Антитела, направленные против ангиопоэтина-1 и ангиопоэтина-2, и их применение
Формула / Реферат
1. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, имеющие последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается по меньшей мере с одним из лигандов Ang-1 и Ang-2 рецептора Tie-2.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее константную область IgG человека.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где изотип константной области IgG представляет собой IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.3, содержащее константный домен легкой цепи.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, где константный домен легкой цепи представляет собой константный домен каппа.
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее константный домен иммуноглобулина человека.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.6, где аминокислотные последовательности константной области тяжелой цепи выбраны из последовательностей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, и аминокислотные последовательности константной области легкой цепи выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 44 и 46.
8. Антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где фрагмент представляет собой Fab, F(ab')2, Fv фрагмент, одноцепочечное антитело или scFv фрагмент.
9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, дополнительно содержащее детектируемую метку.
10. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1.
11. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.10.
12. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.11.
13. Клетка-хозяин по п.12, где клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.
14. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1, включающий экспрессию указанного антитела в клетке-хозяине по п.12.
15. Способ по п.14, где клетка-хозяин представляет собой клетку CHO.
16. Фармацевтическая композиция для ингибирования нежелательного ангиогенеза, содержащая терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1 совместно с фармацевтически приемлемым носителем.
17. Фармацевтическая композиция по п.16, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно связано с молекулой, выбранной из группы, состоящей из молекулы-репортера, водорастворимого полимера, Fc-фрагмента антитела и цитотоксического агента.
18. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-9 для ингибирования нежелательного ангиогенеза у субъекта, нуждающегося в этом.
19. Применение по п.18, где нежелательный ангиогенез связан с раком.
Текст
Согласно настоящему изобретению предложены специфичные связывающие агенты, такие как изолированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, специфически связывающиеся по меньшей мере с одним из лигандов Ang1 и Ang2 рецептора Tie 2, а также способы их получения и применение для ингибирования нежелательного ангиогенеза у субъекта. Также описаны фармацевтические композиции для ингибирования нежелательного ангиогенеза, содержащие указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Также описаны изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты; векторы, содержащие указанные молекулы. Область техники Настоящее изобретение относится к специфичным связывающим агентам, распознающим и связывающим ангиопоэтины-1 (Ang-1) и/или ангиопоэтин-2 (Ang-2). В частности, изобретение относится к получению, применению в диагностике и терапевтическому применению моноклональных и поликлональных антител, а также антигенсвязывающих фрагментов таких антител, специфично связывающихAng-1 и/или Ang-2. Также аспекты изобретения относятся к гибридомам или другим линиям клеток, экспрессирующим указанные антитела. Описанные антитела пригодны для применения в диагностике и лечении заболеваний, связанных с активностью и повышенной продукцией Ang-1 или Ang-2. Уровень техники Ангиогенез, образование новых кровеносных сосудов из уже существующих, имеет существенное значение для многих физиологических и патологических процессов. В норме ангиогенез строго регулируется про- и антиангиогенными факторами, но в случае таких заболеваний, как рак, неоваскулярные заболевания глаз, артрит и псориаз, в данном процессе могут появляться отклонения. Folkman, J., Nat.Med., 1:27-31 (1995). Существует ряд заболеваний, связанных с нарушением регуляции или нежелательным ангиогенезом. Такие заболевания включают, но не ограничиваются следующими: неоваскуляризация глаза, например ретинопатии, включая диабетическую ретинопатию, возрастная дегенерация желтого пятна, псориаз,гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, заболевания воспалительного характера, например ревматоидные или ревматические воспалительные заболевания, в частности артрит (включая ревматоидный артрит), или другие хронические заболевания воспалительного характера, например хроническая астма,артериальный или посттрансплантационный атеросклероз, эндометриоз, и неопластические заболевания,например так называемые солидные (твердые) опухоли и жидкостные (или гематопоэтические) опухоли(например, лейкемия и лимфомы). Специалистам в данной области также известны другие заболевания,связанные с нежелательным ангиогенезом. Хотя в процесс регуляции ангиогенеза вовлечены многие системы трансдукции, одной из наиболее изученных является система, селективная в отношении клеток эндотелия, которая включает рецепторную тирозинкиназу Tie-2 (также называемую "Tie-2" или "Tie-2R" (также именуемый "ORK"); рецепторTie-2 мыши также именуется "tek") и ее лиганды, ангиопоэтины (Gale, N.W. and Yancopoulos, G.D., GenesDev. 13:1055-1066 [1999]). В настоящее время известны 4 типа ангиопоэтинов: от ангиопоэтина-1 ("Ang1") до ангиопоэтина-4 ("Ang-4"). Указанные ангиопоэтины также называют "лигандами Tie-2" (Davis, S.,et al., Cell, 87:1161-1169 [1996]; Grosios, K., et al., Cytogenet Cell Genet, 84:118-120 [1999]; Holash, I., et al.,Investigative OphthalmologyVisual Science, 42:1617-1625 [1999]; Koblizek, T.I., et al., Current Biology,8:529-532 [1998]; Lin, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:8829-8834 [1998]; Maisonpierre, P.C., et al.,Science, 277:55-60 [1997]; Papapetropoulos, A., et al., Lab Invest, 79:213-223 [1999]; Sato, T.N., et al., Nature,375:70-74 [1998]; Shyu, K.G., et al., Circulation, 95:2081-2087 [1998]; Suri, C., et al., Cell, 57:1171-1180Academy of Sciences of the USA, 96:1904-1909 [1999]; Witzenbichler, В., et al., J. Biol. Chem., 273:1851418521 [1998]). В то время как связывание Ang-1 с Tie-2 стимулирует фосфорилирование рецептора в культуре клеток эндотелия, для Ang-2 проявляет как агонистические, так и антагонистические свойства в отношении фосфорилирования рецептора Tie-2 (Davis, S., et al. [1996], supra; Maisonpierre, P.C., et al.Maisonpierre, et al., Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001. Фенотипы мышей с нокаутом по Tie-2 и Ang-1 сходны, что позволяет предположить, что процесс фосфорилирования Tie-2, стимулируемый Ang-1, опосредует ремоделирование (перестройку) и стабилизацию образующихся сосудов in utero путем обеспечения адгезии к эндотелиальным поддерживающим клеткам (Dumont, D.J., et al., GenesDevelopment, 5:1897-1909 [1994]; Sato, T.N., et al., Nature, 376:70-74[1995]; Suri, C., et al. [1996], supra). Считается, что роль Ang-1 в стабилизации сосудов сохраняется и во взрослом состоянии, когда он экспрессируется на значительном уровне и конститутивно (Hanahan, D.,Science, 277:48-50 [1997]; Zagzag, D., et al., Experimental Neurology, 759:391-400 [1999]). Напротив, экспрессия Ang-2, в основном, ограничена областями перестройки сосудов, в которых он, как считают, блокирует функцию Ang-1, и, таким образом, индуцирует состояние пластичности сосудов, благоприятное для процессов ангиогенеза (Hanahan, D. [1997], supra; Holash, I., et al., Science, 254:1994-1998 [1999]; Maisonpierre, P.C., et al. [1997], supra). Многочисленные опубликованные результаты исследований указывают на сосудоселективную экспрессию Ang-2 при болезненных состояниях, связанных с ангиогенезом. Такие патологические состояния включают, например, псориаз, дегенерацию желтого пятна и рак (Bunone, G., et al., American Journal[2000]; Zagzag, D., et al. [1999] supra). Большинство упомянутых исследований сфокусированы на раке,при котором многие типы опухолей демонстрируют экспрессию Ang-2 в сосудах. В противоположность экспрессии при патологическом ангиогенезе экспрессия Ang-2 в нормальных тканях чрезвычайно ограничена (Maisonpierre, Р.С., et al. [1997], выше; Mezquita, J., et al., Biochemical and Biophysical ResearchCommunications, 260:492-498 [1999]). В нормально функционирующем взрослом организме тремя основными областями ангиогенеза являются яичники, плацента и матка; перечисленные ткани в норме являются первичными (т.е. нераковыми) тканями, в которых обнаруживается мРНК Ang-2. Некоторые функциональные исследования указывают на то, что Ang-2 может быть вовлечен в ангиогенез опухолей. Ahmad et al. (Cancer Res., 61:1255-1259 [2001]) описывают сверхэкспрессию Ang-2 и показывают ее возможную связь с усилением роста опухоли в модели с мышами с ксенотрансплантатами. См. также источники Etoh et al., выше, и Tanaka et al., выше, в которых представлены данные, предполагающие связь сверхэкспрессии Ang-2 с гиперваскуляризацией опухоли. Тем не менее, в противоположность этому, Yu et al. (Am. J. Path., 158:563-570 [2001]) приводят данные, показывающие, что сверхэкспрессия Ang-2 в легочной карциноме Льюиса и клетках ТА 3 карциномы молочной железы предположительно увеличивали время жизни мыши, которой инъецировали соответствующие транфектанты. В последние несколько лет в различных публикациях Ang-1, Ang-2 и Tie-2 рассматривались как возможные мишени для противораковой терапии. Например, в патентах США 6166185, 5650490 и 5814464 раскрыты антитела к лигандам Tie-2 и телам рецепторов. Патент США 2003/0124129 А 1 описывает отдельные антитела к Ang-2 и их применение в лечении рака. Lin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA,95:8829-8834 [1998]) инъецировали мышам аденовирус, экспрессирующий растворимый рецептор Tie-2; растворимый Tie-2, предположительно, снижал количество и размеры опухолей, развивавшихся у мышей. В связанном исследовании Lin et al. (J. Clin. Invest., 100:2072-2078 [1997]) вводили растворимую форму Tie-2 крысам; данное вещество предположительно снижало размер опухоли у крысы. Siemeister etal. (Cancer Res., 59:3185-3189 [1999]) получили линии клеток меланомы человека, экспрессирующие внеклеточный домен Tie-2, клетки таких линий вводили бестимусным ("nude") мышам и пришли к выводу,что присутствие растворимого Tie-2, предположительно, вело к "значительному ингибированию" роста опухоли, а также ангиогенеза опухоли. Следовательно, эффективная терапия, направленная против Ang-2, может быть полезной для большого числа пациентов, больных раковыми заболеваниями, так как большинству солидных опухолей для достижения размеров более 1-2 мм в диаметре требуется процесс неоваскуляризации. Такая терапия может найти широкое применение при лечении других заболеваний, связанных с ангиогенезом, таких как ретинопатии, артрит и псориаз. Сущность изобретения Несмотря на то что многочисленные данные указывают на пригодность ингибирования уровнейAng-2 в лечении нежелательного ангиогенеза (или любой группы состояний, включающих нежелательное образование кровеносных сосудов, таких как артериогенез), при существующем уровне техники не ясно, будет ли пригодным в терапии одновременное ингибирование Ang-1, и, если это так, какая степень ингибирования Ang-1, в дополнение к ингибированию Ang-2, может потребоваться для обеспечения, по меньшей мере, аддитивного терапевтического эффекта. Соответственно, настоящее изобретение направлено на удовлетворение непризнанной потребности в определении новых агентов, которые специфично распознают и связывают как лиганды Ang-1, так и лиганды Ang-2. Связывающие агенты, такие как антитела согласно настоящему изобретению, обладают требуемыми уровнями активности ингибирования какAng-2, так и Ang-1, что делает их особенно полезными во многих областях применения, таких как диагностический скрининг, биологические исследования и терапевтическое вмешательство при заболеваниях, связанных с активностью Ang-1 и/или Ang-2, таких как рак, воспаления и другие заболевания, связанные с нежелательным ангиогенезом. Различные варианты реализации настоящего изобретения относятся к связывающим агентам направленного действия, которые специфично связывают Ang-1 и/или Ang-2, и, соответственно, ингибируют физиологический или патологический ангиогенез. Механизмы достижения указанного результата включают, но не ограничиваются следующими: ингибирование связывания Ang-1 и/или Ang-2 с рецепторами Tie-1 и/или Tie-2, ингибирование передачи сигнала Tie-1 и/или Tie-2, индуцируемой Ang-1 и/илиAng-2, или повышенный клиренс Ang-1 и/или Ang-2 из организма пациента и соответственно снижение эффективной концентрации Ang-1 и/или Ang-2. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к изолированному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, имеющие последовательности, выбранные из группы, состоящей из: где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается по меньшей мере с одним из лигандов Ang-1 и Ang-2 рецептора Tie-2. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему константную область IgG человека. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где изотип константной области IgG представляет собой IgG1, IgG2,IgG3 или IgG4. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему константный домен легкой цепи. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где константный домен легкой цепи представляет собой константный домен каппа. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему константный домен иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где аминокислотные последовательности константной области тяжелой цепи выбраны из последовательностей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, и аминокислотные последовательности константной области легкой цепи выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 44 и 46. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где фрагмент представляет собой Fab, F(ab')2, Fv фрагмент, одноцепочечное антитело или scFv фрагмент. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, дополнительно содержащему детектируемую метку. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к вектору, содержащему вышеуказанную молекулу нуклеиновой кислоты. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вышеуказанный вектор. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к клетке-хозяину, где клетка-хозяин представляет собой клетку CHO. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к способу получения вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающему экспрессию указанного антитела в клетке-хозяине. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к вышеуказанному способу, где клетка-хозяин представляет собой клетку CHO. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования нежелательного ангиогенеза, содержащей терапевтически эффективное количество вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к фармацевтической композиции, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно связан с молекулой, выбранной из группы, состоящей из молекулы-репортера, водорастворимого полимера, Fc-фрагмента антитела и цитотоксического агента. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к применению вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для ингибирования нежелательного ангиогенеза у субъекта, нуждающегося в этом. Согласно одному варианту реализации изобретения изобретение относится к применению, где нежелательный ангиогенез связан с раком. Другие варианты реализации настоящего изобретения будут очевидны из раскрытия сущности,приведенного в настоящем изобретении. Краткое описание чертежей На фиг. 1 изображен график изменения размера опухоли (ось у) в зависимости от времени (ось х) в организме мыши-носителя опухоли, которую подвергали воздействию либо антитела, направленного против Ang-1/2 (H4L4, H4L11 или H6L7) согласно изобретению, либо высокоактивного пептидного антитела, применяемого в качестве контроля (AMG 386), либо антитела 536, в сравнении с лечением с использованием антитела-контроля изотипа. Подробности описаны в примерах. На фиг. 2 изображена масса опухоли (% жизнеспособной опухоли [срединный срез]массу опухоли) в организме мыши-носителя опухоли, которую подвергали воздействию либо антитела, направленного против Ang-1/2 (H4L4, H4L11 или H6L7), согласно изобретению, либо высокоактивного пептидного антитела, применяемого в качестве контроля (AMG 386), либо антитела 536, в сравнении с лечением с использованием изотипического контроля. Подробности описаны в примерах. На фиг. 3 изображено влияние H4L4, H4L11 и H6L7 согласно изобретению, высокоактивного пептидного антитела, применяемого в качестве контроля (AMG 386) и антитела 536 на пролиферацию клеток эндотелия в организме мыши-носителя опухоли Colo205. Подробности описаны в примерах. На фиг. 4 изображена зависимость ответа от дозы у мышей-носителей опухоли Colo205 от дозы антитела H4L4. Подробности описаны в примерах. На фиг. 5 показано влияние антитела H4L4 на массу опухоли Colo205 in vivo. Подробности описаны в примерах. На фиг. 6 показано влияние антитела H4L4 на пролиферацию клеток эндотелия в организме мышиносителя опухоли Colo205. Подробности описаны в примерах. На фиг. 7 отображена нейтрализация индуцированного Ang-1 фосфорилирования Tie-2 в легких мыши при помощи системно вводимого mL4-3. Мышей (n = 3 в группе) подвергали воздействию L1-7(N)(2 мг/кг), mL4-3 (20 мг/кг) или контроля Fc (20 мг/кг) ежедневно в течение 23 дней перед внутривенным введением Ang-1 или БСА. На следующем этапе производили забор легких мыши, и при помощи анализа методом Вестерн-блот определяли уровни фосфорилирования Tie-2. Приведенные данные являются средними значениямиSE (стандартная ошибка). Р = 0.0005 vs Ang-1 плюс Fc, ANOVA (дисперсионный анализ) при использовании апостериорного критерия Фишера. На фиг. 8 показано, что фармакологическое ингибирование Ang-1 в ходе раннего органогенеза ведет к изменениям в развитии сердца. А) У эмбрионов мыши, которых подвергли воздействию 300 мг/кгmL4-3 (справа), были сердца меньших размеров, с более малочисленными, более узкими и реже расположенными трабекулами, по сравнению с сердцами больших размеров, с крупными, часто расположенными трабекулами, наблюдавшимися на соответствующей стадии эксперимента у эмбрионов, подвергнутых воздействию 300 мг/кг контроля Fc (слева). Приведены показательные изображения. В) Частота возникновения аномалий сердца у эмбрионов, подвергнутых воздействию Fc и mL4-3. Р 0.0001 vs Fc,анализ по хи-квадрат. На фиг. 9 показано совместное ингибирование Ang-1 и Ang-2 роста ксенотрансплантатов опухолиColo205. Мышам (n = 10 в группе) имплантировали клетки Colo205, и когда опухоли достигали приблизительно 500 мм 3, начинали лечение с использованием контроля Fc (5.2 мг/кг QD), mL4-3 (3.2 мг/кг QD),L1-7(N) (2.0 мг/кг QD), L1-7(N) в комбинации с mL4-3 (в тех же режимах дозировки, что и в группах, для которых применяли лечение с использованием одного агента) или AMG 386 (5.6 мг/кг дважды в неделю). Приведен один из четырех показательных экспериментов. Данные представляют собой средние значенияSE. Р 0.0001 vs L1-7(N), RMANOVA (дисперсионный анализ повторных измерений), оценка по критерию Шеффе в повторе. На фиг. 10 показано антагонистическое влияние Ang-1 и Ang-2 на пролиферацию опухолевых клеток эндотелия, ангиогенез роговицы, и ангиогенез сетчатки. А) Влияние ингибирования Ang-1 и Ang-2 на поглощение BrdU (5-бромдезоксиуридина) в клетках эндотелия мыши, полученных из ксенотрансплан-4 022308 татов опухоли Colo205. Мышей-носителей опухоли обрабатывали Fc в течение 3 дней (5.7 мг/кг QD),AMG 386 (в однократной дозе 6 мг/кг), L1-7(N) (2.2 мг/кг QD), mL4-3 (3.5 мг/кг QD) или L1-7(N) в комбинации с mL4-3 (в тех же дозировках и по тем же схемам, которые использовали в группах с использованием одного агента). Каждая полоса представляет уровни BrdU в клетках эндотелия: общее количество клеток мыши (n = 3). Данные представляют собой средние значенияSE. Р 0.05 vs. Fc, по одностороннему t-критерию Стьюдента. В и С) Влияние ингибирования Ang-1 и Ang-2 на ангиогенез роговицы,индуцированный (В) VEGF и (С) bFGF. Ангиогенез индуцировали путем имплантации нейлоновых дисков, пропитанных VEGF или bFGF, в строму роговицы крыс (n = 8 в группе). Лечение начинали за один день до корнеальной имплантации и проводили каждые 3 дня с применением: Fc (60 мг/кг), L1-7(N) (5 мг/кг), mL4-3 (60 мг/кг) и L1-7(N) в комбинации с mL4-3 (в тех же дозировках и по тем же схемам, которые использовали в группах с применением одного агента). Данные представляют собой средние значенияSE. Р 0.0001 vs Fc + VEGF (В); Р 0.002 vs Fc + bFGF (С), ANOVA при использовании теста Фишера в повторе. D) Ингибирование Ang-2 предотвращает неоваскуляризацию, индуцированную кислородом, в сетчатке мыши. Начиная с Р 8 дня постнатального периода, детенышам (n = 5 в группе) ежедневно в течение 9 дней подкожно вводили Fc (200 мг/кг) L1-7(N) (100 мг/кг) mL4-3 (100 мг/кг) или L17(N) в сочетании с mL4-3 (в тех же дозировках и по тем же схемам, которые использовали в группах с использованием одного агента). Данные представляют собой средние значенияSE. Р 0.0001 vs Fc,ANOVA при использовании теста Фишера в повторе. На фиг. 11 показано совместное подавление ингибиторами Ang-1 и Ang-2 ангиогенеза овариальных фолликулов. Для индуцирования суперовуляции у мышей применяли ХГЧ человека. Fc (300 мг/кг), mL43 (150 мг/кг), L1-7(N) (150 мг/kg) или сочетание mL4-3/L1-7(N) (150 мг/кг каждого вещества), вводимые подкожно (n = 7-10 мышей в группе), оценивали по способности предотвращать неоваскуляризацию в образующихся фолликулах. Площадь кровеносных сосудов вычисляли по областям отдельных фолликулов, окрашенных с помощью иммунной метки, направленной на CD31. Данные представляют собой средние значенияSE. Приведены два независимых эксперимента. Р = 0.005 в сравнении с комбинацией mL4-3/L1-7(N) vs любой из агентов, применяемый отдельно; Р 0.05 vs Fc, ANOVA с апостериорным критерием теста Дуннетта. Подробное описание изобретения Для получения молекул рекомбинантных ДНК, белков и антител, а также для культур клеток и трансформации клеток можно применять стандартные методики. Ферментативные реакции и процедуры очистки обычно осуществляют в соответствии с техническими условиями производителя или в соответствии с обычными методиками, существующими в данной области, при применении таких стандартных способов, как описанные в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]), или способов, описанных в настоящем изобретении. За исключением случаев, когда приведены особые определения, номенклатура, используемая в данной связи, а также описанные в настоящем изобретении методики лабораторных исследований и методики органической химии, синтетической органической химии, и медицинской и фармацевтической химии, широко известны и общеприняты в данной области. Для химического синтеза, химического анализа, приготовления препаратов и лекарственных форм, а также их доставки в организм и лечения пациентов применяются общепринятые способы. Термины, используемые для описания изобретения, за исключением случаев, определенных особо в настоящем тексте, будут иметь значение, обычно понимаемое и применяемое в данной области. Следует упомянуть, что термины Н 5 и Н 5 Р используются взаимозаменяемо, и относятся к тяжелой цепи, используемой в различных вариантах осуществления изобретения, например, в МАТ, обозначаемых как H5L7, H5L6, H5L8, H5L4, H5L11, H5L1, H5L12 и H5L9. Термин "Ang-2" относится к полипептиду, изображенному на фиг. 6 патента США 6166185 ("лиганд-2 Tie-2"), включенном в текст настоящего изобретения посредством ссылки, или к фрагментам такого полипептида, к родственным ему полипептидам, которые включают аллельные варианты, варианты сплайсирования, производные, варианты, полученные в результате внесения замен, делеций, и/или вставок, слитые пептиды и полипептиды, и межвидовые гомологи. Полипептид Ang-2 может включать или не включать дополнительные концевые остатки, например, лидерные последовательности, нацеливающие последовательности, аминоконцевой остаток метионина, аминоконцевые остатки метионина и лизина, и/или последовательности-метки или последовательности слитых белков, в зависимости от способа создания. Термин "специфичный связывающий агент" относится к молекуле, предпочтительно к белковой молекуле, связывающей Ang-2, а также Ang-1 (и их варианты и производные, настоящему описанию) с большей аффинностью, чем другие ангиопоэтины. Специфичный связывающий агент может представлять собой белок, пептид, нуклеиновую кислоту, углеводород, липид или низкомолекулярное вещество,предпочтительно связывающееся с Ang-2 и Ang-1. В предпочтительном варианте реализации специфичный связывающий агент согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, например поликлональное антитело, моноклональное антитело (mAb), химерное антитело, антитело с привитыми гипервариабельными участками, мультиспецифичное антитело, биспецифичное антитело, каталитическое антитело, гуманизированное антитело, антитело человека, антиидиотипическое (anti-Id) антитело и антитела, в которые может быть внесена метка в растворимой или связанной форме, а также антигенсвязывающие фрагменты таких антител, их варианты и производные, как отдельно, так и в сочетании с другими аминокислотными последовательностями, полученные при помощи известных техник. Такие методики включают, но не ограничиваются следующими: ферментативное расщепление, химическое расщепление, синтез пептидов и рекомбинантные технологии. Специфичные связывающие агенты согласно настоящему изобретению, направленные против Ang-2 и Ang-1, способны связывать области Ang2 и Ang-1, которые модулируют, например, ингибируют или способствуют биологической активностиAng-2 и Ang-1 и/или другие типы активности, связанные с Ang-2 и Ang-1. Термин "поликлональное антитело" относится к гетерогенной смеси антител, распознающих и связывающих различные эпитопы одного и того же антигена. Поликлональные антитела можно получать из неочищенных препаратов сыворотки, или они могут быть очищены путем, например, антигенной аффинной хроматографии, или аффинной хроматографии с белком А/белком G. Термин "моноклональные антитела" относится к ряду антител, кодируемых одной и той же молекулой нуклеиновой кислоты, возможно, получаемых при помощи одной гибридомы (или клона гибридомы) или другой линии клеток, или при помощи трансгенного млекопитающего таким образом, что каждое моноклональное антитело обычно распознавало один и тот же эпитоп в составе антигена. Термин "моноклональное" не ограничено определенном способом получения антитела, а также не ограничено получением в каких-либо определенных видах организмов, например, в организме мыши, крысы и т.д. Термин "химерные антитела" относится к антителам, в составе которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующей последовательности в составе антитела,полученного в определенном виде организмов, или относящегося к определенному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) является идентичной или гомологичной соответствующей последовательности в составе антитела, полученного в другом виде организмов, или относящегося к другому классу или подклассу антител. Данный термин также включает антигенсвязывающие фрагменты указанных антител, проявляющие желаемую биологическую активность (например, способность специфично связывать Ang-2). См. патент США 4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 81:6851-6855 [1985]. Термин "антитело с привитым гипервариабельным участком" относится к антителу, в составе которого гипервариабельный участок (CDR) одного антитела определенного вида организма или изотипа рекомбинантным путем помещен в каркас другого антитела того же или другого вида или изотипа. Термин "мультиспецифичное антитело" относится к антителу, которое содержит вариабельные участки, распознающие более одного эпитопа одного или более антигенов. Подклассом такого типа является"биспецифичное антитело", распознающее два различных эпитопа одного или различных антигенов."Каталитические" антитела означают антитела, в составе которых одна или более цитотоксических,или, в более общем случае, биологически активных групп присоединены к агенту, связывающемуся с мишенью. Термин "гуманизированное антитело" относится к отдельному типу антитела с привитым гипервариабельным участком, в составе которого каркасная область антитела является производной каркасной области антитела человека, но каждый гипервариабельный участок замещен на соответствующий участок, полученный из организма другого вида, например гипервариабельного участка мыши. Термин "гипервариабельный участок (CDR)" определен выше. Термин "полностью человеческое антитело" относится к антителу, в составе которого как гипервариабельный участок, так и каркасный участок получены из одной или более молекул ДНК человека. Термин "антиидиотипическое" антитело относится к антителу, которое специфично связывается с другим антителом, распознающим антиген. Антиидиотипические антитела могут быть получены любым из способов, описанных в настоящем изобретении, которые предназначены для получения антител, специфичных к Ang-2, за исключением того, что описанные антитела продуцируются, например, в ответ, на иммунизацию животного антителом, специфичным к Ang-2 или фрагментом такого антитела, связывающим Ang-2, a не самим полипептидом Ang-2 или его фрагментом. Термин "варианты" в настоящем описании включает полипептиды, аминокислотный состав которых соответствует аминокислотной последовательности связывающего агента, встречающегося в природе (или, по меньшей мере, известного), в которую внесены вставки, делеции или замены остатков аминокислот. Варианты согласно изобретению включают белки слияния, описанные выше."Производные" включают связывающие агенты, подвергнутые химической модификации способом,отличным от вариантов с внесением вставок, делеций или замен."Специфично связывает" относится к способности специфичного связывающего агента (такого как антитело или фрагмент антитела) согласно настоящему изобретению, распознавать и связывать зрелый,полноразмерный полипептид-мишень или его часть (Ang-2 и Ang-1 согласно настоящему изобретению) или ортолог такого полипептида, причем аффинность (определенная, например, методом ИФА на аффинность или в анализе BIAcore, как описано в настоящем изобретении) или его нейтрализующая спо-6 022308 собность (определенная, например, методом ИФА на нейтрализацию или сходных методов анализа) по меньшей мере в 10 раз выше, но, возможно, в 50 раз выше, в 100, 250 или 500 раз выше, или даже по меньшей мере в 1000 раз выше, чем аффинность или нейтрализующая способность указанного агента в отношении другого ангиопоэтина или другого пептида или полипептида. Термин "антигенсвязывающая область (домен)" или "антигенсвязывающий участок" относится к части специфичного агента (например, молекулы антитела), содержащей аминокислотные остатки специфичного связывающего агента (или другие группы), которые взаимодействуют с антигеном и обеспечивают специфичность и аффинность связывающего агента в отношении антигена. В составе антитела антигенсвязывающую область обычно называют гипервариабельным участком или участком, определяющим комплементарность (CDR). Термин "эпитоп" относится к части любой молекулы, которая может быть распознана и связана любым специфичным агентом, например антителом, в одном или более антигенсвязывающих участках связывающего агента. Эпитопы обычно состоят из поверхностных групп на молекуле, обладающих химической активностью, таких как, например, боковые цепи аминокислот или углеводородов, и обладают особыми характеристиками трехмерной структуры, а также особыми характеристиками заряда. Термин"эпитопы" в настоящем описании может относиться как к перекрывающимся, так и к не перекрывающимся эпитопам. Более того, эпитопы могут представлять собой "миметики", в случае, когда они имеют трехмерную структуру, идентичную структуре эпитопа, который использовали для создания антитела, и при этом не содержат или содержат только некоторые аминокислотные остатки, обнаруживаемые в составе Ang-2, который применяли для стимуляции иммунного ответа. Термин "ингибирующий и/или нейтрализующий эпитоп" обозначает эпитоп, действие которого при связывании специфичным агентом, таким как антитело, проявляется в потере (или, по меньшей мере,снижении) биологической активности молекулы, клетки или организма, несущего указанный эпитоп, invivo, in vitro или in situ. В контексте настоящего изобретения нейтрализующий эпитоп локализован в биологически активном участке Ang-2 или связан с указанным участком. В противоположность этому,термин "активирующий эпитоп" относится к эпитопу, действие которого при связывании специфичным агентом согласно изобретению, таким как антитело, проявляется в активации Ang-2, или, по меньшей мере, принятии им биологически активной конформации. Термин "фрагмент антитела" относится к пептиду или полипептиду, который меньше, чем полноразмерное, интактное антитело. Полноразмерные антитела содержат две функционально независимые составляющие или два фрагмента: антигенсвязывающий фрагмент, называемый "Fab", и карбоксиконцевой кристаллизующийся фрагмент, называемый фрагмент "Fc". Фрагмент Fab включает первый константный домен как тяжелой, так и легкой цепи (CH1 и CL1) вместе с вариабельными участками тяжелой и легкой цепи, связывающими специфичный антиген. Каждый вариабельный участок в составе как тяжелой, так и легкой цепи содержит три гипервариабельных и остатки аминокислот каркасного участка, находящиеся между отдельными гипервариабельными участками. Фрагмент Fc содержит второй и третий константные домены тяжелой цепи (CH2 и CH3) и участвует в эффекторных функциях, например в активации комплемента и атаке фагоцитов. В некоторых вариантах реализации фрагменты Fc и Fab разделены "шарнирной областью" антитела, и, в зависимости от того, каким образом произойдет протеолитическое расщепление, шарнирная область может быть связана либо с фрагментом Fab либо с Fc. Например,при расщеплении антитела протеазой папаином образуется шарнирная область, связанная с фрагментомFc, тогда как при расщеплении протеазой пепсином образуется фрагмент, в составе которого шарнирная