Средство, активирующее стволовые клетки и/или клетки-предшественники

СРЕДСТВО, АКТИВИРУЮЩЕЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И/ИЛИ КЛЕТКИПРЕДШЕСТВЕННИКИ Изобретение предоставляет средство, активирующее стволовые клетки и/или клеткипредшественники, включающее батроксобин, которое может использоваться в регенеративной медицине, и особенно в регенеративной медицине, использующей саморегенерацию, действующее быстро и умеренно в зависимости от распространенности и степени повреждения органов и/или тканей, к которым применяется регенеративная медицина, с незначительными побочными эффектами или без них. Настоящее изобретение также предоставляет способ активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников у животного, включающий стадию введения животному эффективного количества батроксобина и использование батроксобина для активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников. 014296 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к средству, активирующему стволовые клетки и/или клеткипредшественники, включающему тромбиноподобный фермент, методу активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников у животного, включающему стадию введения животному эффективного количества тромбиноподобного фермента, и применению тромбиноподобного фермента для активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников. Уровень техники Заболевания, встречающиеся у человека, ориентировочно классифицируются как органические заболевания и функциональные заболевания. В традиционной медицине консервативное лечение используется главным образом для функциональных заболеваний, в то время как хирургическое лечение и консервативное лечение используются для органических заболеваний. Однако большинство способов консервативного лечения является симптоматическим лечением, которое в большинстве случаев не может радикально вылечить заболевания. Кроме того, хирургическое лечение является инвазивным способом лечения, в котором практикуется удаление всего или части поврежденного органа, приводящее к частичной или полной потерям функций органа. С другой стороны трансплантация органов и искусственные органы используются как альтернативные медицинские способы хирургического лечения. Однако в трансплантации органов существует много проблем, например, технические проблемы, такие как побочные эффекты, вызванные иммунодепрессантами, используемыми для подавления реакции отторжения, а также социальные проблемы, такие как серьезная нехватка доноров и увеличение затрат на здравоохранение. Кроме того, также существует много проблем в лечении, использующем искусственные органы,которые включают технические проблемы, такие как неспособность восстановить органные функции и биологическую совместимость, а также социальные проблемы, такие как увеличение затрат на здравоохранение. Регенеративная медицина в настоящее время привлекает внимание как новый способ лечения, который решает эти проблемы. Регенеративная медицина определяется как способ лечения, который активно использует клетки для восстановления конструкции и восстановления функции тканей и органов,у которых функции приходят в состояние функционального расстройства или дисфункции из-за болезни или несчастных случаев. Регенеративная медицина расширенно классифицируется на следующие три типа, основанные на способе использования клетки:(1) способ, включающий этапы отбора у донора эмбриональных стволовых клеток, мононуклеарных клеток, полученных из плацентарной крови, мононуклеарных клеток, полученных из крови, или мононуклеарных клеток, полученных из костного мозга, индуцирования пролиферации клеток и/или дифференцировки культуры in vitro, и введения отобранных недифференцированных (стволовые клетки и/или клетки-предшественники) и/или дифференцированных клеток в тело пациента с помощью имплантации;(2) способ, включающий этапы отбора у вышеуказанного пациента соматических стволовых клеток,мононуклеарных клеток, полученных из крови, или мононуклеарных клеток, полученных из костного мозга, индуцирования пролиферации клеток и/или дифференцировки культуры in vitro, и введения отобранных недифференцированных (стволовые клетки и/или клетки-предшественники) и/или дифференцированных клеток в тело этого же пациента с помощью имплантации; и(3) способ, включающий этап стимулирования тела пациента (например, с помощью введения лекарственного препарата, физической нагрузки или физиотерапии, и т.д.) для активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников, присутствующих в поврежденных органах или тканях пациента in situ(они называются резидентные стволовые клетки и/или клетки-предшественники), и/или полученные из крови или полученные из костного мозга стволовые клетки и/или клетки-предшественники пациента, без индуцирования пролиферации и/или дифференцировки культуры стволовых клеток и/или клетокпредшественников in vitro. Этот метод определяется как "саморегенерация". Основное современное направление регенеративной медицины предполагает способы, с помощью которых клетки вводятся извне в тело пациента с помощью имплантации (то есть, описанные выше способы (1) и (2. Способы, в которых дифференцированные клетки вводятся не из тела пациента, используются в областях дерматологии, офтальмологии и ортопедической хирургии, которые нацелены на ткани или органы (например, кожу, кость, хрящ, роговую оболочку и мышечные ткани), построенные из одного типа или чрезвычайно ограниченных типов клеток. Однако относительно цельных органов (например, сердца,печени, легких, почек и мозга), построенных из многочисленных типов клеток, технология для надлежащего управления поведением этих многочисленных типов дифференцированных клеток должна все же быть достаточно проработана и еще не достигла практического уровня. С другой стороны известны следующие способы введения недифференцированных клеток не из тела пациента.(1) Способ ангиогенной терапии, предполагающий введение стволовых клеток и/или сосудистых эндотелиальных клеток-предшественников не из тела пациента для стимуляции ангиогенеза и формирования новых кровеносных сосудов при серьезных ишемических заболеваниях и сердечно-сосудистых(2) Способ васкулогенеза, использующий введение эмбриональных стволовых клеток (ES клеток) не из тела пациента (McCloskey KE et al.: Use of embryonic stem cell-derived endothelial cells as a cell sourceto generate vessel structures in vitro. Tissue Eng 11:497-505, 2005). Этот способ не достиг практического применения, так как способы культивирования ES клеток, обеспечения дифференцировки клеток и получения дифференцированных клеток и тому подобное не были достаточно проработаны.(3) Способ аутогенной трансплантации костного мозга, использующий полученные из костного мозга мононуклеарные клетки, изолированные из собственного костного мозга пациента, и непосредственное введение клеток в пораженный участок для формирования новых кровеносных сосудов (Sato Y etgenes. Transplantation Proceedings 37:273-275, 2005). Этот способ имеет проблемы, такие как наличие небольшого количества доступных стволовых клеток, физическая тяжесть, и существующий для пациента риск при отборе большого количества костного мозга под общей анестезией. Кроме того, также имеется значительная трудность в управлении дифференцировкой имплантированных клеток. Кроме того, в регенеративной медицине, использующей способы, предполагающие рассматриваемое введение стволовых клеток и/или клеток-предшественников не из тела пациента, общей проблемой является риск возникновения осложнений, относящихся к избыточной регенерации и/или избыточному восстановлению с помощью имплантированных клеток. Напротив, способы, использующие "саморегенерацию", позволяют возвратить функцию с помощью регенерации пораженных органов и/или тканей при помощи "активации" стволовых клеток, и/или клеток-предшественников, первоначально присутствующих внутри тела пациента (то есть, резидентных стволовых клеток и/или клеток-предшественников, и/или полученных из крови или полученных из костного мозга собственных стволовых клеток и/или клеток-предшественников пациента). Хотя традиционно известно, что резидентные стволовые клетки и/или клетки-предшественники присутствуют в печени, регенеративном органе, недавно было сообщено, что эти клетки с регенеративной способностью также присутствуют в нервной системе (особенно в центральной нервной системе,такой как головной мозг), коже, жировой ткани, сетчатке, роговой оболочке, скелетной мышце и даже в сердце (Garry DJ et al.: Ponce de Leon's fountain: stem cells and the regenerating heart. Am J Med Sci 329(4): 190-201, 2005). В настоящее время предполагается, что резидентные стволовые клетки и/или клеткипредшественники присутствуют во всех органах и тканях (Weissman IL: Translating stem and progenitorleon's fountain: stem cells and the regenerating heart. Am J Med Sci 329(4) :190-201, 2005). Из представленной ниже литературы известно, что резидентные стволовые клетки и/или клеткипредшественники, и/или полученные из крови или полученные из костного мозга стволовые клетки и/или клетки-предшественники способны дифференцироваться в различные типы клеток ткани в зависимости от различных индуцирующих параметров микросреды, в которой они находятся, таких как различные типы контактирующих клеток, содержание внеклеточного матрикса, содержащихся в индуцирующих параметрах микросреды цитокинов и факторов роста. Например:(1) когда невральные стволовые клетки культивируются в присутствии нейротрофического фактора или фактора роста, они формируют полученные из отдельной клетки колонии, называемые нейросферами (то есть, ауторепликация), и эти нейросферы дифференцируются в нейроны, астроциты и олигодендроциты, исходя из различных индуцирующих параметров микросреды (то есть, мультипотентность). Кроме того, когда нейросфера пересеивается in vitro, другая нейросфера может быть сформирована из отдельной клетки, полученной из нейросферы (Reynolds BA and Weiss S: Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science 255:1707-1710, 1992);(2) хотя невральные стволовые клетки дифференцируются только в глиоциты, когда полученные из спинного мозга взрослой крысы невральные стволовые клетки пересаживаются в спинной мозг другой взрослой крысы, они же дифференцируются в нейроны, когда пересаживаются в зубчатую извилину гиппокампа (Shihabuddin LS et al.: Adult spinal cord stem cells generate neurons after transplantation in the(3) когда невральные стволовые клетки культивируются с сосудистыми эндотелиальными клетками,стимулируется пролиферация невральных стволовых клеток и дифференцировка в нейроны (Shen Q etal.: Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science 304:13381440, 2004). С другой стороны с точки зрения регенеративной медицины, использующей саморегенерацию, известны способы, стимулирующие размножение резидентных стволовых клеток и/или клетокпредшественников, и/или полученных из крови или полученных из костного мозга стволовых клеток и/или клеток-предшественников как изложено ниже:(1) при введении EGF животным с моделью ишемии головного мозга стимулируется пролиферация невральных стволовых клеток, и приблизительно 20% погибших клеток в области инфаркта регенерируются (Teramoto T et al.: EGF amplifies the replacement of parvalbumin-expressing striatal interneurons after(2) при введении терапевтического лекарственного препарата для лечения гиперлипемии, такого как статин (ингибитор 3-гидрокси-3-метил-глютарил кофермент A (HMG-CoA) редуктазы), пациентам с артериосклерозом, в крови увеличиваются уровни гемангиобластов или эндотелиальных клетокпредшественников, полученных из костного мозга (Walter DH et al.: Statin therapy accelerates reendothelialization: A novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Circulation 105:3017-3024, 2002);(b-FGF), PDGF, NGF и HGF, цитокины, такие как G-CSF, GM-CSF, эритропоэтин (ЕРО), и другие биологически активные вещества, такие как эстроген и липиды, и т.