Промотор для il-18bp, его получение и применение

007460 Настоящее изобретение относится к промотору белка, связывающего интерлейкин-18 (IL-18BP), к его получению и применению. Уровень техники Цитокин-связывающие белки (растворимые цитокиновые рецепторы) представляют собой, как правило, внеклеточные лиганд-связывающие домены соответствующих цитокиновых рецепторов клеточной поверхности. Они образуются в результате альтернативного сплайсинга или в результате протеолитического расщепления рецептора клеточной поверхности. Эти растворимые рецепторы были описаны раньше: например, растворимые рецепторы для IL-6 и -IFN (Novick и соавт. 1989), TNF (Engelman и соавт. 1989 и Engelman и соавт. 1990), IL-1 и IL-4 (Malishewski и соавт. 1990) и /-IFN (Novick и соавт. 1994,Novick и соавт. 1992). Один из цитокин-связывающих белков, названный остеопротегерин (OPG, известный также в качестве фактора ингибирования остеокластов - OCIF), представитель семейства TNFR/Fas,являет собой первый пример растворимого рецептора, который существует исключительно в качестве секретируемого белка (Anderson и соавт. 1997, Simonet и соавт. 1997, Yasuda и соавт. 1998). Белок, связывающий интерлейкин-18 (IL-18BP), был выделен из мочи аффинной очисткой на колонке с IL-18 (Novick и соавт. 1999). IL-18BP устраняет IL-18-индукцию -IFN и IL-18-активацию NF-kBin vitro. Кроме того, IL-18BP ингибирует -IFN-индукцию у мышей, которым инъецировали LPS. Ген IL18BP расположен на 11-й хромосоме человека, и в геномной последовательности размером 8.3 т.п.н.,включающей ген IL-18BP, нет экзона, кодирующего трансмембранный домен. К настоящему времени у человека обнаружено четыре изоформы IL-18BP, производимые путем альтернативного сплайсинга мРНК. Их обозначили IL-18BP а, b, с, и d, причем все они обладают одним и тем же N-концом и отличаются по C-концу (Novick и соавт. 1999) . Данные изоформы разнятся по способности связывать IL-18(Kim и соавт. 2000). Известно, что среди этих четырех изоформ IL-18 ВР-изоформы а и с человека (hIL18BP) обладают способностью нейтрализовать IL-18. Самая распространенная IL-18 ВР-изоформа, сплайсируемый вариант изоформы а, проявляет высокое сродство к IL-18 при быстром включении и медленном выключении скорости, и константе диссоциации (Kd), приблизительно 0,4 нМ (Kim и соавт. 2000).IL-18BP конститутивно экспрессируется в селезенке (Novick 1999), и циркулирует в плазме в концентрации 2,5 нг/мл (Novick и соавт. 2001). Остатки, участвующие во взаимодействии IL-13 с IL-18BP, описаны благодаря использованию компьютерного моделирования (Kim и соавт. 2000) и основаны на взаимодействии между аналогичным белком IL-1 с IL-1R тип I (Vigers и соавт. 1997). В соответствии с моделью связывания IL-18 с IL-18BP, Glu-остаток в положении 42 и Lys-остаток в положении 89 у IL-18 предположительно связывается, соответственно, с Lys-130 и Glu-114 в IL-18BP (Kim и соавт. 2000). Как отмечено, IL-18 индуцирует -IFN, который, в свою очередь, как недавно сообщалось, индуцирует in vitro образование мРНК IL-18BP (Muhl и соавт. 2000). Поэтому, IL-18BP мог бы служить в качестве "выключающего" сигнала, терминирующего воспалительную реакцию.IL-18BP в значительной мере гомологичен семейству белков, кодируемых у некоторых поксвирусов(Novick и соавт. 1999, Xiang and Moss 1999). Ингибирование IL-18 с помощью данного предполагаемого вирусного IL-18BP может ослаблять воспалительный противовирусный Th1-ответ. Уровень сывороточного IL-18BP существенно повышается при сепсисе, что свидетельствует о его роли в регулировании иммунных реакций in vivo (Novick и соавт. 2001). Действительно, IL-18BP в различных клетках индуцируется с помощью -IFN, и это заставляет полагать, что он служит в качестве негативного ингибитора иммунной реакции, опосредованной IL-18, по типу обратной связи (Mughl и соавт. 2000). Предварительные результаты свидетельствуют о том, что мРНК IL-18BP детектируется в лейкоцитах, клетках ободочной кишки, тонкого кишечника, предстательной железы и особенно в клетках селезенки (Novick и соавт. 1999). В состав клеток селезенки входят макрофаги, лимфоциты, а также клетки плазмы, дополненные клетками из кровотока. Активность элементов, которые контролируют транскрипцию, промотор и энхансеры, существенно варьирует у разных типов клеток. Промоторы и энхансеры состоят из коротких цепочек ДНКпоследовательностей, которые специфически взаимодействуют с клеточными белками, участвующими в транскрипции (обзор Dynan and Tjian 1985, McKnight and Tjian 1986, Sassone-Corsi and Borreli 1986 и Maniatis и соавт. 1987). Определенное сочетание разных последовательностей распознавания и определенное количество родственных факторов транскрипции определяет эффективность, с которой данный ген транскрибируется в клетке конкретного типа. Многие эукариотические промоторы содержат два типа распознающих последовательностей: ТАТА-бокс и расположенные левее элементы промотора. Предположительно, данный ТАТА-бокс, расположенный в положении апстрим на 25-30 п.н. от сайта инициации транскрипции, участвует в управлении РНК-полимеразой II, которая начинает синтез РНК в соответствующем сайте. В отличие от него, расположенные в положении апстрим промоторные элементы определяют скорость, с которой начинается транскрипция. Энхансерные элементы могут стимулировать почти 1000-кратное увеличение транскрипции с присоединенными гомологичным или гетерологичным промоторами. Вместе с тем, в отличие от промоторных элементов, расположенных в положении апстрим, энхансеры активны при размещении их в положении даунстрим от сайта инициации транскрипции или же-1 007460 на значительном расстоянии от данного промотора. Многие энхансеры клеточных генов функционируют только в определенной ткани или в клетке определенного типа (обзор Voss и соавт. 1986, Maniatis и соавт. 1987). Кроме того, некоторые энхансеры становятся активными лишь в специфических условиях,которые возникают в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла (обзор Sassone-Corsiand Borrelli 1986, а также Maniatis 1987). Из-за этой разницы в клеточной специфичности клеточных энхансеров выбор промоторных и энхансерных элементов, которые вводят в эукариотический экспрессионный вектор, определяется типом клеток, в которых экспрессируется данный рекомбинантный ген. С другой стороны, использование заранее изготовленного вектора, содержащего специфический промотор и клеточный энхансер, может несколько ограничить типы клеток, в которых можно осуществить экспрессию. Многие энхансерные элементы, полученные из вирусов, обладают более широким кругом хозяев и активны в разнообразных тканях, хотя у разных клеточных типов наблюдаются существенные количественные различия. Например, ранний энхансер вируса SV40 во многих клетках, полученных от различных видов млекопитающих, активен по-разному, и, следовательно, векторы, включающие данный энхансер,полезны для использования (Dijkema и соавт. 1985). Две другие комбинации энхансер/промотор, которые активны у широкого круга клеток, получены из длинного повтора (LTR) генома вируса саркомы Рауса(Gorman и соавт. 1982b) и из цитомегаловируса человека (Boshart и соавт. 1985). Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к ДНК-последовательности, кодирующей IL-18 ВР-промотор(SEQ ID NO:1) человека, или фрагмент, такой как SEQ ID NOS 2 или 3, или его функциональное производное, в котором 3'-конец указанной ДНК-последовательности или ее фрагмент включает один или несколько нуклеотидов из 5'-конца SEQ ID NO:5. Точнее, производное, в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой ДНК настоящего изобретения, измененную по одному или нескольким API-сайтам, представленным в элементе сайленсера, присутствующем в данной последовательности, при этом данная ДНКпоследовательность может дополнительно содержать ген, присоединенный путем сшивки к промоторуIL-18BP. В первом аспекте настоящего изобретения данный ген может кодировать, например, IL-18BP или гетерологичный белок, такой как люцифераза, бета-интерферон, TNF, эритропоэтин, тканевой активатор плазминогена, гранулоцитарный колоннестимулирующий фактор, марганец-супероксид-дисмутазу, иммуноглобулин, или его фрагмент, гормон роста, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR и белки, связывающие рецептор TNF. В настоящем изобретении представлены вектор, включающий ДНК-последовательность, последовательность, кодирующую IL-18BP-промотор человека, хозяйская клетка, включающая данный вектор,например, СНО, WISH, HepG2, Cos, CV-1, HeLA, и клетки Hakat U937, а также способ получения рекомбинантного белка, включающий культивирование соответствующей хозяйской клетки и выделение продуцируемого рекомбинантного белка. Кроме того, в настоящем изобретении представлен рекомбинантный вирусный вектор, который включает часть генома данного вируса, фрагмент ДНК, кодирующей соответствующий ген и фрагмент ДНК, включающий ДНК-последовательность, кодирующую IL-18 ВР-промотор человека. Более конкретно, часть данного вируса может, например, представлять собой аденоассоциированный вирус, а также ретровирус, такой как HIV, HFV, MLV, FIV и VSV. В настоящем изобретении разработан также способ регуляции клеточноспецифической экспрессии соответствующего гена, включающий трансдуцирование клетки-мишени млекопитающего с помощью указанного вирусного вектора настоящего изобретения в клетке-мишени, такой как гемопоэтическая стволовая клетка, а также моноцита. Соответствующий ген может, например, представлять белок, придающий резистентность к ВИЧ-инфекции. Регуляция клеточноспецифической экспрессии представляющего интерес гена может использоваться для лечения, например, ВИЧ-инфекции, нарушений кроветворения, таких как SCID, хроническое гранулематозное заболевание и талассемия. Далее, в настоящем изобретении разработан способ генной терапии для лечения заболевания индивида с повышенным синтезом -IFN в тканях тела, включающий ведение эффективного количества вирусного вектора настоящего изобретения, кроме того, необязательно включающий введение факторов IL6 и/или -TNF, либо IRF и/или С/ЕВР. В другом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным мышам, несущим ДНКпоследовательность, кодирующую ДНК-последовательность настоящего изобретения. Кроме того, в настоящем изобретении раскрыто использование ДНК-последовательности, кодирующей IL-18 ВР-промотор человека (SEQ ID NO:1), либо фрагмента или его функционального производного, где 3'-конец указанной ДНК-последовательности или ее фрагмент включает один или несколько нуклеотидов из 5'-конца SEQ ID NO:5, для производства лекарственного средства, используемого при лечении заболевания.