Аллель- и изотип-специфическая интервенция в ассоциированные с аутоиммунными заболеваниями молекулы класса ii мнс при помощи пептидов

АЛЛЕЛЬ- И ИЗОТИП-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИНТЕРВЕНЦИЯ В АССОЦИИРОВАННЫЕ С АУТОИММУННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ МОЛЕКУЛЫ КЛАССА II МНС ПРИ ПОМОЩИ ПЕПТИДОВ Настоящее изобретение относится к пептиду для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания, кодирующей этот пептид молекуле нуклеиновой кислоты, включающей пептид и/или молекулу нуклеиновой кислоты фармацевтической композиции, а также к способу лечения и/или профилактики аутоиммунного заболевания. Вайссерт Роберт (CH), Вайсмюллер Карл-Хайнц (DE), Де Граф Катрин Л.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: МЕРК СЕРОНО СА (CH) Настоящее изобретение относится к пептиду для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания, кодирующей этот пептид молекуле нуклеиновой кислоты, фармацевтической композиции,включающей пептид и/или молекулу нуклеиновой кислоты, а также способу лечения и/или профилактики аутоиммунного заболевания. Аутоиммунные заболевания, называемые также как аутоагрессивные заболевания, представляют собой вызываемые аутоантителами или аутореактивными Т-клетками заболевания. Аутоиммунитет основывается на специфическом, адаптивном иммунном ответе по отношению к гомологичным антигенам. Его можно понимать как результат "разрушения" толерантности по отношению к гомологичным веществам и/или результат дефектного механизма контроля и регуляции иммунной системы. К причинам аутоиммунных заболеваний относят, наряду с обусловленным влиянием окружающей среды, также генетические факторы, как, например, генотип главного комплекса гистосовместимости (HLA). Основным примером аутоиммунного заболевания является рассеянный склероз (MS). Это воспалительное аутоиммунное заболевание центральной нервной системы, которое приводит к нейродегенерации, характеризуется очаговым распадом миелиновых оболочек. Также разрушаются даже нервные пути. Заболевание протекает хронически с далеко отделенными по времени друг от друга приступами, зачастую с регрессом клинической симптоматики, однако также может медленно непрерывно прогрессировать. Симптомы являются разнообразными, в зависимости от потери соответственно пораженной части нервной системы, и относятся, например, к нарушениям зрения, двойному изображению за счет паралича глазной мышцы, тремору, приступам головокружения, слабости мышц, состояниям оцепенения, недержанию, нарушениям восприимчивости и речи, психическим изменениям. Заболевание начинается чаще всего между двадцатым и сороковым годами жизни; женщины заболевают чаще, чем мужчины. Рассеянный склероз особенно часто, по сравнению с другими частями мира, возникает в Северной Европе и Северной Америке и представляет собой одно из наиболее частых неврологических заболеваний с темпом новых заболеваний, соответственно, частотой новых случаев заболевания, в случае от примерно 1 до 1000 жителей в год в Средней Европе. Как большинство других аутоиммунных заболеваний, рассеянный склероз в качестве комплексного генетического заболевания ассоциируется с определенными аллельными вариантами изотипов класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС). В случае кавказской популяции существует наиболее сильная ассоциация с гаплотипом DR15 HLA, то есть DRB11501, DRB50101, DQA10102 иDQB10602. В недавно опубликованных экспериментах указывается на то, что HLA-DRB11501 представляет собой генетический главный фактор риска в случае рассеянного склероза. Ассоциация молекул класса II главного комплекса гистосовместимости с заболеванием, вероятно, должна объясняться тем,что эти молекулы презентируют фрагменты аутоантигенов в аутореактивных Т-клетках, которые затем возбуждают заболевание в центральной нервной системе. Лечение рассеянного склероза до сих пор является невозможным. Однако пригодны некоторые лекарственные средства, которые могут замедлять протекание рассеянного склероза и ослаблять уже появившиеся симптомы. Так, например, введение высокодозированных кортикостероидов во время острого приступа может уменьшать воспалительную реакцию в центральной нервной системе и приводить к ослаблению симптомов. В рамках долговременной терапии используют иммунодепрессанты или иммуномодуляторы, которые угнетают иммунную систему или, однако, изменяют иммунную реакцию. Трудность в случае этого принципа действия состоит в том, что слишком неспецифическое изменение иммунной системы может приводить к более высокому темпу инфекционных и раковых заболеваний. В рамках симптоматической терапии используют лекарственные средства, которые ослабляют часто наблюдаемые у пациентов симптомы, такие как хроническая усталость и анергия, так называемый синдром усталости, спастику и нарушения опорожнения мочевого пузыря, однако не лечат причину. В соответствии с этим в основу изобретения положена задача получения соединения, которое причинно вмешивается в патологию аутоиммунных заболеваний