Молекулы днк межгенных участков вируса верхушки грозди бананов, способ экспрессии гена в растительной клетке с помощью указанных молекул днк и линия трансформированных растительных клеток, содержащаятакие молекулы днк

1 Изобретение относится к последовательностям ДНК вируса верхушки грозди бананов(BBTV) и, в частности, к межгенным участкам компонентов 1-6. Предшествующий уровень техники Заболевание верхушки грозди бананов(BBTV) является наиболее важным вирусным заболеванием бананов (Dale, 1987, Advances inVirus Research 33 301-325). Оно широко распространено в Азии и странах Южной части Тихого океана и имеет ограниченное распространение в Австралии и Африке. Не сообщалось о случаях заболевания в Америке. Первоначально считалось, что заболевание вызывается лютеовирусом и передатся тлями, но не механическим путм, причм вирус инфицирует растения с поврежднной флоэмой и вызывает их пожелтение. Однако недавно из ткани инфицированных растений были выделены и очищены изометрические вирусоподобные частицы (VLPs) размером 18-20 нм и было показано, что они ассоциированы с заболеванием (Harding et al., 1991,Journal of General Virology 72 225-230; ThomasDietzgen, 1991, Journal of General Virology 72 217-224; Wu and Su, 1990 Journal of Phytopathology 128 153-160). Harding et al (Harding et al.,1991, Journal of General Virology 72 225-230;Harding et al, 1993 Journal of General Virology 74 323-328), изолировали кольцевую одноцепочечную ДНК (ssДHK) размером около 1 kb из указанных частиц, а затем клонировали и секвенировали е. Указанная ssДHK, называемая ДНКкомпонентом 1 BBTV, имеет одну большую открытую рамку считывания (ORF) в смысловой цепи и предпочтительно кодирует репликазу. Указанный компонент передатся тлями переносчиками заболевания. В работе Burns et al., 194 Arch Virol. 137 371-380, сообщается о клонировании и секвенировании второго компонента BBTV. Исследователи обнаружили, что между двумя геномными компонентами ssДHK BBTV находится строго консервативная последовательность из 93 нуклеотидов. На основе указанной последовательности были сконструированы два внешних удлиняющих вырожденных праймера, которые использовались в полимеразной цепной реакции(PCR) с ДНК, экстрагированной из очищенных варионов BBTV. Продукты PCR-амплификации соответствовали, по крайней мере, семи отдельным полосам размером около 1 kb каждая и возможно подтверждали выделение полноразмерной dsДHK BBTV. Продукты PCRамплификации клонировали и полученные клоны исследовали с помощью анализа рестрикционными ферментами. В результате по характеру рестрикции было идентифицировано четыре отдельные группы клонов. В указанной работе утверждается, что геном BBTV содержит, по крайней мере, четыре компонента и BBTV принадлежит к ранее неописанной группе вирусов 2 растений, которая может также включать вирус скрытой низкорослости гвоздики. В работе Karan et al., 1994 Journal of General Virology 75 3541-3546, приведены результаты клонирования и последующего сравнения упорядоченных последовательностей компонента 1 BBTV, выделенного из вирусных изолятов,полученных в 10 различных странах. В результате было идентифицировано две группы: группа стран Южной части Тихого океана (изоляты из Австралии, Бурунди, Египта, Фиджи, Индии,Тонга и Западного Самоа), и Азиатская группа(изоляты из Филиппин, Тайваня и Вьетнама). Средняя величина различия последовательностей в пределах каждой группы составляет 1,93,0%, а между изолятами двух групп около 10%,однако, некоторые участки последовательностей различались в большей степени, чем другие. Тем не менее белки, кодируемые большими открытыми рамками считывания, различались примерно на 5%. Участок от начала стержневой петлевой последовательности до возможного ТАТА-бокса был идентичным у всех изолятов,за исключением двух нуклеотидных замен в изоляте Западного Самоа и одной нуклеотидной замены в изоляте NSW. Приведнные результаты вместе с другими свидетельствами позволяют предположить, что BBTV заражает бананы после того, как они начинают поступать из Азиатско-Тихоокеанского региона в Африку и Америку. В работе Xie et al., 1995, Phytopathology 85 339-347, описано получение очищенного Гавайского изолята BBTV из инфицированной культуры бананов Вильямса. Были секвенированы и клонированы три одноцепочечных компонента ДНК (ssДНК), обозначенные 1, 3 и 4 соответственно. Компонент 1 имеет 1110 нуклеотидов в длину и обнаруживает 96% идентичности нуклеотидной последовательности с ДНКкомпонентом 1 BBTV Австралийского изолята,описанного Harding et al. (1993), см. выше. Указанный компонент содержит две открытых рамки считывания (ORF), кодирующих белок мол. массы около 33,5 кДа, который может функционировать как репликаза, и белок с мол. массой около 15,2 кДа с неизвестными функциями. Компонент 3 имеет 1057 нуклеотидов в длину и не содержит каких-либо открытых рамок считывания, кодирующих продукт мол. массой более чем 10 кДа. Компонент 4 имеет 1017 нуклеотидов в длину и возможно кодирует белок с мол. массой 18,9 кДа. Все три компонентаssДНК имеют одинаковую стержневую последовательность и консервативную некодирующую область. Последовательность каждого изо всех трх указанных компонентов отличается от таковой ДНК-компонентов BBTV двух Тайваньских изолятов. BBTV-специфические клоны используют для дот-блот-гибридизации с целью выявления BBTV в тканях растений с помощью радиоактивно-меченных и немеченных проб. 3 Для выявления BBTV в образцах бананов и отдельных тлях используют полимеразную цепную реакцию (PCR). Дот-блот-гибридизация чувствительна в той же степени, что и тврдофазный иммуноферментный анализ (ELISA), в то время, как PCR в 1000 раз чувствительнее,чем дот-блот-анализ и ELISA, при выявленииBBTV в бананах. Так называемые межгенные участки геномных компонентов 1, 3 и 4 описаны Hardinget al., 1993, см. выше, и Xie and Нu, 1995, см. выше. Однако известна только одна особенность таких межгенных участков, а именно наличие стержневой петлевой структуры в компоненте 1, описанной Harding et al., 1993, см. выше. В ранее поданной заявке (PCT/AU 95/00311) имеется ссылка на компоненты 3, 4 и 6 BBTV, которые заявлены в формуле per se. Участки за пределами ORF (так называемые межгенные участки) также описаны в указанной более ранней заявке. Геномные компоненты 1, 3 и 4, охарактеризованные Xie and Hu, 1995, см. выше, соответствуют компонентам 1, 2 и 5, описанным в указанной более ранней заявкеPCT/AU 95/00311. Краткое описание изобретения Неожиданно было обнаружено, что межгенные участки геномных компонентов 1-6BBTV или их фрагменты содержат последовательности, способные промотировать, усиливать, регулировать или модифицировать транскрипцию генов не BBTV. Под межгенным участком в настоящем описании подразумеваются некодирующий участок компонента BBTV или участок, находящийся за пределами ORF компонента BBTV. Изобретение, таким образом, относится к указанным выше последовательностям, которые используются для промотирования, усиления,регуляции или модификации транскрипции генов не BBTV. Последовательность ДНК-молекулы может быть по существу идентичной или комплементарной частичному фрагменту межгенного участка компонентов 1-6 BBTV. Понятие "по существу комплементарная или идентичная" относится к последовательностям, различающимся на величину до 20% (то есть комплементарная,по меньшей мере, на 80%). Степень различия может быть определена стандартными методами гибридизации или сравнением последовательностей. Величина вариабельности, составляющая 20%, показана для участков, находящихся за пределами ORF компонента 1 у двух различных географических изолятов (Karan et аl., 1994,Journal of General Virology, 75, 5341-3546; заявка на патент США 08/202 1986). Оба источника информации приведены здесь в качестве ссылки для подтверждения заявленных данных о 20%ной вариабельности всех компонентов BBTV. Вариабельность, установленная для компонента 4 1 различных географических изолятов, соответствует вариабельности между отдельными компонентами различных географических изолятов. Таким образом, величина вариабельности, достигающая 20%, относится к последовательностям компонентов 2-6, как указано ниже. Понятие "происходящая" относится к любой последовательности, которая получена в результате замещений, изменений или модификаций фрагмента межгенного участка BBTVкомпонента каким-либо методом, в том числе мутагенезом. В частности, последовательность ДНКмолекулы может представлять собой вставку рВТ 6.1 межгенного участка BBTV-компонента 6 (фрагмент размером около 623 пар оснований), вставку рВТ 6. 2 (фрагмент размером около 351 пары оснований), вставку рВТ 6.3 (фрагмент размером около 239 пар оснований) и вставку рВТ 6.4 (фрагмент размером около 172 пары оснований) компонента 6; вставку pBT1.1 (фрагмент размером около 214 пар оснований) и(фрагмент размером около 454 пар оснований) компонента 5. ДНК-молекула может представлять собой участок размером 275 пар оснований, включающий CR-M, содержащийся во вставке рВТ 6.1, но не во вставке рВТ 6.2. Участок размером 275 пар оснований может быть регуляторной областью. ДНК-молекула может содержать участок, включающий область CRSL и кодон ATG открытой рамки считывания, или участок, расположенный между областью CRSL и кодоном ATG открытой рамки считывания какого-либо из компонентов 1-6 BBTV. Вставки рВТ 1.1, рВТ 2.1, рВТ 3.1, рВТ 4.1, рВТ 5.1, рВТ 6.1 показаны на рис. 11. На рис. 12 приведена последовательность вставки pBT1.INT. На рис. 13 приведена ДНК-последовательность вставок (а) рВТ 6. 1; (b) рВТ 6. 2; (с) рВТ 6. 3 и (d) pBT6. 