Способ отбора крестоцветного растения, обладающего повышенной антиканцерогенной активностью, и потомка указанного растения и способ получения проростков крестоцветного растения

1 Данное изобретение сделано при поддержке правительства США по гранту NIH 1PO1 СА 44530, и правительство США имеет определенные права в отношении данного изобретения. Область изобретения относится к способам отбора крестоцветного растения и его потомка,обладающих высокими антиканцерогенными свойствами. В частности, изобретение относится к способам отбора растений брокколи и цветной капусты с высокими антиканцерогенными свойствами. Изобретение относится к способам отбора крестоцветных растений, содержащих значительные количества химических соединений, которые модулируют ферменты млекопитающих, участвующие в обмене канцерогенов. Эти соединения стимулируют активность ферментов фазы 2, не стимулируя биологически значительно активность тех ферментов фазы 1,которые активизируют канцерогены. Более конкретно, отобранные заявляемым способом растения крестоцветных содержат увеличенное отношение содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов. Далее изобретение относится также к способу проращивания семян отобранных крестоцветных растений, которые обладают повышенной антиканцерогенной активностью. Предшествующий уровень техники Общепризнано, что диета играет важную роль в ограничении опасности развития рака и что увеличение потребления фруктов и овощей снижает заболеваемость раком у людей. В настоящее время считается, что основной механизм защиты зависит от присутствия в растениях химических компонентов, которые, попадая в клетки млекопитающих, повышают уровни ферментов фазы 2, обезвреживающих канцерогены. Ферменты фазы 2 осуществляют эффективную детоксификацию электрофильных форм канцерогенов, которые в ином случае повредили бы ДНК. Соединения, повышающие уровень ферментов фазы 2, называются "селективными стимуляторами". Селективные стимуляторы ферментов фазы 2 называются монофункциональными стимуляторами. Это означает, что они стимулируют только ферменты фазы 2, не оказывая существенного влияния на активность ферментов фазы 1. В отличие от них, соединения, стимулирующие ферменты как фазы 1, так и фазы 2, называются бифункциональными стимуляторами, (см. ProchaskaTalalay (1988)Cancer Res. 48: 4776-4782). Почти все монофункциональные стимуляторы электрофильны и принадлежат по меньшей мере к 9 различным химическим классам (см. Prestera и др. (1993)ego). Единственным очевидным общим свойством, присущим всем этим стимуляторам, является их способность реагировать с тиоловыми группами. Таким образом, монофункциональные стимуляторы представляют собой антиканцерогенные агенты, снижающие восприимчивость млекопитающих к токсичным и вызывающим новообразования эффектам канцерогенов. Такие агенты могут иметь растительное присхождение или быть синтетическими соединениями. Были получены также синтетические аналоги существующих в природе стимуляторов, и было доказано, что они блокируют химический канцерогенез у животных (см. Posner и др. (1994) J. Med.Cancer Res. (Suppl) 54: 1976s-1981s). Разработаны высокоэффективные методы измерения способности экстрактов растений повышать или стимулировать активность ферментов фазы 2 (ProchaskaSantamaria (1988)Proc Natl. Acad Sci. USA 89: 2394-2398). Кроме того, эти методы применяются для выделения соединений, ответственных за действие стимуляторов в растениях, и для оценки антиканцерогенного действия этих соединений и их синтетических аналогов (Zhang и др. (1992) Proc. Natl.(1994) J.Med. Chem. 17: 170-176). Эти методы позволили выделить крестоцветные растения как возможный источник стимулирующего воздействия. Однако уровни такого воздействия сильно различаются у разных растений в зависимости от сорта и условий выращивания и сбора. В настоящее время известно, что стимулирующее воздействие крестоцветных растений большей частью зависит от присутствия и количеств изотиоцианатов и их биогенных предшественников - глюкозинолатов. Глюкозинолаты преобразуются в изотиоцианаты под действием фермента мирозиназы, который представляет собой тиоглюкозид глюкогидролазы. В нормальном состоянии мирозиназа и глюкозинолаты в клетке разделены. Если же клетка повреждена с разрушением внутриклеточных перегородок, мирозиназа входит в контакт с глюкозинолатами и преобразует их в изотиоцианаты. Хотя глюкозинолаты сами по себе не являются стимуляторами ферментов фазы 2 у млекопитающих, продукты их преобразования под действием мирозиназы таковыми являются. Именно изотиоцианатные продукты являются потенциальными монофункциональными стимуляторами ферментов фазы 2 в определении биологической активности QR на клетках гепатомы мышей. Однако не все глюкозинолаты продуцируют изотиоцианаты, являющиеся стимуляторами ферментов фазы 2. Некоторые глюкозинолаты(например, алкилтиоалкилглюкозинолаты) образуют изотианаты, которые являются потенциальными антиканцерогенными агентами. Другие же глюкозинолаты (например, индолглюкозинолаты) образуют такие соединения, как индол 3-карбинол и индол-3-ацетонитрил), которые по ряду причин вызывают сомнения. Во-первых,такие соединения являются бифункциональными стимуляторами, т.е. стимулируют как ферменты фазы 1, так и ферменты фазы 2. Ферменты фазы 1 могут активизировать ксенобиотики,создавая тем самым канцерогены (ProchaskaTalalay (1988) Cancer Res. 48: 4776-4782). Вовторых, индолглюкозинаты являются лишь слабыми стимуляторами ферментов фазы 2 (Faheyfor Disease Prevention I (функциональные продукты питания для профилактики заболеваний) под ред. Shibamoto и др., с. 16-22, Симпозиум Американского Химического Общества, серия 701, Вашингтон, округ Колумбия). В третьих,эти соединения сами по себе действуют как активаторы развития опухоли (Kim D.J. и др.(1997) Carcinogenesis 18(2): 377-381). Наконец,эти соединения в кислотной среде, в которую они попадают в желудке, могут образовывать продукты конденсации, которые являются потенциальными канцерогенами, очень похожими на диоксин (TCDD) (Bjeldanes L.F. и др. (1991)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 88:9543-9547). Таким образом, величина стимулирующей активности зависит как от количества, так и от качества глюкозинолатов, присутствующих в крестоцветных растениях. Например, брокколи и цветная капуста на товарной стадии развития имеют одни из самых высоких уровней содержания алкилтиоалкилглюкозинолатов, 4-метилсульфинилбутил- и 3-метилсульфинилпропилглюкозинолата, которые до сих пор отмечались в овощах. Они содержат, однако, аналогичные уровни индолглюкозинатов - глюкобрассицина(индол-3-метилглюкозинат), неоглюкобрассицина и 4-гидроксиглюкобрассицина. С другой стороны, в пророщенных семенах, ростках и молодых растениях брокколи и цветной капусты содержатся более высокие концентрации глюкозинолатов, чем в овощах, поступающих на рынок. Количество глюкозинолатов, присутствующих в проростках, может до некоторой степени зависеть от вымывания глюкозинолатов из семян при их набухании и прорастании. Процессы набухания и прорастания семян,а также затравки, осмокондиционирования,матрикондиционирования и т.п., хотя связаны прежде всего с поступлением воды в семя и проросток, включают также и утечку, или вымывание, химических веществ из прорастающего семени. Количество химических веществ,вымываемых из семени, можно регулировать путем изменения среды, в которую помещается семя, хотя некоторая утечка неизбежна. Кроме 4 того, величина утечки может зависеть также от качества партии семян и от типа семян. Однако вымывание во время набухания снижает содержание глюкозинолатов в семенах и проростках, уменьшая тем самым их антиканцерогенную активность. Таким образом, в данной области существует потребность в определении конкретных крестоцветных растений, которые дают высокие уровни стимуляторов активности ферментов фазы 2 с целью химиозащиты. Существует также потребность в выявлении крестоцветных растений, продуцирующих известный спектр конкретных стимуляторов ферментов фазы 2, с целью повышения прицельности инактивации конкретных канцерогенов или классов канцерогенов. Далее существует потребность в получении зародышевой плазмы с повышенными уровнями активности стимуляторов ферментов фазы 2 и в разработке методов эффективной работы со спектром стимуляторов, получаемых в конкретных сортах и линиях. Наконец, существует потребность в получении семян и проростков с пониженным вымыванием глюкозинатов