и тем самым делает возможным целенаправленное лечение или профилактику аутоиммунных заболеваний, как, например, рассеянный склероз. Эта задача решается путем получения пептида, который выполнен таким образом, что он высокоаффинно может связываться с человеческой молекулой класса II главного комплекса гистосовместимости, HLA-DR2b. Лежащая в основе изобретения задача полностью решается согласно данному изобретению. Авторы изобретения осуществляли эксперименты при использовании МНС-конгенных крыс,трансфицированных HLA-DR2b клеточных линий и специфичных к основному миелиновому белку(МБР) Т-клеточных линий и HLA-DR2b-трансгенных мышей. С помощью полученных in vivo данных доказано, что путем применения предлагаемых согласно изобретению высокоаффинных пептидов можно подавлять, соответственно, замедлять появление экспериментально индуцированного, подобного рассеянному склерозу аутоиммунного заболевания, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита(ЕАЕ). Эксперименты in vitro показывают, что пептиды вызывают уменьшение пролиферации Т-клеток в случае человеческих, специфичных к МБР, аутореактивных Т-клеток. В случае HLA-DR2b-трансгенных мышей пептиды приводят к ослаблению тяжести заболевания. Авторы изобретения, поэтому, впервые получили соединение, которое может селективно аллель- и изотип-специфически связываться с молеку-1 019358 лой класса II МНС, HLDR2b, и благодаря этому интерферирует с презентацией молекулы класса II МНС аутоантигенов. Определенная авторами изобретения эффективность предлагаемого согласно изобретению пептида в случае экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита оказалась неожиданной, и ее нельзя было ожидать. Так, правда, De Graaf и др. в статье "МНС class II isotype- and allele-specific attenuation of experimental autoimmune encephalomyelitis", J. Immunol. 173, 2792-2802 (2004), указывают, что можно получать пептиды, которые изотип- и аллель-специфически связываются с молекулами класса II МНС крыс,RT1.B и RT1.D, и при этом могут ослаблять экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит. Из осуществленных на крысе экспериментов нельзя сделать вывод, что можно получать соответствующие пептиды, которые могут высокоаффинно связываться с человеческой молекулой класса II МНС, HLADR2b, так как HLA-DR2b у человека и RT1.B и RT1.D у крысы структурно различаются. К тому же различаются генетическое "оснащение" МНС- и не-МНС-генома, а также иммунные системы крысы, мыши и человека. Поэтому также особенно неожиданными были данные in vitro, полученные авторами изобретения при использовании человеческих Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток. Синтез предлагаемых согласно изобретению пептидов осуществляют согласно известным специалисту в данной области способам, которые описаны в стандартных руководствах; см. John Howl (ред.)"Peptide Synthesis and Applications" (Methods in Molecular Biology), Humana Press; первое издание. Эти способы осуществляются отчасти полностью автоматизированно, так что в течение самого короткого времени можно получать множество пептидов с рандомизированными аминокислотными последовательностями. Альтернативно, также можно использовать коммерчески доступные библиотеки пептидов. Аффинность к связыванию синтезированного, предлагаемого согласно изобретению пептида с HLADR2b можно определять, например, посредством конкурентного, базирующегося на флуоресценции,твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) при использовании очищенных HLA-DR2bмолекул, как описывается в примерах осуществления. Специфическое "выполнение" пептида осуществляют, соответственно, согласно стандартным способам и не требуется никакого лишнего экспериментирования. Человеческая молекула класса II МНС, HLA-DR2b, описана, например, Wu и др., J. Immunol. 138(9),pp.2953-2959 (1987): "cDNA cloning and sequencing reveals that the electrophoretically constant DR -2 molecules as well as the variable DR p-1 molecules, from HLA-DR2 subtypes have different amino acid sequencesincluding a hypervariable region for a functionally important epitop". Содержание этой публикации является составной частью настоящей заявки. Аминокислотная последовательность человеческой HLA-DR2b опубликована в библиотеке данных NCBI и представлена в прилагаемом списке последовательностей в случае идентифицированной последовательности NO:26. При этом предпочтительно, когда предлагаемый согласно изобретению пептид для связывания сHLA-DR2b имеет значение IC50, которое составляет примерно 0,1 мкМ, предпочтительно примерно 0,01 мкМ, более предпочтительно примерно 0,002 мкМ и, в высшей степени предпочтительно, примерно 0,001 мкМ. Преимущество этого технического решения состоит в том, что пептиды особенно высокоаффинно связываются с HLA-DR2b и тем самым обеспечивают большую эффективность в терапии и/или профилактике аутоиммунных заболеваний. Значение IC50 указывает концентрацию ингибитора, в настоящем случае концентрацию предлагаемого согласно изобретению пептида, которая необходима для