Ген и белок, ассоциированные с шизофренией

005921 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам гена РАРАР, к полипептидам, кодируемым геном РАРАР, и к антителам, специфичным к таким полипептидам. Настоящее изобретение также относится к способам лечения или диагностики шизофрении, биполярных нарушений или родственных заболеваний ЦНС. Настоящее изобретение также относится к взаимодействию РАРАР с геном g34872, который является кандидатом на ген шизофрении. Предшествующий уровень техники Прогресс, достигнутый в технологическом оснащении современных лабораторий для теоретических и клинических исследований, позволяет проводить более серьезное изучение функций головного мозга и нервной системы как у здоровых индивидуумов, так и у индивидуумов с патологией. Было выдвинуто множество нейробиологических и фармакологических гипотез, касающихся нейрохимических и генетических механизмов, вызывающих нарушения центральной нервной системы (ЦНС), включая психические и нейродегенеративные нарушения. Однако нарушения ЦНС имеют сложную и еще недостаточно ясную этиологию, и их симптомы, которые перекрываются друг с другом, еще недостаточно охарактеризованы и представляют определенные трудности для диагностики. В будущем необходимо разработать такие схемы лечения и лекарственные средства, которые обладали бы более тонким и направленным действием на мультигенные этиологические факторы, а также необходимо разработать новые анализы для выявления людей, страдающих указанными заболеваниями, и для получения более точных диагностических и прогностических данных относительно пациентов, страдающих нарушениями ЦНС. Нарушения ЦНС могут охватывать заболевания широкого спектра и, соответственно, широкий спектр генетических факторов. Примерами нарушений ЦНС являются нейродегенеративные заболевания, психотические нарушения, нарушения настроения, аутизм, злоупотребление веществами, вызывающими зависимость, и алкоголизм, задержка умственного развития и другие психические заболевания, включая нарушение познавательной способности, тревожные состояния, нарушения, связанные с приемом пищи, неконтролируемая импульсивность и нарушения личности. Такие нарушения могут быть определены с использованием(DSM-IV) ("Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition classification"). Даже при рассмотрении лишь небольшого ряда нарушений ЦНС очевидно, что исходя из отсутствия адекватного лечения и понимания молекулярных механизмов психотических нарушений, шизофрении и биполярных нарушений, которые являются новыми целями терапии настоящего изобретения, необходимо разработать усовершенствованные способы лечения этих нарушений. Что касается шизофрении и биполярного нарушения, то все известные молекулы, используемые для лечения шизофрении, дают побочные эффекты и действуют только на симптомы данного заболевания. Существует крайняя необходимость в получении новых молекул, которые не давали бы побочных эффектов и которые были бы направлены на мишени, участвующие в механизмах, вызывающих шизофрению и биполярные нарушения. Поэтому необходимо разработать способы, облегчающие обнаружения и характеризацию этих мишеней. Данные о сочетании шизофрении с биполярным нарушением в семьях, данные, полученные при исследовании близнецов и приемных детей, а также отсутствие динамики в заболеваемости во всем мире указывают на то, что шизофрения и биполярное нарушение являются, главным образом, генетическими состояниями, хотя на определенном уровне присутствуют также и внешние факторы риска, такие как необходимые, достаточные или интерактивные этиологические факторы. Так, например, шизофренией страдает 1% всего населения. Но если в семье бабушка или дедушка страдали шизофренией, то риск развития этого заболевания возрастает примерно до 3%, а если один из родителей страдал шизофренией, то этот риск увеличивается примерно до 10%. Если оба родителя страдали шизофренией, то риск составляет приблизительно 40%. Идентификация гена чувствительности к шизофрении на хромосоме 13q31-q33. Идентификация генов, участвующих в сообщении конкретного признака, такого как специфическое нарушение центральной нервной системы, например шизофрения, может быть осуществлена с помощью двух главных стратегий, которые используются в настоящее время для генетического картирования, а именно анализ на сцепление генов и исследование на ассоциацию генов. Анализ на сцепление генов требует проведения исследования семейств, в которых наблюдалось множество случаев заболевания индивидуумов, и такое исследование в настоящее время может быть использовано для обнаружения моноили олигогенных наследуемых признаков. В отличие от этого, исследования ассоциации генов позволяют определить частоту встречаемости маркерных аллелей у неродственных индивидуумов с этим признаком (Т+) по сравнению с негативным контролем (Т-) по этому признаку, и такое исследование часто используется для обнаружения полигенной наследуемости. Генетическая связь или "сцепление" генов основано на анализе, который позволяет определить, какие из двух соседних последовательностей на хромосоме содержат наименьшее число рекомбинаций,происходящих в результате кроссинговера в процессе мейоза. Для этого была определена точная локализация хромосомных маркеров, таких как микросателлитные маркеры, на геноме. Анализ на сцепление-1 005921 генов позволяет вычислить вероятности рекомбинаций на целевом гене с использованием хромосомных маркеров в соответствии с генеалогическим древом, вероятность передачи болезни и переноса маркеров. Таким образом, если конкретный аллель данного маркера передается с данной болезнью более часто, чем вероятность того, что он уже присутствует в нем (уровень рекомбинации от 0 до 0,5), то можно сделать вывод, что рассматриваемый целевой ген присутствует возле этого маркера. С использованием этого метода можно определить локализацию нескольких генов, свидетельствующих о генетической предрасположенности к наследственной злокачественной опухоли. Для включения в исследование на сцепление генов семьи, страдающей наследуемой формой заболевания, она должна удовлетворять критериям "информативности", т.е. эта семья должна иметь несколько страдающих этим заболеванием индивидуумов(у которых имеется структурная ДНК) на одно поколение, а в лучшем случае она должна иметь большое число сибсов. Результаты предварительных исследований на сцепление генов подтвердили предположение, что хромосома 13 по всей вероятности имеет локус чувствительности к шизофрении на 13q32 (Blouin J.L. etal., 1998, Nature Genetics, 20:70-73; Lin M.W. et al., 1997, Hum. Genet., 99(3) :417-420). Эти наблюдения позволяют предположить, что локус шизофрении находится на хромосоме 13q32, что было подтверждено в исследованиях на сцепление генов. Анализ на сцепление генов был успешно применен для картирования простых генетических признаков, которые ясно указывают на характер менделевского наследования и которые имеют высокий уровень пенетрантности, однако, этот метод имеет ряд недостатков. Вопервых, анализ на сцепление генов зависит от выбора генетической модели, подходящей для каждого исследуемого признака. Кроме того, использование анализа на сцепление генов ограничено разрешением, которое может быть достигнуто при его применении, и для более точного анализа типичных 20 м.п.н. областей, которые были предварительно идентифицированы этим методом, требуются дополнительные исследования. Кроме того, анализ на сцепление генов представляет определенные трудности при его применении в целях обнаружения сложных генетических признаков, таких как признаки, обусловленные комбинированным действием множества генов и/или факторов окружающей среды. В этих случаях для подбора адекватного числа семей с данным заболеванием, необходимого для проведения анализа на сцепление генов для конкретных ситуаций, требуется очень большой объем работы и средств. И, наконец,анализ на сцепление генов не может быть применен для исследования признаков, в которых не может участвовать большое число "информативных" семей. Позже, вместо использования анализов на сцепление генов был использован альтернативный метод исследований на ассоциацию генов, который позволил идентифицировать новый ген, ассоциированный с шизофренией и биполярным нарушением и обозначенный геном g34872, который локализован в локусе хромосомы 13q31-q33. Этот альтернативный метод предусматривает создание биаллельных маркеров(главным образом, с однонуклеотидным полиморфизмом) в нужной области, идентификацию маркеров,указывающих на неравновесность по сцеплению с шизофренией, и проведение исследований на ассоциацию генов у индивидуумов со случаями неродственной шизофрении и биполярного нарушения, а также у контрольных популяций. В целом, был сконструирован ВАС-контиг, охватывающий геномный участок-кандидат, с использованием 27 опубликованных STS (STS - ДНК-маркирующий сайт), локализованных на участке хромосомы 13q31-q33 для скрининга 7 геномных эквивалентных запатентованных ВАС-библиотек. На основе этих материалов были генерированы новые STS, что позволило построить плотную физическую карту этой области. В целом, 275 STS позволили идентифицировать 255 ВАС, имеющие все возможные размеры и картированные путем хромосомной гибридизации in situ для их подтверждения. Новые биаллельные маркеры были генерованы путем частичного секвенирования концов вставки от субклонов некоторых вставок ВАС, локализованных в области 13q31-q33 хромосомы человека. В первой фазе этого анализа для случая шизофрении и контроля была проанализирована первая серия 34 биаллельных маркеров на 9 различных ВАС вдоль локуса-кандидата хромосомы 13q31-q33, что позволило идентифицировать субобласть, указывающую на ассоциацию с шизофренией. После проведения этого первого анализа генерировали дополнительные биаллельные маркеры, как описано выше, для построения карты очень высокой плотности нужной области. Была идентифицирована и полностью секвенирована минимальная серия из 35 ВАС, что позволило выявить несколько контигов, включая контиг, состоящий из последовательностей в более чем 900 т.п.н. в нужной области. Эти биаллельные маркеры были использованы в комбинации с исследованиями, которые проводились в целях уточнения конкретной нужной субобласти, содержат кандидат на ген шизофрении, g34872. В некоторых исследованиях, проводимых на различных популяциях в целях подтверждения ассоциации с указанной субобластью, был определен генотип этих биаллельных маркеров. Исследования на ассоциацию сначала осуществляли на двух различных скринирующих образцах для случаев шизофрении и на контрольных образцах, взятых от индивидуумов, проживающих во французской Канаде, из которых 139 человек имели шизофрению, а 141 человек составляли контрольную группу, и 215 человек имели шизофрению, а 241 человек составляли контрольную группу соответственно, а также на образцах для случаев биполярного нарушения и контрольных образцах, взятых от индивидуумов, проживающих в Аргентине. Данные, полученные в результате нескольких исследований с участием указанных индивидуумов,-2 005921 выявили геномную область, имеющую примерно 150 т.п.н. и обнаруживающую значимую ассоциацию с шизофренией. Эта ассоциация была затем подтверждена в независимых исследованиях с использованием образцов для случаев заболевания и контрольных образцов, взятых от больных шизофренией, проживающих в США, а также дополнительных образцов, взятых от индивидуумов, проживающих в Аргентине и во французской Канаде. Было обнаружено, что геномная область примерно в 150 т.п.н., ассоциированная с шизофренией,содержит ген-кандидат g34872. Кроме того, помимо характеризации структуры интрон-экзон генаg34872 был идентифицирован ряд вариантов мРНК-сплайсинга, включая тканеспецифические варианты мРНК-сплайсинга, и было продемонстрировано присутствие мРНК. Затем пептидный фрагмент, происходящий от полипептидного продукта g34872, аминокислотная последовательность которого показана вSEQ ID No: 5, обнаруживал при его внутрибрюшинном введении мышам снижение частоты локомоторных движений и увеличение стереотипии. Последующее обсуждение идентификации гена g34872 приводится в одновременно рассматриваемой заявке на патент США рег.09/539333, озаглавленной "Гены,белки и биаллельные маркеры, ассоциированные с шизофренией" ("Schizophrenia associated genes, proteins and biallelic marker"), и в одновременно рассматриваемой международной патентной заявкеPCT/IB 00/00435, которые были поданы 30 марта 2000 г. и которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Крайне необходимо идентифицировать гены, ассоциированные с шизофренией и биполярным нарушением. Также необходимо идентифицировать гены, участвующие в пути g34 872, и гены, продукты которых функционально взаимодействуют с продуктами гена g34872. Эти гены могут послужить началом нового этапа в лечении шизофрении или биполярных нарушений и также позволят проводить дальнейшие исследования и характеризацию гена g34872 и связанного с ним биологического пути. Сведения об этих генах и связанного с ним биологического пути, ответственных за шизофрению, могут помочь исследователям понять этиологию шизофрении и биполярного нарушения и способствовать разработке лекарственного средства и медицинских препаратов, которые будут направлены на причину, вызывающую эти заболевания. Существует также острая необходимость в разработке новых способов обнаружения чувствительности к шизофрении и биполярным нарушениям, а также способов предупреждения развития шизофрении или контроля за ходом ее развития. Также крайне необходимо разработать средства для диагностики этих заболеваний. Действительно, ранняя идентификация индивидуумов с риском развития шизофрении позволила бы проводить раннее и/или профилактическое лечение. Кроме того, точная оценка потенциальной эффективности лекарственного средства, а также потенциальной толерантности к нему пациентов, позволила бы клиницистам увеличить отношение польза/риск при разработке схем лечения шизофрении и биполярного нарушения. Таким образом, настоящее изобретение относится к новому гену и белку, который взаимодействует с пептидом g34872. Этот новый ген, обозначенный геном РАРАР, был клонирован авторами настоящего изобретения, которые продемонстрировали, что продукт гена РАРАР взаимодействует с пептидомg34872. Сведения о партнере по связыванию с g34872 дают возможность разработать лекарственные средства для лечения заболеваний ЦНС, опосредованных g34872 и/или РАРАР, и проводить исследования g34872 путем получения средств для детекции РАРАР, g34872 и комплексов g34872-РАРАР или их взаимодействий. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим геномную последовательность нового гена человека, который кодирует белок РАРАР. Геномная последовательность РАРАР включает регуляторную последовательность, расположенную выше (с 5'-конца) и ниже (с 3'конца) от транскрибируемой части указанного гена, и эти регуляторные последовательности также являются частью настоящего изобретения. Настоящее изобретение также относится к полной кДНК-последовательности, кодирующей белок РАРАР, а также к полипептидам РАРАР и к антителам, специфически распознающим полипептид РАРАР. Настоящее изобретение также относится к комплексу РАРАР-g34872, не содержащему белка, с которым он обычно ассоциирован, а также к антителам, специфически распознающим указанный комплекс. Олигонуклеотидные зонды или праймеры, специфически гибридизующиеся с геномной или с кДНК-последовательностью РАРАР, а также способы ДНК-амплификации и детекции с использованием указанных праймеров и зондов также являются частью настоящего изобретения. Другим объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные векторы, содержащие любые вышеописанные последовательности нуклеиновой кислоты, а в частности рекомбинантные векторы, содержащие регуляторную последовательность РАРАР или последовательность, кодирующую белок РАРАР, а также клетки-хозяева и трансгенные животные, отличные от человека, и содержащие указанные последовательности нуклеиновой кислоты или рекомбинантные векторы. Настоящее изобретение также относится к способам скрининга веществ или молекул, ингибирующих экспрессию РАРАР, а также к способам скрининга веществ или молекул, которые взаимодействуют с полипептидом РАРАР и которые модулируют активность полипептида РАРАР или нарушают, преду-3 005921 преждают, дестабилизируют или усиливают связывание и/или взаимодействие пептидов и/или белков РАРАР и g34872. И, наконец, настоящее изобретение относится к использованию полипептида РАРАР, антител против этого полипептида и агонистов и антагонистов активности РАРАР для лечения нарушений ЦНС. Краткое описание последовательностей, представленных в списке последовательностейSEQ ID NO: 4 содержит ДНК-последовательность, кодирующую гибридный белок "пептид g34872 щелочная фосфатаза", описанный в примере 1.SEQ ID NO: 5 содержит ДНК-последовательность, кодирующую пептид g34 872, используемый для идентификации и клонирования гена РАРАР, описанного в примере 1.SEQ ID NO: 6 содержит аминокислотную последовательность, кодируемую ДНК SEQ ID NO: 4. Подробное описание Идентификация гена РАРАР, локализованного на хромосоме 1 р 35-р 36 Для идентификации белка РАРАР авторами настоящего изобретения был использован метод экспрессионного клонирования, подробно описанный ниже в примере 1. Для этого заявителями был создан с сохранением рамки считывания гибрид кДНК-последовательности, кодирующей пептидный фрагментg34872, с С-концом секретируемой щелочной фосфатазы (АР) в векторе, содержащем секретируемую сигнальную последовательность, расположенную выше вставки, которая направляет секрецию этого гибридного белка в данную среду, где указанная среда, содержащая этот гибридный белок, может быть собрана, проанализирована на АР-активность и использована в анализе in situ на рецептор/лиганд. Затем авторами настоящего изобретения был проведен анализ in situ на рецептор/лиганд. кДНК, выделенные из кДНК-библиотеки головного мозга человека, клонировали в экспрессирующий вектор и трансфицировали в клетки COS-1. Секретированный АР-гибридный белок использовали в качестве зонда для клонирования РАРАР путем инкубирования клеток со средой, содержащей гибридный белок "пептид g34872 АР". В случае детекции позитивного клона анализ повторяли с использованием еще более мелких пулов кДНК до тех пор, пока не был идентифицирован единственный клон. