xanthus K111-40-1 и K111-72.4.4 и/или других рекомбинантных штаммов, которые были созданы компанией Kosan Biosciences Inc. (ныне BMS) для улучшения выработки эпотилона D. Условия сбраживания и очистки для изготовления эпотилона D также изложены в патентах США 6998256 В 2 и 7067286, кроме того, в патентах США 6583290, 6858411, 6921650 и 7129071, каждый из которых принадлежит компании Kosan (ныне BMS, патентообладатель настоящей заявки) и включен в этот документ в качестве ссылки, см. также Lau с соавт., Kosan Biosciences, Optimizing the Heterologous Production of Epothilone D in Myxococcus xanthus, BiotechnologyBioengineering,78(3): 280-288 (May 5, 2002). Другие способы, которые можно использовать для изготовления эпотилона D, проиллюстрированы в патентной заявке США серийный номер 12/118432. Эта заявка раскрывает комбинацию химического и биосинтетического этапов в процессе изготовления эпотилонов, таких как эпотилон D. Например, предлагаются способы, в которых для синтеза эпотилона можно использовать одно или более промежуточных веществ, которые получают в результате брожения рекомбинантных клеток, а затем биосинтетические производные с использованием рекомбинантных клеток, раскрытых в цитируемой заявке, преобразуют в конечные соединения эпотилона посредством химического синтеза. Эпотилон D, используемый в способах по настоящему изобретению, можно вводить пациенту различными путями, известными в данной области знаний, обычно, посредством внутривенного (ВВ) введения, подкожного введения перорального введения и т.д. Например, эпотилон D можно ввести в лекарственный состав с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Фармацевтическая композиция, включающая эпотилон D, может быть составлена классическим способом с применением твердых или жидких носителей, разбавителей и добавок, соответствующих намеченному способу введения. Типичные композиции для парентерального введения включают инъекционные растворы или суспензии, которые могут содержать, например, подходящие нетоксичные, парентерально приемлемые разбавители или растворители, такие как маннит, 1,3-бутандиол, воду, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия (0,9% натрия хлорид для инъекций [физиологический раствор] или 5% декстроза для инъекций) или другие диспергирующие или смачивающие агенты, включая синтетические моно- или диглицериды и жирные кислоты. Фармацевтически приемлемые композиции и/или способы введения соединений по изобретению могут включать применение сорастворителей, включая, но, не ограничиваясь ими, этанол, N,N-диметилацетамид, пропиленгликоль, глицерин и полиэтиленгликоли, например полиэтиленгликоль 300 и/или полиэтиленгликоль 400. Для увеличения распространения соединения или усиления его смачивающих свойств за счет снижения поверхностного натяжения можно использовать сурфактанты (фармацевтически приемлемые поверхностно активные агенты), включая, без ограничений,dтокоферил полиэтиленгликоль 1000 сукцинат (TPGS), кремофор, солютол HS 15, полисорбат 80, полисорбат 20, полоксамер, пирролидоны, такие как N-алкилпирролидон (например, N-метилпирролидон) и/или поливинилпирролидон, однако применение кремофора связано с недостатками и не является предпочтительным. Лекарственный состав также может включать один или более буферов (то есть ингредиентов, которые придают способность сопротивляться изменениям в эффективной кислотности или щелочности среды при введении кислых или щелочных добавок), включая, без ограничений, фосфат натрия, цитрат натрия, диэтаноламин, триэтаноламин, L-аргинин, L-лизин, L-гистидин, L-аланин, глицин,карбонат натрия, трометамин (а/k/а трис[гидроксиметил]аминометан или трис) и/или их смеси. Лекарственные составы для введения соединений эпотилона, включая лекарственные составы, в которых избегают использовать неионные сурфактанты, такие как кремофор, были описаны ранее. Напри- 12021758 мер, лекарственный состав для ВВ введения, который включает смесь пропиленгликоля и этанола, описан в патенте США 6683100. Другие лекарственные составы могут включать смеси полиэтиленгликоля/абсолютного спирта или пропиленгликоля или глицерина/абсолютного спирта. Например, патентный документ WO 2006/105399 (PCT/US 2006/011920), принадлежащий компании BMS, раскрывает лекарственные составы, которые включают смеси, содержащие приблизительно от 30 до 70 об.% абсолютного спирта на каждые 30-70 об.% PEG 300 и/или PEG 400, при этом их можно разбавлять жидкостями для вливаний на основе солевого раствора или декстрозы и применять для ВВ введения эпотилона больным. Предпочтительно, чтобы в таких лекарственных составах количество этанола было сведено к минимуму во избежание побочных эффектов, связанных с введением этанола. Квалифицированный специалист в данной области может легко получить оптимальные соотношения растворителей. Другие предпочтительные лекарственные составы, специально разработанные для введения эпотилона D и аналогов, раскрыты в патенте США 7091193 (также опубликованном как патентная заявка США 2005/0148543), выданном компании Kosan (ныне BMS). Этот патент описывает лекарственный состав, в котором эпотилон D и гидроксипропил-бета-циклодекстрин скомбинированы в водноспиртовом растворе, который затем подвергают лиофилизации. Варианты осуществления такого состава включают использование приблизительно 10 мг эпотилона D и приблизительно 0,4 г гидроксипропилбета-циклодекстрина, скомбинированных в 60% водном растворе трет-бутанола, который затем подвергают лиофилизации (в соответствии с настоящим изобретением количество ингредиентов можно пропорционально уменьшать для индивидуального приготовления состава с уменьшенной дозой). Лиофилизированный активный ингредиент таблетку впоследствии можно восстановить для ВВ введения, применяя для этого воду, этанол и/или гликоль, который может включать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль 400, полиоксиэтилен сорбитан моноолеат (поступающий в продажу под торговым названиемTWEEN 80) и родственные окисленные углеводороды. Понятно, что можно использовать гликоли с разной длиной цепей и разным молекулярным весом (например, полиэтиленгликоль 1000, другие соединения TWEEN). Как более специфический пример для применения можно привести лекарственный состав для введения эпотилона D пациенту в соответствии с настоящим изобретением, который включает от 0 до 50% пропиленгликоля, приблизительно от 1 до 10% TPGS, приблизительно от 0,5 до 10% этанола, приблизительно 0-90% воды и/или приблизительно от 5 до 85% ПЭГ, например ПЭГ-400. Более конкретные варианты состава могут включать: 50% пропиленгликоля, 10% TPGS, 10% этанола, 30% воды; или 10% пропиленгликоля, 40% ПЭГ-400, 5% TPGS, 5% этанола, 40% воды; или 85% ПЭГ-400, 10% TPGS, 5% этанола; или 8,5% ПЭГ-400, 1% TPGS, 0,5% этанола, 90% воды. Подходящую дозировку эпотилона D может определить квалифицированный специалист, принимая во внимание сущность изобретения, описанную в настоящем документе, и типичные факторы, такие как масса тела пациента, физическое состояние пациента и т.