4. Ген не BBTV может быть любым подходящим геном, таким как GUS, NPTII, геном устойчивости к инсектициду, гербициду или геном, усиливающим рост. ДНК-молекула может транскрибировать ген в каком-либо подходящем прокариотическом или эукариотическом хозяине. Предпочтительно, чтобы ДНК-молекула транскрибировала ген в клетке однодольного растения, например,клетке Musa spp (банан) и пшеницы. ДНКмолекула способна транскрибировать ген в однодольных растениях, таких как банан и пшеница. Предпочтительно, чтобы ДНК-молекула транскрибировала ген в клетке двудольного растения, например клетке табака и цуккини. ДНК-молекула способна транскрибировать ген 5 в двудольных растениях, таких как табак и цуккини. ДНК-молекула предпочтительно транскрибирует ген в клетках недифференцированной ткани двудольного растения. Кроме того, изобретение относится к способу экспрессии гена не BBTV в клетке растения при использовании ДНК-молекулы, описанной выше. Изобретение также относится к клетке растения, содержащей описанную выше ДНКмолекулу. Изобретение иллюстрируется приведнными ниже примерами, характеризующими предпочтительные варианты его осуществления. Однако примеры не ограничивают объма изобретения. В примере 1 описывается, каким образом были обнаружены и идентифицированы три "новых" компонента BBTV, и основываясь на методике, изложенной в данном примере,специалист сможет выделить указанные компоненты BBTV. Соответствующая информация опубликована Burns et al в Journal of GeneralVirology, 76, 1471-1482, 1995. Экспериментальная часть Пример 1. Компоненты BBTV. Методы Синтез и клонирование кДНК Собирают бананы с характерными симптомами заболевания верхушки грозди бананов из района Намбур Юго-восточного Квинсленда. Частицы BBTV выделяют и очищают, как описано Wu and Su, 1990, Journal of Phytopathology,128, 153-160, и Thomas and Dietzgen, 1991, Journal of General Virology, 72, 217-224. Нуклеиновую кислоту экстрагируют из вирионов, как описано Francki and Randles, 1973, Virology, 54,359-368. Двуцепочечную ДНК синтезируют, как описано Gubler and Hoffman, 1983, Gene, 25,263-269, при использовании выборочных гексамеров (Bresatec) для праймирования синтеза первой цепи. DsДHK обрабатывают нуклеазой золотистой фасоли (Promega) и лигируют в расщеплнный Sma I плазмидный вектор pUC18(Upcroft and Healey, 1987, Gene, 51, 69-75). Затем плазмиду используют для трансформации штамма Escherichia coli JM 109 (Hanahan, 1983,Journal of Molecular Biology, 166, 557-580) и осуществляют отбор возможных рекомбинантных клонов на субстрате с X-gal (Vieria andMessing, 1982, Gene, 19, 259-268). Плазмиды выделяют методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989, Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory). Вставки изолируют путм расщепления плазмид EcoRI/Hind III, электрофорезом в агарозных гелях и капиллярным блоттингом на мембране HybondCold Spring Harbor Laboratory). Вставки для использования в качестве ДНК-проб очищают из(Bresatec). ДНК-пробы метят при использовании специального набора Ready-To-Go (Pharmacia),согласно рекомендациям производителя. Прегибридизацию и гибридизацию осуществляют,как описано Burns et al., 1994, Archives of Virology, 137, 371-380. Секвенирование и анализ последовательностей Мини-препараты ожидаемых клоновBBTV получают методом щелочного лизиса клонов с последующей преципитацией полиэтиленгликолем (Hattori and Sakaki, 1986, Аналитическая биохимия, 152, 232-238). Секвенирование осуществляют с помощью 35SdATP и набора "Секвеназа" (US Biochemicals), как рекомендовано производителем. Продукт реакции подвергают электрофорезу в 8%-ном (вес на объм) полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину. Гели фиксируют, высушивают и экспонируют на рентгеновскую плнку. Праймеры, используемые для секвенирования, представляют собой универсальные секвенирующие праймеры или праймеры из 17-30 нуклеотидов, комплементарные соответствующим участкам клонированной вирусной ДНК, синтезированные с помощью набора Applied Biosystems (ABI) PCRMate и используемые согласно рекомендациям производителя.PCR-продукты для секвенирования очищают из агарозных гелей при использовании набора Gene-Clean (Bresatec). ДНК секвенируют с помощью набора "Секвеназа" (USB), согласно рекомендациям производителя. Денатурацию ДНК-матрицы (500 нг) осуществляют при кипячении с последующим добавлением DMSO и 3 пкМ праймера для секвенирования. Нуклеотидные последовательности анализируют при использовании обеспечения GCG версии 8, полученного из компьютерного центраANGIS в Университете г. Сидней, Австралия. Нуклеотидную и аминокислотную последовательности упорядочивают при использовании программного обеспечения Clustal V на мягких дисках (Higgins et al., 1991, CABIOS, 8, 189191). Четыре базы данных для ДНК (GenBank,GenBank Weekly Updates, EMBL and EMBLweekly updates) и пять баз данных для белковых последовательностейGenPeptides Weekly Updates) анализируют для поиска последовательностей, гомологичных нуклеотидной и выведенной на е основе аминокислотной последовательности BBTV с помощью двух систем аналитического программного обеспечения FASTA (Pearson and Lipman,1988, Proceeding of the National Academy of Sciences, USA, 85, 2444-2448) и BLAST (Altschul etPCR: Анализ и клонирование При использовании соответствующих нуклеотидных последовательностей клонов (I)pBTRP-11, 20, 80 и 88 и (II) pBTRP-Pl и Р 2 и нуклеотидных последовательностей BBTV компонентов 1 (Harding et al., 1993, Journal of General Virology 74 323-328) и 2 синтезируют три набора непосредственно прилегающих внешних удлиняющих праймеров, а именно набор (I): праймер А структуры 5' GCATCCAACGGCCCATA 3'; праймер В структуры 5' CTCCATCGGACGATGGA 3'; набор (II): праймер С: 5' TATTAGTAACAGCAACA 3'; праймер D: 5' CTAACTTCCATGTCTCT 3'; набор (III) праймер Е структуры 5' CGGGa/tTa/cTGATTGt/Ggt 3'; праймер F структуры 5' TACa/tTTTGTCATAGc/tGT 3'. Указанные праймеры используют при осуществлении PCR с ДНК BBTV в качестве матрицы, как описано Burrs et al., 1994, Archivesof Virology 137, 371-380. Амплифицированные продукты клонируют при использовании набора для клонирования ТА (Invitrogen) в плазмидные векторы pCRII или pCR2000, как рекомендовано производителем, или в плазмиду pVC19 с Тучастком и Bluescript (Marchak et al., 1990. Nucleic Acids Research, 19, 1154). Рекомбинантные клоны отбирают при использовании субстрата сX-gal на агаре Луриа-Бертани (LB), содержащем подходящий антибиотик, и плазмиды выделяют методом щелочного лизиса (Sambrook et al.,1989, Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. New York: Cold Spring HarborLaboratory). Клоны с явными вставками полной длины (размером около 1 kb) отбирают для секвенирования. Полярность ssДHK виpионаSsДHK BBTV экстрагируют, подвергают электрофорезу в агарозе и капиллярному блоттингу на двойных найлоновых мембранах(Harding et al., 1993, Journal of General Virology,74, 323-328). В случае компонента 2 используют набор для мочения 3'-концевого участка ДНК(Boehringer Mannheim) с целью получения меченных 32 Р специфических олигонуклеотидных проб для гибридизации (праймер BT2F5.30 (G): 5' GGTCCCCTTTAAGATTCCTTTCTTCGTCGC 3'; праймер BT2R5.30 (Н): 5' CGGAAAATGAATAAGTATGAGGTGAAAGAG 3'). Мембраны прегибридизуют и гибридизуют в течение 12 и 20 ч соответственно в реактивеRapid-hyb (Amersham) при 600 С. Фильтры однократно отмывают 1%-ным SDS, 2xSSC (0,3 МNaCl, 0,03 М цитрат натрия, рН 7,0) при комнатной температуре и затем 2xSSC при 650 С. Высушенные мембраны экспонируют на рентгеновскую плнку при -800 С с помощью усиливающих экранов. Для компонентов 3, 4, 5 и 6 используют специфичные к цепи РНК пробы. РНКтранскрипты полной длины полноразмерныхBBTV-клонов каждого из четырх компонентов синтезируют при использовании набора для транскрипции рибопробы in vitro (Promega), как рекомендовано изготовителем. Результаты Клонирование и секвенирование пяти геномных компонентов Пять новых геномных компонентов BBTV клонируют и секвенируют при использовании двух библиотек: (I) выборочно праймированной библиотеки (II) и PCR-библиотеки.(I) Выборочно праймированная библиотека. Выборочно праймированную библиотеку получают на основе ssДНК BBTV, экстрагированной из очищенных варионов. ВыделеннуюdsДНК обрабатывают нуклеазой золотистой фасоли, лигируют по тупым концам в расщеплнную Sma I плазмиду pUC18 и клонируют в Е. coli JM 109. Указанную библиотеку скринируют 32 Р-меченной ДНК из вирионов BBTV,незараженных бананов и вставки рВТ 338, которая является частью клона ДНК-компонента 1of General Virology, 74, 323-328). ДНК-компонент 2 BBTV Четыре клона, pBTRP-11, 20, 80 и 88, гибридизуют с ДНК вирионов BBTV и друг с другом, но не с ДНК незаражнных бананов и рВТ 338. Вставки указанных клонов секвенируют. PBTRP-20 и 80, содержащие вставки размером 220 п. о., имеют идентичные последовательности; pBTRP-80 имеет вставку размером 188 п. о. и последовательность размером 148 п. о., идентичную pBTRP-20 и 88, и последовательность размером 40 п. о. на одном конце,которая является уникальной. Последовательность размером 115 п. о. вставки pBTRP-11 идентична эквивалентному участку pBTRP-20 и 88. Два непосредственно примыкающих внешних удлиняющих праймера, а именно А и В,конструируют на основе перекрывающейся последовательности четырх клонов таким образом, что указанные праймеры служат затравками для амплификации полноразмерных копийal., 1993, Journal of General Virology, 74, 323328). SsДНК вириона BBTV амплифицируют с помощью PCR при использовании указанных праймеров и ДНК-полимеразы Pfu и полученные продукты клонируют в плазмиду pCR2000. Четыре из полученных клонов секвенируют в обоих направлениях при использовании универсальных прямых и обратных праймеров и специфических праймеров для последовательностей. Три из указанных клонов содержат вставки размером 1060 п. о. и один клон содержит вставку размером 1059 п. о. Четыре клона имеют идентичные последовательности, за исключением