д., представляются полезными для увеличения количества стволовых клеток и/или клеток-предшественников (Takeyama К, Ohto H: PBSC mobilization. Transfus Apher Sci 31:233-243, 2004; Aicher A, Zeiher AM, Dimmeler S: Mobilizing endothelial progenitor cells. Hypertension 45:321-325, 2005). Однако для фармацевтических препаратов были разработаны только два или три из вышеупомянутых веществ, такие как G-CSF и b-FGF. Кроме того, G-CSF имеет риск канцерогенеза, в то время как b-FGF имеет риск побочных эффектов, таких как окклюзия сосуда во время внутривенной инъекции. Кроме того, с учетом разнообразия побочных эффектов, относящихся к факторам роста, нацеленным на многочисленные типы клеток, адекватная клиническая эффективность должна все же быть получена в клинических исследованиях для VEGF и b-FGF, которые разрабатываются как факторы роста, имеющие небольшое количество целевых типов клеток. Кроме того, ЕРО имеет побочные эффекты, включающие повышение кровяного давления. Кроме того, известно, что батроксобин является терапевтическим лекарственным препаратом для лечения острого церебрального инфаркта и тому подобное. На следующем вебсайте китайского интернета имеется сообщение о экспрессии CD34 в ишемизированной ткани во время локализованной ишемии головного мозга крысы. Автор: Cai Zhenli Название: Экспрессия CD34 в крысиной модели локальной ишемии головного мозга/реперфузии и воздействие батроксобина на его экспрессию. Связанный сайт: Chinese Dissertations Database (CDDB), Index No. Y653774. Тип носителя: интерактерактивный. Издатель: Wanfang Data. Дата обращения: 28 июля 2005. Адрес: URL: http://ww.wanfangdata.com.cn/ В этом сообщении экспрессия поверхностного клеточного антигена CD34 была обнаружена в образцах мозговой ткани, содержащих сосуды, свободные от крови (образцы ткани, полученные с помощью удаления крови из мозговой ткани с помощью выполнения коронарной перфузии до осуществления выборки образца). Здесь CD34 экспрессируется не только в гемангиобластах, гемопоэтических стволовых клетках, сосудистых ЕРС и мезенхимальных стволовых клетках, присутствующих в костном мозге, и сосудистых ЕРС и мезенхимальных клетках (и те и другие являются недифференцированными клетками), присутствующих в крови, но также и в зрелых сосудистых эндотелиальных клетках (дифференцированные клетки), которые составляют стенки сосуда (Ohsawa T et al. ed.: Encyclopedia of Immunology (2ndEdition), p. 327, Tokyo Kagaku Dozin, December 3, 2001). Соответственно, в случае использования костного мозга и крови в качестве образцов, хотя недифференцированные клетки (стволовые клетки и клеткипредшественники) позитивны для CD34, в случае использования образца, состоящего из мозговой ткани,содержащей сосуды, свободные от крови, только дифференцированные клетки являются CD34 позитивными. Таким образом, это сообщение не делает вообще никакой оценки относительно действия батроксобина на стволовые клетки и/или клетки-предшественники. С другой стороны есть клиническая потребность в веществе, способном использоваться в регенеративной медицине, основанной на способе, использующем саморегенерацию, которое имеет немного или не имеет побочных эффектов и способно действовать быстро и умеренно в зависимости от распространенности и степени повреждения органов и/или тканей, к которым применяется регенеративная медицина (Kinnaird T et al.: Bone-marrow derived cells for enhancing collateral development: mechanism, animal dataand initial clinical experiences. Cir Res 95 (4) :354-363, 2004). Сущность изобретения Таким образом, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы создать средство, активирующее стволовые клетки и/или клетки-предшественники, подходящее для использования в регенеративной медицине, и особенно в регенеративной медицине, использующей саморегенерацию. В результате проведения обширных исследований взаимосвязи между батроксобином, который является своего рода тромбиноподобным ферментом, и активацией стволовых клеток и клеток-предшественников для того, чтобы решить вышеупомянутые проблемы, авторы настоящего изобретения выявили, что поврежденные органы и ткани могут быть регенерированы с помощью использования батроксобина для активации вышеуказанных клеток. Настоящее изобретение выполнено на основе этого открытия.-3 014296 В частности, настоящее изобретение относится к средству, активирующему стволовые клетки и/или клетки-предшественники, включающему тромбиноподобный фермент, способу активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников у животного, включающему стадию введения животному эффективного количества тромбиноподобного фермента, и применению тромбиноподобного фермента для активации стволовой клетки и/или клетки-предшественника. Краткое описание чертежей Фиг. 1 является гистограммой, представляющей относительные количества нестин-позитивных клеток в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой; фиг. 2 является гистограммой, представляющей относительные количества BrdU-позитивных клеток в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой; фиг. 3 является гистограммой, представляющей относительные количества GFAP-позитивных клеток в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой; фиг. 4 является гистограммой, представляющей относительные количества BrdU-позитивных (мигрировавших) клеток в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой, и фиг. 5 является фотографией, представляющей распределение BrdU-позитивных клеток в областиSVZ в контрольной группе (слева) и в группе батроксобина (справа). Стрелками указаны BrdUпозитивные клетки. Лучший вариант осуществления изобретения Далее предоставлено детальное разъяснение настоящего изобретения. Средство, активирующее стволовые клетки и/или клетки-предшественники настоящего изобретения, характеризуется включением тромбиноподобного фермента в качестве активного компонента. Конкретные примеры тромбиноподобного фермента включают батроксобин, анкрод, кроталазу и так далее (Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis, in Medical Use of SnakeVenom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, pl30-131;1990). Батроксобин является самым типичным представителем тромбиноподобного фермента и является особенно предпочтительным. Батроксобин является тромбиноподобной сериновой протеазой, полученной из яда Bothrops atroxmoojeni. Батроксобин высвобождает только фибринопептид А из фибриногена, в результате чего происходит формирование дез-А-фибрина (то есть, фибрина I) (Aronson DL: Comparison of the actions of thrombin and the thrombin-like venom enzymes Ancrod and Batroxobin. Thrombos Haemostas (stuttg) 36:9-13,1976). Кроме того, первичная структура батроксобина предварительно идентифицирована как одноцепочечный гликопротеин, состоящий из 231 аминокислоты с молекулярной массой приблизительно 36000 Да (Itoh N et al. Molecular cloning and sequence analysis of cDNA for batroxobin, a thrombin-like snake venomenzyme. J Biol Chem 262:3132-3135, 1987). Батроксобин является сериновой протеазой также, как тромбин. Однако в отличие от батроксобина,высвобождающего только фибринопептид А из фибриногена, в результате чего происходит формирование дез-А-фибрина, тромбин высвобождает и фибринопептиды А и фибринопептиды В из фибриногена,в результате чего происходит формирование фибрина, таким образом делая их различными в этом отношении. Кроме того, хотя батроксобин не действует на факторы свертывания крови кроме фибриногена,тромбин отличается тем, что он действует на другие факторы свертывания крови. Сам батроксобин является известным веществом и может быть приготовлен согласно способу, описанному в опубликованной Японской патентной заявкеS57-10718, проходящей экспертизу (Японский патент 1118129). В качестве альтернативы, он может быть легко получен благодаря Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokyo, Japan) и ее филиалу Beijing Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. (Beijing, China). Анкрод является тромбиноподобной сериновой протеазой, полученной из яда Agkistrodonrhodostoma. Анкрод является гликопротеином, имеющим молекулярную массу приблизительно 354 00 Да. Как и батроксобин, анкрод высвобождает только фибринопептид А из фибриногена, в результате чего происходит формирование дез-А-фибрина (Stocker KF Snake venom proteins affecting hemostasis andfibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, pl34-135; 1990). Кроталаза является тромбиноподобной сериновой протеазой, полученной из яда Crotalusadamanteus. Кроталаза является гликопротеином, имеющим молекулярную массу приблизительно 32700 Да. Как и батроксобин, кроталаза высвобождает только фибринопептид А из фибриногена, в результате чего происходит формирование дез-А-фибрина (Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis andfibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, pl40-141; 1990). Вышеупомянутые тромбиноподобные ферменты, такие как батроксобин, анкрод и кроталаза, могут быть встречающимися в природе веществами или рекомбинантными генетическими продуктами. Хотя определение стволовых клеток и клеток-предшественников, являющихся целью настоящего изобретения, не было полностью стандартизировано в соответствующей области техники, в настоящем описании изобретения они определяются следующим образом на основе концепции, на которое было получено согласие (Weissman IL: Translating stem and progenitor cell biology to the clinic- Barriers and opportunities. Science 287:1442-1446, 2000; McKay R: Stem cells hype and hope. Nature 406:361-364, 2000). Стволовые клетки являются недифференцированными клетками со способностью к ауторепликации и мультипотентностью. Конкретные примеры стволовых клеток включают эмбриональные стволовые-4 014296 клетки (ES клетки), эмбриональные зародышевые клетки (EG клетки), соматические стволовые клетки(взрослые стволовые клетки), гемангиобласты, невральные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки и стволовые клетки других клеток (включая остеоцит,хондроцит, миоцит, сердечный миоцит, нейрон, сухожильную клетку, адипоцит, панкреоцит, гепатоцит и нефроцит). Клетки-предшественники являются недифференцированными клетками со способностью к ауторепликации и