д. Доза лекарства должна содержать эпотилон D в таком количестве, которое эффективно для лечения БА. Обычно рассматриваемый диапазон доз эпотилона D, вводимого для лечения БА, составляет 0,0001-10 мг/м 2, более предпочтительно 0,001-5 мг/м 2. Другие более предпочтительные диапазоны доз для перорального и внутривенного введения определены выше в разделе Альтернативные варианты осуществления изобретения. Такие единицы изменения доз,как мг/м 2, используются в настоящем документе в целях сравнения с химиотерапевтическими дозами,ранее применявшимися для эпотилонов и их аналогов. Однако единицы типа мг/м можно легко преобразовать в мг/кг, принимая во внимание биологические виды животных, получающих (или получавших) лекарство, и такие параметры пациентов, как вес тела и/или рост. Например, для пациента весом около 70 кг дозовый диапазон 0,0001-10 мг/м 2 преобразуется приблизительно в 0,00003-0,3 мг/кг. Дополнительную информацию о конвертировании доз можно найти на сайте www.rphworld.com/viewlink-25045html и в ссылке Freireich с соавт., Cancer Chemother. Reports, 50(4): 219 (1966). Лекарство можно вводить ежедневно, еженедельно или на перемежающейся основе. Например, лекарство можно вводить по таким схемам, как три недели введения и одна неделя перерыва или две недели введения и одна неделя перерыва, а также по другим схемам, которые может определить квалифицированный специалист. Конкретная выбранная доза будет зависеть от способа введения и выбранной схемы дозирования лекарства. Примечательно, что доза эпотилона D, которую вводили пациентам для лечения рака в некоторых клинических испытаниях II фазы, составляла 100 мг/м 2, и ее вводили посредством 90-минутного вливания еженедельно в течение 3 недель из 4 (т.е. в 1-й, 8-й и 15-й день каждого 4-недельного цикла) после испытаний I фазы с повышением дозы от 9 до 150 мг/м 2 для каждой дозы. Доза лекарства, предназначенная для лечения БА, приблизительно в десять раз меньше или более вероятно приблизительно в 100 раз меньше, а еще в одном рассматриваемом варианте осуществления изобретения даже в 1000 с лишним раз меньше, чем терапевтическая доза эпотилона D, которую вводят для лечения раковым пациентам в клинических испытаниях II фазы, хотя график дозирования и способ введения лекарства повлияют на дозу. Далее настоящее изобретение будет объяснено более подробно посредством неограничивающих примеров, которые содержат ссылки на прилагаемые чертежи. Представленные ниже способы были использованы в экспериментах, которые описаны в примерах, следующих за описанием способов. Способы для экспериментов (примеры с 1 по 5) Недавно было описано создание трансгенной линии мышей Tg4510 с агрессивным белком Tau (Santacruz с соавт., 2005; Berger с соавт., 2007). Линия Tg4510 экспрессировала Tau-P301L, мутантную форму белка Tau, обнаруживаемую при FTDP-17, с применением промотора кальмодулин-зависимой киназы II. Линия Tg4510 была уникальной в нескольких отношениях: 1. Высокий уровень экспрессии белка Tau (13-кратный по сравнению с мышиным Tau). 2. Ограничение экспрессии Tau в лобно-височных долях (позволяя тем самым избежать моторных дефектов, которые характеризовали предыдущие линии Tau, экспрессировавшие белок Tau в спинном мозге). 3. Быстрая и обширная нейродегенерация (60% нейронов СА 1 утрачивались через 5,5 месяцев), которой предшествовали когнитивные дефекты, определяемые в сроке 4,5 месяца. Приготовление лекарства для исследования Tg4510 Эпотилон D (соединение I) вводили внутрибрюшинно иглой 26-го калибра в композиции, содержащей 10% этанола и 90% воды, из расчета 10 мл/кг в дозах 0 (носитель), 1 и 10 мг/кг. Исходный раствор 10 готовили в 100% этаноле и разбавляли непосредственно перед введением доз. Лекарство вводили мышам, разделенным на 3 когорты, а данные объединяли, чтобы получить конечные величины N 12, 9 и 15 в группах носителя, 1 и 10 мг/кг соответственно. Дозы вводили мышам в химическом вытяжном шкафу. Инъекции и график поведенческого тестирования в исследовании Tg4510 В настоящем исследовании были использованы мыши Tg4510. Эти мыши представляют собой хорошо охарактеризованную агрессивную модель таупатии с избыточной экспрессией мутантного белка человека Tau P301L в переднем мозге (Santacruz с соавт., 2005; Berger с соавт., 2007). Для этих мышей характеры скопления аномальных форм белка Tau, включая клубки, похожие на находки в мозге при БА,дефекты поведения и, в конечном итоге, потеря нейронов. В возрасте 9 недель (+/- 15 дней) мышей акклиматизировали одной инъекцией фосфатно-солевого буферного раствора, проведенной в химическом вытяжном шкафу. Затем мышей помещали в клетки и выдерживали в химическом вытяжном шкафу 48 ч. По окончании 48-часового периода мышей помещали в чистые клетки и переносили в специальный блок для поведенческого тестирования. Затем мышей тестировали в водном лабиринте Морриса (MWM) в течение шести дней. Мышей распределяли на группы лечения на основе результатов анализа их поведения, используя ранговые баллы для кольцевого индекса перекрестных ссылок 2 пробных испытаний. В начале лечения возраст мышей составлял 11 недель (+/- 15 дней), а лечение проводили по еженедельной схеме, вводя лекарство один раз в неделю. После первой недели лечения животным проводили панель тестов на неврологические и физические склонности (модифицированная процедура SHIRPA), включая анализ положения тела, тремор,внешний вид шерстного покрова, походку, бегство при прикосновении, позиционную пассивность, хватание конечностями и установочный рефлекс. Спустя 48 ч после каждой еженедельной дозы мышей дополнительно обследовали на внешний вид шерстного покрова, хватание конечностями, установочный рефлекс и любое явное стереотипное поведение. По ходу исследования у животных не наблюдалось никаких признаков явной токсичности, потери веса или моторных дефектов. После восьмой дозы лекарства(в возрасте 19 недель +/- 15 дней) мышей снова тестировали в MWM в течение шести дней. После поведенческого тестирования введение доз лекарства продолжали до достижения животными возраста 5,5 месяцев, когда проводилось заключительное наблюдение. Животных содержали и лечили в соответствии со стандартами Комитета по уходу за больными и использованию животных, а также Национальных институтов здравоохранения. Протокол водного лабиринта Морриса Мышей тестировали в водном лабиринте Морриса (MWM) дважды, первый раз перед началом лечения и второй раз через два месяца после начала лечения. Второй цикл тестирования в водном лабиринте проводили в другом испытательном помещении. Перед началом тестирования мышей акклиматизировали в экспериментальном помещении 2-3 дня. Мышей помещали в водный лабиринт диаметром 1,5 м с платформой диаметром 16 см, расположенной на 0,5-1,0 см ниже поверхности воды. Воду замутняли нетоксичной белой краской, а температуру воды поддерживали на уровне 22-25 С. Мышей подвергали 4 испытаниям в день продолжительностью до 90 с каждое с 10-секундным периодом отдыха на платформе после каждого испытания. Если мышь не находила платформу за 90 с, ее осторожно направляли на платформу и оставляли в покое на 10 с. Каждая испытательная камера имела большие наружные ориентиры, позволяющие мышам ориентироваться в процессе обучения расположению платформы. После каждого испытания мышей помещали под инфракрасную лампу для профилактики гипотермии. Интервал между испытаниями варьировали от 25 до 45 мин. Путь мышей отслеживали,используя прикладную программу HVS Image Advanced Tracker VP200 (Buckingham, UK), определяя общее расстояние, пройденное до достижения платформы. Статистический анализ по длине приобретенного пути в пяти испытаниях включал дисперсионный анализ с повторяющимися измерениями. Статистическая модель включала лечение (0, 1 или 10 мг/кг эпотилона D (соединение I как критерий сравнения между животными и 5 попыток на каждое животное как повторные измерения. Если анализ показывал значительный эффект лечения или взаимодействие между лечением и испытанием, различия между группами 1 и 10 мг/кг сравнивали с группой носителя,применяя критерий Даннета. Пробную длину пути в каждом квадранте и число пересечений платформы в каждом квадранте анализировали, применяя критерий