девяти единичных нуклеотидных замен,включая одну делецию. Более того, последова 9 тельности исходных четырх кДНК-клонов обнаруживаются в составе четырх PCR-клонов. Консенсусную последовательность данного компонента, называемую ДНК-компонентом 2et al., 1993, Journal of General Virology, 74, 323328); две последовательности значительно отличаются от двух существенных участков гомологии. ДНК-компонент 6 BBTV Два клона из той же самой библиотеки,pBTRP-P1 и Р 2, гибридизуют с меченной ДНК вирионов BBTV, но не с ДНК незаражнных бананов и рВТ 338. Однако вставки указанных клонов, обе размером около 1 kb, расщепляютEcoRV, в то время как ни компонент 1, ни компонент 2, не имеют EcoRV-сайтов. Два клона частично секвенируют при использовании универсальных прямых и обратных праймеров. Последовательности обоих клонов идентичны, но явным образом отличаются от таковых компонентов 1 и 2. Как и в предыдущем эксперименте, конструируют два непосредственно прилегающих внешних удлиняющих праймера, а именно праймеров С и D. SsДНК вирионовBBTV используют в качестве матрицы совместно с указанными праймерами в PCR и полученные продукты клонируют в вектор Bluescript с Т-вставкой. Один полноразмерный клон рВТР 2 А 1 отбирают и секвенируют в обоих направлениях из субклонов, генерированных при расщеплении экзонуклеазой III и применении универсальных прямых и обратных и специфичных по отношению к последовательности праймеров. Последовательность компонента 6 размером 1089 п. о. приведена на фиг.1 е.(II) PCR-библиотека. При сравнении последовательностей компонентов 1 и 2 идентифицируют два гомологичных участка. Первый участок, позднее названный общим участком стержневой петли (CRSL), содержит возможную стержневую/петлевую последовательность, идентифицированную в компоненте 1 (Harding et al., 1993, Journal ofGeneral Virology, 74, 323-328); второй участок,входящий в состав области, позднее обозначаемый как основной общий участок (CR-M), представляет собой последовательность размером около 66 нуклеотидов, расположенную с 5 конца стержневой петлевой последовательности. Предполагается, что все геномные компоненты BBTV должны содержать CR-M, и в соответствии с указанным конструируют и синтезируют два непосредственно прилегающих внешних удлиняющих "вырожденных" праймера, а именно Е и F, на основе указанного участка и проводят реакцию PCR при использованииPCR-продуктов, каждый размером около 1 kb,выявляют с помощью электрофореза в полиак 002180PCRII. Полученные клоны подразделяют на три группы В, С и D, на основе их способности гибридизоваться с вирионной ДНК BBTV, но не с ДНК незараженных бананов. Каждая группа также характеризуется определнной картой рестрикции, отличной от двух других групп и компонентов 1,2 и 6 (Burrs et al., 1994, Archivesof Virology, 137, 371-380). Одна группа, группа А, характеризуется картой рестрикции, неотличимой от таковой компонента 2, и позднее путм секвенирования подтверждается, что клоны группы А соответствуют клонам компонента 2. Каждая группа клонов предположительно соответствует новому и универсальному ДНКкомпоненту BBTV. Из каждой группы клонов три клона (компонент 3) или четыре клона(компоненты 4 и 5) частично секвенируют с помощью универсальных прямых и обратных праймеров. В каждом случае все клоны в пределах группы имеют идентичные последовательности, которые перекрываются за исключением одной иди двух определнных нуклеотидных замен. Более того, последовательности из каждой группы отличаются от последовательностей каждой другой группы и от последовательностей компонентов 1, 2 и 6. Один клон из каждой группы или компонент отбирают и полностью секвенируют в обоих направлениях. Важно отметить, что каждую из указанных групп клонов получают при использовании вырожденных праймеров, перекрывающих последовательность из консервативного участка CR-M компонентов 1 и 2. CR-M из компонентов 1 и 2 консервативен не в полной степени и поэтому ожидается, что гипотетическая CR-M-последовательность у других компонентов иная. Таким образом, конструируют конвергирующие праймеры, уникальные для каждого компонента, и используют их для амплификации последовательности, содержащей CR-M каждого компонента ssДHK вирионов BBTV. ПолученныеPCR-продукты секвенируют непосредственным образом при использовании двух компонентных специфических конвергирующих праймеров. ДНК-компонент 3 BBTV Компонент 3 (Группа С клона рВТР-64) секвенируют в обоих направлениях (первоначальный клон и субклон, полученные при расщеплении эндонуклеазой III, или рестрикционные фрагменты) при использовании универсальных прямых и обратных праймеров и трх специфичных к последовательности праймеров. Конструируют два дополнительных конвергирующих праймера на основе указанной последовательности для амплификации продукта размером 380 п. о., содержащего CR-M. Последовательность указанного продукта идентична таковой рВТР-64, за исключением пяти одиночных нуклеотидных замен, четыре из которых затрагивают последовательность, перекрывающуюся первоначальными вырожденными прай 11 мерами, и одна находится за пределами указанной последовательности и затрагивает нуклеотид 947. Окончательная последовательность компонента 3 размером 1075 п. о. приведена на фиг. 1b. ДНК-компонент 4 BBTV Компонент 4 (Группа D клона рВТР-62) секвенируют в обоих направлениях (первоначальный клон и субклоны, полученные при расщеплении эндонуклеазой III) с помощью универсальных прямых и обратных праймеров и трх специфичных по отношению к последовательности праймеров. Конструируют два дополнительных конвергирующих праймера на основе указанной последовательности для амплификации продукта размером 350 п. о., содержащего CR-M. Последовательность указанного продукта идентична таковой рВТР-62, за исключением двух одиночных нуклеотидных замен в последовательности, перекрывающейся первоначальными вырожденными праймерами. Окончательная последовательность компонента 4 размером 1043 п. о. приведена на фиг. 1 с. ДНК-компонент 5 BBTV Компонент 5 (Группа В клона рВТР-129) секвенируют в обоих направлениях (первоначальный клон и субклоны, полученные при расщеплении экзонуклеазой III) с помощью универсальных прямых и обратных праймеров и трх специфичных к последовательности праймеров. Конструируют два дополнительных конвергирующих праймера на основе указанной последовательности для амплификации продукта размером 290 п. о., содержащего CR-M. Последовательность указанного продукта идентичны таковой рВТР-129, за исключением четырх одиночных нуклеотидных замен в последовательности, перекрывающейся первоначальными вырожденными праймерами. Окончательная последовательность компонента 5 размером 1018 п. о. приведена на фиг. 1d. Ориентация геномных компонентов и взаимосвязь с заболеванием верхушки грозди бананов Авторы изобретения предварительно показали, что геном BBTV представлен одноцепочечнoй ДНК (Harding et al., 1991, Journal of General Virology, 72, 225-230; Harding et al., 1993,Journal of General Virology, 74, 323-328). С целью определения ориентации каждого компонента в вирионах, синтезируют специфичные к цепи ДНК или РНК пробы для каждого компонента и гибридизируют с вирионной ДНКBBTV. Специфичные пробы для компонента 2 представляют собой два 3'-меченных олигонуклеотида (размером 30 нуклеотидов каждый) в то время, как пробы, специфичные для компонентов 3, 4, 5 и 6, были получены на основе РНКтранскриптов, меченных 32P. В случае каждого компонента пробы с последовательностями,комплементарными последовательностям компонентов, приведнных на фиг. 1, строго гибридизуются с ДНК вирионов BBTV, в то время, 002180 12 как пробы с последовательностями, идентичными приведнным на фиг. 1, не гибридизуются с ними (фиг. 2). Это свидетельствует о том, что каждый компонент представлен одноцепочечной ДНК только в одной ориентации, как показано на фиг. 1. Более того, специфичные к цепи ДНК и компоненту BBTV пробы, которые гибридизуются с ssДНК вирионов BBTV, используются в качестве зондов для подтверждения того, что каждый компонент ассоциирован с заболеванием верхушки грозди бананов. Экстракты ДНК из трх (для компонента 2) или четырх (для компонентов 3-6) различных изолятов BBTV и ДНК из четырх здоровых бананов подвергают Саузерн-блоттингу и гибридизуют с каждой пробой. Каждая компонент-специфическая проба гибридизуется с низкомолекулярной ДНК ожидаемого размера во всех экстрактах из BBTVинфицированных бананов, но не гибридизуется с экстрактами здоровых бананов (результаты не приведены). Это свидетельствует о том, что каждый компонент явным образом ассоциирован с заболеванием и вирусом. Анализ геномных компонентов BBTV Последовательности пяти полученных геномных компонентов BBTV и последовательность компонента 1 (Harding et. al., 1993, 2) упорядочивают и сравнивают. Каждая из шести последовательностей отлична от другой, за исключением двух существенных участков, которые обладают различной степенью гомологии у всех шести компонентов. Общий участок стержневой петли Авторы изобретения предварительно идентифицировали возможную структуру стержневой петли компонента 1 BBTV (Harding et al.,1993, Journal of General Virology, 74, 323-328),который имеет петлевую последовательность,практически идентичную инвариантной петлевой последовательности геминивирусов(Lazarowitz, 1992, Critical Reviews in Plant Sciences, 11, 327-349). Эквивалентная стержневая петлевая структура также обнаружена в компонентах 2-6 (фиг. 3). Каждый компонент имеет петлевую структуру из 11 нуклеотидов, из которых 9 последовательных нуклеотидов консервативны у всех компонентов. Каждый компонент имеет также стержневую последовательность размером 10 п. о., из которых 14 нуклеотидов высококонсервативны. Однако при сравнении всех шести компонентов, участок гомологии соответствует 25 нуклеотидам с 5-конца стержневой петлевой структуры и 13 нуклеотидам с 3'-конца стержневой петлевой структуры. 