дифференциации, но для которых в конечном счете предопределен тип дифференцированной клетки. Конкретные примеры клеток-предшественников включают сосудистые эндотелиальные клеткипредшественники (ЕРС), клетки-предшественники нейрона и гемопоэтические клетки-предшественники. Способность к ауторепликации, которая является одним из критериев для идентификации стволовых клеток и клеток-предшественников, может быть оценена с использованием теста инкорпорирования 5-бромдезоксиуридина (BrdU) в ДНК (Gould EGross CG: Neurogenesis in adult mammals some progressand problems. The J Neuroscience 22(3): 619-623, 2002). Кроме того, идентификация типа стволовых клеток и клеток-предшественников может быть выполнена на основе экспрессии характерного маркера на стволовой клетке и клетке-предшественнике. Например, экспрессия нестина на невральных стволовых клетках (Wiese, С. et al.: Nestin expression - a property of multi-lineage progenitor cells Cellular and Molecular Life Sciences, 61:2510-2522, 2004), или экспрессия CD34 и CD31 на сосудистых ЕРС (Asahara T et al.: Isolation of putative progenitor endothelial cells forangiogenesis. Science 275: 964-967, 1997; Shi Q et al.: Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood 92(2):362-367, 1998). Присутствующие в теле взрослого стволовые клетки и клетки-предшественники могут быть разделены на резидентные клетки (то есть, резидентные стволовые клетки и резидентные клеткипредшественники), клетки, полученные из крови (то есть, стволовые клетки, полученные из крови, и клетки-предшественники, полученные из крови), и клетки, полученные из костного мозга (то есть, стволовые клетки, полученные из костного мозга, и клетки-предшественники, полученные из костного мозга), основываясь на их происхождении и местоположении. Резидентные клетки (резидентные стволовые клетки и/или резидентные клетки-предшественники) определяются как клетки со способностью к ауторепликации и мультипотентностью, которые первоначально присутствуют в определенном органе и/или ткани, которые участвуют в регенерации этого органа и/или ткани в случае если вышеуказанный орган и/или ткань подвергается повреждению. Конкретные примеры этих резидентных клеток включают роговичные стволовые клетки, сердечные стволовые клетки, невральные стволовые клетки, сосудистые ЕРС и так далее. Клетки, полученные из крови (то есть, стволовые клетки, полученные из крови, и клеткипредшественники, полученные из крови), определяются как мононуклеарные клетки со способностью к ауторепликации и мультипотентностью, которые присутствуют в циркулирующей крови, которые участвуют в регенерации органа и/или ткани с помощью мигрирования и накопления в том органе и/или ткани, в случае если вышеуказанный орган и/или ткань подвергается повреждению. Кровь в этом случае включает периферическую кровь, плацентарную кровь, артериальную кровь, венозную кровь, кровь, забранную из сердца, и кровь, отобранную из глазного дна. Конкретные примеры мононуклеарных клеток,полученных из крови, включают сосудистые ЕРС, мезенхимальные стволовые клетки и так далее. Клетки, полученные из костного мозга (то есть, стволовые клетки, полученные из костного мозга, и клетки-предшественники, полученные из костного мозга), определяются как клетки со способностью к ауторепликации и мультипотентностью, которые первоначально присутствуют в костном мозге, которые участвуют в регенерации органа и/или ткани с помощью мигрирования через кровоток и накопления в вышеуказанном органе и/или ткани в случае если вышеуказанный орган и/или ткань подвергается повреждению. Конкретные примеры клеток, полученных из костного мозга, включают сосудистые ЕРС,мезенхимальные стволовые клетки и так далее. Настоящее изобретение способно активировать каждую из этих резидентных клеток, клеток, полученных из крови, и клеток, полученных из костного мозга. Кроме того, стволовые клетки и клетки-предшественники могут быть разделены на клетки в активированном состоянии (состояние, в котором клетки пролиферируют, дифференцируются или мигрируют) и клетки в неактивном состоянии (состояние, в котором клетки не пролиферируют, не дифференцируются или не мигрируют). Но активирующее средство настоящего изобретения способно активировать стволовые клетки и клетки-предшественники и в активированном состоянии и в неактивном состоянии. Активирующее средство настоящего изобретения активирует стволовые клетки и/или клеткипредшественники. Здесь "активировать" определено как три действия, обозначенные ниже.(1) Стимуляция пролиферации стволовых клеток и/или клеток-предшественников.(2) Стимуляция миграции стволовых клеток и/или клеток-предшественников. Миграция определяется как мобилизация стволовых клеток и/или клеток-предшественников из костного мозга, органа и/или ткани в циркулирующую кровь; накопление в поврежденном органе и/или ткани из циркулирующей крови; или перемещение внутрь органа и/или ткани.(3) Стимуляция дифференцировки стволовых клеток и/или клеток-предшественников.-5 014296 Стволовые клетки и/или клетки-предшественники, на которые нацелено активирующее средство настоящего изобретения, являются стволовыми клетками и/или клетками-предшественниками, применяющимися при заболевании, поддающемся лечению с помощью регенеративной медицины (включая регенеративную медицину, в которой вводятся клетки не из тела пациента, и регенеративную медицину,использующую саморегенерацию). Таким образом, активирующее средство настоящего изобретения может использоваться не только для стволовых клеток и/или клеток-предшественников, используемых в регенеративной медицине, использующей саморегенерацию (то есть, клетки, которые первоначально имеются у пациента, и не подвергаются индуцированию пролиферации и/или дифференцировки культуры in vitro), но также и для стволовых клеток и/или клеток-предшественников, используемых в регенеративной медицине, в которой вводятся клетки не из тела пациента (то есть, клетки, вводимые не из тела пациента). Активирующее средство настоящего изобретения может предпочтительно использоваться для стволовых клеток и/или клеток-предшественников, используемых в регенеративной медицине, использующей саморегенерацию. На причину, тип или степень заболеваний (поврежденные органы или поврежденные ткани), к которым применяется регенеративная медицина, нет никаких специфических ограничений. Далее приводятся конкретные примеры этих заболеваний. Кожные заболевания Рана, ожог, лучевое поражение, обморожение, ультрафиолетовое повреждение, поражение электрическим током, травма, язва кожи, пролежень, контактный дерматит, буллезный дерматит, атопический дерматит, ксеродермия, диабетические язвы кожи, аутоаллергический дерматит, эритродермия, эксфолиативный дерматит, буллезный эпидермолиз, фотодерматоз, хроническая пигментная пурпура (болезнь Шамберга), повреждение слизистой оболочки полости рта, стоматит, околоротовой дерматит, признаки старения кожи, алопеция, паронихий, инкарнация ногтя, эрозия желудочно-кишечной слизистой оболочки, язва желудочно-кишечного тракта, эрозия роговицы, язва роговицы, кариес, пульпит, краевой периодонтит, аллергический ринит, поллиноз, весенний конъюнктивит, геморрой, повреждение желудочнокишечной слизистой оболочки, ожог желудочно-кишечной слизистой оболочки, бронхиальная астма,глоссит, рецидивирующая афта, внутриротовая афта, зловонное дыхание, аномальная ротовая чувствительность, зубная инфекция, прикусы слизистой оболочки полости рта, прикусы языка, ожог слизистой оболочки полости рта и язва слизистой оболочки полости рта. Заболевания черепных нервов Инсульт, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, различные заболевания центральной нервной системы (например, миелит), различные заболевания периферических нервов (например, множественная периферическая нейропатия), миелопатия и различные типы энцефалита. Сердечно-сосудистые заболевания Инфаркт миокарда, стенокардия, нестабильная стенокардия, различные типы миокардита (например, вирусный миокардит), острая сердечная недостаточность, хроническая сердечная недостаточность,атеросклероз, гипертония, ревматическое заболевание сердца, аритмия, клапанный порок сердца, инфекционный эндокардит, перикардит, чрескожное вмешательство на коронарной артерии, и рестеноз, и реобструкция после РТСА. Желудочно-кишечные заболевания Эзофагит, острый гастрит, хронический гастрит, язва желудка, язва двенадцатиперстной кишки,различные типы колита (например, язвенный колит), кишечный туберкулез, вирусный гепатит, алкогольный гепатит, лекарственный гепатит, жировая инфильтрация печени, цирроз печени, панкреатит и органные расстройства, вызванные хирургическим вмешательством при различных типах рака желудочно-кишечного тракта (например, рак печени, рак толстой кишки и рак желудка). Заболевания органов дыхания Различные типы бронхита (например, бактериальный бронхит), инфекционная пневмония, аспирационная пневмония, легочная эмболия, пневмоторакс и легочная недостаточность. Урологические заболевания Цистит, различные типы нефрита (например, хронический нефритический синдром, первичное клубочковое заболевание), адреналит, уретрит, бактериальный и небактериальный простатит, гипертензивная нефропатия, диабетическая нефропатия и почечная недостаточность. Заболевания опорно-двигательного аппарата Различные типы артрита (например, ревматоидный артрит), мышечная атрофия, костные дефекты после краниотомии при нейрохирургическом вмешательстве, костные дефекты после удаления опухоли при ортопедическом хирургическом вмешательстве, костные дефекты после переломов, костные дефекты, вызванные периодонтозом в области стоматологии, хондрит, дефекты хряща различных суставов,повреждения сухожилия, вызванные различными повреждениями (например, травмой или деформацией). Сосудистые заболевания Различные типы артериальных заболеваний (например, облитерирующий артериосклероз (ASO,болезнь Бюргера (облитерирующий тромбоартериит (ТАО, различные типы венозных заболеваний (например, тромбофлебит), тромбоз, циркуляторные расстройства, тромбоз глубоких вен (DVT), различные-6 014296 типы заболеваний, сопровождающихся периферическими циркуляторными расстройствами (например,внезапная глухота и вибрационная болезнь), и рестеноз и реобструкция после ангиопластики. Эндокринные заболевания Диабет и его осложнения (например, диабетическая периферическая нейропатия, диабетическая стопа и диабетическая язва), гиперлипемия, тиреоидит и тучность. Офтальмологические заболевания Различные типы кератита (например, вызванный щелочными или кислыми составами кератит и травматический кератит), и диабетическая ретинопатия. В дополнение к упомянутым выше заболеваниям, стволовые клетки и/или клеткипредшественники, используемые в регенеративной медицине при заболеваниях, которые способны лечиться с помощью активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников (то есть, регенерация поврежденного органа и/или поврежденной ткани), также являются целями активирующего средства настоящего изобретения. Кроме того, нет никаких специфических ограничений в распространенности заболевания, к которому