Даннета. Во всех случаях группы 1 и 10 мг/кг сравнивали с группой носителя. Все вычисления проводили в программе SAS, версия 9.1, под управлением операционной системы Windows XP Professional. Обучающий тренинг проводили в течение 5 дней подряд. Пробное испытание проводили через 18 ч после последней учебной тренировки в 6-й день. Во время этих 60-секундных испытаний платформу удаляли, измеряя расстояние, которое мышь преодолевала в целевом квадранте, и число пересечений участка, где ранее располагалась платформа. У всех животных мониторировали скорость плавания; применение лекарства не приводило к каким-либо изменениям в скорости плавания, согласующимся с лекарством, которое не влияло на моторное поведение. Резерв времени (скорость плавания 5 см/с) также не варьировался между группами лечения. Сбор тканей Мышей умерщвляли смещением шейных позвонков в возрасте 5,5 месяцев с последующей декапитацией. Мозг немедленно извлекали и разделяли по срединной линии на два полушария. Правое полушарие помещали в 20 мл 4% параформальдегида (свежеприготовленного в день умерщвления) и хранили ночью при 4 С. На следующий день мозг переносили в пробирку, содержащую 20 мл TBS (рН 7,4, 20 мМTRIS, 100 мМ NaCl), а затем хранили при 4 С до обработки. Правые полушария заливали парафином,делали срезы толщиной 5 мкм и делали препараты на положительно заряженных предметных стеклах. Стекла высушивали ночью в термошкафу при 60 С и хранили при комнатной температуре до окрашивания. Левые полушария замораживали (в течение 2 мин) на сухом льду. Способ Gallyas Способ окрашивания по Gallyas использовали для выявления положительных на серебро нейрофибриллярных клубков и дистрофических аксонов. Залитые парафином тонкие срезы (5 мкм), смонтированные на предметных стеклах, депарафинизировали и обезвоживали при серийной инкубации в ксилоле(дважды по 10 мин), 100% этаноле (дважды по 10 мин), 95% МеОН/5% Н 2 О 2 (30 мин), 95% этаноле (дважды по 5 мин), 80% этаноле (дважды по 5 мин), 50% этаноле (дважды по 5 мин) и воде (дважды по 5 мин). Затем срезы помещали в 5% перйодную кислоту на 5 мин, отмывали в dH2O (дистиллированной воде) дважды по 5 мин и помещали в щелочной раствор йодида серебра (содержащий 1% нитрата серебра) на 1 мин. Срезы отмывали в 0,5% уксусной кислоте 10 мин, посещали в свежеприготовленный проявляющий раствор на 15 мин и снова отмывали в 0,5% уксусной кислоте 5 мин. После ополаскивания деионизированной водой срезы помещали в 0,1% хлорид золота на 5 мин и снова ополаскивали деионизированной водой. Срезы инкубировали в 1% трисульфате натрия (гипо) в течение 5 мин, а затем ополаскивали водопроводной водой. Контрастное окрашивание проводили 0,1% ядерным быстрым красным в течение 2 мин. Затем срезы ополаскивали водопроводной водой, обезвоживали в градиентной серии спиртов (95%,100%, 100%) в течение 2 мин и просветляли в 3 сменах ксилола, 10 погружений каждый раз. Наконец на предметные стекла добавляли заливочную среду Cytoseal 60 и устанавливали покровные стекла (RichardAllan Scientific of Kalamazoo, MI). Статистическую обработку данных проводили, применяя непараметрический критерий Краскела-Уоллиса с последующим критерием множественного сравнения Данна в компьютерной программе Graphpad Prism 4. Такие же результаты были получены в параметрическом анализе ANOVA с последующим применением критерия Даннета post-hoc. Иммуногистохимия Залитые парафином тонкие срезы (5 мкм) были депарафинизированы и обезвожены в 3 сменах ксилола, двух сменах 100% этанола и 1 смене 95% этанола с последующим ополаскиванием в воде. Восстановление антигена проводили, отпаривая предметные стекла в 10 мМ буфера из цитрата натрия, рН 6,0 в течение 30 мин в паровом аппарате Black and Decker (модельHS900) с последующим охлаждением в течение 30 мин. Активность эндогенной пероксидазы блокировали посредством инкубации в 0,6% перекиси водорода в 90% МеОН в течение 15 мин. После отмывания в TBS стекла блокировали в 10% нормальной козьей сыворотке в TBS в течение 1 ч Это сопровождалось инкубацией антитела АТ 8 phosphoTau (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, Goedert с соавт., 1995) разведенного в блокирующем растворе в течение ночи при 4 С. После 3 промываний в TBS стекла инкубировали с противомышиным антителомIgG в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания в TBS выявляли сигнал с применением набора Vectastain ABC Elite (Vector Labs Burlingame, CA) в течение 1 ч и последующим выявлением с использованием реактива diaminobenzadine компании Vector labs. Ядра контрастно окрашивали в синий цвет гематоксилином, после чего предметные стекла дважды погружали в заменитель водопроводной воды Скотта (Surgipath02900, Richmond, IL), а затем ополаскивали водопроводной водой. Далее срезы обезвоживали в градиентной серии спиртов (95, 100, 100%) и просветляли в 3 сменах ксилола. Затем добавляли заливочную среду Cytoseal 60 и закрывали препараты покровными стеклами.captured at high resolution and stored as files within Spectrum (Aperio software). Для обработки изображений захватывали участок размером 40004000 пикселей, включающий весь гиппокамп, применяя инструмент для извлечения, и сохраняли данные в файле JPEG для импорта в программу Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) с целью количественной оценки клеточных потерь в участках гиппокампа СА 1 и СА 3. Для количественной оценки клеточных потерь использовали модифицированную версию способа рассечения одиночного среза (Moller с соавт., 1990) в связи с ее пригодностью для тонких тканевых срезов, залитых парафином. Для получения относительного количества клеток собирали каждый пятый срез по мере сагиттального рассечения залитого парафином мозга между точкой брегма и приблизительно 0,75 мм латеральнее. Из каждого среза были выбраны и обсчитаны три участка с использованием программы Metamorph. Для каждого изображения были использованы одни и те же участки, а на каждое животное были обсчитаны 5 срезов (5 препаратов порознь). Статистический анализ проводили методомANOVA с последующим применением критерия Даннета post-hoc. Пример 1 Схема эксперимента Tg4510 с эпотилоном D (соединение I), описанного выше, отображена на фиг. 1. В настоящем эксперименте мышей в возрасте 2,5 месяца тестировали в MWM и распределяли на три группы (N = 12, 13, 16) так, чтобы характеристики каждой группы перед началом лечения были сходными. Начиная с 2,5-месячного возраста мышам еженедельно вводили внутрибрюшинно (IP) либо только носитель, либо носитель с 1 или 10 мг/кг эпотилона D (соединение I). В возрасте 4,5 месяца мышей снова тестировали в MWM, чтобы оценить влияние лечения на когнитивные способности. В возрасте 5,5 месяцев мышей умерщвляли и собирали мозговой материал для последующего анализа. В экспериментах с ксенотрансплантатами опухолей исследователи обычно вводили эпотилон D (соединение I) внутрибрюшинно из расчета 30 мг/кг через день в течение 5 дней, получая накопленную дозу 150 мг/кг (Chou с соавт., 1998). Следовательно, можно считать, что лечение эпотилоном D (соединение I) в дозе 1 мг/кг на протяжении 12 недель, как описано в настоящем документе, соответствует приблизительно в 100 раз меньшей дозе по сравнению с онкологической дозой, а лечение в дозе 10 мг/кг соответствует приблизительно в 10 раз меньшей дозе по сравнению с типичной онкологической дозой, вводимой в экспериментах такого типа. Когда мышам еженедельно вводили внутрибрюшинные дозы 1 и 10 мг/кг эпотилона D (соединение I) в течение 2 или 6 месяцев, не наблюдалось никаких гистопатологических аномалий во многих тканях, включая печень, почки, сердце, яички, надпочечники, костный мозг, периферийные нервы, желудок, а также тонкий и толстый кишечник. На фиг. 2 показаны результаты тестирования 2,5-месячных мышей Tg4510 в MWM перед введением доз эпотилона D (соединение I) или носителя. Не было выявлено статистически значимых различий между группами перед введением доз при отборе животных или во время пробных испытаний, которые послужили основой для разделения животных на группы. Другими словами, фиг. 2 выполняет роль контрольного критерия, показывая, что продуктивность в каждой группе перед началом лечения была сходной. Затем мышам Tg4510 один раз в неделю внутрибрюшинно вводили эпотилон D (соединение I) в дозах 1 и 10 мг/кг, а также носитель, после чего тест MWM проводили в возрасте 4,5 месяца через 12 недель еженедельного введения доз. Результаты, которые представлены на фиг. 3, показали, что мыши,получавшие эпотилон D (соединение I) в дозе 1 мг/кг, были способны находить скрытую платформу вMWM быстрее (т.