Способы лечения женщин в постклимактерическом состоянии с применением ультранизких доз эстрогена

1 Предпосылки создания изобретения Содержание эндогенных эстрогенов резко снижается после естественной или хирургической менопаузы и это снижение приводит к значительному возрастанию потери костной ткани и опасности последующих переломов. Эндогенные эстрогены очень важны для поддержания здоровой скелетной системы у молодых женщин. Однако значение эндогенных эстрогенов для женщин старшего возраста менее выражено. Ранее было установлено, что содержание эндогенного эстрогена у женщин старше 65 лет не связано с возможностью переломов тазобедренного сустава и позвоночника. S.R. Cummingset.al., J. Bone Min. Res. 10 (Suppl. I): S174 (1995). Однако эстрадиол является более сильнодействующим эстрогеном, чем эстрон, и изучение его связи с переломами не привело ни к какому заключению. Содержание эстрадиола в сыворотке у женщин до менопаузы в среднем составляет более 100 пг/мл. Содержание эстрадиола в сыворотке у женщин в постклимактерическом состоянии, которых не подвергали гормональной терапии, уменьшается и составляет менее 20 пг/мл и до 30-50% женщин в постклимактерическом состоянии характеризуются таким содержанием эстрадиола в сыворотке, которое не определяется обычными методами анализа (то есть менее 5 пг/мл). Обычное лечение женщин в постклимактерическом состоянии заключается в восполнении эстрогена в дозах, обеспечивающих его содержание в сыворотке, превышающее 40-60 пг/мл. Обычные методы восполнения гормонов оказались пригодными для лечения физических состояний, возникающих вследствие уменьшения содержания эстрогена в постклимактерическом состоянии, включая снижение потерь костной ткани или даже увеличение плотности костной ткани и уменьшение риска перелома костей. Однако исследования показали, что лечение методом восполнения гормонов может быть связано с повышенным риском возникновения рака груди и эндометрического рака, а также возникновения сгустков крови и маточного кровотечения. Соответственно, продолжает оставаться необходимость в разработке способов лечения физических состояний, возникающих вследствие уменьшения содержания или дефицита эстрогена в постклимактерическом состоянии. Остается также необходимость в способах лечения таких состояний при уменьшении побочных эффектов терапии восполнения гормонов. Сущность изобретения Согласно первому аспекту изобретение предусматривает метод лечения физических состояний, являющихся следствием снижения содержания эстрогена у субъекта в постклимактерическом состоянии. Этот способ включает введение субъекту такого количества эстрогена,которое эффективно для обеспечения содержа 004573 2 ния эстрогена в сыворотке в интервале между примерно 5 пм/мл и примерно 15 пм/мл. Согласно второму аспекту данное изобретение предусматривает способ уменьшения риска возникновения остеопорозных переломов костей у субъекта, пораженного постклимактерическим остеопорозом или восприимчивого к нему. Способ включает введение субъекту такого количества эстрогена, которое эффективно для обеспечения содержания эстрогена в сыворотке в интервале между примерно 5 пм/мл и примерно 15 пм/мл. Согласно третьему аспекту данное изобретение предусматривает набор для потребителя,пораженного или восприимчивого к физическим состояниям, вызванным снижением содержания эстрогена в постклимактерическом периоде. Набор включает а) трансдермальный пластырь,пригодный для трансдермального введения эстрогена в количестве менее 20 мкг в день и б) инструкции, описывающие метод применения трансдермального пластыря для уменьшения риска перелома костей у потребителя. Согласно четвертому аспекту данное изобретение предусматривает другой способ лечения физических состояний, обусловленных постклимактерическим снижением эстрогена в постклимактерическом периоде. Этот способ включает введение менее 20 мг эстрогена в день в отсутствие экзогенного прогестина. Согласно пятому аспекту изобретение предусматривает другой способ уменьшения риска остеопорозного перелома костей у субъекта,страдающего от остеопороза или восприимчивого к нему. Этот способ включает введение менее 20 мг эстрогена в день в отсутствие экзогенного прогестина. Эти и другие аспекты данного изобретения описаны ниже в описании предпочтительного варианта, в примерах и проиллюстрированы нижеследующими фигурами. Краткое описание рисунков На фиг. 1 показано поперечное сечение одного вида трансдермального пластыря, который может быть использован в способах по изобретению. На фиг. 2 представлено поперечное сечение другого типа трансдермального пластыря, который можно использовать в способах по изобретению. Описание предпочтительной формы осуществления изобретения Все технические и научные термины, используемые ниже, имеют свое обычное значение, если не оговорено иное. Эти термины имеют следующие значения. "Физические состояния, возникающие вследствие постклимактерического снижения содержания эстрогена" относится к физическим состояниям, обычным для женщин в постклимактерическом периоде, которые вызваны, по меньшей мере, частично,уменьшением содержания эстрогена в организме. Эти состояния включают, но не ограничи 3 ваются, остеопороз, головные боли, тошноту,депрессию, приливы, уменьшение плотности костной ткани и повышенный риск перелома костей или перелома костей, включая переломы тазобедренного сустава и/или позвоночника. Термин "субъект в постклимактерическом периоде" относится к женщинам, у которых уже наступила менопауза. Субъекты, пораженные постклимактерическими симптомами, включают женщин после менопаузы, у которых проявляются любые из вышеописанных симптомов после менопаузы, особенно женщин после менопаузы, у которых наблюдается уменьшенная плотность костной ткани в позвоночнике, тазобедренном суставе или другом месте, или у которых произошел перелом позвоночника или тазобедренного сустава. Субъекты, восприимчивые к физическим состояниям, возникающим вследствие уменьшения содержания эстрогена,включают женщин, у которых приближается наступление менопаузы и у которых наблюдается снижение содержания эстрадиола в сыворотке, но у которых еще не проявились физические состояния, вызванные постклимактерическим снижением содержания эстрогена. Субъекты, у которых наблюдается пониженное содержание эстрадиола в сыворотке, включают субъектов, у которых содержание эстрадиола в сыворотке равно или менее 20 пм/мл, включая субъектов, у которых не обнаруживается в сыворотке эстрадиол. Для целей данного изобретения содержание половых гормонов, включая содержание эстрадиола в сыворотке, измеряют радиоиммунологическим методом после экстракции и разделения на колонке. Нижний предел обнаруживаемого содержания эстрадиола составляет 5 пм/мл. Термин "остеопорозные переломы костей" относится к переломам костей, обычно к перелому позвоночника или тазобедренного сустава, основной причиной которого был остеопороз. Способы по изобретению пригодны для лечения субъектов в постклимактерическом периоде, особенно субъектов, пораженных постклимактерическими заболеваниями вышеуказанного типа или восприимчивых к ним. Способы по изобретению включают введение эстрогена в количестве, которое является эффективным для обеспечения желательного содержания эстрадиола в сыворотке данного субъекта. Используемое выражение "лечение физических состояний" означает снятие или снижение серьезности или возможности возникновения таких физических состояний у субъекта, находящегося в таком состоянии, а также профилактику возникновения постклимактерических физических состояний у субъекта, восприимчивого к таким состояниям вследствие снижения содержания эстрогена в постклимактерическом периоде. Хотя лечение этих постклимактерических физических состояний может включать полное устранение таких состояний у больного 4 субъекта, но смысл вышеуказанного выражения вовсе не означает полное устранение состояния. Таким образом, данное изобретение предусматривает применение ультранизких доз эстрогена для лечения физических состояний, возникающих вследствие уменьшения содержания эстрогена и для уменьшения риска остеопорозных переломов костей у субъекта, страдающего от постклимактерического остеопороза или восприимчивого к нему. Способы по изобретению могут также включать дополнительную стадию определения содержания эстрадиола в сыворотке у субъекта в постклимактерическом периоде, подвергающегося лечению, и констатацию того факта, что содержание эстрадиола в сыворотке у субъекта,подвергающегося лечению, является нормальным для женщин той же возрастной группы,находящихся в постклимактерическом состоянии, что и данный субъект. Другими словами,способы согласно данному изобретению не предусматриваются для лечения женщин, имеющих содержание эстрадиола в сыворотке меньше,чем в среднем у женщин той же возрастной группы в постклимактерическом периоде. Способы по изобретению могут быть использованы для лечения субъектов в постклимактерическом состоянии, у которых содержание сывороточного эстрадиола является нормальным для женщин той же возрастной группы, находящихся в постклимактерическом состоянии. Используемый здесь термин "нормальное содержание сывороточного эстрадиола" означает содержание сывороточного эстрадиола, сравнительно близкое к среднему уровню сывороточного эстрадиола у женщин той же возрастной группы. Авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что уменьшение плотности костной ткани не является единственным фактором, приводящим к увеличению риска остеопорозного перелома костей у субъектов, страдающих от постклимактерического остеопороза. Низкие уровни сывороточного эстрадиола, а именно,менее 5 пг/мл, особенно сопровождаемые содержанием полового гормона, связывающего глобулина (SHBG), равным 1 мкг/дл и более,значительно повышают риск переломов позвоночника и тазобедренного сустава. Кроме того,низкое содержание сывороточного 1,25(ОН)2 витамина D также увеличивает риск переломов тазобедренного сустава. Метод оценки риска остеопорозных переломов костей включает использование логистических моделей, разработанных SAS Institute, Cary, North Carolina, для анализа связи между прогностическими факторами и переломами позвоночника, и моделей пропорционального риска, которые учитывают схему отбора проб "случай - контингент" для анализа связи между прогностическими факторами и переломами тазобедренных суставов. Анализы предназначены для базисных возрастов и весов тела, и данные получают в виде ве 5 личин относительного риска с 95% вероятностью. Пропорция переломов, связанных с различным содержанием гормонов, подсчитывается по методу, описанному W.S. Browner, American Journal of Epidemiology, 123:143 (1986). Этот источник включен в