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам и к полипептидам, ассоциированным с геном РАРАР. Частью настоящего изобретения также являются олигонуклеотидные зонды или праймеры, специфически гибридизующиеся с геномной или с кДНК-последовательностью РАРАР. Другой целью настоящего изобретения являются рекомбинантные векторы, содержащие любые вышеописанные последовательности нуклеиновой кислоты, а в частности рекомбинантные векторы, включающие регуляторную последовательность РАРАР или последовательность, кодирующую белок РАРАР, а также клетки-хозяева, содержащие указанные последовательности нуклеиновой кислоты или рекомбинантные векторы. Настоящее изобретение также относится к способам скрининга молекул, которые ингибируют экспрессию гена РАРАР и которые модулируют активность белка РАРАР или которые нарушают, предупреждают, дестабилизируют или усиливают связывание и/или взаимодействие пептидов и/или белков РАРАР и g34872. Настоящее изобретение также относится к антителам, которые специфически направлены против таких полипептидов и которые могут быть использованы в качестве диагностических реагентов. Идентифицированный ген и белок РАРАР может быть использован при разработке анализов для диагностики шизофрении или биполярных нарушений и при разработке анализов для надежной детекции генетической предрасположенности к шизофрении, к биполярным нарушениям и к родственным заболеваниям. Для лечения указанных нарушений могут быть использованы нуклеиновые кислоты и полипептиды РАРАР, а также антитела против указанных полипептидов. Ген и белок РАРАР и антитела против них могут быть также использованы при разработке схем скрининга лекарственных средств для точной и эффективной оценки терапевтического эффекта и побочных эффектов новых или уже имеющихся лекарственных средств или схем лечения. Кроме того, нуклеиновые кислоты и полипептиды РАРАР могут быть использованы для исследования g34872 и РАРАР и их участия в развитии заболеваний ЦНС. Определения. Перед более подробным описанием настоящего изобретения приводятся нижеследующие определения, в которых проиллюстрированы и определены значения и объем используемых в этом изобретении терминов. Используемые здесь термины "ген РАРАР" охватывают геномные, мРНК- и кДНКпоследовательности, кодирующие белок РАРАР, включая нетранслируемые регуляторные области геномной ДНК. Используемый здесь термин "гетерологичный белок" означает любой белок или полипептид, не являющийся белком РАРАР. Более конкретно, таким гетерологичным белком является соединение, которое может быть использовано в качестве маркера в последующих экспериментах с регуляторной областью РАРАР. Термин "выделенный" означает, что данный материал должен быть удален из его природной среды(например, природного окружения, если оно имеется). Так, например, природный полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом организме, не является выделенным, но те же самые полинуклеотид, ДНК или полипептид, отделенные от некоторых или всех материалов, имеющихся в природной системе, являются выделенными. Такой полинуклеотид может быть частью вектора, и/или такой полинуклеотид или полипептид может быть частью композиции, и в случае, если они выделены, то данный вектор или композиция не являются частью его природного окружения. Так, например, природный полинуклеотид, присутствующий в живом организме, не является выделенным, но тот же самый полинуклеотид, отделенный от некоторых или от всех веществ, имеющихся в природной системе, является выделенным. Более конкретно, из понятия "выделенный" должны быть исключены природные хромосомы (такие как хромосомные препараты), искусственные хромосомные библиотеки, геномные библиотеки и библиотеки кДНК, которые существуют либо в виде препарата, полученного на основе нуклеиновой кислоты in vitro, либо в виде препарата, полученного на основе трансфицированной/трансформированной клетки-хозяина, где указанные клетки-хозяева представляют собой либо гетерогенный препарат in vitro, либо высеваются в виде гетерогенной популяции единичных колоний. Конкретными исключениями также являются вышеуказанные библиотеки, где конкретный полинуклеотид составляет менее чем 5% от числа вставок нуклеиновой кислоты в векторных молекулах. Другими конкретными исключениями являются геномные ДНК целых клеток или РНК-препараты целых клеток (включая указанные препараты целых клеток, которые являются механически фрагментированными или ферментативно гидролизованными). Другими конкретными исключениями являются вышеуказанные препараты целых клеток, полученные либо в виде in vitro-препарата, либо в виде гетерогенной смеси, выделенной путем электрофореза (включая перенос блотов этого препарата), где полипептид настоящего изобретения в дальнейшем не был выделен из гетерологичных полинуклеотидов в среде для электрофореза (например, не был подвергнут последующему вырезанию одной полосы из популяции гетерогенных полос в агарозном геле или в найлоновом блоте). Используемый здесь термин "очищенный" необязательно означает абсолютную чистоту, а скорее он имеет относительное толкование. В конкретных случаях может предусматриваться очистка исходного материала или природного материала по крайней мере первого порядка, а предпочтительно второго или третьего порядков, а более предпочтительно четвертого или пятого порядков. Примером может служить очистка в пределах от 0,1%-ной концентрации до 10%-ной концентрации, что составляет очистку второго порядка. Для иллюстрации, отдельные кДНК-клоны, выделенные из библиотеки кДНК, были очищены стандартным способом до электрофоретической гомогенности. Последовательности, полученные из этих клонов, не могут быть непосредственно получены ни из библиотеки, ни из полной ДНК человека. Сами клоны кДНК не встречаются в природе, и они могут быть получены путем модификации частично очищенного природного вещества (матричной РНК). Превращение мРНК в библиотеку кДНК приводит к образованию синтетического вещества (кДНК), а чистые отдельные клоны кДНК могут быть выделены из синтетической библиотеки путем клонального отбора. Так, например, создание библиотеки кДНК из матричной РНК и последующее выделение отдельных клонов из этой библиотеки дает приблизительно 104-106-кратную очистку нативного мессенджера. Используемый здесь термин "очищенный" необязательно означает абсолютную чистоту, а скорее он имеет относительное толкование. В конкретных случаях может предусматриваться очистка исходного материала или природного материала по крайней мере первого порядка, а предпочтительно второго или третьего порядков, а более предпочтительно четвертого или пятого порядков. Примером может служить очистка в пределах от 0,1 до 10%-ной концентрации, что составляет очистку второго порядка. Для иллюстрации, отдельные клоны кДНК, выделенные из библиотеки кДНК, были очищены стандартным способом до электрофоретической гомогенности. Последовательности, полученные из этих клонов, не могут быть непосредственно выделены ни из библиотеки, ни из полной ДНК человека. Сами клоны кДНК не встречаются в природе, и они могут быть получены путем модификации частично очищенного природного вещества (матричной РНК). Превращение мРНК в библиотеку кДНК приводит к образованию синтетического вещества (кДНК), а чистые отдельные клоны кДНК могут быть выделены из синтетической библиотеки путем клонального отбора. Так, например, создание библиотеки кДНК из матричной РНК и последующее выделение отдельных клонов из этой библиотеки дает приблизительно 104-106-кратную очистку нативного мессенджера. Используемый здесь термин "очищенный" относится к полипептиду или к полинуклеотиду настоящего изобретения, который был выделен из других соединений, включая, но не ограничиваясь ими, полипептиды или полинуклеотиды, углеводы, липиды и т.п. Термин "очищенный" может быть использован для идентификации отделения мономерных полипептидов настоящего изобретения от олигомерных форм, таких как гомо- или гетеродимеры, тримеры и т.п. Термин "очищенный" может быть также использован для идентификации отделения ковалентно связанных полинуклеотидов от линейных полинуклеотидов. Полинуклеотид является, в основном, чистым в том случае, если по крайней мере 50%, а предпочтительно 60-75% образца обнаруживают одиночную полинуклеотидную последовательность и конформацию (линейную по сравнению с ковалентно связанной). В основном, чистый полипептид или по-5 005921 линуклеотид обычно составляет примерно 50%, а предпочтительно 60-90 мас.% от всего полипептидного или полинуклеотидного образца соответственно, а обычно его чистота составляет примерно 95%, а предпочтительно примерно более 99%. Чистоту или гомогенность полипептида и полинуклеотида определяют различными способами, хорошо известными специалистам, такими как электрофорез образца в агарозном или в полиакриламидном геле, с последующей визуализацией одиночной полосы после окрашивания геля. Для определенных целей может быть использовано более высокое разрешение с применением ВЭЖХ или других способов, хорошо известных специалистам. В качестве альтернативного варианта осуществления изобретения чистота полипептидов и полинуклеотидов настоящего изобретения может быть определена как "по крайней мере, процент чистоты" по отношению к гетерологичным полипептидам и полинуклеотидам (ДНК, РНК или оба этих вещества). В качестве предпочтительного варианта осуществления изобретения, полипептиды и полинуклеотиды настоящего изобретения имеют чистоту по крайней мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 98, 99 или 100% по отношению к гетерологичным полипептидам и полинуклеотидам соответственно. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептиды и полинуклеотиды имеют чистоту, составляющую в пределах от любого числа до тысячных долей от 90 до 100% (например, полипептид или полинуклеотид, по крайней мере, с чистотой 99,995%) по отношению к гетерологичным полипептидам или полинуклеотидам соответственно, или их чистота может быть выражена как их массовое отношение ко всем соединениям и молекулам, кроме тех, которые присутствуют в носителе. Каждое число, представляющее процент чистоты, вплоть до тысячных долей может быть заявлено как отдельный тип чистоты. Термин "полипептид" означает полимер, состоящий из аминокислот, независимо от длины этого полимера; таким образом, в понятие "полипептид" входят пептиды, олигопептиды и белки. Этот термин не определяет или не исключает посттрансляционные модификации полипептидов, так, например, термин "полипептид" охватывает полипептиды, которые включают ковалентно связанные гликозильные группы, ацетильные группы, фосфатные группы, липидные группы и т.п. В это определение входят также полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты, аминокислоты, которые присутствуют только в неродственных биологических системах, модифицированные аминокислоты, происходящие из систем млекопитающих и т.п.), полипептиды с замещенными связями, а также другие модификации, известные специалистам, как природные,так и неприродные. Используемый здесь термин "рекомбинантный полипептид" означает полипептиды, которые были искусственно сконструированы и которые содержат по крайней мере две полипептидных последовательности, не присутствующие как непрерывные полипептидные последовательности в его природном окружении, либо этот термин означает полипептиды, которые были экспрессированы рекомбинантным полинуклеотидом. Используемый здесь термин "очищенный полипептид" означает полипептид настоящего изобретения, который был выделен из других соединений, включая, но не ограничиваясь ими, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы и другие белки. Полипептид является, в основном, чистым в том случае, если по крайней мере 50%, а предпочтительно 60-75% образца составляет одиночная полипептидная последовательность. В основном, чистый полипептид обычно составляет примерно 50%, а предпочтительно 6090 мас.% образца белка, а обычно примерно 95%, а предпочтительно примерно более 99% по всей массе образца белка. Чистоту или гомогенность полипептида определяют способами, хорошо известными специалистам, такими как электрофорез образца в полиакриламидном геле, с последующей визуализацией одной полипептидной полосы после окрашивания геля. Для определенных целей может быть использовано более высокое разрешение с применением ВЭЖХ или других хорошо известных способов. Используемый здесь термин "животное, отличное от человека", означает любое позвоночное, отличное от человека, птицы, и более обычно млекопитающие, предпочтительно приматы, сельскохозяйственные животные, такие как свиньи, козы, овцы, ослы и лошади, кролики или грызуны, а более предпочтительно крысы или мыши. Используемый здесь термин "животное" означает любое позвоночное, а предпочтительно млекопитающее. В понятие "животное" и "млекопитающее", помимо животных, перечисленных выше при определении понятия "животное, отличное от человека", входит также и человек. Используемый здесь термин "антитело" означает полипептид или группу полипептидов, которые состоят по крайней мере из одного связывающего домена, где домен, связывающийся с антителом, формируется в результате укладки вариабельных доменов молекулы антитела с образованием трехмерных связывающих областей, имеющих форму внутренней поверхности и распределение заряда, комплементарные элементам антигенной детерминанты данного антигена, в результате чего обеспечивается осуществление иммунологической реакции с этим антигеном. Антителами являются рекомбинантные белки,содержащие связывающие домены, а также их фрагменты, включая Fab, Fab', F(ab)2 и F (аb')2-фрагменты. Используемый здесь термин "антигенная детерминанта" означает часть молекулы антигена, а в данном случае, полипептид РАРАР, который определяет специфичность реакции "антиген-антитело". Термин "эпитоп" означает антигенную детерминанту полипептида. Эпитоп может содержать по крайней мере 3 аминокислоты в пространственной конформации, которая является уникальной для этого эпитопа. В основном, эпитоп содержит по крайней мере 6 таких аминокислот, а обычно по крайней мере 8-10 та-6 005921 ких аминокислот. Методами определения аминокислот, имеющихся в эпитопе, являются рентгеновская кристаллография, 2-мерный ядерный магнитный резонанс и картирование эпитопа, например, метод Pepscan, описанный Geysen et al. 1984; в публикации РСТWO 84/03564; и в публикации РСТWO 84/03506. В описании настоящего изобретения термин экспрессионная "нуклеотидная последовательность" может означать либо полинуклеотид, либо нуклеиновую кислоту. Более точно, термин экспрессионная"нуклеотидная последовательность" охватывает сам нуклеиновый материал и, таким образом, не ограничивается информацией о последовательности (т.е. последовательности букв, выбранной для обозначения буквенного кода из четырех оснований), которая биохимически характеризует конкретную молекулу ДНК или РНК). Используемые здесь взаимозаменяемые термины "нуклеиновые кислоты", "олигонуклеотиды" и"полинуклеотиды" означают последовательности РНК, ДНК или гибридные последовательности РНК/ДНК, состоящие из более чем одного нуклеотида, либо в одноцепочечной, либо в дуплексной форме. Термин "нуклеотидный", используемый здесь как прилагательное, означает молекулы, содержащие РНК, ДНК или гибридные последовательности РНК/ДНК любой длины в одноцепочечной или в дуплексной форме. Термин "нуклеотид", используемый здесь как существительное, означает отдельные нуклеотиды или ряд нуклеотидов, т.