-2 007460 В настоящем изобретении представлена также фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество ДНК-последовательности, кодирующей IL-18 ВР-промотор человека(SEQ ID NO:1), или фрагмент или его функциональное производное, в котором 3'-конец указанной ДНКпоследовательности или ее фрагмента включает один или несколько нуклеотидов из 5'-конца SEQ IDNO:5. Краткое описание фигур На фиг. 1 представлено схематическое изображение промоторной области гена IL-18BP, включающей 5 регуляторных элементов. На фиг. 2 представлены данные по кинетике индукции IL-18BP и совместной деятельности IL-18BP с -TNF и IL-6. (A) -IFN индуцирует IL-18BP в WISH-клетках человека дозозависимым способом. Клетки инкубируют с указанными концентрациями -IFN в течение 24 и 48 ч. (В) Синергическое действие TNF, IL-6 и их сочетания на IL-18BP, индуцируемого -IFN. HepG2-клетки инкубируют с указанными комбинациями -IFN (100 Ед./мл), -TNF (20 нг/мл) и IL-6 (300 Ед./мл). Индукция IL-18BP с помощью каждой комбинации оказывается существенно выше (р 0,05), чем индукция с помощью одного лишь IFN. Данные представляют собой среднююSD (n=3, для А, n=4 для В). На фиг. 3 представлено схематическое изображение консервативной структуры экзон-интрон геновIL-18BP человека и мыши. IL-18 ВРа-ген человека сравнивают с мышиным геном IL-18BPd. Экзоны указаны. Сайт инициации транскрипции, сайт инициации трансляции (ATG) , стоп-кодон (Stop) и сигнал полиаденилирования (PAS) указаны для IL-18 ВРа-гена человека. На фиг. 4 показано, что индукция IL-18BP с помощью -IFN осуществляется на транскрипционном уровне и зависит от de novo-синтеза белка. (А) полуколичественная RT-ПЦР мРНК IL-18BP из клетокHepG2, которые преинкубируют с актиномицином D (1 мкг/мл, 30 мин), промывают и инкубируют с IFN (100 Ед./мл) в течение указанного времени. RT-ПЦР мРНК -актина представлена в качестве контроля. (В) полуколичественная RT-ПЦР мРНК IL-18BP из клеток HepG2, которые преинкубируют с циклогексимидом (20 мкг/мл) и -IFN (100 Ед./мл) в течение указанного времени. На фиг. 5 показана базовая и -IFN-индуцированная активность люциферазных репортерных векторов, несущих IL-18BP-промотор человека. Размер вставки, простирающейся от сайта инициации транскрипции (+1), приведен в скобках. Цифры в кружках представляют различные элементы ответа: 1. GAS. 2. IRF-Е. 3. С/ЕВР-Е (2 участка). Сайленсер 5. Дистальный энхансер. Зачерненные прямоугольники отображают мутацию в специфическом элементе ответа. HepG2-клетки котрансфицируют с помощью указанного репортерного вектора и GAL pSV40. Все значения люциферазы стандартизуют по галактозидазной активности. (А) активность люциферазы в экстрактах неиндуцированных клеток в сравнении с клетками, трансфицированными с помощью pGL3 - Базовый вектор. (В) активность люциферазы в клетках, трансфицированных с помощью выбранных векторов и индуцированных с помощью -IFN. Кратность индукции превышает базовую активность, которая показана в (А). На фиг. 6 показано, что IRF-1 существен для экспрессии IL-18 ВР у мышей. IL-18BP сыворотки С 57 В 1/6 IRF-l-/- и контрольных С 57 В 1/6-мышей, которые инъецируют внутрибрюшинно с мышиным IFN (53000 а.е.м./мышь) . Одну часть мышей обескровливают до инъекции, а другую - через 24 ч после инъекции. Сывороточный IL-18BP определяют с помощью ИФА. Данные представлены среднейSE(n=6 в каждой группе). Различия между сывороточным IL-18BP у контрольных мышей и у дефицитных по IRF мышей, а также индукция IL-18BP у контрольных мышей является статистически значимой(р 0,05). На фиг. 7 показана роль IRF-1 и С/ЕВР и их ассоциация на индукцию гена IL-18BP. (А) анализ смещения электрофоретической подвижности (EMSA пример 18) ДНК-содержащих зондов, корреспондирующих с основаниями от -33 до -75 (IRF-E, левая панель) и от -8 до -55 (GAS, правая панель). НерG2 клетки обрабатывают с помощью -IFN в указанное время, и ядерным экстрактам дают возможность взаимодействовать с зондами IRF-E или GAS. Смещение полос указано зачерненными стрелками. GASкомплекс также подвержен сильному смещению указанными антителами. Сильно смещенная полоса указана светлой стрелкой. (В) полуколичественная RT-ПЦР мРНК IL-18BP из НерG2-клеток, которые трансфицируют указанными сочетаниями экспрессионных векторов IRF-1 или С/ЕВР. Там, где указано,добавляют -IFN и клетки собирают через 5 ч. Значения стандартизуют по мРНК -актина. (С) активность люциферазы в клетках, трансфицированных люциферазным репортерным вектором pGL3(1272),содержащим полный IL-18 ВР-промотор, вместе с указанной концентрацией pCDNA3-IRF-l (кружки) и 1 мкг/106 клеток с pCDNA3-С/ЕВР. В качестве альтернативы, клетки трансфицируют указанной концентрацией pCDNA3-С/ЕВР (прямоугольники) и 0,1 мкг/106 клеток pCDNA3-IRF-1. Активность люциферазы стандартизуют по -Gal-активности. (D) иммуноблоты ядерного и цитоплазматического экстрактов(см. пример 17 по получению экстрактов) клеток, обработанных с помощью -IFN (100 Ед./мл, 2 ч). Экстракты иммунопреципитируют (IP) и иммуноблотируют указанными антителами. На фиг. 8 показано связывание данных факторов с IL-18BP-промотором после -IFN-индукции (A)EMSA с помощью проксимального С/ЕВР Е и цельных экстрактов после обработки с помощью -IFN.-3 007460 Показано, что данные экстракты сильно смещены указанными антителами. (В) EMSA с помощью зонда,корреспондирующего с дистальным энхансером, и экстрактов цельных клеток после обработки с помощью -IFN. Показано, что клеточные экстракты сильно смещены указанными антителами, с или без конкуренции с помощью dsДНК, корреспондирующей с проксимальной половиной данного зонда. Смещенные полосы указаны зачерненными стрелками, а сильно сдвинутая полоса указана светлыми стрелками. Подробное описание настоящего изобретения Настоящее изобретение относится к IL-18 ВР-промотору человека. Данный промотор приводит в действие конститутивную экспрессию IL-18BP в конкретных клетках, например в моноцитах, a -IFN опосредует индукцию экспрессии IL-18BP во многих клетках. IL-18 ВР-промотор человека способен управлять конститутивной и -IFN-индуцируемой экспрессией гетерологичного белка. Настоящее изобретение относится к ДНК-последовательности, кодирующей IL-18 ВР-промотор человека (SEQ ID NO:1), или фрагменту, или к его функциональному производному, где 3'-конец указанной ДНК-последовательности или ее фрагмент включает один или несколько нуклеотидов 5'-конца SEQID NO:5. мРНК IL-18BP детектируется в лейкоцитах, клетках ободочной кишки, тонкого кишечника, предстательной железы и, преимущественно, в клетках селезенки (Novick и соавт. 1999). В одном из нижеприведенных примеров показано, что IL-18-белок конститутивно экспрессируется в моноцитах. Установлено, что экспрессия IL-18BP индуцируется с помощью -IFN не только в моноцитах, но также и во многих других клетках, и что данная индукция может усиливаться при добавлении IL-6 и TNF. Установлено, что синтез белка de novo существен для активации IL-18 ВР-гена с помощью -IFN. Сайт инициации транскрипции мРНК IL-18BP детерминируется с помощью 5'-RACE. Обнаружено, что 3'-конец мРНК белка типа "цинкового пальца" располагается в положении апстрим по отношению IL-18BP-гена, лимитируя, таким образом, потенциал расположенной левее регуляторной последовательности IL-18BPa до 1601 оснований, расположенных в положении апстрим от основания 1. В данной области (протянувшейся от проксимального места транскрипции до дистального места транскрипции) идентифицируется шесть регуляторных элементов (фиг. 1): 1-гамма-активированные последовательности (GAS) с основаниями от -24 до -32; 2- IRF-1,2-элемент ответа (IRF-E), включающий основания от 57 до -69; 3- и 4- два С/ЕВР-элемента ответа с основаниями от -309 до -322 и от -621 до - 634; 5 - сайленсер с остатками от -625 до -1106; и 6 - энхансерный элемент, охватывающий основания от -1106 до -1272. Ряд люциферазных репортерных векторов с постепенным укорочением по 5'-концу фрагмента из 1601 п.н. тестировали в НерG2-клетках (линия клеток эпителиомы печени человека). Область размером 1272 п.н., представленная SEQ ID NO:1, управляет базисной экспрессией, наблюдаемой в некоторых тканях и типах клеток, и индукцией с помощью -IFN. Тестирование промоторной активности при последовательном укорочении ДНК-фрагментов в данной области показывает, что ДНК-фрагмент из 122 п.н., проксимальный по отношению к сайту инициации транскрипции, представленный SEQ ID NO:3, включает минимальный промотор. Данный минимальный промотор также является индуцируемым. Однако другие регуляторные последовательности, расположенные слева от этого минимального промотора, не способствуют увеличению индукции. Установлено, что ДНК-фрагмент размером 635 п.н., содержащий помимо элементов IRF-1 иGAS два элемента С/ЕВР, представленные SEQ ID NO:2, обеспечивает максимальную индукцию экспрессии люциферазы с помощью -IFN.In-vivo эксперименты, осуществленные на дефицитных по IRF-1 мышах, подтверждают значениеIRF-1 в качестве посредника базисной, а также и -IFN-индуцированной экспрессии IL-18BP. Установлено, что при -IFN-индукции индуцируется экспрессия IRF-1-фактора и данный фактор образует комплекс с С/ЕВР, который конститутивно присутствует в данных клетках. Данный комплекс связан с проксимальным промоторным GAS-элементом и с его смежным промоторным IRF-Eэлементом. Установлено, что энхансер, присутствующий на дистальном сайте инициации транскрипции, взаимодействует с базальным промотором через IRF-1. Настоящее изобретение относится к IL-18 ВР-промотору SEQ ID NO:1, или к ее фрагменту, а также к способам регуляции генной экспрессии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделяемым ДНК-последовательностям IL-18BP, 1272 п.н. (SEQ ID NO:1) или к ее фрагменту, такому как из 635 п.н. (SEQ ID NO:2) и из 122 п.н. (SEQ ID NO:3), которые способны управлять генной экспрессией. Данную область IL-18 ВР-промотора клонируют и секвенируют, и корреспондируют с нуклеотидами последовательности размером 1272 п.