е. лучше на уровне статистической значимости (р 0,01, по сравнению с мышами,получавшими носитель. Группа лечения дозой 10 мг/кг показала тенденцию к улучшению по сравнению с группой, получавшей носитель. Эти находки показывают, что лечение мышей Tg4510 эпотилоном D(соединение I) приводило к статистически значимому улучшению когнитивной функции по сравнению с введением носителя, а также, в дополнение к этому, что меньшая доза 1 мг/кг давала лучшие результаты по сравнению с большей дозой (10 мг/кг). Примечательно, что здесь авторы изобретения подтвердили концепцию дозовой зависимости реакции, сравнивая результаты лечения мышей, получавших дозы 1 и 10 мг/кг. По этим соображениям менее выраженное поведенческое улучшение в группе 10 мг/кг по сравнению с группой 1 мг/кг не было результатом непредвиденно низкого уровня лекарства у животных, получавших дозу 10 мг/кг. Пример 2 Фиг. 4 показывает данные зондирования через 18 ч после 5 дней тренировки 4,5-месячных мышейTg4510, которые на протяжении 2 месяцев получали эпотилон D (соединение I) в дозах 1 и 10 мг/кг или носитель. На фиг. 4 TQ означает целевой квадрант, AR означает соседний справа, AL означает соседний слева и ОР означает противоположный квадрант. На фиг. 4 показаны два измеряемых показателя продуктивности, а именно % длины пути (А) и число пересечений платформы (В) в каждом квадранте. Преимущество целевого квадранта указывает на то, что мыши запомнили расположение платформы во время фазы набора животных для исследования. Как можно видеть из представленных данных, мыши,- 16021758 получавшие носитель, демонстрировали сходные результаты в квадрантах TQ, AR, AL и ОР, по показателям как длины пути (А), так и пересечений платформы (В), то есть не проявляли никаких предпочтений в квадрантах. Однако мыши, получавшие соединение I в дозе 1 мг/кг, демонстрировали статистически значимые различия с группой, получавшей носитель, по обоим показателям памяти, например, вспоминая, что платформа была расположена в TQ. В дополнение к этому, дозовая группа 10 мг/кг демонстрировала значительно лучшую продуктивность по сравнению с группой носителя по показателю % длины пути (А), но не по числу пересечений платформы (В). Пример 3 Для того чтобы оценить влияние эпотилона D (соединение I) на патологию мозга, ткань мозга исследовали в подвыборке мышей Tg4510 (N=5) из предыдущего эксперимента. Предыдущие исследования показали, что мыши Tg4510 утрачивают около 60% своих нейронов в участке СА 1 гиппокампа через 5,5 месяцев (Santacruz с соавт., 2005). Таким образом, авторы настоящего изобретения сначала исследовали количество нейронов в участке СА 1 гиппокампа, а затем исследовали участок СА 3. Фиг. 5 отображает количество нейронов в участках гиппокампа СА 1 и СА 3 у мышей в возрасте 5,5 месяцев после лечения носителем, 1 мг/кг эпотилона D (соединение I) и 10 мг/кг эпотилона D (соединение I). Как можно увидеть на фиг. 5, мыши Tg4510, получавшие 1 мг/кг эпотилона D (соединение I), неожиданно имели значительно большее количество нейронов в участке СА 1, чем животные, получавшие носитель. Фактически, различие между мышами, получавшими носитель, и мышами, получавшими 1 мг/кг эпотилона D (соединение I), показывает, что эпотилон D (соединение I) в дозе 1 мг/кг предупреждал потерю нейронов на уровне статистической значимости по сравнению с носителем (р 0,01). Мыши,получавшие 10 мг/кг эпотилона D (соединение I), имели потерю нейронов в участке СА 1 на промежуточном уровне между контрольными мышами, получавшими носитель, и мышами, получавшими 1 мг/кг эпотилона D (соединение I). Эти результаты согласуются с находками исследований поведения в примерах 1 и 2 и подтверждают их, демонстрируя, что 100-кратно меньшая доза (по сравнению с химиотерапевтическими дозами, вводимыми в экспериментах с ксенотрансплантатами опухолей) неизменно дает значимо лучшие результаты при лечении таупатии. Похожая тенденция также наблюдалась в отношении общего количества клеток в участке СА 3 гиппокампа со статистически значимыми отличиями дозовой группы 1 мг/кг и нетрансгенных мышей от мышей, получавших носитель. Увеличение количества клеток в участке СА 3 у мышей, получавших активное лечение, было менее выраженным, чем в участке СА 1, где в настоящем возрасте происходила большая дегенерация. Однако эти результаты показывают влияние испытуемого лекарства на основное заболевание во многих участках мозга. Пример 4 Также было исследовано влияние лечения на окрашивание фосфорилированного белка Tau в участке СА 1. Антитело АТ 8 распознает белок Tau, который фосфорилирован в 202-м и 205-м остатках. Эта форма гиперфосфорилированного белка Tau обильно представлена при БА и в мозге пациентов при других таупатиях (Goedert с соавт., 1995). На фиг. 6 показано окрашивание антителом АТ 8 фосфорилированного белка Tau у мышей Tg4510,получавших носитель (контроль), 1 мг/кг эпотилона D (соединение I) и 10 мг/кг эпотилона D (соединение I), как это описано выше. Окрашивание фосфотау показано темным (черным) цветом. Неожиданно было обнаружено, что мыши, получавшие 1 мг/кг эпотилона D (соединение I), демонстрируют намного меньшее окрашивание фосфотау, особенно по сравнению с мышами, получавшими носитель. Мыши,получавшие 10 мг/кг эпотилона D (соединение I), демонстрировали промежуточный уровень окрашивания фосфотау. Пример 5 Влияние лечения эпотилоном D (соединение I) на образование нейрофибриллярных клубков в коре исследовали окрашиванием серебром по Gallyas. На фиг. 7 А показано окрашивание серебром нейрофибриллярных клубков в лобном отделе коры у мышей Tg4510, получавших носитель (контроль), 1 мг/кг эпотилона D(соединение I) и 10 мг/кг эпотилона D (соединение I), как это описано выше. На фиг. 7 А окрашивание серебром (позитивное) показано черным цветом, а символы NT означают нетрансгенных мышей, демонстрирующих некоторое неспецифическое окрашивание, связанное с кровеносными сосудами. Как можно видеть на фиг. 7 А, мыши, получавшие 1 мг/кг эпотилона D (соединение I), имели намного меньший уровень нейрофибриллярных клубков, чем мыши, получавшие носитель, а количественная интерпретация данных по всем животным в исследовании представлена на фиг. 7 В. Значительное влияние на основное заболевание как в коре, так и в гиппокампе наблюдалось в дозовой группе 1 мг/кг, а дозовая группа 10 мг/кг вновь продемонстрировала тенденцию к улучшению. Как было описано в предыдущих примерах, лечение мышей Tg4510 эпотилоном D (соединение I) предупреждало когнитивный спад и со временем улучшало когнитивную функцию по сравнению с нелеченными мышами Tg4510. Кроме того, нейропатологические тесты как показатель влияния на основное заболевание (т.