при проращивании. Имеется также потребность в разработке методов коммерческого производства проростков, обеспечивающих повышенную антиканцерогенную активность растений, поставляемых на рынок. Поэтому желательно получить сорта крестоцветных, обладающих постоянной по качеству и количеству антиканцерогенной активностью. Желательно также получить сорта крестоцветных, обладающие очень высокой антиканцерогенной активностью. Такие сорта крестоцветных включают перекрестно опыленные и инбредные линии брокколи и цветной капусты,которые содержат высокие уровни алкилтиоалкилглюкозинатов по сравнению с уровнями индолглюкозинатов. Кроме того, желательно получить семена и проростки крестоцветных с пониженным вымыванием глюкозинатов при проращивании. Желательно также разработать методы товарного производства проростков, обеспечивающие высокую антиканцерогенную активность проростков, поставляемых на рынок. Сущность изобретения Повышения антиканцерогенных свойств овощей, семян и проростков семейства крестоцветных можно достичь путем получения новой зародышевой плазмы способами, соответствующими настоящему изобретению. Следовательно, цель настоящего изобретения - создать способы отбора крестоцветных растений, в частности, брокколи и цветной капусты, содержащих значительные количества химических соединений, защищающих от раковых заболеваний. Другая цель изобретения - создать способы отбора крестоцветного растения, в частности,брокколи и цветной капусты, содержащих зна 5 чительные количества стимуляторов ферментов фазы 2 и в основном не содержащей стимуляторов ферментов фазы 1. Еще одна цель изобретения - создать способы отбора крестоцветных растений, в частности, брокколи и цветной капусты, содержащих значительные количества потенциальных стимуляторов ферментов фазы 2 и нетоксичные уровни индолглюкозинатов и продуктов их распада. Такие растения имеют повышенное отношение содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатам в соответствующей ткани, которая предназначена в конечном счете для продажи и последующего потребления. Эта ткань включает семена, проростки и кочаны товарной стадии. Далее целью изобретения является создание способов отбора инбредных или дублированных гаплоидных крестоцветных, в частности, брокколи и цветной капусты, путем их отбора на повышенное отношение содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов. Целью изобретения является также создание инбредных или дублированных гаплоидных крестоцветных, в частности, брокколи и цветной капусты, с повышенным отношением содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов. Еще одна цель изобретения - создать способы отбора инбредных или дублированных гаплоидных крестоцветных растений, с семенами, характеризующимися низкой степенью вымывания вещества семени и повышенным содержанием глюкозинолатов. Еще одна цель изобретения - создать способ проращивания семян и выращивания ростков крестоцветных с целью увеличения антиканцерогенной активности проростков. Эти и другие цели достигаются путем создания способа отбора крестоцветных растений,а именно, брокколи и цветной капусты, с повышенными антиканцерогенными свойствами,который включает использование популяции диплоидного растения, полученного удвоением хромосом гаплоидного растения, и отбор индивидуального растения с повышенным отношением содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата. Кроме того, или альтернативно, это индивидуальное растение также дает семена со сниженной степенью вымывания вещества семян при прорастании и выращивании ростков, что увеличивает содержание глюкозинолатов. Популяцию диплоидных растений можно получить от родительского растения методом культивирования из пыльников. Операция отбора может содержать скрининг каждого растения на определение в нем отношения содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата. Кроме того,операция отбора может содержать операции 6 приготовления экстракта из растения и измерения количества алкилглюкозинолата и индолглюкозинолата в этом экстракте. Наконец, операция скрининга может включать скрининг семян, получаемых от каждого растения, с целью определения величины вымывания веществ из семени, а также содержания глюкозинолатов в самих семенах и в получаемой при вымывании вытяжке. Кроме того, создан способ отбора крестоцветных растений, в частности, брокколи и цветной капусты, с повышенными антиканцерогенными свойствами, включающий использование популяции диплоидного растения, полученного удвоением хромосом гаплоидного растения, отбор индивидуального растения с повышенным отношением содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата и самоопыление отобранного растения и отбор потомства от самоопыленного растения с повышенным отношением алкилглюкозинолата к индолглюкозинолату. Кроме того, или альтернативно, это индивидуальное растение также дает семена со сниженной степенью вымывания вещества семян, что увеличивает содержание глюкозинолатов. Потомство от самоопыленного растения также может давать семена со сниженной степенью вымывания вещества семян. Создан также способ отбора крестоцветных растений с повышенными антиканцерогенными свойствами, включающий использование растений, подвергнутых метагенезу, и отбор индивидуального растения с повышенным отношением содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата. Кроме того,или альтернативно, это индивидуальное растение также дает семена со сниженной степенью вымывания вещества семян, что увеличивает содержание глюкозинолатов. Создан также сорт крестоцветных, имеющий повышенное отношение содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата, причем указанное повышенное отношение превышает приблизительно на 10%,предпочтительно на 20%, предпочтительнее всего на 30% или более то отношение, которое наблюдается в родительском растении, из котрого выведен сорт. Кроме того, или альтернативно, данный сорт крестоцветных дает семена со сниженной степенью вымывания вещества семян при проращивании и росте. Далее создан способ проращивания семян и выращивания ростков крестоцветных в условиях, позволяющих увеличить антиканцерогенную активность проростков, в котором набухание и прорастание семян происходит при соотношении воды и сухих семян, едва достаточном для нормального роста в течение обычного периода товарного проращивания и исключающем какое-либо существенное стекание воды с ростков. 7 Таким образом, настоящее изобретение направлено на создание способа отбора растения, содержащего измерение отношения содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата и отбор растения, если это отношение составляет определенное число. Предпочтительно растение является диплоидным растением, полученным удвоением хромосом галлоидного растения, например, указанное гаплоидное растение получают методом культивирования из пыльников, или растение подвергают мутагенезу, например, с применением химического мутагена (такого как этилметансульфонат), причем растение подвергают мутагенезу до операции измерения указанного выше соотношения. Предпочтительно растение является крестоцветным, таким как брокколи, желательно принадлежащим к культурному сорту, выбранному из группы, состоящей из следующих сортов: Сага, ДеЧикко, Эверест, Эмералд Сити,Пэкмен, Корвет, Денди ранний, Император, Маринер, Грин Комет, Грин Вэлиант, Аркадия,Калабрийская Каравелла, Ченселлор, Сайтейшн,Круизер, Ранняя Пурпурная брокколи Ред Эрроу, Эврика, Эксцельсиор, Галеон, Джинга, Голиаф, Грин Дюк, Грин Белт, Итальянская брокколи, Хай Сьерра, Поздняя Пурпурная, Поздняя зимняя Уайт Стар, Легенда, Лепрехаум, Марафон, Маринер, Минарет (Романеско), Парагон,Патриот, Премиум Кроп, Репайн (Весенний Рааб), Розалинд, Салатная (Фолл Рааб), Самурай,Сегун, Спринтер, Султан, Тайко, Трикси и Викинг. В другом варианте растение является крестоцветным, таким как цветная капуста, желательно принадлежащим к культурному сорту,выбранному из группы, состоящей из следующих сортов: Альверда, Эмейзинг, Анды, Бургунди Квин, Кандид Чарм, Кашмир, Кристмас Уайт, Доминант, Эльби, Сноубол и селекционированные из него сорта, Фримонт, Инклайн,Милкивэй Минитмен, Рашмор, S-207, Серрано,Сьерра Невада, Сирия, Сноу Краун, Сноу Флейк, Сноу Грейс, Сноубред, Солид, Тайпэн,Вайолет Куин, Уайт Барон, Уайт Бишоп, Уайт Контесса, Уайт Корона, Уайт Доув, Уайт Флеш,Уайт Фокс, Уайт Найт, Уайт Лайт, Уайт Куин,Уайт Рок, Уайт Сэйлз, Уайт Саммер, Уайт Топ,Юкон. Настоящее изобретение относится также к способу получения растения-потомка, содержащему измерение отношения содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата в ткани потенциального родительского растения, отбор потенциального родительского растения, если это отношение составляет определенное число, и получение растения-потомка от отобранного растения. Предпочтительно отношение содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата в ткани растения-потомка выше, чем в ткани отобранного 8 растения, причем ткань растения-потомка и ткань родительского растения относятся к одному и тому же типу. Настоящее изобретение относится также к растению-потомку, полученному этим способом. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанное отношение в ткани растения потомка по меньшей мере на 10, 20,30, 50 или 100% выше, чем в ткани отобранного растения. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное отношение в ткани растения потомка по меньшей мере в 10 раз или в 100 раз выше, чем в ткани отобранного растения. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное отношение в ткани растения потомка выше, чем в ткани отобранного растения, на величину от 10 до 100%, от 20 до 80% или от 30 до 60%. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное отношение в ткани растения потомка выше в 10100 раз или в 25-75 раз, чем в ткани отобранного растения. Предпочтительно растениепотомок получают самоопылением отобранного растения, или же растение-потомок является гибридным растением. Настоящее изобретение относится также к крестоцветному растению, такому как растение брокколи или цветной капусты, у которого отношение содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглю-козинолата в ткани растения составляет больше 6, 10, 25, 50, 100 или 1000. В предпочтительном варианте осуществления изобретения отношение содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата в ткани растения составляет от 6 до 1000, от 10 до 500, от 25 до 250 или от 50 до 100. Настоящее изобретение относится также к способу отбора семени или проростка, содержащему (а) добавление некоторого количества воды к семени или проростку, (b) измерение концентрации глюкозинолатов в вытяжке из семени или проростка, и (с) отбор семени или проростка, если концентрация имеет определенную величину. Настоящее изобретение относится также к способу получения растения-потомка, содержащему (а) добавление некоторого количества воды к семени или проростку, (b) измерение концентрации глюкозинолата в вытяжке из семени или проростка, (с) отбор семени или проростка, если концентрация имеет определенную величину, и (d) получение растения-потомка из отобранного семени или проростка. Настоящее изобретение относится также к способу приготовления проростков, содержащему (а) использование некоторого количества семян, (b) добавление к семенам от 0,6 до 1,0 г воды на 1 г семян, (с) прорастание политых водой семян и образование проростков и (d) добавление к проросткам от 5 до 8 мг воды на 1 9 проросток за каждые 24 ч в течение от 24 до120 ч. Предпочтительно операция (b) содержит добавление к семенам от 0,7 до 0,9 г воды (в идеале 0,8 г) на 1 г семян. Предпочтительно операция (d) содержит добавление к проросткам от 6 до 8 мг (в идеале 7 мг) воды на 1 проросток за каждые 24 ч в течение от 24 до 120 ч. Предпочтительно операция (d) содержит добавление к проросткам от 5 до 9 мг (в идеале 7 мг) воды на 1 проросток за каждые 24 ч в течение от 48 до 120 ч (в идеале 72 ч). Проростки являются проростками крестоцветных, таких как брокколи или цветная капуста. Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения будут понятны из приводимого ниже подробного описания. Следует,однако, понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и показывают наилучшие способы осуществления изобретения,даются исключительно для иллюстрации, поскольку специалистам из подробного описания станет очевидна возможность различных изменений и модификаций в рамках сущности и объема настоящего изобретения. Подробное описание предпочтительного варианта осуществления изобретения 1. Определения. В нижеследующем описании широко используется ряд терминов. Культивирование пыльников - культивирование in vitro пыльников для получения гаплоидных или гомозиготных регенерированных растений. Пыльники содержат микроспоры или незрелые пыльцевые зерна, которые при выращивании на питательной среде в соответствующих условиях образуют эмбрионы, которые, в свою очередь, могут быть регенерированы в растения. Поскольку культивируемые клетки микроспор и незрелые пыльцевые зерна получают из клеток, прошедших мейоз, у них число хромосом составляет половину от числа хромосом родительского растения, поэтому растения,регенерированные из таких клеток, являются гаплоидными. Антиканцерогенный агент - синтетическое или встречающееся в природе химическое вещество, снижающее восприимчивость млекопитающих к токсическим и вызывающим новообразования эффектам канцерогенов. Диплоидное растение - растение, полученное удвоением хромосомного набора гаплоидного растения. Как правило, гаплоидное растение получают культивированием пыльников; хромосомы дублируются либо искусственно,например, путем обработки колхицином, либо самопроизвольно. Диплоидное растение гомозиготно во всех местоположениях генов. Повышенное отношение содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата - отношение, превышающее то отношение, которое наблюдается у 70%, предпочтительнее у 80%, предпочтительнее всего - у 90% 10 обследованной популяции растений, или превышающее отношение, наблюдаемое у родителя(ей), от которого(ых) произошло анализируемое растение, желательно не менее чем на 20%. Альтернативное определение повышенным считается отношение, которое не встречается в природе и получено искусственно, например,путем обработки мутагенами или сомаклонального (somaclonal) изменения при выращивании ткани, и которое существенно выше обычно встречающегося в популяции растений, из которой получены обработанные растения. Глюкозинолатный профиль - определение как типов глюкозинолатов, так и количества глюкозинолата каждого типа, содержащегося в растении. Глюкозинолатный профиль можно определить путем измерения количеств алкил- и индолглюкозинолатов и вычисления их отношения. Стимулирующая активность, или активность стимулирования ферментов фазы 2 - мера способности соединения(й) стимулировать активность ферментов фазы 2. (См. ProchaskaProchaska и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2394-2398). Инбредная, или чистая, линия - линия растений, которая гомозиготна или близка к этому. Обычно такие линии получают обычными селекционными методами, однако, в последнее время такие линии стало возможно получать методами выращивания тканей, например, получением дублированных гаплоидов. Инбредные линии используют для выведения гибридов. Стимулирующий потенциал, или потенциал стимулирования ферментов фазы 2 - мера совокупных величин стимулирующей активности в ткани растений, обеспечиваемой изотиоцианатами плюс глюкозинатами, которые под воздействием мирозиназы могут превращаться в изотиоцианаты. Глюкозинаты сами по себе не являются непосредственными стимуляторами ферментов фазы 2 у млекопитающих, но стимулирующими свойствами обладают их продукты,образующиеся при обмене веществ - изотиоцианаты. Культурный сорт - группа аналогичных растений, которые принадлежат к одному виду и которые по своим структурным особенностям и свойствам отличаются от других сортов того же вида. Две основные характеристики сорта идентичность и воспроизводимость. Идентичность необходима для того, чтобы сорт можно было распознавать и отличать от других сортов в пределах вида культуры. Отличительными чертами могут быть морфологические характеристики, окраска, физиологические функции,реакции на болезни или потребительские свойства. Большинство сельскохозяйственных растений являются чистыми по тем характеристикам, которые определяют сорт. Воспроизводимость необходима для того, чтобы характери 11 стики, по которым идентифицируется сорт, воспроизводились в потомстве. Сорт выводится из линии, т.е. популяции, размноженной из одного генотипа или смеси генотипов. Если устанавливается, что линия обладает улучшенными свойствами, она получает название, размножается и поступает на рынок в качестве "сорта" или"культурного сорта". Термины "культурный сорт" и "сорт" взаимозаменяемы, но первый из них обычно используется в научной литературе,а второй применяется американскими фермерами и в торговле семенами. 