е. молекулу или отдельное звено в более крупной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей пурин или пиримидин, рибозную или дезоксирибозную часть и фосфатную группу, либо фосфодиэфирную связь в случае, когда нуклеотиды находятся внутри олигонуклеотида или полинуклеотида. Хотя используемый здесь термин "нуклеотид" охватывает "модифицированные нуклеотиды", которые содержат по крайней мере одну из модификаций (а) альтернативную связывающую группу,(b) аналогичную форму пурина, (с) аналогичную форму пиримидина или (d) аналогичный сахар, например, аналогичные связывающие группы, пурин, пиримидин и сахара, см., например, РСТ-публикациюWO 95/04064. Полинуклеотидные последовательности настоящего изобретения могут быть получены любыми известными методами, включая методы синтеза, метод рекомбинантных ДНК, метод ех vivoгенерирования или их комбинации, а также любые методы очистки, известные специалистам. Последовательность, которая является "функционально связанной" с регуляторной последовательностью, такой как промотор, означает, что указанный регуляторный элемент находится в правильной локализации и ориентации по отношению к нуклеиновой кислоте и, тем самым, обеспечивает регуляцию инициации РНК-полимеразы и экспрессию нужной нуклеиновой кислоты. Используемый здесь термин"функционально присоединенный" относится к присоединению полинуклеотидных элементов в функциональной зависимости. Так, например, промотор или энхансер считаются "функционально присоединенными" к кодирующей последовательности, если они влияют на транскрипцию данной кодирующей последовательности. Используемые здесь термины "признак" и "фетотип" являются взаимозаменяемыми и означают любое видимое, детектируемое или как-либо иначе определяемое свойство организма, такое как, например,симптомы или чувствительность к заболеванию. Обычно используемые здесь термины "признак" и "фетотип" означают симптомы или чувствительность к заболеванию, положительный ответ на лечение или побочные эффекты, ассоциированные с этим лечением. Предпочтительно указанными признаками могут быть, но не ограничиваются ими, злокачественные опухоли, онтогенетические заболевания и нервные болезни. Используемый здесь термин "аллель" означает варианты нуклеотидной последовательности. Биаллельный полиморфизм имеет две формы. Дипольные организмы могут быть гомозиготными или гетерозиготными по аллельной форме. Используемый здесь термин "генотип" означает идентичность аллелей, присутствующих у индивидуума или в образце. В контексте настоящего изобретения "генотип" предпочтительно означает описание биаллельных маркерных аллелей, присутствующих у индивидуума или в образце. Термин "определение генотипа" образца или индивидуума по биаллельному маркеру означает определение специфического аллеля или специфического нуклеотида, присутствующего в биаллельном маркере у данного индивидуума. Используемый здесь термин "мутация" означает отличие в ДНК-последовательностях между различными геномами или индивидуумами либо в пределах одного генома или индивидуума, частота встречаемости которого составляет менее 1%. Используемый здесь термин "полиморфизм" означает присутствие двух или нескольких альтернативных геномных последовательностей или аллелей в различных геномах или индивидуумах либо в одном геноме или индивидууме. Термин "полиморфный" относится к состоянию, при котором в популяции могут быть обнаружены два или несколько вариантов специфической геномной последовательности. Термин "полиморфный сайт" означает локус, в котором имеется изменение. Однонуклеотидный полиморфизм означает замену одного нуклеотида другим нуклеотидом в полиморфном сайте. Делеция одного нуклеотида или инсерция одного нуклеотида также приводит к однонуклеотидному полиморфизму. В контексте настоящего изобретения термин "однонуклеотидный полиморфизм" предпочтительно означает замену в одном нуклеотиде. Обычно у различных индивидуумов полиморфный сайт может быть занят-7 005921 двумя различными нуклеотидами. Используемые здесь термины "биаллельный полиморфизм" и "биаллельный маркер" являются взаимозаменяемыми и означают однонуклеотидный полиморфизм, имеющий два аллеля с высокой частотой встречаемости в данной популяции. Термин "биаллельный макерный аллель" означает нуклеотидные варианты, присутствующие в биаллельном маркерном сайте. Используемый здесь термин "расположенный выше" относится к указанию местоположения в направлении к 5'-концу полинуклеотида от конкретной исходной точки. Используемые здесь термины "пары нуклеотидов" и "пары оснований Уотсона и Крика" являются взаимозаменяемыми и означают нуклеотиды, которые могут быть связаны друг с другом водородной связью благодаря идентичности их последовательностей так, как это наблюдается в двухспиральной ДНК с тиминовыми или урацильными остатками, связанными с адениновыми остатками двумя водородными связями и с цитозиновыми и гуаниновыми остатками, связанными тремя водородными связями(см. Stryer, L., Biochemystry 4-th edition, 1995). Используемые здесь термины "комплементарный" или "его комплемент" относятся к последовательностям полинуклеотидов, которые способны образовывать пары оснований Уотсона и Крика с другим конкретным полинуклеотидом на протяжении всей комплементарной области. В соответствии с настоящим изобретением считается, что первый олигонуклеотид комплементарен второму полинуклеотиду, если каждое основание первого полинуклеотида спарено с комплементарным ему основанием. Обычно комплементарными основаниями считаются А и Т (или А и U), или С и G. Используемый здесь термин "комплемент" является синонимом "комплементарного полинуклеотида", "комплементарной нуклеиновой кислоты" и "комплементарной нуклеотидной последовательности". Эти термины применяются к парам полинуклеотидов, исходя лишь только из их последовательностей, но не имеют никакого отношения к условиям, при которых эти два полинуклеотида фактически связываются. Варианты и фрагменты. 1. Полинуклеотиды. Настоящее изобретение также относится к вариантам и фрагментам описанных здесь полинуклеотидов, а в частности, к гену РАРАР, содержащему один или несколько биаллельных маркеров настоящего изобретения. Используемый здесь термин "варианты полинуклеотидов" означает полинуклеотиды, которые отличаются от известного полинуклеотида. Вариант полинуклеотида может быть природным вариантом,таким как природный аллельный вариант, либо он может представлять собой вариант, который не встречается в природе. Такие неприродные варианты полинуклеотида могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, используемые для мутагенеза полинуклеотидов, клеток или организмов. Обычно различия между ними являются незначительными, т.е. нуклеотидные последовательности известного полинуклеотида и варианта имеют большее сходство, а на некоторых участках они вообще идентичны. В соответствии с настоящим изобретением вариантами полинуклеотидов являются, но не ограничиваются ими, нуклеотидные последовательности, которые по крайней мере на 95% идентичны полинуклеотиду SEQ ID NO: 1 или 3, либо любому полинуклеотидному фрагменту, состоящему из 12 смежных нуклеотидов полинуклеотида SEQ ID NO: 1 или 3, а предпочтительно по крайней мере на 99%, более предпочтительно по крайней мере на 99,5%, а наиболее предпочтительно по крайней мере на 99,8% идентичны полинуклеотиду SEQ ID NO: 1 или 3 или любому полинуклеотидному фрагменту, состоящему из 12 смежных нуклеотидов полинуклеотида SEQ ID NO: 1 или 3. Нуклеотидные модификации, присутствующие в варианте полинуклеотида, могут быть молчащими,а это означает, что они не приводят к изменению аминокислот, кодируемых этим полинуклеотидом. Однако нуклеотидные модификации могут также приводить к заменам, добавлениям, делециям, инсерциям и усечению аминокислот в полипептиде, кодируемом известной последовательностью. Эти замены, делеции или добавления могут включать один или несколько нуклеотидов. Указанные варианты могут иметь модификации в кодирующей или некодирующей области, либо в той и другой. Изменения в кодирующей области могут приводить к продуцированию консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, делеций или добавлений. В контексте настоящего изобретения, особенно в предпочтительном его варианте настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, которые, в основном, сохраняют ту же самую биологическую функцию или активность, что и зрелый белок РАРАР, или к полинуклеотидам,кодирующим полипептиды, которые сохраняют или имеют повышенную какую-либо определенную биологическую активность, но пониженную какую-либо другую биологическую активность. Полинуклеотидный фрагмент означает полинуклеотид, имеющий последовательность, которая, в целом, идентична, но не всей данной нуклеотидной последовательности, а предпочтительно нуклеотидной последовательности гена РАРАР и его вариантов. Этот фрагмент может быть частью интрона или экзона гена РАРАР. Он может быть также частью регуляторных областей РАРАР. Такие фрагменты могут находиться в "свободном состоянии", т.е. они не являются частью других полинуклеотидов или не связаны с другими полинуклеотидом, либо они могут находиться в одном более крупном полинуклеотиде, часть или участок которого они образуют. Действительно, несколько из этих фрагментов могут присутствовать в одном более крупном полинуклеотиде.-8 005921 Необязательно, такие фрагменты могут состоять или, в основном, состоять из непрерывного участка по крайней мере из 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 или 1000 смежных нуклеотидов. 2. Полипептиды. Настоящее изобретение также относится к вариантам, фрагментам, аналогам и производным описанных здесь полипептидов, включая мутированные белки РАРАР. Таким вариантом может быть 1) вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативными или неконсервативными аминокислотными остатками, и такие замененные аминокислотные остатки могут кодироваться, а могут и не кодироваться генетическим кодом, или 2) вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков включают замещающую группу, или 3) вариант, в котором мутированный РАРАР присоединен к другому соединению, такому как соединение,которое увеличивает время полужизни полипептида (например, полиэтиленгликоль), или 4) вариант, в котором к мутированному РАРАР присоединены дополнительные аминокислоты, такие как лидерная или секреторная последовательность или последовательность, которая используется для очистки мутированного РАРАР или предпоследовательности белка. Очевидно, что такие варианты входят в объем настоящего изобретения. Полипептидный фрагмент представляет собой полипептид, имеющий последовательность, которая полностью аналогична части, но не всей последовательности данного полипептида, а предпочтительно полипептид, кодируемый геном РАРАР и его вариантами. В случае замены аминокислот в аминокислотной последовательности полипептида настоящего изобретения одна или несколько аминокислот могут быть заменены "эквивалентными" аминокислотами. Используемый здесь термин экспрессируемая "эквивалентная" аминокислота используется для обозначения любой аминокислоты, которая может быть замещена одной из аминокислот, имеющей аналогичные свойства, которые, например, как известно специалисту в области пептидной химии, в основном, не должны изменять предполагаемую вторичную структуру и гидропатическую природу данного полипептида. Обычно эквивалентные замены могут быть сделаны в пределах нижеследующих групп аминокислот (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4)Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His. Конкретными вариантами модифицированной пептидной молекулы РАРАР, представляющей интерес для настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, пептидная молекула, которая обладает резистентностью к протеолизу; пептид, в котором пептидная связь -CONH- модифицирована и заменена на восстановленную связь (CH2NH), ретро-инверсосвязь (NHCO), метиленоксисвязь (СН 2 О),тиометиленовую связь (CH2S), карбасвязь (СН 2 СН 2), цетометиленовую связь (СО-СН 2), гидроксиэтиленовую связь (СНОН-СН 2), связь (N-N), Е-альценовую связь или также связь -СН=СН-. Настоящее изобретение также относится к человеческому полипептиду РАРАР или к его фрагменту или варианту, в которых по крайней мере одна пептидная связь была модифицирована как описано выше. Указанные фрагменты могут находиться в "свободном состоянии", т.е. не являются частью других полипептидов или не присоединяются к другим полипептидам, либо они могут находиться в одном более крупном полипептиде, часть или область которого они образуют. Однако в одном более крупном полипептиде могут находиться несколько фрагментов. В качестве репрезентативных примеров полипептидных фрагментов настоящего изобретения могут быть упомянуты фрагменты, имеющие длину примерно в 5, 6, 8, 9 или 10-15, 10-20, 15-40 или 30-55 аминокислот. Предпочтительными являются фрагменты, содержащие по крайней мере одну аминокислотную мутацию в белке РАРАР. Идентичность между нуклеиновыми кислотами или полипептидами Используемые здесь термины "процент идентичности последовательности" и "процент гомологии" являются взаимозаменяемыми и означают степень идентичности и гомологии полинуклеотидов и полипептидов, которая определяется путем сравнения двух первичных последовательностей, оптимально сопоставляемых в "окне сравнения", где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в данном "окне" сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит этих добавлений или делеций), где эти добавления или делеции были внесены для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Процент вычисляют путем определения числа положений, в которых находятся идентичные основания нуклеиновой кислоты или аминокислотные остатки в обеих последовательностях, в результате чего получают число соответствующих положений, делят полученное число соответствующих положений на общее число положений в "окне" сравнения и полученный результат умножают на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Гомологию оценивают с использованием любого ряда алгоритмов и программ для сравнения последовательностей, известных специалистам. Такими алгоритмами и программами являются, но не ограничиваются ими, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA и CLUSTALW(PearsonLipman, 1988; Altschul et al., 1990; Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996; Altdchul et al.,1990; Altschul et al., 1993). В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гомологию последовательностей белков и нуклеиновых кислот оценивают с использованием про-9 005921 граммы "Basic Local Alignment Search Tool" ("BLAST") (программы поиска в базах данных посредством локального выравнивания последовательностей), хорошо известной специалистам (см., например, KarlinAltschul, 1990; Altschul et al., 1990, 1993, 1997). В частности, для решения нижеследующих задач были использованы пять конкретных программ BLAST(1) BLASTP и BLAST3 осуществляют сравнение запрашиваемой аминокислотной последовательности с последовательностями белка базы данных;(2) BLASTN осуществляет сравнение запрашиваемой нуклеотидной последовательности с нуклеотидными последовательностями базы данных;(3) BLASTX осуществляет сравнение концептуальных продуктов трансляции в шести рамках считывания запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обеих цепей) с последовательностями белка базы данных;(4) TBLASTN осуществляет сравнение запрашиваемой последовательности белка нуклеотидных последовательностей с нуклеотидными последовательностями базы данных, транслируемыми во всех шести рамках считывания; и(5) TBLASTX осуществляет сравнение продуктов трансляции в шести рамках считывания запрашиваемой нуклеотидной последовательности с продуктами трансляции нуклеотидных последовательностей базы данных в шести рамках считывания. Программы BLAST позволяют идентифицировать гомологичные последовательности путем идентификации аналогичных сегментов, называемых здесь "пары сегментов с высокой оценкой", для запрашиваемой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты и тестпоследовательности, которая была получена предпочтительно из базы данных последовательностей белка или нуклеиновой кислоты. Пары сегментов с высокой оценкой предпочтительно идентифицируют(т.