применяется регенеративная медицина. Кроме того, активирующее средство настоящего изобретения способно действовать быстро и умеренно в зависимости от распространенности и степени повреждения органа и/или повреждения ткани, к которым применяется регенеративная медицина. Активирующее средство настоящего изобретения может предпочтительно применяться к стволовым клеткам и/или клеткам-предшественникам, присутствующим у пациентов с кожными заболеваниями, заболеваниями опорно-двигательного аппарата, эндокринными заболеваниями, заболеваниями органов дыхания, урологическими заболеваниями, желудочно-кишечными заболеваниями, офтальмологическими заболеваниями, заболеваниями черепных нервов, сердечно-сосудистыми заболеваниями и сосудистыми заболеваниями, и особенно предпочтительно применяться к стволовым клеткам и/или клеткампредшественникам, присутствующим у пациентов с заболеваниями черепных нервов, сердечнососудистыми заболеваниями, кожными заболеваниями и сосудистыми заболеваниями. Кроме того, активирующее средство настоящего изобретения имеет незначительное количество или не имеет побочных эффектов. Кроме того, активирующее средство настоящего изобретения способно демонстрировать продолжительные активирующие воздействия. Активирующее средство настоящего изобретения может состоять из одного тромбиноподобного фермента (например, только батроксобин) или одного или более тромбиноподобных ферментов и может состоять из комбинации тромбиноподобного фермента с одним или более любыми активными веществами кроме тромбиноподобных ферментов. Примеры других активных веществ включают факторы роста, такие как VEGF, EGF, FGF, PDGF,NGF и HGF, цитокины, такие как G-CSF, GM-CSF и ЕРО, и эстроген, липиды, статин (ингибитор кофермента А-редуктазы), антитело против фактора роста, ингибитор фактора роста, антитело против ингибитора фактора роста и антитело против цитокина (Takeyama К, Onto H: PBSC mobilization. Transfus ApherSci 31:233-243, 2004; Aicher A, Zeiher AM, Dimmeler S. Mobilizing endothelial progenitor cells. Hypertension 45:321-325, 2005). Любая композиция в Japanese Pharmacopoeia General Rules for Preparations может применяться для получения композиции активирующего средства настоящего изобретения. Примеры композиции активирующего средства настоящего изобретения включают инъекции для прямого применения внутрь тела(включая суспензии и эмульсии); мази (включая жирные мази, мази-эмульсии (кремы), водорастворимые мази и т.п.), лекарственные формы для ингаляций, растворы (включая глазные растворы, раствор для орошения полости носа и т.п.), свечи, пластыри, примочки, лосьоны и другие композиции для наружного применения; и внутренние композиции, включая таблетки (включая покрытые сахаром, пленкой и желатином), растворы, капсулы, гранулы, порошки (включая зерна), пилюли, сиропы, пастилки и т.п. Эти композиции могут быть приготовлены с помощью способов, описанных в Japanese Pharmacopoeia GeneralRules for Preparations. Кроме того, активирующее средство настоящего изобретения может также включать фармакологически приемлемые твердые или жидкие носители или инвазивные средства для терапии. Примеры фармакологически приемлемых твердых или жидких носителей включают растворители, стабилизаторы,консерванты, солюбилизирующие агенты, эмульгаторы, суспендирующие агенты, буферные агенты, изотонизирующие агенты, красящие агенты, основания, загустители, эксципиенты, лубриканты, связывающие агенты, дезинтегранты, средства для покрытия, корригенты и т.п. Конкретные примеры включают воду, лактозу, сахарозу, фруктозу, глюкозу, маннит, сорбитол и другие сахара и сахарные спирты, кристаллическую целлюлозу, метилцеллюлозу, этилцеллюзу, гидроксипропилцеллюлозу, низкозамещенную гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу,фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, сукцинат ацетата гидроксипропилметилцеллюлозы, кармелозу,кармелозу кальция, кармелозу натрия, кроскармелозу натрия, карбоксиметилэтилцеллюлозу, фталат ацетата целлюлозы и другие целлюлозы и родственные производные, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, декстрин, пептизированный крахмал, частично пеп-7 014296 тизированный крахмал, гидроксипропилированный крахмал, карбоксиметилированный крахмал натрия,циклодекстрин, пуллулан и другие крахмалы и родственные производные, агар, альгинат натрия, камедь,желатин, коллаген, шеллак, трагант, ксантановая камедь и другие природные полимеры (морские водоросли, растительная слизь, белки и т.п.), поливинилпирролидон, аминоалкил метакрилатный сополимер,сополимер метакриловой кислоты, карбоксивинил полимер, поливинилалкоголь, диметилполисилоксан и другие синтетические полимеры, оливковое масло, масло какао, карнаубский воск, говяжий жир, гидрогенизированное масло, соевое масло, кунжутное масло, масло камелии, парафин, жидкий парафин, желтый пчелиный воск, белый вазелин, кокосовое масло, микрокристаллический воск и другие масла и жиры, стеариновая кислота, стеарат алюминия, стеарат кальция, стеарат магния, триэтилцитрат, триацетин,триглицерид со среднецепочечными жирными кислотами, твердый жир, изопропилмиристат и другие жирные кислоты и их производные, глицерин, стеариловый спирт, цетанол, пропиленгликоль, макроголь и другие спирты и поливалентные спирты, оксид цинка, двухосновный фосфат кальция, осажденный карбонат кальция, синтетический силикат алюминия, диоксид кремния, каолин, высушенный гель гидроокиси алюминия, синтетический гидроталькит, оксид титана, тальк, бентонит, алюмометасиликат магния, алюмокалиевые квасцы, основный галловокислый висмут, субсалицилат висмута, лактат кальция,бикарбонат натрия и другие неорганические вещества и смеси солей металлов, жирнокислотные эфиры сахарозы, полиоксилстеарат, полиоксиэтилен, гидрогенизированное касторовое масло, полиоксипропилен полиоксиэтилен гликоль, сорбитансесквиолеат, сорбитантриолеат, сорбитанмоностеарат, сорбитанмонопальмитат, сорбитанмонолаурат, полисорбат, глицерилмоностеарат, лаурилсульфат натрия, лауромакроголь и другие поверхностно-активные вещества, красители, ароматизаторы и т.п. Примеры инвазивных средств для терапии включают стенты, искусственные кровеносные сосуды,катетер, баллон и т.п. Например, продукт активирующего средства настоящего изобретения может содержать следующие ингридиенты и любое количество в общем объеме 1 мл, как представлено в табл. 1. Таблица 1. Составы продукта батроксобина Вводимая доза активирующего средства настоящего изобретения варьирует в зависимости от веса пациента, характера заболевания и состояния, но составляет например от 0,1 до 50 единиц батроксобина(BU) батроксобина один раз в день, предпочтительно от 1 до 20 BU батроксобина один раз через день у взрослого. Единицей батроксобина, описанной здесь, является единица, представляющая активность фермента батроксобина и такую активность, что коагуляция плазмы происходит через 19,00,2 секунды, когда 0,1 мл раствора батроксобина добавляется к 0,3 мл стандартной человеческой плазмы, содержащей лимонную кислоту при температуре 37 С, что определяется как 2 BU. Активирующее средство настоящего изобретения может быть введено с помощью внутривенного капельного введения, внутривенной инъекции, внутриартериальной инъекции, внутримышечной инъекции, подкожной инъекции, внутрикожной инъекции, интракардиальной инъекции, интраперитонеальной инъекции, интратекальной инъекции, ректального введения, сублингвального введения, назального введения, чрескожного введения, ингаляционного или местного введения в поврежденный орган и/или ткань после надлежащего растворения батроксобина в физиологическом растворе. В большинстве случаев активирующее средство настоящего изобретения предпочтительно вводится в течение 1 ч или более после растворения в 100 мл или более физиологического раствора. Острая токсичность (LD50 (BU/кг батроксобина для мышей, крыс, кроликов и собак представлена в табл. 2 ниже. Исследования острой токсичности проводились с помощью внутривенного введения батроксобина согласно способам, описанным в литературе (Ozaki M et aU Toxicity of the defibrase, Defibrinogen Batroxobin (First Report), Pharmacometrics 25:339-346, 1983).-8 014296 Таблица 2 Острая токсичность батроксобина (i.v.) Активирующее средство настоящего изобретения применяется к животному, имеющему стволовую клетку и/или клетку-предшественника. Конкретные примеры животного включают человека, обезьяну,собаку, свинью, кошку, кролика, крысу и мышь. Среди них человек является предпочтительным. Хотя ниже предоставлено детальное разъяснение настоящего изобретения с помощью раскрывающих его примеров, настоящее изобретение не ограничено этими примерами. Пример 1. Воздействие батроксобина на активацию CD34-позитивных мононуклеарных клеток, полученных из пуповинной крови. В настоящем примере воздействие батроксобина на активацию CD34-позитивных мононуклеарных клеток, полученных из пуповинной крови оценивается in vitro. Кроме того, известно, что данные клетки, присутствующие в пуповинной крови, соответствующиеCD34-позитивным мононуклеарным клеткам, состоят из сосудистых ЕРС и мезенхимальных стволовых клеток (Murohara T et al.: Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J Clin Invest 105:1527-1536, 2000). Таким образом, оцениваемые в настоящем примереCD34-позитивные мононуклеарные клетки, полученные из пуповинной крови человека, могут считаться сосудистыми ЕРС и мезенхимальными стволовыми клетками. Экспериментальный метод:(1) Сбор мононуклеарных клеток пуповинной крови человека. Отбирали нормальные доношенные беременности, и 40-60 мл пуповинной крови забирали из пуповины и плаценты с использованием гепарина (20-30 Ед/мл) в качестве антикоагулянта. Забранную пуповинную кровь смешивали в отношении 5:1 с 6% гидроэтилкрахмалом (Becton Dickinson, NJ, USA) и оставляли на инкубацию в течение 30 мин с последующим удалением осажденных красных кровяных клеток. Затем жидкость верхнего слоя забирали и суспендировали в отношении 2:1 в раствор для отделения лимфоцитов (относительная плотность: 1,077, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China), и центрифугировали в течение 25 мин при 460 г. Мононуклеарные клетки в промежуточном клеточном слое забирали и дважды промывали в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) перед использованием в эксперименте.