н., в положении апстрим от сайта инициации транскрипции IL18BP (SEQ ID NO:1). Настоящее изобретение включает полный IL-18 ВР-промотор (SEQ ID NO:1), а также ДНКпоследовательности, включающие его фрагмент (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3), способные управлять генной транскрипцией, и, следовательно, одновременно управлять генной экспрессией, и могут использоваться с другими частями IL-18BP-промоторной области или, альтернативно, с гетерологичными промо-4 007460 торами или гетерологичными промоторными элементами, чтобы контролировать генную транскрипцию. Данный промотор или его фрагмент способен индуцироваться с помощью -IFN. Такая индукция может быть также усилена в результате сверхэкспрессии IRF-1 и/или С/ЕВР, и/или в результате IL-6- и/или TNF-обработки. Функциональные производные промотора, представленные SEQ ID NO:1, или его фрагмент, такой как SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, являются мутантами, в которых 1-10, предпочтительно 1-5, более предпочтительно 1 нуклеотид замещен другим, или делетирован, и который способен управлять генной экспрессией и IFN-индукцией. ДНК-последовательности настоящего изобретения, включающие IL-18 ВР-промотор (SEQ ID NO:1) или его фрагмент, такой как SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, можно выделить с использованием разных способов, известных в данной области техники. По меньшей мере, можно использовать три альтернативных основных способа:(1) выделение ДНК-последовательности из геномной ДНК, которая содержит данную последовательность; (2) химический синтез данной ДНК-последовательности; и (3) синтез данной ДНКпоследовательности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В первом методе геномную ДНК-библиотеку человека можно скринировать для того, чтобы идентифицировать ДНК-последовательность, включающую IL-18 ВР-промотор или элемент IL-18 ВРпромотора. Во втором методе ДНК-последовательность, включающую IL-18 ВР-промотор или элемент IL-18 ВРпромотора, можно синтезировать химически. Например, ДНК-последовательность, включающую IL18 ВР-промоторную область или IL-18 ВР-промотор, можно синтезировать в виде набора олигонуклеотидов по 100 оснований, которые затем последовательно лигируют (с помощью надлежащих терминальных сайтов рестрикции) так, чтобы образовать правильную линейную последовательность нуклеотидов. В третьем методе ДНК-последовательность, включающую IL-18 ВР-промоторную область или IL18 ВР-промотор, можно синтезировать с использованием ПЦР. Вкратце, пары синтетических ДНКолигонуклеотидов, по меньшей мере, длиной 15 оснований (ПЦР-праймеры), которые гибридизуют с противолежащими цепями целевой ДНК-последовательности, можно использовать для ферментативно амплифицируемого встроенного участка ДНК в данной целевой последовательности. Повторяемые циклы тепловой денатурации данной матрицы, отжиг праймеров и удлинение 3'-концов отожженных праймеров с помощью ДНК-полимеразы приводит к амплификации данного сегмента, определяемого 5'концами данных ПЦР-праймеров. См. патенты США 4683195 и 4683202. Было показано, что IL-18 ВР-промотор настоящего изобретения способен обеспечивать базисную экспрессию, а также индуцируемую экспрессию с помощью -IFN гетерологичного гена. Таким образом,промотор IL-18BP обладает и базисной, и индуцируемой активностью. Несмотря на то, что нуклеотидная последовательность данного промотора, представленная SEQ IDNO:1 или его фрагментами, обладает промоторными активностями и в настоящем описании сделана ссылка на такую последовательность, считается, что можно создать нуклеотидные производные, которые не влияют на промоторную функцию или на функцию промоторного элемента. Такие модифицированные нуклеотидные последовательности можно получить с использованием различных способов, известных в данной области техники, например, с помощью мутирующей нуклеотидной последовательности с тем, чтобы данная мутация привела к делеции, заменяемой вставке, инверсии или к добавке одного или нескольких нуклеотидов. Например, можно использовать методы сайт-направленного мутагенеза, описанные Taylor J.W. и соавт., Nucl. Acids Res. 13, 8749-8764 (1985) и Kunkel J.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 482-492 (1985). Кроме того, у поставщиков можно закупить наборы для сайт-направленного мутагенеза. К примеру, набор для осуществления сайт-направленного мутагенеза можно приобрести у Amersham Corp. (Arlington Heights, Ill.). В настоящем изобретении рассматривается ДНК, содержащая последовательности, идентичные, соответственно, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, при условии,что данная промоторная активность сохраняется и/или усиливается по меньшей мере на 50% и предпочтительно на 75%, и более предпочтительно на 90%. Одно такое производное, например в виде SEQ IDNO:1, представляет собой производное, которое мутирует по одному или по всем трем API-сайтам, присутствующим в сайленсерной области. Данная нуклеотидная последовательность, включающая IL-18 ВР-промотор, его фрагмент и/или его производное, может быть присоединена путем сшивки к кодирующей области любого представляющего интерес гена, чтобы экспрессировать этот ген в соответствующей хозяйской клетке. Под сшивкой подразумевается присоединение путем сшивки промотора и элементов. Для экспрессии соответствующего гена предпочтительно, чтобы к данному интересующему гену присоединить путем сшивки полный IL18 ВР-промотор в виде SEQ ID NO:1 или его фрагмент, такой как SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, или его производное. Как показано ниже в разделе с примерами, IL-18 ВР-промотор, или его фрагмент, такой как фрагмент в виде SEQ ID NO:2 или в виде SEQ ID NO:3, способен управлять экспрессией гетерологичных генов. Рассматривается также экспрессия гомологичных генов под промотором настоящего изобретения.-5 007460 Данный промотор может дополнительно содержать интрон, например первый интрон в IL-18BP."Присоединенный путем сшивки" IL-18 ВР-промотор или промоторный элемент должен управлять транскрипцией молекулы нуклеиновой кислоты, входящей в соответствующую открытую рамку считывания. Что касается гетерологичных промоторов, то промоторы и промоторные элементы настоящего изобретения присоединяют путем сшивки в том случае, если они контролируют функцию таких гетерологичных промоторов. Как указано выше, IL-18 ВР-промотор настоящего изобретения, его фрагмент и его производные последовательности можно использовать для экспрессии любого представляющего интерес гена. Как правило, для этой цели используют экспрессионный вектор. Поэтому настоящее изобретение описывает также экспрессионные векторы, включающие выделяемую ДНК-последовательность, способную управлять экспрессией гена, которая содержит IL-18 ВР-промотор или ее фрагмент, или ее производное. Данные экспрессионные векторы предпочтительно содержат IL-18 ВР-промотор, его фрагмент, или его производное, обладающие нуклеотидной последовательностью, подобной, соответственно, SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, или ее фрагментами и/или ее производными. Предпочтительны также экспрессионные векторы, включающие гомологичный или гетерологичный ген, присоединенный путем сшивки к IL-18BP-промотору, или к его фрагменту и/или к его производному, к модифицированной его нуклеотидной последовательности. В настоящем изобретении экспрессионные векторы часто эффективны в виде "плазмид" (векторная форма), которые относятся к кольцевым двухцепочечным ДНК и не связаны с определенной хромосомой. Однако настоящее изобретение предполагает включение также иных форм экспрессионных векторов, которые обладают эквивалентными функциями и которые после этого станут известны в данной области техники. Экспрессионные векторы, примененные в настоящем изобретении, как правило, содержат ориджин репликации, IL-18BP-промотор, расположенный спереди (т.е. в положении апстрим) соответствующего гена, последовательности терминации транскрипции, и остальной вектор. Данные экспрессионные векторы могут также включать иные ДНК-последовательности, известные в данной области техники, например стабилизирующие лидерные последовательности, которые обеспечивают стабильность данного продукта экспрессии, секреторные лидерные последовательности, которые обеспечивают секрецию данного продукта экспрессии, последовательности, которые делают возможной экспрессию модулируемого структурного гена (например, благодаря наличию или отсутствию питательных веществ или других индукторов в данной ростовой среде), маркирующие последовательности, которые способны обеспечить отбор по фенотипу в трансформированных хозяйских клетках, а также последовательности, которые создают сайты для расщепления эндонуклеазами рестрикции. Характеристики реально действующего используемого экспрессионного вектора должны быть совместимы с данной используемой клеткойхозяином. Рассматриваемый в настоящем изобретении экспрессионный вектор, по меньшей мере, способен управлять транскрипцией, а предпочтительно и экспрессией соответствующего гена, определяемого промоторной областью IL-18BP или IL-18BP-промотором или его модифицированной нуклеотидной последовательностью. Подходящие ориджины репликации включают, например, ориджин из вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40). Подходящие последовательности терминации включают, например, последовательность из вакуолизирующего обезьяньего вируса (SV40). Промотор настоящего изобретения можно использовать для экспрессии фактически любого представляющего интерес гена, например генов, кодирующих терапевтические продукты, такие как бета-интерферон, TNF, эритропоэтин,тканевой активатор плазминогена, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, марганецсупероксид-дисмутаза, иммуноглобулин, или его фрагмент, гормон роста, hsLDLR, FSH, hCG, IL-18,белки, связывающие рецептор TNF, и белки, связывающие IL-18. Все эти вещества известны в данной области техники и многие коммерчески доступны. Подходящие экспрессионные векторы, содержащие требуемые кодирующую и контрольную последовательности, можно сконструировать с использованием известных в данной области техники стандартных методов рекомбинантных ДНК, многие из которых описаны Sambrook, и соавт., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Кроме того, в настоящем изобретении рассматриваются хозяйские клетки, содержащие экспрессионный вектор, включающий выделяемую ДНК-последовательность, способный управлять экспрессиейгена, который включает IL-18BP-промоторную область, или IL-18BP-промотор, или его модифицированную нуклеотидную последовательность. Предпочтительно, IL-18BP-промоторная область обладает нуклеотидной последовательностью, соответствующей из 1272 п.н. последовательности в положении апстрим (т.е. слева) от сайта инициации транскрипции IL-18BP, представленной SEQ ID NO:1, или ее фрагментом, таким как нуклеотидная последовательность, соответствующая 635 п.н. последовательности слева от сайта инициации транскрипции, представленной SEQ ID NO:2, или ее фрагментом, таким как нуклеотидная последовательность из 122 п.