качестве ссылки. Выражение "снижение риска остеопорозного перелома костей" означает, что степень риска, измеренная вышеуказанными методами, у данного субъекта,подвергающегося лечению способами по изобретению, меньше, чем у того же субъекта до лечения этими способами по изобретению. Таким образом, риск остеопорозных переломов костей для субъекта, подвергающегося лечению способами по изобретению, меньше, чем у субъекта в постклимактерическом состоянии,пораженного остеопорозом или склонного к нему, не подвергавшегося этому лечению. Авторы данного изобретения также установили неожиданно, что лечение физических состояний, вызванных уменьшением содержания эстрогена, может осуществляться при применении ультранизких доз эстрогена без введения прогестина. Авторы данного изобретения установили, что введение эстрогена в отсутствии прогестина является эффективным для лечения женщин в постклимактерическом состоянии, у которых есть матка и яичники. Известные терапевтические методы восполнения гормонов были основаны на совместном введении прогестина для эффективного лечения женщин, которые не подвергались гистерэктомии и овариэктомии. Источником экзогенного эстрогена для введения субъекту при осуществлении способов по изобретению может быть любая подходящая форма эстрогена. Подходящие формы экзогенного эстрогена включают как природные, так и синтетические соединения, обладающие эстрогенной активностью. Некоторые формы экзогенного эстрогена коммерчески доступны. Например, подходящие формы экзогенного эстрогена включают, без ограничений, эстрадиолы, в том числе -эстрадиол, 17-эстрадиол, этинилэстрадиол, бензоат эстрадиола, 17-ципионат эстрадиола, эстрон, эстриол, эстрогены сопряженных эквинов и соли этих соединений. Вышеперечисленные соединения все являются примерами стероидов, обладающих эстрогенной активностью. Примеры нестероидных соединений, обладающих эстрогенной активностью,включают без ограничения дифосфат диэтилстилбестрола, дипропионат диэтилстилбестрола и гексестрол. В настоящее время предпочтительной формой экзогенного эстрогена при осуществлении способов по изобретению является эстрадиол. Количество экзогенного эстрогена, которое нужно ввести субъекту, должно быть достаточным для обеспечения содержания сывороточного эстрадиола, равного, по меньшей мере, около 5 пг/мл, но не более 20 пг/мл,предпочтительно, не более 15 пг/мл. Другими 6 словами, в соответствии со способами по изобретению экзогенный эстроген вводят в количестве, достаточном для достижения общего содержания сывороточного эстрадиола, равного,по меньшей мере, примерно 5-20 пг/мл. Поскольку содержание сывороточного эстрадиола у субъектов, не подвергавшихся лечению, является у разных субъектов различным, отдельные индивидуумы могут потребовать введения различных доз эстрогена для обеспечения требуемого содержания эстрадиола в сыворотке. Не требуется, чтобы содержание эстрадиола в сыворотке у каждого субъекта, подвергающегося лечению, увеличивалось до величины между примерно 5 и примерно 20 пг/мг, скорее, общее содержание эстрадиола в сыворотке у каждого субъекта, проходящего курс лечения, должно быть равным, по меньшей мере, примерно 5, но не выше примерно 20 пг/мл. Часто количество экзогенного эстрогена, которое нужно ввести,достаточно для достижения содержания эстрадиола в сыворотке, равного примерно 5-10 пг/мл. В противоположность известной ранее теории авторы данного изобретениятеперь установили, что содержание эстрадиола в сыворотке, составляющее примерно 5-15 пг/мл уменьшает риск переломов позвоночника и тазобедренных суставов. Введение такого количества экзогенного эстрогена, меньшего, чем обычно вводимое количество, еще больше снижает риск проявления нежелательных побочных эффектов, связанных с восполнением гормонов. Введение экзогенного эстрогена можно осуществлять любым приемлемым способом. Например, можно при осуществлении способов по изобретению использовать препаративные формы для перорального и парентерального введения экзогенного эстрогена. Препараты,подходящие для перорального введения могут быть в виде дозированных форм, например,капсул, крахмальных капсул, леденцов или таблеток, каждая из которых содержит определенное количество активного соединения в виде порошка или гранул, или в виде раствора, дисперсии или суспензии в водной или неводной жидкости. Такие препараты могут быть приготовлены любым подходящим методом, который включает сочетание активного соединения и подходящего носителя (который может содержать один или несколько вспомогательных ингредиентов). В общем, препараты по изобретению приготавливают путем равномерного и тщательного смешения активного соединения с жидкостью или мелкоизмельченным твердым носителем или и с тем, и другим и затем, если это необходимо, формования полученной смеси. Например, таблетку можно приготовить прессованием или формованием порошка или гранул,содержащих активное соединение, возможно, с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть изготовлены прессованием в подходящем 7 устройстве соединения в свободнотекучей форме, например, в виде порошка или гранул, возможно, смешанным со связующим, смазочным агентом, инертным разбавителем и/или поверхностно-активным/диспергирующим агентом(агентами). Формованные таблетки могут быть изготовлены формованием в подходящем устройстве порошкообразного соединения, увлажненного инертным жидким связующим. Количество экзогенного эстрогена в оральном препарате является ультранизкой дозой эстрогена, которая зависит от точной формы эстрогена, которую нужно ввести, но обычно меньше 0,5 мг в день. Предпочтительно, чтобы количество эстрогена, вводимого перорально,составляло между примерно 0,1 мг и примерно 0,25 мг эстрогена в день. Например, количество эстрадиола, вводимого перорально, составляет от примерно 0,1 мг до примерно 0,25 мг в день. Специалисту в данной области известно, как определить эквивалентные дозы других форм эстрогена. Согласно предпочтительному варианту данного изобретения эстроген вводят скорее парентерально или трансдермально, чем перорально. Первые два пути введения предпочтительны по сравнению с пероральным введением потому, что пероральное введение эстрогена может привести к повышенному содержанию глобулина, связующего половые гормоны. Глобулин, связывающий половые гормоны,может ослабить благоприятный эффект от введения эстрогена субъектам в постклимактерическом периоде, особенно субъектам, у которых наблюдаются симптомы остеопороза или снижения плотности костной ткани. Хотя пероральное введение не является предпочтительным, способы по изобретению могут осуществляться с использованием пероральных препаратов. Препараты, пригодные согласно данному изобретению для парентерального введения,обычно представляют собой стерильные водные препараты активного соединения, которые,предпочтительно, являются изотоническими по отношению к крови реципиента. Эти препараты могут вводиться подкожно, внутривенно, внутримышечно или интрадермально. Такие препараты обычно могут быть приготовлены смешением активного ингредиента, эстрогена с водой или глицидным буфером и придания полученному раствору стерильности и изотоничности по отношению к крови. Количество экзогенного эстрогена в парентеральном препарате представляет собой ультранизкую дозу эстрогена, которая зависит от точной формы эстрогена, которая должна быть введена, но обычно она составляет не более 20 мкг в день. Предпочтительно, чтобы количество эстрогена, вводимого парентерально,составляло между примерно 5 мкг и примерно 15 мкг эстрогена в день и, более предпочтительно, около 10 мкг эстрогена в день. Например,количество эстрадиола, вводимого парентераль 004573 8 но составляет от примерно 5 мкг до примерно 15 мкг в день. Специалистам в данной области хорошо известно, как определить эквивалентные дозы других форм эстрогена. Более предпочтительно, способы по изобретению включают трансдермальное введение экзогенного эстрогена. Подходящие составы для трансдермального введения эстрогена известны из уровня техники и могут быть использованы в способах по изобретению. Например, подходящие составы для трансдермальных накладок для введения экзогенного эстрогена описаны в патентах США 4460372 (Campbell и др.), 4573996(Eckert и др.) и 5223261 (Nelson и др.), которые введены в данное описание в качестве ссылки при обсуждении технологии трансдермальных накладок. Один подходящий тип трансдермального пластыря для применения в способах по изобретению показан на фиг. 1. В общем, подходящий трансдермальный пластырь 10 включает подложку 12, являющуюся непроницаемой,проницаемый поверхностный слой 13 и резервуар 16, расположенный между подложкой 12 и проницаемым поверхностным слоем 13 таким образом, что подложка 12 простирается вокруг резервуара 16 и соединена с проницаемым поверхностным слоем 13 на краях проницаемого поверхностного слоя 13. Трансдермальный пластырь 10 прикрепляется к коже адгезионным слоем на проницаемом поверхностном слое 13 таким образом, что проницаемый поверхностный слой 13 находится в практически непрерывном контакте с кожей, когда трансдермальный пластырь 10 прикреплен к коже. Когда трансдермальный пластырь 10 прикреплен к коже субъекта, эстроген, содержавшийся в резервуаре 16 трансдермального пластыря 10, переходит через проницаемый поверхностный слой 13 из резервуара 16 через адгезионный слой в кожу субъекта и через нее. Трансдермальный пластырь 10 может также необязательно включать один или несколько агентов, способствующих проникновению и находящихся в резервуаре 16, которые улучшают проникновение эстрогена через кожу. Примеры подходящих материалов, из которых может быть выполнена подложка, хорошо известны в области трансдермальных пластырей и в трансдермальном пластыре по изобретению может быть использована любая обычная подложка. Конкретные примеры подходящих для подложки материалов включают, не ограничивая, полиэфирные пленки, полиэтилен высокой плотности,полиэтилен низкой плотности или композиционные материалы на основе полиэтилена, полипропилен, поливинилхлорид, поливинилиденхлорид, сополимеры этилена с винилацетатом и т.п. Примеры подходящих материалов для проницаемого поверхностного слоя хорошо известны в области изготовления трансдермальных пластырей и для трансдермального пластыря по 9 изобретению может быть использован любой обычный материал, проницаемый для активного ингредиента, который нужно ввести. Конкретные примеры подходящих для проницаемого поверхностного слоя материалов включают, не ограничивая, монолитные или микропористые полимерные пленки, например, из поликарбонатов, поливинилхлоридов, полиамидов, модакриловых сополимеров, полисульфонов, галоидированных полимеров, хлорированных полиэфиров, полиацеталей, акриловых смол и т.