(2) Отделение и идентификация CD34-позитивных мононуклеарных клеток. Мононуклеарные клетки, полученные из пуповинной крови человека, полученные в экспериментальном методе (1) выше, суспендировали в PBS для приготовления клеточной суспензии с концентрацией 2106 клеток/мл. CD34-позитивные мононуклеарные клетки отделяли от мононуклеарных клеток,полученных из пуповинной крови человека, с использованием CD34-Positive Cell Monoclonal Iramunomagnetic Bead Separation Kit (MACS, Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Germany) в соответствии с инструкциями, предоставленными в комплекте. Качество получающихся CD34-позитивных мононуклеарных клеток оценивали с помощью проточной цитометрии (Becton Dickinson FACS Vantage, Becton(3) Тест миграции клеток. Этот тест выполняли с использованием модифицированной камеры Бойдена, состоящей из 24 ячеечного культурального планшета (Corning, NY, USA) и 5 мкм трансвелла (Corning, NY, USA). Модифицированная камера Бойдена разделена на два отделения с помощью поликарбонатного мембранного фильтра с размером пор 5 мкм (диаметр). Верхним отделением является пространство выше фильтра, и нижним отделением является промежуток между фильтром и ячейками. Шестьсот мкл каждой из различных концентраций батроксобина (0 (контрольная группа), 0,1 и 0,2BU/мл), приготовленные с использованием 0,25% BSA IMDM (Gibco, Los Angeles, USA), добавляли в нижнее отделение камеры Бойдена. Затем 100 мкл клеточной суспензии в концентрации 1105 клеток/млCD34-позитивных мононуклеарных клеток, полученных из пуповинной крови человека в среде IMDM,добавляли в верхнее отделение каждой камеры Бойдена. Эта система инкубировалась во влажной камере при 37 С в атмосфере 5% СО 2/95% воздуха в течение 6 ч при постоянном состоянии. После инкубации клетки в нижнем отделении, которые переместились через фильтр из верхнего отделения, определяли как мигрировавшие клетки. Мигрировавшие клетки собирали и подсчитывали количество с использованием проточной цитометрии. На основе полученного количества мигрировавших клеток вычисляли величины клеточной миграции для группы батроксобина 0,1 BU/мл и группы батроксобина 0,2 BU/мл, основываясь на значении-9 014296 100% для количества мигрировавших клеток контрольной группы. Величину клеточной миграции вычисляли как среднеестандартное отклонение (SD) (%), основываясь на данных, полученных в двух экспериментах, выполненных в трех повторностях при одинаковых условиях. Результаты и обсуждение Когда величина миграции CD34-позитивных клеток в контрольной группе (0 BU/мл) определялась как 100%, величина миграции в группе батроксобина 0,1 BU/мл составляла 149,376,82%, и в группе батроксобина 0,2 BU/мл составляла 254,2617,44%. А именно, и 0,1 и 0,2 BU/мл группы батроксобина показывали значительно более высокую величину миграции, чем контрольная группа. Эти результаты показывают, что батроксобин значительно активировал CD34-позитивные мононуклеарные клетки, полученные из пуповинной крови человека (то есть сосудистые ЕРС и мезенхимальные стволовые клетки). Считается, что активирующее воздействие батроксобина стимулирует миграцию сосудистых ЕРС и мезенхимальных стволовых клеток. Кроме того, хотя в настоящем примере в качестве источника CD34-позитивных мононуклеарных клеток использовалась пуповинная кровь, также известно, что CD34-позитивные мононуклеарные клетки присутствуют в периферической крови взрослого, костном мозге взрослого и эмбриональном костном мозге (Michejda M: Which stem cells should be used for transplantation Fetal Diagn Ther 19:2-8, 2004). Таким образом, батроксобин также может активировать CD34-позитивные мононуклеарные клетки, присутствующие помимо пуповинной крови в крови и костном мозге, таких как периферическая кровь взрослого, костный мозг взрослого, эмбриональный костный мозг и другой источник крови и так далее. Пример 2. Активация CD34-позитивных клеток, CD34-позитивных/CD31-позитивных клеток и VEкадгерин-позитивных клеток в периферической крови пациентов с тромбозом глубоких вен нижних конечностей, и воздействия батроксобина на функциональное восстановление пораженной ткани у пациентов с тромбозом глубоких вен нижних конечностей. В настоящем примере батроксобин вводили пациентам с тромбозом глубоких вен нижних конечностей (DVT нижних конечностей), разновидностью сосудистого заболевания, для оценки воздействий батроксобина на активацию CD34-позитивных клеток, CD34-позитивных/CD31-позитивных клеток иVE-кадгерин-позитивных клеток в периферической крови, и воздействий батроксобина на регенерацию сосудов, пораженных тромбами. Кроме того, известно, что те клетки, присутствующие в периферической крови, которые считаютсяCD34-позитивными мононуклеарными клетками, являются сосудистыми ЕРС и мезенхимальными стволовыми клетками (Zhao Y et al.: A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stemCD34-позитивные мононуклеарные клетки в периферической крови могут считаться сосудистыми ЕРС и мезенхимальными стволовыми клетками. Кроме того, известно, что эндотелиальные клетки-предшественники экспрессируют CD34 Michejda M: Which stem cells should be used for transplantation Fetal Diagn Ther 19:2-8, 2004; Fadini GP et al.:clinical relevance. J Cell Mol Med 8:498-508, 2004) в качестве маркеров. Более того, также известно, что сосудистые ЕРС, в которых дифференцировка прогрессирует и находящиеся в состоянии возможности адгезироваться к кровеносным сосудам, кроме того экспрессируют VE-кадгерин (Hristov M, Weber С:Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance. J Cell Mol Med 8:498-508, 2004). Таким образом, оцениваемые в настоящем примере CD34-позитивные/CD31 позитивные мононуклеарные клетки и VE-кадгерин-позитивные мононуклеарные клетки в периферической крови могут считаться сосудистыми ЕРС. Экспериментальный метод(1) Испытуемые субъекты. Субъекты состояли из пациентов с DVT нижних конечностей, 11 мужчин и 4 женщин в возрасте от 37 до 80 лет (средний возраст: 64 года). Цель клинического испытания объяснялась всем субъектам, и их согласие было получено перед проведением клинического испытания.(2) Способ введения. Батроксобин вводили пациентам с помощью внутривенного капельного введения в течение 14 дней подряд из расчета 10 BU/тело/день первоначально (в день госпитализации в случае, если пациента госпитализировали утром, или на следующий день после госпитализации в случае, если пациента госпитализировали во второй половине дня), и из расчета 5 BU/тело/день впоследствии.(3) Забор крови. Пять мл периферической крови забирали из срединной локтевой вены предплечья каждого пациента с использованием низкомолекулярного гепарина в качестве антикоагулянта перед введением (перед- 10014296 первоначальным введением) и на 7 и 14 день после введения. Забранную кровь немедленно помещали при 4 С и оценивали в течение 6 часов после сбора. Образцы крови забирались у всех 15 пациентов сDVT нижних конечностей перед введением и на 7 день после введения, и у 10 из 15 пациентов с DVT нижних конечностей на 14 день после введения.(4) Отделение мононуклеарных клеток периферической крови. Два с половиной мл раствора для отделения лимфоцитов (Ficoll, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China) добавляли к 5 мл крови, полученной в экспериментальном методе (3) выше для приготовления суспензии. После центрифунгирования суспензии при 460 g промежуточный слой клеток извлекали как мононуклеарные клетки, полученные из периферической крови. Общее количество получающихся мононуклеарных клеток составляло около 56106 клеток на пациента. Получающиеся мононуклеарные клетки суспендировались в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) для приготовления клеточной суспензии с концентрацией 2106 клетки/мл.CD34-позитивные мононуклеарные клетки выделяли с помощью иммунофлюоресцентной окраски с использованием проточной цитометрии. Двадцать мкл меченных фикоэритрином анти-CD34 антител(Becton Dickinson, NJ, USA) добавляли к 100 мкл суспензии мононуклеарных клеток, полученной в Экспериментальном методе (4) выше, и оставляли на инкубацию в течение 30 минут при 4 С и в условиях темноты. Затем CD34-позитивные мононуклеарные клетки выделяли и считали с помощью проточной цитометрии. Отношение (%) CD34-позитивных мононуклеарных клеток к мононуклеарным клеткам вычисляли согласно следующей формуле:CD34-позитивные мононуклеарные клетки(%)=(Количество CD34-позитивных мононуклеарных клеток/ общее количество мононуклеарных клеток)100CD34-позитивные/CD31-позитивные мононуклеарные клетки выделяли с помощью двойной иммунофлюоресцентной окраски с использованием проточной цитометрии. Двадцать мкл меченных фикоэритрином анти-CD34 антител (Becton Dickinson, NJ, USA) и 20 мкл FITC-меченных анти-CD31 антител(Becton Dickinson, NJ, USA) добавляли к 100 мкл суспензии мононуклеарных клеток, полученной в экспериментальном методе (4) выше, и оставляли на инкубацию в течение 30 мин при 4 С и в условиях темноты. Затем CD34-позитивные/CD31-позитивные мононуклеарные клетки выделяли и считали с помощью проточной цитометрии. Отношение (%) CD34-позитивных/CD31-позитивных мононуклеарных клеток к мононуклеарным клеткам вычисляли согласно следующей формуле:VE-кадгерин-позитивные мононуклеарные клетки выделяли с помощью иммунофлюоресцентной окраски с использованием проточной цитометрии. Двадцать мкл FITC-меченных анти-VE-кадгерин антител (Becton Dickinson, NJ, USA) добавляли к 100 мкл суспензии мононуклеарных клеток, полученной в экспериментальном методе (4) выше, и оставляли на инкубацию в течение 30 мин при 4 С и в условиях темноты. Затем VE-кадгерин-позитивные мононуклеарные клетки выделяли и считали с помощью проточной цитометрии. Отношение (%) VE-кадгерин-позитивных мононуклеарных клеток к мононуклеарным клеткам вычисляли согласно следующей формуле:(8) Измерение обхвата выше колена и ниже колена. Отек нижней конечности является типичным и объективным признаком DVT нижних конечностей. Поэтому степень отека нижней конечности оценивается, основываясь на обхвате нижней конечности в 20 см выше колена и в 15 см ниже колена, измеренном до и после введения батроксобина у 15 пациентов. Результаты и обсуждение(1) Активация CD34-позитивных мононуклеарных клеток. Таблица 3. Изменения CD34-позитивных мононуклеарных клеток в периферической крови пациентов с- 11014296 означает Р 0,05; иозначает Р 0,01 по сравнению со значением, полученным до введения, с использованием непараметрического теста для парных выборок. В результате введения батроксобина процент CD34-позитивных мононуклеарных клеток в периферической крови значительно увеличился по сравнению со значением до введения (табл. 3). Этот результат показывает, что батроксобин активировал CD34-позитивные мононуклеарные клетки (то есть, сосудистые ЕРС и мезенхимальные стволовые клетки) периферической крови у пациентов сDVT нижних конечностей. Считается, что активирующее воздействие батроксобина стимулирует пролиферацию и миграцию CD34-позитивных мононуклеарных клеток.(2) Активация CD34-позитивных/CD31-позитивных мононуклеарных клеток. Таблица 4. Изменения CD34-позитивных/CD31-позитивных мононуклеарных клеток в периферической крови пациентов с DVT нижних конечностей (среднееSD, %) означает Р 0,05; иозначает Р 0,01 по сравнению со значением, полученным до введения, с использованием непараметрического теста для парных выборок. В результате введения батроксобина процент CD34-позитивных/CD31-позитивных мононуклеарных клеток в периферической крови значительно увеличился по сравнению со значением до введения(табл. 4). Этот результат показывает, что батроксобин активировал CD34-позитивные/CD31-позитивные мононуклеарные клетки (то есть, сосудистые ЕРС и мезенхимальные стволовые клетки) периферической крови у пациентов с DVT нижних конечностей. Считается, что активирующее воздействие батроксобина стимулирует пролиферацию, миграцию и дифференцировку CD34-позитивных/CD31-позитивных мононуклеарных клеток.