2. Описание. Основной механизм защиты, с помощью которого крестоцветные растения снижают заболеваемость раком у людей, зависит от присутствия в ткани растения небольшого количества химических компонентов, которые, попадая в клетки млекопитающих, повышают уровни ферментов фазы 2, которые обезвреживают канцерогены. В настоящее время установлено,что антиканцерогенную активность крестоцветных растений можно увеличивать, выводя новые инбредные линии с повышенной химиозащитной активностью. Повышенная химиозащитная активность обусловлена повышенным отношением содержания алкилглюкозинатов к содержанию индолглюкозинатов. Такое повышенное отношение можно можно получить, например, путем количественного увеличения уровня конкретных алкилглюкозинатов, таких как алкилтиоалкилглюкозинаты, или путем количественного уменьшения уровня индолглюкозинатов. Химиозащитную активность ткани поступающих на рынок проростков можно также усилить путем выведения новых инбредных линий крестоцветных, семена которых меньше подвержены вымыванию семенного вещества. Далее установлено, что если количество воды, подаваемой к развивающимся росткам крестоцветных, сведено к минимуму или к такому уровню, при котором развивающиеся проростки содержатся во влажном, но не мокром состоянии. Такое сокращение полива приводит к уменьшению вымывания глюкозинатов, а также других неорганических ионов и органических соединений и, соответственно, к увеличению содержания этих соединений в ткани потребляемых в конечном счете растений. Таким образом, например, уровни содержания глюкорафанина, который обладает свойствами предупреждения раковых заболеваний, в ткани выращиваемых проростков можно повысить,если уменьшить количество воды. Способы отбора крестоцветных растений включают комбинацию новых методов скрининга для идентификации и отбора тканей растений с повышенным отношением содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата с обычными и необычными методами выведения. В частности, такие способы позволяют получить сорта крестоцветных, в осо 004572 12 бенности брокколи и цветной капусты, с повышенными отношениями алкилглюкозинолата к индолглюкозинолату в тканях. Кроме того (или альтернативно), скрининг включает оценку семян с точки зрения вымывания вещества семян при прорастании и выращивании, в частности,для получения растений со сниженным вымыванием глюкозинолатов из семени. Крестоцветные растения, используемые в заявляемых способах выведения растений с повышенным отношением содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата,относятся к семейству Cruciferae, подсемействуBrassiceae и роду Brassinae. Предпочтительно крестоцветные растения принадлежат к группе(кочанная капуста). Другие растения, которые могут использоваться в заявляемых способах выведения растений с повышенным отношением алкилглюкозинолата к индолглюкозинолату,включают, в частности, Lepideum sativum(кресс-салат), Sinapis alba и Sniger (горчица),Raphanus sativun (японская редька дайкон),Eruca sativa (рокет-салат, или эрука), а также их межсортовые, межвидовые или межродовые гибриды. Скрининг: Глюкозинатный профиль. Для проведения скрининга больших количеств отдельных растений с целью отбора растений с повышенным отношением содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов было необходимо разработать усовершенствованные методики выделения, идентификации и количественной оценки различных типов глюкозинолатов, присутствующих в экстрактах растений. Выделение отдельных глюкозинолатов представляет трудности, поскольку их молекулы сильно заряжены и водорастворимы; разрешение различных молекул зависит от свойств обладающих меньшей полярностью боковых цепочек. Для выделения и разделения глюкозинолатов разработано много хроматографических методов, которые нельзя характеризовать как идеальные. (См., например, Betz J.M., Fox W.D.(1994) в сб. Food Phytochemical for Cancer Prevention. I. Fruits and Vegetables (Пищевые фитохимические вещества для профилактики раковых заболеваний. I. Фрукты и овощи) под ред.Huang M.T. и др., Симпозиум Американского химического общества, 546, стр. 181-196, AmRapeseeds: Analytical Aspects (Глюкозинолаты в семенах рапса: Аналитические аспекты) под ред. Wathelet J.P., стр. 177-191, Nijhoff Dordrecht, Нидерланды; Wathelet J.P. (1987) Glucosinolates in Rapeseeds: Analytical Aspects (Глюкозинолаты в семенах рапса: Аналитические аспекты), Nijhoff Dordrecht, Нидерланды. Эти хроматографические методы включают ионнообменную хроматографию, газожидкостную хроматографию (ГЖХ) и жидкостную хроматографию высокого давления (ЖХВД), в большинстве из которых осуществляется химическая модификация путем удаления сульфата и/или введения силильной группы. Недавно была разработана простая, прямая стратегия анализа содержания глюкозинолатов в экстрактах растений, представляющая собой новую комбинацию широко известных методов.(Prestera Т. и др. (1996) Anal Biochem, 239; ссылка включается в данный документ во всей своей полноте). Эта аналитическая стратегия предоставила также мощный метод идентификации и количественной оценки глюкозинолатов в экстрактах растений без получения производных. Экстракты растений приготавливают путем смешивания до однородности ткани растения с 10 такими же объемами смеси, состоящей из равных объемных частей диметилсульфоксида, диметилформамида и ацетонитрила (тройной растворитель), выдерживаемой при температуре около -50 С в ванне из сухого льда/этанола. Образцы гомогенизируются, в зависимости от размера образцов, в стеклянном гомогенизаторе,гомогенизаторе фирмы "Бринкман Политрон" или смесителе "Уэринг Блендер". Среди других экстрагирующих растворителей можно назвать кипящий метанол, кипящую воду, холодную воду (на льду) и ацетонитрил. Например, экстракты растений можно также приготавливать погружением ткани растения в кипящую воду и,по истечении короткого времени, гомогенизацией. Во всех случаях гомогенизированная смесь обрабатывается на центрифуге, и находящаяся над осадком жидкость при желании фильтруется для удаления остающихся частиц. Получаемый сырой водный экстракт можно хранить при температуре от -20 до -80 С до анализа. Затем сохранившиеся в сыром экстракте растений глюкозинолаты выделяют, идентифицируют и оценивают количественно путем последовательного анализа. Методика анализа включает ионпарную хроматографию с обращенной фазой гидрофобных тетраалкиламмониевых солей глюкозинолатов в присутствии избытка этих противоионов, преобразование этих солей глюкозинолатов в их аммониевые соли, масс-спектрометрию отрицательных ионов с прямой бомбардировкой быстрыми атомами (ББА), масс-спектрометрию с химической ионизацией посредством аммиака и, наконец, 004572(3 Н ЯМР) высокого разрешения. Детали приводятся в работе Prestera Т. и др. (1996) Anal. Biochem, 239: 168-179, которая включается сюда путем отсылки во всей полноте. Предпочтительно экстракты растений хроматографируются в смеси ацетонитрила и воды (1:1 по объему), содержащей 5 мМ тетрадециламмонийбромида, при расходе 3 мл/мин,на колонках с обращенной фазой (модель(1996) Anal. Biocbem, 239: 168-179). В качестве стандарта используется синигрин (аллилглюкозинолат). Относительные интегральные площади поглощения на 235 нм для таких алкилтиоглюкозинолатов как глюкорафанин, глюкобрассицин и неоглюкобрассицин составляют 1,00; 1,22 и 2,70 эквимолярного количества синигрина, соответственно (Fahey J.W. и др. (1997) Proc,Natl. Acad. Sci. USA 94: 10367-10372; Shapiro и др. (1998) Cancer Epidemiol. Biomark. Prevent. 