п. Конкретные примеры этих типов обычных проницаемых материалов для мембран описаны в патенте США 3797494 (Zaffaroni). Примеры подходящих адгезивов, которые можно наносить на подложку для создания слоя адгезива также хорошо известны из уровня техники и включают, например, чувствительные к давлению адгезивы, например, содержащие акриловые и/или метакриловые полимеры. Конкретные примеры подходящих адгезивов включают полимеры эфиров акриловой или метакриловой кислоты (например, н-бутиловые, нпентиловые, изопетиловые, 2-метилбутиловые,1-метилбутиловые,1-метилпентиловые,3 метилпентиловые, 3-этилбутиловые, изооктиловые, н-дециловые или н-додециловые) в отдельности или же в виде сополимеров с этиленненасыщенными мономерами, например акриловой кислотой, метакриловой кислотой, акриламидом, метакриламидом, N-алкоксиметилакриламидами, N-алкоксиметилметакриламидами, Nтрет.бутилакриламидом, итаконовой кислотой,винилацетатом, N-разветвленными С 10-24 алкилмалеамовыми кислотами, гликольдиакрилатом или их смесями; натуральные или синтетические каучуки, например силиконовый, бутадиенстирольный, бутилкаучук, неопреновый каучук, нитрильный каучук, полиизобутилен, полибутадиен и полиизопрен; полиуретановые эластомеры; виниловые полимеры, например поливиниловый спирт, поливиниловые эфиры,поливинилпирролидон и поливинилацетат, мочевино-формальдегидные смолы, фенолформальдегидные смолы, резоцин-формальдегидные смолы, производные целлюлозы, например этилцеллюлозу, метилцеллюлозу, нитроцеллюлозу, ацетобутират целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозу; и природные смолы, например гуаровая, смола акации, пектин, крахмал, дестрия, желатин, казеин и т.д. Как очевидно для специалистов, адгезионный слой должен быть инертным по отношению к активному ингредиенту, эстрогену, и не должен участвовать в процессе трансдермальной доставки эстрогена через проницаемый поверхностный слой. Для адгезионного слоя трансдермального пластыря по изобретению предпочтительны адгезивы, чувствительные к давлению, для облегчения прикрепления пластыря к коже субъекта. Подходящие агенты, способствующие проникновению, также хорошо известны. Примеры агентов, способст 004573 10 вующих проникновению, включают алканолы,например этанол, гексанол, циклогексанол и т.п.; углеводороды, например гексан, циклогексан, изопропилбензол; альдегиды и кетоны, например,циклогексанон; ацетамид,N,Nди(низший алкил)ацетамиды, например N,Nдиэтилацетамид, N,N-диметилацетамид; N-(2rидpoкcиэтил)aцeтaмид; эфиры, например N,Nди-низший алкилсульфоксиды; эфирные масла,например пропиленгликоль, глицерин, монолаурат глицерина, изопропилмиристат и этилолеат; салицилаты и смеси указанных веществ. На фиг. 2 показан пример второго типа трансдермального пластыря, пригодного для трансдермальной доставки эстрогена согласно данному изобретению. В этом пластыре активный ингредиент введен в адгезионный слой и не содержится в резервуаре. Примеры таких типов пластырей известны и включают, например,CLIMERA, производимый Berlex. Трансдермальный пластырь 20 состоит из подложки 22 и слоя адгезив/лекарство 24. Слой адгезив/лекарство характеризуется объединенной функцией прикреплять пластырь 20 к коже субъекта и содержать активный ингредиент,эстроген, который должен быть введен. Активный ингредиент выделяется из слоя адгезив/лекарство 24 на кожу и проникает через кожу субъекта, когда пластырь прилипает к коже. Любая подложка, описанная выше, также может быть использована в этом варианте. Кроме того,может быть использован любой из подходящих адгезивов, описанных выше. Слой адгезив/лекарство представляет собой сравнительно гомогенную смесь выбранного адгезива и активного ингредиента. Обычно слой адгезив/лекарство представляет собой покрытие,покрывающее одну поверхность подложки. Слой адгезив/лекарство может также включать агент, способствующий проникновению, такой как агенты, описанные выше, введенный в практически гомогенную смесь адгезива и активного ингредиента. Специалистам очевидно, что трансдермальные пластыри по изобретению могут включать различные дополнительные эксципиенты, которые обычно применяются для облегчения трансдермального введения активного агента, особенно стероидного активного агента. Примеры таких эксципиентов включают,не ограничивая, носители, гелеобразующие агенты, суспендирующие агенты, диспергирующие агенты, консерванты, стабилизаторы,смачиватели, эмульгаторы и т. п. Конкретные примеры каждого из этих типов эксципиентов хорошо известны, и в трансдермальных пластырях по изобретению могут применяться любые обычные эксципиенты. Важно, однако, отметить, что в трансдермальных пластырях по изобретению не содержатся прогестины. Соответственно, прогестин не является подходящим эксципиентом для применения в трансдермальном пластыре по изобретению. Экзогенный эст 11 роген вводится в трансдермальный пластырь в ультранизких дозах, которые зависят от формы эстрогена, которую нужно ввести, но достаточно ввести менее 20 мкг, обычно не более 15 мкг в день. Предпочтительно, чтобы количество эстрогена, введенного через трансдермальный пластырь, составляло между примерно 5 мкг и примерно 15 мкг эстрогена в день. Более предпочтительно, количество эстрогена, вводимого субъекту, составляет примерно 10 мкг в день. Хотя обычно доза эстрогена согласно способу по изобретению меньше 20 мкг, можно использовать такие большие дозы как 25 мкг. Например, количество эстрадиола, введенного парентерально, составляет от примерно 5 мкг до примерно 15 мкг в день. Специалистам также хорошо известно, как определить эквивалентные дозы других форм эстрогена. Неожиданно было установлено, что ультранизкое количество эстрогена, используемое в способах по данному изобретению, значительно снижает риск остеопорозных переломов костей у женщин в постклимактерическом состоянии. Обычно трансдермальные пластыри предназначены для ношения в течение нескольких дней до замены. Таким образом, количество эстрогена в резервуаре должно быть достаточным, чтобы ввести менее 20 мкг в день в течение нескольких дней. Например, трансдермальный пластырь по изобретению, предназначенный для введения 10 мкг эстрогена в день в течение 7 дней будет содержать приблизительно 1 мг эстрогена. Пластырь, пригодный для введения 15 мкг в день в течение 7 дней, будет содержать примерно 1,4 мг эстрогена. Основываясь на этих конкретных примерах, специалист может установить необходимое количество эстрогена, которое должно быть включено в трансдермальный пластырь, для обеспечения введения нужной дневной дозы эстрогена. Данное изобретение предусматривает также набор для потребителя, у которого проявляются постклимактерические симптомы или который восприимчив к такому состоянию, включающий трансдермальный пластырь и инструкции, описывающие метод использования трансдермального пластыря для лечения постклимактерического состояния и/или уменьшения риска остеопорозных переломов костей у потребителя. Инструкции рекомендуют прикреплять трансдермальный пластырь, используя адгезив, непосредственно на поверхность кожи, например, на предплечье, для обеспечения трансдермального введения ультранизкой дозы эстрогена из пластыря и тем самым повышения содержания эстрадиола в сыворотке у потребителя до величины между примерно 5 пг/мл и примерно 20 пг/мг. Инструкция также рекомендует потребителю заменять пластырь для продолжения введения эстрогена, что необходимо для поддержания этого уровня эстрадиола в сыворотке с применением трансдермального пластыря. В частности, инст 004573 12 рукция может рекомендовать потребителю заменять трансдермальный пластырь каждые 7 дней для обеспечения введения менее 20 мкг и,предпочтительно, 10 мг эстрогена в день, когда в наборе используется семидневный пластырь. Такие наборы могут быть упакованы и продаваться единичными, или же могут содержать большое количество пластырей. Следующие примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем. Пример 1. Следующие примеры и полученные данные иллюстрируют корреляцию между уровнем эстрадиола в сыворотке и риском возникновения остеопорозного перелома костей, а также свидетельствуют об эффективности применения ультранизкой дозы экзогенного эстрогена для уменьшения риска остеопорозного перелома костей и для лечения постклимактерического состояния. 1. Группа лиц, участвующих в опытах. Изучение остеопорозных переломов представляло собой изучение состояния группы, состоящей из 9704 женщин, которые были выбраны по спискам в четырех городах США: Балтиморе, Минеаполисе, Питсбурге и Портланде cм. Cummings et.al. N. Engl. J. Med. 332:767-773(1995). Женщины в возрасте 65 лет и старше были приглашены участвовать в проведении исследований по почте. Группа лиц включала негритянок, поскольку у них наблюдается пониженная склонность к переломам тазобедренного сустава, и женщин, у которых дважды заменяли тазобедренные суставы или которые нуждались в других людях для того, чтобы передвигаться. Производился опрос участников эксперимента относительно применения эстрогена в недавнем прошлом и в настоящем и прием кальция и мультивитаминов, содержащих витамин D. 2. Клинические измерения. Плотность костной ткани (а именно, массы пяточной кости) измеряли с использованием метода абсорбциометрии с единичным протоном при помощи OsteoAnalyzer, Siemens-Osteon,Wahiawa, Hawaii. Средний коэффициент вариации этого параметра, измеренного в разных клинических центрах, составил 1,2%. См. Steigeret.al., J. Bone Miner. Res. 7:625 (1992). 3. Образцы сыворотки. Всем участникам было рекомендовано придерживаться диеты без жиров с вечера и в течение утра перед исследованием для уменьшения липемии, которая может помешать анализу. Кровь отбирали между 8 ч и 14 ч и сыворотку сразу же замораживали до -20 С. Все образцы перевозили в течение 2 недель в Biomedical Research Institute в Rockville, Maryland, где они хранились при -190 С в жидком азоте. 13 4. Установление факта переломов. С женщинами поддерживали контакт каждые 4 месяца по почте или во время периодических посещений клиник: 99,7% пациенток наблюдались для определения их состояния и возникновения переломов тазобедренных суставов. Переломы тазобедренных суставов подтверждались просмотром рентгенограмм до операции. В среднем через 3,3 года после снятия базисных рентгенограмм 7299 женщин (79% от общего числа наблюдаемых) снова повторили исследование позвоночника; на 7238 парах рентгенограмм видны были трещины в позвоночнике. Мы оценивали рентгенограммы для выявления трещин, используя метод количественной морфометрии, описанной Black et. al., J. Bone Miner.Res. 10:890 (1995). При этом считалось, что у женщины имеются трещины в позвоночнике,если высота позвоночного столба уменьшилась на 20% и на 4 мм при сравнении базисной и последующей рентгенограмм. См. National Osteoporosis Foundation Working Group on VertebralFractures, J. Bone Miner. Res. 10:518 (1995). Те,кто изучал рентгенограммы, не имели сведений о результатах анализа сыворотки участника опыта. 