е. количество клеток, окрашивание фосфотау и тесты на окрашивание серебром) демонстрируют, что лечение эпотилоном D предупреждает потерю нейронов, уменьшает накопление аномального белка Tau и предупреждает образование нейрофибриллярных клубков на уровне статистической зна- 17021758 чимости по сравнению с нелеченными мышами Tg4510. Таким образом, авторы настоящего изобретения в данном случае убеждены в том, что они впервые открыли и продемонстрировали профилактику когнитивного спада, патологии белка Tau и нейродегенерации при лечении соединением, стабилизирующим микротубулы, а именно эпотилоном D. В дополнение к этому, авторы изобретения открыли, что терапевтические эффекты, достигаемые при лечении эпотилоном D, вероятно, проявляют нелинейную дозовую зависимость. Конкретнее, устойчивые результаты с дозовой зависимостью были воспроизводимо получены в каждом из описанных поведенческих и нейропатологических исследованиях, при этом меньшая доза (1 мг/кг) (приблизительно в 100 раз меньше химиотерапевтической дозы в экспериментах с ксенотрансплантатами опухолей) значительно усиливала полезный эффект, наблюдаемый по всем показателям, при сопоставлении с носителем,тогда как более высокая доза (10 мг/кг) демонстрировала тенденцию к улучшению большинства показателей и статистически значимое превосходство над носителем по результатам пробного тестирования вMWM. Пример 6 Эффективность эпотилона D по сравнению с другими стабилизаторами микротубул в экспериментах с ВВ болюсами. В одной группе экспериментов иксабепилон (аналог аза-эпотилона В), соединение II (BMS 310705,21-аминоэпотилон F) и эпотилон D (соединение I) проходили оценку и сравнение с паклитакселом после болюсного ВВ введения в хвостовую вену мышей nude в дозах от 1 до 12 мг/кг (по 3 мыши в группе). Каждое из четырех соединений вводили из расчета 5 мл/кг, используя композицию с 10% кремофора,10% этанола и 80% воды, содержащие 5% декстрозы. Для того чтобы определить относительное проникновение в мозг каждого соединения, проводили измерение уровня соединений в плазме, мозге и печени в разных точках времени после введения единичной дозы, применяя для этого жидкостную хроматографию с тандемной масс-спектрометрией (LC/MS/MS) после экстрагирования органической фазы, как это представлено на фиг. 8A-8D и в табл. 1. У мышей, получавших паклитаксел, уровень лекарства в печени не измеряли. На фиг. 8 А показана концентрация соединения II в плазме, мозге и печени мышей в разных точках времени после ВВ введения дозы 1 мг/кг. На фиг. 8 В показана концентрация иксабепилона в плазме, мозге и печени мышей в разных точках времени после ВВ введения дозы 12 мг/кг. На фиг. 8 С показана концентрация паклитаксела в плазме и мозге мышей в разных точках времени после ВВ введения дозы 4 мг/кг. На фиг. 8D показана концентрация эпотилона D (соединение I) в плазме, мозге и печени мышей в разных точках времени после ВВ введения дозы 5 мг/кг. Данные показали, что соединение II и иксабепилон имели небольшой уровень в мозге по сравнению с периферическими тканями, измеряемый соотношением уровней соединения между мозгом и печенью,особенно в более позднее время после начального распределения лекарства и его клиренса из плазмы. Как и ожидалось, уровень паклитаксела в мозге был невысок. Более конкретно, уровень паклитаксела в мозге не превышал уровня лекарства в плазме по меньшей мере в течение 24 ч после введения дозы. Неожиданно было обнаружено, что эпотилон D (соединение I) имел сочетанные свойства значительно лучшего проникновения в мозг и избирательного удержания в мозге по сравнению с другими соединениями,участвовавшими в настоящем эксперименте, о чем свидетельствовал высокий уровень в мозге, превышавший уровень в печени через 6 и 24 ч после введения дозы. Это демонстрирует неожиданное задерживание эпотилона D (соединение I) в целевом органе (мозге) по отношению к периферии, включая плазму и ткани, особенно печень, которая является потенциальным местом проявления токсичности. Более конкретно, в табл. 1 представлены сравнительные данные по проникновению в мозг для четырех стабилизаторов микротубул-паклитаксела, соединения II (BMS 310705), иксабепилона и эпотилонаD после болюсного введения ВВ дозы (вариации выражены в мг/кг, как это представлено в таблице) мышам nude. Эти данные также отражены на фиг. 8A-8D. Соотношение уровня лекарства между мозгом и плазмой обычно увеличивалось в зависимости от времени, прошедшего после введения дозы для всех соединений, вследствие быстрого выведения из плазмы и удержания лекарства в мозге за счет его связывания с микротубулами. Затем для тех соединений, которые в меньшей степени способны задерживаться в мозге, соотношение уровней между мозгом и плазмой падает, как это наблюдалось для соединения II,продемонстрировавшему снижение между 6 и 24 ч. Несмотря на изменение соотношения между мозгом и плазмой по времени, это соотношение является важным мерилом проникновения в мозг для соединения при сравнении данных в течение небольшого промежутка времени после введения дозы (например, в интервале от 20 до 60 мин). В тех таблицах, которые представлены в настоящем документе, соотношения концентраций веществ между мозгом и плазмой, а также между мозгом и печенью были рассчитаны сначала для отдельных животных, а затем по средним величинам соотношений; которые и представлены в приведенных ниже таблицах. Из табл. 1 видно, что паклитаксел плохо проникает в мозг, о чем свидетельствует его соотношение между мозгом и плазмой 0,1 через 1 ч после введения дозы, иксабепилон проникает в мозг лучше паклитаксела, имея соотношение между мозгом и плазмой 0,73 через 1 ч после введения дозы (табл. 1). В промежутке времени от 6 до 24 ч после введения дозы соотношение концентраций вещества между мозгом и плазмой отражает как способность вещества проникать в мозг, так и задерживаться в мозге (полувыведение). Данные, полученные через 6 и 24 ч после введения дозы эпотилона D, показывают по меньшей мере 60-кратное увеличение соотношения между мозгом и плазмой по сравнению с иксабепилоном, следующим по порядку соединением в этой группе с наивысшим соотношением между мозгом и плазмой. Соотношение между мозгом и печенью не только является более специфическим мерилом удержания в мозге и полувыведения из мозга, но также показателем избирательного удержания по сравнению с периферическими тканями. Это представляется ценным, поскольку печень, выбранная в связи с ее хорошей перфузией и тенденцией к более высоким уровням исследуемых веществ по сравнению со многими другими периферическими тканями, содержит микротубулы, где может задерживаться соединение, в отличие от внеклеточной плазмы. В отличие от соотношения между мозгом и плазмой, где оптимальное время измерения находится в диапазоне 20-60 мин, предпочтительно определять соотношение между мозгом и печенью позже (например, через 24 ч или более после введения дозы), когда уровень вещества в плазме существенно снижается, позволяя, таким образом, провести более точные измерения лекарства,которое специфически задерживается в клетках мозга и печени. Сравнение соотношений между мозгом и печенью показывает, что эпотилон D с высокой избирательностью задерживается в мозге по сравнению с печенью. Например, через 24 ч соотношение между мозгом и печенью для эпотилона D составляет 1204,что заметно больше по сравнению с соотношениями для иксабепилона (1,2) и соединения II (0,02) в той же серии экспериментов. В самостоятельном эксперименте концентрации эпотилона D в плазме и мозге оценивали на протяжении более длительного времени, т.