область одновременно связана с обоими фрагментами Fab. Поскольку два фрагмента Fab оказываются,по существу, ковалентно связанными в результате расщепления пепсином, получаемый фрагмент называется фрагмент F(ab')2. Фрагмент Fc может иметь относительно длительный период полужизни в сыворотке, тогда как период полужизни фрагмента Fab непродолжителен [Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989)]. При экспрессии фрагмента Fc в виде части слитого белка, его период полужизни может становится удлиняться, или фрагмент может приобретать такие функции, как связывание Fc рецептора, связывание белка А, фиксация комплемента, и, возможно, даже плацентарный перенос в белок, с которым производили сияние. Фрагмент Fc согласно изобретению может представлять собой фрагмент Fc, встречающийся в природе,или модифицированный с улучшением определенных свойств, например, терапевтических свойств, или увеличением времени циркуляции. Термин "вариабельная область" или "вариабельный домен" относится к области легкой и/или тяжелой цепи антитела, обычно включающей приблизительно от 120 до 130 аминоконцевых аминокислот в составе тяжелой цепи и приблизительно от 100 до 110 аминоконцевых аминокислот в составе легкой цепи. Вариабельные области обычно сильно различаются по аминокислотной последовательности даже в пределах антител одного вида. Вариабельный участок антитела обычно определяет свойства связывания и специфичность каждого конкретного антитела в отношении конкретного антигена. Вариабельность последовательности сконцентрирована в областях, называемых гипервариабельными участками (CDR), а более консервативные участки в составе вариабельной области называются каркасными участками (FR). Гипервариабельные участки легких и тяжелых и легких цепей содержат аминокислоты, которые в значи-7 022308 тельной степени ответственны за непосредственное взаимодействие между антигеном и антителом, хотя аминокислоты в составе каркасных участков могут значительно влиять на связывание/распознавание антигена, как обсуждается ниже в настоящем изобретении. Термин "легкая цепь" применительно к антителу является собирательным термином, относящимся к двум различным типам, называемым каппаи лямбда , в зависимости от аминокислотных последовательностей константных областей. Термин "тяжелая цепь" применительно к антителу является собирательным термином, относящимся к пяти различным типам, называемым альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, в зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи. Пять известных классов антител выделены по принципу сочетания тяжелой и легкой цепей: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно, включая четыре известных подкласса IgG, обозначаемых как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Термин "встречающийся в природе" (природный) применительно к биологическим веществам, таким как молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды, к клеткам-хозяевам и т.д., относится к веществам, клеткам и т.д., обнаруживаемым в природе и не модифицированным человеком. Термин "изолированный" применительно к Ang-2 или специфичному агенту, связывающему Ang-2,относится к веществу, свободному по меньшей мере от одного контаминирующего полипептида, или к веществу, обнаруживаемому в естественных условиях, предпочтительно, по существу, свободному от любых контаминирующих полипептидов млекопитающих, которые могут препятствовать терапевтическому или диагностическому применению. Термин "зрелый" применительно к Ang-2, антителу к Ang-2 или любому белковому специфичному агенту, связывающему Ang-2, относится к пептиду или полипептиду, в составе которого отсутствует лидерная или сигнальная последовательность. При экспрессии связывающего агента согласно изобретению, например, в прокариотической клетке, "зрелый" пептид или полипептид также может включать дополнительные остатки аминокислот (но не включать при этом лидерную последовательность) такие,как аминоконцевой остаток метионина, или один или более остатков метионина или лизина. Пептид или полипептид, полученный таким способом, можно применять как без удаления из него дополнительных остатков аминокислот, так и после их удаления. Специфичные связывающие агенты и антитела. Термин "специфичный связывающий агент" в настоящем описании относится к молекуле, которая обладает специфичностью в распознавании и связывании с Ang-2 и Ang-1, как описано в настоящем изобретении. Подходящие специфичные связывающие агенты включают, но не ограничиваются перечисленными: антитела и производные антител, полипептиды и низкомолекулярные вещества. Подходящие специфичные связывающие агенты могут быть получены способами, известными в данной области. Типичный полипептидный агент согласно настоящему изобретению, связывающий Ang-2 и Ang-1, способен к связыванию определенного участка полипептидов Ang-2 и Ang-1, и предпочтительно - к модулированию активности или функций полипептидов Ang-2 и Ang-1. Специфичные связывающие агенты, такие как антитела и фрагменты антител, специфично связывающие полипептиды Ang-2 и Ang-1, включены в объем настоящего изобретения. Антитела могут представлять собой поликлональные антитела, включая моноспецифичные поликлональные, моноклональные(mAb, MAT), рекомбинантные, химерные, гуманизированные, такие как антитела с привитыми гипервариабельными участками, антитела человека, одноцепочечные, каталитические, мультиспецифичные и/или биспецифичные, а также предусмотрены антигенсвязывающие фрагменты, варианты и/или производные описанных антител. Поликлональные антитела, направленные против полипептидов Ang-2 и Ang-1, в общем случае получают в организме животных (например, кроликов, хомяков, коз, овец, лошадей, свиней, крыс, песчанок, морских свинок, мышей или любого другого подходящего млекопитающего, а также в организме других видов, не относящихся к млекопитающим) путем многократных подкожных или внутрибрюшинных инъекций полипептида Ang-2 и/или Ang-1 или его фрагмента, с адъювантом или без него. Такие адъюванты включают, без ограничений, следующие: полный и неполный адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, и поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин,плюрониловые многоатомные спирты, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки и динитрофенол. Потенциально пригодные для человека адъюванты представляют собой БЦЖ(бацилла Кальметта-Герина) и Corynebacterium parvum. Также можно применять соединение полипептидного антигена с белком-переносчиком, являющимся иммуногенным для видов, подвергаемых иммунизации, например, гемоцианином лимфы улитки, сывороткой, альбумином, бычьим тироглобулином или ингибитором трипсина из бобов сои. Также для усиления иммунного ответа можно применять агенты, вызывающие агрегацию, например квасцы. После иммунизации животных обескровливают и сыворотку исследуют на титр антител к полипептиду Ang-2, который можно определить при помощи анализов, описанных в настоящем изобретении в разделе "Примеры". Поликлональные антитела можно применять в сыворотке, где они детектированы, или они могут быть выделены из сыворотки, путем, например, аффинной хроматографии с антигеном, или аффинной хроматографии с белком А или белком G. Моноклональные антитела к полипептидам Ang-2 могут быть получены, например, традиционным методом "гибридом" или более новой техники "фагового отображения", но не ограничиваясь указанными методами. Например, моноклональные антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены методом гибридом, описанного в Kohler et al., Nature 256:495 [1975]; the human B-cell hybridoma technique [Kosbor et al., Immunol. Today 4:72 (1983); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80: 2026-2030(1983); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63, Marcel Dekker,Inc., New York (1987)] и технологии гибридом, трансформированных EBV [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, New York N.Y., p. 77-96 (1985)]. Также согласно настоящему изобретению предложены линии клеток гибридомы, продуцирующих моноклональные антитела, реакционно-способные в отношении полипептидов Ang-2. При использовании технологии гибридом можно применять линии клеток миеломы. Такие линии клеток, подходящие для применения в процедурах слияния с образованием гибридом, предпочтительно являются неантителообразующими, обладают высокой эффективностью слияния, и являются дефицитными по ферментам, что обеспечивает неспособность к росту на определенных селективных средах,поддерживающих рост только требуемых слитых клеток (гибридом). Примерами линий клеток, применяемых для процедур слияния в организме мыши, являются Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653,NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 и S194/5XX0 Bul; к линиям клеток,применяемым для процедур слияния в организме мыши, относятся R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F и 4 В 210. Другими линиями клеток, подходящими для процедур слияния, являются U-266, GM1500-GRG2,LICR-LON-HMy2 и UC729-6. Гибридомы и другие линии клеток, продуцирующие моноклональные антитела, рассматриваются как новые композиции согласно настоящему изобретению. Технологию фагового дисплея также можно применять для получения моноклональных антител в организме любого вида. Предпочтительно указанную технологию применяют для получения полноразмерных моноклональных антител человека, в составе которых полинуклеотид, кодирующий один фрагмент антитела, Fab или Fv, экспрессируется на поверхности частицы фага [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991); см. также патент США 5885793)]. Можно провести "скрининг" каждого фага с использованием методов анализа, описанных в настоящем изобретении, для определения фрагментов антител, обладающих аффинностью к Ang-2. Следовательно, указанные процедуры имитируют иммунную селекцию посредством представления набора фрагментов антитела на поверхности нитевидного бактериофага, и последующей селекции фага по признаку связывания с Ang-2. Один подобный алгоритм с применением указанного подхода описан в предварительной заявке на патентPCT/US98/17364, поданной от имени Adams et al., в которой описано выделение фрагментов высокоаффинного и функционально агонистического антитела к рецепторам MPL- и msk. С применением этого подхода можно создать полный набор генов антител человека путем клонирования перестроенных естественным путем генов V человека из лимфоцитов периферической крови, как было описано ранее [Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 87: 8095-8099 (1990)]. После определения полинуклеотидных последовательностей, кодирующих каждую цепь полноразмерного моноклонального антитела, или фрагмента (фрагментов) Fab или Fv согласно изобретению,клетки-хозяева, как эукариотические, так и прокариотические, можно использовать для экспрессии полинуклеотидов моноклонального антитела, с использованием рекомбинантных технологий, широко известных и рутинно применяемых в данной области. Так же как вариант, получают трансгенных животных путем введения полинуклеотида, кодирующего специфичный связывающий агент согласно изобретению, в геном животного-реципиента, например, в геном мыши, кролика, козла или коровы, способом,что обеспечивает возможность экспрессии полинуклеотидных молекул, кодирующих моноклональное антитело или другой специфичный связывающий агент. Согласно одному аспекту изобретения полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело или другой специфичный связывающий агент, можно соединить с регуляторными последовательностями, специфичными для молочной железы, и химерные полинуклеотиды можно ввести в зародышевую клетку животного-мишени. Полученное трансгенное животное будет продуцировать требуемое антитело в составе молока [Pollock et al., J. Immunol. Meth 231:147-157 (1999); Little et al., Immunol. Today 8:364-370 (2000)]. Также, в дополнение, для экспрессии и получения специфичных агентов, связывающих Ang-2, например моноклональных антител, можно применять растения; с этой целью подходящие растения трансфицируют полинуклеотидами, кодирующими моноклональные антитела или другие специфичные связывающие агенты. В другом варианте реализации настоящего изобретения моноклональное или поликлональное антитело или его фрагмент, полученный в организме вида, не относящегося к виду человек, можно "гуманизировать" или "химеризовать". Способы гуманизации антител, не являющихся антителами человека, хорошо известны в данной области (см. патент США 5859205, 5585089 и 5693762). Гуманизацию осуществляют, например, способами, известными в данной области [Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986);Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)], путем замены по меньшей мере части гипервариабельных участков (CDR), например антитела грызуна, на соответствующие участки антитела человека. Также, согласно изобретению предложены варианты и производные указанных антител человека, обсуждаемых в настоящем изобретении, хорошо известных в данной области. Также изобретение включает полностью человеческие антитела, связывающие полипептиды Ang-2,а также антигенсвязывающие участки, варианты и/или производные указанных полипептидов. Такие антитела могут быть получены с использованием методики фагового дисплея, описанной выше. Также,как вариант, для создания таких антител можно использовать трансгенных животных (например, мышей), способных продуцировать репертуар антител человека в отсутствие эндогенной выработки иммуноглобулинов. Этого можно достичь путем иммунизации животного антигеном Ang-2 или его фрагментами при условии, что такие фрагменты имеют уникальную для Ang-2 аминокислотную последовательность. Такие иммуногены при необходимости можно конъюгировать с носителем. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993);Bruggermann et al., Year in Immuno, 7: 33 (1993). Согласно одному способу таких трансгенных животных получают путем выключения эндогенных локусов, которые кодируют тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина животного, и введения в геном животного локусов, кодирующих белки тяжелой и легкой цепи человека. После этого скрещивают частично модифицированных животных, которые несут менее чем полный набор указанных модификаций, с получением животного, обладающего всеми требуемыми модификациями иммунной системы. При введении иммуногена такие трансгенные животные способны вырабатывать антитела с вариабельными областями человека, включая аминокислотные последовательности человека (а не, например, мыши), которые являются иммуноспецифичными в отношении требуемых антигенов. См. предварительную заявку на патент СШАPCT/US96/05928 и PCT/US93/06926. Дополнительные способы описаны в патенте США 5545807, предварительной заявкеPCT/US91/245,PCT/GB89/01207 и в ЕР 546073 В 1 и ЕР 546073 А 1. Антитела человека также можно получать путем экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или путем экспрессии в клетках гибридомы, как описано в тексте настоящего изобретения. Трансгенез осуществляют несколькими различными путями. См., например, Bruggeman et al., Immunol. Today 17:391-7 (1996). Согласно одному подходу конструируют мини-локус, в котором сегменты гена в конфигурации зародышевой линии искусственно располагают близко друг к другу. Из-за ограничений в размере (например, масса обычно менее 30 кБ), итоговый мини-локус содержит ограниченное количество различных сегментов гена, но сохраняет способность к продуцированию большого набора антител. Мини-локусы, содержащие только последовательности ДНК человека, включая промоторы и энхансеры, полноценно функционируют в геноме трансгенной мыши. Если требуется трансгенное животное с большим количеством сегментов генов, применяют искусственные хромосомы дрожжей (YAC). Размеры YAC могут варьировать от нескольких сот килобаз до 1Mb, и их вводят в геном мыши (или другого подходящего животного) путем микроинъекции непосредственно в яйцеклетку или путем переноса YAC в линии эмбриональных стволовых клеток (СК). В общем случае, YAC вносят в СК путем липофекции очищенной ДНК, или слияния сферопластов дрожжей, при котором очищенную ДНК переносят в мицеллах, и слияние осуществляют способом, аналогичным описанному в протоколах слияния гибридом. Селекцию СК согласно изобретению после переноса ДНК проводят путем включения в состав YAC любого из селективных маркеров, известных в данной области. В качестве другого варианта применяют векторы на основе бактериофага Р 1, которые амплифицируют в бактериальной клетке-хозяине Е.coli. Поскольку указанные векторы несут меньше внесенной ДНК, чемYAC, клоны изначально выращивают с выходом, достаточно высоким для осуществления прямой микроинъекции в яйцеклетку. Было показано, что применение смесей различных векторов Р 1 позволяет достичь высоких уровней гомологичной рекомбинации. После выявления подходящей трансгенной мыши(или другого подходящего животного) с применением любой из известных методик, определения уровней антитела, циркулирующего в сыворотке (например, метода твердофазного ИФА), трансгенное животное скрещивают с мышью, в геноме которой был выключен локус эндогенных Ig. В результате получают потомство, в организме которого, по существу, все В-клетки продуцируют антитела человека. В еще одном варианте локус, кодирующий Ig животного, целиком замещают на локус, кодирующийIg человека, и полученное животное продуцирует только антитела человека. Согласно другому способу участки локуса генома животного замещают специфичными и соответствующими участками локуса генома человека. В отдельных случаях животные, полученные с применением указанной методики, могут экспрессировать химерные антитела, в противоположность полностью человеческим антителам, в зависимости от типа замены в локусе генома мыши, кодирующем Ig. Также антитела человека путем воздействия на спленоциты (В- или Т-клетки) человека антигеномCarballido et al., NatMed, 6: 103-106 [2000]. Согласно одному способу приживление зародышевой ткани человека в организм мыши SCID (SCID-hu) стимулирует стабильный гемопоэз и развитие Т-клеток человека [McCune et al., Science 247:1532-1639 (1988); Ifversen et al., Sem Immunol. 