ингибирования in vitro на 50% фермента, клетки, клеточного рецептора, микроорганизма, в настоящем случаеHLA-DR2b-молекулы, вообще - структур-мишеней. Предлагаемый согласно изобретению пептид включает предпочтительно менее чем 20 аминокислот, более предпочтительно менее чем 15 аминокислот, более предпочтительно менее чем 10 аминокислот и в высшей степени предпочтительно 9 аминокислот или состоит из вышеуказанного количества аминокислот. Преимущество этого технического решения состоит в том, что пептид на основании своей "короткости" является не только особенно стабильным, но и также его можно просто и при меньших затратах синтезировать и использовать для получения фармацевтических композиций. Согласно изобретению далее, предпочтительно, когда пептид ингибирует способность HLA-DR2b к презентации антигенов. Известно, что за счет презентации антигенов, в особенности аутоантигенов, при помощи человеческой молекулы класса II МНС, HLA-DR2b, Т-клетками происходят деструктивные аутореакции иммунной системы. За счет ингибирования презентации антигенов эндогенного происхождения, согласно изобретению, специфическим образом ингибируется аутоиммунная реакция и вместе с тем замедляется или возможно даже прекращается прогрессирование заболевания. При этом предпочтительно, когда предлагаемый согласно изобретению пептид обладает иммуномодулирующей активностью, которая предпочтительно представляет собой терапевтическую эффективность против иммунного заболевания. Под "иммуномодулирующей активностью" согласно изобретению понимают, что пептид после применения в случае пациента, пораженного аутоиммунным заболеванием или находящегося в опасности относительно этого заболевания, приводит к изменению аутоиммунного заболевания за счет влияния на иммунную реакцию. Эта иммуномодулирующая активность предпочтительно представляет собой терапевтическую эффективность против аутоиммунного заболевания. Преимущество этого технического решения состоит в том, что получают такой пептид, который пригоден для целенаправленной терапевтической интервенции в патологию аутоиммунного заболевания. При этом предпочтительно, когда иммуномодулирующая активность представляет собой терапевтическую эффективность против экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) или рассеянного склероза (MS). Согласно этому варианту получают пептид, который обладает терапевтической эффективностью против проблематичных и важных аутоиммунных заболеваний. Согласно одному варианту предлагаемый согласно изобретению пептид имеет следующую структуру:- причем X1 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из лейцина, валина,изолейцина, метионина, фенилаланина, аспартата;- причем Х 2 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из изолейцина, лейцина, валина;- причем Х 3 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, метионина, тирозина, аспартата;- причем Х 4 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из тирозина, триптофана, изолейцина;- причем Х 5 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из тирозина, фенилаланина, изолейцина, триптофана;- причем Х 6 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из тирозина, серина,аспарагина;- причем Х 7 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из тирозина, серина,аспарагина, фенилаланина;- причем Х 8 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из тирозина, триптофана, лейцина, серина; и- причем Х 9 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, валина, пролина, тирозина, фенилаланина, аспартата. Авторы изобретения исследовали 171 рандомицированный нонапептид (пептиды из 9 аминокислот) в отношении их способности к высокоаффинному связыванию с очищенной HLA-DR2b-молекулой. Из результата этих исследований установили вышеуказанную консенсусную последовательность. Благодаря предусмотрению указанных аминокислот в соответствующих позициях X1-X9 обеспечивается то, что получают такие пептиды, которые могут высокоаффинно связываться с человеческой молекулой классаII МНС, HLA-DR2b, и тем самым имеют особенное терапевтическое значение. При этом предпочтительно, когда у предлагаемого согласно изобретению пептида N-терминальный конец ацетилирован, и С-терминальный конец амидирован. А именно, известно, что для заполнения борозды пептидного связывания МНС-II-молекул предпочтительно используют пептиды длиной из девяти аминокислот, однако, более длинные пептиды могут вступать в более стабильные связывания. За счет амидирования и ацетилирования имитируются две другие аминокислоты, благодаря чему пептид, между прочим, стабилизируется в борозде связывания. Согласно предпочтительному варианту предлагаемый согласно изобретению пептид имеет аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из идентифицированных последовательностей от NO: 1 до NO: 15. В соответствии с этим техническим решением уже получают пептид, который, согласно проведенным авторами изобретения экспериментам, оказывается особенно высокоаффинным к HLA-DR2b и тем самым особенно терапевтически