5'концевые 25 нуклеотидов высококонсервативны у компонентов 1, 3, 4 и 5. Обнаружены две явные делеции в обоих компонентах 2 и 6. В компоненте 2 восемь нуклеотидов высококонсервативны по отношению к компонентам 1, 3, 4 и 5,в то время как в компоненте 6 16 нуклеотидов консервативны по отношению к таковым других 13 компонентов. 13 нуклеотидов 3'-конца стержневой петли высококонсервативны у всех шести компонентов, за исключением явной одиночной нуклеотидной делеции в компоненте 2. Последовательность из 69 нуклеотидов, включающая стержневую петлевую последовательность, обозначена как стержневой петлевой консервативный участок или CR-SL. Основной общий участок Второй общий участок локализуется на различных расстояниях с 5-конца CR-SL и его называют основным общим участком или CRМ. Указанный участок варьирует в размерах и состоит из 65 нуклеотидов в компоненте 1 и из 92 нуклеотидов в компоненте 5 (фиг. 4). У компонента 1 явным образом первые 26 нуклеотидов CR-M делетированы и, кроме того, обнаруживается ещ одна нуклеотидная делеция. У компонентов 2, 3 и 4 обнаружены две одиночные нуклеотидные делеции и у компонента 6 одна одиночная нуклеотидная делеция. У всех компонентов 45 нуклеотидов консервативны и 23 из первых 26 делетированных у компонента 1 нуклеотидов консервативны у компонентов 2-6. Кроме того, у компонентов обнаружен практически полный 16-нуклеотидный прямой повтор(ATACAAc/ gACa/gCTATGA) в пределах нуклеотидов 4-20 и 21-36. Далее, 15-нуклеотидная,обогащнная основаниями GC последовательность (около 86% GC), локализована в пределах нуклеотидов 78-92 и на 93% консервативна у всех компонентов. Последовательность между последним нуклеотидом CR-M и первым нуклеотидом CRSL варьирует по длине и содержит от 22 нуклеотидов у компонента 1 и 233 нуклеотида у компонента 2 (фиг. 1 и 5). Интересно, что последовательность из 175 нуклеотидов у компонентов 3 и 4 на 97% консервативна. Возможные ТАТА-боксы. Возможный ТАТА-бокс идентифицирован в компоненте 1BBTV и он расположен на расстоянии 20 нуклеотидов от 3'-конца последнего нуклеотида стержневой петли и 43 нуклеотидов от 5-конца стартового кодона возможного гена репликазы(Harding et al., 1993, Journal of General Virology,74, 323-328). Сходные возможные ТАТА-боксы также идентифицированы в компонентах 2-6. В каждом из указанных компонентов возможный ТАТА-бокс представляет собой последовательность из 9 нуклеотидов, CTATa/ta/tAt/aA, и локализован в положении "downstream" (ниже) по отношению к петлевой стержневой последовательности (фиг. 1). Однако последовательность между последним 3'-нуклеотидом стержневой петлевой последовательности и возможным ТАТА-боксом значительно больше по длине у компонентов 2-6, чем у компонента 1, и варьирует от 157 нуклеотидов у компонентов 5 до 227 нуклеотидов у компонента 4 (фиг. 1 и 5). Анализ возможных сигналов полиаденилирования 14 Идентифицируют шесть возможных сигналов полиаденилирования, которые ассоциированы с 3'-концом основных ORFs компонентов 3-6. Обогащнный основаниями GT участок размером 10-17 нуклеотидов локализован между нуклеотидами 0 и 23 с 3'-конца каждого из указанных сигналов полиаденилирования и каждый обогащнный GT участок содержит тринуклеотидную последовательность TTG (фиг. 4). Только один возможный сигнал полиаденилирования, идентифицированный в компоненте 2, имеет соответствующий обогащнный GT участок с тринуклеотидной последовательностью TTG и он локализован на расстоянии 233 нуклеотидов от 3'-конца девятинуклеотидного возможного ТАТА-бокса в смысловой цепи вирионной ДНК. Выводы Все шесть компонентов имеют два общих участка, CR-SL и CR-M, в возможной межгенной или нетранслируемой области и пять из шести компонентов имеют одну большую ORF в смысловой цепи вирионной ДНК, с которой ассоциированы возможные ТАТА-боксы и сигналы полиаденилирования (фиг. 5). CR-SL включн в консервативную стержневую петлевую структуру. Петлевая последовательность из 11 нуклеотидов консервативна у всех компонентов BBTV, за исключением двух нуклеотидов, и сходна с таковой, обнаруживаемой у девяти геминивирусов (Lazarowitz, 1992, Geminiviruses:(Rohde et al., 1990, Virology, 176, 648-651) и другого компонента BBTV (Yeh et al, 1994, Virology, 198, 645-652). Модель участия петлевой последовательности в репликации посредством механизма "катящегося кольца" была описана у геминивирусов (Saunders et al., 1993, DNA formsof the geminivirus -African cassava mosaic virus consistent with the rolling circle mechanism of replication. IX Международный конгресс по вирусологии, Glasgow, August, 1993. Реферат Р 6018). Возможно, что петлевая последовательность у BBTV имеет сходную функцию. Стержневые петлевые последовательности также высококонсервативны у всех компонентов BBTV и содержат пентануклеотидную последовательность ТАССС, которая, как обнаружено, представляет собой сайт инициации синтеза вирусной цепи ДНК у геминивируса карликовости пшеницы (Heyraud et al., 1993, EMBO Journal,12, 4445-4452). Основной общий участок (CR-M) идентифицирован у всех компонентов и локализован на 3'-конце основной ORF (за исключением компонента 2, где не идентифицирована основная ORF) и 5'-конце CR-SL (фиг. 5). Гексануклеотидные повторы были идентифицированы в пределах CR-M у всех компонентов, за исключением компонента 1. Однако не установлена непосредственная функция указанных повторов,хотя они могут быть связаны с промоторными последовательностями или их частью. CR-MGC последовательность, локализованную на 3'конце, и, возможно, образующую небольшую стержневую петлевую структуру. Указанная обогащнная GC последовательность также включает два прямых GC повтора, которые соответствуют Sp1 связывающим сайтам, обнаруженным в промоторах генов клеток млекопитающих и вирусов (Fenoll et al., 1990, Plant Molecular Biology, 15, 865-877). Показано, что сходный промотор, обнаруженный у геминивируса, инфицирующего однодольную кукурузу(геминивирус полосатости кукурузы), необходим для максимально более правильной транскрипции, а также, по-видимому, связывает ядерные факторы кукурузы некооперативным образом (Fenoll et al., 1990, Plant Molecular Biology, 15, 865-877). Каrаn et al., (1994, Journal of General Virology, 75, 3541-3546) сообщили, что CR-M последовательность компонента 1 высококонсервативна у BBTV-изолятов группы ЮжноТихоокеанского региона (96,5% гомологии) и у изолятов Азиатской группы (98,0% гомологии),но сильно варьирует между двумя группами изолятов (68,0% гомологии). Отмечается 76%ная гомология между CR-M последовательностями шести различных компонентов Австралийского изолята. Таким образом, важно определить уровень гомологии между CR-M последовательностями индивидуальных компонентов различных групп изолятов, чтобы установить,высококонсервативны ли указанные последовательности в группах изолятов, но вириабельны ли в группах и различных компонентах, и имеет ли это какое-либо биологическое значение. Длина и состав последовательности CR-M и CR-SL несхожи у четырх из шести компонентов. Однако у компонентов 3 и 4 указанный участок из 175 нуклеотидов гомологичен на 97% и 334 нуклеотида с 5-конца CR-M до 3'конца CR-SL гомологичны на 98%. Сходный большой общий участок из 300 нуклеотидов обнаружен у геминивирусов и он идентичен у А и В компонентов индивидуальных геминивирусов, существующих в форме двух вирионов(Lazarowitz, 1992, Geminiviruses: genome structure and gene function. 2). У геминивирусов этот участок содержит стержневую область. Участок гомологии также обнаружен у пяти из семи компонентов SCSV, включающих стержневую петлевую область (Surin et al., 1993. The subteranean clover stunt virus genome consists of microchromosomes encoding single ORFs. IX Международный конгресс вирусологии, Glasgow,August, 1993, Реферат P62-1), которая сходна с таковой геминивирусов, но отличается у четырх из шести BBTV-компонентов. Компоненты 3, 4, 5 и 6 имеют одну протяжнную OFR в смысловой цепи ДНК вириона на 3'-конце CR-SL. Каждая из ORFs содержит возможные консервативные ТАТА-боксы и ас 002180 16 социированные с ними сигналы полиаденилирования (фиг. 8). Возможные ТАТА-боксы высококонсервативны и представляют собой девятинуклеотидную последовательность CTATa/ta/tAa/tA, которая в полной мере сходна с описанной Bucher et al. (1990, Journal of Molecular Biology, 212, 563-578). Расстояние между возможным ТАТА-боксом и кодоном инициации трансляции варьирует у каждого компонента от 13 нуклеотидов у компонент 3 до 102 нуклеотидов у компонента 1. Кодон инициации трансляции ATGG идентифицирован у пяти компонентов, кодирующих протяжнные ORFs. Однако два возможных кодона инициации трансляции идентифицированы у компонента 3, первый в положении нуклеотида 213 (ATGT) и второй в положении нуклеотида 227 (ATGG); второй кодон инициации находится в пределах одной рамки считывания с первой. Указанное позволяет предположить, что второй кодон инициации функционирует должным образом, как это подтверждается путм 5'-RACE или N-концевого секвенирования продукта трансляции ORF. Обогащение GT участки были идентифицированы в положении от 0 до 24 нуклеотида на 3'конце каждого сигнала полиаденилирования у компонентов 1, 3, 4, 5 и 6. Каждый из указанных обогащнных GT участков содержит нуклеотидную последовательность TTG. Сигналы полиаденилирования компонентов 3 и 6 содержат указанные последовательности. Комбинация консенсусного сигнала полиаденилированияGT участка, содержащего тринуклеотидную последовательность TTG, ассоциирована только с одной ORF в смысловой цепи ДНК вирионов компонентов 1, 3, 4, 5 и 6 и не идентифицирована где-нибудь ещ в указанных последовательностях. Это позволяет