е. сопоставляют) методами, в которых используют оценочную матрицу и многие из которых известны специалистам. Предпочтительно используемой оценочной матрицей является матрица BLOSUM62 (Gonnet et al., 1992; HenikoffHenikoff, 1993). Могут быть также использованы матрицы РАМ или РАМ 250,но они являются менее предпочтительными (см., например, SchwartzDayhoff, eds., 1978). ПрограммыBLAST позволяют оценивать статистическую значимость всех идентифицированных пар сегментов с высокой оценкой и предпочтительно отбирать те сегменты, которые удовлетворяют определенному пользователем порогу значимости, такому как определенный пользователем процент гомологии. Предпочтительно статистическую значимость пары сегментов с высокой оценкой определяют по формуле статистической значимости Karlin (см., например, KarlinAltschul, 1990). Программы BLAST могут быть использованы с параметрами по умолчанию или с модифицированными параметрами, введенными пользователем. Жесткие условия гибридизации Для определения гибридизующейся нуклеиновой кислоты настоящего изобретения были использованы следующие жесткие условия гибридизации: стадию гибридизации осуществляют при 65 С в присутствии буфера 6 х SSC, 5 х раствора Денхардта, 0,5% ДСН и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. После стадии гибридизации осуществляют четыре стадии промывки- две промывки в течение 5 мин предпочтительно при 65 С в буфере 2 х SSC и 0,1% ДСН;- одна промывка в течение 30 мин предпочтительно при 65 С в буфере 2 х SSC и 0,1% ДСН;- одна промывка в течение 10 мин предпочтительно при 65 С в буфере 0,1 х SSC и 0,1% ДСН,эти условия гибридизации являются подходящими для молекулы нуклеиновой кислоты длиной примерно в 20 нуклеотидов. Нет необходимости объяснять, что описанные выше условия гибридизации должны быть адаптированы в соответствии с длиной нужной нуклеиновой кислоты методами, хорошо известными специалистам. Подходящие условия гибридизации могут быть, например, адаптированы в соответствии с методами, описанными в книге HamesHiggins (1985). Геномные последовательности гена РАРАР Настоящее изобретение относится к геномной последовательности РАРАР. Настоящее изобретение охватывает ген РАРАР или геномные последовательности РАРАР, состоящие или в основном состоящие из последовательности SEQ ID NO: 3 или содержащие указанную последовательность; комплементарную ей последовательность; а также ее фрагменты и варианты. Указанные полинуклеотиды могут быть очищенными, выделенными или рекомбинантными. Нуклеиновыми кислотами РАРАР являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок, или в основном состоящие или состоящие из указанного непрерывного участка, охватывающего по крайней мере 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 3 или комплементарной последовательности. Нуклеиновыми кислотами РАРАР могут быть также выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок, или в основном состоящие или состоящие из указанного непрерывного участка, охватывающего по крайней мере 12, 15, 18, 20, 25,30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов, выбранных из группы нуклеотидов в положениях 1-3038, 1-421, 422-557, 2158-2218 и 2620-3039 последовательности SEQ IDNO: 3 или комплементарной последовательности. Настоящее изобретение также охватывает очищенный,- 10005921 выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентична нуклеотидной последовательности SEQ IDNO: 3, или комплементарной последовательности, или ее фрагменту. Различия в нуклеотидах по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 могут быть, в основном, случайно распределены по всей длине нуклеиновой кислоты. Тем не менее, предпочтительными нуклеиновыми кислотами являются нуклеиновые кислоты, в которых различия в нуклеотидах по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 преимущественно локализованы за пределами кодирующих последовательностей, содержащихся в экзонах. Эти нуклеиновые кислоты, а также их фрагменты и варианты могут быть использованы в качестве олигонуклеотидных праймеров или зондов для детекции присутствия копии гена РАРАР в тестируемом образце, или альтернативно, для амплификации нужной нуклеотидной последовательности в последовательностях РАРАР. Другим объектом настоящего изобретения является очищенная, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации, описанных выше, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3, или с ее комплементарной последовательностью, или с ее вариантом. Хотя этот раздел озаглавлен "Геномные последовательности РАРАР", однако, следует отметить, что фрагменты нуклеиновой кислоты, имеющие любой размер и любую последовательность, могут также охватывать описанные в этом разделе полинуклеотиды, фланкирующие геномные последовательности РАРАР на любой стороне указанных геномных последовательностей или между двумя или несколькими такими последовательностями. кДНК-последовательности РАРАР Было показано, что экспрессия гена РАРАР приводит к продуцированию по крайней мере одной молекулы мРНК, нуклеотидная последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1. Другим объектом настоящего изобретения является очищенная, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1; комплементарные ей последовательности, а также ее аллельные варианты и фрагменты. Кроме того, предпочтительными полинуклеотидами настоящего изобретения являются очищенные, выделенные или рекомбинантные кДНК РАРАР, состоящие или в основном состоящие из последовательности SEQ ID NO: 1, или содержащие эту последовательность. Особенно предпочтительными нуклеиновыми кислотами настоящего изобретения являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок или в основном состоящие или состоящие из непрерывного участка, охватывающего по крайней мере 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1 или комплементарной последовательности. Нуклеиновыми кислотами также являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов SEQ ID NO: 1 или комплементарной последовательности, где указанный непрерывный участок включает по крайней мере 1, 2, 3, 3 или 10 из нижеследующих нуклеотидных положений SEQ ID NO: 1: 1-140, 141-460, 460-690, 87-346 и 691-1104. Другими предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50,60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов SEQ ID NO: 1 или комплементарную последовательность, где указанный непрерывный участок охватывает биаллельный маркер. Настоящее изобретение также относится к выделенной или очищенной нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, имеющий по крайней мере 95%-ную идентичность нуклеотидов с полинуклеотидом SEQ ID NO: 1, преимущественно 99%-ную идентичность, предпочтительно 99,5%-ную идентичность, а наиболее предпочтительно 99,8%-ную идентичность нуклеотидов с полинуклеотидом SEQ IDNO: 1, или с комплементарной последовательностью, или с ее биологически активным фрагментом. Другим объектом настоящего изобретения являются очищенные, выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащие полинуклеотид, который гибридизуется в вышеуказанных жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом SEQ ID NO: 1 или с комплементарной последовательностью,или с его вариантом, или с биологически активным фрагментом. кДНК SEQ ID NO: 1 включает 5'UTR-область, начинающуюся от нуклеотида в положении 1 и заканчивающуюся нуклеотидом в положении 86 SEQ ID NO: 1. кДНК SEQ ID NO: 1 включает 3'UTRобласть, начинающуюся от нуклеотида в положении 347 и заканчивающуюся нуклеотидом в положении 1104 SEQ ID NO: 1. Сигнал полиаденилирования начинается от нуклеотида в положении 1085 и заканчивается нуклеотидом в положении 1104 SEQ ID NO: 1. Следовательно, настоящее изобретение относится к очищенной, выделенной или рекомбинантой нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность 5'UTR кДНК РАРАР, комплементарную ей последовательность или ее аллельный вариант. Настоящее изобретение также относится к очищенной, выделенной или нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность 3'UTR кДНК РАРАР, комплементарную ей последовательность или ее аллельный вариант. Хотя этот раздел озаглавлен "кДНК последовательности РАРАР", однако, следует отметить, что фрагменты нуклеиновой кислоты, имеющие любой размер и любую последовательность, могут также- 11005921 охватывать описанные в этом разделе полинуклеотиды, фланкирующие геномные последовательности РАРАР на любой стороне указанных геномных последовательностей или между двумя или несколькими такими последовательностями. Кодирующие последовательности Открытая рамка считывания РАРАР содержится в соответствующей мРНК SEQ ID NO: 1. Более точно, эффективная кодирующая последовательность РАРАР (CDS) включает область, расположенную между нуклеотидом в положении 87 (первый нуклеотид кодона ATG) и нуклеотидом в положении 346(конечный нуклеотид кодона TGA) SEQ ID NO: 1. Настоящее изобретение также относится к выделенным, очищенным и рекомбинантным полинуклеотидам, кодирующим непрерывный участок по крайней мере из 6 смежных аминокислот, предпочтительно по крайней мере 8 или 10 смежных аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 смежных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 2. Вышеописанный полинуклеотид, который содержит кодирующую последовательность гена РАРАР,может быть экспрессирован в нужной клетке-хозяине или в нужном организме-хозяине при помещении этого полинуклеотида под контроль подходящих сигналов экспрессии. Сигналами экспрессии могут быть либо сигналы, содержащиеся в регуляторных областях в гене РАРАР настоящего изобретения, либо, наоборот, этими сигналами могут быть экзогенные регуляторные последовательности нуклеиновой кислоты. Такой полинуклеотид, помещаемый под контроль подходящих сигналов экспрессии, может быть также встроен в вектор для его экспрессии и/или амплификации. Регуляторные последовательности РАРАР Как упоминалось выше, геномная последовательность гена РАРАР содержит регуляторные последовательности в некодирующей 5'-фланкирующей области и в некодирующей 3'-фланкирующей области,которая граничит с кодирующей областью РАРАР, содержащей три экзона этого гена. Полинуклеотиды, происходящие от 5'- и 3'-регуляторных областей, могут быть использованы для детекции присутствия по крайней мере одной копии нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 или ее фрагмента в тестируемом образце. Промоторная активность 5'-регуляторных областей, находящихся в РАРАР, может быть оценена,как описано ниже. Для идентификации соответствующих биологически активных полинуклеотидных фрагментов или вариантов SEQ ID NO: 3 следует обратиться к книге Sambrook et al. (Sambrook, 1989), где описано использование рекомбинантного вектора, несущего маркерный ген (т.е. ген бета-галактозидазы, хлорамфениколацетилтрансферазы и т.п.), экспрессия которого может детектироваться при его помещении под контроль биологически активных полинуклеотидных фрагментов или вариантов SEQ ID NO: 3. Геномные последовательности, локализованные выше первого экзона гена РАРАР, клонировали в репортерный вектор с подходящим промотором, таким как pSEAP-основа, pSEAP-энхансер, рgаl-основа, pgalэнхансер, или в репортерные векторы с подходящим промотором, pEGFP-1, изготавливаемые Clontech,или вектор "pGL2-ocновa" или pGL3-ocнова с репортерным геном люциферазы без промотора, изготавливаемый Promega. Вкратце, каждый из этих векторов с промотором включает сайты множественного клонирования, расположенные выше репортерного гена, кодирующего легко оцениваемый белок, такой как секретированная щелочная фосфатаза, люцифераза, галактозидаза или белок, флуоресцирующий в"зеленом" диапазоне спектра. Последовательности, расположенные выше кодирующей области РАРАР,встраивают в сайты клонирования выше от репортерного гена в обеих ориентациях и вводят в соответствующую клетку-хозяина. Уровень репортерного белка анализируют и сравнивают с уровнем, полученным от вектора, у которого отсутствует вставка в сайте клонирования. Повышенный уровень экспрессии в векторе, содержащем эту вставку, по сравнению с контрольным вектором указывает на присутствие промотора в данной вставке. Если необходимо, то вышерасположенные последовательности могут быть клонированы в векторы, содержащие энхансер для повышения уровня транскрипции, осуществляемой под контролем последовательностей слабого промотора. Значительный уровень вышеуказанной экспрессии, наблюдающийся в векторе, у которого отсутствует вставка, указывает на то, что промоторная последовательность присутствует во встроенной вышерасположенной последовательности. Промоторная последовательность в вышерасположенной геномной ДНК может быть затем определена путем конструирования гнездовых 5' и/или 3' делеций в вышерасположенной ДНК с использованием стандартной техники, такой как гидролиз экзонуклеазой III или соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой. Полученные делеционные фрагменты могут быть встроены в репортерный вектор с промотором для того, чтобы определить, оказывает ли эта делеция ослабляющее или полностью ингибирующее влияние на активность промотора, такое как, например, описано в работе Coles et al. (1998), описание которой во всей своей полноте вводится в настоящую заявку посредством ссылки. Таким образом,могут быть определены границы этих промоторов. Если это необходимо, то потенциальные отдельные регуляторные сайты внутри этого промотора могут быть идентифицированы с использованием сайтнаправленного мутагенеза или линкерного сканирования либо отдельно, либо в комбинации для элиминации потенциальных сайтов связывания с факторами транскрипции внутри этого промотора. Влияние- 12005921 этих мутаций на уровни транскрипции могут быть определены путем введения мутаций в сайты клонирования в репортерные векторы с промотором. Анализы такого типа хорошо известны специалистам и описаны в WO 97/17359, в патенте США 5374544, в ЕР 582796, в патенте США 5698389, в патенте США 5643746, в патенте США 5502176 и в патенте США 5266488; описание которых во всей своей полноте вводятся в настоящую заявку посредством ссылки. Сила и специфичность промотора гена РАРАР может быть оценена по уровням экспрессии детектируемого полинуклеотида, функционально связанного с промотором РАРАР, в клетках и тканях различных типов. Детектируемый полинуклеотид может быть либо полинуклеотидом, который специфически гибридизуется с предварительно определенным олигонуклеотидным зондом, либо с полинуклеотидом, кодирующим детектируемый белок, включая полипептид РАРАР, или его фрагмент, или вариант. Этот тип анализа хорошо известен специалистам и описан в патенте США 5502176 и в патенте США 5266488, описания которых во всей своей полноте вводятся в настоящую заявку посредством ссылки. Некоторые из этих методов более подробно описаны ниже. Полинуклеотиды, несущие регуляторные элементы, локализованные у 5'-конца и у 3'-конца кодирующей области РАРАР, могут быть использованы преимущественно для регуляции транскрипционной и трансляционной активности нужного гетерологичного полинуклеотида. Таким образом, настоящее изобретение также относится к очищенной или выделенной нуклеиновой кислоте, включающей полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из 5'- и 3'-регуляторных областей, или к комплементарной последовательности, или к ее биологически активному фрагменту, или варианту. В одном из своих аспектов "5'-регуляторная область" содержит нуклеотидную последовательность, локализованную между положениями 1 и 421 SEQ ID NO: 3. В одном из аспектов настоящего изобретения "3'-регуляторная область" содержит нуклеотидную последовательность, локализованную между положениями 3040 и 3189 SEQ ID NO: 3. Настоящее изобретение также относится к очищенной или выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, имеющий по крайней мере 95%-ную идентичность нуклеотидов с полинуклеотидом SEQ ID NO: 1, выбранным из группы, состоящей из 5'- и 3'-регуляторных областей, преимущественно 99%-ную идентичность, предпочтительно 99,5%-ную идентичность, а наиболее предпочтительно 99,8%-ную идентичность с полинуклеотидом SEQ ID NO: 1, выбранным из группы, состоящей из 5'- и 3'регуляторных областей, или с комплементарной последовательностью, или его биологически активным фрагментом. Другим объектом настоящего изобретения является очищенная или выделенная нуклеиновая кислота, содержащая полинуклеотид, который гибридизуется в описанных здесь жестких условиях гибридизации, описанных выше, с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 5'- и 3'-регуляторных областей, или с комплементарной последовательностью, или с его вариантом, или биологически активным фрагментом. Предпочтительные фрагменты 5'-регуляторной области имеют длину примерно 1500 или 1000 нуклеотидов, а предпочтительно примерно 500 нуклеотидов, более предпочтительно примерно 400 нуклеотидов, еще более предпочтительно 300 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно примерно 200 нуклеотидов. Предпочтительные фрагменты 3'-регуляторной области имеют длину по крайней мере 50, 100, 150,200, 300 или 400 оснований."