7:1091-1100). Отбор тканей для анализа зависит от целей программы селекции; так, могут отбираться товарные кочаны, которые представляют собой соцветия с нераскрывшимися цветочными бутонами, ткань листьев, ткань семян и/или проростков. Если идет селекция на желаемый глюкозинолатный профиль кочанов, то ткань цветочного бутона предпочтительно берется до раскрытия бутона. Скрининг: вымываемая вытяжка семян. Можно проводить скрининг семян отдельных растений на количество семенного вещества, вымываемого при проращивании и росте, в частности, на количество и тип глюкозинолата,выделяемого в получаемую вытяжку. Семена сначала дезинфицируют, обычно в водном растворе хлорной извести с содержанием хлорной извести около 20%, а затем тщательно прополаскивают в воде, в соответствии с хорошо известными в производстве рассады методиками. Затем семена помещают в камеры для проращивания; такие камеры могут состоять из плоских лотков, которые могут быть расположены наклонно, или это могут быть контейнеры, удобные для перевозки и продажи. Обычно такой контейнер представляет собой пластиковую коробку или банку, на дне которой находится водная подушка. Такие контейнеры пропускают свет и в то же время обеспечивают защиту от механических воздействий. Желательно, чтобы лотки или контейнеры были сконструированы или модифицированы таким образом, чтобы можно было прополаскивать прорастающие семена и собирать получающийся при полоскании раствор, или вытяжку, в то время как нормальный рост растений продолжается в течение всего обычного периода товарного проращивания. Известно множество методов 15 выращивания рассады; они описаны, например,в патентах США 3733745, 3643376,3945148, 4130964, 4292760, 4086725. Высаженные семена прополаскивают определенными количествами воды в течение определенных периодов времни с определенными интервалами; затем воду от полоскания, или вытяжку, собирают и определяют содержание в ней вещества семян. Можно использовать различные известные методы измерения вымытого вещества, в том числе общее взвешивание в сухом виде и определение вымытых белков и сахаров. В дополнение или альтернативно этому можно определять количество и профиль выделившихся глюкозинолатов, как описано выше. Отбор. В зависимости от целей селекционной программы определяют, какие растения включаются в программу скрининга и какие растения отбираются для дальнейшей селекции. Необходимо рассмотреть и другие факторы, в частности,какие ткани будут отбираться и на какой стадии; так, некоторые программы могут быть направлены на овощную продукцию товарной стадии, например, кочаны или цветки цветной капусты и брокколи, тогда как другие - на продукцию для такой рыночной ниши, как проростки или части более зрелых растений, из которых можно приготавливать чаи, настои, отвары или экстракты. Скрининг может проводиться на различных популяциях растений, в зависимости от типа зародышевой плазмы и стратегий последующей селекции. Предпочтительно скринингу подвергается популяция гомозиготных растений; такие гомозиготные растения получают чаще всего методами искусственного выращивания ткани, но могут быть выведены и другими методами. Другие предпочтительные популяции растений для скрининга - это растения, подвергнутые мутагенезу. Методы искусственного выращивания тканей, которыми можно получить монозиготные растения, включают выращивание in vitro пыльников, содержащих микроспоры или незрелые пыльцевые зерна, на питательной среде с целью получения гаплоидных ростков. Затем число хромосом полученного гаплоидного ростка удваивается с помощью соответствующей методики; в результате получают полностью гомозиготное диплоидное растение. Диплоидные растения, отобранные по программе скрининга, размножаются и оцениваются по агрономическим характеристикам. В альтернативном варианте размноженные растения немедленно используются как инбредные линии в выведении гибридов путем перекрестного опыления. Время, необходимое для получения культурного сорта или инбредной линии этим методом, сокращается на несколько поколений по сравнению с обычными методами селекции. 16 Методики выращивания пыльниковой культуры из ткани брокколи хорошо известны специалистам (Keller W.A., Armstrong К.С.(1985) Can. J. Plant Sci. 65: 1033-1037). В основном такая методика содержит отбор бутонов из основного соцветия до появления цветка, стерилизация поверхности бутонов и высаживание ткани на питательную среду. Из микроспор появляются эмбрионы, которые затем регенерируют в растения. При указанных условиях выращивания примерно половина растений является дублированными гаплоидами, а остальные- гаплоидами, тетраплоидами и другими плоидами. Идентификацию дублированных гаплоидов можно осуществлять с помощью потоковой цитометрии ДНК (Arumaganathan К, Earle E.D.(1991) Agronomie 11: 727-736). Число хромосом в гаплоидных растениях можно удвоить путем соответствующей обработки, например, колхицином, пользуясь известными специалистам методами, или же число хромосом может удваиваться спонтанно. Глюкозинолатный профиль можно изменять путем уменьшения или ликвидации синтеза индолглюкозинолатов или же путем усиления синтеза алкилглюкозинолатов. Имеется несколько методов достижения этой цели. Например, один метод состоит в простом использовании сомаклональной вариации, которая происходит при выращивании ткани. По другому методу растения подвергают мутагенной обработке с целью увеличения частоты появления растений с желательным глюкозинолатным профилем. Еще один метод заключается в инактивации или удалении генов, участвующих в синтезе индолглюкозинолата, например, путем введения ДНК в эти гены. Способы мутагенной обработки включают воздействие ионизирующим излучением и химическими мутагенами, хотя последние обычно предпочтительнее. Наиболее широко применяемым для этого химическое вещество является этилметансульфонат (ЭМС). Хотя чаще всего обрабатывают семена, можно обрабатывать также пыльцу, живые растения или части растений, например, почки, корни или спящие черенки. Обработка состоит обычно в вымачивании растений или частей растений в растворе химического мутагена. Затем обработанный растительный материал используется для получения целых растений, которые подвергаются процедурам скрининга и отбора. Методы мутагенеза растений хорошо известны специалистам. См.,например, Malmberg R.L., "Production and Analysis of Plant Mutants Emphasizing Arabidopsis thaliana" (Методы получения и анализа мутантов растений с выделением Arabidopsis thaliana) в кн. "Methods in Plant Molecular Biology and Bio 17and J.E. Thompson (CRC Press, Boca Raton 1993). Методы инактивации или удаления генов,участвующих в синтезе индолглюкозинолатов,путем введения подвижной последовательности ДНК, например, Т-ДНК или транспозонов, от растения-хозяина или другого происхождения,хорошо известны (Koncz и др., 1992). Введение Т-ДНК может осуществляться известными методами, например, посредством Agrobacterium(Hoekema и др., 1983; патент США 5149645); методы введения транспозонов также известны(Федоров и др., 1984; патенты США 4732856 и 5013658). Используемым транспозионным элементом может быть автономный транспозон,неавтономный транспозон или система из автономных и неавтономных транспозонов, например, Ac/Dc транспозонная система маиса. Предпочтительно для скрининга отбираются растения с желательными агрономическими характеристиками. Однако если для скрининга отобраны менее желательные растения,можно ввести желаемую характеристику глюкозинолатного профиля в коммерчески желательные сорта обычными селекционными методами. Предпочтительно также, чтобы растения,отбираемые для скрининга, выращивались в аналогичных условиях и собирались на аналогичных стадиях развития. Это облегчает сравнение отдельных растений, поскольку известно,что как качество, так и количество глюкозинолатов широко варьируется в различных тканях растения и на различных стадиях развития, а также сильно зависит от условий выращивания. Части растений, отбираемых для скрининга,включают семена, проростки и соцветия. Отбираемая ткань зависит от того, для какого конечного рынка производится зародышевая плазма. В зависимости от выбора ткани для скрининга возможен отбор различных индивидуальных растений, поскольку глюкозинолатный профиль в каждой ткани может изменяться в пределах одного и того же растения, причем, как представляется, какая-либо корреляция профилей различных тканей отсутствует. Например, ткань кочана на товарной стадии, обладающая желательным глюкозинолатным профилем, может дать росток с нежелательным или менее желательным глюкозинолатным профилем или с очень низким общим уровнем алкилтиоалкилглюкозинолатов по сравнению с другими сортами. Те растения, которые обладают желательным глюкозинолатным профилем в соответствующей ткани на стадии конечного рыночного продукта, отбираются для последующей селекции. Предпочтительный профиль - это повышенное отношение содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов. Повышенное отношение - это отношение, превышающее то, которое наблюдается приблизи 004572 18 тельно у 70%, предпочтительно у 80%, предпочтительнее всего у 90% проанализированной популяции растений. В другом варианте повышенное отношение определяется как отношение выше того, которое наблюдается у родительского растения, предпочтительно на 