5. Выбор случаев и образцов. Используя подход случай - контингент,описанный в Prentice, R.L., Biometrica 73:1(1986) и исключив женщин, которых подвергли лечению методом восполнения гормонов, мы выбирали случайные образцы сыворотки у 133 обследуемых женщин, у которых был первый перелом тазобедренного сустава, и у 138 женщин, у которых были трещины в позвоночнике. Мы также отбирали случайные образцы у 359 женщин из контингента, включая 12 женщин, у которых был последующий перелом тазобедренного сустава, и 14 женщин, у которых были последующие трещины в позвоночнике. При исследовании переломов тазобедренного сустава мы исключили контрольных пациентов (n=4),которые пострадали от переломов тазобедренных суставов до основного визита; при исследовании трещин в позвоночнике мы исключили контрольных пациентов (n=8), которые не сделали последующие рентгенограммы или у которых базисная или последующая рентгенограммы были не пригодны для морфометрии. 6. Биохимические анализы. Мы определяли стабильность измерений выбранных типов гормонов у 51 женщины в постклимактерическом состоянии путем измерения их содержания в базисных образцах и снова через 3,5 года хранения при -190 С. Корреляции (все при Р 0,01) между двумя измерениями были следующими: в среднем участке паратироидный гормон (r=0,99), 25(ОН) витамин D (r=0,88), тестостерон (r=0,99) и эстрон(r=0,98). Было очень мало отклонений, если они вообще были, средних величин для этих веществ. Иммунорадиометрический анализ(IRMA) паратироидного гормона был неприемлем в случае базисных измерений; корреляция между величинами, измеренными IRMA и методом средних участков, составляла 0,78. Все анализы осуществляли для смешанных порций контрольных и исследуемых образцов вслепую, без привязки к истории болезни исследуемого пациента. Образцы из места хранения направлялись сразу же в аналитическую лабораторию без размораживания. Первоначально определялось содержание эстрона, а не эстрадиола. После завершения первой партии определений, мы добавили на измерительный стенд эстрадиол и определили его содержание у 89 женщин с переломами тазобедренного сустава, у 96 женщин с переломами позвоночника и у 204 женщин, не имевших переломов. Половые гормоны и глобулин, связывающий половой гормон, определялись EndocrineSciences of Calabasas Hills, California. Эстрадиол и эстрон определяли методом радиоиммунологического анализа после экстракции и разделения на колонке 1H2O. Вариабельность при анализе составляла для эстрадиола 8-12,5% и для эстрона - 6,2-7%. Нижний предел обнаружения эстрадиола был равен 5 пг/мл. Общее количество тестостерона измеряли методом радиоиммунологического анализа после экстракции и хроматографии на колонке с Аl2 О 3, при вариабельности, равной от 6,1 до 13,4%. Связывающую способность SHBG определяли непосредственно в сыворотке, используя метод вытеснения,вариабельность составляла от 4,1 до 14,4%. Концентрацию свободного тестостерона определяли методом осаждения сульфатом аммония,описанным Furuyama et.al., Steroids 16:415(1970); и Mayes, J. Clin. Endocrinol. Metab. 28:1169 (1968). Вариабельность колебалась от 10,7 до 15,5%. Кальциотропные гормоны определяли вof San Francisco, California. Интактный паратироидный гормон определяли методом радиоиммунологического анализа, вариабельность измерений составляла для интраопределения для 5,2%, а для интеропределения - 8,5%. Мы определяли 25(ОН) витамин D и 1,25(ОН)2 витаминD методом радиоиммунологии, вариабельность для обоих типов витамина при интраопределении составляла 6,6%, а для интеропределения 15% и 24,4%, соответственно. Содержание креатинина измеряли, используя автоматический химический анализатор. 7. Анализ данных. Мы определяли уровни гормонов и витаминов как непрерывные переменные приближенными квинтильонами и, в случае релевантности, как дихотомные переменные (выше или ниже порога обнаружения). Мы использовали логистические модели, разработанные SAS Institute of Cary, North Carolina для анализа взаимосвязи между предикторами и переломами 15 позвоночника и модели пропорционального риска, учитывающие систему отбора образцов случай - контингент (Epicure Hirosoft International, Seattle, WA) для анализа взаимосвязи между предикторами и переломами тазобедренного сустава. Все анализы были сделаны с учетом базисного возраста и веса тела и оценены как сравнительные случаи риска (аппроксимированные в виде нерегулярных или случайных соотношений) с 95% интервалами конфидентности. Мы подсчитывали количество переломов, вызванных различными уровнями гормонов стандартными методами, описаннымиBrownes, Am. J. Epidemiol. 123:143 (1986). Мы сравнивали плотности костной ткани различных возрастных групп, используя общие линейные модели. 8. Результаты. В табл. 1 приведены данные, характеризующие участников эксперимента с переломами тазобедренного сустава или позвоночника. Таблица 1 Характеристика участников определения со случайными переломами тазобедренных суставов, случайными переломами позвоночника и контрольных субъектов без переломов Число контрольных пациентов при определении переломов тазобедренного сустава меняется от 240 до 343 из-за недостающих данных по определению эстрадиола. Число контрольных пациентов при определении переломов позвоночника меняется от 193 до 264; оно меньше вследствие исключения тех субъектов, у которых не было адекватных пар основной и последующей рентгенограмм. Случаи случайных переломов в контрольных образцах включены в графу "случай".P0,1 по сравнению с контрольными.P0,5 по сравнению с контрольными. Данные показывают, что участники эксперимента, пострадавшие от переломов тазобедренного сустава и позвоночника, были старше,весили меньше, были курильщиками и характеризовались меньшей плотностью костной ткани,чем контрольные участники. Примерно у каждой женщины из трех (81 или 247) в случайно отобранных контрольных образцах нельзя было определить уровень эстрадиола (5 пг/мл). Данные, характеризующие сравнительный риск для 16 определенного веса и возраста, приведены ниже в табл. 2. Таблица 2 Зависимость между содержанием гормонов и витамина и риском переломов тазобедренного сустава и позвоночника у женщин определенного возраста Сравнительные риски подсчитаны как нерегулярные соотношения в случае переломов позвоночника и как случайные соотношения в случае переломов тазобедренного сустава.C.I. = доверительный интервал.Преобладание в статистическом образце.Для превращения величин для 1,25 дигидрокси витамина D в нм/л надо умножить на 2,496.Для превращения величин для 1,25 дигидрокси витамина D в пм/л умножить на 2,4. Данные свидетельствуют, что у женщин с неопределяемым содержанием эстрадиола риск перелома тазобедренного сустава и позвоночника в 2,5 раза больше, чем у женщин с измеряемым содержанием этого гормона. Мы определили, что 33% переломов тазобедренного сустава и 32% переломов позвоночника в этой группе связаны с неопределяемым содержанием эстрадиола. Оказывается, что эти данные отражают порог снижения содержания эстрадиола, равный 5 пг/мл. Женщины с общим уровнем эстрадиола от 5 до 10 пг/мл характеризуются меньшим на 62% риском переломов тазобедренного сустава (случайное соотношение=0,38; 0,20-0,72) и меньшим на 57% риском переломов позвоночника (нерегулярное соотношение=0,43; доверительный интервал 0,25-0,76) по сравнению с женщинами с уровнем менее 5 пг/мл. Более высокие уровни SHBG были связаны с повышенным риском возникновения переломов тазобедренного сустава и позвоночника. Для определенной возрастной группы увеличение на каждый 1,0 мкг/дл уровня SHBG было связано с увеличением риска переломов тазобедренного сустава в 1,44 раза (1,16-1,80) и переломов позвоночника в 1,65 раза (1,30-2,10). В случае пе 17 реломов тазобедренного сустава этот эффект частично зависит от веса. Для случайного образца для этой группы 26% (63 из 244) женщин характеризовались неопределяемым содержанием эстрадиола и содержанием SHBG 1 мкг/дл; у этих женщин риск переломов тазобедренного сустава в 14 раз больше (доверительный интервал 95%; 3,0-62) и риск переломов позвоночника в 12 раз больше(3,3-41), чем у других женщин. Поправка на вес несколько ослабила эти зависимости как для переломов тазобедренного сустава (случайное соотношение=6,9; 1,5-32), так и для переломов позвоночника (случайное соотношение=7,9; 2,228). Зависимости между эстрадиолом, SHBG и переломами позвоночника были похожими и в тех подгруппах женщин, у которых наличие перелома позвоночника было видно на базисной рентгенограмме и у которых его не было. Для 26% женщин с таким сочетанием риск перелома тазобедренного сустава составлял 60%, а переломов позвоночника - 64%. Данные о переломах позвоночника, приведенные в табл. 2, далее подтверждаются данными табл. 3 ниже. Таблица 3 Предикторы переломов позвоночника: мультипеременные модели Все результаты скорректированы для других переменных в таблице. SD (стандартное отклонение) костной массы пяточной кости равен 0,098 г/см 2.Костная масса пяточной кости измерена для базисных случаев. Данные табл. 2 показывают, что женщины с содержанием эстрона в самых низких квинтилях (1,4 нг/дл) характеризуются меньшим риском появления переломов позвоночника, чем женщины с более высоким содержанием. Хотя женщины с меньшим содержанием эстрона характеризуются меньшим содержанием эстрадиола, корреляция между уровнями эстрона и эстрадиола была умеренной (r=0,57) и низкие уровни эстрона оставались связанными со сниженным риском переломов позвоночника после корректировки для уровней эстрадиола, как показано в табл. 3. Женщины, у которых уровень 1,25(ОН)2 витамина D был в самом низком квинтиле (23 пг/мл) [55,2 пм/л], характеризуются значительно более высоким риском переломов тазо 004573 18 бедренного сустава (случайное соотношение = 2,1; 1,2-3,5), как показывает табл. 4 ниже. Таблица 4 Предикторы переломов тазобедренных суставов: мультипеременные модели Все результаты скорректированы для других переменных в таблице. SD (стандартное отклонение) костной массы пяточной кости равен 0,098 г/см 2.