предположить, что каждый из указанных компонентов кодирует определнный ген. Сходные последовательности ассоциированы с различными сигналами полиаденилирования и могут быть необходимы для эффективной терминации (Gil and Proudfoot,1984, Nature, 312, 473-474; Conway and Wickens,1985, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 82, 3949-3953). Пример 2. Модификация экспрессии при использовании межгенных участков BBTV. Материалы и методы Плазмиды Опосредованная агробактериями трансформация Все возможные промоторные последовательности BBTV лигируют в бинарный вектор на основе агробактерий pBI101.3 (Clontech). Указанная плазмида содержит кассету устойчивости к антибиотику, включающую конструкцию "промотор нопалинсинтазы/ген NPTII (ген устойчивости к канамицину)/ терминатор нопалинсинтазы (NOS) и безпромоторный ген глюкуронидазы (GUS) с терминатором NOS".pBI101.3, за исключением того, что содержит промотор CaMV 35S на 5'-конце гена GUS, что обеспечивает экспрессию гена GUS. Бомбардировка микрочастицами Для транзисторного анализа промоторной активности BBTV посредством бомбардировки микрочастицами, кассету "промотор BBTV/GUS/nos" субклонируют в pGEM3zf+ (Promega). В качестве позитивного контроля для большинства экспериментов кассету "промотор CaMV 35S/GUS/nos" сходным образом субклонируют из рВI121 в pGEM3zf+ (pGEM35S-GUS). Большие количества указанных плазмид в высокоочищенной форме получают для бомбардировки при использовании набора Qiagen Plasmid MaxiGUS вводят в различные виды растений и тканевые культуры как методом бомбардировки микрочастицами, так и электропорацией или трансформацией, опосредованной агробактериями (Horsch et al., 1989, In: Plant MolecularHauptmann et al., 1987, Plant Cell Reports, 6, 265270; Last et al., 1991, Theoretical and Applied Genetics, 81, 581-588). Анализ GUS-экспрессии осуществляют практически тем же самым методом, как описано Jefferson, 1987, Plant Molecular Reporter 5 (4): 387-405. Получение промоторных конструкций BBTV Праймеры: ВТ 6.1 (25 нукл.) 5' gcctgcagagttgtgctgtaatgtt 3' ВТ 6.2 (24 нукл.) gcggaatccgcttctgccttccgct ВТ 6.3 (25 нукл.) gccctgcagcatggacgtcagcaagg ВТ 3.1 (24 нукл.) gcctgcagactattgtatggaatg 18 1. Клонирование межгенных участков BBTV Компонент 6 BBTV Компонент 6 полной длины (1089 п. о.) 1. Межгенный участок из BBTV6 клона Р 2 А 1 амплифицируют с помощью PCR при использовании праймеров ВТ 6.1 (+746) и ВТ 6.2(+280). 2. Межгенный участок размером 623 п. о. субклонируют как PstI и BamHI фрагмент вpUC19 (pUC6.1). 3. Межгенный участок клонируют изpBI101.2 (pBT6.1). 4. Фрагмент "промотор BBVV6/GUS/nos" из pBT6.1 субклонируют в pGEM3zf + как HindIII и EcoRI фрагмент (pGEM6.1-GUS). Конструирование рВТ 6.2 с 5'-делециями межгенного участка BBTV6 Конструирование рВТ 6.2. 1. 5'-Делецию размером 272 п. о. в межгенном участке BBTV6 генерируют путм расщепления pUC6.1 эндонуклеазой AccI, сайт рестрикции которой локализован в положении+1018 в кольцевой ДНК компонента 6. Сайт рестрикции PstI локализован в 5'-области сайта множественного клонирования pUC19. 2. Концы заполняют с помощью фрагмента Клнова и снова лигируют с получениемBamHI фрагмент. 4. Кассету "промотор BBTV6 (351 п. о.)/GUS/nos" субклонируют из pBT6.2 как HindIII и EcoRI фрагмент в pGEM3zf+ (pGEM6.2GUS). Конструирование рВТ 6.3. 1. 5'-делецию размером 384 п. о. межгенного участка BBTV6 генерируют путм PCRамплификации из клона Р 2 А 1 BBTV6 при использовании праймеров ВТ 6.3 (+41) и ВТ 6.2(+280). 2. Межгенный участок размером 239 п. о. клонируют как PstI и BamHI фрагмент в pUC19(рUС 6.3). 3. Межгенный участок клонируют изpBI101.3 (рВТ 6.3). 4. Кассету "промотор BBTV6 (239 п. о.)/GUS/nos" субклонируют из рВТ 6.3 как HindIII и EcoRI фрагмент в pGEM3zf+ (pGEM6.3GUS). Конструирование рВТ 6.4. 1. 5'-делецию размером 451 п. о. в межгенном участке BBTV6 генерируют расщеплениемBBTV6). 2. Концы заполняют с помощью фрагмент Клнова и фрагмент с тупыми концамиo.)/GUS/nos" субклонируют из рВТ 6.4 как HindIII и EcoRI фрагмент в pGEM3zf+ (pGEM6.4GUS). Компонент 1 BBTV Компонент 1 полной длины (1111 п. о.) 1. Фрагмент размером 225 п. о., содержащий межгенный участок BBTV1, амплифицируют с помощью PCR из клона полной длины при использовании праймеров BT1R1.17 (+986) и BT1F4.30 (+129). 2. Полученный PCR-продукг расщепляют+118 в кольцевой ДНК BBTV1). 3. Полученный фрагмент размером 214 п. о. достраивают до тупых концов с помощью фрагмента Клнова и клонируют в SmaI-сайтRACE. Указанная ORF локализована в положении +430 +555. На основе локализации даннойOFR выделяют другой межгенный промоторBBTV-1. 1. Протяжнный межгенный участок, основанный на идентифицированной в BBTV-1 меньшего размера OFR, амплифицируют с помощью PCR из полноразмерного клона BBTV-1 при использовании праймеров BT1.INT.R28(+429) и BT1.INT.F25 (+560). 2. Полученный межгенный участок размером 980 п. о. клонируют в пoлoжeнии upstremBBTV2 полной длины, клонированную в pUC19 как XbaI фрагмент в положении +361 (pUCBT2), получают от фирмы Raktham Wanitchakorr. 1. Межгенный участок размером 855 п. о. генерируют из pUC-BT2 расщеплением XbaI и АссI (сайт рестрикции локализован в положении+565 в кольцевой ДНК компонента 2). AccIконец затупляют с помощью фрагмента Клнова, а XbaI-сайт остатся липким. 2. Полноразмерный межгенный участок непосредственно клонируют в сходным образом полученный pGEM3zf+(pGEM2.1). 3. Межгенный участок клонируют из 20 Компонент 3 BBTV Полноразмерный компонент 3 (1075 п. о.) 1. Полноразмерный межгенный участок компонента 3 амплифицируют с помощью PCR из экстракта нуклеиновой кислоты инфицированных BBTV бананов (QId) при использовании праймеров ВТ 3.1 (+761) и ВТ 3.2 (+212). 2. Межгенный участок paзмером 526 п. o. субклонируют как PstI-BamHI фрагмент вpGEM3zf+(pGEM3.1). 3. Межгенный участок клонируют изo.)/GUS/nos" субклонируют из рВТ 3.1 какpGEM3zf+(pGEM3.1-GUS). Компонент 4 BBTV Полноразмерный компонент 4 (1043 п. о.) 1. Полноразмерный межгенный участок компонента 4 амплифицируют с помощью PCR из экстракта нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоты инфицировании BBTV бананов (QId) при использовании праймеров ВТ 4.1 (+278). 2. Meжгeнный yчacтoк размером 659 п. о. субклонируют как XbaI и BamHI фрагмент вpGEM3zf+(pGEM4.1). 3. Межгенный участок клонируют изo.)/GUS/nos" субклонируют из рВТ 4.1 как Xbal и EcoRI фрагмент в pGEM3zf+(pGEM4.1-GUS). Компонент 5 BBTV Полноразмерный компонент 5 (1018 п. о.) 1. Межгенный участок компонента 5 амплифицируют с помощью PCR из экстракта нуклеиновой кислоты больных бананов (QId) при использовании праймеров BT129V3.17BamHI и AccI (сайт рестрикции локализован в положении +794 в кольцевой ДНК комплекта 5).AccI-сайт достраивают до тупых концов с помощью фрагмента Клнова, а ВаmHI-конец остатся липким. 3. Полученный межгенный участок размером 454 п. о. непосредственным образом субклонируют в сходным образом сконструированный pGEM3zf+(pGEM5.1). 4. Межгенный участок клонируют из 21 2. Транзиторный анализ промоторной активности BBTV посредством бомбордировки микрочастицами клеточной линии Nicotianatabacum (NT) Получение суспензии клеток NT 1. 25 мл суспензии клеток NT субкультивируют в 75 мл свежей среды NT и перемешивают при 280 С и умеренном освещении. 2. Через два дня после субкультивирования 50 мл активно растущей культуры NT переносят в фальконовскую пробирку объмом 50 мл и оставляют для осаждения на 5-10 мин. 3. Полученные в результате осаждения клетки NT ресуспендируют в эквивалентном количестве жидкой среды NT. 4. 200-мкл аликвоты клеточной смеси NT наносят пятнами на тврдую среду NT и оставляют для высыхания на воздухе в течение 3-4 ч. 5. NT-пятна инкубируют при 280 С при умеренном освещении в течение 2 дней. 6. NT-пятна подвергают бомбардировке микрочастицами, как описано ниже, из расчта пять пятен NT на промоторную конструкцию. 7. После бомбардировки NT-пятна инкубируют при 280 С и умеренном освещении в течение 3 дней. 8. Промоторную активность анализируют путм GUS-окрашивания одного NT-пятна на промоторную конструкцию с помощью субстрата Х-глюкуронида. Оставшиеся четыре NTпятна подвергают количественному GUSфлуорометрическому анализу при использовании субстрата MUG. Указанные методики осуществляют, в основном, как описано Jefferson,1987, Plant Molecular Reporter 5(4): 387-405. Получение суспензии меченной золотом ДНК для бомбардировки микрочастицами 1. Суспензию частиц золота быстро перемешивают и обрабатывают ультразвуком в ледяной воде в течение 30 с. 2. Суспензию меченной золотом ДНК получают на льду добавлением 2 мкг ДНК, 25 мкл СаСl2x2H2 О (2,5 М) и 5 мкл спермидина, свободного от оснований (0,1 М), к 25 мкл суспензии частиц золота (100 мг/мл). 3. Суспензию меченной золотом ДНК перемешивают с перерывами в течение 5 мин, а затем оставляют для осаждения на льду в течение 10 мин. 4. Супернатант в количестве 22 мкл собирают и выливают. Оставшуюся суспензию перемешивают и для бомбардировки микрочастицами используют 5-мл аликвоту. 5. Один препарат золота используют в расчте на промоторную конструкцию. Этой суспензии меченной золотом ДНК достаточно для бомбардировки пяти NT-пятен. Условия бомбардировки проточными частицами при использовании генного ружья Вакуум при 25 мм ртутного столба. Давление гелия около 550 КПа. Высота платформы 10 см. Сетка для защиты мишени. 22 Используемые конструкции Тестируемые конструкции: pGEM6.1-GUS,pGEM6.2-GUS, pGEM6.3-GUS, pGEM6.4-GUS,PGEM1.1-GUS, pGEM2.1-GUS, pGEM3.1-GUS,pGEM4.1-GUS, pGEM5.1-GUS. Контроли: pGEM35S-GUS Результаты: результаты приведены на чертежах. Сравнение промоторной активности BBTV6 1. Межгенный участок полной длины компонента 6 BBTV обладает промоторной активностью, сравнимой с таковой промотораCaMV35S размером 800 п. о. из рВI121. 