н. слева от сайта инициации транскрипции, представленнойSEQ ID NO:3. Предпочтительны также хозяйские клетки, содержащие экспрессионный вектор, дополнительно включающий гомологичный или гетерологичный ген, присоединенный путем сшивки к IL-18BP-6 007460 промоторной области или к IL-18BP, представленными SEQ ID NO:1 или ее фрагментом. Подходящие хозяйские клетки включают, например, HeLa-клетки человека или клетки CV-1 и COS-1 африканской зеленой мартышки, клетки СНО, HepG2, WISH-клетки, Hakat U937 и так далее. Предпочтительны хозяйские клетки, содержащие рецепторы для -IFN, что делает возможной индукцию IL-18 ВР-промотора и тем самым усиливая экспрессию представляющего интерес гена. Экспрессионные векторы можно вводить в хозяйские клетки разнообразными способами, известными в данной области техники. Например, трансфекцию хозяйских клеток экспрессионными векторами можно осуществить с помощью метода кальций-фосфатного осаждения. Впрочем, можно также использовать и другие способы введения экспрессионных векторов в хозяйские клетки, например электропорацию, слияние в результате баллистической трансфекции, липосомное слияние, ядерную инъекцию, и можно также использовать инфицирование вирусом или фагом. После того, как экспрессионный вектор введен в соответствующую хозяйскую клетку, данную хозяйскую клетку можно культивировать и затем выделить представляющий интерес полипептид, кодируемый данным геном. В качестве альтернативы, после того, как экспрессионный вектор был введен в подходящую хозяйскую клетку, данную клетку можно культивировать, и по достижении требуемой плотности клеток последние можно стимулировать с помощью -IFN, а затем выделить полипептид, кодируемый соответствующим геном. Хозяйские клетки, содержащие экспрессионный вектор, который содержит ДНКпоследовательность, кодирующую соответствующий ген, можно идентифицировать с использованием разнообразных способов, известных в данной области техники. Например, можно использовать ДНКДНК-гибридизацию, определяя наличие или отсутствие функций маркерного гена, определяя уровень транскрипции, который измеряют по образованию мРНК-транскриптов соответствующего гена в данной хозяйской клетке, и иммунологическое детектирование генного продукта. ДНК-последовательности экспрессионных векторов, плазмид или ДНК-молекул настоящего изобретения можно определить разнообразными методами, известными в данной области техники. Например, можно использовать дидезоксицепочечно-терминирующий метод, который описан Sanger и соавт.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977), или метод Максама-Гилберта, который описан в Proc.Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977). Следует иметь в виду, что можно идентифицировать специфические нуклеотиды или области в IL18 ВР-промоторе, которые необходимы для регуляции. Данные области или нуклеотиды могут быть локализованы в результате тонкого структурного анализа данных элементов и могут быть изучены в экспериментах, в которых анализируют функциональную способность промоторных мутантов. Например, точечные мутации в промоторных элементах или последовательные делеции, как таковые используемые в нижеприведенном разделе с примерами, можно создать с использованием ПЦР. Этим способом амплифицируют ряд мутантных промоторных областей или делеционных конструкций, после чего клонируют обратно в репортерные конструкции и оценивают с помощью методов трансфекции и люциферазного анализа (представлено ниже в разделе с примерами). Данные амплифицированные фрагменты можно клонировать обратно в случае IL-18 ВР-промотора, а также в гетерологичные промоторные конструкции. Этим способом точно идентифицируют нуклеотидные последовательности, которые существенны для управления генной транскрипцией. Данным анализом идентифицируют также нуклеотидные изменения, которые не влияют на промоторную функцию, или же которые могут повысить промоторную функцию. Поэтому, можно также сконструировать функциональные промоторные производные и промоторные элементы. Функциональный анализ данной промоторной области или промотора можно облегчить благодаря исследованиям по футпринту и смещению в геле. Знание точных пар оснований, существенное для опосредованного связывания белков, предоставляют экспериментальные данные, которые важны для опосредования транскрипционного ответа. Поэтому настоящее изобретение включает также пары оснований, существенные для взаимодействия ДНК-белок. Такие пары оснований можно выяснить. Геномные фрагменты, содержащие представляющие интерес области, можно использовать в in vitro-экспериментах по футпринтингу [Galas и соавт.,Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981)]. Выделяемый фрагмент рестрикции метят радиоактивной меткой и затем инкубируют с ядерными экстрактами, полученными с помощью традиционных методов из клеток, предположительно содержащих ДНК-связывающие белки, которые и должны связаться с данным фрагментом [например, Dingman и соавт., Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983)]. Меченые ДНКфрагменты инкубируют с ядерными экстрактами, обработанными ДНКазой I, и подвергают электрофорезу в денатурирующем полиакриламидном геле. ДНК-связывающие белки в данном клеточном экстракте связываются с узнающей их последовательностью, содержащейся в данном радиоактивно меченном рестрикционном фрагменте, и защищают ДНК от расщепления ДНКазой. Области защиты ограничивают данный сайт связывания. Тесты по установлению первичной структуры ДНК данного фрагмента по Максаму и Гилберту можно применять в качестве индикатора для выявления нуклеотидов, защищенных от действия ДНКазы.-7 007460 Далее в настоящем изобретении также идентифицируются и характеризуются трансдействующие факторы, которые взаимодействуют с данным промотором или промоторными элементами. Цисдействующие регуляторные последовательности служат в качестве сайтов связывания белков, которые называют трансдействующими факторами (TAF) [Dynan W.S., Tjian T. Nature 316, 774-778 (1985); Maniatis Т. и соавт., Science 236, 1237-1245 (1987)]. Предполагается, что каждый ген связывает один или несколько белков по каждой своей регуляторной последовательности, и эти белки взаимодействуют друг с другом и с РНК-полимеразой II таким образом, чтобы контролировать транскрипцию.TAFs были идентифицированы в ядерных экстрактах по их способности связывать и замедлять электрофоретическую подвижность ДНК-фрагментов цис-действующей последовательностью [DingmanJ.D. и соавт., Nucleic Acids Res. 11. 1475-1489 (1983); Dynan W., Cell 58, 1-4 (1989); Fletcher С. и соавт.,Cell 773-781 (1987); Scheidereit С. и соавт., Cell 51, 783-793 (1987)]. Цис-действующие последовательности пригодны для метода задержки в геле, чтобы определить связывающую активность ядерных экстрактов. Способ осуществления анализов по смещению в геле описан в литературе и включает многие из тех же реагентов, которые используют в экспериментах по футпринту [Pried M. и соавт., Nucleic Acids Res. 9,6505-6525 (1981); Revzin A., Biotechniques 7, 346-355 (1989); Strauss F.A. и соавт., Cell 37, 889-901 91984)]. Фрагменты рестрикции, меченные Р 32, или отожженные пары комплементарных олигонуклеотидов инкубируют с ядерными экстрактами и поли-d(I-С) в буфере для связывания, и продукты данной реакции подвергают электрофорезу в неденатурирующем полиакриламидном геле. Положение данного ДНК-фрагмента в геле, определяемого с помощью радиоавтографии, замедляется в случаях, когда белок связался с данной ДНК. Степень замедления является функцией, соответствующей размеру данного белка. Идентифицированные таким образом связывающиеся белки можно впоследствии выделить очисткой и одновременно клонировать с использованием известных методов.IL-18 ВР-промотор находит также применение в трансгенных исследованиях. Трансгенные мыши являются действенной генетической моделью для изучения ряда заболеваний человека, в том числе и злокачественных опухолей. Они также предоставляют очень ценный in vivo-способ изучения генной регуляции, что подтверждается и обширными наблюдениями, сделанными в экспериментах по трансфекции репортерного гена (например, люциферазного) [Palmiter F.L. и соавт., Ann. Rev. Genet. 20, 465-499(1986)]. Исследования, направленные на анализ сигналов, учитывающих зависимость в ходе развития генной экспрессии, можно иногда осуществлять в моделях клеточной культуры, но, по-видимому, лучше изучать в трансгенной модели. Данный вид эксперимента возможен вследствие поразительного консерватизма у видов регуляторных последовательностей, так что с помощью мышиного транскрипционного механизма безошибочно интерпретируются регуляторные сигналы человека. Поэтому конструкции, экспрессируемые у трансгенных мышей, могли бы давать больше информации о регуляции IL-18 ВР-гена. Трансгенных мышей можно создавать способами, известными в данной области техники. Наиболее широко используемый способ, с помощью которого создают трансгенных животных, включает инъекцию ДНК-молекулы в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки [Brinster и соавт., Cell 27, 223(1976)]. После инъекции ДНК-молекулы в оплодотворенную яйцеклетку, данную клетку имплантируют в матку реципиентной самки и дают возможность развиваться в организме животного. Поэтому все клетки организма такого животного содержат введенную генную последовательность. Полученных трансгенных мышей или основателей можно скрестить, а их потомство проанализировать для получения линий, созданных от этих основателей, которые экспрессируют данный трансген. У трансгенных животных можно обследовать множество тканей и наблюдать генную экспрессию. Исследования РНК в разных мышиных линиях позволяют оценить независимость сайта интеграции для уровней экспрессии данного трансгена (См. Hogan В. и соавт., Manipulating the mouse embryo: a laboratoryIL-18 ВР-промотор и промоторные элементы помогут также обеспечить полезные средства для осуществления генной терапии."Генная терапия" представляет собой введение генетического материала для модификации или управления экспрессией генного продукта, который изменяет биологические свойства живых клеток при терапевтическом использовании. Данные клетки могут быть аллогенными или аутологичными. Клетки можно модифицировать exvivo для последующего введения пациенту или изменить in vivo генотерапевтическими продуктами, непосредственно вводимыми данному пациенту. Большей частью, конструкции, включающие IL-18 ВР-промотор или его фрагмент и/или его производное, следует использовать для экспрессии гена-мишени в тех клетках, где IL-18 ВР-ген экспрессируется нормально, например, в моноядерных клетках. Можно применять любые способы, доступные в данной области техники, для переноса конструкций в организм животных, в том числе и в организм челове-8 007460 ка. Они включают вирусные векторы, в частности, ретровирусные векторы (см., например, Zweibel и соавт., Science 243, 220 (1989), и приведенные там ссылки), а также другие способы. Было показано, что рекомбинантные AAV-векторы весьма перспективны для терапевтической генной доставки в печень и в скелетную мышцу (Snyder и соавт. 