(3) Активация VE-кадгерин-позитивных клеток мононуклеарных клеток. Таблица 5. Изменения VE-кадгерин-позитивных мононуклеарных клеток в периферической крови пациентов с DVT нижних конечностей (среднее+SD, %) означает Р 0,05 по сравнению со значением, полученным до введения, с использованием непараметрического теста для парных выборок. В результате введения батроксобина процент VE-кадгерин-позитивных мононуклеарных клеток в периферической крови значительно увеличился по сравнению со значением до введения (табл. 5). Этот результат показывает, что батроксобин активировал VE-кадгерин-позитивные мононуклеарные клетки (то есть, сосудистые ЕРС) периферической крови у пациентов с DVT нижних конечностей. Считается, что активирующее воздействие батроксобина стимулирует пролиферацию, миграцию и дифференцировку VE-кадгерин-позитивных мононуклеарных клеток.(4) Положительная динамика симптомов отека при DVT нижних конечностей. Таблица 6. Изменения обхвата выше колена и ниже колена у пациентов с DVT нижних конечностей- 12014296 означает Р 0,01 по сравнению со значением, полученным до введения, с использованием теста Вилкоксона,означает Р 0,01 по сравнению со значением, полученным до введения, с использованиемt-теста для парных выборок. Степень отека нижней конечности оценивается, основываясь на обхвате нижней конечности в 20 см выше колена и в 15 см ниже колена. Обхват выше колена и ниже колена значительно уменьшился вследствие введения батроксобина (табл. 6). Этот результат показывает, что стволовые клетки и/или клетки-предшественники активируются с помощью введения батроксобина, который, как считается, стимулирует пролиферацию, миграцию и дифференцировку стволовых клеток, и/или клеток-предшественников, в результате чего пораженные сосуды восстанавливаются, и симптомы отека уменьшаются у пациентов с DVT нижних конечностей. Кроме того, когда уровень фибриногена в плазме анализируется как индикатор фармакологического действия батроксобина, выявляется, что уровень фибриногена значительно уменьшается на 7 и 14 день после введения батроксобина (данные не показаны). Это свидетельствует, что вводимый батроксобин очень хорошо действует in vivo. Кроме того, хотя параметры АРТТ, РТ и ТТ, которые служат индикаторами побочных эффектов(таких как кровотечение), проявляющихся во время введения препаратов, действующих на свертывание крови и системы фибринолиза (включая батроксобин), анализировали до введения, на 7 и 14 день после введения батроксобина, не было никаких существенных различий между до и после введения батроксобина (данные не показаны). Эти результаты свидетельствуют, что при введении батроксобина не возникают побочные эффекты. Пример 3. Воздействия батроксобина на активацию невральных стволовых клеток и/или невральных клеток-предшественников, и восстановление нервной функции в модели ишемии головного мозга/реперфузионного повреждения. В этом примере воздействия батроксобина на активацию невральных стволовых клеток и/или невральных клеток-предшественников и восстановление нервной функции оценивали с использованием модели ишемии головного мозга/реперфузионного повреждения у крыс. Экспериментальный метод.(1) Животные. Самцы крыс Sprague-Dawley в возрасте 12 недель и массой 250-280 г (Shanghai Animal Center, Chinese Academy of Medical Sciences, Shanghai, China) использовались в эксперименте после акклиматизации в течение 1 недели.(2) Создание модели ишемии головного мозга/реперфузионного повреждения. Сначала создали модель окклюзии средней мозговой артерии по способу Longa EZ et al. (Longa EZet al.: Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 20:84-91, 1989). Более конкретно, 0,36 г/кг 10% хлоралгидрата (Shencheng Chemical Co., Shanghai, China) вводили интраперитонеально крысам, которые голодали в течение 12 ч (хотя давался свободный доступ к воде) для обезболивания крыс. Затем в шее делался срединный разрез для выделения правой общей каротидной артерии. Когда внутреннюю каротидную артерию и наружную каротидную артерию отделяли, заднюю каротидную артерию, которая является ветвью наружной каротидной артерии, и верхнюю щитовидную артерию коагулировали и разъединяли, наружную каротидную артерию лигировали в месте ветвления на язычную артерию и верхнечелюстную артерию, в наружной каротидной артерии сформировывали маленький прокол, нейлоновую нить 4-0 пропускали в общую каротидную артерию через прокол и постепенно вводили во внутреннюю каротидную артерию до появления сопротивления. Длина нейлоновой нити составляла приблизительно 1820 мм от разветвления общей каротидной артерии. В результате закупорки средней мозговой артерии нейлоновой нитью, ишемическое состояние применяли в течение 2 ч для создания модели окклюзии средней мозговой артерии. Модель ишемии головного мозга/реперфузионного повреждения создавали с помощью удаления нейлоновой нити из средней мозговой артерии окклюзионной модели и дальнейшей реперфузии крови.(3) Введение батроксобина модельным крысам. Крысы были разделены на три группы и соответственно лечились таким образом как описанные ниже. 1) Группа имитации операции (75 крыс): вышеупомянутая процедура (2) выполнена у крыс только для отделения внутренней каротидной артерии и наружной каротидной артерии, последующие процедуры окклюзии средней мозговой артерии и реперфузии не выполняли. Крысам в этой группе вводили тот же самый объем физиологического раствора в качестве альтернативы батроксобина интраперитонеально в те же сроки введения, как обозначено в группе батроксобина. 2) Контрольная группа (75 крыс): этих животных использовали для создания модели ишемии головного мозга/реперфузионного повреждения. Модельным крысам в этой группе вводили тот же самый объем физиологического раствора в качестве альтернативы батроксобина интраперитонеально в те же сроки введения как обозначено в группе батроксобина. 3) Группа батроксобина (75 крыс): Эти животные использовались для создания модели ишемии головного мозга/реперфузионного повреждения, после которой препарат батроксобина, растворенный в- 13014296 физиологическом растворе, вводили интраперитонеально в дозе 20 BU/кг/10 мл через 30 мин после начала ишемии, и ишемию далее поддерживали в течение одного часа и 30 мин, затем следовала реперфузия с помощью удаления нейлоновой нити. Батроксобин также вводили интраперитонеально в дозе 20 Вu/кг/10 мл на 2, 4, 6 и 8 день после создания модели ишемии/реперфузионного повреждения.(4) Оценка показателя нервной функции. Показатели нервной функции оценивались один раз в день после создания модели ишемии/реперфузионного повреждения у 15 крыс в каждой группе. Показатели расстройств нервной функции оценивали с использованием следующих критериев согласно способу Longa EZ (Longa EZ et al.: Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 20:84-91, 1989). Результаты показывались как медиана. 0: Нормально. 1: Сгибание конечности на противоположной от очага инфаркта стороне. 2: Конечность на противоположной от очага инфаркта стороне приходит в астеническое состояние,когда хвост тянут назад. 3: Поворот к противоположной от очага инфаркта стороне, когда хвост тянут. 4: Самопроизвольные повороты к противоположной от очага инфаркта стороне. 5: Потеря самопроизвольного движения.(5) Анализ нестин-позитивных клеток. Десяти крысам из каждой группы проводили вскрытие на 7, 14 и 21 день после создания модели соответственно (общее количество животных составило 30 крыс из каждой группы). После препарирования образцов ткани невральные стволовые клетки подсчитывали под микроскопом. Более определенно, замороженные срезы мозга крысы готовили на 7, 14 и 21 день после создания модели, и присутствие нестин-позитивных клеток в субвентрикулярной зоне (SVZ) оценивали с помощью иммуногистохимической окраски с использованием маркера нестина, экспрессируемого на невральных стволовых клетках. Присутствие нестин-позитивных клеток анализировали с использованием мышиного анти-крысиного нестина моноклонального антитела (Chemicon, Temecula, USA).(6) Анализ BrdU-позитивных клеток и BrdU-позитивных/нестин-позитивных клеток. На 5, 6, 12, 13, 19 и 20 день после создания модели 50 мг/кг 5-бромдезоксиуридина (BrdU, CalBiochem, San Diego, USA) вводили интраперитонеально 30 крысам в каждой группе. Поскольку BrdU является аналогом тимидина, он может инкорпорироваться в ДНК клеток во время клеточной пролиферации(синтез ДНК). Таким образом, клеточная пролиферация может быть проанализирована с помощью обнаружения количества внутриклеточного BrdU. Крысам проводили вскрытие на 7, 14 и 21 день после создания модели для препарирования замороженных срезов мозга. Присутствие BrdU-позитивных клеток анализировали с помощью иммунохимической окраски и присутствие BrdU-позитивных/нестинпозитивных клеток с помощью двойной иммунофлюоресцентной окраски в области SVZ. Наличие BrdU-позитивных клеток анализировали с использованием мышиного анти-крысиногоBrdU моноклонального антитела (Oncogene, Westhaver, USA). Наличие BrdU-позитивных/нестин-позитивных клеток анализировали с помощью двойной иммунофлюоресцентной окраски с использованием комбинации первичного антитела козьего антикрысиногоBrdU поликлонального антитела (Biodesign, Saco, USA) и вторичного антитела FITC-меченного кроличьего антикозьего антитела (Pierce, Rockford, USA), и комбинации первичного антитела мышиного антикрысиного нестина моноклонального антитела и вторичного антитела Rho-меченного кроличьего антимышиного антитела (Pierce, Rockford, USA).(7) Анализ NeuN-позитивных клеток, GFAP-позитивных клеток, и BrdU-позитивных/GFAPпозитивных клеток. На 5, 6, 12, 13, 19 и 20 день после создания модели 50 мг/кг BrdU вводили интраперитонеально 30 крысам в каждой группе. Крысам проводили вскрытие на 7, 14 и 21 день после установления модели для препарирования замороженных срезов мозга. Наличие NeuN-позитивных клеток анализировали с помощью иммунохимической окраски, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP)-позитивных клеток с помощью иммунохимической окраски, и BrdU-позитивных/GFAP-позитивных клеток с помощью двойной иммунофлюоресцентной окраски в области SVZ. NeuN является маркером, экспрессирующимся на незрелых нейронах, которые дифференцируются из невральных стволовых клеток. GFAP является маркером, экспрессирующимся на астроцитах, которые также дифференцируются из невральных стволовых клеток. Наличие NeuN-позитивных клеток анализировали с использованием козьего анти-NeuN моноклонального антитела. Присутствие GFAP-позитивных клеток анализировали с использованием козьего анти-GFAP поликлонального антитела (Sigma, St. Louis, USA). Наличие BrdU-позитивных/GFAPпозитивных клеток анализировали с помощью двойной иммунофлюоресцентной окраски с использованием комбинации первичного антитела мышиного анти-крысиного BrdU моноклонального антитела(Pierce, Rockford, USA), и комбинации первичного антитела козьего анти-GFAP поликлонального антитела и вторичного антитела FITC-меченного кроличьего антикозьего антитела.