8:243-248 (1996)]. Любой гуморальный иммунный ответ у таких химерных мышей полностью зависит от совместного развития Тклеток в организме [Martensson et al., Immunol. 53:1271-179 (1994)]. Согласно другому способу лимфоциты периферической крови человека внутрибрюшинным (или другим) путем трансплантируют мышиSCID [Mosier et al., Nature 335:256-259 (1988)]. При воздействии на трансплантированные клетки ини- 10022308 циирующим (праймирующим) агентом, таким как энтеротоксин А стафилококка (SEA) [Martensson et al.,Immunol. 84: 224-230 (1995)] или любое моноклональное антитело к сыворотке человека, несущее маркерCD40 [Murphy et al., Blood 86:1946-1953 (1995)], достигают более высоких уровней продукции В-клеток. Согласно другому способу полностью синтетический репертуар тяжелой цепи человека получают из не перегруппированных (не перестроенных) сегментов гена V путем сборки каждого сегмента VH человека с сегментами D из случайно выбранных нуклеотидов вместе с сегментом J человека [Hoogenboomet al., J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)]. Подобным образом получают набор легкой цепи путем объединения каждого сегмента V человека с сегментом J [Griffiths et al., EMBO J. 13:3245-3260 (1994)]. Нуклеотиды, кодирующие полное антитело (т.е. и тяжелую, и легкую цепь) связывают в единый Fv фрагмент одной цепи, и полученный полинуклеотид лигируют с нуклеотидом, кодирующим белок оболочки нитевидного бактериофага. При экспрессии описанного слитого белка на поверхности фага полинуклеотид,который кодирует специфичное антитело, определяют путем селекции с применением иммобилизованного антигена. Согласно еще одному способу фрагменты антитела объединяют как два фрагмента Fab путем слияния одной цепи с белком фага и секреции другой в периплазматическое пространство бактерии [Hoogenboom et al., Nucl. Acids. Res. 19:4133-4137 [1991]; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:7978-7982(1991)]. Широкомасштабное производство химерных, гуманизированных, CDR-привитых и полностью человеческих антител или антигенсвязывающих областей антител человека обычно осуществляют при помощи методов рекомбинации. Полинуклеотидную последовательность (последовательности), кодирующую тяжелую и легкую цепь каждого антитела, можно ввести в клетку-хозяина и экспрессировать с использованием веществ и способов, описанных в тексте настоящего изобретения. В предпочтительном варианте реализации антитела получают в клетках-хозяевах организма млекопитающего, например в клетках CHO. Подробности указанного способа получения приведены в настоящем описании. В состав специфичных связывающих агентов согласно настоящему изобретению, таких как антитела, фрагменты антител и производные антител, согласно изобретению далее можно включить любую известную константную область. Константная область в составе легкой цепи может принадлежать, например, к типу каппа или лямбда константных областей легкой цепи, например константная область легкой цепи антитела человека типа каппа или лямбда. Константная область в составе тяжелой цепи может представлять собой константную область тяжелой цепи типа альфа, дельта, эпсилон, гамма или мю, например константную область тяжелой цепи антитела человека типа альфа, дельта, эпсилон, гамма или мю. В одном варианте реализации константные области в составе тяжелой или легкой цепи представляют собой фрагмент, производное, вариант или мутеин константной области, встречающейся в природе. В одном варианте реализации специфичные связывающие агенты согласно изобретению, такие как антитела, фрагменты антител и производные антител, включают IgG. Известны методики получения антитела другого подкласса или изотипа из антитела согласно изобретению, т.е. переключение подкласса. Так, например, можно получить антитело IgG из антитела IgM, и наоборот. Такие методики дают возможность получать новые антитела, обладающие антигенсвязывающими свойствами данного антитела (родительского антитела), но также проявляющие биологические свойства, присущие изотипу или подклассу антитела, отличного от родительского антитела. Возможно применение методик рекомбинантной ДНК. В описанных процессах можно применять клонированную ДНК, кодирующую специфичные полипептиды антитела, например ДНК, кодирующую константную область антитела требуемого изотипа. См. также Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16. Специфичные связывающие агенты согласно настоящему изобретению, такие как антитела, фрагменты антител и производные антител согласно изобретению, могут включать константную область тяжелой цепи IgG1 или фрагмент области тяжелой цепи IgG1. Антитела, фрагменты антител и производные антител согласно изобретению могут далее включать константную область легкой цепи каппа или лямбда или фрагменты константных областей. Константные области легкой цепи и полинуклеотиды,кодирующие их, приведены ниже. В одном варианте реализации антитела, фрагменты антител и производные антител согласно изобретению дополнительно включают константную область тяжелой цепи или ее фрагмент, например константную область тяжелой цепи IgG2, также приведенную ниже в настоящем документе. Нуклеиновая кислота (ДНК), которая кодирует константные области тяжелой и легкой цепи, а также аминокислотные последовательности константных областей тяжелой и легкой цепей приведены ниже в настоящем изобретении. Можно осуществлять слияние вариабельных областей лямбда с константными областями лямбда и осуществлять слияние вариабельных областей каппа с константными областями каппа. Последовательность ДНК константной области тяжелой цепи IgG2 (SEQ ID NO: 41): Последовательность белка константной области тяжелой цепи IgG2 (SEQ ID NO: 42): Последовательность ДНК константной области легкой цепи каппа (SEQ ID NO: 43): Последовательность белка константной области легкой цепи каппа (SEQ ID NO: 44): Последовательность ДНК константной области легкой цепи лямбда (SEQ ID NO: 45): Последовательность белка константной области легкой цепи лямбда (SEQ ID NO: 46): Специфичные связывающие агенты согласно настоящему изобретению, такие как антитела, фрагменты антител и производные антител согласно изобретению, включают молекулы, содержащие, например, следующие комбинации вариабельных областей: H6L7, H5L7, H4L13, H11L7, H4L7, H10L7, H5L6,H2L7, H5L8, H6L8, H3L7, H5L4, H4L12, H6L6, H4L2, H4L6, H4L4, H5L11, H5L1, H4L11, H5L12, H5L9 требуемого изотипа (например, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE и IgD), а также их фрагменты Fab или F(ab')2. Более того, в случае, если требуемым изотипом является IgG4, также может потребоваться введение точечной мутации в шарнирную область, как описано в Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407(включенной в настоящий документ посредством ссылки) для снижения тенденции к формированию дисульфидных связей внутри Н цепи, которое может привести к появлению гетерогенности антител IgG4. Дополнительная полезная информация о последовательностях. Следующие последовательности изотипов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 применяют в сочетании с последовательностями вариабельных областей тяжелых цепей антител согласно настоящему изобретению с получением конкретного требуемого изотипа указанного антитела. Последовательности тяжелой цепи антител согласно настоящему изобретению в форме IgG2. Следующие последовательности представляют собой последовательности тяжелых цепей антител согласно настоящему изобретению в форме IgG2. Последовательности легких цепей те же, что приведены в примерах. Подчеркнутые участки последовательностей представляют собой последовательности Партнеры специфичных связывающих агентов по слиянию. Возможно осуществлять слияние полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность вариабельных областей антител к Ang-2, например вариабельной области тяжелой цепи, с аминокислотной последовательностью, описанной в настоящем изобретении, как по N-, так и по С-концу, с одной или более областью фрагмента Fc IgG человека. При встраивании Fc-фрагмента в одну конструкцию с терапевтическим белком, например Fab или антителом, специфичным к Ang-2, Fc фрагмент может удлинять период полужизни или обеспечить такие функции, как связывание рецептора Fc, связывание белка А,фиксация комплемента и, возможно, даже плацентарный перенос [Capon et al., Nature, 337: 525-531(1989)]. Возможно осуществлять слияние шарнирной области антитела, областей CH2 и CH3 как по N-, так и по С-концу специфичных связывающих агентов, таких как фрагменты Fab или Fv, направленных против Ang-2 (полученные, например, из библиотеки фагового отображения), с использованием методов,известных специалисту в данной области. Полученный слитый белок может быть очищен с использованием аффинной колонки с белком А или белком G. Было обнаружено, что пептиды или белки, слитые сFc фрагментом, обладают значительно более длительным периодом полужизни in vivo, чем их аналоги,не подвергнутые слиянию. Также, слияние Fc фрагментом позволяет осуществлять димеризацию/мультимеризацию слитого полипептида. Fc-фрагмент может представлять собой Fc-фрагмент,встречающийся в природе, или он может быть модифицирован с улучшением определенных свойств,например, терапевтических свойств, времени циркуляции, снижением проблем, связанных с агрегацией,и т.д. Другие известные в данной области примеры включают Fc-фрагмент, возможно, полученный из организма человека или других видов, или, возможно, синтезированный, слитый с N-концом CD30L, для лечения болезни Ходжкина, анапластической лимфомы и Т-клеточной лейкемии (патент США 5480981), и Fc фрагмент, слитый с рецептором ФНО, для лечения септического шока [Fisher et al., N EnglJ. Med, 334: 1697-1702 (1996)], а также Fc-фрагмент, слитый с рецептором Cd4, для лечения СПИДа [Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989)]. Каталитические антитела представляют собой другой тип слитых молекул и включают антитела, в составе которых к специфичному связывающему агенту присоединена одна или более молекул, обладающих цитотоксической активностью, или, в более общем случае, одна или более биологически активных молекул. См., например, Rader et al., Chem Eur J. 12:2091-2095 (2000). Цитотоксические агенты такого типа улучшают опосредуемую антителом цитотоксичность и включают такие молекулы, как цитокины, которые прямо или опосредованно стимулируют гибель клеток, радиоизотопы, хемотерапевтические препараты (включая пролекарства), бактериальные токсины (например, экзотоксин псевдомонад, дифтерийный токсин и т.д.), растительные токсины (например, рицин, гелонин и т.д.), химические конъюгаты(например, майтансиноиды, калихеамицин и т.д.), радиоконъюгаты, конъюгаты ферментов (конъюгаты РНКазы, фермент/пролекарственная терапия антителами направленного действия [ADEPT)]) и т.п. Согласно одному аспекту цитотоксический агент может быть "присоединен" к одному компоненту биспецифического или мультиспецифического антитела путем связывания указанного агента с одним из альтернативных сайтов распознавания антигена на поверхности антитела. В качестве альтернативного варианта, белковые цитотоксины можно экспрессировать в форме белков, слитых со специфичным связывающим агентом, после чего полинуклеотид, кодирующий токсин, лигируют с полинуклеотидом, кодирующим связывающий агент. Еще одним альтернативным вариантом является ковалентная модификация специфичного связывающего агента с включением требуемого цитотоксина. Примерами таких слитых белков являются иммуногенные полипептиды, белки длительным периодом полужизни, такие как константные области иммуноглобулинов, маркерные белки, белки или полипептиды, способствующие очистке требуемого полипептидного специфичного связывающего агента, и последовательности полипептидов, способствующие образованию мультимерных белков (например, мотивы лейциновых "молний", полезные в образовании димеров и придании им стабильности). Такой вариант, получаемый путем вставок, обычно содержит нативную молекулу целиком, или ее существенную часть, присоединенную по N- или С-концу к целому второму целому полипептиду или к его части. Например, слитые белки обычно включают лидерные последовательности, полученные из других видов, для рекомбинантной экспрессии белка в гетерологичном хозяине. Другой полезный сли- 15022308 тый белок включает дополнительную иммунологически активную область, например, эпитоп антитела,способствующий очистке слитого белка. Введение сайта расщепления в область слияния, или рядом с ней, будет способствовать удалению чужеродного полипептида после очистки. Другие полезные продукты слияния включают функциональные области, например, активных сайтов ферментов, областей гликозилирования, сигналов клеточного нацеливания или трансмембранных участков. Существуют различные коммерчески доступные системы для экспрессии белков слияния, которые возможно применять согласно настоящему изобретению. Особенно полезные системы включают, но не ограничиваются следующими: система, включающая глутатион-S-трансферазу (GST) (Pharmacia), система, включающая связывающий мальтозу белок (NEB, Beverley, MA), система FLAG (IBI, New Haven, CT) и система 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Указанные системы позволяют продуцировать рекомбинантные полипептиды, включающие лишь очень небольшое количество дополнительных аминокислот, которые являются нежелательными из-за возможности влияния на антигенные свойства рекомбинантного полипептида. Например, системы FLAG и 6xHis добавляют лишь короткие последовательности, обе обладающие слабой антигенностью, и не оказывают существенного влияние на сворачивание полипептида в нативную конформацию. Другое слияние по N-концу, которое рассматривается как полезное, представляет собой присоединение дипептида Met-Lys дипептида в N-концевом участке белка или пептидов. Такое слияние может привести к благоприятному повышению уровня экспрессии или активности белка. Особенно эффективной может являться слитая конструкция, в составе которой пептидный специфический связывающий агент слит с гаптеном (полуантигеном) с повышением антигенности слитой конструкции специфичного связывающего агента, что полезно, например, при создании антиидиотипических антител согласно настоящему изобретению. Такие слитые конструкции с повышенной иммуногенностью хорошо известны специалистам в данной области, например, слияние специфичного связывающего агента с хелперным антигеном, таким как hsp70 или пептидными последовательностями, например,из цепи дифтерийного токсина или цитокина, такого как IL-2, обеспечит стимуляцию иммунного ответа. В других вариантах реализации можно создать слитую конструкцию, которая будет улучшать нацеливание композиции с антигенсвязывающим агентом на специфический сайт или клетку. Также предложены другие слитые конструкции, включающие гетерологичные полипептиды с желаемыми свойствами, например константную область Ig, используемую для увеличения периода полужизни, или антитело или фрагмент антитела, используемые для нацеливания. Другие слитые системы позволяют получать гибриды полипептидов, для которых необходимо отделение партнера по слиянию от полипептида согласно изобретению. В одном варианте реализации молекула партнера по слиянию связана с рекомбинантным полипептидным специфичным связывающим агентом последовательностью пептида, содержащей специфичную последовательность, распознаваемую протеазой. Примеры подходящих последовательностей представляют собой последовательности, распознаваемые протеазой вируса гравировки табака (Life Technologies, Gaithersburg, MD) или фактором Ха (New England Biolabs, Beverley,MA). Также могут быть получены слитые полипептиды, включающие целую вариабельную область антитела к Ang-2 или ее часть, например вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательностью, приведенную в настоящем описании, вариабельная область легкой цепи, имеющая аминокислотную последовательность, приведенную в настоящем описании, в комбинации с укороченным тканевым фактором (tTF), агентом, направленно воздействующим (нацеливающим) на сосуды, состоящим из укороченной формы белка, вызывающего коагуляцию, который функционирует как коагулирующий агент в кровеносных сосудах опухоли. Слияние tTF с антителом к Ang-2, или его фрагментами,может способствовать доставке агента, направленного против Ang-2, к клеткам-мишеням. Варианты специфичных связывающих агентов. Варианты специфичных связывающих агентов включают варианты, полученные путем вставок, делеций и/или