эффективным. Понятно, что указанные аминокислотные последовательности могут быть другими N- и/или С-концевыми аминокислотными последовательностями, без существенного ухудшения, благодаря этому, терапевтической эффективности и способности пептида в отношении возможности высокоаффинного связывания с человеческой молекулой класса II МНС, HLADR2b. Только непрерывная последовательность девяти аминокислот в пептиде обеспечивает связывание с HLA-DR2b и тем самым терапевтическую эффективность пептида. В соответствии с этим объектом настоящего изобретения является также пептид, который обладает идентичностью аминокислотной последовательности с вышеуказанным пептидом, соответственно одной из идентифицированных последовательностей от NO: 1 до NO: 15, которая составляет примерно 50%,более предпочтительно, примерно 60%, более предпочтительно примерно 70%, более предпочтительно примерно 80%, более предпочтительно примерно 90%, более предпочтительно 95%, более предпочти-3 019358 тельно примерно 99% и в высшей степени предпочтительно примерно 100%. Известно, что пептиды с достаточно высокой идентичностью аминокислотной последовательности обладают сравнимыми активностями. Так, например, замена одной аминокислоты с определенными химическими свойствами (например, аспарагиновой кислоты) на другую аминокислоту с подобными химическими свойствами (например, глутаминовую кислоту) не приводит к потере биологической активности пептида. Такого рода пептиды с модифицированными, достаточно идентичными, соответственно, гомологичными аминокислотными последовательностями также обладают свойствами предлагаемых согласно изобретению пептидов и входят в объем охраны настоящего изобретения. Идентичности последовательностей можно просто определять с помощью обычного, имеющегося в распоряжении специалиста программного обеспечения. Примером такого программного обеспечения является "SEM Alignment Toolfor Protein Sequences" http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html. В соответствии с этим, объектом настоящего изобретения является также пептид, который обладает идентичностью аминокислотной последовательности с вышеуказанным пептидом, соответственно с одной из идентифицированных последовательностей от NO: 1 до NO: 15, которая составляет примерно 50%, более предпочтительно примерно 60%, более предпочтительно примерно 70%, более предпочтительно примерно 80%, более предпочтительно примерно 90%, более предпочтительно 95%, более предпочтительно примерно 99% и в высшей степени предпочтительно примерно 100%. Также такого рода пептиды проявляют достаточно высокую аффинность к человеческой молекуле класса II МНС, HLA-DR2b, и поэтому пригодны для лечения и/или профилактики аутоиммунных заболеваний. Активность такого пептида можно просто определять при использовании созданной изобретателями и описанной в примерах осуществления модели. Согласно предпочтительному варианту предлагаемый согласно изобретению пептид используют вместе с лекарственным средством против рассеянного склероза, выбираемым из группы, состоящей из кортикостероида; интерферона, предпочтительно Betaferon, Avonex, Rebif; глатирамерацетата,предпочтительно Copaxone; азатиоприна, предпочтительно Imurek; натализумаба, предпочтительноEndoxan; метотрексата, предпочтительно Metex 7,5; иммуноглобулина, предпочтительно Gamunex 10%, Octagam . Преимущество этого технического решения состоит в том, что снова повышается терапевтическая и/или профилактическая эффективность предлагаемого согласно изобретению пептида. Благодаря комбинации пептида с обычным лекарственным средством против рассеянного склероза получают различные механизмы действия, которые приводят к особенно эффективному лечению пораженного рассеянным склерозом пациента. В соответствии с этим следующим объектом настоящего изобретения является применение предлагаемого согласно изобретению пептида для получения лекарственного средства в целях терапевтического и/или профилактического лечения аутоиммунного заболевания. Объектом настоящего изобретения далее является молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно вектор экспрессии, которая, соответственно, кодирует предлагаемый согласно изобретению пептид. Дальнейший объект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей предлагаемый согласно изобретению пептид, а также фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители описываются, например, Rowe и др. "Handbook of Pharmaceutical Excipients", Pharmaceutical Press and American Pharmacists Assoc, пятое издание (2006), и Bauer и др. "Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie", Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart. Содержание вышеуказанных публикаций путем ссылки входит составной частью в настоящее изобретение. Объектом настоящего изобретения, далее, является способ лечения или профилактики аутоиммунного заболевания, которое предпочтительно выбирают из группы, состоящей из рассеянного склероза(MS), экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ), ревматоидного