2. 5'-Делеция размером 272 п. о. (pGEM6.2GUS) вызывает существенное увеличение промоторной активности, которая поддерживается другой 5'-делецией размером 112 п. о.(pGEM6.3-GUS). 3. Промоторная активность существенным образом редуцирована другой 5'-делецией размером 75 п. о. (pGEM6.4-GUS). Значение результатов Увеличение промоторной активности, наблюдаемое у плазмид pGEM6.1-GUS иpGEM6.2-GUS обеспечивается участком размером 272 п. о., окружающим CR-M, который может содержать возможную последовательность снижающей регуляции, ответственную за уменьшение промоторной активности. Уровни промоторной активности, наблюдаемые у плазмид pGEM6.2-GUS, pGEM6.3-GUS и pGEM6.4GUS, указывают на то, что большая часть сильной промоторной активности, ассоциированной с межгенным участком BBTV6, связана с участком размером 112 п. о., расположенным на 3'конце CR-S/L. Важно, что этот участок содержит возможную промоторную структуру TGA1b (положение +44), включающую коровую последовательность TGACGT, аналогично другим промоторным структурам и связывающим доменам транскрипционного фактора. Сравнение промотоpов BBTV1-6 1. Промотор BBTV-1 не обладает активностью при транзиторной трансформации суспензии NT-клеток. 2. Промотор BBTV-2 обладает наивысшей промоторной активностью среди шести BBTVкомпонентов. Уровень его активности в 2-3 раза превышает таковой промотора CaMV 35S размером 800 п. о., полученного из рВI121. 3. Промоторы BBTV-3, -4 и -5 относительно слабоактивны. Уровень активности примерно на 50% ниже по сравнению с промотором CaMV 35S. 4. Межгенный участок полной длиныBBTV-6 обладает сходным уровнем промоторной активности, что и промотор CaMV 35S. Значение результатов Отсутствие промоторной активности, ассоциированной с межгенным участком BBTV-1 может указывать на то, что данный промотор обладает в значительной степени тканеспеци 23 фическим характером экспрессии или нуждается в транскрипционных факторах, отсутствующих в ядре клеток табака. Идентификация возможной структуры промотора (элемент типа 1 гена гистона Н 3 пшеницы), ассоциированного с клеточной экспрессией, специфичной для Sфазы, может показать, что активность промотора ограничена интенсивно делящимися меристематическими тканями. Значительные уровни промоторной активности, ассоциированные с межгенным участкомBBTV-2, могут обусловить использование указанной последовательности в качестве возможного промотора для обеспечения высокого уровня экспрессии. Несмотря на тот факт, чтоBBTV инфицирует однодольные растения, результаты приведнных иccлeдoвaний позволяют предположить, что промоторы BBTV2-6 в различной степени активны в клетках двудольных растений. 3. Транзиторный анализ промоторной активности BBTV в растениях других видов Бомбардировка микрочастицами клеток огурца 1. Пре-эмбриогенный каллус огурца субкультивируют на среде SQM2EV в течение двух недель до трансформации с помощью бомбардировки микрочастицами. 2. Каллус переносят на небольшие чашки со средой SQM2EV за 4 дня до трансформации с помощью бомбардировки микрочастицами. 3. Бомбардировку микрочастицами осуществляют, как описано выше. 4. GUS-активность выявляют в трансформированном каллусе с помощью GUSокрашивания при использовании Хглюкуронидного субстрата (через 2 дня после бомбардировки). Используемые конструкции рВТ 6.1,рВТ 6.3, pBT1.1, pBTI121. Результаты 1. Плазмиды рВТ 6.1 и рВТ 6.3 обнаруживают небольшое число синих фокусов (явление трансформации), как и рВI121 после GUSокрашивания. 2. Плазмида pBT1.1 не обнаруживает промоторной активности в каллусе огурца (т.е. не обнаруживается синих фокусов трансформации). Электропорация протопластов цуккини Выделение протопластов цуккини. 1. Суспензию эмбриогенного каллуса цуккини объмом 1,5 мл смешивают с 20 мл смеси фермента (Е 3) и инкубируют при 250 С в темноте на медленном шейкере (30-50 об/мин) в течение 5-6 ч. 2. Протопласты выделяют путм фильтрования через сито с диаметром ячеек 450 мкм,105 мкм и 51 мкм и центрифугирования при 4050 g в течение 5 мин. 24 3. Протопласты один раз отмывают раствором PWS и ресуспендируют в известном объме TBS. 4. Число клеток оценивают с помощью откалиброванного счтного стекла и доводят объм до содержания протопластов, равного 1106 клеток/мл. 5. 10 мкг плазмидной ДНК добавляют к 1 мл протопластов и инкубируют на льду в течение 10 мин. Электропорация протопластов цуккини. 1. Протопласты: смесь ДНК подвергают электропорации в кювете BioRad (электродный просвет 0,4 см) с 10 мкг плазмидной ДНК с помощью прибора для электропорации Gene Pulsar(BioRad) (3 импульса при 300 Вольт, продолжительность импульса 10 миллисекунд, интервал между импульсами 100 миллисекунд). 2. Протопласты инкубируют в течение 10 мин на льду и осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в микроцентрифуге. 3. Протопласты отмывают один раз в культуральной среде 415 А и ресуспендируют в 1 мл 415 А. 4. Протопласты переносят в 12-луночный планшет для микротитрования и инкубируют в течение 48 ч на медленном шейкере в темноте. 5. После инкубирования протопласты собирают центрифугированием и исследуют наGUS-активность. Флуорометрический GUS-анализ. 1. 5 мкг экстрагированного из протопластов белка используют для стандартного флуорометрического анализа (реагент исследования белка BioRed). 2. Объм доводят до 100 мкл буфером для экстрации белка и инкубируют при добавлении 100 мкл MUG-субстрата (2 мМ) при 370 С в течение 30 мин. 3. Реакции останавливают добавлением 1 мл Na2CО 3. 4. Энзиматическую активность оценивают против 4-MU стандартной кривой (0-500 нМ) при использовании флуорометрического спектрофотометра (возбуждение - 365 нм; эмиссия 455 нм; время интеграции - 10). 25 Уровни GUS-акгивности, обусловленные фрагментом межгенного участка BBTV6(рВТ 6.3) размером 239 п. о., в 2 раза выше по сравнению с уровнем активности промотора 35SCaMV (pBI121), имеющего размер 800 п. о. Не обнаруживается GUS-активность или она обнаруживается на небольшом уровне у промотора BBTV1 (pBT1.1). Бомбардировка микрочастицами клеточной суспензии пшеницы 1. Суспензию клеток пшеницы субкультивируют в 50 мл среды WTL1 в течение 4 дней перед бомбардировкой микрочастицами. 2. Клетки пшеницы осаждают низкоскоростным центрифугированием и ресуспендируют в 10 мл среды WTL1. 3. Клетки переносят на стерильную фильтрованную бумагу непосредственно перед бомбардировкой. 4. Бомбардировку микрочастицами осуществляют, как описано ранее. 5. Через 2 дня после бомбардировки трансформированную суспензию клеток пшеницы подвергают GUS-окрашиванию при использовании Х-глюкуронидного субстрата. Используемые конструкции:pBT1.1,рВТ 2.1, рВТ 3.1, рВТ 4.1, рВТ 5.1, рВТ 6.1, pBI121,DM8052 (актин риса усиливает экспрессию,направляемую GUS-промотором). Результаты 1. Актин риса усиливает промоторную активность; 5000 синих фокусов на процедуру трансформации. 2. PBI121 образует в среднем примерно 70 синих фокусов на процедуру трансформации. 3. Изо всех тестированных промоторных конструкций BBTV только рВТ 2.1 обнаруживает активность, генерируя примерно 100 синих фокусов на процедуру трансформации. Бомбардировка микрочастицами эмбриогенного каллуса мужского цветка банана 1. Эмбриогенную культуру банана Кавендиша культивара "Вильямс" получают при использовании мужских цветков, как описано Escalant et al., 1994, InVitro Cellular and Developmental Biology 30 Р: 181-186. Культуру поддерживают в иммерсионной системе в жидкой среде МР (Escalant et al., 1994, InVitro Cellular andDevelopmental Biology 30P: 181-186). 2. За пять дней до бомбардировки микрочастицами эмбриогенный каллус переносят на тврдую среду МР. 3. Ткань подвергают бомбардировке микрочастицами, как описано ранее. 4. Транзисторную GUS-активность визуализируют GUS-окрашиванием при использовании Х-глюкуронидного субстрата через 2 дня после бомбардировки. Используемые конструкции:pGEM-Ubi, (убиквитиновый промотор кукурузы обеспечивает GUS-экспрессию). Результаты 1. Убиквитиновый промотор кукурузы обеспечивает высокий уровень экспрессии GUS в указанном типе ткани с интенсивным синим окрашиванием фокусов трансформации (точное количество фокусов определить не удатся из-за их большого числа и интенсивности окраски). 2. Среди тестированных промоторных конструкций все промоторы обнаруживают низкий уровень активности (10 синих фокусов на процедуру трансформации). В зависимости от проявляемой активности, определяемой по числу фокусов трансформации, плазмиды располагают в следующем порядке: GEM2.1-GUS (наивысший уровень активности), pGEM4.1-GUS,pGEM3.1-GUS и pGEM5.1-GUS (наиболее низкий уровень активности). Значение результатов Результаты исследования транзиторной промоторной активности BBTV у альтернативных видов растений показывают, что промоторBBTV6 (в особенности фрагмент размером 239 п. о., рВТ 6.3) по-видимому, активен в недифференцированных тканях тыквенных (двудольных). Результаты бомбардировки суспензии клеток пшеницы показывают, что только промоторBBTV2 обладает значительной активностью. Это свидетельствует о том, что, по крайней мере, один из BBTV-промоторов в определнной степени активен в однодольных растениях, семейства злаковых. Исследования транзиторной экспрессии при использовании эмбриогенной культуры банана обнаруживают, что промоторы BBTV, тестируемые на сегодняшний момент времени, обладают некоторым уровнем активности в растениях-хозяевах. И опять же, самым сильным из тестируемых промоторов BBTV является компонент 2 BBTV, что позволяет рассматривать его как важный промотор, который будет использоваться в дальнейшем. 4. Стабильная трансформация суспензии клеток NT путем инфицирования агробактериями 1. За два-три дня трансформации 5 мл культуры LB, содержащей 100 мкг/мл канамицина, инокулируют необходимым трансформированным штаммам агробактерий из 40%-ного глицеринового исходного концентрата. 