Биологически активными" производными полинуклеотидов SEQ ID NO: 3 являются полинуклеотиды, содержащие фрагмент, или, альтернативно, содержащиеся во фрагменте указанного полинуклеотида, который является функциональной регуляторной областью, контролирующей экспрессию рекомбинантного полипептида или рекомбинантного полинуклеотида в рекомбинантной клетке-хозяине. Он может действовать как энхансер или как репрессор. В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота или полинуклеотид является"функциональными" в качестве регуляторной области, контролирующей экспрессию рекомбинантного полипептида или рекомбинантного полинуклеотида, в том случае, если указанный регуляторный полинуклеотид имеет нуклеотидные последовательности, которые содержат транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, и такие последовательности являются "функционально присоединенными" к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют нужный полипептид или нужный полинуклеотид. Регуляторные полинуклеотиды настоящего изобретения могут быть получены из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 путем расщепления подходящими рестриктирующими ферментами, как описано, например, в книге Sambrook et al. (1989). Регуляторные полинуклеотиды могут быть также получены путем гидролиза SEQ ID NO: 3 ферментом экзонуклеазой, такой как Ва 131 (Wabiko et al., 1986). Эти регуляторные полинуклеотиды могут быть также получены путем химического синтеза нуклеиновых кислот, как описано в настоящей заявке. Регуляторные полинуклеотиды настоящего изобретения могут быть частью рекомбинантного экспрессирующего вектора, который может быть использован для экспрессии кодирующей последовательности в нужной клетке-хозяине или в организме-хозяине. Рекомбинантные экспрессирующие векторы- 13005921 настоящего изобретения описаны в настоящей заявке. Предпочтительно 5'-регуляторный полинуклеотид настоящего изобретения включает 5'-нетранслируемую область (5'UTR) кДНК РАРАР, или ее биологически активный фрагмент, или вариант. Предпочтительно 3'-регуляторный полинуклеотид настоящего изобретения включает 3'-нетранслируемую область (3'UTR) кДНК РАРАР, или ее биологически активный фрагмент, или вариант. Другим объектом настоящего изобретения является очищенная или выделенная нуклеиновая кислота, включающаяa) нуклеиновую кислоту, содержащую регуляторную нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из(i) нуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотид 5'-регуляторной области, или комплементарной ей последовательности;(ii) нуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотид, имеющий по крайней мере 95%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью 5'-регуляторной области, или комплементарной ей последовательности;(iii) нуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с нуклеотидной последовательностью 5'-регуляторной области, или с комплементарной последовательностью; и(iv) биологически активного фрагмента или варианта полинуклеотидов в (i), (ii) и (iii);b) полинуклеотид, кодирующий нужный полипептид или нужную нуклеиновую кислоту и функционально присоединенный к нуклеиновой кислоте, определенной выше в (а); с) необязательно, нуклеиновую кислоту, содержащую 3'-регуляторный полинуклеотид, предпочтительно 3'-регуляторный полинуклеотид гена РАРАР. В конкретном варианте определенной выше нуклеиновой кислоты указанная нуклеиновая кислота включает 5'-нетранслируемую область (5'UTR) кДНК РАРАР, или ее биологически активный фрагмент,или вариант. Во втором конкретном варианте определенной выше нуклеиновой кислоты, указанная нуклеиновая кислота включает 3'-нетранслируемую область (3'UTR) кДНК РАРАР, или ее биологически активный фрагмент, или вариант. Регуляторный полинуклеотид 5'-регуляторной области или его биологически активные фрагменты или варианты функционально присоединены у 5'-конца полинуклеотида, кодирующего нужный полипептид или полинуклеотид. Регуляторный полинуклеотид 3'-регуляторной области или его биологически активные фрагменты или варианты функционально присоединены преимущественно у 3'-конца полинуклеотида, кодирующего нужный полипептид или полинуклеотид. Нужный полипептид, кодируемый вышеописанной нуклеиновой кислотой, может иметь любую природу или любое происхождение, включая белки прокариотов или эукариотов. Полипептидами, экспрессируемыми под контролем регуляторной области РАРАР, являются бактериальные, грибковые или вирусные антигены. Такие полипептиды также охватывают эукариотические белки, такие как внутриклеточные белки, например белки "домашнего хозяйства", мембрано-ассоциированные белки, такие как рецепторы, и секретированные белки, например эндогенные медиаторы, такие как цитокины. Нужным полипептидом может быть белок РАРАР, а в частности белок аминокислотной последовательности SEQ IDNO: 2, или ее фрагмент, или вариант. Нужные нуклеиновые кислоты, кодируемые вышеуказанным полинуклеотидом, обычно РНКмолекула, могут быть комплементарны нужному кодирующему полинуклеотиду, например РАРАРкодирующей последовательности, а поэтому они могут быть использованы в качестве антисмыслового полинуклеотида. Такой полинуклеотид может быть включен в рекомбинантный экспрессирующий вектор для экспрессии нужного полипептида или нужной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине или организмехозяине. Подходящие рекомбинантные векторы, которые содержат определенный здесь полинуклеотид,описаны в других разделах настоящей заявки. Полинуклеотидные конструкции Используемые здесь термины "полинуклеотидная конструкция" и "рекомбинантный полинуклеотид" являются взаимозаменяемыми и означают линейный или кольцевой, очищенный или выделенный полинуклеотид, который был искусственно сконструирован и который содержит по крайней мере две нуклеотидных последовательности, не являющиеся смежными нуклеотидными последовательностями в их природном окружении. ДНК-конструкция, которая регулирует временную и пространственную экспрессию гена РАРАР в рекомбинантных клетках-хозяевах и в трансгенных животных Для исследования физиологических и фенотипических последствий отсутствия синтеза белка РАРАР как на клеточном уровне, так и в многоклеточном организме, настоящее изобретение также охватывает ДНК-конструкции и рекомбинантные векторы, обеспечивающие зависимую от внешних условий экспрессию специфического аллеля геномной последовательности или кДНК-последовательности гена- 14005921 РАРАР, а также копии этой геномной последовательности или кДНК, имеющей замены, делеции или добавления одного или нескольких оснований, по сравнению с нуклеотидной последовательностью РАРАР SEQ ID NO: 1 и 3, или ее фрагментом, где указанные замены, делеции или добавления оснований имеются либо в экзоне, либо в интроне, либо в регуляторной последовательности, но предпочтительно в 5'-регуляторной последовательности, или в экзоне геномной последовательности РАРАР, или в кДНК РАРАР SEQ ID NO: 1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность РАРАР содержит биаллельный маркер. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам, содержащим любой из полинуклеотидов, описанных в настоящем изобретении. Более конкретно, полинуклеотидные конструкции настоящего изобретения могут включать любой полинуклеотид, описанный в разделах "Геномные последовательности гена РАРАР", "кДНК-последовательности РАРАР", "Кодирующие области" и "Олигонуклеотидные зонды и праймеры". Первая предпочтительная ДНК-конструкция основана на опероне резистентности к тетрациклинуtet, происходящем от транспозона Tn10 E.coli и используемом для регуляции экспрессии гена РАРАР,как описано Gossen et al. (1992, 1995) и Furth et al. (1994). Такая ДНК-конструкция содержит семь операторных последовательностей tet от Tn10 (tetop), которые присоединены либо к минимальному промотору, либо к 5'-регуляторной последовательности гена РАРАР, где указанный минимальный промотор или указанная регуляторная последовательность гена РАРАР функционально присоединена к нужному полинуклеотиду, который кодирует смысловой или антисмысловой олигонуклеотид, или полипептид, включая полипептид РАРАР или его пептидный фрагмент. Эта ДНК-конструкция является функциональной в отношении зависимой от внешних условий экспрессии нужной нуклеотидной последовательности в том случае, когда та же самая клетка также содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую репрессор дикого типа (tTA) или мутантный репрессор (rТА), присоединенный к активирующему домену вирусного белка VP16 вируса простого герпеса, находящемуся под контролем промотора, такого как энхансер/промотор HCMVIE1 MMTV-LTR. Действительно, предпочтительная ДНК-конструкция настоящего изобретения включает полинуклеотид, содержащий последовательности оператора tet, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую репрессор tTA или rТА. В конкретном варианте осуществления изобретения ДНК-конструкция с зависимой от внешних условий экспрессией содержит последовательность, кодирующую мутантный тетрациклиновый репрессорrТА, где экспрессия нужного полинуклеотида не происходит в отсутствие тетрациклина и индуцируется в его присутствии. ДНК-конструкции, способствующие гомологичной рекомбинации: векторы замещения Вторая предпочтительная ДНК-конструкция содержит от 5'-конца до 3'-конца (а) первую нуклеотидную последовательность, которая содержится в геномной последовательности РАРАР; (b) нуклеотидную последовательность, содержащую маркер позитивного отбора, такой как маркер резистентности к неомицину (nео); и (с) вторую нуклеотидную последовательность, которая находится в геномной последовательности РАРАР и расположена на геноме ниже первой нуклеотидной последовательности РАРАР (а). В предпочтительном варианте осуществления изобретения, эта ДНК-конструкция также включает маркер негативного отбора, расположенный выше нуклеотидной последовательности (а) или ниже нуклеотидной последовательности (с). Маркер негативного отбора предпочтительно содержит ген тимидинкиназы (tk) (Thomas et al., 1986), ген гигромицина-бета (Те Riele et al., 1990), ген hprt (Van der Lugt et al.,1991; Reid et al., 1990) или ген фрагмента дифтерийного токсина A (Dt-A) (Nada et al., 1993; Yagi et al.,1990). Маркер позитивного отбора предпочтительно локализован в последовательности экзона РАРАР так, что он прерывает последовательность, кодирующую белок РАРАР. Эти векторы замещения описаны, например, Thomas et al. (1986; 1987), Mansour et al. (1988) и Roller et al. (1992). Первая и вторая нуклеотидные последовательности (а) и (с) могут быть независимо локализованы в регуляторной последовательности РАРАР, в интронной последовательности, в экзонной последовательности или в последовательности, содержащей регуляторную, и/или интронную, и/или экзонную последовательности. Размер нуклеотидных последовательностей (а) и (с) составляет в пределах от 1 до 50 т.п.н.,предпочтительно от 1 до 10 т.п.н., более предпочтительно от 2 до 6 т.п.н., а наиболее предпочтительно от 2 до 4 т.п.н. ДНК-конструкции, способствующие гомологичной рекомбинации: система Cre-loxP Эти новые ДНК-конструкции позволяют использовать сайт-специфическую рекомбинантную систему фага Р 1. Этот фаг Р 1 имеет рекомбиназу, обозначенную Сrе, которая специфически взаимодействует с 34 парами оснований сайта lохР. Сайт lохР состоит из двух палиндромных последовательностей в 13 п.н., разделенных консервативной последовательностью в 8 п.н. (Hoess et al., 1986). Рекомбинация под действием фермента Сrе между двумя сайтами lохР, имеющими идентичную ориентацию, приводит к делеции ДНК-фрагмента. Система Cre-loxP, используемая в комбинации с техникой гомологичной рекомбинации, была впервые описана Gu et al. (1993, 1994). Вкратце, нужная нуклеотидная последовательность, встраиваемая в нужное положение генома, имеет по крайней мере два сайта lохР в той же самой ориентации и расположена у соответствующих концов нуклеотидной последовательности, вырезаемой из рекомбинантного- 15005921 генома. Для такого вырезания требуется присутствие фермента рекомбиназы (Сrе) в ядре рекомбинантной клетки-хозяина. Фермент рекомбиназа может "запускаться" в нужное время либо посредством (а) инкубирования рекомбинантных клеток-хозяев в культуральной среде, содержащей этот фермент, путем инъекции фермента Сrе непосредственно в нужную клетку, как описано Araki et al. (1995), либо путем липофекции этого фермента в клетки, как описано Baubonis et al. (1993); (b) трансфекции клетки-хозяина вектором, содержащим последовательность, кодирующую Сrе и функционально присоединенную к промотору, являющемуся функциональным в рекомбинантной клетке-хозяине и необязательно индуцибельным, где указанный вектор вводят в рекомбинантную клетку-хозяина, как описано Gu et al. (1993) иSauer et al. (1988); (с) введения в геном клетки-хозяина полинуклеотида, содержащего последовательность, кодирующую Сrе и функционально присоединенную к промотору, являющемуся функциональным в рекомбинантной клетке-хозяине и необязательно индуцибельным, где указанный полинуклеотид встраивают в геном клетки-хозяина либо путем произвольной инсерции, либо гомологичной рекомбинации, как описано Gu et al. (1994). В конкретном варианте осуществления изобретения вектор, содержащий последовательность,встраиваемую в ген РАРАР путем гомологичной рекомбинации, конструируют так, чтобы селективные маркеры были фланкированы сайтами lохР в той же самой ориентации, если это возможно, путем обработки ферментом Сrе для элиминации селективных маркеров, еще присутствующих в нужных последовательностях РАРАР, которые были инсертированы путем гомологичной рекомбинации. И в этом случае необходимы два селективных маркера: маркер позитивного отбора для отбора на событие рекомбинации и маркер негативного отбора для отбора на событие гомологичной рекомбинации. Векторы и методы с использованием системы Сrе-lохР описаны Zou et al. (1994). Таким образом, третья предпочтительная ДНК-конструкция включает от 5'-конца до 3'-конца: (а) первую нуклеотидную последовательность, которая содержится в геномной последовательности РАРАР;(b) нуклеотидную последовательность, содержащую полинуклеотид, кодирующий маркер позитивного отбора, где указанная нуклеотидная последовательность содержит две дополнительные последовательности, определяющие сайт, распознаваемый рекомбиназой, такой как сайт lохР, причем два этих сайта находятся в одной и той же ориентации; и (с) вторую нуклеотидную последовательность, которая находится в геномной последовательности РАРАР и расположена на геноме ниже первой нуклеотидной последовательности РАРАР (а). Последовательности, определяющие сайт, распознаваемый рекомбиназой, такой как сайт lохР,предпочтительно локализованы в нуклеотидной последовательности (b) в подходящих положениях,фланкирующих нуклеотидную последовательность, которая должна быть вырезана в зависимости от окружающих условий. В одном из вариантов осуществления изобретения два сайта lохР локализованы с каждой стороны последовательности маркера позитивного отбора так, чтобы ее вырезание происходило в нужное время после события гомологичной рекомбинации. В предпочтительном варианте способа, предусматривающего использование третьей ДНКконструкции, описанной выше, вырезание полинуклеотидного фрагмента, фланкированного двумя сайтами, распознаваемыми рекомбиназой, предпочтительно двумя сайтами lохР, осуществляется в нужное время, благодаря присутствию в геноме рекомбинантной клетки-хозяина последовательности, кодирующей фермент Сrе, функционально присоединенный к промоторной последовательности, а предпочтительно к индуцибельному промотору, более предпочтительно к тканеспецифической промоторной последовательности, а наиболее предпочтительно к промоторной последовательности, которая является индуцибельной и тканеспецифической, как описано Gu et al. (1994). Присутствие фермента Сrе в геноме рекомбинантной клетки-хозяина может быть результатом скрещивания двух трансгенных животных, первого трансгенного животного, несущего нужную последовательность, происходящую от РАРАР и содержащую сайты lохР, как описано выше, и второго трансгенного животного, несущего последовательность, кодирующую Сrе и функционально присоединенную к подходящей промоторной последовательности, как описано Gu et al. (1994). Пространственно-временная регуляция экспрессии фермента Сrе может быть также достигнута с использованием вектора на основе аденовируса, содержащего ген Сrе, который позволяет инфицировать клетки или in vivo инфицировать органы для доставки фермента Сrе, как описано AntonGraham (1995) и Kanegae et al. (1995). ДНК-конструкции, описанные выше, могут быть использованы для введения нужной нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, предпочтительно геномной последовательности РАРАР или кДНК-последовательности РАРАР, а наиболее предпочтительно модифицированной копии геномной или кДНК-последовательности РАРАР в заранее определенное положение в целевом геноме, что приводит к генерированию модифицированной копии целевого гена ("отключения" гомологичной рекомбинации) или к замене копии нужного гена другой копией, в достаточной степени гомологичной для того,чтобы происходило событие гомологичной рекомбинации ("включения" гомологичной рекомбинации). В конкретном варианте осуществления изобретения ДНК-конструкции, описанные выше, могут быть использованы для введения геномной последовательности РАРАР или кДНК-последовательности РАРАР,включающей по крайней мере один биаллельный маркер.- 16005921 Ядерные антисмысловые ДНК-конструкции Другие композиции, содержащие вектор настоящего изобретения, включающий олигонуклеотидный фрагмент нуклеотидной последовательности кДНК SEQ ID NO, предпочтительно фрагмент, включающий старт-кодон гена РАРАР, могут быть использованы в качестве антисмысловой последовательности, которая ингибирует экспрессию соответствующего гена РАРАР. Предпочтительными методами с использованием антисмыслового полинуклеотида настоящего изобретения являются процедуры, описанные Sczakiel et al. (1995), или процедуры, описанные в заявке РСТWO 95/24223, описание которых во всей своей полноте вводится в настоящую заявку посредством ссылки. Антисмысловые последовательности предпочтительно выбирают из полинуклеотидов (длиной 15200 п.