1997, Murphy и соавт. 1997, Song и соавт. 1998, Snyder и соавт. 1999, Herzog и соавт. 1997). Мыши, выведенные после разрушения гена фактора IX свертывания, демонстрируют сильное кровотечение, чем очень напоминают фенотип пациентов с гемофилией В. Сообщается (Wang и соавт. 1999), что единичная инъекция в воротную вену рекомбинантного адено-ассоциированного вирусного (AAV) вектора, кодирующего кДНК фактора IX собак под контролем специфичного для печени энхансер/промотора, приводит к пролонгированной и полной коррекции болезненного кровотечения. Ретровирусные векторы, получаемые из онкоретровируса, такого как вирус лейкоза мышей (MVL),представляли собой наиболее широко используемые векторы для генного переноса, так как геном данного вектора интегрируется в хромосомы клеток-мишеней, приводя к стабильной экспрессии трансгенов(I.M.Verma and N.Somia, Nature 389, 239 (1997), тем не менее данные векторы доказали свою пригодность для делящихся клеток. Лентивирусные векторы, такие как ВИЧ-векторы, постоянно используются для неделящихся клеток (Mioshi и соавт. Science 1999, 283:682-686). Способность лентивирусов заражать неделящиеся клетки, такие как макрофаги, делают их перспективными кандидатами для использования в качестве инструментов генного переноса. ВИЧ-векторы облегчают трансдукцию покоящихся гемопоэтических стволовых клеток человека (HSCs). Гемопоэтические стволовые клетки человека (HCS) являются привлекательной мишенью для генной терапии наследственных гемопоэтических нарушений, а также других приобретенных заболеваний,поскольку данные клетки обладают способностью полностью регенерировать гемопоэтическую систему. К примеру, гемопоэтические стволовые клетки могут регенерировать моноцитарные клетки, которые,как известно, вовлечены в патогенез иммунодефицита, связанного с вирусом-1 (ВИЧ-1). Несмотря на более чем 15-летние исследования в области генной терапии с использованием гемопоэтических стволовых клеток, сохраняется главное препятствие, связанное с неспособностью эффективно и стабильно встраивать гены в эти клетки. Ретровирусные векторы на основе вируса лейкоза мышей Молони (MLV) используют наиболее широко, но частота генного переноса в плюрипотентные HSC человека сравнительно низкая, а генная экспрессия часто неудовлетворительна. В последнее время предприняты попытки по генетической модификации гемопоэтических стволовых клеток с помощью генов, ингибирующих репликацию ВИЧ-1, для создания моноцитов, резистентных к заражению ВИЧ-1 (Kohn и соавт. 1999). Теоретически, встраивание гена, способного придать резистентность к ВИЧ-1, в гемопоэтические стволовые клетки должно было бы привести к тому, что искомый ген оказался бы представленным в потомстве зрелых моноцитов и других клеток, восприимчивых к ВИЧ-1. Таким образом, использование промотора, который активен в моноцитарных клетках, такого как IL18-промотор, или его фрагмента, является преимуществом для генной терапии ВИЧ-1. Генная терапия большинства генетических заболеваний крови (например, SCID, хронический гранулематоз, талассемия и так далее) нуждаются в генном переносе ex vivo в трансплантируемые самовозобновляющиеся HSC и в регуляции трансгенной экспрессии в одной или в нескольких клеточных линиях. Коррекция нарушений, влияющих на специфическое потомство HSC (например, гемоглобинопатии или талассемии, ВИЧ-1-инфекция), требует специфическим образом ограничить экспрессию терапевтического гена в клеточной линии (Lotti и соавт. 2002). В этих случаях транскрипционное позиционирование переносимого гена является обязательным. Генная экспрессия в разных типах клеток зависит от относительной длины используемого промотора. Несмотря на это, большинство осуществляемых доклинических исследований до сих пор опиралось на использование вирусных, конститутивных промоторов,которые приводят в действие трансгенную экспрессию. Например, в ВИЧ-1-векторе используют внутренний CMV-промотор и мышиный CMV-промотор мышиного ретровирусного векторного LTR. Подходящая трансгенная регуляция в структуре ретровирусного вектора является трудной задачей из-за транскрипционного взаимовлияния между длинным концевым повтором вируса (LTR) и внутренним энхансер-промотором, и генетической нестабильностью комплексных регуляторных последовательностей. В настоящем изобретении IL-18 ВР-промотор, который, как известно, запускает транскрипцию в моноядерных клетках, используется для запуска трансгенной экспрессии в HSCs, предшественнике таких моноядерных клеток. Генетическая модификация гемопоэтических стволовых клеток с помощью "анти-ВИЧ-генов" могла бы привести к получению лимфоцитов и моноцитов, резистентных к ВИЧ-инфекции после трансплантации. У пациентов, инфицированных ВИЧ-1, можно извлечь HSC, выделить СD34+-клетки, трансдуцировать in vitro с помощью ретровирусного вектора, несущего ингибирующий ВИЧ-1 белок под контролем IL-18 ВР-промотора (вместо ретровирусного промотора), и данные клетки вновь ввести этим же пациентам (Kohn и соавт. 1999). Наиболее обычным источником HSC являются гемопоэтические стволовые клетки периферической крови (PBSC), которые в значительной мере замещают костный мозг в условиях аутологичной транс-9 007460 плантации (Gale и соавт. 1992 и Kessinger и соавт. 1991). PBSC мобилизуют из костного мозга в периферическое кровообращение путем введения факторов, таких как G-CSF или GM-CSF в течение 3-5 дней, и затем собирают с помощью лейкафереза. В нескольких исследованиях было показано, что приживление трансплантата происходит быстрее при трансплантации стволовых клеток периферической крови, а не костного мозга (Henon и соавт. 1992 и Chao и соавт. 1993). Клоногенные клетки-предшественники, содержащиеся в G-CSF-мобилизованных PBSC, весьма восприимчивы к ретровирус-опосредованному генному переносу, несмотря на то, что скорость трансдукции продолжительно воссоздающихся стволовых клеток в PBSC не лучше, чем в костном мозге (Breni и соавт. 1992, Cassel и соавт. 1993, Dunbar и соавт. 1995). Было показано, что ВИЧ-1-инфицированные пациенты могут успешно мобилизовать и накапливать G-CSF-мобилизованные PBSC без какого-либо увеличения уровня эндогенного ВИЧ-1, по меньшей мере, на протяжении ранних стадий заболевания (Junker и соавт. 1997 и Slobod и соавт. 1996). Другим источником гемопоэтических стволовых клеток является пуповинная кровь (UCB) , которая, как установлено, восприимчива к ретровирусной трансдукции гораздо сильнее, чем клетки костного мозга (Moritz и соавт. 1993 и Нао и соавт. 1995) . Использование HSC из USB могло бы быть особенно благоприятным для ВИЧ-1-инфицированных новорожденных. Так как трансмиссия является по большей части перинатальной, пуповинная кровь должна содержать нормальное количество и функцию гемопоэтических стволовых клеток, которых может быть меньше в костном мозге ВИЧ-1-инфицированного ребенка и взрослых (Kearns и соавт. 1997). Создано большое число синтетических генов, которые могут супрессировать ВИЧ-1-репликацию("анти-ВИЧ-1-гены"), включающих: антисмысловые, рибозимные, доминантно-негативные мутанты (например, RevM10), РНК-ловушки, внеклеточные антитела для предотвращения экспрессии вирусных белков или клеточных корецепторов, и так далее (Veres и соавт. 1996, Zhou и соавт. 1994, Couture и соавт. 1996, Malim и соавт. 1989, Bahner и соавт. 1993 и Sullenger и соавт. 1990, Lee и соавт. 1994, Marasco и соавт. 1997 и Chen и соавт. 1997). Во многих случаях было показано, что анти-ВИЧ-1-гены в модельных системах способны существенно супрессировать репликацию ВИЧ-1, а в некоторых случаях даже ограничивать вхождение вируса в клетки (36, 39-44) . Если бы оказалось, что у 100% пациентов HSC и получающиеся в результате моноцитарные клетки неспособны существенным образом поддержать репликацию ВИЧ-1, то это, по-видимому, привело бы к уменьшение вирусной нагрузки. Теоретически, потребовалось бы активное ингибирование репликации ВИЧ-1 у 99,9% восприимчивых клеток, чтобы получить 3-кратное log-снижение вирусной нагрузки, то есть результата, часто достигаемого с помощью высокоэффективной противовирусной терапии. Впрочем, при ограниченных возможностях эффективного преобразования большого процента гемопоэтических стволовых клеток человека в настоящее время невозможно защитить большинство восприимчивых клеток. Альтернативный механизм эффективности основывается на возможности, при которой созданные клетки, неспособные поддерживать активную репликацию ВИЧ-1, могут быть защищены от индуцированной вирусом цитопатичности и, таким образом, по сравнению с незащищенными клетками обладать селективной жизнеспособностью, преимуществом. В этом случае ограниченное количество защищенных клеток может включать увеличенную долю всех моноцитов, что приводит к некоторому сохранению иммунной функции. Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим фармацевтически приемлемый носитель, а также включающим вирусную последовательность настоящего изобретения, соответствующую IL-18 ВР-промоторной области или с промотором, оперативно связанными с соответствующим геном, кодирующим соответствующее лекарственное средство. Данные композиции могут использоваться предпочтительно для связывания лекарственного средства с тканями, в которых повышен уровень -IFN. Теперь, располагая описанным настоящим изобретением, его легче понять путем ссылки на нижеследующие примеры, которые представлены в качестве иллюстрации и не предназначаются для ограничения настоящего изобретения. Примеры Пример 1. Базисный уровень экспрессия IL-18BP в моноцитах. мРНК IL-18BP детектируют в лейкоцитах, клетках ободочной кишки, тонкого кишечника, предстательной железы и особенно в клетках селезенки (Novick и соавт. 1999). Клетки селезенки состоят из макрофагов, лимфоцитов, и плазматических клеток, дополненных клетками, полученными из кровотока. Для того чтобы определить экспрессию IL-18 ВР-белка в клетках, применяют специальный метод ИФА (пример 12). Установлено, что моноядерные клетки периферической крови человека конститутивно продуцируют IL-18BP (0,7-1,5 нг/мл). Клетки U937, клеточная линия, происходящая из клеток злокачественной опухоли, получают из плеврального выпота от пациента с ретикулоклеточной саркомой, не экспрессирующей какой-либо IL-18BP. Клетки U937 можно индуцировать до терминальной моноцитарной дифференциации путем обработки с помощью форболовых эфиров. Базисный уровень экспрессииIL-18BP в 0,70,01 нг/мл детектируют только после дифференциации данных клеток в макрофагоподобные клетки путем стимуляции с помощью ТРА (10 нг/мл). Данные результаты свидетельствуют о том,что IL-18BP конститутивно продуцируется в моноцитах и макрофагах.