2. Клетки NT используют на 5-7-ой день после субкультивирования (4 мл культуры используют для одной трансформации, 4 мл культуры без бактерий служат контролем). Примечание: для каждой конструкции используют два эксперимента по трансформации. 3. В расчте на 1 мл клеток NT добавляют 1 мкл ацетосирингона (20 мМ в этаноле). 27 4. С помощью 5 мл-пипетки клетки NT перемешивают около 20 раз для индукции повреждений и усиления трансформации. 5. 100 мкл культуры агробактерий (плотность роста) добавляют в планшет для микротитрования, содержащий 4 мл обработанных клеток NT, и интенсивно перемешивают. 6. Планшеты инкубируют в течение 3 дней при 280 С при умеренном освещении. 7. После инкубирования 10 мл жидкой среды NT, содержащей 500 мкг/мл карбенициллина (NTC) добавляют в каждую лунку. 8. Клетки центрифугируют при 1000 об/мин в течении 4 мин в 50-мл фальконовских пробирках с доведением объма с помощьюNTC. 9. Отмывание повторяют два раза. 10. Клетки ресуспендируют в 5 мл NTC и 2 мл помещают на тврдую среду NTKC двух видов (100 мкг/мл канамицина, 500 мкг/мл карбенициллина). Планшеты инкубируют при 280 С при умеренном освещении. 11. Через 3-4 недели после инфицирования трансформанты субкультивируют по отдельности и поддерживают в селективных условиях в течение двух недель. 12. Промоторную активность определяют путм GUS-окрашивания при использовании Хглюкуронидного субстрата. Используемые конструкции: рВТ 6.1 (3 линии NT), рВТ 6.2 (3 линии NT), рВТ 6.3 (2 линииNT), рВТ 2.1 (25 линий NT). Результаты 1. Определяют сильную активность в стабильно трансформированном каллусе NT с промоторными конструкциями BBTV. 2. Некоторые различия в экспрессии между различными линиями трансформированных ВТ 2.1 клеток NT скорее всего обусловлены позиционным эффектом (локализацией интегрированной ДНК в геноме хозяина) и количеством интегрированных копий. Значение результатов Указанные эксперименты показывают, что промоторы BBTV6 и BBTV2 высоко активны в стабильно трансформированных недифференцированных клетках табака. Эти результаты согласуются с таковыми, полученными при бомбардировке микрочастицами, когда промоторы обнаруживают сильную транзиторную активность. Более того, приведнные результаты подтверждают, что активность указанных промоторов не определяется в значительной степени стабильной интеграцией в геном хозяина. 5. Стабильная трансформация табака путем опосредованного агробактериями инфицирования листовых дисков 1. Путм электропорации в штамм агробактерий LBA4404 вводят промоторные бинарные конструкции. 28 2. Трансформированные агробакгерий выращивают на селективной среде с канамицином(100 мкг/мл) и подтверждают наличие в них промоторной конструкции посредством модифицированной процедуры щелочного лизиса. 3. За два-три дня до трансформации 5 мл культуры трансформированных агробакгерий в среде LB инициируют из единичной колонии или 40%-ного глицеринового исходного концентрата и перемешивают при 280 С. 4. Культуру разводят в соотношении 1:20 средой LB и переносят в стерильный флакон объмом 10 мл. 5. Удаляют листья у 3-6 недельного растения табака (Nicotiana xanthii) и разрезают на кусочки размером 1 см x 1 см. 6. Нарезанные кусочки переносят в разбавленную культуру агробактерий и оставляют погружнными на 10-15 мин. 7. Затем кусочки высушивают на стерильной фильтрованной бумаге, помещают верхней(адаксиальной) стороной на среду MS 104 и инкубируют при 280 С до тех пор, пока не будет виден слабый рост бактерий (2-3 дня). 8. Кусочки листьев переносят на селективную среду MS 104 (100 мкг/мл канамицина, 200 мкг/мл тиментина) и инкубируют при умеренном освещении при 280 С. 9. Примерно через 2 недели на инфицированной стороне становится виден каллус корончатых галлов. Ещ через 2-5 недель появляются ростки. 10. Когда стебли становятся хорошо видимыми, ростки отрезают и помещают на среду ускорения MS (100 мкг/мл канамицина и 200 мкг/мл тиментина). 11. Активно развивающиеся растеньица (с корневой системой) поддерживают в культуре в условиях селекции и возможные трансформанты подвергают GUS-окрашиванию при использовании Х-глюкуронидного субстрата. 12. В целом, для каждой промоторной конструкции получают 6-12 возможных трансформантов. Используемые конструкции Тестируемые конструкции: рВТ 6.1,рВТ 6.2, рВТ 6.3, рВТ 6.4, рВТ 2.1, рВТ 2.2,рВТ 2.3, рВТ 2.4, pBT1.1, рВТ 3.1, рВТ 4.1,рВТ 5.1. Контроли: рВТ 121. Результаты 1. Выявляют сильную конститутивнуюBBTV. У оставшихся 90% трансформантов не выявляется GUS-экспрессия в листьях и корнях. Значение результатов Результаты,полученные приGUSокрашивании тканей большинства растений та 29 бака (90%), стабильно трансформированных промоторными конструкциями BBTV, показывают, что указанные промоторы обладают слабой активностью в целых растениях или дифференцированных тканях. То обстоятельство, что некоторые межгенные участки BBTV (компоненты 2 и 6) обнаруживают высокие уровни экспрессии в транзиторных системах (бомбардировка клеточной линии Nicotiana tabacum микрочастицами), указывает на то, что активность указанных промоторов может быть ограничена недифференцированными типами клеток, или на молчание таких промоторов при переходе от недифференцированного каллуса к дифференцированным типам клеток. Это предположение поддерживается дальнейшими экспериментами, в которых каллус регенерированный из листьев стабильно трансформированных растений табака (не обнаруживающих GUSактивности) при окрашивании обнаруживает различные уровни GUS-экспрессии. Преимущество такого уникального характера экспрессии может заключаться в обеспечении селективной устойчивости, поскольку большинство трансформационных систем на основе растений базируется на строгой селекции трансформированной ткани во время стадии недифференцированных клеток. Таким образом,кассета трансформации, содержащая BBTVпромотор (компонент 2 и 6), направляющая экспрессию NPTII, должна обеспечивать сильную устойчивость к канамицину в трансформированной ткани во время ранних стадий трансформации растения (фаза каллуса), но когда клетки становятся дифференцированными (т.е. образуются ростки, листья и т.д.) промотор должен выключаться. Поскольку экспрессия генов селективной устойчивости к антибиотику и гербицидам в трансгенных растениях составляет основную проблему в некоторых странах,использование такого промотора может иметь большие преимущества. 6. Анализ промотора BBTV, направляющего экспрессию NPTII, обусловленную конструкцией BBTV6-NPTII 1. Фрагмент размером 239 п. о. межгенного участка компонента 6 ВВТV из pUC6.3 клонируют в положении upstream ("выше") по отношению к гену NPTII размером 800 п. о. с терминатором CaMV 35S как BamHI и PstI фрагмент. 2. Полученную кассету "промотор BBTV6(239 п. о.)/NРТII/терминатор CaMV 35S" субклонируют как SacI и XbaI фрагмент между левой и правой границами Т-ДНК агробактерий в бинарный вектор рТАВ 5. 3. Кассету "промотор CaMV 35S/(530 п.("ниже") как EcoRI-фрагмент (см. фиг. 14). 4. Полученный вектор рВТ 6.3-NPT, детально описанный ниже, впоследствии исполь 002180 30 зуют для опосредованной агробактериями трансформации табака (как описано ранее). Анализ трансформантов 1. Восемь, возможных трансформантов получают после опосредованной агробактериями трансформации табака (Nicotiana xanthii) конструкцией рВТ 6.3-NPT. Указанные восемь растений отбирают на среде, содержащей канамицин в концентрации 100 мкг/мл. 2. Уровни NPTII-экспрессии у указанных растений оценивают с помощью количественного теста NTPII-ELISA (5 праймирование 3 праймирование), согласно рекомендациям изготовителя. Сравнение проводят между тканями различных типов (листья и корни) и между промоторами (CaMV 35S промотор и промотор нопалинсинтазы). Результаты Результаты экспериментов приведены на чертежах. 1 Высокие уровни экспрессии NPTII обнаруживают в листьях и корнях растений, содержащих промотор CaMV 35S, направляющей экспрессию NPTII. 2 В целом, уровни NPTII у восьми растений, экспрессирующих NPT под контролем промотора BBTV6, значительно ниже по сравнению с таковыми при использовании промотора CaMV 35S. Уровни экспрессии NPTII в листьях не превышают 6 нг NPTII/мг белка. Уровни экспрессии в корнях немного выше, но не превышают 12 нг NPTII/мг белка. Указанные величины экспрессии сравнимы с таковыми,обеспечиваемыми промотором nos. Значение результатов Указанные эксперименты показывают, что фрагмент межгенного участка BBTV6 размером 239 п. о. способен обеспечивать селективную устойчивость стабильно трансформированных растений табака. Как предсказано, уровни экспрессии NPTII у стабильно трансформированных растений (листья и корни) были очень низкими, но сравнимыми с таковыми, обеспечиваемыми промотором нопалинсинтазы. 7. Регуляторные элементы межгенных участков BBTV- обнаружен в BBTV-компонентах и локализован в положении upstream ("выше") по отношению к стартовому кодону транскрипции,- содержит консервативную последовательность из 9 нуклеотидов CTATa/ta/tAa/tA,- отвечает за правильную инициацию транскрипции.- содержит консенсусную последовательность TGACGTAA,- as-1-связывающая структура, вовлечнная в регуляцию транскрипции.(III) TGA1-b структура гексамерная связывающая структура с консенсусной последовательностью TGACGT.(IV) Промоторный элемент типа 1 гена гистона Н 3 пшеницы (гексамерная структура)- консенсусная последовательность ACGTAA,- расположен сразу же в положении 3' по отношению к CR-S/L во всех компонентахBBTV,- гексамерная структура, связывающая родственные TAF-1 и НВР-1 белки,- связан с экспрессией, специфичной для Sфазы клеточного цикла. Предполагается (Nakayama et al., 1992, FEBS Letters, 300: 167-170),что промоторная активность ограничена недифференцированными активно делящимися клетками.CCACG,- связывающий фактор неизвестен,- обнаружен во всех межгенных участкахBBTV (в вирионах или смысловой цепи).CGTGG,- связывающий фактор неизвестен,- обнаружен во всех межгенных участкахBBTV (в вирионах или смысловой цепи). 