замен. В одном аспекте изобретения предложены варианты, получаемые путем вставки, в составе которых последовательность специфичного связывающего агента дополнена одним или более остатками аминокислот. Вставки могут быть внесены на любом конце белка, или по обоим концам, или во внутренние области аминокислотной последовательности специфичного связывающего агента. Варианты, полученные путем вставок, с дополнительными остатками аминокислот на любом из концов, или на обоих концах, могут включать, например, слитые белки и белки, содержащие аминокислотные метки. Варианты, полученные путем вставок, включают полипептидные специфичные связывающие агенты, к аминокислотной последовательности которых добавлен один или более остаток аминокислоты, или их фрагменты. Вариантные продукты также включают зрелые формы специфичных связывающих агентов. Из состава таких форм специфичного связывающего агента удалены лидерные или сигнальные последовательности, но конечный белок содержит аминоконцевые остатки, также как полипептид Ang-2 дикого типа. Дополнительные аминоконцевые остатки могут быть получены из другого белка, или они могут включать один или более остатков, которые идентифицированы как полученные из конкретного белка. Предусмотрены формы специфичного связывающего агента с дополнительным остатком метионина в положении -1 (Met-1-специфичный связывающий агент), а также формы специфичного связывающего- 16022308 агента с дополнительными остатками метионина и лизина в положениях -2 и -1 (Met-2-Lys-1 специфический связывающий агент). Варианты специфичных связывающих агентов с дополнительными остатками Met, Met-Lys, Lys (в общем, один или более основной остаток) особенно эффективны для увеличения продукции рекомбинантного белка в бактериальных клетках-хозяевах. Могут быть получены варианты специфичных связывающих агентов, содержащие дополнительные остатки аминокислот, полученные путем применения специфических систем экспрессии. Например,применение коммерчески доступных векторов, экспрессирующих полипептид согласно изобретению в форме части продукта слияния с глутатион-S-трансферазой (GST), позволяет получать полипептид согласно изобретению, содержащий дополнительный остаток глицина в положении аминокислот -1 после отщепления компонента GST от полипептида согласно изобретению. Также предусмотрены варианты,образованные путем экспрессии в других системах экспрессии, включая системы, в которых в аминокислотную последовательность внесены полигистидиновые метки, обычно в карбокси- и/или аминоконцевой участок последовательности. Варианты, получаемые путем вставок, также включают слитые белки, описанные выше, где карбокси- или аминоконцевой участок полипептидного специфичного связывающего агента слит с другим полипептидом, или его фрагментом, или с аминокислотными последовательностями, не идентифицированными как последовательности какого-либо специфичного белка. Могут быть получены варианты, полученные путем делеции, в которых один или более остатков аминокислот в составе полипептида специфичного связывающего агента удалены. Делеции могут быть осуществлены в одном конце или в обоих концах полипептида специфичного связывающего агента, или путем удаления одного или более остатков из последовательности специфичного связывающего агента. Варианты, полученные путем делеции, обязательно включают все фрагменты полипептида специфичного связывающего агента. Фрагменты антител включают участки антител, связывающиеся с эпитопом на полипептиде антигена. Примеры таких фрагментов включают фрагменты Fab и F(ab')2, полученные, например, путем ферментативного или химического расщепления полноразмерных антител. Другие связывающие агенты включают агенты, полученные с использованием технологии рекомбинантной ДНК, например, путем экспрессии рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие вариабельные области антитела. Изобретение также охватывает фрагменты полипептидов агента,связывающего Ang-2, которые сохраняют способность специфично связывать полипептид Ang-2. Предусмотрены фрагменты, состоящие из 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 или более аминокислот пептида или полипептида согласно настоящему изобретению. Предпочтительные фрагменты полипептида проявляют иммунологические свойства, характерные для антигенсвязывающего агента согласно изобретению. Фрагменты согласно изобретению, обладающие желаемыми иммунологическими свойствами, могут быть получены любым из методов, хорошо известных и рутинно применяемых в данной области. Могут быть получены варианты специфичных связывающих агентов, получаемые путем замены. Варианты, получаемые путем замены, обычно считают "аналогичными" исходному полипептиду или обладающими определенным "процентом идентичности" с исходным полипептидом, и включают полипептиды, в составе которых один или более аминокислотных остатков удалены и заменены на альтернативные остатки. В одном аспекте замены являются консервативными по природе, тем не менее, объем изобретения также охватывает не консервативные замены. Идентичность и сходство родственных полипептидов можно с легкостью рассчитать с использованием известных методов. Такие методы включают, но не ограничиваются методами, описанными в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed, Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis ofAnalysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov,M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo et al., SIAM J. Applied Math.,48:1073 (1988). Предпочтительными способами определения родства или процента идентичности двух полипептидов являются способы, позволяющие определить максимальное совпадение двух исследуемых последовательностей. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные способы определения идентичности двух последовательностей, обеспечиваемые компьютерными программами, включают, но не ограничиваются следующими: пакет программ GCG,включая GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990. Программа BLASTX общедоступна в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и других источниках (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra(1990. Широко известный алгоритм Смита-Ватермана также можно применять для определения идентичности. Некоторые схемы сопоставления, предназначенные для сопоставления двух аминокислотных последовательностей, могут давать совпадения лишь коротких участков двух последовательностей, и такой небольшой выровненный участок может иметь очень высокую идентичность в последовательностях, даже если между двумя полноразмерными последовательностями отсутствует существенное родство. Соответственно, в отдельных вариантах реализации применение выбранного метода сопоставления (программы GAP) будет приводить к сопоставлению, которое охватывает по меньшей мере 10% полной длины сравниваемого полипептида-мишени, т.е. по меньшей мере 40 соседних аминокислот, в случае, когда длина сравниваемых аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере 400 аминокислот, 30 соседних аминокислот, в случае, когда длина сравниваемых последовательностей находится в промежутке от 300 до приблизительно 400 аминокислот, по меньшей мере 20 соседних аминокислот, в случае, когда длина сравниваемых последовательностей находится в промежутке от 200 до приблизительно 300 аминокислот и по меньшей мере 10 соседних аминокислот, в случае, когда длина сравниваемых последовательностей находится в промежутке от 100 до 200 аминокислот. Например, путем применения компьютерного алгоритма GAP (Genetics Computer Group, Universityof Wisconsin, Madison, WI), два полипептида, для которых нужно определить процент идентичности последовательностей, выравнивают для оптимального совпадения соответствующих аминокислот ("участок сопоставления", как определено алгоритмом). В отдельных вариантах реализации в сочетании с алгоритмом применяют штраф за открытие пробела (который обычно рассчитывают как 3 Х среднюю диагональ;"средняя диагональ" представляет собой среднее значение используемой матрицы сравнения; "диагональ" представляет номер, определенный для каждой завершенной пары аминокислот в конкретной матрице сравнения) и штраф на продолжение пробела (который обычно составляет 1/10 штрафа за открытие пробела), а также матрицу сравнения, например РАМ 250 или BLOSUM 62. В отдельных вариантах реализации алгоритмом также применяется стандартная матрица сравнения (см. Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) для матрицы сравнения РАМ 250 comparison matrix; Henikoff et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) для матрицы сравнения BLOSUM 62). В отдельных вариантах реализации параметры для сравнения последовательности полипептида включают следующее: алгоритм: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970); матрица сравнения: BLOSUM 62 from Henikoff et al., supra (1992); штраф за пробел в последовательности: 12; штраф за удлинение пробела: 4; пороговое сходство: 0. Программа GAP может быть полезна при введении указанных выше параметров. В отдельных вариантах реализации параметры, указанные выше, являются параметрами по умолчанию при сравнении полипептидов (вместе с отсутствием штрафа за концевые пробелы) при применении алгоритма GAP. В отдельных вариантах реализации параметры для сравнения последовательности молекулы полинуклеотида включают следующее: алгоритм: Needleman et al., supra (1970); матрица сравнения: соответствия = +10, несоответствие = 0; штраф за пробел в последовательности: 50; штраф за удлинение пробела: 3. Программа GAP также можно применять с указанными выше параметрами. Параметры, указанные выше, являются параметрами по умолчанию при сравнении молекул полинуклеотида. Возможно применение других примеров алгоритмов, штрафов за внесение пробела, штрафов на продолжение делеции, матриц сравнения, порогов сходства и т.д., включая приведенные в Руководстве по работе с программой пакета Wisconsin, версия 9, сентябрь, 1997. Выбор в конкретных случаях будет понятен специалистам в данной области и будет зависеть от конкретного осуществляемого сравнения,например, ДНК-ДНК, белок-белок, белок-ДНК; и, также, осуществляют ли сравнение данных пар (в этом случае, обычно, предпочтительными являются GAP или BestFit) или сравнение последовательности и большой базы данных последовательностей (в этом случае предпочтительными являются FASTA илиBLASTA). Двадцать стандартных аминокислот и их аббревиатуры, используемые в настоящем описании, соответствуют общепринятой номенклатуре. См. Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R.Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991, внесенный в настоящий документ посредством ссылки с любой целью. Аминокислоты могут иметь форму L- или D-стереоизомеров (за исключением Gly, не имеющего L и D стереоизомеров), и полипептиды и композиции полипептидов согласно настоящему изобретению могут содержать сочетания стереомерных вариантов. Тем не менее, стереохимия L является предпочтительной. Также, согласно изобретению предложены обращенные молекулы, в составе которых аминоконцевая последовательность аминокислот заменена на карбоксиконцевую. Например, поворот молекулы с нормальной последовательностью Х 1-Х 2-Х 3 будет выглядеть как Х 3-Х 2-Х 1. Также, согласно изобретению предложены обращенные молекулы, в составе которых, как описано выше, аминоконцевая последовательность аминокислот заменена на карбоксиконцевую, и остатки, которые в норме находятся в состоянии энантиомеров "L", заменены на стереоизомерную форму "D". Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати стандартных (незаменимых) аминокислот,неприродных аминокислот, например -, -дизамещенных аминокислот, N-алкил аминокислот, молочной кислоты, и других нестандартных аминокислот также могут быть пригодны в качестве компонентов полипептидов согласно настоящему изобретению. Примеры нестандартных аминокислот включают, без ограничений, следующие: аминоадипиновая кислота, бета-аланин, бета-аминопропионовая кислота, аминомасляная кислота, пиперидиновая кислота, аминокапроновая кислота, аминогептановая кислота, аминоизомасляная кислота, аминопимелиновая кислота, диаминомасляная кислота, десмозин, диаминопимелиновая кислота, диаминопропионовая кислота, N-этилглицин, N-этиласпарагин, гидроксилизин, аллогидроксилизин, гидроксипролин, изодесмозин, алло-изолейцин, N-метилглицин, саркозин, Nметилизолейцин, N-метилвалин, норвалин, норлейцин, оритин, 4-гидроксипролин, -карбоксиглутамат,-N,N,N-триметиллизин, -N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3 метилгистидин, 5-гидролизин, -N-метиларгинин, и другие двойники аминокислот и аминокислоты (например, 4-гидроксипролин). Также, если не указано обратного, левый конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей представляет собой 5' конец; левое направление (против часовой стрелки) обозначено как 5' направление. Направление от 5' к 3' растущих транскриптов РНК обозначено как направление транскрипции; участки последовательности на цепи ДНК, имеющие такую же последовательность, что и РНК,и располагающиеся от 5' к 3' концу транскрипта РНК обозначены как "последовательности "выше по ходу транскрипции"; участки последовательности на цепи ДНК, имеющие такую же последовательность,что и РНК, и располагающиеся от 3' к 5' концу транскрипта РНК, обозначены как "последовательности"ниже по ходу транскрипции". Консервативные замены аминокислот могут охватывать не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые обычно вносят путем пептидного химического синтеза скорее, чем путем синтеза в биологических системах. Такие молекулы включают пептидомиметики и другие реверсированные или инверсированные формы аминокислотных остатков. Остатки, встречающиеся в природе, можно разделить на классы на основе свойств боковых цепей: 1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) кислотные: Asp, Glu; 4) основные: His, Lys, Arg; 5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro; и 6) ароматические: Trp, Tyr, Phe. Например, не консервативные замены могут включать замену представителя одного из перечисленных классов на представителя другого класса. Такие замещенные остатки можно вводить в области антитела человека, являющиеся гомологичными антителам, полученным не из организма человека, или в не гомологичные области молекулы. При внесении указанных изменений может быть необходимо учесть гидропатический индекс аминокислот. Для каждой аминокислоты был определен гидропатический индекс на основе ее гидрофобности и характеристик заряда. Такие индексы равны: изолейцин (+4.5); валин (+4.2); лейцин (+3.8); фенилаланин (+2.8); цистеин/цистин (+2.5); метионин (+1.9); аланин (+1.8); глицин (-0.4); треонин (-0.7); серин (-0.8); триптофан (-0.9); тирозин (-1.3); пролин (-1.6); гистидин (-3.2); глутамат (-3.5); глутамин (3.5); аспартат (-3.5); аспарагин (-3.5); лизин (-3.9) и аргинин (-4.5). Важность гидропатического индекса в придании интерактивной биологической функции белку известна в данной области. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Известно, что отдельные аминокислоты можно замещать на другие аминокислоты со сходным гидропатическим индексом или значением с сохранением сходной биологической активности. При внесении изменений на основе гидропатического индекса, в отдельных вариантах реализации, предусмотрены замены аминокислот, значения гидропатических индексов которых находятся в границах 2. В отдельных вариантах реализации предусмотрены значения гидропатических индексов таких аминокислот, находящиеся в границах 1, и, в отдельных вариантах реализации, предусмотрены значения гидропатических индексов таких аминокислот, находящиеся в границах 0.5. Также в данной области известно, что замены аналогичных аминокислот можно эффективно осуществлять на основе гидрофильности, особенно в случаях, когда биологически активный белок или пептид, получаемый при помощи таких замен, предназначен для применения в иммунологических вариантах реализации, как в настоящем случае. В отдельных вариантах реализации максимальная локальная средняя гидрофильность белка, которая определяется гидрофильностью составляющих его аминокислот,коррелирует с иммуногенностью и антигенностью белка, т.