- 10007460 Пример 2. Индукция экспрессии IL-18BP в разных клетках. Ранее сообщали, что -IFN индуцирует мРНК и белок IL-18BP в разных клеточных линиях, таких как кератиноцитная клеточная линия, клеточная линия карциномы ободочной кишки и первичные почечные мезангиальные клетки (Muhl и соавт. 2000). Индукцию IL-18BP изучают в разных клеточных линиях человека, а также в моноядерных клетках (РВМС) периферической крови с помощью -IFN и других цитокинов. -IFN индуцирует экспрессию IL-18BP (см. пример 11 по мониторингу мРНК и пример 12 по ИФА) дозозависимым образом, обнаруживая ЕС 50 в 50 Ед./мл для WISH- и НерG2-клеток (фиг. 2 А и В). IL-18BP явно накапливается в культуральных супернатантах WISH-клеток, поскольку его концентрация оказалось более высокой к 48 ч культивирования по сравнению с 24-часовым периодом (фиг. 2 А). Моноядерные клетки периферической крови (РВМС) человека конститутивно продуцируют IL18BP (0,7-1,5 нг/мл), а обработанные с помощью -IFN повышают уровень IL-18BP в 1,70,1 и 20,3 раза, соответственно, через 24 и 48 ч (р 0,05, n=4). На образование IL-18BP не влияет предобработка РВМС с помощью ТРА. Индукцию IL-18BP с помощью -IFNy испытывают на линии клеток U937. -IFN не индуцирует IL18BP в недифференцированных клетках U937, но после дифференциации с помощью форболового эфира(ТРА, 10 нг/мл) макрофагоподобных клеток получают базисный уровень IL-18BP (0,07+0,01 нг/мл) и повышенный уровень в 4,60,05 раза после индукции с помощью -IFN (100 Ед./мл, 24 ч), дополнительно увеличивающийся через 96 ч (не показано). Действие других цитокинов, таких как 2-IFN, -IFN, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 и -TNF, на экспрессию IL-18BP испытывают в клетках HepG2 (фиг. 2 В). Результаты, полученные после инкубации указанных клеток с различными цитокинами в присутствии или в отсутствие -IFN (фиг. 1, web-каталог PNAS) свидетельствуют, что 2-IFN, -IFN, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 и -TNF в одиночку не индуцируют IL18BP. Но на НерG2-клетки IL-6 и -TNF действуют синергически с -IFN, обеспечивая статистически значимое увеличение IL-18BP. Данные результаты свидетельствуют, что IL-18BP можно индуцировать в моноцитах и во многих других клетках с помощью -IFN. Индукция IL-18BP с помощью -IFN дополнительно усиливается при добавлении IL-6 и -TNF. Пример 3. IL-18 ВР-ген транскрипционно регулируется с помощью y-IFN с обязательным синтезом белка de novo. Для того чтобы проверить, происходит ли индукция мРНК IL-18 ВР с помощью -IFN на транскрипционном уровне, действие интерферона на HepG2- и Wish-клетки измеряют в присутствии актиномицинаD, ингибитора трансляции (фиг. 3 А). Увеличение уровня мРНК IL-18BP выявляют в HepG2-клетках с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР после 3 ч обработки их с помощью у-IFN и только после 5 ч обработки Hakat- и WISH-клеток. Предварительная обработка HepG2- и WISH-клеток актиномицином D перед -IFN-стимуляцией нарушает экспрессию мРНК IL-18BP в разных временных точках, что свидетельствует о том, что y-IFN стимулирует синтез мРНК de novo. Накопление IL-18BP отмечено через 24 ч и позже, после -IFN-обработки, поддерживая зависимость IL-18 ВР-экспрессии от предшествующей индукции белков, например факторов транскрипции. Поэтому, чтобы подтвердить такое предположение в последующем используют белковый ингибитор, циклогексимид, чтобы проверить требует ли -IFN-индукция мРНК IL-18BP синтеза белков de novo. Результаты, суммированные на фиг. 3 В, свидетельствуют, что предварительная обработка указанных клеток циклогексимидом нарушает индукцию мРНК IL-18BP. Данный результат указывает, что синтез белка denovo существен для активации IL-18 ВР-гена с помощью -IFN. Пример 4. Определение сайта инициации транскрипции IL-18BPa и его промоторной области для картирования IL-18 ВР-промотора. Для изучения IL-18 ВР-промоторной области прежде всего необходимо специфически определить место расположения сайта инициации транскрипции. Сайт инициации транскрипции мРНК IL-18BPa человека определяют с помощью 5'-RACE (RACE,пример 14) . Лишь один ПЦР-продукт, соответствующий IL-18BPa, наиболее часто встречаемым вариантом сплайсинга, получают с помощью 5'-RACE. Анализ ДНК-последовательности данного продукта обнаруживает сайт инициации транскрипции и дополнительный экзон размером 50 п.н. после сайта инициации транскрипции на 5'-конце мРНК IL-18BP человека, соответствующий позициям нуклеотидов 7 85-835 геномной ДНК IL-18 ВР (можно найти в нуклеотидной базе данных Entrez pubmed, ссылкаAF110798) . В соответствии с этим создают новую экзон-интрон-карту путем сравнения геномной ДНК и мРНК, в которую добавлен новый 5'-экзон (см. фиг. 4). Обладая данным сайтом инициации транскрипции IL-18BP (основание 1), можно было бы далее анализировать геномную ДНК человека слева от основания 1 (хромосома 11q клон:RP11-757C15, ссылкаАР 000719.4, нуклеотиды левее основания 152178), соответствующую IL-18 ВР-промоторной области. Сравнение данной ДНК с экспрессируемой маркерной последовательностью (EST) базы данных в NCBI- 11007460 с помощью программы BLAST обнаруживает слева ген на [+]-цепи, кодирующий белок типа цинкового пальца (ссылкаАК 001961). Затем депонированную мРНК данного белка типа цинковый палец удлиняют с помощью программы "Instant RACE" (www.LabOnWeb. com), которая просматривает обширную коллекцию по EST человека. Данная программа помещает 3'-конец мРНК белка типа цинковый палец по нуклеотиду 150517 геномного клона RP11-757C15, ограничивая, таким образом, предполагаемую левую регуляторную последовательность из IL-18BP по 1661 основаниям слева от основания 1. Пример 5. Исследование минимального промотора слева от IL-18 ВР-гена, способного стимулировать конститутивную экспрессию гетерологичного гена. Чтобы обнаруживать минимальный ДНК-фрагмент, в положении апстрим от IL-18 ВР-гена, способного управлять экспрессией шестичленного гена, такого как люциферазный репортерный ген, с данным люциферазным геном (пример 15) сливают вектор, содержащий до 1601 п.н., соответствующий ДНКпоследовательности слева от основания 1 и включающий 50 п.н. справа от сайта инициации транскрипции (SEQ ID NO:5), и векторы, обладающие укороченными формами данной ДНК (фиг. 5 А). Люциферазная активность в HepG2-клетках человека (линия клеток эпителиомы печени человека), трансфицированных вектором (pGL3(1601) ) , включающим указанные 1601 п.н. "левой" ДНК, оказывается в 10,30,9 раз выше, чем активность, полученная с помощью пустого pGL3-вектора. Такая активность не наблюдается при встраивании этой же ДНК в противоположной ориентации (pGL3(-1601). Данный результат свидетельствует о том, что эта ДНК из 1601 п.н. слева от основания 1 обладает базисной промоторной активностью. Анализ последовательности данного ДНК-фрагмента из 1601 п.н. обнаруживает, что она не содержит элемент ТАТА-бокс, но обладает несколькими GC-богатыми доменами вблизи сайта инициации транскрипции по основаниям от -3 до -9, от -39 до -48 и от -122 до -132. Анализ этой ДНКпоследовательности из 1601 п.н. с помощью программы TFSEARCH идентифицирует гаммаактивированную последовательность (GAS) по основаниям от -24 до -32 (фиг. 1). Последующий анализ обнаруживает элемент ответа IRF1,2 (IRF-E), охватывающий основания от -57 до -69, и два элемента ответа С/ЕВР по основаниям от -309 до -322 и от -621 до -634. Были тестированы группы люциферазных репортерных векторов с последовательным укорочением по 5'-концу указанного фрагмента из 1601 п.н Полученные результаты, суммированые на фиг. 5 А, свидетельствуют, что все конструкции, в том числе иpGL3 (122), содержащие только элементы IRF и GAS, оказываются, по меньшей мере, эффективными в виде pGL3(1601) для поддержания базисной промоторной активности. Данные результаты показывают, что данный фрагмент из 122 п.н. (SEQ ID NO:3), включающий элементы IRF и GAS, является достаточным для стимуляции базисной активности гетерологичного гена(фиг. 5A). Пример 6. Исследование минимального промотора слева от IL-18BP-гена, способного стимулировать индуцируемую экспрессию гетерологичного гена. Для того чтобы идентифицировать минимальный ДНК-фрагмент, "левую" область IL-18 ВРпромотора, способного усиливать -IFN-индуциремую люциферазную экспрессию, укороченные ДНКвекторы из предыдущего примера проверяют в трансфицированных HepG2-клетках в присутствии -IFN(фиг. 5 В по трансфекциям, см. пример 16). Полученные результаты, суммированные на фиг. 5 В, свидетельствуют, что через 24 ч -IFN в 33 раза увеличивает люциферазную активность сверх базисного уровня экспрессии в векторе, включающем лишь элементы IRF-E и GAS (pGL3(122)-вектор). Данный результат свидетельствует, что пара IRF-EGAS без дополнительной помощи может опосредовать индукцию гетерологичного гена с помощью IFN. Включение элементов С/ЕВР-Е 1 и 2 (pGL3(656 существенно, в 88 раз сверх базисной активности,увеличивает индукцию люциферазной активности, демонстрируя значимость данных элементов для индукции синтеза с помощью -IFN. В противоположность этому, включение дополнительной "левой" ДНК в такую вставку (pGL3(1106 аннулирует индукцию люциферазной активности сверх ее базисной активности. Данный результат дает основание полагать, что остатки сайленсерного элемента находятся в пределах оснований от -656 до -1106 (слева от второго С/ЕВР-Е 1-элемента). Показано, что три API-элемента ответа представлены в сайленсерной области и что c-Jun связывается с IL-18 ВР-геном и участвует в его сайленсинге с помощью всех трех таких АР-1-элементов ответа. Дальнейшее удлинение данного промотора с помощью 88 оснований "левого" сайленсера(pGL3(1272 восстанавливает указанный ответ к -IFN, и это заставляет полагать, что остатки энхансерного элемента, по основаниям от -1106 до -1272, и его активация с помощью -IFN подавляет действие соседнего сайленсера. Дополнительное удлинение данной последовательности не влияет на базисную или -INF-индуцированную активность, и это дает основание полагать, что все "левые" регуляторные последовательности локализуются в пределах оснований от -1 до -1272 (SEQ ID NO:1). Из всех апробированных конструкций индуктивность pGL3(656) является наибольшей, и это свидетельствует о том, что данный ДНК-фрагмент содержит оптимальный индуцируемый IL-18BP-промотор. Полученные результаты свидетельствуют, что минимальный индуцируемый промотор, содержащий элементы IRF-E и GAS, расположен на 122 п.