8. Среды и растворы для культивирования тканей растений Среда М 80NT жидкая среда карбенициллин, 500 мкг/мл Среда для селекции MSNT тврдая среда канамицин, 100 мкг/мл карбенициллин,500 мкг/мл Среда для укоренения MS 32 Соли MS Мио-инозитол, 1 мг/мл сахароза, 3% ТС-агар, 0,7% 2,4-D, 10 мкМ ВАР 1,5 мкМ Жидкая среда NT Соли MS сахароза, 3%L-глицин, 10 мкг/мл жидкость кокосового ореха Gibco, 2%MES 639,6 мг маннитол 109,3 г рН 5,6 Смесь ферментов (Е 3) 2,0% целлюлаза (R-10) 0,5% мацерозим (R-10) 0,5% гемицеллюлаза 1,0% пектолаза (Y23) 0,5% BSA Объм доводят с помощью PWS (рН 5.6) Раствор TBS (200 мл) тризма-основание 0,73 г хлорид натрия 1,75 г хлорид кальция 0,18 г маннитол 9,2 г рН 9,0 9. Значение CR-М Получают упорядоченные последовательности CR-M компонентов 1-6 BBTV. Повидимому, данный участок действует как возможный сайт связывания праймера и принимает участие в репликации BBTV. Несмотря на то,что CR-M BBTV содержит два прямых GCповтора, которые напоминает Sp1-связывающей сайты, обнаруженные в промоторах генов животных и вирусов (например вируса полосатости кукурузы), по-видимому, данный участок не обладает способностью усиливать активность промотора. Указанная гипотеза поддерживается 5'-делеционным анализом межгенного участкаBBTV6, который показывает, что удаление области размером 272 п. о., включающей CR-M,приводит к значительному увеличению промоторной активности. Более того, предваритель 33 ные исследования при использовании межгенного участка BBTV2 показывают, что не происходит уменьшения промоторной активности при удалении CR-M. 10. Заключение Авторы изобретения показали, что межгенные участки ДНК-последовательностей компонентов 1-6 BBTV обладают промоторной активностью и данная активность варьирует от одного межгенного участка к другому. При использовании транзиторных и стабильных систем экспрессии авторы продемонстрировали, что промоторы BBTV, по-видимому, обнаруживают тканеспецифичный характер экспрессии, который может быть аналогичен способу репликации и аккумуляции BBTV в его природном хозяине. Более того, авторы идентифицировали возможные регуляторные элементы, по крайней мере, в одном из промоторов BBTV (компонент 6), которые, по-видимому, влияют на экспрессию репортрного гена.BBTV - это вирус, который инфицирует однодольные растения рода Musa. Поэтому можно ожидать, что промоторы BBTV обнаруживают наиболее сильную активность при заражении банановых деревьев и других однодольных растений. Исследования транзиторной экспрессии при использовании суспензий клеток пшеницы и эмбриогенного каллуса бананов показали, что некоторые промоторы BBTV в определнной степени активны в таких системах. Важно, что два из промоторов BBTV(BBTV 2 и 6) обеспечивают высокий уровень транзиторной экспрессии в недифференцированных тканях двудольных растений (табак,огурец и цуккини). Описание иллюстраций На фиг. 1(а), (b), (с), (d) и (е) приведены соответственно нуклеотидные последовательности ДНК-компонентов 2, 3, 4, 5 и 6 и выведенные аминокислотные последовательности главной ORF указанных компонентов. Возможные ТАТА-боксы набраны жирным шрифтом и подчркнуты двойной линией, стержневые петлевые структуры набраны курсивом и подчркнуты, при этом стержневые последовательности отмечены стрелками; возможные сигналы полиаденилирования набраны жирным шрифтом и подчркнуты; CR-SL подчркнуты; CR-M набраны жирным курсивом; ORF набраны жирным шрифтом. На фиг. 2 приведены результаты определения ориентации смысловой цепи ДНКкомпонентов 2-6 в вирионах BBTV. Каждый блот по отдельной обрабатывают пробой, представляющей собой 32 Р-меченный олигонуклеотид (в случае компонента 2) или полноразмерный РНК-транскрипт (в случае компонентов 36), специфичный по отношению к смысловой или комплементарной цепям каждого компонента вирионов BBTV. Панель (а): блоты гиб 002180 34 ридизуют с пробами, комплементарными к последовательностям компонентов, приведнных на фиг. 1. Панель (b): блоты гибридизуют с пробами, имеющими последовательности, приведнные на фиг. 1. Линия 1: полноразмерный клон каждого соответствующего компонента; линия 2: нуклеиновая кислота здорового банана; линия 3: ДНК, экстрагированная из очищенных вирионов BBTV. На фиг. 3. приведены упорядоченные стержневые-петлевые общие участки (CR-SL) ДНК-компонентов 1-6 BBTV. Стержневаяпетлевая структура в каждом компоненте подчеркнута, а петлевая последовательность набрана курсивом. Звздочками отмечены консервативные нуклеотиды в составе всех компонентов. Точки включены в некоторые последовательности, чтобы максимально упорядочить их и облегчить сравнение. На фиг. 4 приведены упорядоченные последовательности общих участков (CR-M) ДНКкомпонентов 1-6 BBTV. 15-нуклеотидная обогащнная GС последовательность подчркнута. Звздочками отмечены консервативные нуклеотиды в составе всех компонентов, а чрными треугольниками обозначены консервативные нуклеотиды в пределах первых 26 нуклеотидов компонентов 2-6, перекрывающих делецию в компоненте 1. Точки включены в некоторые последовательности, чтобы максимально упорядочить их и повторяющиеся неполные последовательности набраны курсивом. На фиг. 5 приведена диаграмма возможной организации генома BBTV. (I). Общая организация генома всех компонентов. (II). Линейная структура генома каждого компонента. На фиг. 6 приведены различные конструкции межгенного участка компонента 1. На фиг. 7 приведены различные конструкции межгенного участка компонента 2. На фиг. 8 приведены различные конструкции межгенного участка компонентов 3 и 4. На фиг. 9 приведены различные конструкции межгенного участка компонента 5. На фиг. 10 приведены различные конструкции межгенного участка компонента 6. На фиг. 11 приведены упорядоченные последовательности межгенных участков компонентов 1-6 BBTV. bbtvpro1 - вставка pBT1.1;bbtvpro6 TGA-1a локализована в положении 1083, TGA-1b локализована в положении 44,Adh1US1 локализован в положении 173, G-BOX локализована в положении 46. Также обратите внимание, что G-BOX представляет собой растительный промотор, ассоциированный с транскрипционной коровой последовательностьюCACGTG. На фиг. 12 приведена последовательность вставки pBT1.INT (982 п. о.). Обратите внимание, что последовательность межгенного участка компонента 1 BBTV основана на небольшой открытой рамке считывания. На фиг. 13 приведена последовательность вставки рВТ 6.1 (а) (622 п. о.); рВТ 6.2 (b) (351 п. о.); рВТ 6.3 (с) (238 п. о.) и рВТ 6.4 (d) (182 п. о.). Обратите внимание, что выделенный участок в рВТ 6.3 представляет собой последовательность,ассоциированную с большей частью промоторной активности межгенного участки компонента 6. Указанный участок удалн в рВТ 6.4. На фиг. 14 приведена схема конструкцииBBTV6-NPTII. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента 1 вируса верхушки грозди бананов (BBTV), показанной на фиг. 11 как последовательностьbbtvpro 1 (pBT1.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не BBTV. 2. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента 2 BBTV, показанной на фиг. 11 как последовательность bbtvpro 2 (рВТ 2.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не BBTV. 3. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента 3 BBTV, показанной на фиг. 11 как последовательность bbtvpro 3 (рВТ 3.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не BBTV. 4. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента 4 BBTV, показанной на фиг. 11 как последовательность bbtvpro 4 (рВТ 4.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не BBTV. 5. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента 5 BBTV, показанной на фиг. 11 как последовательность bbtvpro 5 (рВТ 5.1), по меньшей мере 36 на 80%, и кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не BBTV. 6. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности межгенного участка компонента 6 BBTV, показанной на фиг. 11 или 13 (а) как последовательность bbtvpro 6 (рВТ 6.1), по меньшей мере на 80%, и кодирующая промотор,способный к осуществлению транскрипции гена не BBTV. 7. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности рВТ 6.2, показанной на фиг. 13(в), по меньшей мере на 80%, кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не BBTV. 8. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности рВТ 6.3, показанной на фиг. 13(с), по меньшей мере на 80%, кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не BBTV. 9. Молекула ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности рВТ 6.4, показанной на фиг. 13(d), по меньшей мере на 80%, кодирующая промотор, способный к осуществлению транскрипции гена не BBTV. 10. Молекула ДНК по любому из пп.1-9,отличающаяся тем, что способна к осуществлению транскрипции гена не BBTV в клетках однодольного растения или в таком растении. 11. Молекула ДНК по любому из пп.1-9,отличающаяся тем, что способна к осуществлению транскрипции гена не BBTV в клетках двудольного растения или в таком растении. 12. Молекула ДНК по любому из пп.1-9,способная к осуществлению транскрипции гена не BBTV в недифференцированной ткани двудольного растения. 13. Способ экспрессии гена не BBTV в растительной клетке, включающий получение образца, содержащего выделенную молекулу ДНК по любому из пп. 1-9; получение препарата растительной клетки в таких условиях, которые делают возможным введение молекулы ДНК в растительную клетку и индукцию экспрессии гена не BBTV в растительной клетке, содержащей указанную молекулу ДНК. 14. Линия трансформированных растительных клеток, содержащих молекулу ДНК по любому из пп.1-9.