(8) Анализ BrdU-позитивных (мигрирующих) клеток. Тридцати крысам в каждой группе дважды интраперитонеально вводили 50 мг/кг BrdU не позднее 24 часов после создания модели. Крысам проводили вскрытие на 7, 14 и 21 день после создания модели для препарирования замороженных срезов мозга. Наличие BrdU-позитивных клеток в области SVZ анализировали с помощью иммунохимической окраски с использованием мышиного анти-крысиного BrdU моноклонального антитела. Результаты и обсуждение(1) Оценка нервной функции. Показатели регистрировали каждый день после создания модели ишемии/реперфузионного повреждения до 21 дня окончания эксперимента. Таблица 7. Изменения показателей нервной функции со временем (n=15, медиана) означает Р 0,05 по сравнению с контрольной группой, означает Р 0,05 по сравнению с 1 днем каждой группы с использованием теста КрускалУоллиса. В группе имитации операции расстройства нервной функции не наблюдались. В других двух группах существенное восстановление нервной функции наблюдалось на 21 день по сравнению с нервной функцией в 1 день после создания модели (Р 0,05). Наблюдалось, что в группе батроксобина восстановление нервной функции встречалось раньше,чем в контрольной группе. Существенное восстановление нервной функции наблюдалось в группе батроксобина особенно на 7, 8, 9 и 16 день после создания модели по сравнению с контрольной группой. Этот результат свидетельствует, что батроксобин активировал невральные стволовые клетки и/или невральные клетки-предшественники, в результате чего участвовал в положительной динамике расстройств нервной функции. Считается, что активирующее воздействие батроксобина стимулирует пролиферацию, миграцию и дифференцировку невральных стволовых клеток и/или невральных клетокпредшественников.(2) Демонстрация наличия невральных стволовых клеток. Таблица 8. Количества нестин-позитивных клеток в области SVZ (среднееSD, количество клеток/мм 2)- 15014296 означает, что Р 0,01 по сравнению с группой имитации операции,означает Р 0,05 по сравнению с контрольной группой в тот же самый день, с использованием теста Вилкоксона. Согласно данным, представленным в табл. 8, относительное значение (%) количества нестинпозитивных клеток в группе батроксобина вычисляли, основываясь на значении 100% для контрольной группы с использованием следующей формулы:BRt (%) - процент нестин-позитивных клеток в группе батроксобина во время t;Bt - среднее количество нестин-позитивных клеток в группе батроксобина во время t;St - среднее количество нестин-позитивных клеток в группе имитации операции во время t;Mt - среднее количество нестин-позитивных клеток в контрольной группе во время t.t - 7 день, 14 день или 21 день. Результаты представлены на фиг. 1. По сравнению с группой имитации операции количество нестин-позитивных клеток увеличилось в контрольной группе (нестин является маркером невральных стволовых клеток) (табл. 8). Считается, что это относится к компенсаторной реакции, вызванной с помощью стимуляции ишемии головного мозга/реперфузионного повреждения у животных. С другой стороны, количества нестин-позитивных клеток увеличились в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой на 7, 14 и 21 день после создания модели (табл. 8, фиг. 1). Эти результаты свидетельствуют, что батроксобин активировал нестин-позитивные клетки (то есть, невральные стволовые клетки). Считается, что активирующее воздействие батроксобина стимулирует пролиферацию и миграцию невральных стволовых клеток. Кроме того, хотя батроксобин не вводили с 9 дня после создания модели, количества нестинпозитивных клеток значительно увеличились в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой на 21 день после создания модели (фиг. 1). Этот результат свидетельствует, что батроксобин оказывает продолжительное активирующее воздействие на невральные стволовые клетки.(3) Демонстрация наличия пролиферирующих невральных стволовых клеток и их способности к ауторепликации. 1) Демонстрация наличия пролиферирующих невральных стволовых клеток. Наличие пролиферирующих нестин-позитивных/BrdU-позитивных клеток (то есть, невральных стволовых клеток) подтверждали с помощью двойной иммунофлюоресцентной окраски в области SVZ в группе батроксобина (данные не показаны). Это свидетельствует о наличии пролиферирующих невральных стволовых клеток в группе батроксобина. 2) Демонстрация способности к ауторепликации невральных стволовых клеток. Таблица 9. Количества BrdU-позитивных клеток в области SVZ (среднееSD, количество клеток/мм 2) означает Р 0,01 по сравнению с группой имитации операции,означает Р 0,01 по сравнению с контрольной группой в тот же самый день, с использованием теста Вилкоксона. Согласно данным, представленным в табл. 9, относительное значение (%) количества BrdUпозитивных клеток в группе батроксобина вычисляли, основываясь на значении 100% для контрольной группы с использованием следующей формулы:BRt(%)=(Bt-St)/(Mt-St)100,BRt(%) - процент BrdU-позитивных клеток в группе батроксобина во время t,Bt - среднее количество BrdU-позитивных клеток в группе батроксобина во время t,St - среднее количество BrdU-позитивных клеток в группе имитации операции во время t,Mt - среднее количество BrdU-позитивных клеток в контрольной группе во время t,t - 7 день, 14 день или 21 день. Результаты представлены на фиг. 2. По сравнению с группой имитации операции, количество BrdUпозитивных клеток увеличилось в контрольной группе (BrdU является маркером пролиферирующих клеток) (табл. 9). Считается, что это относится к компенсаторной реакции, вызванной с помощью стимуляции ишемии головного мозга/реперфузионного повреждения у животных. С другой стороны, количества BrdU-позитивных клеток увеличились в группе батроксобина по- 16014296 сравнению с контрольной группой на 7, 14 и 21 день после создания модели (табл. 9, фиг. 2).BrdU-позитивные клетки, присутствующие в мозговой ткани, состоят только из невральных стволовых клеток и невральных клеток-предшественников, которые являются способными к инкорпорированию BrdU, основанному на их способности к ауторепликации. Таким образом, эти результаты свидетельствуют, что батроксобин активировал невральные стволовые клетки и/или невральные клеткипредшественники. Считается, что активирующее воздействие батроксобина стимулирует пролиферацию и миграцию невральных стволовых клеток и/или невральных клеток-предшественников. Кроме того, хотя батроксобин не вводили с 9 дня после создания модели, количества BrdUпозитивных клеток значительно увеличились в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой на 21 день после создания модели (фиг. 2). Это свидетельствует, что батроксобин оказывает продолжительное активирующее воздействие на невральные стволовые клетки и/или невральные клеткипредшественники.(4) Демонстрация наличия незрелых нейронов, астроцитов, дифференцированных из невральных стволовых клеток, и увеличения количества астроцитов. 1) Демонстрация наличия незрелых нейронов. Наличие NeuN-позитивных клеток подтверждали в группе батроксобина (данные не показаны).NeuN является маркером, экспрессирующимся на незрелых нейронах, которые дифференцируются из невральных стволовых клеток. Таким образом, этот результат свидетельствует, что незрелые нейроны,дифференцированные из невральных стволовых клеток, присутствуют в группе батроксобина. 2) Демонстрация наличия астроцитов, дифференцированных из невральных стволовых клеток. Наличие BrdU-позитивных/GFAP-позитивных клеток подтверждали с использованием двойной иммунофлюоресцентной окраски в области SVZ в группе батроксобина (данные не показаны). GFAP является маркером, экспрессирующимся на астроцитах, которые дифференцируются из невральных стволовых клеток. Таким образом, этот результат свидетельствует, что астроциты, дифференцированные из невральных стволовых клеток, присутствуют в группе батроксобина. Однако астроциты являются дифференцированными клетками в нервных тканях, почему BrdU инкорпорировался в них Считается, что обнаруженный BrdU инкорпорировался в клетки, когда они были в состоянии стволовых клеток и/или клеток-предшественников до дифференциации в астроциты, и постоянно в них присутствовал. 3) Демонстрация наличия увеличения количества астроцитов. Таблица 10. Количества GFAP-позитивных клеток в области SVZ (среднее+SD, количество клеток/мм 2) означает, что Р 0,01 по сравнению с группой имитации операции,означает Р 0,05 по сравнению с контрольной группой в тот же самый день, с использованием теста Вилкоксона. Согласно данным, представленным в табл. 10, относительное значение (%) количества GFAPпозитивных клеток в группе батроксобина вычисляли, основываясь на значении 100% для контрольной группы с использованием следующей формулы:BRt(%)=(Bt-St)/(Mt-St)100,BRt(%) - процент GFAP-позитивных клеток в группе батроксобина во время t;Bt - Среднее количество GFAP-позитивных клеток в группе батроксобина во время t;St - Среднее количество GFAP-позитивных клеток в группе имитации операции во время t;Mt - Среднее количество GFAP-позитивных клеток в контрольной группе во время t;T - 7 день, 14 день или 21 день. Результаты представлены на фиг. 3. По сравнению с группой имитации операции количествоGFAP-позитивных клеток увеличилось в контрольной группе (GFAP является маркером для астроцитов,дифференцированных из невральных стволовых клеток) (табл. 10). Считается, что это относится к компенсаторной реакции, вызванной с помощью стимуляции ишемии головного мозга/реперфузионного повреждения у животных. С другой стороны, количества GFAP-позитивных клеток увеличились в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой на 7, 14 и 21 день после создания модели (табл. 10, фиг. 3). Эти результаты свидетельствуют, что батроксобин активировал GFAP-позитивные клетки (то есть,невральные стволовые клетки и/или невральные клетки-предшественники). Считается, что активирующее воздействие батроксобина стимулирует пролиферацию, дифференцировку и миграцию невральных стволовых клеток и/или невральных клеток-предшественников и особенно стимулирует дифференцировку вышеупомянутых клеток в астроциты. Кроме того, хотя батроксобин не вводили с 9 дня после создания модели, количества GFAPпозитивных клеток увеличилось в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой на 21 день- 17014296 после создания модели (фиг. 3). Этот результат свидетельствует, что батроксобин оказывает продолжительное активирующее воздействие на невральные стволовые клетки и/или невральные клеткипредшественники для их дифференцировки в астроциты.