н. левее от старта инициации транскрипции (SEQ ID NO:3),- 12007460 а максимальный и оптимальный индуцируемый промотор, содержащий кроме элементов IRF-E и GAS два С/ЕВР-элемента, расположен на 656 п.н. левее от старта инициации транскрипции. Пример 7. Участие IRF-1 в IL-18 ВР-экспрессии in-vivo. Чтобы исследовать участие IRF-1 в IL-18 ВР-экспрессии, связывающий сайт которого, как установлено, находится в IL-18 ВР-промоторе, у дефицитных по IRF-1 мышей изучают экспрессию IL-18BP. У дефицитных по IRF-1 мышей измеряют уровни IL-18BP (Jackson laboratories, Bar Harbor ME) до и после введения мышиного -IRF и сравнивают с уровнями IL-18BP у контрольных С 57 В 1/6-мышей (фиг. 6). Базисный уровень сывороточного IL-18BP у контрольных С 57 В 1/6-мышей составляет 9,11,9 нг/мл и существенно увеличивается, благодаря -IFN, до 22,4+2,2 нг/мл. В противоположность этому, сывороточный IL-18BP у дефицитных по IRF-1 мышей оказывается ниже границы детектирования и возрастает с помощью -IFN только до 0,71,15 нг/мл. Данный результат подтверждает значимость IRF-1 в качестве посредника базисной, а также -IFN-индуцируемой экспрессии IL-18BP. Пример 8. Детекция факторов транскрипции, связывающихся с IL-18BP-промотором в условиях индукции. Для идентификации взаимодействия белок-ДНК среди разных элементов ответа в IL-18 ВРпромоторе анализируют смещение электрофоретической подвижности (EMSA, пример 18). МеченымdsДНК-зондам, соответствующим основаниям от -33 до -75 (содержащие элемент IRF-E) и от -8 до -55(содержащие элемент GAS), дают возможность связываться с ядерными экстрактами контрольных и IFN-обработанных клеток. Комплекс, содержащий IRF-E зонд и ядерный белок (ядерные белки), становится видимым после инкубации клеток в течение 1 ч с -IFN, а максимальный ответ наблюдают через 3 ч (фиг. 7 А, дорожки 1-5). Как и следовало ожидать, добавление антител к IRF-E вызывает "суперсмещение", тогда как антиантитела передатчика сигнала и активатора транскрипции 1 (STAT1) не оказывают влияния (данные не представлены). В противоположность IRF-E, GAS-содержащий зонд конститутивно ассоциируется с белком (фиг. 7 А, дорожка 6) и данный комплекс усиливается при индукции клеток с помощью -IFN в течение 3-6 ч (дорожки 7, 8). Как и ожидалось, GAS связывает -IFN-индуцированныйSTAT1-димер. Тем не менее, данный комплекс не подвергается воздействию антител к STAT1 (дорожка 10), что заставляет предположить, что этот -IFN-индуцированный STATl-димер не связывается с элементом GAS. Такой же отрицательный результат был получен с ядерными экстрактами клеток, обработанными с помощью -IFN в течение лишь 15 или 30 мин (данные не представлены). Поразительно, но данный комплекс разрушается антителами к С/ЕВР (дорожка 9) и смещается антителами к IRF-1 (дорожка 10). Следовательно, GAS-содержащий ДНК-зонд, по-видимому, связывается с С/ЕВР/3, несмотря на отсутствие общего типичного элемента структуры С/ЕВР Е. Результаты, полученные с помощью EMSA, свидетельствуют о том, что при -IFN-индукции, IRF-1 связывается с IRF-E-элементом в данном IL-18 ВР-промоторе. Кроме того, образуется комплекс, включающий IRF-1 и С/ЕВР, который связывается с указанным GAS-элементом. Пример 9. Изучение роли комплекса IRF-1-C/EBP в индукции IL-18BP. При дальнейшем изучении роли IRF-1 и С/ЕВР/3 в индукции IL-18 ВР-гена вслед за сверхэкспрессией IRF-1 и С/ЕВР измеряют уровень мРНК IL-18BPa с помощью полуколичественной RT-ПЦР, применяя трансфекцию экспрессионных векторов (пример 14, фиг. 7 В). Сверхэкспрессия транскрипционного фактора или сочетание обоих факторов в HepG2-клетках не индуцируют мРНК IL-18 ВР. Данный результат позволяет предположить, что для активации IL-18 ВР-гена необходимы дополнительные -IFNиндуцируемые факторы. Трансфекция данных клеток любым одним из указанных экспрессионных векторов вслед за их индукцией с помощью -IFN, в сравнении с одной лишь -IFN-индукцией, на самом деле снижают уровень мРНК IL-18BP. В противоположность этому, коэкспрессия двух транскрипционных факторов увеличивает индукцию мРНК IL-18BP благодаря -IFN. Данный результат позволяет предположить, что IRF-1 и С/ЕВР должны быть представлены в определенном соотношении, вероятно образуя комплекс с указанным комплексом инициации транскрипции. При последующем изучении осуществляют возможное взаимодействие между IRF-1 и С/ЕВР титрованием люциферазной активности после котрансфекции клеток с помощью pGJ3 (1272), фиксированным количеством экспрессионного вектораIRF-1 и изменяющимися количествами экспрессионного вектора С/ЕВР/3. Подобным образом, люциферазную активность измеряют при неизменном количестве С/ЕВР-вектора и с разными количествамиIRF-1-вектора. В обоих случаях получают колоколообразную дозозависимую кривую, и это заставляет полагать, что для оптимальной IL-18 ВР-индукции требуется неизменное молярное соотношение этих двух транскрипционных факторов (фиг. 7 С). Исследования по иммунопреципитации осуществляют для того, чтобы подтвердить физическую связь между IRF-1 и С/ЕВР (пример 19, фиг. 7D) . Иммунопреципитация (ip) с последующим иммуноблоттингом (ib) ядерных и цитоплазматических белков (пример 15) из -IFN-обработанных клеток антителами к С/ЕВР обнаруживает, что С/ЕВР конститутивно экспрессируется в HepG2-клетках и перемещается в их ядра в ответ на -IFN (верхняя панель) . В противоположность С/ЕВР, который не индуцируется с помощью -IFN, ip и ib клеточных экстрактов антителами к IRF-1, обнаруживают, что -IFN инду- 13007460 цирует экспрессию IRF-1. Но подобно С/ЕВР/3 при -IFN-индукции IRF-1 перемещается в клеточные ядра (средняя панель) . Ip антителами к С/ЕВР и последующим ib антителами к IRF-1 обнаруживают присутствие стабильного комплекса IRF-1-C/EBP в данной ядерной фракции (нижняя панель). Эти результаты подтверждают образование указанного комплекса IRF-1-C/EBP после -IFN-индукции, что впервые демонстрирует существование такого комплекса между этими двумя транскрипционными факторами. Таким образом, при -IFN-индукции ближайшая GAS-содержащая последовательность и примыкающий к ней элемент IRF-E связывают указанный комплекс, состоящий из С/ЕВР и IRF-1. Пример 10. Выяснение роли С/ЕВР-Е-элементов для IL-18 ВР-промоторной активности. Два С/ЕВР-сайта в положениях от -309 до -322 и от -621 до -634 не граничат со смежным IRF-Eэлементом. Действительно, EMSA (пример 18) зонда, корреспондирующего с С/ЕВР-сайтами в положениях от -309 до -322, показывает замедленную полосу (зачерненная стрелка) , которую сильно смещают антитела к С/ЕВР/3 (светлая стрелка), но не антитела к IRF-1 (фиг. 8 А). Поэтому был сделан вывод о том,что данный сайт связывает С/ЕВР, а не его комплекс с IRF-1. Кроме того, данная полоса порождается ядерным экстрактом неиндуцированных HepG2-клеток, которые конститутивно экспрессируют С/ЕВР,но не содержат IRF-1. Действительно, -IFN не увеличивает экспрессию С/ЕВР в этих клетках (фиг. 8D) и, следовательно, не увеличивает интенсивность вышеуказанной замедленной полосы (фиг. 8 А). Аналогичные результаты получены и с более дистальным С/ЕВР-сайтом (данные не представлены). Эти результаты показывают, что, в отличие от транскрипционного фактора IRF-1, транскрипционный фактор С/ЕВР экспрессируется конститутивно и не индуцируется с помощью -IFN, и что помимо связывания с IRF-1 и с GAS, он связывается с обоими С/ЕВР-элементами, присутствующими в IL-18 Впромоторе. Пример 11. Изучение роли энхансера в экспрессии IL-18BP. Регуляторную роль дистального энхансера изучают по EMSA (пример 28) с помощью 192 п.н. ДНК-зонда, соответствующего нуклеотидам от -1081 до -1272. Ядерный экстракт контрольных HepG2 клеток с данным зондом образует комплекс (фиг. 8 В, зачерненная стрелка). После обработки указанных клеток с помощью -IFN образовавшийся комплекс оказывается более интенсивным и отчасти более замедленным. Затем осуществляют сверхсильное смещение данного комплекса антителами к IRF-1,С/ЕВР и cFos. Из них только анти-IRF-l вызывает сверхсильное смещение (фиг. 8 В, светлая стрелка). Немеченая dsДНК, соответствующая нуклеотидам от -1083 до -1174, не конкурирует с радиоактивно меченым зондом, свидетельствуя о том, что данные ядерные белки связаны с остатками от -1175 до -1272. Так как IRF-E идентифицируют только в проксимальной области, данный результат позволяет предположить, что данный дистальный энхансер, вероятно, ассоциирован с проксимальным IRF-E. Данные результаты свидетельствуют о том, что данный дистальный энхансер взаимодействует с базисным промотором через IRF-1. Пример 12. ИФА IL-18BP. Уровень IL-18BP человека измеряют с помощью ИФА-метода двойных антител, как описано (Novick и соавт. 2001) . Мышиный IL-18BP измеряют ИФА-методом двойных антител с использованием поликлонального антитела к мышиному IL-18BP, выделенного очисткой по сродству к кроличьему антигену, и биотинилированного антитела, который был получен от Суtolab, Израиль. Пример 13. Выделение РНК и обратнотранскриптазная (ОТ)-ПЦР. После обработки в бессывороточной среде в указанное время собирают HepG2- и WISH-клетки (106) и экстрагируют тотальную РНК с использованием TRI-реагента. кДНК получают с использованием случайных гексамеров и SuperscriptII (Invitrogen, Leek, Голландия), в соответствиями с инструкциями производителя. ПЦР осуществляют с помощью следующих праймеров: IL-18BP человека, 5'CACGTCGTCACTCTCCTGG и 5'CGACGTGACGCTGGACAAC; IRF-1 человека 5'GACCCTGGCTAGAGATGCAG и 5'GACCTGCTGAGTCCATCAG; -актина человека 5'GTGGGGCGCCCCAGGCACCA и 5'CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC. Амплификацию осуществляют с помощью начальной денатурации (92 С, 2 мин), 28 циклов денатурации (92 С,45 с), отжига (62 С, 1 мин) и удлинения (72 С, 1,5 мин), и завершающего удлинения (72 С, 10 мин). Полученные ПЦР-продукты разделяют электрофорезом в агарозном (1%) геле. Пример 14. Быстрая амплификация 5'-концов кДНК (5'-RACE). 5'-RACE осуществляют с помощью 5'RACE-System (GIBCO BRL) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, тотальную РНК из -IFN-обработанных WISH-клеток обратно транскрибируют с помощью праймера, комплементарного нуклеотидам 89-70 из мРНК IL-18BP (GenBank, каталожныйAF110799) с последующим наращиванием вновь синтезируемых концов с помощью якорной ДНК. Затем ПЦР осуществляют с помощью прямого праймера, комплементарного якорной ДНК, и гнездового обратного праймера, комплементарного нуклеотидам 31-11 из мРНК IL-18BP. Затем полученные ПЦРпродукты субклонируют и подвергают ДНК-секвенированию. Пример 15. Плазмиды и клонирование. Полную предполагаемую IL-18 ВР-промоторную область размером 1601 п.