артрита, сахарного диабета типа I, тяжелой миастении, у живого организма, который, предпочтительно, является человеческим, причем молекула класса II МНС предпочтительно типа HLA-DR2b, включающий следующие стадии: (1) селективное аллель- и изотип-специфическое ингибирование презентации антигенов молекулами класса II МНС в живом организме и (2), в случае необходимости, повторение стадии 1. При этом ингибирование презентации антигенов осуществляют предпочтительно путем введения пептида, который высокоаффинно может связываться с человеческой молекулой класса II, HLA-DR2b. При этом предпочтительно, когда в качестве пептида используют предлагаемый согласно изобретению пептид. Альтернативно, ингибирование презентации антигенов молекулами класса II МНС осуществляют путем введения предлагаемой согласно изобретению молекулы нуклеиновой кислоты и/или предлагаемой согласно изобретению фармацевтической композиции. Понятно, что вышеуказанные и ниже еще поясняемые признаки применимы не только в соответственно указанной комбинации, но и также в других комбинациях или в индивидуальном варианте, не выходя за рамки настоящего изобретения. Настоящее изобретение теперь поясняется подробнее, руководствуясь примерами осуществления,-4 019358 из которых следуют дальнейшие признаки и преимущества. Примеры осуществления являются чисто иллюстративными и не ограничивают объем охраны изобретения. Ссылаются на прилагаемые фигуры. На них представлено следующее: На фиг. 1 представлено ингибирование индуцируемой МБР 85-99 секреции IL-2 предлагаемыми согласно изобретению HLA-DR2b-пептидами. L466-клетки и 08073-клетки, которые трансфицированы с помощью HLA-DR2b, совместно инкубировали в присутствии 1 мкг/мл МВР 85-99 и 10 мкг/мл различных HLA-DR2b-пептидов, kein Komp. = в смеси нет никакого предлагаемого согласно изобретению пептида. Спустя 24 часа супернатант собирали и количество IL-2, которое находилось в супернатанте, определяли путем специфического для мыши IL-2-ELISA. На фиг. 2 представлена ингибирующая способность А-, К- и X-замещенных HuPb28-вариантов.L466-клетки и 08073-клетки, которые трансфицированы с помощью HLA-DR2b, совместно инкубировали в присутствии 1 мкг/мл МБР 85-99 и 10 мкг/мл HuPb28-вариантов. Спустя 24 ч клеточный супернатант собирали и количество IL-2, которое находилось в супернатанте, определяли путем специфического для мыши IL-2-ELISA. На фиг. 3 представлен результат эксперимента по совместной иммунизации. DR2b-мышей иммунизировали с помощью пептида MOG 35-55 в CFA (n=8) или иммунизировали одновременно с помощьюMOG 35-55 и пептида HuPb11 (идентифицированная последовательность NO: 17) (n=8) или MOG 35-55 и пептида HuPb29 (идентифицированная последовательность NO: 9) (n=9). Pertussis-токсин (РТХ) вводили интраперитонеально в день 0 и в день 2. Мышей ежедневно исследовали в отношении ЕАЕ и взвешивали. Совместное введение пептида HuPb28 (идентифицированная последовательность NO: 9;) приводит к уменьшению суммарного показателя (р 0,05). 1. Материал и методы 1.1 Библиотеки пептидов и пептиды Библиотеки с синтетическими ацетилированными нонапептидами, как также определенные ацетилированные нонапептидамиды и биотинилированные пептидамиды получали посредством полностью автоматизированного твердофазного пептидного синтеза при использовании 9 флуоренилметоксикарбонил-трет-бутил(Fmoc-tWu)-химии и анализировали посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии с ионизацией электронным распылением. Биотинилированный CLIP-пептид 97-120 (LPKSAKPVSPMRMATPLLMRPSMD) получали тем,что пептид удлиняли с помощью двух спейсерных аминокислот, следующих за биотином, при использовании метода связывания. 1.2 Очистка DR2b-молекул и исследования в отношении пептидного связыванияDR2b-молекулы очищали из L-клеток, которые котрансфицированы с помощью HLA-DRA и HLADRB11501, и именно путем аффинной хроматографии при использовании специфичного к HLA-DR антитела L243, как описано Weissert и др. "МНС class II-regulated central nervous system autoaggression andexperimental autoimmune encephalomyelitits", J. Immunol., 166, 7588-7599 (2001). Вышеуказанная публикация путем ссылки входит составной частью в настоящую заявку. Исследование связывания осуществляли с помощью конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), который базируется на иммунофлуоресцентном анализе с усиленной диссоциацией за счет лантанида (Wallac, Turku, Финляндия). Для конкурентного ELISA 50 нМ раствора DR2b-молекул инкубировали в течение 48 ч при температуре 37 С вместе с 50 нМ биотинилированного CLIP 97-120 в присутствии 250 нМ суббиблиотеки ацетилированных нонапептид-амидов или с различными концентрациями конкурентных пептидов,которые использовали в области от 1 нМ до 100 мкМ. Значение IC50 пептида определяли как концентрацию пептида, которая является необходимой для 50%-ного ингибирования связывания меченого пептида. 