Для превращения величин для 1,25 дигидроксивитамина D в пм/л умножить на 2,4. Эта картина остается действительной для уровней эстрадиола и SHBG (случайное соотношение=2,2; 1,0-4,8). Никакой разницы не было и в случае уровня креатинина в сыворотке(случайное соотношение=2,3; 1,0-5,2). После исключения женщин, принимающих витамин D,содержание 25(ОН) витамина D (среднее SD) было значительно выше в образцах, отобранных в период с января по июнь (28,410,2 нг/мл[83,625,5 нм/л]), чем в образцах, отобранных с июля по декабрь (25,510,4 нг/мл [63,625,9 нм/л], Р 0,01. При сравнении содержания витамина D в образцах, отобранных в апреле - сентябре и октябре - марте, не было никакой разницы. Не было обнаружено статистически заметной зависимости между низким содержанием 25(ОН) витамина D в сыворотке и риском переломов тазобедренного сустава или позвоночника (см. табл. 2), даже после разбивки данных в зависимости от месяца, времени года или клинического состояния или в зависимости от того,включались ли женщины, принимающие витамин D, или нет. Включение костной массы в мультипеременные модели гормонов и риска переломов только слегка ослабило зависимость между содержанием эстрадиола, SHBG и риском переломов тазобедренного сустава или позвоночника см. табл. 3 и 4. Разбивка по костной массе не влияет на зависимость между содержанием 1,25 (ОН)2 витамина D и риском переломов тазобедренного сустава или между содержанием эстрона и риском переломов позвоночника. Все объединенные данные показывают,что риск переломов тазобедренного сустава и позвоночника у женщин старше 65 лет значительно выше, когда концентрации эстрадиола в сыворотке ниже 5 пг/мл, что является пределом 19 обнаружения. Около одной трети случайных переломов тазобедренного сустава и позвоночника может быть объяснено этим чрезвычайно низким содержанием эстрадиола. Женщины с несколько более высоким содержанием эстрадиола, в интервале от 5 до 10 пг/мл гораздо меньше подвержены риску таких переломов. Женщины, у которых эстрадиол нельзя определить, имеют также меньшую плотность костной ткани. Однако разбивка данных по величине плотности костной ткани пяточной кости очень немного повлияла на данные о вероятности риска переломов. Это позволяет предположить, что зависимость между очень низким содержанием эстрадиола и риском переломов, по меньшей мере, частично не зависит от костной массы. Содержание SНВG также сильно влияет на вероятность переломов тазобедренного сустава и позвоночника. Женщины с концентрациейSHBG 1,0 мкг/дл и с неопределяемым содержанием эстрадиола подвержены в 7 раз большему риску переломов тазобедренного сустава и позвоночника, чем женщины с меньшим содержанием SHBG и большим содержанием эстрадиола. SHBG связывает циркулирующий эстрадиол, поэтому повышенный уровень SHBG связан с пониженной биодоступностью эстрадиола. Таким образом, концентрации биодоступного эстрадиола могут даже больше влиять на вероятность переломов, чем общее содержание эстрадиола, измеренное во время этого исследования. Пример 2. Этот пример демонстрирует сравнение действия различных количеств эстрогена, введенного при помощи 7-дневной трансдермальной терапевтической системы, на предотвращение потери костной массы у женщин в постклимактерическом периоде. 1. Методика. Были отобраны здоровые женщины в возрасте 45-65 лет, подвергнутые гистерэктомии, у которых менопауза наступила 1-5 лет назад, с базисной плотностью костной ткани (BMD),измеренной методом двойной абсорбции Хлучей (DEXA), при L2-L4 при 2,5 S.D. от среднего значения для обычных женщин моложе 45 лет. Субъектам бессистемно вводили 1-4 дозы эстрадиола TTS (пластыри площадью 6,5, 12,5,15 и 25 см 2, доставляющие 0,025, 05,0,06 и 0,1 мг/день эстрадиола, соответственно) или плацебо. Один пластырь в неделю обследуемые носили на животе в течение 2 лет. Каждые 6 месяцев измеряли ВID при L2-L4 шейки бедра и предплечья, остеокальцин (OST) и соотношение сшивки деоксипиридинолином/креатинин(DPD). Были получены результаты после 18 месячного лечения. 2. Результаты. Были зарегистрированы 176 женщин,средний возраст 51,2 года. 103 субъекта завер 004573 20 шили 18-месячное лечение. Потерю ВID предотвращали введением всех доз в нужное время. Через 18 месяцев пациенты, которым вводили плацебо, характеризовались средним изменением, в %, поясничной ВID, составлявшим-0,74,1 против 3,64,7, 3,23,1, 3,03,6 и 4,85,5 для групп, получивших 0,025, 0,05, 0,06 и 0,1 мг/день, соответственно, (все разницы 0,05 против плацебо). Через 12 месяцев уровень OST снизился от базисной величины во всех группах активного лечения (изменение в процентах: -30,442,9, -17,950,7, -13,037,6 и 26,929,8, соответственно; все разницы р 0,05 против плацебо +27,660,4). Через 12 месяцев снизилось по сравнению с базисным значением также DPD во всех группах активного лечения-1,810,8 нмол/ммол, соответственно). Три из четырех курсов активного лечения значительно отличались от курса с применением плацебо. Однако DPD также снизилось у субъектов, которых лечили плацебо. 3. Выводы. Трансдермальный эстрадиол из двух доступных в настоящее время пластырей CLIMARA TTS (0,05 и 0,1 мг/день) и пластыря 6,5 см 2 с низкой дозой CLIMARA TTS, доставляющего 0,025 мг/день предотвращает потерю костной ткани в постклимактерическом периоде. Ожидается, что пластырь CLIMARA TTS,доставляющий 10-15 мкг/день будет влиять на потерю костной массы скелета. Пример 3. Следующий пример и полученные данные демонстрируют корреляцию между содержанием эстрадиола в сыворотке и снижением плотности костной ткани. Этот пример демонстрирует также эффективность применения ультранизкой дозы экзогенного эстрогена для снижения степени уменьшения плотности костной ткани. 1. Группа лиц, участвовавшая в эксперименте. Отобранные субъекты были участниками программы "Изучение остеопорозных переломов" (SOF), детали которой описаны в примере 1. Это исследование основано на случайном отборе образцов у 261 участника SOF, у них брали кровь и измеряли BID пяточной кости,определяя базисные величины и последующие в 1993-94 гг. Среди участников у 241 женщины технически адекватно измеряли плотность костной ткани тазобедренного сустава 2 раза в 1990 г. и затем в 1993-94 гг. Конечные результаты получены для подгрупп из 231 и 218 женщин, имеющих две сканограммы BID пяточной кости и тазобедренного сустава, соответственно,которые не сообщили о текущем применении терапии восполнения эстрогена во время базисного интервью. Размер образцов для индивидуальных анализов менялся из-за недостающих величин. Кроме того, размер образцов при оп 21 ределении содержания эстрадиола меньше, чем в случае других анализов, так как мы добавляли эстрадиол к ряду образцов некоторое время спустя после начала исследования. 2. Измерения. Во время базисного визита в 1986-1988 гг. обследуемым предлагали подробный вопросник, в котором содержались вопросы о более раннем приеме эстрогена, кальция и мультивитаминов, содержащих витамин D. У обследуемых измеряли так же рост и вес. Массу пяточной кости измеряли с использованием метода абсорбциометрии с единичным протоном во время первого базисного визита и следующего визита в 1993-1994 гг., в среднем через 5,9 года. Плотность костной ткани тазобедренного сустава измеряли методом двойной абсорбции Х-лучей во время второго визита в 1988-1990 гг. у 82% субъектов первоначальной группы, которые поправились. Повторно плотность костной ткани тазобедренного сустава измеряли во время последующего визита в 1993-1994 гг., в среднем через 3,5 года. Средние коэффициенты отклонения (CV), равные 1,2%,между центрами пяточной кости и шейки бедра были рассчитаны путем множественных измерений у обследуемых, которые посетили каждый центр. Измерения плотности спинальной костной ткани проводили у недостаточного количества субъектов и поэтому не учитывались в данном эксперименте. 3. Образцы сыворотки. Во время базисной проверки кровь сдавали на анализ между 8 и 14 ч и хранили сыворотку при -20 С. В течение 2 недель образцы отправляли в Biomedical Reseach Institute (Rockville,M.D.) и хранили при -190 С в жидком азоте. В 1994 году образцы сыворотки отобранных уча стников эксперимента размораживали и определяли уровни циркулирующих гормонов и другие биохимические показатели. Лаборатории,проводившие определение, не имели информации о наличии переломов. Стабильность величин содержания выбранных гормонов во времени определяли у 51 женщины, определяя базисное содержание и последующее через 3,5 года хранения при-190 С. Корреляции между парами измеренных величин были следующими: эстрон (r=0,98),общее содержание тестостерона (r=0,99), среднеуровневый паратироидный гормон (r=0,99), и 25(OH)D (r=0,88). Все корреляции имели значение при р 0,001. Во время базисных определений иммунорадиометрический анализ РТН был не доступен. Корреляция между РТН (IRMA) и средним уровнем в образцах, измеренным через 3,5 года хранения составляла 0,78. Средние уровни гормонов в двух образцах отличались незначительно. 4. Биохимические анализы. Концентрации эстрадиола, эстрона и общего тестостерона измеряли радиоиммунологическим методом. Связывающая способность глобулина, связывающего половой гормон, определялась методом вытеснения. Уровни свободного тестостерона рассчитывались как произведение общего тестостерона и количества неSHBG связанного стероида, определенного методом осаждения сульфатом аммония. Содержание интактного паратироидного гормона,25(OH)D и 1,25(OH)2D определяли методом радиоиммунологического анализа. Точность всех методов анализа охарактеризована в табл. 5 вместе с данными о средних и стандартных отклонениях, а также в виде интервалов квартилей для каждого гормона. Таблица 5 Данные биохимических анализовN, значение (SD) и точки квартилей были рассчитаны по потере массы пяточной кости. N для общей потери костной ткани тазобедренного сустава приведены в табл. 4.Интервал величин для указанного квартиля. 23 1. Статистические анализы. Все биохимические переменные кроме эстрадиола определяли квартилями и в виде непрерывных переменных. Поскольку у 36% обследуемых уровень эстрадиола был меньше определяемого количества(5 пг/мл), величины содержания эстрадиола были разделены на четыре группы, причем необнаруженные величины были отнесены к низшей категории, а остальные обнаруживаемые величины были разделены на тертили. Данные о содержании эстрадиола приведены в таблицах в виде квартилей для простоты. Для непрерывных моделей обнаруживаемые величины содержания эстрадиола были обозначены нулевыми величинами. Для анализа зависимости между содержанием гормонов и годовым процентным изменением BMD, разбитым по возрасту и весу тела, использовали линейный регрессионный анализ. Данные о годовом абсолютном изменении BMD,включая клинические в виде переменного параметра,были одинаковыми и не показаны. Зависимость между содержанием гормонов и потерей костной ткани была менее выраженной для шейки бедра и подобной для вертелов бедренной кости в сравнении со всем тазобедренным суставом, и поэтому мы представили результаты только для потери костной ткани всего тазобедренного сустава. Изменение BMD, разбитые по весу тела и возрасту обследуемых, и 95% доверительных интервалов были рассчитаны в виде квартилей каждого гормона с использованием метода наименьших квадратов, и для оценки статистической значимости был использован опыт определения тенденции в квартилях (была сделана разбивка по возрасту и весу). Зависимость между непрерывными величинами содержания гормонов и годовым изменением BMD в процентах выражена в виде стандартизованных бета-коэффициентов, представляющих разницу годового изменения BMD в процентах на единицу увеличения стандартного отклонения в содержании каждого гормона. Мультипеременные модели были созданы для определения, какие биохимические пере 004573 24 менные являлись независимыми предикторами потери костной ткани после контролирования уровней других гормонов. Поскольку содержание эстрадиола и эстрона умеренно коррелируется для этой группы (r=0,64), эти переменные анализировались только в отдельных моделях. 