10%, предпочтительнее не менее чем на 20%, предпочтительнее всего не менее чем на 30%. Еще в одном варианте повышенным считается отношение,которое не встречается в природе и получено искусственно, например, путем обработки мутагенами или сомаклонального (somaclonal) изменения при выращивании ткани, и которое существенно выше обычно встречающегося в популяции растений, из которой произошли обработанные растения. Кроме того или альтернативно, для дальнейшей селекции отбираются растения, дающие семена с пониженным вымыванием семенного материала во время прорастания и роста, в частности, с пониженным вымыванием глюкозинолатов. Пониженное вымывание определяется как существенное уменьшение вымывания по сравнению с тем, которое наблюдалось у родительского растения, или с наблюдавшимся в популяции растений, из которой получено данное индивидуальное растение. Существенным уменьшением считается уменьшение по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 30%,предпочтительнее всего на 50% или более величины вымывания, наблюдавшейся у родительского растения. В другом варианте существенное уменьшение вымывания определяется как вымывание, наблюдаемое только у 10%, предпочтительно у 5%, предпочтительнее всего у 1% популяции растений. Еще в одном варианте существенным считается уменьшение, которое не встречается в природе и индуцировано искусственно, например, путем обработки мутагенами или сомаклонального изменения при выращивании ткани, и которое существенно ниже величины вымывания, обычно встречающейся в популяции растений, из которой произошли обработанные растения. Селекция растений. Когда растения, обладающие желательными глюкозинолатными профилями, отобраны,они используются для дальнейшей селекции. Повышенные отношения содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов могут иметь место в кочанах товарной стадии, проростках, семенах или других частях растений. Для растений, являющихся диплоидными растениями, мутагенированными растениями или другими растениями-источниками,прошедшими скрининг на глюкозинолатные профили, могут применяться следующие методики селекции. В принципе селекция осуществляется путем скрининга потомства отобранных растений на повышенное отношение алкилглюкозинолатов к индолглюкозинолатам (как описано вы 19 ше), причем отношения берутся в желаемых частях растения на желаемых стадиях его развития. Растения, обладающие этим свойством,селекционируются дальше путем усиления этого свойства или его комбинации с другими важными агрономическими характеристиками. Так,растения с выбранным свойством могут быть использованы непосредственно как прародители нового сорта или же как источник перенесения желательного свойства в другие, агрономически предпочтительные сорта. В частности, полезными сортами брокколи, применяемыми в осуществлении заявляемого метода, являются Сага, ДеЧикко, Эверест,Эмералд Сити, Пэкмен, Корвет, Денди ранний,Император, Маринер, Грин Комет, Грин Вэлиант, Аркадия, Калабрийская Каравелла, Ченселлор, Сайтейшн, Круизер, Ранняя Пурпурная брокколи Ред Эрроу, Эврика, Эксцельсиор, Галеон, Джинга, Голиаф Грин Дюк, Грин Белт,Итальянская брокколи, Хай Сьерра, Поздняя Пурпурная, Поздняя зимняя Уайт Стар, Легенда, Лепрехаум, Марафон, Маринер, Минарет(Фолл Рааб), Самурай, Сегун, Спринтер, Султан, Тайко, Лайт Стар и Трикси. Однако для этого пригодны и многие другие сорта брокколи. Особенно полезными в этом отношении сортами цветной капусты являются Альверда,Эмейзинг, Анды, Бургунди Квин, Кандид Чарм,Кашмир, Кристмас Уайт, Доминант, Эльби,Сноубол и селекционированные из него сорта,Фримонт, Инклайн, Милкивэй Минитмен, Рашмор, S-207, Серрано, Сьерра Невада, Сирия,Сноу Краун, Сноу Флейк, Сноу Грейс, Сноубред, Солид, Тайпэн, Вайолет Куин, Уайт Барон,Уайт Бишоп, Уайт Контесса, Уайт Корона, Уайт Доув, Уайт Флеш, Уайт Фокс, Уайт Найт, Уайт Лайт, Уайт Куин, Уайт Рок, Уайт Сэйлз, Уайт Саммер, Уайт Топ, Юкон. Однако годятся и многие другие сорта цветной капусты. Цель селекционной программы - обеспечить стабильность выбранного глюкозинолатного профиля, его наличие в растениях с желаемыми агрономическими характеристиками или возможность его переноса в такие растения, а также возможность использования отобранных растений для выведения сортов или линий, из которых можно создать пригодный для продажи на рынке гибрид. Чтобы обеспечить устойчивость признака повышенного содержания глюкозинолатов, из отобранных растений получают поколение F1. Хотя здесь можно применить различные методы, предпочтительно произвести самоопыление отобранных растений и получить поколение потомства F1, которое затем можно подвергнуть скринингу на глюкозинолатные профили. Поскольку брокколи и цветная капуста являются самонесовместимыми, отобранные растения 20 можно искусственно самоопылить несколькими методами. Одним из таких методов является"опыление бутона", состоящее в нанесении пыльцы на незрелые рыльца за 1-2 дня до цветения. Бутоны осторожно открывают пинцетом и на незрелые рыльца наносят пыльцу, взятую от зрелых цветков. Другой метод заключается в предварительной обработке зрелых рылец NaCl или СО 2. На зрелые рыльца воздействуют 15% раствором NaCl в течение 10-15 мин перед опылением или воздухом с повышенным содержанием СО 2 (предпочтительно 5% СО 2) в течение нескольких часов перед опылением. Полученные семена F1 собирают и выращивают из них зрелые растения, которые затем подвергают скринингу на глюкозинолатные профили. Те растения, у которых свойство усиленного глюкозинолатного профиля стабильно,отбирают для дальнейшей селекции. Такая селекция включает в себя выведение инбредных линий от отобранных растений, или дальнейший отбор полученных растений на другие агрономические характеристики, или введение данного свойства в другие линии или сорта. Стратегии скрещивания, отбора и селекции новых сортов крестоцветных хорошо известны.Breeding (Культуры Brassica и их дикие родственники: Биология и селекция) под ред. S. Tsunoda и др., Japan Scientific Societies Press, Токио,с. 1-354 (1980. Растения, выведенные из диплоидного растения, полученного удвоением хромосом гаплоидного растения, которое в свою очередь получено путем культивирования из пыльников, дают "непосредственные инбреды", поскольку диплоидное растение уже монозиготно во всех местоположениях генов. При использовании этих растений для селекции можно получить инбредные линии за 2 года, а не за 5 лет, как при обычных методиках селекции (OckendonBreeding (Генетические манипуляции в селекции растений) под ред Horn J. и др., De Gruyter,Нью-Йорк, стр. 265-272). Такие линии могут быть использованы сами как культурные сорта или в качестве родителей для выведения гибридов. Однако инбредных родителей трудно сохранять и поддерживать, так как они самонесовместимы. Однако существуют различные методы преодоления самонесовместимости. Один из наборов таких методов направлен на получение семян. Эти методы включают изменение условий питания (Stout A.B. (1931) Am J Bot 18: 686-695), трансплантацию пыльцы (Kroh М.(1966) (Contribution to characterization of incompatibility mechanisms with Cruciferae - Вклад в изучение характеристик механизмов несовместимости у крестоцветных), Zuchter т. 18: 185189), повреждение рылец (Linken H.F., Kroh M.(Gonai H., Hinata К. (1971) L Jpn J Breed 21: 195198) и воздействие электричеством (Roggen и др. (1972) L Euphytica 21:181-184). Однако обычно используется метод опыления бутонов до срабатывания самонесовместимости, илиEuphytica 7:223-227). Однако получение семян этими методами является трудоемким и дорогостоящим. Второй набор методов преодоления самонесовместимости направлен на вегетативное размножение для сохранения инбредных линий. Эти методы включают размножение от вегетативных частей растения, таких как эксплантаты стебля, листа или жилки (Johnson и др. (1970) Hort Sci 13: 246247, размножение от черенков стебля и целых зародышей розеток или их частей (Nieuwhof M.(1969) в серии World Crop Series, Hill, London), а также размножение черенками корней (North С.(1993) Ann Appl Biol 40: 250-261). Эти методы могут применяться также для размножения растений, отобранных при полевых испытаниях. Признак усиленных глюкозинолатных профилей вводится в линии с высокими агрономическими свойствами обычными селекционными методами. Такие методы включают рекуррентную селекцию (Vello и др. (1977);Breed Abstract т. 48, с. 7062) и дополнительную генетическую вариацию путем инбридинга с целью однородности и комбинирования инбредных линий (Honma S. (1965) J Am Soc Hortic Sci 87: 295-298). При выведении гибридных культурных сортов F1 используется гетерозис(Legg и др. (1968) J Am Soc Hortic Sci 92:432437). Для выведения гибридов используется цитоплазменная мужская стерильность, доступная теперь в сорте Калабрийский (Dicson M.H.