н.), комплементарных 5'-концу мРНК РАРАР. В одном из вариантов осуществления изобретения используется комбинация различных антисмысловых полинуклеотидов, комплементарных различным частям нужного гена. Предпочтительные антисмысловые полинуклеотиды настоящего изобретения комплементарны последовательности мРНК РАРАР, которая содержит либо кодон инициации трансляции ATG, либо сайт сплайсинга. Другие предпочтительные антисмысловые полинуклеотиды настоящего изобретения комплементарны сайту сплайсинга мРНК РАРАР. Антисмысловые полинуклеотиды настоящего изобретения предпочтительно имеют сигнал 3'полиаденилирования, который был заменен саморасщепляющейся последовательностью рибозима так,чтобы транскрипты РНК-полимеразы II продуцировались без poly(А) на своих 3'-концах, причем эти антисмысловые полинуклеотиды неспособны транспортироваться из ядра, как описано Liu et al. (1994). В предпочтительном варианте осуществления изобретения эти антисмысловые полинуклеотиды РАРАР также включают в кластере рибозима гистонную структуру "стебель-петля" для стабилизации расщепленных транскриптов в целях их защиты от 3'-5'-экзонуклеолитического расщепления, например структуру, описанную Eckner et al. (1991). Олигонуклеотидные зонды и праймеры Полинуклеотиды, происходящие от гена РАРАР, могут быть использованы для детекции присутствия, по крайней мере, копии нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или 3, или ее фрагмента,комплемента или варианта в тестируемом образце. Особенно предпочтительными зондами и праймерами настоящего изобретения являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 3 или комплементарные последовательности. Зондами и праймерами также являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов SEQ ID NO: 3 или его комплементарные последовательности, где указанный непрерывный участок включает нуклеотид, по крайней мере один из нижеследующих нуклеотидов в положениях SEQ ID NO: 3: 1-3038, 1-421, 422-557, 2158-2218 и 2620-3039. Другими предпочтительными зондами и праймерами настоящего изобретения являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50,60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов SEQ ID NO: 1 или ее комплементарной последовательности. Другими предпочтительными зондами и праймерами настоящего изобретения являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов SEQ ID NO: 1 или ее комплементарной последовательности, где указанный непрерывный участок содержит нуклеотид по крайней мере в одном из нижеследующих положений последовательности SEQ ID NO: 1: 1-140, 141-460, 460-690, 87-346 и 691-1104. Таким образом, настоящее изобретение также относится к нуклеиновокислотным зондам, отличающимся тем, что они специфически гибридизуются в описанных выше жестких условиях гибридизации с нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностейSEQ ID NO: 1 и 3, или их вариантов, или их комплементарных последовательностей. В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение охватывает выделенные, очищенные и рекомбинантные полинуклеотиды, состоящие или в основном состоящие из непрерывного участка, охватывающего 8-50 смежных нуклеотидов любой из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3 и их комплементов, где указанный непрерывный участок включает РАРАР-ассоциированный биаллельный маркер в указанной последовательности или биаллельный маркер неравновесности по сцеплению с РАРАР и где указанный непрерывный участок имеет, но необязательно, длину в 18-35 смежных нуклеотидов, а указанный биаллельный маркер находится на расстоянии 4 нуклеотидов от центра указанного полинуклеотида, где указанный полинуклеотид необязательно состоит из указанного непрерывного участка и указанный непрерывный участок имеет длину в 25 смежных нуклеотидов, а указанный биаллельный маркер находится в центре указанного полинуклеотида; при этом, необязательно, 3'-конец указанного непрерывного участка расположен у 3'-конца указанного полинуклеотида и, необязательно, 3'-конец указанного непрерывного участка локализован у 3'-конца указанного полинуклеотида, а указанный биал- 17005921 лельный маркер расположен у 3'-конца указанного полинуклеотида. В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение охватывает выделенные, очищенные и рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок или состоящие или в основном состоящие из указанного непрерывного участка, охватывающего 8-50 смежных нуклеотидов любой последовательности SEQ ID NO: 1, 3 или их комплементов, где 3'-конец указанного непрерывного участка расположен у 3'-конца указанного полинуклеотида и где 3'-конец указанного полинуклеотида локализован в области в 20 нуклеотидов, расположенных выше РАРАР-ассоциированного биаллельного маркера в указанной последовательности, или биаллельного маркера неравновестности по сцеплению с РАРАР. В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение охватывает полинуклеотиды, используемые в гибридизационных анализах, секвенирующих анализах и в ферментативных анализах, проводимых для детекции несоответствия оснований в целях определения идентичности нуклеотидов в РАРАР-ассоциированном биаллельном маркере в SEQ ID NO: 1, 3 или в комплементарных последовательностях; а также полинуклеотиды, используемые для амплификации сегментов нуклеотидов, содержащих РАРАР-ассоциированный биаллельный маркер в SEQ ID NO: 1, 3 или в комплементарных последовательностях. Настоящее изобретение относится к использованию полинуклеотидов настоящего изобретения для определения идентичности нуклеотидов в РАРАР-ассоциированном биаллельном маркере, предпочтительно в гибридизационных анализах, секвенирующих анализах, микросеквенирующих анализах или в ферментативных анализах, проводимых для детекции несоответствия оснований и для амплификации сегментов нуклеотидов, содержащих РАРАР-ассоциированный биаллельный маркер. Зонд или праймер настоящего изобретения имеет длину от 8 до 1000 нуклеотидов, или, в частности,длину по крайней мере в 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 нуклеотидов. Более конкретно, длина этих зондов и праймеров может составлять в пределах от 8, 10, 15, 20 или 30 до 100 нуклеотидов, а предпочтительно от 10 до 50, а более предпочтительно от 15 до 30 нуклеотидов. Более короткие зонды и праймеры имеют тенденцию к потере специфичности по отношению к последовательности-мишени нуклеиновой кислоты и обычно требуют более низких температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Более длинные зонды и праймеры являются дорогостоящими, и иногда они могут подвергаться самогибридизации с образованием "шпилечных" структур. Подходящая длина праймеров и зондов в конкретной совокупности аналитических условий может быть определена эмпирически самим специалистом. Образование стабильных гибридов зависит от температуры плавления (Тm) ДНК. Тm зависит от длины праймера или зонда, ионной силы раствора и содержания G+C. Чем выше содержание G+C в праймере или зонде, тем выше температура плавления, поскольку пары G:C имеют три водородных связи, а пары А:Т имеют только две связи. Содержание GC в зондах настоящего изобретения обычно составляет в пределах от 10 до 75%, предпочтительно от 35 до 60%, а более предпочтительно от 40 до 55%. Указанные праймеры и зонды могут быть получены любым подходящим методом, включая, например, клонирование и рестрикцию соответствующих последовательностей и прямой химический синтез,например, фосфодиэфирным методом Narang et al. (1979), фосфодиэфирным методом Brown et al. (1979),диэтилфосфорамидитным методом Beaucage et al. (1981) и методом с использованием твердого носителя,описанным в ЕР 0707592. Детектирующими зондами обычно являются последовательности нуклеиновой кислоты или незаряженные аналоги нуклеиновой кислоты, такие как, например, пептидсодержащие нуклеиновые кислоты, описанные в международной патентной заявке WO 92/20702, и морфолиновые аналоги, описанные в патентах США 5185444, 5034506 и 5142047. Этот зонд можно сделать "неудлиняемым" так, чтобы к этому зонду не могли добавляться другие dNTP. Сами аналоги как внутри, так и снаружи, обычно не удлиняются, а нуклеиновокислотные зонды могут быть сделаны неудлиняемыми путем модификации 3'конца зонда так, чтобы гидроксильная группа не могла больше участвовать в удлинении. Например, 3'конец зонда может быть функционализирован захватывающей или детектирующий меткой так, чтобы, он мог захватывать или как-либо иначе блокировать гидроксильную группу. Альтернативно, 3'гидроксильная группа может быть просто отщеплена, заменена или модифицирована, причем в заявке на патент США, peг.07/049061, поданной 19 апреля 1993 г., описаны модификации, которые могут быть использованы для создания "неудлиняемого" зонда. Любой из полинуклеотидов настоящего изобретения может быть помечен, если это необходимо,путем включения любой метки, известной специалистам и определяемой спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими или химическими методами. Так, например, подходящими метками являются радиоактивные вещества (включая 32 Р, 35S, 3H, 12I), флуоресцентные красители (включая 5-бромдезоксиуридин, флуоресцеин, ацетиламинофлуорен, дигоксигенин) или биотин. Полинуклеотиды предпочтительно метят у 3'- и 5'-концов. Примерами методов нерадиоактивного мечения фрагментов нуклеиновой кислоты являются методы, описанные в патенте ФранцииFR-7810975, илиUrdea et al. (1988), или Sanchez-Pescador et al. (1988). Кроме того, зонды настоящего изобретения могут иметь структурные свойства, которые позволяют осуществлять амплификацию сигнала, причем такими- 18005921 структурными свойствами обладают, например, разветвленные ДНК-зонды, описанные Urdea et al., 1991 или в европейском патентеЕР 0225807 (Chiron). Метка может быть также использована для захвата праймера в целях облегчения иммобилизации либо праймера, либо продукта удлинения праймера, такого как амплифицированная ДНК, на твердом носителе. Метка-ловушка присоединяется к праймерам или зондам и может специфически связываться с членом, который образует пару связывания с членом, специфически связывающимся с твердофазным реагентом (например, с биотином и стрептавидином). Поэтому в зависимости от типа метки, которую несет полинуклеотид или зонд, она может быть использована для захвата или для детекции ДНКмишени. Кроме того, следует отметить, что описанные здесь полинуклеотиды, праймеры или зонды сами могут служить меткой-ловушкой. Так, например, в случае, когда членом, связывающимся с твердофазным реагентом, является последовательность нуклеиновой кислоты, то она может быть выбрана так,чтобы она связывалась с комплементарной частью праймера или зонда и, тем самым, иммобилизировала праймер или зонд на твердой фазе. В случаях, когда сам полинуклеотидный зонд служит связывающим членом, для каждого специалиста очевидно, что этот зонд будет содержать последовательность или"хвост", которые не являются комплементарными данной мишени. В случае, когда сам полинуклеотидный праймер служит меткой-ловушкой, то по крайней мере часть этого праймера будет свободно гибридизоваться с нуклеиновой кислотой на твердой фазе. Техника мечения ДНК хорошо известна специалистам. Зонды настоящего изобретения могут быть использованы в различных целях. А именно, они могут быть использованы в Саузерн-гибридизации с геномной ДНК. Эти зонды могут быть также использованы для детекции продуктов ПЦР-амплификации. Они могут быть также использованы для детекции несоответствий в гене РАРАР или мРНК с использованием другой техники. Любой из полинуклеотидов, праймеров и зондов настоящего изобретения может быть соответствующим образом иммобилизован на твердом носителе. Твердые носители известны специалистам, и ими являются стенки лунок реакционного планшета, тест-пробирки, полистироловые сферы, магнитные сферы, нитроцеллюлозные полоски, мембраны, микрочастицы, такие как латексные частицы, бараньи эритроциты (или эритроциты других животных), дурациты и т.п. Выбор твердого носителя не играет решающей роли и может быть осуществлен по усмотрению специалиста. Таким образом, наиболее подходящими примерами являются латексные частицы, микрочастицы, магнитные или немагнитные сферы, мембраны, пластиковые пробирки, стенки лунок для микротирования, стекло или кремниевые чипы, бараньи эритроциты (или эритроциты других животных) и дурациты. Подходящими методами иммобилизации нуклеиновых кислот на твердых фазах являются ионные, гидрофобные, ковалентные взаимодействия и т.п. Используемый здесь термин "твердый носитель" означает любой материал, который является нерастворимым или который может быть сделан нерастворимым в результате последующей реакции. Этот твердый носитель может быть выбран так, чтобы он обладал присущей ему способностью захватывать и иммобилизировать захваченный реагент. Альтернативно, твердая фаза может удерживать дополнительный рецептор, который способен захватывать и иммобилизовывать захваченный реагент. Таким дополнительным рецептором может быть заряженное вещество, которое имеет заряд, противоположный заряду самого захватываемого реагента, или заряженное вещество, конъюгированное с захватываемым реагентом. В еще одном альтернативном способе молекулой рецептора может быть любой специфически связывающийся член, который иммобилизован на твердом носителе (присоединен к твердому носителю) и который способен иммобилизировать захваченный реагент посредством реакции специфического связывания. Молекула рецептора способна опосредованно связывать захваченный реагент с твердым носителем перед проведением анализа или в процессе проведения анализа. Так, например, твердой фазой может быть пластик, дериватизированный пластик, магнитный или немагнитный металл, стеклянная или кремниевая поверхность тест-пробирки, микротитрационные лунки, листы, сферы, микрочастицы, чипы,бараньи эритроциты (или эритроциты других животных), дурациты и другие конфигурации, известные специалистам. Полинуклеотиды настоящего изобретения могут быть присоединены к твердому носителю или иммобилизованы на твердом носителе отдельно или группами, состоящими по крайней мере из 2,5, 8, 10, 12, 15, 20 или 25 различных полинуклеотидов настоящего изобретения на одном твердом носителе. Кроме того, полинуклеотиды, не являющиеся полинуклеотидами настоящего изобретения, могут быть присоединены к тому же самому твердому носителю таким же образом, как один или несколько полинуклеотидов настоящего изобретения. Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу детекции присутствия нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид SEQ ID NO: 1 или 3, его фрагмент или вариант и комплементарную последовательность, в образце, где указанный способ включает следующие стадии:a) контактирования нуклеиновокислотного зонда или множества нуклеиновокислотных зондов, которые могут гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, включенной в нуклеиновую кислотуb) детекции гибридного комплекса, образовавшегося между зондом и нуклеиновой кислотой в данном образце.