6. Результаты. Характеристики случайного подобразца,использованного в этом опыте, представлены в табл. 2, и они незначительно отличаются от характеристик группы, у которой были взяты образцы. Средний возраст женщин для этого подобразца составлял 71,3 года. Средняя величина потери костной массы составляла примерно 1,5% для пяточной кости и 0,5% для всего тазобедренного сустава и шейки бедра вместе. Таблица 6 Характеристики участников группы, у которых определялась потеря костной массы пяточной кости Зависимость содержания гормонов и изменения BMD пяточной кости отражена в табл. 7. В линейных регрессионных моделях, расклассифицированных по возрасту и весу, толькоSНВG был значительным предиктором потери массы пяточной кости. Таблица 7 Зависимость между содержанием гормонов и изменением BMD пяточной кости Годовое среднее изменение в процентах BMD (95% CI), классифицировано Классифицировано по возрасту и весу обследуемых, исключая принимающих ERT.Разница годового изменения BMD в процентах на увеличение SD в уровне гормона/фактор.р 0,10 р 0,05p0,01 Значимые опыты по определению разница/SD основаны на H0: =0, на оценке линейного параметра для каждого гормона. Значимые опыты в квартилях основаны на определении тенденции. Женщины с уровнем SHBG в наивысшем квартиле (2,4 мкг/дл) имели потерю костной массы пяточной кости в год в два раза большую(среднее изменение=-2,2%; 95% CI=-2,9%, 1,6%), чем женщины с уровнем SHBG в наименьшем квартиле (1,1 мкг/дл; среднее изменение=-1,2%; -1,6%, -0,7%). Эта связь остается сильно выраженной даже после разбивки по содержанию в сыворотке эстрадиола, эстрона и тестостерона (р 0,002). Тенденции к увеличению потери массы пяточной кости с понижением уровня гормонов очевидно для всех половых стероидов (см. табл. 7), но они не были статистически значимыми. Существовала граничная(р 0,10) обратная статистическая связь между концентрациями эстрона в сыворотке, смоделированными в виде непрерывной переменной, и потерей костной массы пяточной кости. Данные, характеризующие зависимость уровня гормонов от изменения BMD всего тазобедренного сустава (см. табл. 8), показывают,что более низкие уровни и эстрона, и эстрадиола связаны с большей величиной потери массы костной ткани тазобедренного сустава. Например, после классификации по возрасту и весу женщины с уровнем эстрадиола 10 пг/мл или выше имели небольшое увеличение костной массы при повторном обследовании то время как женщины с уровнем эстрадиола ниже 5 пг/мл имели потерю костной массы тазобедренного сустава выше среднего (среднее годовое изменение=-0,8%, -1,2, -0,3). Исследование среднегодового изменения плотности тазобедренного сустава в зависимости от квартилей уровня тестостерона позволяет предположить наличие порога: женщины с уровнем общего тестостерона 26 нг/дл или выше (наивысший квартиль) имели среднегодовое изменение в процентах только -0,1% (-0,5%,0,3%), а женщины с уровнем ниже 26 нг/дл(объединенные квартили 1-3) имели эту величину, равную -0,6% (-0,8%, -0,4%). Это различие было статистически значимым (р 0,05). Наблюдалось увеличение потери костной ткани тазобедренного сустава в зависимости от квартилейSHBG, хотя эта тенденция не была статистически значимой в случае регрессионных моделей,классифицированных по возрасту и весу(р=0,27). В мультипеременной модели, включающей уровни SHBG, эстрадиола и тестостерона помимо возраста и веса, более низкое содержание общего тестостерона и более высокое содержание SHBG независимо связаны с изменением Таблица 8 Зависимость между содержанием гормонов и изменением BMD всего тазобедренного сустава Годовое среднее изменение BMD (95% CI), классифицировано Классифицировано по возрасту и весу обследуемых, исключая принимающих ERT.Разница в годовом изменении BMD в процентах на увеличение SD в уровне гормона/фактор.р 0,10 р 0,05p0,01 Значимые опыты по определению разница/SD основаны на Н 0: =0, на оценке линейного параметра для каждого гормона. Значимые опыты в квартилях основаны на определении тенденции. Таблица 9 Мультипеременная модель: половые гормоны,SHBG и потеря костной ткани всего тазобедренного сустава Разница в изменении BMD тазобедренного сустава в процентах Все анализы проводились только для женщин, у которых определяли для сравнения содержание эстрадиола.Первая колонка отражает результаты отдельных регрессионных моделей для каждого гормона, классифицированные по возрасту и весу.Вторая колонка отражает результаты единичной регрессионной модели, включающейSHBG, эстрадиол, общий тестостерон, возраст и вес.р 0,05 Ввиду того, что было значительное число женщин, у которых не определяли содержание эстрадиола, было не ясно была ли заметная зависимость между SHBG и потерей костной ткани тазобедренного сустава в мультипеременной модели вызвана регулировкой уровней других гормонов или же в этой подгруппе женщин действительно существовала сильная зависимость между SHBG и потерей костной ткани. Поэтому классифицированная по возрасту и весу заметная зависимость между SHBG и потерей костной ткани тазобедренного сустава снова проверялась у женщин, у которых определяли содержание эстрадиола, и было установлено, что эта зависимость является статистически значимой(см. табл. 9). В виде непрерывной переменной величины эстрадиол не сильно влияет на изменение BMD тазобедренного сустава до или после регулировки содержания тестостерона и SHBG. Однако изучение тенденции в квартилях эстрадиола показало, что эта тенденция была заметной после регулирования уровней SHBG и тестостерона, в то время как тенденция в квартилях эстрона была пограничной (р 0,06). Только уровень 25(OH)D значительно менялся в зимнее время (январь-июнь) по сравнению с остальным временем года (июльдекабрь), со средними величинами 24,0 в зимнее время и 26,9 в остальное время. Не было заметной разницы в уровнях кальциотропных гормонов в период с мая по октябрь и в период с ноября по апрель. Уровни ни одного кальциотропного гормона или кальция не влияли на изменение BMD пяточной кости после классификации по возрасту и весу (см. табл. 7). Это оставалось 28 справедливым даже после классификации по времени года (июль-декабрь и январь-июнь) и клиническим показаниям и после классификации по субъектам, принимающим кальций или мультивитамины, содержащие витамин D, или исключения таких субъектов. Низкие уровни 25 (OH)D заметно влияют на повышение потери костной массы тазобедренного сустава (см. табл. 9). Женщины с уровнем 25 (OH)D в наивысшем квартиле (32 пг/мл) имели среднегодовое изменение ВМD,равное -0,1% (-0,5,0,3), а женщины с уровнем 25(OH)D в наинизшем квартиле (21 пг/мл) имели этот показатель, равный -0,7 (-1,1, -0,4). Эта зависимость оставалась заметной после классификации по клиническим показаниям, времени года, приему кальция и мультивитаминов, содержащих витамин D. Последовательная зависимость между уровнем паратироидного гормона (РТН) и потерей костной массы не наблюдалась (см. табл. 7 и 8). Изучение тенденции в квартилях уровня РТН позволило обнаружить необычную картину большей потери костной массы тазобедренного сустава для уровней РТН в центральной области(второй и третий квартили) и меньшей потерей костной массы у женщин с более экстремальными величинами (наинизший и наивысший квартили). 7. Выводы. Полученные данные показывают, что более низкое содержание эстрогена в сыворотке в заметной степени связано с увеличением потери костной массы тазобедренного сустава у пожилых женщин даже после классификации по возрасту, весу и содержанию SHBG и тестостерона. Действительно, женщины с уровнем эстрадиола 10 пг/мл или выше имели в среднем небольшое увеличение костной массы во время последующего обследования(среднегодовое изменение=0,1%; 95% CI=-0,5, 0,7), в то время как женщины с необнаруживаемым содержанием эстрадиола (5 пг/мл) теряли костную массу тазобедренного сустава со скоростью почти один процент в год (-0,8%; -1,2, -0,3). Поскольку потеря костной массы может быть очень важным фактором риска в случае переломов тазобедренного сустава у пожилых женщин, эти установленные закономерности позволяют предположить, что даже умеренное повышение уровня циркулирующих гормонов может быть эффективным для уменьшения скоростей потери костной ткани и переломов. Концентрации SHBG сильно влияют на потерю костной массы как пяточной кости, так и тазобедренного сустава независимо от возраста, веса и уровня половых гормонов. SHBG связывает эстрадиол сыворотки и тестостерон, и эта связь может отражать повышенный риск потери костной массы с понижением уровней биодоступных половых гормонов. Однако прочность этой связи даже после классифика 29 ции по содержанию эстрадиола в сыворотке и тестостерона дает возможность предположить,что может существовать и другое влияниеSHBG на прочность костей. Более низкие уровни 25(OH)D связаны с более быстрой потерей костной ткани в тазобедренном суставе, но не в пяточной кости. Полученные ранее результаты перекрестных исследований были совмещены: в двух работах было установлено, что женщины в постклимактерическом периоде, имеющие более низкие уровни 25(OH)D, характеризовались меньшей плотностью костной ткани (см. Villareal, J. Clinet. al., Calcified Tissue International, 55(4): 253256 (1994, но в результате, по меньшей мере,одного перекрестного исследования не было обнаружено заметной зависимости между 25(OH)D и плотностью костной ткани в дистальном отделе лучевой кости, средней части лучевой кости или поясничном отделе позвоночника (см. Tsai et. al., Calcified Tissue International, 40(5): 241-243 (1987. Однако Tsai и др. проводили исследования в группе с широким возрастным интервалом (33-94) и не сообщают данные отдельно для пожилых женщин. Уровень РТН не связан с потерей костной массы в пяточной кости или тазобедренном суставе по нашим данным. Это было справедливым даже после классификации данных по времени года, а также исключения женщин, принимающих добавки кальция или витамина D. Это исследование является перспективным, оно предусматривает скорее измерение скоростей изменения костной массы, а не измерение поперечного профиля костной массы. Образцы сыворотки были получены до определения изменения костной массы. Размер образца был значительно больше, чем в большинстве других релевантных исследований, образцы отбирались у субъектов, вышедших в контингент пожилых женщин, живущих в четырех отдельных регионах в США. В заключение следует отметить, что результаты показывают, что SHBG и эндогенные эстрогены являются важными детерминантами потери костной массы у пожилых женщин. Низкие уровни 25(OH)D связаны с более быстрой потерей костной массы в тазобедренном суставе, но не в пяточной кости. РТН и другие кальциотропные гормоны не оказывают значительного влияния на потерю костной массы у пожилых женщин. Пример 4. Следующий пример и полученные данные демонстрируют корреляцию между уровнем эстрадиола в сыворотке и плотностью костной ткани. 