1.3 Блокирование IL-2-секреции при помощи высокоаффинных лигандов DR2b Получали Т-клеточную гибридому (08073), которая экспрессирует Т-клеточный рецептор, специфичный к МБР 85-99, который презентируется HLA-DR2b. После стимуляции с помощью МБР 85-99,презентируемого HLA-DR2b-трансфицированными L466-клетками, 08073-клетки секретируют значительные количества IL-2. 5104 08073-клеток в течение 24 ч совместно инкубировали с 5104 HLA-DR2bтрансфицированными L466-клетками в RPMI-среде (Invitrogen, Pailey, Великобритания)/2% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (PAA, Linz, Австрия)/100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамина (все выпускаются фирмой Invitrogen) в присутствии 1 мкг/мл МБР 85-00 с высокоаффинными пептидами (10 мкг/мл) или без них. Количества IL-2, которые выделились в супернатант, определяли с помощью специфического в отношении IL-2 мыши ELISA (BD Biosciences Pharmingen, СанДиего, СА, США). 1.4 Мыши и индукция ЕАЕinduces severe chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR2-transgenic mice", Eur. J. Immunol., 34, 1251-1261 (2004 в возрасте 8-14 недель иммунизировали с помощью 300 мкг миелинолигодендроцит-гликопротеин-35-55-пептида (MOG 35-55) в CFA или совместно иммунизировали с по-5 019358 мощью 300 мкг MOG 35-33 и 200 мкг пептида HuPb28 (идентифицированная последовательность NO: 9) или пептида HuPb11 (идентифицированная последовательность NO: 17) в CFA. В день 0 и в день 2 интраперитонеально вводили 400 нг Pertussis-токсина (РТХ). Мышей наблюдали вплоть до 46 дней и клинически классифицировали. Использовали следующие градации: 0 - никакого заболевания; 1 - бессилие или паралич хвоста; 2 бессилие задних ног; 3 - паралич задних ног; 4 - паралич передних и задних ног; 5 - обреченные на смерть, или смерть, происшедшая за счет заболевания. 2. Результаты и обсуждение 2.1 Получение модели активности в отношении MS-ассоциированных HLA-DR2b-молекул На первой стадии получали модель активности в отношении HLA-DR2b-молекул тем, что исследовали эффект каждой аминокислоты в каждой позиции кармана пептидного связывания молекулы классаII МНС. Это осуществляли тем, что определяли аффинность 171 суббиблиотеки нонапептидамидов (9 последовательных позиций 19 аминокислот, исключая цистеин; см. табл. I) к очищенным HLA-DR2bмолекулам путем конкурентного, базирующегося на флуоресценции ELISA. Таблица I. Схематическое представление библиотек синтетических ацетилированных нонапептидамидов Полученная модель активности представлена в нижеприводимой табл. II. Таблица II. Относительное влияние определенных аминокислотных остатков на активность пептидного связывания в отношении очищенных DR2b-молекул В этой таблице представлены относительные конкурентные значения, которые рассчитывали тем,что абсолютное конкурентное значение, которое получали для определенной библиотеки нонапептидов,делили на конкурентное значение, которое получали в случае полностью рандомизированной суббиблиотеки нонапептидов (AC-X9-NH2), которая находится на подобном 96-луночном планшете. В общем, отрицательно заряженные аминокислоты являются неблагоприятными для связывания. В противоположность этому, большие гидрофобные остатки имеют тенденцию способствовать связыванию. Ароматическая полярная аминокислота тирозин (Y) усиливает аффинность по всех позициях, кроме второй позиции. Другие ароматические и полярные аминокислоты, как, например, серии (S) и треонин(Т), равным образом неблагоприятны в этой позиции. Наличие больших алифатических гидрофобных боковых цепей в первых трех позициях способствует аффинности. В противоположность этому, позиции 4 и 5 предпочтительно заняты ароматическими аминокислотами. В позициях 6 и 7 полярные аминокислоты серин (S) и аспарагин (N) способствуют связыванию, тогда как наличие алифатических боковых цепей в этих позициях скорее неблагоприятно. Характерно, фенилаланин (F) оказывает сильно отрицательное влияние на аффинность, когда он находится в позиции 6, в то время как он способствует аффинности, когда он находится в позиции 7. Наконец, позиции 8 и 9 предпочтительно занимаются ароматическими и алифатическими гидрофобными остатками. 2.2 Тестирование модели активности, полученной в отношении HLA-DR2 Ь-молекулы Для признания действительной модели активности в отношении HLA-DR2b синтезировали две партии пептидов. Первая партия пептидов состоит из рандомизированно селекционированных комбинаций неблагоприятных аминокислот для каждой из девяти позиций (HuPb10-HuPb19), в то время как вторую партию пептидов получали при использовании рандомизированных комбинаций благоприятных аминокислот (HuPb20-HuPb34); см. табл. III. Таблица III. Значения IC50 ацетилированных нонапептидамидов для связывания с HLA-DR2bмолекулами После синтеза получают лишь незначительное количество пептидов HuPb6, HuPb7, HuPb12, HuPb13,HuPb16 и HuPb25. Поэтому для этих пептидов нельзя определить никаких IC50-значений. Аффинность каждого из этих пептидов к HLA-DR2b-молекуле определяли посредством ELISA. Все пептиды, которые обладали предпочтительными аминокислотами, показывали очень высокую аффинность (IC50 0,002 мкМ) к HLA-DR2b, кроме HuPb23, который показал среднюю аффинность. В противоположность этому, большинство пептидов, которые обладали неблагоприятными аминокислотами, показывали очень низкие (IC5030 мкМ) или неопределяемые аффинности (IC50100 мкМ). 