е. с его биологическими свойствами. Далее приведены значения гидрофильности, которые были определены для следующих аминокислотных остатков: аргинин (+3.0); лизин (+3.0); аспартат (+3.01); глутамат (+3.01); серин (+0.3); аспарагин (+0.2); глутамин (+0.2); глицин (0); треонин (-0.4); пролин (-0.51); аланин (-0.5); гистидин (-0.5); цистеин (-1.0); метионин (-1.3); валин (-1.5); лейцин (-1.8); изолейцин (-1.8); тирозин (-2.3); фенилаланин(-2.5) и триптофан (-3.4). При внесении изменений на основе значений гидрофильности, в отдельных вариантах реализации, предусмотрены замены аминокислот, значения гидрофильности которых находятся в границах 2. В отдельных вариантах реализации предусмотрены значения гидрофильности таких аминокислот, находящиеся в границах 1, и, в отдельных вариантах реализации, предусмотрены значения гидрофильности таких аминокислот, находящиеся в границах 0.5. Также на основе гидрофильности можно определить эпитопы первичных аминокислотных последовательностей. Такие области также обозначают как "коровые области эпитопа". Примеры замен аминокислот приведены в табл. 1. Таблица 1 Замены аминокислот Специалист в данной области сможет определить подходящие варианты полипептида согласно настоящему описанию с использование известных методик. В некоторых вариантах реализации специалист в данной области может определить подходящие области молекулы, в которые можно внести изменения без нарушения активности участков-мишеней, не считающихся важными для биологической активности. В некоторых вариантах реализации можно определить остатки и части молекул, являющиеся консервативными для сходных полипептидов. В отдельных вариантах реализации даже области, которые могут иметь значение в биологической активности или в структуре, можно подвергать консервативным заменам аминокислот без нарушения биологической активности или без значительного влияния на структуру полипептида. Также, специалист в данной области может ознакомиться со структурно-функциональными исследованиями по определению остатков в составе сходных полипептидов, имеющих важное значение для активности или структуры полипептидов. В целях проведения такого сравнения можно предсказать значение аминокислотных остатков в составе белка, которое будет соответствовать аминокислотным остаткам, имеющим важное значение для активности или структуры сходных белков. Специалист в данной области может сделать выбор среди химических замен аминокислот для таких предполагаемых значи- 20022308 мых аминокислотных остатков. Специалист в данной области также может анализировать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность в сравнении с этими же параметрами сходных полипептидов. Учитывая такую информацию, специалист в данной области может прогнозировать сопоставление аминокислотных остатков антитела в соответствии с его трехмерной структурой. В отдельных вариантах реализации специалист в данной области может предпочесть не производить радикальных изменений в аминокислотных остатках, исходя из прогноза, расположенных на поверхности белка, так как такие остатки могут быть вовлечены в важные взаимодействия с другими молекулами. Более того, специалист в данной области может разработать экспериментальные варианты, содержащие одну аминокислотную замену у каждого требуемого аминокислотного остатка. Затем можно провести скрининг вариантов путем применения анализов активности, известных специалистам в данной области. Такие варианта можно использовать для сбора информации о полезных вариантах. Например, если исследователь выяснил, что замена на конкретный остаток привела к нарушенной, нежелательно сниженной, или несоответствующей активности, вариантов с такой заменой можно избегать. Другими словами, на основе информации, полученной в каждом из рутинных экспериментов, специалист в данной области может с легкостью определить, в каких случаях следует избегать дальнейших замен как отдельно, так и в сочетании с другими мутациями. Ряд научных публикаций был посвящен прогнозированию вторичной структуры. См. Moult J., Curr.Op. in Biotech, 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al.,Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 и Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Более того, в настоящее время доступны компьютерные программы, помогающие предсказывать вторичную структуру. Один способ прогнозирования вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например, два полипептида или белка, которые имеют идентичность последовательности более 30%, или сходство выше 40% часто имеют сходные структурные топологии. Недавнее разрастание базы данных белковых структур(PDB) предоставило увеличившуюся предсказуемость вторичной структуры, включая потенциальное количество складок внутри структуры полипептида или белка. См. Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(l):244247 (1999). Было предположено, что (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997 существует ограниченное количество складок в данном полипептиде или белке, и когда будет расшифровано критическое число структур, прогнозирование структуры станет значительно более точным. Дополнительные способы прогнозирования вторичной структуры включают "нарезку" (Jones, D.,Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996, "анализ профиля"Brenner, supra (1997. Могут быть получены варианты антитела, полученные путем гликозилирования, где число и/или тип сайтов гликозилирования изменяют в соответствии с аминокислотными последовательностями родительского полипептида. В отдельных вариантах реализации варианты белка содержат большее или меньшее число N-связанных сайтов гликозилирования, чем нативный белок. N-связанный сайт гликозилирования характеризуется последовательностью: Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где аминокислотный остаток, обозначенный как X, может быть любым аминокислотным остатком за исключением пролина. Замена аминокислотных остатков с созданием такой последовательности предоставляет потенциально новый сайт для добавления N-связанной углеводородной цепи. В качестве альтернативного варианта, замены,нарушающие такую последовательность, будут приводить к удалению существующей N-связанной углеводородной цепи. Также предложено реаранжирование N-связанных углеводородных цепей, где один или более N-связанных сайтов гликозилирования (обычно, встречающиеся в природе) удален и один или более N-связанных сайтов создан. Дополнительные предпочтительные варианты включают варианты цистеина, где один или более остатков цистеина удален или замещен на другую аминокислоту (например, на серин) по сравнению с родительской аминокислотной последовательностью. Варианты цистеина могут быть полезны, когда не нужно, чтобы антитела сворачивались в биологически активную конформацию, как после удаления нерастворимых антител включения. Варианты цистеина обычно имеют меньше аминокислотных остатков, чем нативный белок, и обычно содержат четное число остатков для сведения к минимуму взаимодействий, возникающих из-за наличия непраного цистеина. Аминокислотными заменами являются: (1) снижающие чувствительность к протеолизу, (2) снижающие чувствительность к окислению, (3) изменяющие аффинность связывания с образованием белковых комплексов, (4) изменяющие аффинности связывания и/или (5) придающие или изменяющие другие функциональные свойства таких полипептидов. Согласно некоторым вариантам реализации можно произвести одну или несколько замен аминокислот (в отдельных вариантах реализации замен консервативных аминокислотных остатков) в последовательности, встречающейся в природе (в отдельных вариантах реализации, в участке молекулы полипептида, находящемся вне области (областей), образующих межмолекулярные контакты). В отдельных вариантах реализации замена консервативной аминокислоты,обычно, значительно не изменяет структурные параметры родительской последовательности (например,замены аминокислоты не должна разрушить спираль родительской последовательности, или нарушать другие тиры вторичной структуры, характерной для родительской последовательности). Примеры принятых в данной области техники вторичных и третичных структур описаны в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984; Introduction to ProteinStructure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991; и Thornton et al. Nature 354:105 (1991). Молекулы специфичных связывающих агентов согласно настоящему изобретению, являющиеся молекулами полипептидов или вариантов полипептидов, полученных путем внесения замены, могут содержать до приблизительно 10 или 12% исходной аминокислотной последовательности. Для вариантов антитела тяжелая цепь может содержать 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33,32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замену аминокислоты, тогда как легкая цепь может содержать 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14,13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замену аминокислоты. Производные специфичных связывающих агентов. Могут быть получены производные полипептидов специфичного связывающего агента, производные включают полипептиды специфичных связывающих агентов, содержащие модификации, отличные от вставок, делеций или замен аминокислотных остатков. Предпочтительными являются модификации,ковалентные по структуре, и включающие, например, химическое связывание с полимерами, липидами,другими органическими и неорганическими молекулами. Производные согласно изобретению можно создавать с продлением периода полужизни полипептида специфичного связывающего агента, или они могут быть предназначены для улучшения способности направления на клетки, ткани иорганы, согласно изобретению. Кроме того, могут быть получены производные связывающих агентов, ковалентно модифицированные с присоединением одного или более водорастворимых полимеров, например полиэтиленгликоль,полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, как описано в патентах США 4640835, 4496689,4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. Также, к полезным полимерам, известным в данной области, относятся монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлоза или другие полимеры на основе углеводородов, поли-(N-винил пирролидон)гомополимеры полиэтиленгликоля, пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол) и поливиниловый спирт, а также смеси перечисленных полимеров. Особо предпочтительными являются продукты специфичных связывающих агентов, ковалентно модифицированные при помощи субъединиц полиэтиленгиколя (ПЭГ, PEG). Можно образовывать связи с водорастворимыми полимерами в специфических положениях, например, в аминоконце продуктов специфичных связывающих агентов, или произвольно присоединять к одной или более боковых цепей полипептида. Применение ПЭГ для улучшения терапевтических свойств специфичного связывающего агента и гуманизированных антител, в частности, описано в патенте США 6133426 to Gonzales et al., выданном 17 октября 2000 г. Сайты-мишени для мутагенеза антител. Для манипуляций с собственными свойствами специфичного антитела к Ang-1 и/или Ang-2-, такими как аффинность антитела к его мишени, можно применять определенные стратегии. Такие стратегии включают применение сайт-направленного или случайного мутагенеза молекулы полинуклеотида, кодирующей антитело, с получением вариантов антител, за которым следует этап скрининга, предназначенный для обнаружения вариантов антитела, содержащих требуемую замену, например, повышенную или пониженную аффинность. Остатки аминокислот, которые чаще всего служат мишенями в стратегиях мутагенеза, находятся в гипервариабельных участках. Как описано выше, такие области содержат остатки, по сути, взаимодействующие с Ang-1 и/или Ang-2 и другие аминокислоты, влияющие на пространственное расположение таких остатков. Тем не менее, было показано, что аминокислоты в каркасном участке вариабельных участков вне гипервариабельных участков также вносят существенный вклад в антигенсвязывающие способности антитела и могут служить мишенью для манипуляций с такими свойствами. См. Hudson, Curr Opin.Biotech, 9:395-402 (1999) и приведенные в ней ссылки. Библиотеки вариантов антител меньшего размера и подвергнутые более эффективному скринингу можно получать путем ограничения случайного или сайт-направленного мутагенеза в сайтах CDR, которые соответствуют областям, подверженным "супер-мутации" в ходе соматического процесса аффинного созревания. См. Chowdhury and Pastan, Nature Biotech, 17: 568-572 [1999] и приведенные у них ссылки. Типы известных элементов ДНК, определяющих сайты супер-мутации, включают прямые и обратные повторы, отдельные консенсусные последовательности, вторичные структуры и палиндромы. Консенсусные последовательности ДНК включают четырехосновную последовательность пурин-G-пиримидинА/Т (т.е. А или G - G - С или Т - А или Т) и кодон серина AGY (где Y может представлять собой С или Т). Существуют стратегии мутагенеза, целью которых является повышение степени связывания антитела сего мишенью. Такие стратегии включают мутагенез целой вариабельной области тяжелой и легкой цепи, мутагенез только участков, мутагенез консенсусных сайтов супермутации в пределах гипервариабельных участков, мутаненез областей рамки считывания, или любую комбинацию перечисленных спо- 22022308 собов ("мутагенез" в данном контексте может носить случайный или сайт-направленный характер). Можно выполнить полное картирование гипервариабельных участков и определения остатков, составляющих сайт связывания антитела с определением структуры антитела, и комплекса антитело-лиганд с использованием известных специалистам в данной области, например, рентгеновской кристаллографии. Различные способы, основанные на анализе и изучении кристаллических структур указанных антител,известны специалистам в данной области, и возможно их применение для приблизительного, неточного,расчета гипервариабельных участков. Примеры таких обычно применяемых методов включают Kabat,Chothia, AbM и контактный алгоритмы. Обозначения Kabat основаны на вариабельности последовательности, и чаще всего применяются для прогнозирования структуры гипервариабельных участков [Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 28: 214-8 (2000)]. Алгоритм Chothia основан на локализации петель в структуре [Chothia et al., J. Mol. Biol.,196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)]. Алгоритм AbM представляет промежуточный вариант между алгоритмами Kabat и Chothia. AbM представляет собой целостный набор программ для моделирования структуры антитела, произведенный Оксфордской молекулярной группой [Martin etal., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:9268-9272 (1989); Rees, et al., ABM, компьютерная программа для моделирования вариабельных областей антител, Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.]. Набор AbM моделирует третичную структуру антитела по первичной последовательности путем использования комбинации баз данных знаний и неэмперических методов. Дополнительный алгоритм, известный как контактный алгоритм [MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996)], был введен в недавнее время. Этот алгоритм основан на анализе доступных сложных кристаллических структур. Гипервариабельные участки тяжелой цепи принято обозначать H1, H2 и Н 3, и их последовательно нумеруют по порядку, счет ведут от аминоконца к карбоксильному концу. Гипервариабельные участки легкой цепи принято обозначать L1, L2 и L3 и их последовательно нумеруют по порядку, счет ведут от аминоконца к карбоксильному концу.CDR-H1 имеет в длину приблизительно от 10 до 12 остатков и обычно начинается через 4 остатка после Cys, согласно обозначениям Chothia и AbM, или через 5 остатка после, согласно алгоритму Kabat. 3 а H1 обычно следует Trp, обычно Trp-Val, но также Trp-Ile, или Trp-Ala. Длина H1 состоит из, приблизительно 10-12 остатков согласно алгоритму AbM, тогда как алгоритм Chothia исключает последние 4 остатка.CDR-H2 обычно начинается через 15 остатков после окончания of H1 согласно обозначениям Kabat и AbM. Остатками, предшествующими Н 2, обычно являются Leu-Glu-Trp-Ile-Gly, но существуют некоторые вариации. 