1. Участники эксперимента. В этом исследовании принимали участие участники программы "Изучение остеопорозных переломов" (SOF), которая описана в примере 1. 30 У всех 9704 участников SOF брали интервью, а также обследовали их в одном из клинических центров во время базисного посещения в 1986-1988 годах. Во время этого посещения собирались сведения о состоянии здоровья, врачебном диагнозе и прежних назначениях. Мы получили стандартизованные данные о росте,весе и физической силе. Мы измерили BMD пяточной кости и проксимального отрезка лучевой кости с использованием метода абсорбциометрии с единичным фотоном. Были получены латеральные рентгенограммы грудного отдела позвоночника и поясничного отдела позвоночника. У каждого участника отбирали образцы сыворотки. Участники заполняли ежегодно вопросники и раз в 2 года 3 раза вновь посещали клинику. Во время первого последующего визита (в течение 1988-1990 гг.) мы измеряли BMD проксимального конца бедренной кости с использованием двойной рентгеновской абсорбциометрии (DXA). Подробности этих методов измерения и методика контроля качества денситометрии описаны Steiger et. al., J. Bone Miner. Res. 7: 625-632 (1992). 2. Образцы сыворотки и биохимические исследования. Все участники были проинструктированы о необходимости придерживаться диеты, не содержащей жиров, вечером и снизить до минимума липемию утром в день обследования,что может повлиять на результаты анализов. Кровь брали на анализ между 8 и 14 ч, сыворотку замораживали при -20 С. В течение 2 недель все образцы перевозили в Биомедицинский исследовательский институт (Rockwille, M.D.), где они хранились в жидком азоте (примерно 190 С). Длительную стабильность этих образцов определяли при сравнении уровня эстрадиола через 2 недели хранения при -20 С с уровнем эстрадиола через 3,5 года хранения при-190 С; для 51 образца коэффициент корреляции был равен 0,94, среднее (SD) равнялось 11,8 (9,0) через 2 недели и 10,9 (9,0) через 3,5 года. При обследовании первоначального контингента у 400 случайно отобранных участников были проведены биохимические анализы базисной сыворотки. Для этих анализов мы исключили женщин, у которых не могли измерить уровень эстрадиола в сыворотке (n=134), и женщин, которые сообщили, что они подвергаются текущему лечению с применением эстрогена (n=39); в результате у 247 женщин проводили биохимический анализ. Для каждого субъекта были проведены следующие биохимические анализы: определяли кальциотропные факторы, включая кальций,25-гидроксивитамин D, 1,25-gu-гидроксивитамин D и паратироидный гормон; факторы роста включали инсулиноподобный фактор роста 1 и инсулиноподобный фактор роста, связы 31 вающий протеин 3; маркеры образования кости включали специфическую по отношению к костной ткани щелочную фосфатазу и остеокальцин; половые и адренолиновые гормоны включали эстрадиол, эстрон и тестостерон (общий и свободный), SHBG, дегидроэпиандростерон сульфат (DHEAS); другие эндокринные тесты включали определение тироидстимулирующего гормона (TSH). Методы проведения этих биохимических анализов описаны Reginster et. al., вCalcif. Tissue Intl. 51: 340-343 (1992). Иммуноанализы эстрадиола проводили в Endocrine Sciences Laboratory (Tarzana, CA), где использовали высокочувствительный метод с нижним порогом обнаружения 5 пг/мл. Для подтверждения наших выводов для независимого контингента мы измеряли базисный уровень эстрадиола в сыворотке во втором случайном образце 222 участников SOF, которые соответствовали вышеуказанным критериям отбора и исключения, что в случае первого анализа. Измерение уровня эстрадиола во второй группе проводили в Coring Nichols Institute(San Juan Capistrano, CA), где использовали высокочувствительный метод с нижним порогом чувствительности 2 пг/мл. Результаты исследования 22 образцов расщепленной сыворотки,проведенного двумя вышеуказанными лабораториями, были похожими (коэффициент корреляции=0,9; наклон 1,3). 3. Определение деформации позвоночника. Для диагностики преобладающей деформации позвоночника в базисный момент использовали метод рентгеновской морфометрии; критерием преобладающей деформации было 3 SD уменьшение длины, по меньшей мере,одного позвонка, переднего, среднего и заднего отрезка (см. Black et. al., J. Bone Miner. Res. 10: 890-902 (1995. 4. Статистические анализы. Анализы проводились в SOF CoordinatingCenter в Калифорнийском университете в СанФранциско. При подготовке первого образца (n=247) женщины группировались в 4 группы по содержанию эстрадиола в сыворотке: в 1 группе были все женщины с неопределяемым уровнем (5 пг/мл) эстрадиола (n=81); остальные были разделены на три примерно равные группы по содержанию эстрадиола 5-6 пг/мл, 7-9 пг/мл и 1025 пг/мл; число субъектов в этих группах составляло 55 (22,3%), 63 (25,5%) и 48 (19,4%). При подготовке второго (подтверждающего) образца (n=222) использовались те же опреде 004573 32 ляющие величины содержания эстрадиола; количество субъектов в этих группах составляло 25,2, 27,5, 24,8 и 22,5%. У всех обследуемых был измерен вес и зафиксирован возраст. Поскольку вес и BMI в сильной степени коррелируются, и вес сильно влияет на BMD (см. Bauer et. al., Ann. Intern.Med. 118: 657-665 (1993, мы выбрали показатель веса для включения в модели. Затем мы провели оценку возможного вклада переменных, проверив вначале те переменные, которые мы рассматривали как потенциальные предикторы плотности костной ткани или остеопорозных переломов. Если какой-либо потенциальный фактор показывал наличие постоянной тенденции (анализ изменений при определении линейной тенденции) во влиянии уровня эстрадиола, мы изучали его действие в мультипеременных моделях, в которых конечными параметрами являлись величины плотности костной ткани в четырех областях костного скелета. Эти модели включали возраст, клиническое состояние, уровни эстрадиола, а также возможный предикотор. Если изучаемый переменный параметр сохранялся в большинстве этих моделей,он считался нужным. Мы также добавили в модели величину силы рукопожатия и употребление сигарет, так как в наших более ранних исследованиях эти переменные оказались предикторами BMD (см. Bauer et. al., Ann. Intern. Med. 118: 657-665 (1993 и переломов (см. Cummingset. al., N. Engl. J. Med. 332: 767-773 (1995. С использованием метода анализа изменений для каждой группы с определенным содержанием эстрадиола рассчитывали величинуBMD. Для определения статистической значимости разницы между значениями BMD в группе, где не удавалось определить уровень эстрадиола, и в остальных трех группах использовали метод Dunnet'a. Для расчета многократно классифицированного коэффициента случайности и 95% доверительного интервала для определения риска преобладающей деформации позвоночника для каждой из трех групп с определенным уровнем эстрадиола и группы с самым низким(неопределяемым) содержанием эстрадиола использовали логистическую регрессионную модель. Исследования проводили в SAS (SAS Institute, Саrу, NC). 5. Уровень эстрадиола у обследуемых. Полученные клинические данные для вышеуказанных групп женщин приведены в табл. 10. Таблица 10. Клинические и лабораторные данные для 247 пожилых женщин, разбитых на группы с определенным содержанием эстрадиола в сыворотке Средний возраст женщин при проведении этого исследования составлял около 72 лет(табл. 10). Среднее содержание эстрадиола меняется с возрастом, женщины в возрасте 65-74 лет имели средний (SD) уровень эстрадиола 5,8(5,1) пг/мл, а в возрасте 80 лет - 6,3 (4,9) пг/мл). Рост не сказывается на величине уровня эстрадиола. Вес тела статистически влияет гораздо больше у женщин с самым высоким уровнем эстрадиола. Биохимические анализы, которые не выявили большой или постоянной разницы в показателях в зависимости от уровня эстрадиола, включали определение кальциотропных факторов, факторов роста, специфической костной щелочной фосфатазы и DHEAS(данные не приведены). Содержание эстрона и общего тестостерона у женщин с самым высоким уровнем эстрадиола было в 2 раза выше, 004573 34 чем у женщин с неопределяемым уровнем эстрадиола. Некоторые переменные, включая вес тела, сильно и постоянно отличались в группах с разным содержанием эстрадиола. Наблюдалась тенденция к снижению уровня остеокальцина с увеличением содержания эстрадиола. Ввиду того, что вес тела и уровень SHBG также меняются с изменением уровня эстрадиола и слабо влияют на BMD, измеренную 4 раза, эти параметры также были включены в модель наряду с возрастом, силой рукопожатия и курением во время общего обследования. Базисные значения BMD всех четырех отделов костного скелета, классифицированные в зависимости от возраста и веса также характеризуются тенденцией к возрастанию с повышением уровня эстрадиола. По сравнению с женщинами с уровнем эстрадиола в сыворотке 5 пг/мл, женщины, у которых этот показатель составлял 10-25 пг/мл, характеризовались значительно большими средними величинами BMD во всех отделах костного скелета, разница составляла 4,6, 6,1, 5,8 и 7,1% для всего тазобедренного сустава, пяточной кости, проксимального отрезка лучевой кости и позвоночника(р 0,05 для каждого сравнения). После множественной классификации разница оставалась статистически значимой: 5,7, 6,3, 6,5 и 6,9% для всего тазобедренного сустава, пяточной кости,проксимального отрезка лучевой кости и позвоночника. В ходе подтверждающего обследования у женщин были показатели, сходные с показателями у женщин при первоначальном обследовании, включая уровень эстрадиола. У контингента, проходившего подтверждающее обследование, наблюдалась похожая зависимость между уровнем эстрадиола в сыворотке и BMD. Та же картина наблюдалась и для BMD всех четырех отделов костного скелета, классифицированного по возрасту и весу. По сравнению с женщинами с содержанием эстрадиола в сыворотке 5 пг/мл женщины с аналогичным показателем, равным 10-25 пг/мл, имели BMD всего тазобедренного сустава, пяточной кости, проксимального отрезка лучевой кости и позвоночника на 4,9, 9,6, 7,3 и 6,8% больше, соответственно. После многочисленной классификации разница оставалась статистически значимой: на 3,8, 7,0, 5,4 и 6,9% больше в случае тазобедренного сустава, пяточной кости, проксимального отрезка лучевой кости и позвоночника. У 30% женщин с самым низким уровнем эстрадиола (5 пг/мл) наблюдалась 1 преобладающая деформация позвоночника, в противоположность этому, у женщин в трех других группах это наблюдалось только у 7-19%. После классификации по возрасту и весу у женщин с уровнем эстрадиола 5-25 пг/мл деформация встречалась реже на 60% по сравнению с женщинами с необнаруживаемым уровнем эстрадиола (OR=0,4, 95% доверительный интервал(CI) 0,2-0,8); это отношение почти не изменилось после классификации эстрадиола (OR=0,4,СI=0,2-0,7). В подтверждающей группе никакой связи между уровнем эстрадиола и преобладающей деформацией позвоночника не было установлено; частота деформации колебалась во всех группах от 15 до 19%. 