е. до 168 ч после болюсного ВВ введения, используя тот же протокол, что и описанный выше, но с трижды трансгенными мышами среднего возраста (Oddo с соавт., 2003) руками других исследователей. Результаты этого эксперимента приведены ниже в табл. 2 и на фиг. 10. Таблица 2 (только эпотилон D) Приведенные данные демонстрируют длительное задерживание эпотилона D в ткани мозга, составляющее по меньшей мере 168 ч (7 дней) после введения единичной дозы. Приведенные в табл. 1 и 2 данные по абсолютному уровню эпотилона D в мозге и соотношениям варьируются. Важно обратить внимание на то, что эксперименты, описанные в табл. 1 и 2, были проведены раздельно, в разное время, разными исследователями и на разных штаммах мышей. Авторы настоящего изобретения сделали наблюдение,свидетельствующее о том, что небольшие различия по времени выполнения ВВ инъекции могут изме- 19021758 нять точный профиль воздействия препарата, особенно максимальную концентрацию в плазме, которая повлияет на концентрацию в мозге, и далее, что время выполнения ВВ инъекции у разных исследователей может различаться. По этим соображениям лучше всего сравнивать результаты, полученные в пределах одного эксперимента. Несмотря на эту проблему, общие тенденции и относительные характеристики стабилизаторов микротубул при их сравнении друг с другом устойчивы, а приведенные результаты показывают, что эпотилон D обладает высокой способностью проникновения в мозг и лучшим задерживанием в мозге по сравнению с соединением II, иксабепилоном и паклитакселом. Например, даже при впечатляющем сравнении данных, полученных в двух разных экспериментах, соотношение уровней эпотилона D между мозгом и плазмой через 6 ч после введения дозы составило 2046 в табл. 1 и 89 в табл. 2,что заметно больше, чем соотношения в тех же точках времени для паклитаксела (0,37) и соединения II(2,1) в табл. 1. Поскольку уровни веществ в печени в исследовании, представленном в табл. 2, были меньше нижнего предела количественного определения (LLQ = 49 нМ в настоящем исследовании) в точке времени 24 ч, соотношение между мозгом и печенью в этой точке времени оказалось неподдающимся количественному определению (не опр.). Патентный документ WO 03/074053 А 1 широко раскрывает применение некоторых эпотилонов для лечения заболеваний мозга. Согласно этой публикации уровень трех эпотилонов в плазме и мозге (за исключением эпотилона D) измеряли в первые 40 мин после болюсного ВВ введения из расчета 5 мг/кг. Данные по концентрации в мозге и плазме, приведенные в документе WO 03/074053 А 1 для вещества,обозначенного в этой заявке как соединение 1: 4,8-дигидрокси-16-(1-метил-2-(2-метил-4-тиазолил)этенил)-1-окса-7-(1-пропил)-5,5,9,13-тетраметилциклогексадек-13-ен-2,6-дион, а также для паклитаксела воспроизведены в табл 1 ниже. В документе WO 03/074053 данные были приведены в таких единицах как мкг/мл и мин. Эти данные были преобразованы в нМ и представлены в табл. 3 в нМ по часам в целях сравнения. Эти данные (табл. 3) не были независимо подтверждены авторами настоящего исследования,но скорее воспроизводятся на основе величин, представленных в упомянутой публикации (при их преобразовании в часы и нМ). В дополнение к этому следует отметить, что стереоизомерия и/или способ изготовления соединения 1 в документе WO 03/074053 не указаны, а вместо этого приведена ссылка на смесь 13 E/Z (см. с. 13, строка 15). Таблица 3 Поскольку приведены данные только за 40 мин, в настоящем исследовании по соотношению уровней между мозгом и плазмой было возможно оценить только проникновение в мозг. Подразумевается,что паклитаксел плохо проникает в мозг (в соответствии с данными, приведенными в табл. 1), поскольку его уровень в мозге ниже LLQ, хотя этот уровень определения не был раскрыт. В документе WO 03/074053 А 1 не обсуждались показатели удержания в мозге, которые должны определяться по меньшей мере через 24 ч после введения дозы и избирательное проникновение в мозг по сравнению с периферическими тканями. Пример 7 Производительность эпотилона D после перорального введения Для дальнейшего анализа производительности эпотилона D при лечении таупатий это соединение проходило оценку в двух экспериментах, включая пероральное введение через зонд мышам C57BL/6 в дозах 10 и 35 мг/кг соответственно. Кроме того, в этих экспериментах также проходил оценку изомер 4,8-дигидрокси-16-(1-метил-2-(2-метил-4-тиазолил)этенил)-1-окса-7-(1-пропил)-5,5,9,13-тетраметилциклогексадек-13-ен-2,6-дион (соединение III в настоящем документе), а также было проведено непосредственное сравнение между эпотилоном D и соединением III. Ниже сначала приведены экспериментальные подробности изготовления и выделения соединения III, а затем описание биологических данных in vivo. Общая информация об экспериментах В приведенных далее процедурах все температурные показатели даны в градусах Цельсия. Спектры 1H-HMR прогоняли на инструменте Bruker 500, 400 или 300 МГц, а химический сдвиг указывали в ppm со ссылкой на тетраметилсилан (=0,0). Все процедуры выпаривания выполняли под сниженным давлением. Если специально не указано иное, анализы LC/MS выполняли инструментом Waters с применением колонки с обращенной фазой Phenomenex-Luna 3,050 мм S 10 на скорости потока 4 мл/мин, используя 0,1% TFA в градиенте МеОН/вода [0-100% в течение 3 мин со временем пробега 4 мин] и УФдетектор, настроенный на 220 нМ, либо колонки с обращнной фазой Phenomenex-Luna 3,050 мм 10u на скорости потока 5 мл/мин, используя 10 мМ аммония ацетат в градиенте ацетонитрил/вода [5-95% в течение 3 мин со временем пробега 4 мин] и УФ-детектор, настроенный на 220 нМ. Если специально не указано иное, процедуры очистки проводили на колонках силикагеля с ячейками 40-63, или применяя систему BIOTAGE Horizon system, или применяя соответствующее оборудование и технические условия HPLC (ВЭЖХ). Этап 1 К раствору соли фосфония А (приготовленному по Nicolaou с соавт., J. Am. Chem. Soc., 119: 79747991 (1997); 40,5 г, 57,9 ммоль) в 300 мл THF при 0 добавляли натрия бис-(триметилсилил)амид (63,7 мл, 63,7 ммоль), перемешивая раствор в течение 5 мин. Быстро добавляли раствор (6S)-6-метил-7(тетрагидро-2 Н-пиран-2-илокси)гептан-2-она (приготовленный в соответствии с документом US 7326798; 14,54 г, 63,7 ммоль) в 50 мл THF, а полученную смесь оставляли для согревания при комнатной температуре на 16 ч. Реакционную смесь выливали в насыщенный NH4Cl и экстрагировали EtOAc (300 мл). Органический слой отмывали рассолом, высушивали над сульфатом магния, фильтровали и выпаривали в вакууме. Полученный сырьевой продукт очищали в колонке с силикагелем (EtOAc/гексан 0-10%), получая на выходе 16 г (30,7 ммоль, 53%) синтетического промежуточного продукта-1. 1 Н HMR (500 МГц, CDCl3) Синтетический промежуточный продукт-2 К раствору синтетического промежуточного продукта-1 (16 г, 30,7 ммоль) в 300 мл этанола при комнатной температуре добавляли моногидрат р-толуолсульфоновой кислоты (5,83 г, 30,7 ммоль). Смесь продолжали перемешивать 7 ч, выливали в насыщенный NaHCO3 и дважды экстрагировали метиленхлоридом (300 мл). Объединенные органические слои отмывали рассолом и высушивали над сульфатом магния. После фильтрации и удаления растворителя сырьевой материал очищали, используя системуBIOTAGE (EtOAc/гексан, 10-45%), получая на выходе 9,8 г (22,4 ммоль, 73%) синтетического промежуточного продукта-2. 