3 а Н 2 обычно следует аминокислотная последовательность Lys/ArgLeu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. Согласно алгоритму Kabat, длина Н 2 составляет приблизительно 16-19 остатков, тогда как алгоритм AbM предсказывает 9-12 остатков в длину.CDR-H3 обычно начинается через 33 остатка после окончания Н 2, и ему обычно предшествует аминокислотная последовательность (обычно Cys-Ala-Arg). После Н 3 обычно следует аминокислотная последовательность-Gly. Длина Н 3 может быть любой, в промежутке от 3 до 25 остатков.CDR-L1 обычно начинается приблизительно с 24 остатка и обычно следует за остатком Cys. Остаток после CDR-L1 всегда является Trp, обычно, являющийся началом последовательности Trp-Tyr-Gln,Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, или Trp-Tyr-Leu. Длина CDR-L1 составляет приблизительно от 10 до 17 остатков. Пунитивный CDR-L1 для антител согласно изобретению четко следует этому паттерну с остаткомCys, за которым следуют 15 аминокислот, и затем Trp-Tyr-Gln.CDR-L2 начинается приблизительно через 16 остатка после окончания L1. Обычно, он следует за остатками Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys или Ile-Phe. Длина CDR-L2 составляет приблизительно 7 остатков.CDR-L3 обычно начинается через 33 остатка после окончания L2, и обычно, следует за Cys. ПослеL3 обычно следует аминокислотная последовательность Phe-Gly-XXX-Gly. Длина L3 составляет приблизительно от 7 до 11 остатков. В данной области описаны различные способы модификации антител. Например, патент США 5530101 (to Queen et al., June 25, 1996) описывает способы получения гуманизированных антител, в составе которых последовательность каркасного участка вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина на 65-95% идентична последовательности каркасного участка вариабельной области тяжелой цепи донорного иммуноглобулина. Каждая гуманизированная цепь иммуноглобулина обычно будет содержать, в дополнение к гипервариабельным участкам, аминокислоты из каркасного участка донорного иммуноглобулина, которые, например, способны взаимодействовать с участкамиCDR с затрагиванием связывающей способности, например, одна или более аминокислот, непосредственно примыкающих к CDR в составе донорного иммуноглобулина, или в пределах 3 ангстрем, как предсказано путем молекулярного моделирования. Тяжелую и легкую цепи можно создавать путем применения любого из различных позиционных критериев. При внесении в состав интактного антитела, гуманизированные иммуноглобулины согласно настоящему изобретению будут, по существу, не иммуногенными в организме человека, и будут сохранять аффинность к антигену, по существу, присущую донорному иммуноглобулину, например, к белку или другому веществу, содержащему эпитоп. См. также соответствующие способы в патенте США 5693761 to Queen, et al., изданном 2 декабря 1997 г. ("По- 23022308 линуклеотиды, кодирующие улучшенные гуманизированные иммуноглобулины"); патенте США 5693762 to Queen, et al., изданном 2 декабря 1997 г. ("Гуманизированные иммуноглобулины"); патенте США 5585089 to Queen, et al., изданном 17 декабря 1996 г. ("Гуманизированные иммуноглобулины"). В одном примере патента США 5565332 to Hoogenboom et al., изданный 15 октября 1996 г. ("Создание химерных антител - комбинаторный подход"), описаны способы создания антител и фрагментов антител, обладающих специфичностью связывания, сходной со специфичностью связывания родительского антитела, но с повышенными человеческими свойствами. Гуманизированные антитела получают путем "перетасовки" цепи, с использованием, например, методики фагового отображения, и полипептид,содержащий вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела, не принадлежащего организму человека, специфичного по отношению к антигену согласно изобретению, соединяют с набором комплементарных вариабельных доменов (тяжелой или легкой) цепи. Определяют гибридные пары, являющиеся специфичными по отношению к антигену согласно изобретению, и цепи человека из отобранных пар соединяют с набором комплементарных вариабельных областей человека (тяжелой или легкой цепи). В другом варианте реализации, компонент CDR антитела, не являющегося антителом человека, соединяют с набором составных частей CDR антител человека. Из полученной библиотеки димеров полипептида антитела отбирают гибриды, которые используют на втором этапе перетасовки процесса гуманизирования. В качестве альтернативы, второй этап исключают, если гибриды имеют достаточное родство к организму человека, для того, чтобы обладать терапевтической ценностью. Способы модификации с повышением родства к организму человека также описаны. См. также Winter, FEBS Letts 430:92-92 (1998). В качестве другого примера, патент США 6054297 to Carter et al., выданный 25 апреля 2000 г.,описывает способ создания гуманизированных антител путем замещения аминокислотной последовательности CDR на соответствующую аминокислотную последовательность гипервариабельного участка человека, и/или замещение аминокислотной последовательности FR на соответствующие аминокислотные последовательности каркасного участка человека. В качестве другого примера, патент США 5766886 to Studnicka et al., изданный 16 июня 1998 г.("вариабельные области модифицированного антитела"), описывает способы определения аминокислотных остатков вариабельной области антитела, в которые возможно внести модификации без значительного снижения аффинности, присущей антигенсвязывающей области, при снижении его иммуногенности в отношении гетерологичных видов, и способы создания таких модифицированных вариабельных областей антитела, которые являются полезными для введения гетерологичным видам. См. также патент США 5869619 to Studnicka, изданный 9 февраля 1999 г. Как отмечалось выше, модификацию антитела путем применения любого из способов, известных в данной области, обычно осуществляют для достижения повышения связывающей способности в отношении антигена, и/или снижения иммуногенности антитела в организме реципиента. Согласно одному способу гуманизированные антитела можно модифицировать с удалением сайтов гликозилирования с повышением аффинности антитела в отношении распознаваемого им антигена [Со et al., Mol. Immunol. 30:1361-1367 (1993)]. Такие методики, как "реконструирование" "суперхимеризация" и "облицовки/восстановления поверхности" позволяют получать гуманизированные антитела с большим терапевтическим потенциалом [Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma,Immunol. 81:105 (1998); Roguska et al.,Prot Engineer 9:895-904 (1996)]. См. также патент США 6072035 to Hardman et al., изданный 6 июня 2000 г., который описывает способы реконструирования (инженерии) антител. Хотя такие методики снижают иммуногенность антитела путем сокращения нескольких чужеродных остатков, они не предотвращают антиидиотипический и антиаллотипический ответы, возникавшие на повторяющееся введение антител. Альтернативы перечисленным способам снижения иммуногенности immunogenicity описаны вGilliland et al., J. Immunol. 62(6): 3663-71 (1999). Во многих случаях гуманизирование антител ведет к потере антигенсвязывающей способности. Также предпочтительным считается "back mutate" (процесс мутации в направлении первоначальных видов). В гуманизированное антитело включали один или более аминокислотный остаток антитела (чаще всего, антитела крысы). См., например, Saldanha et al., Mol. Immunol. 36:709-19 (1999). Непептидные налоги специфичных связывающих агентов/миметики белков. Могут быть получены непептидные специфичные связывающие агенты, аналоги пептидов, придающих стабильность структуре или снижающие биодеградацию. Аналоги-миметики пептида специфичного связывающего агента получают на основе выбранного ингибиторного пептида путем замещения одного или более остатков на непептидные молекулы. Предпочтительно непептидные молекулы позволяют пептиду принимать его естественную конформацию, или стабилизировать предпочтительную, например биологически активную, конформацию, сохраняющую способность распознавать и связыватьAng-1 и/или Ang-2. Согласно одному аспекту полученный в результате аналог/миметик проявляет повышенную связывающую способность в направлении Ang-1 и/или Ang-2. Один пример способов создания непептидных миметических аналогов на основе пептидов специфичных связывающих агентов описан вNachman et al., Regul Pept 57:359-370 (1995). Если это требуется, пептиды специфичных связывающих агентов согласно изобретению можно модифицировать, например, путем гликозилирования, амидирования, карбоксилирования или фосфорилирования, или путем создания солей, получаемых добавлением аминокислот, амидов, сложных эфиров, в частности эфиров по С-концу, и N-ацил производных пептидов согласно изобретению. Пептиды специфичных связывающих агентов также можно модифицировать с созданием производных пептида путем образования ковалентных или нековалентных комплексов с другими молекулами. Ковалентно-связанные комплексы можно получать путем связывания химических молекул с функциональными группами боковых цепей аминокислот, содержащими пептиды специфичного связывающего агента, или по N-или С-концам. В частности, предполагается, что пептиды специфичного связывающего агента можно конъюгировать с репортерной группой, включая, но не ограничиваясь следующими: радиоактивная метка, флуоресцентная метка, фермент (например, который катализирует колориметрическую или флуорометрическую реакцию), субстрат, твердый матрикс или переносчик (например, биотин или авидин). Соответственно,согласно изобретению предложена частица, содержащая молекулу антитела, где молекула далее предпочтительно содержит репортерную группу, выбранную из группы, состоящей из следующих: радиоактивная метка, флуоресцентная метка, фермент, субстрат, твердый матрикс, и переносчик такие метки хорошо известны специалистам в данной области, например, в частности, предусмотрены биотиновые метки. Применение таких меток хорошо известно специалисту в данной области и описано, например, в патентах США 3817837; 3850752; 3996345 и 4277437. Другие метки, которые будут полезны, включаю, но не ограничиваются следующими: радиоактивные метки, флуоресцентные метки и хемилюминесцентные метки. И патенты США, которые касаются применения таких меток, включают, например, патенты США 3817837; 3850752; 3939350 и 3996345. Любой из пептидов согласно настоящему изобретению может содержать одну, две или более таких меток. Способы создания специфичных связывающих агентов. Специфичные связывающие агенты, представляющие собой белки, можно изготавливать путем химического синтеза в растворе или на твердом носителе в соответствии с общепринятыми способами. Действующий предел для твердофазного синтеза составляет приблизительно 85-100 аминокислот в длину. Тем не менее, методики химического синтеза часто могут применяться с лигированием ряда пептидов меньшего размера с получением полноразмерных полипептидов. Различные автоматические синтезаторы являются коммерчески доступными, и могут применяться в соответствии с известными протоколами. См., например, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984);Protein Res., 30, 705-739 (1987); и патент США 5424398, каждый из которых внесен в настоящий документ посредством ссылки. Способы твердофазного пептидного синтеза применяют сополи(стирол-дивинилбензол), содержащий 0.1-1.0 мМ амины/г полимера. Указанные способы синтеза пептидов применяют бутоксикарбонил(t-BOC) или 9-фторенилметоксикарбонил (FMOC) защиту альфа-аминогрупп. Оба способа включают пошаговый синтез, в ходе которого на каждом этапе добавляют одну аминокислоту, начиная с С-конца пептида (см. Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9). После завершения химического синтеза с синтетического полипептида можно снимать защиту путем удаления аминокислотных блокирующих групп t-BOC или FMOC, и отщепления этих групп от полимера путем воздействия кислотой при пониженной температуре (например, жидким HF-10% анизолом в течение периода приблизительно от 0.25 до приблизительно 1 ч при 0 С). После выпаривания реагентов пептиды специфичных связывающих агентов экстрагируют из состава полимера при помощи 1% раствора уксусной кислоты, который затем лиофилизируют с получением неочищенного вещества. Такое вещество обычно можно очистить путем применения таких методик, как гель-фильтрация на Sephadex G-15 с применением 5% уксусной кислоты в качестве растворителя. Лиофилизация соответствующих фракций колонки будет давать на выходе гомогенный пептид специфичного связывающего агента или производные пептида, которые затем можно определять путем применения таких стандартных методик, как анализ аминокислот, тонкослойная хроматография, жидкостная хроматография высокого разрешения, абсорбционная спектроскопия в ультрафиолетовом диапазоне, молярное вращение, анализ растворимости, и проводить количественную оценку методом твердофазного расщепления по Эдману. Химический синтез антител к Ang-1 и/или к Ang-2, производных, вариантов и фрагментов антител,а также других белковых агентов, связывающих Ang-2, позволяет вводить в состав агента аминокислоты,которые имеют неприродное происхождение. Методики рекомбинантной ДНК относятся к общепринятым способам создания полноразмерных антител и других крупных специфичных связывающих агентов белковой природы согласно настоящему изобретению, а также их фрагментов. Молекулу кДНК, которая кодирует антитело или его фрагмент,можно вносить в экспрессионный вектор, который, в свою очередь, можно помещать в клетку-хозяина с выработкой антитела или его фрагмента. Очевидно, что кДНК, которая кодирует такие антитела, можно модифицировать с получением молекулы, отличной от "оригинальной" кДНК (транслированной с мРНК) с получением вырожденности кодонов или с обеспечением предпочтительного использования кодона в различных клетках-хозяевах. В общем, молекулу ДНК, которая кодирует антитело, можно получить путем применения способов,- 25022308 описанных в примерах в настоящем изобретении. В случае, когда согласно настоящему изобретению получают молекулы Fab или гипервариабельные участки, родственные исходной молекуле антитела,можно провести скрининг подходящей библиотеки (библиотеки фагового отображения; лимфоцитарной библиотеки и т.д.) при применении стандартных методик определения и Fab/CDR клонов. Зонды, применяемые для такого скрининга, могут быть полноразмерными или укороченными зондами Fab, которые кодируют Fab-фрагмент исходного антитела, пробы, направленные против одного или нескольких гипервариабельных участков Fab фрагмента исходного антитела, и другие подходящие пробы. Если в качестве зондов применяют фрагменты ДНК, обычные условия гибридизации будут соответствовать приведенным в Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press [1994]). После гибридизации, блот с нанесенным на него зондом можно отмывать в условиях соответствующей строгости,в зависимости от таких факторов, как размер пробы, ожидаемая степень гомологии пробы к клону, тип библиотеки, которую применяли при скрининге, и количество клонов, подвергаемых скринингу. Примерами высокой строгости скрининга являются 0.1 X SSC, и 0.1% SDS при температуре 50-65 С. Множество векторов экспрессии/систем-хозяев можно применять для содержания и экспрессии полинуклеотидных молекул, кодирующих полипептиды специфичных связывающих агентов согласно изобретению. Такие системы включают, но не ограничиваются следующими: микроорганизмы, например,бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, экспрессионные векторы, представляющие собой ДНК плазмид или космид; дрожжи, трансформированные дрожжевыми векторами экспрессии; системы клеток насекомых, инфицированных вирусными экспрессионными векторами (например, бакуловирус); системы клеток растений, трансфицированных вирусными экспрессионными векторами (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус табачной мозаики, TMV) или трансформированные бактериальными экспрессионными векторами (например, Ti или плазмида pBR322); или системы клеток животных. Клетки млекопитающих, полезные в создании рекомбинантного белка специфичного связывающего агента включают, но не ограничиваются следующими: клетки VERO, клетки HeLa, линии клеток яичника китайского хомячка (CHO), клетки COS (например, COS-7), W138, ВНК, HepG2, 3 Т 3, RIN, MDCK,A549, РС 12, K562 и клетки 293, а также линии клеток гибридомы, описанные в тексте настоящего изобретения. Клетки млекопитающих являются предпочтительными для создания таких специфичных связывающих агентов, как антитела и фрагменты антител, которые обычно гликозилированы и требуют правильного рефолдинга для своей активности. Предпочтительные клетки млекопитающих включают клетки CHO, клетки гибридомы и клетки миелоида. Примеры некоторых протоколов для рекомбинантной экспрессии белков специфичных связывающих агентов описаны ниже в тексте настоящего документа. Термин "вектор экспрессии" относится к плазмиде, фагу, вирусу или вектору, применяемому для экспрессии полипептида на основе последовательности ДНК (РНК). Вектор экспрессии может содержать единицу транскрипции, состоящую из совокупности (1) генетического элемента или элементов, играющих регуляторную роль в экспрессии генов, например, промоторов и энхансеров, (2) структуру или последовательность, которая кодирует связывающий агент, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в белок, и (3) соответствующие последовательностей инициации и терминации транскрипции. Структурные единицы, которые применяют в дрожжах или эукариотических системах экспрессии предпочтительно включают лидерную последовательность, которая активирует внеклеточную секрецию транслированного белка клеткой-хозяином. В качестве альтернативного варианта, в случае, когда рекомбинантный белок специфичного связывающего агента экспрессируют без лидерной или транспортной последовательности, он может включать аминоконцевой остаток метионина. Этот остаток можно впоследствии отщеплять или нет, от экспрессированного рекомбинантного белка, с получением конечного продукта специфичного связывающего агента. Например, специфичные связывающие агенты можно экспрессировать рекомбинантным путем в клетках дрожжей при применении коммерчески доступной системы экспрессии, например, the PichiaExpression System (Invitrogen, San Diego, CA), в соответствии с инструкциями производителя. Указанная система также основывается на пре-про-альфа-последовательности для прямой секреции, но транскрипция вставки осуществляется промотором алкогольоксидазы (АОХ 1) при индукции метанолом. Секретированный пептид специфичного связывающего агента очищают от среды для роста дрожжей, например, путем применения методов, используемых для очистки пептида от супернатантов клеток бактерий и млекопитающих. В качестве альтернативного варианта, кДНК, которая кодирует пептид специфичного связывающего агента, можно клонировать в бакуловирусный вектор экспрессии pVL1393 (PharMingen, San Diego,CA). Этот вектор можно применять в соответствии с инструкциями производителя (PharMingen) для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda cells в свободной от белка среде sF9, и для получения рекомбинантного белка. Белок специфичного связывающего агента можно очищать и концентрировать из среды путем применения колонки с гепарин-сефарозой (Pharmacia). В качестве альтернативного варианта, пептид можно экспрессировать в системах на основе клеток насекомого. Системы клеток насекомого для экспрессии белка хорошо известны в данной области. В одной такой системе вирус ядерного полиэдроза, Autographa californica (AcNPV) можно применять в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или