2.3 Блокирование биологической активности при использовании высокоаффинных к HLA-DR2b пептидов Прежде всего, нужно исследовать, способны ли высокоаффинные к HLA-DR2b пептиды блокировать презентацию продуцируемого миелином антигена в HLA-DR2b в релевантном биологическом тесте. Множество ссылок указывают на роль основного миелинового белка (МBР) в качестве аутоантигена в случае MS. Эпитоп МBР 83-99 связывается, безразлично, с HLA-DR2a-молекулой, также как с HLADR2b-молекулой. После стимуляции с помощью МBР 85-99, презентируемого L-466-клетками, которые трансфицированы HLA-DR2b, специфичными к МBР 85-99 Т-клеточными гибридомами 08073 секретируются высокие количества IL-2. Тестировали способность пептидов с самой высокой аффинностью к HLA-DR2b блокировать секрецию IL-2 после стимуляции 08073-клеток с помощью МБР 85-99, что проявляется в уменьшении флуоресценции при возбуждении при 450 нм (оптическая плотность, OD). В то время как HuPb28 (идентифицированная последовательность NO:9), HuPb31 (идентифицированная последовательность NO:12) иHuPb32 (идентифицированная последовательность NO:13) в значительной степени уменьшают секрециюIL-2 после стимуляции специфичной к МБР 85-99 Т-клеточной гибридомы, HuPb2 7 (идентифицированная последовательность NO:8) и HuPb30 (идентифицированная последовательность NO:11) индуцируют лишь небольшое уменьшение секреции IL-2 при используемых концентрациях пептида. HuPb17 (идентифицированная последовательность NO:23) и HuPb19 (идентифицированная последовательность NO:25),два низкоаффинных к HLA-DR2b пептида, вообще не оказывают никакого влияния на продуцирование Три пептида, которые в биологическом тесте проявляли самые сильные эффекты, состояли из последовательностей, которые обладали, по существу, гидрофобными аминокислотами. Этот факт оказал сильное влияние на эффективность пептидного синтеза, то есть количество пептида, которое было получено посредством ВЭЖХ-очистки сырой пептидной фракции после твердофазного синтеза. Так какHuPb28 (идентифицированная последовательность NO: 9) синтезирован с самой высокой эффективностью, последующие исследования в отношении потенциала высокоаффинных пептидов для блокады презентации аутоантигена in vivo осуществляли при использовании этого пептида. Для получения больше структурных информации о HuPb28 (идентифицированная последовательность NO:9) получали HuPb28-варианты тем, что все позиции в пептидной последовательности замещали аланином (А), лизином (К) или X (все возможные аминокислоты, кроме цитозина (С и эти пептидные варианты тестировали в биологическом тесте; см. фиг. 2. Замещения в позициях 1-5 приводят, в общем, к получению пептидов с усиленной способностью блокирования секреции IL-2. В особенности, наличие аланина (А) в позиции 3 значительно снижает секрецию IL-2. Эти пептидные варианты могут представлять интерес, так как замещение изолейцином взамен аланина (А) в позиции 3 HuPb28 может положительно влиять на растворимость пептида и/или эффективность синтеза. В противоположность этому, изменения в позициях 6-9 пептида обычно вызывают снижение потенциала HuPb28 в отношении блокирования секреции IL-2. 2.4 Ослабление индуцированного MOG 35-33 экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) на мышиной модели с HLA-DR2b-трансгенной мышью Прежде всего, исследовали потенциал HuPb28 (идентифицированная последовательность NO: 9) в отношении ослабления индуцированного MOG 35-55 ЕАЕ в случае HLA-DR2b-трансгенных мышей. Совместное введение высокоаффинно связывающего пептида (пептид HuPb28; идентифицированная последовательность NO: 9) с MOG 35-55 в момент иммунизации ослабляет клинические симптомы ЕАЕ; см. фиг. 3. 3. Вывод Авторы изобретения продемонстрировали, например, с помощью пептида HuPb28 (идентифицированная последовательность NO:9) в случае HLA-DR11501-трансгенных мышей на основе индуцированного M.OG 35-55 экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (р 0,05, суммарный показатель), что при использовании высокоаффинных к HLA-DR2b пептидных лигандов можно предотвращать аутоиммунные заболевания или их даже можно лечить. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Пептид, связывающийся с высокой аффинностью с человеческой молекулой класса II МНС HLADR2b, выполненный таким образом, что он ингибирует способность HLA-DR2b к презентации антигенов, где указанный пептид имеет следующую структуру: причем N означает N-терминальный конец и С означает С-терминальный конец;X1 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из лейцина, валина, изолейцина, метионина, фенилаланина, аспартата; Х 2 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из изолейцина, лейцина, валина; Х 3 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, метионина, тирозина, аспартата; Х 4 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из тирозина, триптофана, изолейцина; Х 5 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из тирозина, фенилаланина,изолейцина, триптофана; Х 6 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из тирозина, серина, аспарагина; Х 7 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из тирозина, серина, аспарагина, фенилаланина; Х 8 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из тирозина, триптофана, лейцина, серина; и Х 9 означает аминокислоту, которую выбирают из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, валина, пролина, тирозина, фенилаланина, аспартата. 2. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он включает менее чем 20 аминокислот, предпочтительно менее чем 15 аминокислот, более предпочтительно менее чем 10 аминокислот и в высшей степени предпочтительно 9 аминокислот. 3. Пептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что он выполнен таким образом,что он обладает иммуномодулирующей активностью. 4. Пептид по п.3, отличающийся тем, что иммуномодулирующая активность представляет собой терапевтическую эффективность против аутоиммунного заболевания. 5. Пептид по п.4, отличающийся тем, что иммуномодулирующая активность представляет собой терапевтическую эффективность против экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ). 6. Пептид по п.4, отличающийся тем, что иммуномодулирующая активность представляет собой терапевтическую эффективность против рассеянного склероза (MS). 7. Пептид по п.1, отличающийся тем, что N-терминальный конец ацетилирован и С-терминальный конец амидирован. 8. Пептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что он имеет аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из идентифицированных последовательностей от NO: 1 до NO: 15. 9. Пептид, отличающийся тем, что он обладает идентичностью аминокислотной последовательности с пептидом по п.8, которая составляет примерно 50%, более предпочтительно примерно 60%, более предпочтительно примерно 70%, более предпочтительно примерно 80%, более предпочтительно примерно 90%, более предпочтительно примерно 95%, более предпочтительно примерно 99% и в высшей степени предпочтительно примерно 100%. 10. Пептид, отличающийся тем, что обладает примерно 50%, более предпочтительно примерно 60%, более предпочтительно примерно 70%, более предпочтительно примерно 80%, более предпочтительно примерно 90%, более предпочтительно примерно 95%, более предпочтительно примерно 99% биологической активности пептида по п.8. 11. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно связан с лекарственным средством против рассеянного склероза. 12. Пептид по п.11, отличающийся тем, что лекарственное средство против рассеянного склероза выбирают из группы, состоящей из кортикостероида; интерферона, предпочтительно Betaferon,Avonex, Rebif; глатирамерацетата, предпочтительно Copaxone; азатиоприна, предпочтительноImurek; натализумаба, предпочтительно Antegren/Tysabri; митоксантрона, предпочтительно Ralenova; циклофосфамида, предпочтительно Endoxan; метотрексата, предпочтительно Metex 7,5; иммуноглобулина, предпочтительно Gamunex 10%, Octagam. 13. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид по любому из пп.1-10. 14. Молекула нуклеиновой кислоты по п.13, отличающаяся тем, что она представляет собой вектор экспрессии. 15. Фармацевтическая композиция, включающая пептид по любому из пп.1-12, а также фармацевтически приемлемый носитель для применения при лечении рассеянного склероза. 16. Способ лечения или профилактики аутоиммунного заболевания у живого организма, являющегося человеческим организмом, включающий следующие стадии:(1) селективное аллель- и изотип-специфическое ингибирование презентации антигенов молекулами класса II МНС типа HLA-DR2b в живом организме, отличающееся тем, что происходит ингибирование при введении пептида, как заявлено в любом из пп.1-12, молекулы нуклеиновой кислоты по пп.13 и 14 и/или фармацевтической композиции по п.15 в живой организм,(2) в случае необходимости, повторение стадии 1. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что живой организм является человеческим и молекулы класса II МНС являются молекулами типа HLA-DR2b. 18. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что ингибирование осуществляют путем введения пептида, который высокоаффинно может связываться с человеческой молекулой класса II МНС, HLADR2b. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что в качестве пептида применяют пептид по любому из пп.1-12. 20. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что ингибирование осуществляют путем введения в живой организм молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.13 и 14 и/или фармацевтической композиции по п.15. 21. Способ по любому из пп.16-20, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание выбирают из группы, состоящей из рассеянного склероза (MS), экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита(ЕАЕ), ревматоидного артрита, сахарного диабета типа I, тяжелой миастении.