1 Н HMR (500 МГц, CDCl3)ppm 6,92-6,90 (m, 1 Н), 6,45-6,40 (m, 1H), 5,15-5,00 Синтетический промежуточный продукт-3 К раствору оксалилхлорида (2,94 мл, 33,6 ммоль) в 100 мл метиленхлорида медленно добавляли промежуточный продукт-2 (7 г, 15,99 ммоль) в 100 мл метиленхлорида и продолжали перемешивание еще 30 мин. Затем добавляли TEA (11,14 мл, 80 ммоль) и давали смеси согреться до -10. После добавления насыщенного NaHCO3 реакционную смесь дважды экстрагировали метиленхлоридом (100 мл). Объединенные органические слои отмывали рассолом, высушивали над Na2SO4, фильтровали и выпаривали,получая сырьевой продукт в виде желтого масла. Фильтрация через короткую колонку SiO2, элюирование растворителем 15 % EtOAc/гексан и концентрация в вакууме давали на выходе 7 г (16 ммоль, 100 %) синтетического промежуточного продукта-3 в виде бесцветного масла. 1 Н HMR (500 МГц, CDCl3)ppm 9,6-9,5 (d, 1H), 6,9 (m, 1 Н),6,4 (m, 1H), 5,2-5,1 (m, 1H), 4,1-4,0 (m, 1H), 2,7 (s, 3H), 2,3-2,2 (m, 3H), 2,2-1,8-78 добавляли 70 мл 0,5 М свежеприготовленного LDA (35 ммоль), а затем 8,48 г (35 ммоль) (S)-2-(2,2 диметил-1,3-диоксан-4-ил)-2-метилгептан-3-она (Klar с соавт., Synthesis, 2: 301-305 (2005. Перемешивание продолжали еще 30 мин при -30. После охлаждения до -78 добавляли раствор 1,0 М ZnCl2 ( 35,0 мл, 35 ммоль), а полученный раствор перемешивали 20 мин. В течение 20 мин добавляли раствор синтетического промежуточного продукта-3 (7 г, 16,06 ммоль) в 50 мл THF. Смесь продолжали перемешивать еще 8 ч при -78. Смесь выливали в насыщенный NH4Cl дважды экстрагировали EtOAc (300 мл). Органические слои отмывали рассолом, высушивали над Na2SO4 и концентрировали в вакууме. Осадок очищали, используя колонку SiO2 (EtOAc/гексан, 0-10%) и получая на выходе 7,5 г (11 ммоль, 69%) синтетического промежуточного продукта-4 в виде первого элюирующего и главного альдольного изотера. 1 Н Синтетический промежуточный продукт-5 К раствору синтетического промежуточного продукта-4 (8 г, 11,8 ммоль) в 200 мл метиленхлорида при 0 добавляли 2,6-лутидин (6,87 мл, 59 ммоль), а затем трет-бутилдиметилсилил трифторметансульфонат (8,13 мл, 35,4 ммоль). Смеси давали согреться до комнатной температуры в течение 16 ч, выливали ее в насыщенный NaHCO3 и экстрагировали метиленхлоридом. Органические слои отмывали рассолом, высушивали надNa2SO4, а растворители удаляли в вакууме. Осадок очищали в колонке SiO2 (EtOAc/гексан, 5-10%), получая на выходе синтетический промежуточный продукт-5 (7,8 г, 9,84 ммоль, 83%). 1H HMR (500 МГц, CDCl3)ppm 6,90 (s, 1H), 6,44 (s, 1H), 5,15-5,05 (m, 1H), 4,25-4,20 (m, 1H), 4,10-4,00 (m, 1H), 4,00-3,90 (m, 1H), 3,90-3,75 (m,1H), 3,75-3,70 (m, 1H), 3,10-3,00 (, 1H), 2,70 (s, 3 Н), 2,35-2,15 (m, 2H), 2,00-1,85 (m, 5H), 1,70-0,75 (m, 50H),0,100,05 (m, 12H), MS (LCMS) [M+H] = 792,48, [M+Na] = 814,44. Этап 6 Синтетический промежуточный продукт-6 К раствору синтетического промежуточного продукта-5 (6,8 г, 8,58 ммоль) в 100 мл этанола при комнатной температуре добавляли моногидрат р-толуолсульфоновой кислоты (1,8 г, 9,44 ммоль). После перемешивания в течение 6 ч добавляли насыщенный NaHCO3 и экстрагировали смесь EtOAc. Органические слои отмывали рассолом, высушивали над Na2SO4 и концентрировали в вакууме. Реакцию повторяли, используя 1 г синтетического промежуточного продукта-5. Объединенные сырьевые продукты очищали, используя систему BIOTAGE (EtOAc/гексан, 10-40%) и получая на выходе синтетический промежуточный продукт-6 (5 г, 6,65 ммоль, 68%). 1 Н HMR (500 МГц, CDCl3)ppm 6,9 (s, 1H), 6,44 (s, 1H),5,15-5,05 (m, 1H), 4,15-4,00 (m, 1H), 4,00-3,90 (m, 1H), 3,90-3,80 (m, 1H), 3,75-3,65 (m, 1H), 3,65-3,55 (m,1H), 3,10-2,90 (m, 2H), 2,69 (s, 3H), 2,25-2,15 (m, 2H), 2,00-0,75 (m, 50H), 0,100,05 (m, 12H). MS (LCMS) Синтетический промежуточный продукт-7 К раствору синтетического промежуточного продукта-6 (8 г, 6,65 ммоль) в 200 мл метиленхлорида при 0 добавляли 2,6-лутидин (7,7 мл, 59 ммоль), а затем трет-бутилдиметилсилил трифторметансульфонат (9,16 мл, 39,9 ммоль). Смеси давали согреться до комнатной температуры в течение 16 ч, а затем выливати ее в насыщенный NaHCO3 и экстрагировали метиленхлоридом. Органический растворитель выпаривали, а сырьевую смесь фильтровали через слой SiO2 с EtOAc/гексаном (10-20%), получая на выходе синтетический промежуточный продукт-7 в виде масла (6,9 г, 100%). 1 Н HMR (500 МГц, CDCl3)ppm 6,9 (s, 1H), 6,44 (s, 1H), 5,20-5,05 (m, 1H), 4,10-4,00 (m, 1H), 3,95-3,85 (m, 1H), 3,80-3,75 (m, 1H), 3,70-3,60 Синтетический промежуточный продукт-8 К раствору синтетического промежуточного продукта-7 (5 г, 5,1 ммоль) в 80 мл метиленхлорида и 40 мл МеОН при 0 добавляли (+/-)-камфор-10-сульфоновую кислоту (1,18 г, 5,1 ммоль). Смесь перемешивали 6 ч при 0, выливали в насыщенный NaHCO3 и экстрагировали метиленхлоридом. Органические слои отмывали рассолом, высушивали над Na2SO4 и концентрировали, получая на выходе синтетический промежуточный продукт-8 в виде масла (3,6 г, 4,15 ммоль, 81%). 1 Н HMR (500 МГц, CDCl3)ppm 6,90 Синтетический промежуточный продукт-9 К раствору оксалилхлорида (0,8 мл, 9,14 ммоль) в 40 мл метиленхлорида при -78 добавляли DMSO(1,24 мл, 17,5 ммоль). После 10-минутного перемешивания добавляли раствор синтетического промежуточного продукта-8 (3,6 г, 4,15 ммоль) в 40 мл метиленхлорида. Спустя 30 мин добавляли TEA (376 мл,27,0 ммоль) и реакционной смеси давали согреться до 0 в течение 2 ч. Затем добавляли насыщенныйNaHCO3 и экстрагировали смесь метиленхлоридом. Органические слои отмывали рассолом, высушивали над Na2SO4 и концентрировали в вакууме, получая на выходе синтетический промежуточный продукт-9 в виде масла (3,6 г, 4,16 ммоль, 100%). 1 Н HMR (500 МГц, CDCl3)ppm 9,77 (m, 1H), 6,9 (s, 1H), 6,44 (s,1H), 5,3 (s, 1H), 5,2-5,1 (m, 1H), 4,5-4,4 (m, 1H), 4,1-4,0 (m, 1H), 3,8-3,7 (m, 1H), 3,1-3,0 (m, 1H), 2,7 (s, 3H),2,6-2,1 (m, 4H), 2,0-1,9 (m, 4H), 1,7-1,5 (m, 4H), 1,5-1,3 (m, 5H), 1,3-1,1 (m, 5H), 1,1-1,0 (m, 3H), 1,0-0,8 (m,35H), 0,10,1 (m, 18H). Этап 10 Синтетический промежуточный продукт-10 К раствору синтетического промежуточного продукта-9 (3,6 г, 4,16 ммоль) в 120 мл t-BuOH и 85 млTHF при 0 добавляли 30 мл воды, 2-метибут-1-ен (18,5 г, 264 ммоль), дигидрофосфат натрия (1,6 г, 13,2 ммоль) и хлорит натрия (2,98 г, 26,4 ммоль). После перемешивания в течение 2 ч при 0 смесь выливали в насыщенный раствор Na2S2O3 (100 мл) и трижды экстрагировали EtOAc (300 мл). Объединенные органические слои отмывали рассолом, высушивали над Na2SO4 и концентрировали в вакууме. Осадок очищали, используя систему BIOTAGE (EtOAc/гексан, 10-50%), получая на выходе синтетический промежуточный продукт-10 в виде бесцветного масла (2,8 г, 3,18 ммоль, 72%). 1 Н HMR (500 МГц, CDCl3) Синтетический промежуточный продукт-11 К раствору синтетического промежуточного продукта-10 (2,8 г, 3,18 ммоль) в 5 мл THF при комнатной температуре добавляли TBAF (42 мл, 1,0 М). Смесь перемешивали в течение 6 ч, затем выливали в насыщенный NH4Cl и дважды экстрагировали EtOAc (300 мл). Объединенные органические слои отмывали HCl (1,0 N, 200 мл), насыщенным NaHCO3 и рассолом и высушивали над Na2SO4, получая на выходе синтетический промежуточный продукт-11 в виде вязкого масла (2,6 г, 3,3 ммоль, 100%). 