(1975) Hort Sci 10: 535). Эти же методы селекции можно использовать для выведения линий, дающих семена со сниженным вымыванием семенного вещества, в особенности глюкозинолатов, при прорастании и росте рассады. Прорастание семян с пониженным вымыванием вещества семени. Другой метод сведения к минимуму вымывания вещества семян, в особенности глюкозинолатов, заключается в том, что набухание и прорастание семян происходит при соотношении воды и сухих семян, едва достаточном для нормального роста, в течение обычного периода товарного проращивания и исключающем стекание воды с ростков. Воздействие на семена уменьшенным объемом воды снижает количество вещества семян, в частности, глюкозинолатов, вымываемого из семян при прорастании и росте. Такое уменьшение вымывания приводит 22 к повышению содержания глюкозинолатов, что дает рассаду с усиленными химиозащитными свойствами. Проращивание семян осуществляется, как описано выше. Сначала их подвергают поверхностной дезинфекции, а затем проращивают,подавая определенные количества воды в течение определенных периодов времени на протяжении нормального товарного периода проращивания и роста рассады. Предпочтительный минимальный объем воды - это объем, который обеспечивает нормальный рост без стекания или капания воды с набухающих и прорастающих семян. В обычной производственной практике этот объем составляет, как правило, 6 мл воды на грамм сухих семян; можно применять также до 15 мл на грамм сухих семян. Период товарного проращивания обычно составляет 2-5 дней,в зависимости от типа семян и желаемого размера проростков. Пример 1. Получение диплоидных растений. Диплоидные растения были получены из нескольких сортов брокколи, в том числе сортов Эверест, Хай Сьерра, Марафон, Султан и Викинг, доктором Марком У. Фарнхемом, Департамент сельского хозяйства США, Чарльстон,Южная Каролина, как описано в статье FarnhamM.W., J. Amer. Soc. Hort. Sci. 123: 73-77 (1998),которая введена в настоящую заявку путем отсылки. Растения были получены методом культивирования из пыльников с последующим применением методов, описанных в работеGenetics (Клеточная культура и соматическая клеточная генетика), т. 1 (Academic Press, НьюЙорк) с. 302-310) и коротко изложенных ниже. Растения выращивались из семян в контролируемых условиях окружающей среды. Бутоны отбирались из развивающегося главного соцветия до удлинения стебля и до появления цветков. После поверхностной стерилизации бутоны открывали и отделяли пыльники от нити тычинки. Затем пыльники помещали группами на питательную среду, загущенную агаром, в чашках для выращивания. Пыльники инкубировались в темноте до развития из них эмбриоидов. После этого эмбриоиды помещали под непрерывный свет, чтобы они зазеленели. Молодые растения со здоровой корневой системой высаживали в горшки и закаливали в теплице. Затем растения высаживали в поле и выращивали их до взрослости. С взрослых растений собирали товарные кочаны и определяли в них содержание глюкозинолатов. Пример 2. Скрининг диплоидных растений. Ткань получали от диплоидных растений(Д-растений), а также от растений, полученных в результате программы элитной селекции (растения F4), и от гибридных растений (растения 23 популяций, произведенных самоопыленными родителями из культурных сортов Марафон,Эверест, Хай Сьерра и Футура. Отдельные растения F4 были выведены из одинарных отборовF2 и F3, где отбирались лучшие индивидуальные растения по их агрономическим характеристикам и в особенности по качеству кочанов брокколи. Гибриды F1 создавались путем скрещивания двух родителей, полученных либо половым путем, либо от Д-растений. Содержание глюкозинолатов в кочанах брокколи определялось в основном так же, как описывалось выше. Затем для каждого образца ткани определялось соотношение алкилглюкозинолата и индолглюкозинолата. Пример 3. Результаты скрининга: отбор растений. Результаты скрининга Д-растений, растений F4 и растений F1 представлены в табл. 1. Пример 4. Селекция отобранных растений. Индивидуальные диплоидные растения,отобранные как имеющие желаемые отношения содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов, самоопыляли, предпочтительно методом опыления в бутоне, который описывался выше. Семена потомства, или поколение F1, собирали, выращивали в поле и проводили скрининг на уровни глюкозинолатов. В данном случае для скрининга отбиралась ткань кочана брокколи на товарной стадии. Те растения, у которых искомый признак был устойчив, сохранялись в виде инбредных линий,произведенных от одного растения. Размножение производилось искусственным опылением или вегетативным способом, как описывалось выше. Инбредные линии можно использовать непосредственно для производства товарных кочанов брокколи, если эти линии приемлемы в агрономическом отношении. Можно также использовать их для получения гибридных семян. Желательно, чтобы второй родитель, применяемый для получения гибридных семян, принадлежал также к инбредной линии с высоким отношением содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов. Наконец,инбредные линии можно использовать как источник признака повышенного отношения содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов, который можно вводить в другие сорта брокколи обычными селекционными методами. Пример 5. Использование растений с высоким содержанием антиканцерогенных веществ. Растения, обладающие желаемыми глюкозинолатными профилями, о чем свидетельствует повышенное отношение содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов, можно использовать различными способами. Можно включать различные части растений в диету, например, кочаны товарной стадии, 004572 24 семена и проростки. Эти части растений можно потреблять непосредственно, необработанными,или косвенно, то есть когда части растений обрабатываются и потребляются вместе с другими пищевыми продуктами. Так, например, товарные кочаны цветной капусты или брокколи потребляются непосредственно, сырыми или прошедшими тепловую обработку. Семена можно вводить непосредственно в пищевой продукт. Их можно использовать в салатах, в хлебе и других выпечных изделиях. Можно также размалывать семена в муку или крупу и использовать как пищевую добавку в продуктах питания или напитках. Такую муку или крупу добавляют в хлеб, другие выпечные изделия, оздоровительные напитки или коктейли. Муку можно использовать также в виде пилюль, капсул или других принимаемых через рот лекарственных форм. Из семян также выращивают проростки,которые можно использовать различными способами. Проростки можно непосредственно вводить в продукты питания, например, салаты,бутерброды или напитки. Их можно сушить и использовать в виде пилюль, капсул или пищевых добавок. Кроме того, из проростков, с помощью нетоксичных растворителей, делают экстракты для бульонов, чаев и т.п. Обычно проростки выращивают на непитательной твердой подложке, часто в контейнерах, пригодных для транспортировки и торговли. Проростки обычно собирают на стадии двух листов (первая пара истинных листов) или раньше. После прорастания семени проростки выращивают от 1 до 20 дней, в зависимости от температуры выращивания и других небиологических факторов, и собирают на стадии двух листов или раньше. Экстракты семян или проростков на нетоксичных растворителях используют в оздоровительных настоях или бульонах. Семена экстрагируют с помощью нетоксичного растворителя для приготовления бульонов, чаев или других напитков и настоев. Проростки экстрагируют с использованием холодной, теплой, предпочтительнее горячей или кипящей воды. При желании после экстрагирования удаляют остающиеся в экстракте семена или проростки. Экстракт можно употреблять непосредственно или после дальнейшей обработки. Например, его можно выпаривать, чтобы получить сухой экстрагированный продукт. Его можно охлаждать, замораживать или сушить вымораживанием. Можно смешивать его с овощами семейства крестоцветных, содержащими активный фермент мирозиназу. Это обеспечит быстрое преобразование глюкозинолатов в изотиоцианаты, до переваривания. Пригодные для этого овощи, содержащие мирозиназу, - это овощи рода Raphanus,в особенности