6. Выводы. Полученные данные показывают, что уровень эстрадиола в сыворотке менее 5 пг/мл оказывает отрицательное влияние на состояние костного скелета у пожилых женщин. После классификации по возрасту и весу было установлено, что женщины с уровнем эстрадиола 5 пг/мл имеют гораздо меньшую BMD во всех отделах костного скелета. Кроме того, полученные данные показывают, что остеокальцин, индикатор хрупкости костей, имеет тенденцию к возрастанию с понижением уровня эстрадиола в сыворотке у пожилых женщин. Вероятное объяснение заключается в том, что эстрадиол, когда он содержится в низких концентрациях, снижает обновление костного скелета, обеспечивает лучшее качество и большую плотность костной ткани и тем самым уменьшает вероятность переломов. Разница BMD, которую мы наблюдали,была существенной и соответствовала примерно 0,4 стандартного отклонения (SD) даже после классификации в соответствии с многими факторами. Как ожидается, эта разница на 30% уменьшит риск переломов тазобедренного сустава (предположим, что 1,0 SD=0,11 г/см 2 и разница 1,0 SD=RR 2,8). Используя аналогичные расчеты, мы подсчитали, что можно ожидать,что увеличение плотности костной ткани позвоночника, связанное с уровнем эстрадиола в сыворотке 10-25 пг/мл, эквивалентным примерно 0,4 SD, снизит риск перелома позвоночника на 23% (предположим, что 1,0 SD=0,17 г/см 2 и разница 1,0 SD=RR 2,1). У женщин в постклимактерическом состоянии широко изучался в качестве предиктора состояния костного скелета эстрон. Было установлено, что и у белых, и у черных женщин BMD находится в обратнопропорциональной зависимости от уровня эстрона в сыворотке (см. Cauley et. al., Am. J. Epid. 139 : 1035-1046 (1994. Однако это исследование было ограниченным, так как уровень эстрадиола был ниже предела обнаружения более,чем у половины женщин. Эстрон не являлся предиктором переломов тазобедренного сустава. У женщин в постклимактерическом состоянии эстрон в количественном отношении является преобладающим эстрогеном и образуется, в основном, при превращении андростендиона надпочечников. Эстрадиол образуется при восстановлении эстрона и путем ароматизации тестостерона, вырабатываемого яичниками и надпочечниками, который образуется при превращении андростендиона и DHEA (см. Cauley et. 36 свидетельствуют о существовании довольно высокой степени корреляции между уровнем эстрона и уровнем эстрадиола в сыворотке как в первоначальном образце (r = 0,65), так и подтверждающем образце (r=0,78). Считается, что эстрадиол, а не эстрон, является гормоном - эффектором у ядерного рецептора (см. Grodin et.al., J. Clin. Endo. Metab. 36: 207-214 (1973. Кроме того, эстрадиол является в 4-10 раз более сильнодействующим, чем эстрон. Эстрадиол представляет собой основной половой стероидный гормон, который сильно, последовательно влияет на костный скелет, и можно ожидать его положительное воздействие на образование костного скелета. Эстрадиол может оказывать положительное воздействие на костный скелет в соответствии с несколькими возможными механизмами: он уменьшает активацию костных метаболических единиц; он препятствует стимуляции резорбции костей паратироидным гормоном; он способствует выживаемости остеобластов через локальные цитокины или другие факторы роста; он улучшает как эффективность абсорбции кальция желудочно-кишечным трактом, так и сохранение почечного кальция. Некоторые или все указанные эффекты могут отвечать на очень низкие уровни эстрадиола. Наши данные также подтверждают влияние эстрадиола на обновление костей. Косвенно эстрадиол может влиять на состояние костной массы через вес тела, но наши данные учитывали вес тела и все же подтверждали наличие сильной зависимости. В прошлом изучение влияния эстрадиола было затруднено вследствие применения нечувствительных методов анализа. Только очень чувствительные и точные методы позволяют уловить разницу между низким (30 пг/мл) и очень низким (5 пг/мл) уровнем эстрадиола. Очень немногие коммерческие лаборатории проводят определение уровня эстрадиола с нижним пределом обнаружения менее 20 пг/мл. Отсутствие таких чувствительных методов могло помешать другим исследователям установить имеющиеся закономерности. Разница между низким и очень низким уровнем эндогенного эстрадиола является очень тонкой, и могло пройти много лет, прежде чем была установлена разница в BMD. Наши данные показывают, что после 65 лет уровень эстрадиола не снижается. Наши результаты показывают защитное действие низких концентраций эстрадиола против уменьшения костной массы и возникновения переломов; эта зависимость является последовательной, так как ее можно наблюдать при измерении плотности костной ткани в нескольких отделах костного скелета, в случае потери костной массы в тазобедренном суставе, пяточной кости и риске перелома позвоночника. Эти данные получены с использованием различных лабораторных высоко чувствительных методов определения уровня эстрадиола. Положительное 37 действие на костный скелет у пожилых людей эстрадиол оказывает при таком содержании,которое раньше считалось не оказывающим физиологического действия. Вышеприведенное описание предпочтительных аспектов и примеров иллюстрирует данное изобретение, не ограничивает его. Объем изобретения определяется нижеследующей формулой изобретения, включающей также эквиваленты. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения соматических физических состояний во время постклимактерического периода, отличающийся тем, что он предусматривает системное введение эстрогена в количестве, достаточном для обеспечения уровня эстрогена в сыворотке, эквивалентного содержанию в сыворотке эстрадиола, равного примерно 5-15 пг/мл. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что физические состояния выбраны из группы,включающей постклимактерическое уменьшение содержания эстрогена, повышенный риск остеопорозного перелома костей из-за постклимактерического остеопороза и снижение плотности костной ткани. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество эстрогена, которое вводится, достаточно для обеспечения уровня эстрогена в сыворотке, эквивалентного содержанию эстрадиола в сыворотке, равного примерно 5-10 пг/мл. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что эстроген представляет собой эстрадиол. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанное количество эстрадиола вводится орально. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что эстрадиол вводится в количестве менее чем 0,5 мкг в день. 7. Способ по п.5, отличающийся тем, что эстрадиол вводится в количестве 0,10-0,25 мкг в день. 8. Способ по п.4, отличающийся тем, что эстрадиол вводится парентерально. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что эстрадиол вводится в количестве менее чем 20 мкг в день. 10. Способ по п.8, отличающийся тем, что эстрадиол вводится в количестве 5-15 мкг в день. 11. Способ по п.8, отличающийся тем, что эстрадиол вводится в количестве около 10 мкг в день. 12. Способ по п.4, отличающийся тем, что эстрадиол вводится трансдермально. 38 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что трансдермально вводят не более примерно 15 мкг эстрадиола в день. 14. Способ по п.12, отличающийся тем, что трансдермально вводят примерно 5-15 мкг эстрадиола в день. 15. Способ лечения соматических физических состояний во время постклимактерического периода, отличающийся тем, что он предусматривает трансдермальное введение пациенту эстрогена в количестве, эквивалентном менее чем примерно 20 мкг эстрадиола в день, практически в отсутствие экзогенного прогестина,причем уровень эстрогена в сыворотке пациента эквивалентен содержанию в сыворотке эстрадиола, равного примерно 5-15 пг/мл. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанные физические состояния выбраны из группы, включающей постклимактерическое снижение содержания эстрогена, повышенный риск остеопорозного перелома костей из-за постклимактерического остеопороза и снижение плотности костной ткани. 17. Способ по п.15, отличающийся тем, что введение эстрогена осуществляют до гистерэктомии пациента. 18. Способ по п.15, отличающийся тем, что эстроген представляет собой эстрадиол. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что он дополнительно включает в себя операцию определения уровня эстрадиола в сыворотке у пациента перед лечением и обнаружение, является ли уровень эстрадиола в сыворотке у пациента нормальным для женщин во время постклимактерического периода, имеющих ту же возрастную группу, что и пациент. 20. Способ по п.18, отличающийся тем, что вводят примерно 5-15 мкг эстрадиола в день. 21. Способ по п.18, отличающийся тем, что вводят примерно 10 мкг эстрадиола в день. 22. Набор для пациента, страдающего от соматических физических состояний, вызванных постклимактерическим снижением содержания эстрогена, отличающийся тем, что он включает в себя а) трансдермальный пластырь для системного введения эстрогена в количестве, достаточном для обеспечения уровня эстрогена в сыворотке, эквивалентного содержанию в сыворотке эстрадиола, равного примерно 5-15 пг/мл; и б) инструкции, описывающие метод применения трансдермального пластыря для лечения соматических физических состояний, вызванных постклимактерическим снижением содержания эстрогена у данного пациента.