1 Н Смесь 13 E/Z соединения III К раствору синтетического промежуточного продукта-11 (2,6 г, 3,3 ммоль) в 27 мл THF при комнатной температуре добавляли TEA (2,36 мл, 17 ммоль), а затем 2,4,6-трихлорбензоилхлорид (3,31 г,13,57 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 20 мин, а затем разбавляли 260 мл толуола. Раствор толуола медленно добавляли к перемешиваемой смеси DMAP (3,86 г, 31,6 ммоль) в 1400 мл толуола в течение 4 ч, после чего TLC (ТСХ) указывала на завершение реакции. Затем добавляли HCl (4,0 N, 12,5 мл), а растворитель удаляли в вакууме. Осадок частично очищали, используя систему BIOTAGE(EtOAc/гексан, 0-10%) и получая на выходе смесь, которая содержала моносилильный продукт и вышеуказанную смесь (изомеры 13 E/Z), включая соединение III (1,1 г). MS (LCMS) (520,2, 634,2). Этот мате- 24021758 риал был подвергнут снятию защитных групп без дальнейшей очистки. Этап 13 Соединение III К раствору вышеуказанной реакционной смеси (102 мг) при -20 добавляли 1 мл TFA/CH2Cl2 (20% об./об.). Реакционную смесь переносили на ледяную баню и перемешивали 1 ч. Растворитель удаляли в вакууме, добавляя маленькие порции толуола, затем повторно выпаривали, получая твердое белое вещество. Ту же реакцию повторяли со 125 мг частично очищенной смеси. Два осадка реакции объединяли и очищали в колонке SiO2 (EtOAc/гексан, 20-35 %), получая на выходе твердое белое вещество (180 мг). Твердое белое вещество помещали в 5 мл МеОН и очищали посредством HPLC (детектор Varian, Dynamax PDA-2, колонка Waters С 18; А: вода с 0,05% TFA; В: ацетонитрил с 0,05% TFA, изократический). Отбирали два главных пика (пик 1, 73,4 мг, 38% и пик 2, 41,8 мг, 22%). Пик 1 был определен как изомер 13-Z (нумерация 1-окса) в результате наблюдения NOE между олефиновым протоном С-14 и метилом С-13. 1 Н HMR (500 МГц, CDCl3)ppm 7,14 (s, 1H), 6,75 (s, 1 Н),5,15-5,05 (m, 1 Н), 5,05-5,00 (m, 1H), 4,45-4,35 (m, 1H), 3,65-3,55 (m, 1 Н), 3,35-3,25 (m, 1 Н), 2,92 (s, 3 Н),2,55-2,45 (m, 2 Н), 2,35-2,25 (m, 2 Н), 2,25-2,15 (m, 1 Н), 2,00 (s, 3H), 1,90-1,80 (m, 1H), 1,80-1,65 (m, 5H),1,60-1,45 (m, 2H), 1,45-1,30 (m, 5H), 1,25-1,15 (m, 3H), 1,05-0,95 (m, 6H), 0,90-0,85 (t, 3H). MS (LCMS)[M+H] = 520,3. Пик 2 был определен как изомер 13-Е (соединение III в эксперименте из примера 7, ниже) по отсутствию NOE между олефиновым протоном С-14 и метилом С-13. 1 Н HMR (500 МГц, CDCl3)ppm 7,03 (s,1H), 6,65 (s, 1 Н), 5,3-5,2 (m, 1H), 5,05-5,00 (m, 1H), 4,45-4,40 (m, 1H), 3,65-3,60 (m, 1H), 3,4-3,3 (m, 1H),2,77 (s, 3H), 2,6-2,3 (m, 4H), 2,15-2,05 (m, 1H), 1,99 (s, 3H), 1,95-1,85 (m, 1H), 1,8-1,7 (m, 2H), 1,57 (s, 3H),1,50-1,35 (m, 4H), 1,29 (s, 3H), 1,25-1,10 (m, 3H), 1,0-0,9 (m, 6H), 0,9-0,8 (t, 3H). MS (LCMS) [M+H] = 520,3. Исследования эпотилона D и соединения III in-vivo при пероральном введении Каждое соединение (эпотилон D и соединение III, приготовление и описание которых даны в эксперименте, представленном непосредственно выше) вводили трем мышам в каждой группе (10 и 35 мг/кг) в дозах из расчета 10 мл/кг, используя 85% PEG-400, 10% TPGS и 5,0% этанола. С различными интервалами после введения доз измеряли уровни веществ в плазме, мозге и печени после гомогенизации тканей, экстракции ацетонитрилом и жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией(LC/MS/MS). Результаты исследований в сводном виде представлены в табл. 4 и 5, а результаты исследования по дозе 35 мг/кг также представлены на фиг. 9. Конкретно, табл. 4 приводит данные по концентрации эпотилона D (соединение 1) и соединения III в мозге до 24 ч после перорального введения дозы 10 мг/кг (для соединения III до порога выявления, определяемого LLQ), а в табл. 5 и на фиг. 9 приведены данные по концентрации эпотилона D (соединение 1) и соединения III в мозге в период от 5 до 24 ч после перорального введения дозы 35 мг/кг (для соединения III опять до порога выявления). (По данным,представленным в табл. 4, график не был составлен, поскольку для соединения III была определена только одна величина концентрации.) Если в табл. 4 и 5, представленных ниже, величины оказывались меньше LLQ, то значение LLQ указывается в скобках. Таблица 4 Как можно увидеть для соединения III, показатели его уровня в тканях в более позднее время (т.е. спустя 1 ч или более) свидетельствуют о том, что уровень соединения III быстро снижается в мозговой ткани. Следовательно, соединение III плохо задерживается в мозге, о чем свидетельствует отсутствие поддающегося измерению уровня в мозге через 24 ч в обоих экспериментах. При пероральном введении доз эпотилона D соотношение уровней между мозгом и плазмой через 1 ч составило 0,7 и 1,1, что отражает хорошее проникновение в мозг. В отличие от соединения III уровень эпотилона D в мозге поддерживался более 24 ч (табл. 2, 4 и 5, фиг. 9-10). Соотношение концентраций эпотилона D между мозгом и печенью при пероральном введении указывает на то, что эпотилон D избирательно задерживается в мозге, что согласуется с данными, приведенными в табл. 1 и 2 для ВВ введения. Особенно следует отметить,что соотношение между мозгом и печенью для эпотилона D составляло 8 и 19 через 24 ч после введения доз 10 и 35 мг/кг соответственно (табл. 4 и 5). Эти величины отражают необыкновенно высокую степень избирательного удержания эпотилона D в мозге по сравнению с печенью. Пример 8 Данные о полувыведении эпотилона D после внутривенного, перорального и внутривенного введения Для дальнейшей оценки свойств эпотилона D при лечении таупатий во многих исследованиях рассчитывали время полувыведения эпотилона D, а результаты этих исследований приведены в табл. 6. Для расчета точного периода полувыведения из мозга применительно к соединению с длинным периодом полувыведения нужно получить несколько оценок после введения единичной дозы. По результатам исследования, описанного в табл. 2, когда концентрации измеряли в течение 7 дней после введения единичной дозы, период полувыведения из мозга для эпотилона D (соединение I) при ВВ введении составил 61 ч (табл. 6). Период полувыведения из мозга у мышей при нескольких способах введения и разных дозах составил в среднем 46,07 ч (табл. 6). Сходным образом, период полувыведения из мозга у крыс после ВВ введения составил 31 ч (табл. 6). В отличие от этого период полувыведения из мозга для соединения III был значительно короче, чем для эпотилона D, что отображено на фиг. 9. В качестве дополнительной иллюстрации полувыведения эпотилона D из мозга представлена фиг. 10, на которой в виде графика отображены результаты исследования (данные из которого приведены в табл. 2, выше). Эта фигура показывает уровень концентрации в мозге на протяжении времени до 175 ч после введения дозы 5 мг/кг посредством болюсной ВВ инъекции. Таблица 6Zhang, B. et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(1): 227-231 (2005). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения болезни Альцгеймера, включающий внутривенное введение терапевтически эффективного количества эпотилона D пациенту, нуждающемуся в этом, где вводимая пациенту накопленная месячная доза эпотилона D составляет от 0,01 до 5 мг/м 2. 2. Способ по п.1, при котором введение эпотилона D характеризуется соотношением концентраций мозг/плазма 0,5 или более при измерении в интервале от 20 мин до 1 ч после введения дозы; и одно или оба из: 1) период полувыведения из мозга 24 ч или более и 2) концентрация эпотилона D в мозге в 4 раза или более превышает его концентрацию в печени через 24 ч или более после введения дозы. 3. Способ по п.1, при котором достигается терапевтическая эффективность в лечении болезни Альцгеймера у пациента, не вызывая индуцированных лекарством побочных эффектов, которые потребовали бы прекратить лечение эпотилоном D. 4. Способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, которым является человек, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества эпотилона D пациенту, где эпотилон D вводится внутривенно, в соответствии с режимом дозирования, который обеспечивает накопленную месячную дозу эпотилона D пациенту от 0,01 до 5 мг/м 2, и где эпотилон D терапевтически эффективен в оказании влияния на основное заболевание и/или обеспечении когнитивной выгоды пациенту, не вызывая индуцированных лекарством побочных эффектов, которые потребовали бы прекратить лечение эпотилоном D.