дайкон, один из типов редьки. Пример 6. Демонстрация высоких уровней содержания глюкозинолатов и родственных им 25 изотиоцианатов в вытяжках из семян и проростков. Около 600 г семян брокколи и люцерны поместили в отдельные соседние лотки на промышленной тележке для проращивания лоткового типа; семена предварительно продезинфицировали погружением в 25% водный раствор хлорной извести (например, продаваемый под маркой Clarox) на 15 мин, а затем тщательно прополоскали в воде согласно общепринятым в отрасли методикам. Затем семена поместили на наклонный лоток для проращивания, снова прополоскали водой, распыляемой из подвесного моросящего сопла, и оставили на 1 ч, после чего начали подавать воду из подвесного моросящего разбрызгивателя, пока с одного лотка не стекло и не было собрано около 20 мл жидкости. Моросящее орошение продолжалось по шесть 20-секундных распылений в час до следующего периода сбора жидкости, когда лотки оставили стоять на 1 ч, а затем полученную вытяжку смыли свежей водой и собрали. Вытяжку,которая была соломенно-желтого цвета при рН,равном 6,8, проанализировали на количества и типы присутствующих в ней глюкозинолатов. Уровни содержания изотиоцианатов в сточной воде и воде от полоскания семян и проростков брокколи, которые в целом называют термином "вытяжка", увеличились с приблизительно 13 мкМ после первого часа проращивания после дезинфицирующей обработки до приблизительно 192 мкМ после седьмого часа проращивания. Уровни глюкорафанина (предшественника сульфорафана) к седьмому часу достигли приблизительно 0,33 мкМ, а глюкозинолаты состояли из 99,4% глюкопарафина и 0,6% неоглюкобрассицина. В жидкости, собранной от семян и проростков люцерны, обработанной таким же образом, не было обнаружено следов этих соединений. Общее количество растворенного твердого вещества (сухой вес), выделенного из вытяжки брокколи часового возраста, составляло от 3,9 до 5,2 мг/мл. Общее количество глюкорафанина,полученного таким способом из семян, составляло 81,5 нмоль/г семян/ч. Если вымывание продолжается в течение полусуток, то вытяжка содержит около 1 ммоль глюкорафанина или около 20% общего содержания глюкорафанина в семенах, использовавшихся в этих экспериментах. Хотя вышеизложенное относится к конкретным вариантам осуществления изобретения, следует понимать, что настоящее изобретение этим не ограничивается. Специалистам обычного уровня понятно, что возможны различные модификации описанных вариантов в рамках объема настоящего изобретения, который определяется следующими ниже пунктами формулы. Все публикации и патентные заявки,упомянутые в данном описании, указывают на 26 уровень техники в области, к которой относится изобретение. Все публикации и патентные заявки вводятся в данную заявку путем отсылки в той же степени, как если бы относительно каждой отдельной публикации или патентной заявки было конкретно и отдельно указано, что она вводится сюда во всей ее полноте. Было определено отношение содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов в нескольких культурных сортах брокколи. Приведенные данные содержат результаты таких измерений, полученные для нескольких типов отдельных растений, в том числе диплоидных растений, полученных удвоением хромосом гаплоидного растения, полученного методом культивирования из пыльников("Д"); гибридных растений, полученных скрещиванием двух родителей, выведенных либо половым путем или из ДГ растений ("F1"); и растений, выведенных по программе элитной селекции ("F4"). Растения F4 происходили от расщепленных популяций, выведенных от самоопыленных родительских растений из указанных культурных сортов; испытывавшиеся растения - это индивидуальные растения, полученные в результате 4 циклов самоопыления. Как видно из табл. 1, диплоидные растения из двух культурных сортов обладали отношениями содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов, значительно более высокими, чем у других испытывавшихся растений. Так, два дублированных гаплоидных растения из сорта Хай Сьерра имели такие отношения по крайней мере на 20% выше самого высокого значения, наблюдавшегося у других испытывавшихся растений. Аналогичным образом, три индивидуальных растения из сорта Викинг имели указанные отношения по крайней мере на 20% выше самого высокого значения,наблюдавшегося у других испытывавшихся растений. Эти индивидуальные растения были отобраны для дальнейшей селекции. Кроме того, около 100 семян из одной и той же партии семян сорта Европейская Распускающаяся Калабрийская брокколи (JHU740) были высажены в грунт Jiffy Mix в теплице. Через семь дней роста с каждого растения хирургическими ножницами срезали приблизительно 40% одной увеличившейся семядоли и немедленно поместили в тройной раствор с температурой -80 С для последующей гомогенизации и анализа посредством ионпарной хроматографии(ЖХВД) с целью определения содержания глюкозинолатов. Отношения алкил:индол в этих образцах приводятся в табл. 2. Результаты показали 300-кратный разброс отношений алкил: индол. 27 Таблица 1 Отношение содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов 28 Таблица 2 Отношение содержания алкилглюкозинолатов к содержанию индолглюкозинолатов ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ отбора крестоцветного растения,обладающего повышенной антиканцерогенной активностью, включающий измерение отношения содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата в ткани растения и отбор растения, если отношение содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата в ткани растения более 6. 2. Способ по п.1, в котором растение представляет собой диплоидное растение, полученное удвоением хромосом гаплоидного растения. 3. Способ по п.2, в котором указанное гаплоидное растение получают методом выращивания из пыльников. 4. Способ по п.1, в котором растение перед измерением отношения содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата подвергают мутагенезу. 5. Способ по п.4, в котором растение подвергают мутагенезу с помощью химического мутагена. 6. Способ по п.5, в котором химическим мутагеном является этилметансульфонат. 7. Способ по п.1, в котором растение является растением брокколи. 8. Способ по п.7, в котором в качестве растения брокколи используют любое растение из культурных сортов Сага, ДеЧикко, Эверест,Эмералд Сити, Пэкмен, Корвет, Денди ранний,Император, Маринер, Грин Комет, Грин Вэли 004572 30 ант, Аркадия, Калабриз Каравел, Ченселлор,Сайтейшн, Круизер, Ранняя Пурпурная Спраутинг Ред Эрроу, Эврика, Эксцельсиор, Галеон,Джинга, Голиаф, Грин Дюк, Грин Белт, Италиан Спраутинг, Хай Сьерра, Поздняя Пурпурная,Поздняя зимняя Уайт Стар, Легенда, Лепрехаум, Марафон, Маринер, Минарет (Романеско),Парагон, Патриот, Премиум Кроп, Репайн (Весенний Рааб), Розалинд, Салатная (Фолл Рааб),Самурай, Сегун, Спринтер, Султан, Тайко,Трикси и Викинг. 9. Способ по п.1, в котором крестоцветное растение является растением цветной капусты. 10. Способ по п.9, в котором в качестве растения цветной капусты используют любое растение из культурных сортов: Альверда,Эмейзинг, Анды, Бургунди Квин, Кандид Чарм,Кашмир, Кристмас Уайт, Доминант, Эльби,Сноубол и селекционированные из него сорта,Фримонт, Инклайн, Милкивэй Минитмен, Рашмор, S-207, Серрано, Сьерра Невада, Сирия,Сноу Краун, Сноу Флейк, Сноу Грейс, Сноубред, Солид, Тайпэн, Вайолет Куин, Уайт Барон,Уайт Бишоп, Уайт Контесса, Уайт Корона, Уайт Доув, Уайт Флеш, Уайт Фокс, Уайт Найт, Уайт Лайт, Уайт Куин, Уайт Рок, Уайт Сэйлз, Уайт Саммер, Уайт Топ, Юкон. 11. Способ отбора потомка крестоцветного растения, полученного по любому из пп.1-10,которое используется в качестве родительского растения, включающий получение потомства от указанного родительского растения и отбор индивидуального растения-потомка, в ткани которого отношение содержания алкилглюкозинолата к содержанию индолглюкозинолата выше,чем в аналогичной ткани родительского растения, и которое обладает повышенной антиканцерогенной активностью. 12. Способ получения проростков крестоцветного растения, обладающего повышенной антиканцерогенной активностью, включающий проращивание семян растения-потомка, полученного способом по п.11, добавление к семенам от 0,6 до 1,0 г воды на 1 г семян, проращивание политых водой семян с образованием проростков и добавление к проросткам от 5 до 8 мг воды на 1 проросток каждые 24 ч в течение от 24 до 120 ч. 13. Способ по п.12, согласно которому получают проростки брокколи или проростки цветной капусты.