в личинке Trichoplusia. Последовательность, кодирующую специфический связывающий полипептид, можно клонировать в несущественную область вируса, например, в ген полегидрина, и помещать под контроль полигедринового промотора. Успешная вставка пептида специфичного связывающего агента переводит ген полигедрина в неактивное состояние и позволяет производить рекомбинантный вирус, без оболочки protein coat. Рекомбинантные вирусы можно применять для инфицирования клеток S. frugiperda или личинки Trichoplusia, в которых экспрессируют пептид [Smith et al., J. Virol 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nat.Acad. Sci. (USA) 91: 3224-7 (1994)]. В другом примере последовательность ДНК, которая кодирует пептид специфичного связывающего агента, можно очищать путем ПЦР и клонировать в соответствующий вектор, например pGEX-3X (Pharmacia). Вектор pGEX применяют с получением слитого белка глутатион-S-трансферазы (GST), кодируемого вектором, и фрагмент ДНК, колирующий белок специфичного связывающего агента, вводили в сайт клонирования вектора. Можно создавать праймеры для ПЦР, которые включают, например, соответствующий сайт расщепления. В случаях, когда слитую молекулу связывающего агента применяют лишь для усиления экспрессии, или в какой-либо иной форме не является желательным присоединение к пептиду согласно изобретению, рекомбинантный слитый белок специфичного связывающего агента можно впоследствии отщеплять от участка GST слитого белка. pGEX-3 Х/конструкцию пептида специфичного связывающего агента трансформируют в Е.coli XL-1 Blue cells (Stratagene, La Jolla CA), и выделяли и выращивали отдельные трансформанты. Плазмидную ДНК, получаемую из отдельных трансформантов, можно очищать и частично секвенировать с применением автоматического секвенатора, для подтверждения присутствия вставки нуклеиновой кислоты в правильной ориентации, которая кодирует специфический связывающий агент согласно изобретению. Экспрессия полинуклеотидов, которые кодируют антитела к Ang-1 и/или к Ang-2, и их фрагментов,путем применения рекомбинантных систем, описанных выше, может приводить к получению антител и их фрагментов, нуждающихся "рефолдинге" (с правильным формированием множества дисульфидных мостиков) для приобретения биологической активности. Обычные способы рефолдинга для таких антител приведены в примерах и в следующем разделе. Специфичные связывающие агенты, получаемые в бактериальных клетках, возможно продуцируемые в форме нерастворимых телец включений в бактериях, могут быть очищены следующим образом. Клетку-хозяина разрушают путем центрифугирования, промывают в 0.15 М NaCl, 10 мМ Tris, рН 8, 1 мМ ЭДТА; и обрабатывают 0.1 мг/мл лизоцима (Sigma, St. Louis, МО) в течение 15 мин при комнатной температуре. Лизат можно осветлить путем обработки ультразвуком, а обломки клеток осадить путем центрифугирования в течение 10 мин при 12,000g. Осадок, содержащий специфичный связывающий агент,можно ресуспендировать в растворе, содержащем 50 мМ Tris, рН 8 и 10 мМ ЭДТА, нанести на 50% глицерин и центрифугировать в течение 30 мин при 6000g. Осадок можно ресуспендировать в стандартном фосфатном буферном растворе (ФБР), не содержащем Mg и Са. Специфичный связывающий агент можно дополнительно очистить путем фракционирования ресуспендированного остатка в денатурирующем додецилсульфате ПААГ с додецилсульфатом натрия (Sambrook et al., выше). Гель можно вымочить в 0.4 М KCl, чтобы визуализировать белок, который можно вырезать и элюировать под действием электрического тока в подвижном буфере без SDS. Если бактерия продуцирует слитый белок GST в растворимой форме, его можно очистить с использованием модуля GST Purification Module (Pharmacia). Системы экспрессии рекомбинантного белка в клетках млекопитающих также хорошо известны специалистам. Штаммы клеток-хозяев могут быть выбраны по способности к процессингу экспрессируемого белка или обеспечению определенных посттрансляционных модификаций, которые будут полезны для обеспечения активности белка. Такие модификации включают, но не ограничиваются перечисленными:, ацетилирование, карбоксилирование, фосфорилирование, присоединение липидов и ацилирование. Различные клетки-хозяева, такие как CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, и линии клеток гидридом обладают конкретным клеточным аппаратом и механизмами для такой посттрансляционной активности, и могут быть выбраны для обеспечения корректной модификации и процессинга введенного чужеродного белка. Для выделения клеток, трансформированных для продуцирования рекомбинантного белка, можно использовать ряд систем селекции. Такие системы включают, но не ограничиваются перечисленными: гены тимидинкиназы HSV, гипоксантин-гуанидин фосфорибозилтрансферазы и аденинфосфорибозилтрансферазы в клетках tk-, hgprt- или aprt- соответственно. Также, устойчивость к метаболитам может быть использована в качестве основы для селекции на DHFR, которая обеспечивает устойчивость к метатрексату, gpt которая обеспечивает устойчивость к микофеноловой кислоте; neo, которая обеспечивает устойчивость к аминогликозиду G418 и хлорсульфурону, и hygro, которая обеспечивает устойчивость к гигромицину. Дополнительные селектируемые гены, которые могут быть полезны, включают trpB, который позволяетклеткам использовать индол вместо триптофана, или hisD, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина. Маркеры, которые обеспечивают визуальную индикацию для идентификации трансформантов, включают антоциалины, -глюкуорнидазу и ее субстрат, GUS, а также люциферазу и ее субстрат, люциферин. Очистка и рефолдинг специфичных связывающих агентов. В некоторых случаях специфичные связывающие агенты, продуцируемые с использованием описанных выше процедур, возможно требуют "рефолдинга" и окисления для образования правильной третичной структуры и образования дисульфидных связей, которые обеспечивают биологическую активность. Рефолдинг можно осуществить с использованием ряда процедур известных в данной области. Такие методы включают, но не ограничиваются, например, экспозицию растворенного пептидного агента при рН обычно выше 7 в присутствии хаотропного агента. Выбор хаотропного агента аналогичен выбору агентов для солюбилизации телец включения, однако хаотропный агент обычно применяют в более низкой концентрации. Примером хаотропного агента является гуанидин. В большинстве случаев раствор для рефолдинга/окисления также содержит восстанавливающий агент и его окисленную форму в особом соотношении, что обеспечивает конкретный редокс-потенциал, который допускает образование дисульфидных связей с формированием цистеиновых мостиков. Некоторые обычно применяемые редокс-пары включают цистеин/цистамин глутатион/дитиобис-GSH, хлорид меди, дитиотретиол DTT/дитиан DTT и 2-меркаптоэтанол (bME)/дитио-bME. Во многих случаях может быть использован сорастворитель, чтобы повысить эффективность рефолдинга. Обычно используемые сорастворители включают глицерин полиэтиленгликоль различных молекулярных масс и аргинин. Желательно осуществлять очистку специфичных связывающих белков или их вариантов. Методики очистки белка известны специалистам в данной области. Эти методики включают, на одном уровне, грубое разделение пептидных и непептидных фракций. После отделения полипептида специфичного связывающего агента от других белков, представляющий интерес полипептид можно дополнительно очистить с использованием методик хроматографии и электрофореза до полной (до гомогенного состояния) или частичной очистки, аналитические методы, особенно подходящие для получения чистого специфично связывающего пептида, включают ионообменную хроматографию, электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование. Особенно эффективным способом очистки пептида является быстрая жидкостная хроматография белков или даже ВЭЖХ. Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к очистке, и в конкретных вариантах реализации предложена существенная очистка кодируемого специфичного связывающего белка или пептида. Термин "очищенный специфично связывающий пептид или белок" в настоящем описании относится к композиции, отделенной от других компонентов, в которое специфичный связывающий белок или пептид очищен в любой степени по сравнению с его естественным состоянием. Соответственно, очищенный специфичный связывающие белок также относится к специфичному связывающему белку или пептиду,свободному от среды, в которой он встречается в природе. В целом "очищенный" относится к композициям специфичного связывающего агента, которые были подвергнуты фракционированию для удаления различных других компонентов, в которых, по существу, сохранена биологическая активность. В случае, когда используется термин "по существу, очищенный" он обозначает композицию специфичного связывающего агента в форме белка или пептида, в которой основной компонент составляет, например, около 50, около 60, около 70, около 80, около 90, около 95% или белков. Специалистам известны различные способы количественного определения степени очистки специфичного связывающего агента, применимые в настоящем изобретении. Указанные способы включают,например, определение активности специфичного связывания активной фракции или оценку количества полипептидов специфичного связывающего агента в фракции методом электрофореза в ПААГ/SDS. Предпочтительный способ оценки чистоты фракции специфичного связывающего агента состоит в расчете активности связывания первичного экстракта и последующего расчета степени очистки, т.е. числе"кратности очистки". Единицы для фактического представления активности связывания будут, безусловно, зависеть от конкретной выбранной методики анализа после очистки и от того, проявляет ли экспрессируемые специфичный связанный белок детектируемую активность связывания. Различные методики, пригодные для применения с целью очистки специфичных связывающих агентов-белков, известны специалистом в данной области. Такие методики включают, например, осаждение сульфатом аммония, ПЭГ, антителами (иммунопреципитация) и т.п. или тепловую денатурацию с последующим центрифугированием, этап хроматографии, например аффинную хроматографию (например, на сефарозе с белком А е), ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, обращенно-фазовую хроматографию, хроматографию на гидроксиапатитах и аффинную хроматографию, изоэлектрическое фокусирование, гель-электрофорез и комбинации указанных методик. В данной области принято считать, что порядок выполнения различных этапов очистки можно изменить, или некоторые этапы можно пропустить с сохранением приемлемого для данного метода результата очистки специфичного связывающего агента. Не существует общего требования, согласно которому специфичный связывающий агент всегда должен быть представлен в наиболее очищенном состоянии. В самом деле, подразумевается, что в некоторых вариантах осуществления найдут применение менее чистые варианты специфичного связывающе- 28022308 го агента. Частичная очистка может быть выполнена путем проведения меньшего числа стадий очистки в комбинации или путем использования других вариантов тех же схем очистки. Например, очевидно, что катионообменная колоночная хроматография на устройства для ВЭЖХ обычно обеспечивает большую"кратность" очистки, чем хроматография при низком давлении. Способы, демонстрирующие более низкую степень относительной очистки, могут обладать преимуществами по общему выходу специфичного связывающего агента или по сохранению активности связывания экспрессированного белкового специфичного связывающего агента. Известно, что миграция полипептида может варьировать, иногда в существенной степени, в различных условиях электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия [Capaldi et al.,Biochem BiophysRes Comm, 76: 425 (1977)]. Соответственно, следует понимать, что при различных условиях электроформеза кажущиеся молекулярные массы очищенного или частично очищенного полученного путем экспрессии специфичного связывающего продукта могут варьировать. Анализы связывания. В иммунологических анализах связывания можно применять агенты захвата для специфичного связывания и - часто - для иммобилизации экспериментального антигена-мишени. Иммобилизующий агент представляет собой молекулу, специфично связывающую анализируемое вещество. В одном варианте реализации настоящего изобретения агент захвата представляет собой антитело или его фрагмент, специфично связывающее Ang-2 и/или Ang-1. Такие иммунологические анализы связывания хорошо известны в данной области [см., Asai, ed., Methods in Cell Biology, Vol. 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)]. В иммунологических анализах связывания часто применяют агент, несущий метку, который будет передавать сигнал о наличии связанного комплекса, образованного агентом захвата и антигеном. Агент,несущий метку, может являться одной из молекул, оставляющих связанный комплекс; т.е. он может представлять собой специфично связывающий агент, несущий метку, или антитело, направленное против специфичного связывающего агента, несущее метку. В качестве альтернативного варианта, агент, несущий метку, может являться третьей молекулой, обычно - другим антителом, которое связывается со связанным комплексом. Агент, несущий метку, может представлять собой, например, антитело, направленное против специфичного связывающего агента, несущее метку. Во втором антителе, обладающем специфичностью в отношении связанно комплекса, может отсутствовать метка, но оно может связываться через четвертую молекулу, обладающую специфичностью в направлении видов антител, к которым относится второе антитело. Например, второе антитело можно модифицировать путем введения в его состав детектируемого вещества, например биотина, который впоследствии может связываться с четвертой молекулой, например, со стрептавидином, меченым ферментом. Другие белки, способные к специфическому связыванию константных областей иммуноглобулина, например, белка А или белка G, также можно применять в качестве агентов-меток. Такие связывающие белки являются обычными компонентами бактериальной клеточной стенки стрептококков, и они проявляют высокую неиммуногенную реакционную способность в отношении константных областей иммуноглобулинов множества видов [см., в общих чертах, Akerstrom, J. Immunol., 135:2589-2542 (1985); and Chaubert, Mod Pathol, 10:585-591 (1997)]. В ходе анализа может потребоваться проведение этапов инкубации и/или этапов отмывки после каждого сочетания реагентов. Длительность этапов инкубации может варьировать от приблизительно 5 с до приблизительно 24 ч. При этом время инкубации будет зависеть от характера анализа, анализируемого вещества, объема раствора, концентраций, и других подобных параметров. Обычно, анализы проводят при температуре окружающей среды, хотя возможны постановки при различных диапазонах температур.A. Неконкурентные анализы связывания. Иммунологические анализы связывания могут относиться к неконкурентному типу. В таких анализах присутствует некоторое количество захваченного анализируемого вещества, которое напрямую измеряют. Например, в одном предпочтительном способе "сэндвич"-анализа захваченный агент (антитело) может быть связан непосредственно с твердым субстратом, на котором он иммобилизован. Такие иммобилизованные антитела затем захватывают (связываются с) антигеном, присутствующим в анализируемом образце. Иммобилизованный таким образом белок затем связывается метящим агентом, например,со вторым антителом, содержащим метку. В другом предпочтительном "сэндвич"-анализе метка во втором антителе отсутствует, но оно может быть связано меченым антителом, специфичным к антителам того вида, к которому принадлежит второе антитело. Второе антитело также может быть модифицировано путем введения детектируемого агента, например, биотина, с которым может специфично связаться третья меченая молекула, например, стрептавидин [см. Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual,Ch 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), внесенная в настоящий документ посредством ссылки].B. Конкурентные анализы связывания. Иммунологические анализы связывания могут иметь конкурентный характер. Количество анализируемого вещества, присутствующего в образце, измеряют косвенным путем - путем измерения количества вытесненного добавленного анализируемого вещества с иммобилизующего агента анализируемым веществом, присутствующим в образце. В одном предпочтительном конкурентном анализе связывания известное количество анализируемого вещества, обычно меченого, добавляют к образцу, и образец при- 29
МПК / Метки
МПК: A61P 35/00, C07K 16/22, A61K 39/395
Метки: против, антитела, направленные, применение, ангиопоэтина-2, ангиопоэтина-1
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-22308-antitela-napravlennye-protiv-angiopoetina-1-i-angiopoetina-2-i-ih-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Антитела, направленные против ангиопоэтина-1 и ангиопоэтина-2, и их применение</a>
Предыдущий патент: Антитела для лечения и профилактики болезни альцгеймера и их применение
Следующий патент: Применение 2-(1-гидроксипентил)бензоат калия (dl-phpb) для предупреждения и лечения болезни альцгеймера
Случайный патент: Системы, устройства и способы тепловой обработки для сбора и удаления инфекционных и медицинских отходов