(5) Демонстрация наличия мигрирующих клеток. Таблица 11. Количества BrdU-позитивных клеток в области SVZ (среднееSD, количество клеток/мм 2) означает Р 0,01 по сравнению с группой имитации операции,означает Р 0,05 по сравнению с контрольной группой в тот же самый день, с использованием теста Вилкоксона. Согласно данным в табл. 11 относительное значение (%) количества BrdU-позитивных клеток в группе батроксобина вычисляли, основываясь на значении 100% для контрольной группы с использованием следующей формулы:BRt(%)=(Bt-St)/(Mt-St)100,BRt(%) - процент BrdU-позитивных клеток в группе батроксобина во время t;Bt - Среднее количество BrdU-позитивных клеток в группе батроксобина во время t;St - Среднее количество BrdU-позитивных клеток в группе имитации операции во время t;Mt - Среднее количество BrdU-позитивных клеток в контрольной группе во время t;T - 7 день, 14 день или 21 день. Результаты представлены на фиг. 4. В этом эксперименте BrdU вводили интраперитонеально только дважды в течение 24 ч после создания модели, и, так как BrdU не вводили после этого времени, BrdUпозитивные клетки, проанализированные на 7, 14 и 21 день после создания модели, являются BrdUпозитивными клетками, присутствовавшими во время введения BrdU. Таким образом, увеличения количеств BrdU-позитивных клеток, проанализированные в области SVZ на 7, 14 и 21 день после создания модели, отражают количество BrdU-позитивных клеток, которые мигрировали в область SVZ. Более того, BrdU-позитивные клетки в области SVZ состоят только из невральных стволовых клеток и невральных клеток-предшественников, способных к инкорпорированию BrdU, основанному на способности к ауторепликации. На основе вышеупомянутого, таблица 11 и фиг. 4 свидетельствуют о миграционном статусе невральных стволовых клеток и невральных клеток-предшественников в области SVZ. По сравнению с группой имитации операции количество BrdU-позитивных клеток в контрольной группе увеличилось (табл. 11). Считается, что это относится к компенсаторной реакции, вызванной стимуляцией ишемии головного мозга/реперфузионного повреждения у животных. С другой стороны, количества BrdU-позитивных клеток увеличились в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой на 7, 14 и 21 день после создания модели (табл. 11, фиг. 4). Это свидетельствует, что количество невральных стволовых клеток и/или невральных клеток-предшественников,мигрировавших к области SVZ в группе батроксобина, было больше, чем в контрольной группе. Эти результаты свидетельствуют, что батроксобин активировал невральные стволовые клетки и/или невральные клетки-предшественники. Считается, что активирующее воздействие батроксобина стимулирует миграцию невральных стволовых клеток и/или невральных клеток-предшественников. Кроме того, хотя батроксобин не вводили с 9 дня после создания модели, количества BrdUпозитивных клеток увеличились в группе батроксобина по сравнению с контрольной группой даже на 21 день после создания модели (фиг. 4). Этот результат свидетельствует, что батроксобин оказывает продолжительное активирующее воздействие на миграцию невральных стволовых клеток и/или невральных клеток-предшественников. Кроме того, распределение BrdU-позитивных клеток в области SVZ сравнивали между контрольной группой и группой батроксобина с помощью иммунохимической окраски. В контрольной группе BrdUпозитивные клетки были распределены только на поверхности области SVZ (левая сторона фиг. 5), но в группе батроксобина BrdU-позитивные клетки были широко распределены от поверхности до внутренней части области SVZ (правая сторона фиг. 5). Это свидетельствует, что невральные стволовые клетки и/или невральные клетки-предшественники мигрировали от поверхности к внутренней части областиSVZ в результате введения батроксобина, а именно батроксобин стимулировал миграцию невральных стволовых клеток и/или невральных клеток-предшественников мозговой ткани in situ. Эти результаты примера 3 ясно свидетельствуют, что батроксобин оказывает продолжительные активирующие воздействия на невральные стволовые клетки и/или невральные клетки-предшественники.- 18014296 Считается, что активирующее воздействие батроксобина стимулирует пролиферацию, миграцию и дифференцировку невральных стволовых клеток и/или невральных клеток-предшественников. Промышленная применимость Как описано в примерах выше, активирующее средство настоящего изобретения способно к активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников. Таким образом, настоящее изобретение может успешно использоваться в регенеративной медицине, и особенно в регенеративной медицине, использующей саморегенерацию. Так как регенеративная медицина, использующая саморегенерацию, выполняемую с использованием активирующего средства настоящего изобретения, использует стволовые клетки и/или клеткипредшественники, присутствующие в теле пациента, нет необходимости вводить клетки не из тела пациента. Таким образом, тяжесть для пациента является меньшей, и также отсутствует риск, такой как инфекция, возникающая во время имплантации клетки, в результате регенеративная медицина, использующая саморегенерацию, превосходит регенеративную медицину, в которой вводятся клетки не из тела пациента. Кроме того, в регенеративной медицине, использующей саморегенерацию, выполняемую с использованием активирующего средства настоящего изобретения, активация стволовых клеток и/или клетокпредшественников происходит определенно на пораженном участке (то есть, поврежденных органах и/или тканях) у пациента, и эта регенерация происходит только в зависимости от требуемой степени. Таким образом, регенеративная медицина, использующая саморегенерацию, не имеет никакого риска возникновения осложнений, вызванных избыточной регенерацией и/или избыточным восстановлением вследствие имплантации клетки как основного способа традиционной регенеративной медицины, в которой вводятся клетки не из тела пациента. Более того, активирующее средство настоящего изобретения, включающее тромбиноподобный фермент, имеет незначительное число или не имеет побочных эффектов, может действовать быстро и умеренно в зависимости от распространенности и степени повреждения органов и/или тканей, к которым применяется регенеративная медицина, и оказывает продолжительные активирующие воздействия. Таким образом, оно может успешно использоваться в регенеративной медицине. Поэтому настоящее изобретение может использоваться в регенеративной медицине, и особенно в регенеративной медицине, использующей саморегенерацию, с высокой степенью применимости. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Средство, активирующее стволовые клетки и/или клетки-предшественники у животных, включающее эффективное количество тромбиноподобного фермента, где тромбиноподобный фермент является батроксобином, а стволовые клетки выбраны из группы состоящей из невральных стволовых клеток,эмбриональных стволовых клеток, эмбриональных зародышевых клеток, соматических стволовых клеток, гемангиобластов, гемопоэтических стволовых клеток, мезенхимальных стволовых клеток, стволовых клеток остеоцитов, стволовых клеток хондроцитов, стволовых клеток миоцитов, стволовых клеток сердечных миоцитов, стволовых клеток сухожильных клеток, стволовых клеток адипоцитов, стволовых клеток панкреоцитов, стволовых клеток гепатоцитов и стволовых клеток нефроцитов. 2. Средство по п.1, которое дополнительно включает одно или более активных веществ, отличных от тромбиноподобного фермента. 3. Средство по п.2, в котором активное вещество, отличное от тромбиноподобного фермента, выбрано из группы, состоящей из факторов роста, цитокинов, эстрогенов, липидов, статинов, антител против фактора роста, ингибиторов фактора роста, антител против ингибитора фактора роста и антител против цитокина. 4. Средство по п.3, в котором активное вещество, отличное от тромбиноподобного фермента, выбрано из группы, состоящей из цитокинов, эстрогенов и статинов. 5. Средство по п.1, в котором стволовые клетки и/или клетки-предшественники являются клетками,применяющимися в регенеративной медицине. 6. Средство по п.1, в котором стволовые клетки и/или клетки-предшественники являются клетками,применяющимися в регенеративной медицине, использующей саморегенерацию. 7. Средство по п.6, в котором клетки, применяющиеся в регенеративной медицине являются стволовыми клетками и/или клетками-предшественниками, встречающимися у животных с заболеванием,выбранным из группы, состоящей из кожных заболеваний, заболеваний черепных нервов, сердечнососудистых заболеваний, желудочно-кишечных заболеваний, заболеваний органов дыхания, урологических заболеваний, заболеваний опорно-двигательного аппарата, сосудистых заболеваний, эндокринных заболеваний и офтальмологических заболеваний. 8. Средство по п.6, в котором клетки, применяющиеся в регенеративной медицине, являются стволовыми клетками и/или клетками-предшественниками, встречающимися у животных с заболеванием,выбранным из группы, состоящей из заболеваний черепных нервов, сердечно-сосудистых заболеваний,кожных заболеваний и сосудистых заболеваний.- 19014296 9. Средство по п.1, в котором стволовые клетки и/или клетки-предшественники являются клетками,выбранными из группы, состоящей из резидентных клеток, клеток, полученных из костного мозга, и клеток, полученных из крови. 10. Средство по п.1, в котором активация стволовых клеток и/или клеток-предшественников выбрана из группы, состоящей из стимуляции пролиферации, стимуляции миграции и стимуляции дифференцировки стволовых клеток и/или клеток-предшественников. 11. Средство по п.1, в котором стволовые клетки и/или клетки-предшественники являются мезенхимальными стволовыми клетками и/или сосудистыми эндотелиальными клетками-предшественниками,и активация стволовых клеток и/или клеток-предшественников выбрана из группы, состоящей из стимуляции пролиферации, стимуляции миграции и стимуляции дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток и/или сосудистых эндотелиальных клеток-предшественников. 12. Средство по п.1, в котором стволовые клетки и/или клетки-предшественники являются клетками, применяющимися в регенеративной медицине для лечения тромбоза глубоких вен нижних конечностей. 13. Средство по п.12, в котором клетки, применяющиеся в регенеративной медицине, являются мезенхимальными стволовыми клетками и/или сосудистыми эндотелиальными клетками-предшественниками, и активация стволовых клеток и/или клеток-предшественников выбрана из группы, состоящей из стимуляции пролиферации, стимуляции миграции и стимуляции дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток и/или сосудистых эндотелиальных клеток-предшественников. 14. Средство по п.1, в котором стволовые клетки и/или клетки-предшественники являются клетками, применяющимися в регенеративной медицине для лечения ишемических церебрально-васкулярных заболеваний. 15. Средство по п.1, в котором стволовые клетки и/или клетки-предшественники являются клетками, применяющимися в регенеративной медицине для лечения ишемии головного мозга/реперфузионных повреждений. 16. Средство по п.14 или 15, в котором клетки, применяющиеся в регенеративной медицине, являются невральными стволовыми клетками и/или невральными клетками-предшественниками, и активация стволовых клеток и/или клеток-предшественников выбрана из группы, состоящей из стимуляции пролиферации, стимуляции миграции и стимуляции дифференцировки невральных стволовых клеток и/или невральных клеток-предшественников. 17. Средство по п.1, в котором животное является человеком. 18. Средство для активации мезенхимальных стволовых клеток и/или сосудистых эндотелиальных клеток-предшественников и/или невральных клеток-предшественников у человека, включающее эффективное количество батроксобина.