н. получают с помощью ПЦР из геномной ДНК с использованием смыслового праймера (S4753.pgl), содержащего Kpn I-сайтI-фрагмент выделяют из клона pGEM-T Easy и лигируют в pGL3-Basic-вектор (Promega) с использованием набора Rapid DNA Ligation Kit (Roche), что дает pGL3(1601). Группу 5'-укороченных репортеров(pGL3(1454), pGL3(1274), pGL3(1106), pGL3(656), pGL3(280) и pGL3(122) получают аналогичным образом, соответственно, с помощью того же обратного праймера и с нижеследующими смысловыми праймерами:HepG2- или WISH-клетки в 6-луночных планшетах (0,5 х 106/лунку) трансфицируют с использованием FuGENE 6 и указанного люциферазного репортерного вектора (0,5 мкг/лунку), а также -GAL pSV40(0,2 мкг/лунку, Promega) в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых случаях котрансфекцию осуществляют с помощью нижеследующих экспрессионных векторов: pcDNA3-IRF-l (0,07-1,5 мкг/мл, любезно предоставленным д-ром B.Levy, Yechnion, Israel); рсDNA3-С/ЕВР (0,5-2,5 мкг/лунку,любезно предоставленным д-ром D.Zipori, Weizmann Institute of Science). Через 16 ч клетки обрабатывают в бессывороточной среде в течение 24 ч с помощью -IFN (100 Ед./мл), либо IL-6 (150 Ед./мл), либо-TNF (10 нг/мл) или их указанными сочетаниями. Затем клетки собирают, лизируют и измеряют активность люциферазы. Все результаты корректируют по -галактозидазной активности. Пример 17. Получение ядерных и цитоплазматических экстрактов. Клетки промывают 3 х с помощью ледяного фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) и сразу замораживают в жидком азоте. Осадки клеток ресуспендируют в четырех объемах, по отношению к осажденным клеткам, цитоплазматического буфера (10 мМ Hepes, pH 7,9, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 5%Na3VO4, 2 мМ ЭГТА, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ Na2MoO4, 2 мкг/мл, каждого, лейпептина, пепстатина и апротинина) . Полученный лизат центрифугируют (3000 хg, 10 мин) и собирают супернатант, содержащий цитоплазматические белки. Полученный осадок ресуспендируют в 2,5 объемах, по отношению к осажденным клеткам, ядерного буфера (идентичного цитоплазматическому буферу за тем исключением, что концентрацию NaCl увеличивают до 0,42 М). Ядерный дебрис удаляют центрифугированием (15000xg, 20 мин, 4 С), аликвоты полученного супернатанта замораживают в жидком азоте и хранят при -80 С. Концентрацию белка определяют с помощью ВСА-набора реагентов для анализа белка (Pierce, Rockford США) с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Пример 18. Анализ смещения электрофоретической подвижности.Ds-олигонуклеотиды, соответствующие выбранным элементам ответа (10 пкмоль), метят [32 Р] 3 АТФ с помощью полинуклеотидкиназы (New England Biolabs). Ядерные экстракты (5 мкг белка) преинкубируют (15 мин, 0 С) вместе с поли(dI-dC) (Amersham Pharmacia biotechnology) в 20 мл EMSA-буфера(20 мМ Hepes pH 7,5; 5 мМ MgCl2, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ DTT и 5% (по об.) глицерина). Затем добавляют меченый зонд (3x104 cpm) и инкубацию продолжают при комнатной температуре в течение дополнительных 30 мин. Для анализа сверхсильного смещения образцы, перед добавлением зонда, инкубируют с указанными антителами (4 мкг, 1 ч при 0 С). 200-кратный избыток конкурента дикого и измененного типа добавляют вместе с данным подходящим зондом. Затем реакционные смеси подвергают электрофорезу в 5%-ых неденатурирующих полиакриламидных гелях. Гели сушат в вакууме и радиоавтографируют в течение ночи при -80 С. Пример 19. Иммунопреципитационный анализ (ip) и иммуноблот-анализ (ib). Ядерные или цитоплазматические белковые экстракты (80 мкг) инкубируют с 6 мкг указанных поликлональных антител в течение ночи при 4 С и иммунопреципитируют на белок-G-сефарозных шариках (Pharmacia) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем данные шарики кипятят в SDS-ПААГбуфере для образцов, содержащем 10% DTT и полученный супернатант разделяют в SDS-ПААГ (10% акриламида) в восстанавливающих условиях. Затем электрофорезированный гель блоттируют на нитроцеллюлозную мембрану и белки детектируют с помощью указанных антител. Иммунные комплексы идентифицируют, используя набор Super Signal (Pierce). Пример 20. Получение CHO-r-hsLDLR с использованием IL-18-промотора. Стабильные рекомбинантные СНО-клетки, экспрессирующие растворимый LDLR человека, создают путем котрансфекции СНО-DUKX-клеток, не имеющих дигидрофолатредуктазного (DHFR) гена (Urlaub G. и соавт., 1980), с помощью двух экспрессионных векторов: одного, содержащего N-концевой лиганд-связывающий домен из LDLR, начинающегося от аминокислотного остатка Asp (+4) и до Glu 291(+291), и pDHFR, содержащего мышиный ген для DHFR, DHFR, контролируемого ранним SV40 промотором, и sLDLR-гена под IL-18 ВР-промотором (SEQ ID NO:2), а также терминирующими транскрипцию элементами из ранней области SV40. Трансфекцию осуществляют с помощью катионных липосом с использованием LipofectAmine (Gibco BRL), в соответствии с протоколом, описанным производителем. Через семьдесят два часа трансфекции клетки переносят в селективную среду, не содержащую дезокси- и рибонуклеозидов, с добавлением 10%-ной диализованной FCS. Клетки, экспрессирующиеDHFR-активность, способны образовывать колонии, которые отделяют путем отслаивания данных клеток с помощью насыщенных трипсином бумажных дисков. Извлеченные клетки выращивают и проверяют на r-hsLDLR-активность. Затем трансфицированные клетки подвергают генной амплификации с помощью МТХ, с последующим субклонированием стабильных клонов-продуцентов. Список литературыZweibel et al. 1989 Science 243:220. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. ДНК-последовательность, кодирующая IL-18 ВР-промотор человека (SEQ ID NO:1), или фрагмент, или его функциональное производное, в котором 3'-конец указанной ДНК-последовательности или ее фрагмента включает один или несколько нуклеотидов из 5'-конца SEQ ID NO:5. 2. ДНК-последовательность по п.1, где данное производное, измененное по одному или несколькимAPI-сайтам, присутствует в сайленсерном элементе, который представлен в данной последовательности. 3. ДНК-последовательность по п.1, где данный фрагмент включает SEQ ID NO:2. 4. ДНК-последовательность по п.1, где данный фрагмент включает SEQ ID NO:3. 5. ДНК-последовательность по любому из пп.1-4, дополнительно включающая интрон. 6. ДНК-последовательность по п.5, в которой данный интрон состоит из первого интрона IL-18BP. 7. ДНК-последовательность по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая ген, присоединенный путем сшивки к IL-18 ВР-промотору. 8. ДНК-последовательность по п.7, в которой указанный ген кодирует IL-18BP. 9. ДНК-последовательность по п.7, в которой указанный ген кодирует гетерологичный белок. 10. ДНК-последовательность по п.9, в которой указанный гетерологичный ген кодирует люциферазный ген. 11. ДНК-последовательность по п.9, в которой указанный гетерологичный ген кодирует белок, выбранный из бета-интерферона, TNF, эритропоэтина, тканевого активатора плазминогена, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, марганец-супероксид-дисмутазы, иммуноглобулина, или его фрагмента, гормона роста, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR и TNF-рецепторсвязывающих белков. 12. Вектор, включающий ДНК-последовательность по любому из предшествующих пунктов формулы изобретения. 13. Хозяйская клетка, включающая вектор по п.12. 14. Хозяйская клетка по п.13, представляющая собой клетку млекопитающего. 15. Хозяйская клетка по п.14, выбранная из клеток СНО, WISH, HepG2, Cos, CV-1, HeLa, HakatU937. 16. Способ получения рекомбинантного белка, включающий культивирование хозяйской клетки по любому из пп.13-15 и выделение продуцируемого рекомбинантного белка. 17. Рекомбинантный вирусный вектор, включающий часть генома данного вируса, ДНК-фрагмент,кодирующий представляющий интерес ген, и ДНК-фрагмент, включающий ДНК-последовательность,кодирующую IL-18 ВР-промотор человека, по любому из пп.1-6, оперативно связанная с представляющим интерес геном. 18. Рекомбинантный вирусный вектор по п.17, в котором ген, представляющий интерес, выбран из бета-интерферона, TNF, эритропоэтина, тканевого активатора плазминогена, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, марганец-супероксид-дисмутазы, иммуноглобулина или его фрагмента, гормона роста, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR и TNF-рецепторсвязывающих белков. 19. Рекомбинантный вирусный вектор по п.17, где часть генома данного вируса относится к аденоассоциированному вирусу. 20. Рекомбинантный вирусный вектор по п.17, где часть генома данного вируса относится к ретровирусу.- 17007460 21. Рекомбинантный вирусный вектор по п.17, в котором ретровирус выбран из ВИЧ, HFV, MLV,FIV и VSV. 22. Способ регуляции клеточно-специфической экспрессии гена, представляющего интерес, включающий трансдуцирование клетки-мишени млекопитающего вектором по любому из пп.17-21 и, при необходимости, трансплантацию такой клетки индивиду. 23. Способ по п.22, в котором указанная клетка-мишень представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. 24. Способ по п.22, в котором указанная клетка-мишень представляет собой моноцит. 25. Способ по п.22, в котором указанная клетка-мишень представляет собой макрофаг. 26. Способ по любому из пп.22-25, где представляющий интерес ген кодирует белок, обеспечивающий резистентность к ВИЧ-инфекции. 27. Способ по п.26, применяемый при лечении ВИЧ-инфекции. 28. Способ по пп.22-25, применяемый при лечении гемопоэтических нарушений. 29. Способ по п.28, в котором указанное гемопоэтическое нарушение выбрано из SCID, хронического грануломатозного заболевания и талассемии. 30. Способ генной терапии для лечения заболевания у индивида, обладающего повышенным уровнем -IFN в ткани тела, включающий введение эффективного количества вектора по любому из пп.17-21. 31. Способ по п.30, дополнительно включающий введение IL-6 и/или -TNF, а также и/или факторов IRF, и/или С/ЕВР. 32. Трансгенная мышь, обладающая ДНК-последовательностью, кодирующей ДНКпоследовательность по любому из пп.1-11. 33. Применение ДНК-последовательности, кодирующей IL-18BP-промотор человека (SEQ IDNO:1), или фрагмент, или его функциональное производное, в котором 3'-конец указанной ДНКпоследовательности или ее фрагмента включает один или несколько нуклеотидов из 5'-конца SEQ IDNO:5, для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания. 34. Фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество ДНКпоследовательности, кодирующей IL-18 ВР-промотор человека (SEQ ID NO:1), или фрагмент или его функциональное производное, в котором 3'-конец указанной ДНК-последовательности или ее фрагмента включает один или несколько нуклеотидов из 5'-конца SEQ ID NO:5.