- 19005921 Кроме того, настоящее изобретение относится к набору для детекции присутствия нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или 3, ее фрагмент или вариант, и комплементарную последовательность в образце, где указанный набор включаетa) нуклеиновокислотный зонд или множество нуклеиновокислотных зондов, которые могут гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, включенной в нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 1 или 3, или с ее фрагментом, или вариантом и комплементарной последовательностью, иb) необязательно, реагенты, необходимые для осуществления реакции гибридизации. В первом предпочтительном варианте изобретения, относящемся к способу детекции и к набору,указанный нуклеиновокислотный зонд или множество нуклеиновокислотных зондов метят детектируемой молекулой. Во втором предпочтительном варианте изобретения, относящемся к способу детекции и к набору, указанный нуклеиновокислотный зонд или множество нуклеиновокислотных зондов иммобилизуют на субстрате. Олигонуклеотидные массивы Субстрат, содержащий множество олигонуклеотидных праймеров или зондов настоящего изобретения, может быть использован для детекции или амплификации нужных последовательностей в гене РАРАР, и он может быть также использован для детекции мутаций в кодирующих или в некодирующих последовательностях гена РАРАР. Любой описанный здесь полинуклеотид может быть присоединен в перекрывающихся областях или в произвольных участках к твердому носителю. Альтернативно, полинуклеотиды настоящего изобретения могут быть присоединены в упорядоченных массивах, где каждый полинуклеотид присоединен в том месте твердого носителя, которое не перекрывается с местом присоединения любого другого полинуклеотида. Предпочтительно такой упорядоченный массив полинуклеотидов называют "адресуемым",где различные местоположения регистрируются и могут быть использованы как часть аналитической процедуры. Массивы адресуемых полинуклеотидов обычно содержат множество различных олигонуклеотидных зондов, которые связываются с поверхностью субстрата в различных известных положениях. Знание точного положения каждого полинуклеотида дает возможность использовать эти "адресуемые" массивы в гибридизационных анализах. Для полинуклеотидов настоящего изобретения может быть применен любой известный метод с использованием адресуемых массивов. Одним из конкретных вариантов таких полинуклеотидых массивов является массив, известный как Genechips, который, в основном,описан в патенте США 5143854; в публикациях РСТ WO 90/15070 и 92/10092. В основном, эти массивы могут быть продуцированы методами механического синтеза или прямого светонаправленного синтеза, которые представляют собой комбинацию фотолитографических методов и твердофазного синтеза олигонуклеотидов (Fodor et al., 1991). Иммобилизация массивов олигонуклеотидов на твердых носителях стала возможной благодаря разработке технологии, обычно идентифицируемой как "Крупномасштабный синтез иммобилизованных полимеров" ("Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis") (VLSIPS), в котором зонды обычно иммобилизованы в массиве высокой плотности на твердой поверхности чипа. Примеры VLSIPS представлены в патентах США 5143854 и 5412087 и в публикациях РСТ WO 90/15070, WO 92/10092 и WO 95/11995, где описаны методы формирования олигонуклеотидных массивов с использованием такой техники, как светонаправленный синтез. При разработке стратегий для получения массивов олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердых носителях, в попытке максимизировать уровни гибридизации и информации о последовательностях были разработаны дополнительные стратегии представления для упорядочения и отображения массивов на чипах. Примеры таких стратегий представления описаны в публикациях РСТ WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 и WO 97/31256,описания которых во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В другом варианте олигонуклеотидных массивов настоящего изобретения матрица олигонуклеотидных зондов может быть преимущественно использована для детекции мутаций, присутствующих в гене РАРАР, а предпочтительно в его регуляторной области. Для этих конкретных целей специально конструировали зонды, имеющие последовательность, позволяющую им гибридизоваться с генами, которые несут известные мутации (делецию, инсерцию или замену одного или нескольких нуклеотидов). Термин "известные мутации" означает мутации в гене РАРАР, который был идентифицирован, например, методом, использованным Huang et al. (1996) или Samson et al. (1996). Другим методом, который применяется для детекции мутаций в гене РАРАР, является использование ДНК-массивов высокой плотности. Каждый олигонуклеотидный зонд, составляющий единичный элемент ДНК-массива высокой плотности, был сконструирован так, чтобы он соответствовал специфической последовательности геномной ДНК или кДНК РАРАР. Таким образом, массив, состоящий из олигонуклеотидов, комплементарных подпоследовательностям последовательности гена-мишени, используется для определения идентичности последовательности-мишени с последовательностью гена дикого типа в целях измерения его количества и детекции различий между последовательностью-мишенью и сравниваемой последовательностью гена РАРАР дикого типа. В одну такую конструкцию, обозначенную 4L-массивом "черепичного" типа, введена серия из четырех зондов (А, С, G, Т), а предпочтительно 15-нуклеотидные олигонуклеотиды. В каждой серии из четырех зондов абсолютный комплемент будет гибридизоваться более сильно, чем зонды с несоответствиями. Затем нуклеиновокислотную мишень- 20005921 длиной L сканируют на мутации с использованием массива "черепичного" типа, содержащего 4L-зонды,где весь набор зондов имеет все возможные мутации в известной эталонной последовательности. Гибридизационные сигналы от серии 15-мерного зонда "черепичного" массива искажаются изменением лишь одного основания в последовательности-мишени. В результате этого происходит характерная потеря сигнала или "футпринт" для зондов, фланкирующих положение мутации. Эта техника описана Chee et al.,1996. Таким образом, настоящее изобретение относится к массиву молекул нуклеиновой кислоты, содержащей по крайней мере один полинуклеотид, описанный выше и используемый в качестве зонда или праймера. В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к массиву молекул нуклеиновой кислоты, содержащей по крайней мере два полинуклеотида, описанные выше и используемые в качестве зондов или праймеров. Белки и полипептидные фрагменты РАРАР Используемый здесь термин "полипептиды РАРАР" охватывает все белки и полипептиды настоящего изобретения. Частью настоящего изобретения также являются полипептиды, кодируемые полинуклеотидами настоящего изобретения, а также гибридные полипептиды, содержащие указанные полипептиды. Настоящее изобретение относится к человеческим белкам РАРАР, включая выделенные или очищенные белки РАРАР, состоящие из или в основном состоящие из последовательности SEQ ID NO: 2,или содержащие эту последовательность. Как описано в настоящей заявке, авторами настоящего изобретения было продемонстрировано, что белок РАРАР ассоциирован с белком или пептидом g34872, который рассматривается как фактор генетической предрасположенности к шизофрении и биполярным нарушениям, а также к родственным нарушениям ЦНС. Настоящее изобретение относится к полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или 3, или комплементарной последовательностью, или ее фрагментом. Настоящее изобретение относится к выделенным, очищенным рекомбинантным полипептидам, содержащим непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 смежных аминокислот SEQ ID NO: 2. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанный непрерывный участок из смежных аминокислот содержит сайт мутации или функциональной мутации,включая делецию, добавление, замену или усечение аминокислот в последовательности белка РАРАР. Настоящее изобретение также охватывает очищенный, выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90,95, 98 или 99%-ную идентичность аминокислот с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или ее фрагментом. Такие варианты полипептидов входят в настоящее изобретение независимо от того,имеют ли они нормальную биологическую активность или нет. Даже в том случае, если конкретная полипептидная молекула не обладает биологической активностью, для каждого специалиста очевидно, каким образом может быть использован данный полипептид, например, в качестве вакцины или для продуцирования антител. Другими применениями полипептидов настоящего изобретения, которые не обладают РАРАР-активностью, является inter alia, их использование в качестве эпитопных меток для эпитопного картирования и в качестве маркеров молекулярной массы на ДСН-ПААГ-гелях или на колонках для гель-фильтрации с молекулярным ситом, осуществляемой методами, известными специалистам. Как описано ниже, полипептиды настоящего изобретения могут быть также использованы для продуцирования поликлональных и моноклональных антител, которые могут быть использованы в анализах на детекцию экспрессии белков РАРАР или в качестве агонистов и антагонистов, способных усиливать или ингибировать функции белка РАРАР. Кроме того, такие полипептиды могут быть использованы в дрожжевой двухгибридной системе для "захвата" белков, связывающихся с белком РАРАР, которые также являются агонистами- и антагонистами-кандидатами настоящего изобретения. В других вариантах своего осуществления настоящее изобретение также относится к комплексам,образованным полипептидами РАРАР и g34872. Таким образом, настоящее изобретение относится к очищенным, выделенным или рекомбинантно продуцированным комплексам, состоящим по крайней мере из одного полипептида РАРАР и по крайней мере из одного полипептида g34872, где указанный полипептид РАРАР содержит по крайней мере 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислотSEQ ID NO: 2. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полипептид g34872 содержит по крайней мере 6, предпочтительно по крайней мере 8-10 аминокислот SEQ ID NO: 5. Кроме того, как было предположено, исходя из дополнительного анализа структуры полипептида РАРАР, полипептид РАРАР настоящего изобретения может содержать сайт N-гликозилирования (ASP) в положениях аминокислот 69-72 (аминокислоты NNTD). Кроме того, полипептид РАРАР настоящего изобретения может содержать сайт фосфорилирования протеинкиназы С в положениях аминокислот 2628 (SCR), 53-55 (SKR), 71-73 (TDK) и 80-82 (SPK). Кроме того, полипептид РАРАР может содержать сайт N-миристоилирования в положениях аминокислот 18-23 (GGDZGQ), 22-27 (GQIFSC) и 37-42(GAGQNK). Другими структурными аспектами являются мотивы рацемазы ASPGLU в положениях- 21005921 аминокислот 8-16 и 9-16 (аминокислоты D - PYG). Помимо своей ассоциации с шизофренией и биполярным нарушением посредством взаимодействия с g34872 полипептид РАРАР также имеет последовательность, гомологичную кальций/кальмодулинзависимого белка протеинкиназы II (САМКII) (peг.AS2711561), участие которого в нейротрансмиссии было продемонстрировано ранее. В одном из аспектов настоящего изобретения РАРАР может действовать как молекулярный шаперон; так, например, РАРАР может усиливать или предотвращать взаимодействие или связывание g34872 с рецептором g34872. В другом аспекте изобретения РАРАР может функционально взаимодействовать с белками g34872 в пути передачи сигнала. Белки РАРАР предпочтительно выделяют из образцов ткани человека или млекопитающего или экспрессируют из генов человека или млекопитающего. Полипептиды РАРАР настоящего изобретения могут быть получены рутинными методами экспрессии, известными специалистам. Полинуклеотид, кодирующий нужный полипептид, лигируют в экспрессирующий вектор, подходящий для любого стандартного хозяина. Для получения рекомбинантных полипептидов могут быть использованы как эукариотические, так и прокариотические системы хозяев, и совокупность некоторых наиболее распространенных систем. Затем полипептид выделяют из лизированных клеток или из культуральной среды и очищают до определенной степени, необходимой для использования. Очистку проводят любым известным методом, таким как, например, дифференциальная экстракция, фракционирование солями, хроматография, центрифугирование и т.п. Различные методы очистки белков можно найти, например, в "Методах энзимологии" (Methods in Enzymology). Кроме того, более короткие фрагменты белка продуцируют методами химического синтеза. Альтернативно, белки настоящего изобретения экстрагируют из клеток или тканей человека или других животных. Методы очистки белков известны специалистам, и таким методом является использование детергентов или хаотропных агентов для дизрупции частиц с последующей дифференциальной экстракцией и разделением полипептидов с помощью ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии,седиментации в градиенте плотности и гель-электрофореза. Для экспрессии белков и полипептидов РАРАР может быть использована любая кДНК РАРАР,включая SEQ ID NO: 1. Нуклеиновую кислоту, кодирующую экспрессируемый белок или полипептид РАРАР, функционально присоединяют к промотору в экспрессирующем векторе с использованием стандартной техники клонирования. Вставка РАРАР в экспрессирующем векторе может включать полную кодирующую последовательность для белка РАРАР или его части. Так, например, РАРАР-вставка может кодировать полипептид, содержащий по крайней мере 10 смежных аминокислот белка РАРАР SEQ IDNO: 2. Экспрессирующим вектором являются любые экспрессионные системы млекопитающего, дрожжей,насекомых или бактерий, известные специалистам. Коммерчески доступные векторы и экспрессионные системы поставляются рядом фирм-поставщиков, включая Genetic Institute (Cambridge, MA), Stratagene(La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin) и Invitrogen (San Diego, California). Если это необходимо, то для усиления экспрессии и облегчения правильной укладки белка, окружение кодона и спаривание последовательностей кодонов оптимизируют для конкретного экспрессирующего организма, в который вводят экспрессирующий вектор, как описано в патенте США, Hatfield et al.,5082767, описание которого во всей своей полноте вводится в настоящую заявку посредством ссылки. В одном из вариантов осуществления изобретения полную кодирующую последовательность кДНК РАРАР функционально присоединяют к промотору в экспрессирующем векторе посредством poly(А)сигнала кДНК. Альтернативно, если нуклеиновая кислота, кодирующая часть белка РАРАР, у которого отсутствует метионин, служит в качестве сайта инициации, то инициирующий метионин может быть введен после первого кодона нуклеиновой кислоты с использованием стандартной техники. Аналогичным образом, если во вставке из кДНК РАРАР отсутствует poly(А)-сигнал, то эта последовательность может быть введена в конструкцию, например, посредством сплайсинга из poly(А)-сигнала от pSG5(Stratagene) с использованием рестриктирующих эндонуклеаз BglI и SalI и встроена в экспрессирующий вектор млекопитающего рХТ 1 (Stratagene). pXT1 содержит LTR и часть гена gag мышиного вируса лейкоза Молони. Положение LTR в данной конструкции позволяет осуществлять стабильную трансфекцию. Указанный вектор включает промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса и селективный ген неомицина. Нуклеиновую кислоту, кодирующую белок РАРАР или его часть, получают из бактериального вектора, содержащего кДНК РАРАР SEQ ID NO: 2, посредством ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, комплементарных кДНК РАРАР или его части, где указанный вектор содержит последовательности рестриктирующей эндонуклеазы PstI, встроенной в 5'-праймер, и рестриктирующей эндонуклеазы BglII у 5'-конца соответствующего кДНК-3'-праймера для гарантии того, что последовательность, кодирующая белок РАРАР или его часть, будет правильно расположена по отношению к poly А-сигналу. Очищенный фрагмент, полученный в результате ПЦР-реакции, гидролизуют PstI, затупляют по концам экзонуклеазой, гидролизуют BglII, очищают и лигируют с вектором pXT1, уже содержащимpoly(А)-сигнал и гидролизованным BglII. Лигированный продукт трансфицируют в мышиные клетки NIH3T3 с использованием липофектина(Life Technologies, Inc., Grand Island, New York) в условиях, указанных в описании продукта. Положительные трансфектанты отбирают после культивирования трансфицированных клеток в 600 мкг/мл G418(Sigma, St.Louis, Missouri). Вышеописанные процедуры могут быть также использованы для экспрессии мутантного белка РАРАР, ответственного за детектируемый фенотип, или его части. Экспрессированный белок очищают стандартными методами очистки, такими как осаждение сульфатом аммония или хроматографическое разделение по размеру или заряду. Белок, кодируемый нуклеиновокислотной вставкой, может быть также очищен стандартными иммунохроматографическими методами. В таких процедурах раствор, содержащий экспрессированный белок РАРАР или его часть, такой как клеточный экстракт, наносят на колонку, содержащую антитела против белка РАРАР или его части,нанесенные на хроматографическую матрицу. Экспрессированный белок связывается с иммунохроматографической колонкой. Затем колонку промывают для удаления неспецифически связанных белков. Этот специфически связанный экспрессированный белок удаляют из колонки и выделяют стандартными методами. Для подтверждения экспрессии белка РАРАР или его части белки, экспрессированные из клетокхозяев и содержащие экспрессирующий вектор, включающий вставку, которая кодирует белок РАРАР или его часть, могут быть подвергнуты сравнению с белками, экспрессированными в клетках-хозяевах,содержащих экспрессирующий вектор без вставки. Присутствие полосы в образцах клеток, содержащих экспрессирующий вектор со вставкой, которая отсутствует в образцах клеток, содержащих экспрессирующий вектор без вставки, указывает на то, что был экспрессирован белок РАРАР или его часть. В основном, эта полоса будет иметь подвижность, ожидаемую для белка РАРАР или его части. Однако эта полоса может также иметь подвижность, отличающуюся от ожидаемой подвижности, в случае модификаций, таких как гликозилирование, убихитинизация или ферментативный гидролиз. Антитела, способные специфически распознавать экспрессированный белок РАРАР или его часть,описаны ниже. Если продуцирование антитела невозможно, то нуклеиновые кислоты, кодирующие белок РАРАР или его часть, встраивают в экспрессирующие векторы, сконструированные для получения схем очистки с применение химерных полипептидов. В таких стратегиях нуклеиновую кислоту, кодирующую белок РАРАР или его часть, встраивают в той же самой рамке считывания, которую имеет ген, кодирующий другую половину химеры. Другой половиной этой химеры является последовательность, кодирующая глобин или никельсвязывающий полипептид. Затем, для очистки химерного белка используют хроматографическую матрицу, имеющую антитело против -глобина или антитело, связывающееся с никелем. Между геном глобина или никельсвязывающего полипептида и геном белка РАРАР или его части конструируют сайты расщепления протеазой. Таким образом, два полипептида химеры могут быть отделены друг от друга посредством расщепления протеазой. Одним из экспрессирующих векторов, используемых для генерирования глобиновых химерных белков, является pSG5 (Stratagene), который кодирует кроличий глобин. Интрон II гена кроличьего глобина облегчает сплайсинг экспрессированного транскрипта, а сигнал полиаденилирования, введенный в данную конструкцию, повышает уровень экспрессии. Эти способы хорошо известны специалистам по молекулярной биологии. Стандартные методы опубликованы в методических руководствах, таких какDavid et al., (1086), и многие из них разработаны Stratagene, Life Technologies, Inc., или Promega. Кроме того, полипептид может быть продуцирован из данной конструкции с использованием систем трансляции in vitro, таких как набор для экспресс-трансляции in vitro (Stratagene). Антитела, которые связываются с полипептидами РАРАР настоящего изобретения Для генерирования антител, способных связываться с экспрессированным белком РАРАР или его фрагментами, может быть использован любой описанный полипептид или целый белок РАРАР. Одна из композиций антитела настоящего изобретения способна к специфическому связыванию или специфически связывается с белком РАРАР SEQ ID NO: 2. Композиция антитела, специфически связывающегося с белком РАРАР, должна иметь аффинность связывания для первого полноразмерного варианта белка РАРАР, которая по крайней мере на 5, 10, 15, 20, 50 или 100% превышает аффинность связывания для второго полноразмерного варианта белка РАРАР в ELISA или другом анализе, основанном на связывании с антителом. В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к композициям антитела поликлонального или моноклонального, которое способно к селективному связыванию или селективно связывается с эпитопсодержащим полипептидом, включающим непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 смежных аминокислот SEQ ID NO: 2. В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к композициям антитела поликлонального или моноклонального, которое способно к селективному связыванию или селективно связываться с комплексом полипептидов РАРАР и g34872, где указанный полипептид РАРАР содержит по крайней мере 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере 8-10 аминокислот, а- 23005921 более предпочтительно по крайней мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот SEQ ID NO: 2. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полипептид g34872 содержит по крайней мере 6 аминокислот, а предпочтительно по крайней мере 8-10 аминокислот SEQ ID NO: 5. Эпитоп может содержать по меньшей мере 3 аминокислоты в пространственной конформации, которая является уникальной для данного эпитопа. Обычно эпитоп состоит по крайней мере из 6 таких аминокислот, а чаще по крайней мере из 8-10 таких аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антигенные эпитопы содержат несколько аминокислот, число которых составляет от 3 до 50. Фрагменты, которые действуют как эпитопы, могут быть получены стандартными методами. Эпитопы могут быть определены с помощью анализа Джеймсона-Вольфа, который осуществляют, например, с помощью компьютерной программы PROTEAN с использованием параметров по умолчанию(Version 4.0 Windows, DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madison, WI). Предсказанные антигенные эпитопы представлены ниже. Следует отметить, что в списке иммуногенных эпитопов представлены только аминокислотные остатки, содержащиеся в эпитопах, которые, как было предсказано в соответствии с конкретным алгоритмом, имеют наивысшую степень иммуногенности. Полипептиды настоящего изобретения, которые конкретно не описаны как иммуногенные, считаются неантигенными. При этом они все же могут быть антигенными in vivo, но они просто не распознаются конкретно используемым алгоритмом. Альтернативно, эти полипептиды, возможно, являются антигенными in vitro, как было определено методами фагового представления. Таким образом, перечисленные ниже аминокислотные остатки представляют собой аминокислотные остатки, содержащие лишь предпочтительные эпитопы, но этот список является неполным. Действительно, все фрагменты полипептидов настоящего изобретения, имеющие по крайней мере 6 аминокислот, входят в объем настоящего изобретения и используются в качестве антигенного эпитопа. Кроме того, перечисленные ниже аминокислотные остатки являются лишь критическими остатками эпитопов, определенных с помощью анализа Джеймсона-Вольфа. Так, например, в перечисленные последовательности могут быть добавлены дополнительные фланкирующие остатки либо на N-конце, либо на С-конце, либо на обоих N- и С-концах для генерирования эпитопсодержащей части, имеющей длину по крайней мере в 6 остатков. Аминокислотные остатки, содержащие другие иммуногенные эпитопы, могут быть определены с помощью алгоритмов, аналогичных анализу Джеймсона-Вольфа, или посредством in vivo-тестирования на антигенный ответ описанными здесь методами или методами, известными специалистам. Эпитопсодержащие фрагменты настоящего изобретения предпочтительно включают 6-50 аминокислот (т.е. целое число от 6 до 50 включительно) полипептида настоящего изобретения. Кроме того,настоящее изобретение включает антигенные фрагменты, имеющие длину, начиная от 6 аминокислот и кончая полноразмерной последовательностью РАРАР. Предпочтительные иммуногенные эпитопы РАРАР:Ser-80 - Thr-83. Настоящее изобретение также относится к выделенному или очищенному антителу, способному специфически связываться с мутированным белком РАРАР, или с его фрагментом, или вариантом, содержащим эпитоп мутированного белка РАРАР. В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к антителу, способному связываться с полипептидом, содержащим по крайней мере 10 смежных аминокислот белка РАРАР и включающим по крайней мере одну аминокислоту, которая может кодироваться мутациями, приводящими к появлению конкретного признака. Для получения антител желательно использовать животных или млекопитающих дикого типа или трансгенных, не относящихся к человеку, которые экспрессируют тип РАРАР, отличающийся от типа РАРАР, с которым связывается антитело, а особенно предпочтительными являются животные, которые не экспрессируют РАРАР (т.е. описанные здесь животные, у которых отсутствует РАРАР). Животные, у которых отсутствует РАРАР, будут распознавать все области или большинство доступных областей белка РАРАР в качестве чужеродных антигенов, а поэтому они будут продуцировать антитела для более широкого спектра эпитопов РАРАР. Кроме того, более короткие полипептиды, имеющие только 10-30 аминокислот, могут быть использованы для обеспечения специфического связывания с любым белком РАРАР. Кроме того, иммунная система гуморального ответа животных, которые продуцируют молекулы РАРАР, которые являются сходными с антигенной последовательностью, будут преимущественно распознавать различия между нативными РАРАР-молекулами животного и антигенной последовательностью и продуцировать антитела против этих уникальных сайтов в последовательности антигена. Такая техника может быть, в частности, использована для получения антител, специфически связывающихся с любым одним из белков РАРАР. Препараты антител, полученные в соответствии с любым протоколом, могут быть использованы в количественных иммуноанализах, в которых определяют концентрации ангиген-содержащих веществ в- 24005921 биологических образцах; и, кроме того, они могут быть использованы в полуколичественном или качественном анализе для идентификации присутствия антигена в биологическом образце. Эти антитела могут быть также использованы в терапевтических композициях для цитолиза клеток, экспрессирующих данный белок, или для снижения уровня этого белка в организме. Антитела настоящего изобретения могут быть помечены любыми радиоактивными, флуоресцентными или ферментными метками, известными специалистам. Поэтому настоящее изобретение также относится к способу специфической детекции присутствия полипептида РАРАР настоящего изобретения в биологическом образце, где указанный способ включает следующие стадии:a) контактирования биологического образца с поликлональным или моноклональным антителом,которое специфически связывается с полипептидом РАРАР, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или с его пептидным фрагментом, или вариантом, иb) детекции образовавшегося комплекса "антиген-антитело". Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для детекции in vitro присутствия полипептида РАРАР настоящего изобретения в биологическом образце, где указанный набор включаетa) поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом РАРАР, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или с его пептидным фрагментом, или вариантом, необязательно меченные, иb) реагент, обеспечивающий детекцию образованных комплексов антиген-антитело, где указанный реагент, необязательно, несет метку или сам может распознаваться меченным реагентом, а более конкретно это происходит в случае, когда вышеупомянутое моноклональное или поликлональное антитело само не является меченным. Таким образом, настоящее изобретение относится к антителам и Т-клеточным антигенным рецепторам (TCR), которые специфически связываются с полипептидами, а более конкретно с эпитопами указанных полипептидов настоящего изобретения, включая, но не ограничиваясь ими, IgG (включая IgG1,IgG2, IgG3 и IgG4), IgA (включая IgA1 и IgA2), IgD, IgE или IgM и IgY. В предпочтительном варианте антителами настоящего изобретения являются фрагменты антител, связывающиеся с человеческим антигеном, включая, но не ограничиваясь ими, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fd, одноцепочечный Fv (oдFv), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанный Fv (oцFv) и фрагменты, содержащие либо домен VL, либо домен VH. Указанные антитела могут быть получены от любого животного, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно указанными антителами являются антитела человека, мыши, кролика, козы,морской свинки, верблюда, лошади или курицы. Антиген-связывающие фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, могут содержать вариабельную область (области), отдельно или в комбинации со следующими полными или неполными областями: шарнирной областью, доменами CH1, CH2 и СН 3. В объем настоящего изобретения также входят любые комбинации из вариабельных областей и шарнирных областей и доменов CH1, CH2 и СН 3. В объем настоящего изобретения также входят химерные, гуманизированные и человеческие моноклональные и поликлональные антитела, специфически связывающиеся с полипептидами настоящего изобретения. В объем настоящего изобретения также входят антитела, которые являются антиидиотипическими по отношению к антителам настоящего изобретения. Антитела настоящего изобретения могут быть моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими, либо они могут иметь мультиспецифичность более высокого порядка. Мультиспецифические антитела могут быть специфичными для других эпитопов полипептида настоящего изобретения,либо они могут быть специфичными как для полипептида настоящего изобретения, так и для гетерологичных композиций, таких как гетерологичный полипептид или материал твердого носителя. См., например, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt A. et al. (1991) J. Immunol. 147:6069; патенты США 5573920, 4474893, 5601819, 4714681, 4925648; Kostelny S.A. et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553. Антитела настоящего изобретения могут быть описаны или охарактеризованы по их взаимодействию с эпитопом(ами) или эпитопнесущей частью(ями) полипептида настоящего изобретения, которые распознаются или специфически связываются этими антителами. В случае белков настоящего изобретения и секретированных белков, указанные антитела могут специфически связываться с полноразмерным белком, кодируемым нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, со зрелым белком (т.е. белком,генерируемым путем расщепления сигнального пептида), кодируемым нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, с сигнальным пептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой настоящего изобретения,или с любым другим полипептидом настоящего изобретения. Поэтому эпитоп(ы) или эпитопсодержащая полипептидная часть(и) могут быть определены как описано в настоящей заявке, например,по N-концевым и С-концевым положениям, по размеру в смежных аминокислотных остатках или какимлибо другим описанным здесь последовательностям (входящих в список последовательностей). Антитела, которые специфически связываются с любым эпитопом или полипептидом настоящего изобретения,могут быть также исключены как отдельный вид. Поэтому настоящее изобретение относится к антите- 25005921 лам, которые специфически связываются с определенными полипептидами настоящего изобретения, что позволяет исключить вышеупомянутые антитела. Антитела настоящего изобретения могут быть также описаны и охарактеризованы с точки зрения их перекрестной реактивности. Антитела, которые специфически не связываются с любым другим аналогом, ортологом или гомологом полипептидов настоящего изобретения, входят в объем настоящего изобретения. В объем настоящего изобретения также входят антитела, которые не связываются с полипептидами, имеющими менее чем 95%, менее чем 90%, менее чем 85%, менее чем 80%, менее чем 75%,менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60%, менее чем 55% и менее чем 50%-ную идентичность (вычисленную известными и описанными здесь методами) с полипептидом настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, связывающимся лишь с полипептидами, кодируемыми полинуклеотидами, которые гибридизуются с полинуклеотидом настоящего изобретения в жестких условиях гибридизации (как описано в настоящей заявке). Антитела настоящего изобретения могут быть также описаны или охарактеризованы с точки зрения их аффинности связывания. Предпочтительными аффинностями связывания являются аффинности связывания с константой диссоциации или Kd,составляющей менее 510-6 М, 10-6 М, 510-7 М, 10-7 М, 510-8 М, 10-8 М, 510-9 М, 10-9 М, 510-10 М, 10-10 М,510-11 М, 10-11 М, 510-12 М, 10-12 М, 510-13 М, 10-14 М, 510-14 М, 10-14 М, 510-15 М и 10-15 М. Антитела настоящего изобретения используются в методах, которыми являются, но не ограничиваются ими, известные методы очистки, детекции и нацеливания на полипептиды настоящего изобретения,включая диагностические in vivo и in vitro методы и терапевтические методы. Так, например, эти антитела используются в иммуноанализах для качественного и количественного измерения уровней полипептидов настоящего изобретения в биологических образцах. См., например, работу Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) (которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). Антитела настоящего изобретения могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими композициями. Эти антитела могут быть затем рекомбинантно присоединены к гетерологичному полипептиду у N- или С-конца либо они могут быть химически конъюгированы (включая ковалентное или нековалентное конъюгирование) с полипептидами или другими композициями. Так, например, антитела настоящего изобретения могут быть рекомбинантно связаны или конъюгированы с молекулами, используемыми в качестве меток в детектирующих анализах, и с эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные средства или токсины. См., например, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент США 5314995 и ЕР 0396387. Антитела настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим методом, известным специалистам. Так, например, полипептид настоящего изобретения или его антигенный фрагмент может быть введен животному для стимуляции продуцирования сыворотки, содержащей поликлональкые антитела. Термин "моноклональное антитело" не ограничивается антителами, продуцируемыми с помощью гибридомной техники. Термин "антитело" означает полипептид или группу полипептидов, состоящих по крайней мере из одного связывающего домена, где этот связывающий домен образуется в результате укладки вариабельных доменов молекулы антитела с образованием трехмерных связывающих областей,имеющих внутреннюю форму поверхностей и распределение заряда, которые комплементарны соответствующим признакам антигенной детерминанты, и, тем самым, обеспечивают возможность иммунологической реакции с антигеном. Термин "моноклональное антитело" означает антитело, которое происходит от одного клона, включая эукариотический, прокариотический или фаговый клон, но не относится к методу его получения. Моноклональные антитела могут быть получены с использованием многих методов,известных специалистам, включая использование гибридомной техники, техники рекомбинантных ДНК и техники фагового представления. Гибридомная техника хорошо известна специалистам (см., например, работы Harlow et al. (1998);Hammerling et al. (1981) (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Fab и F(ab')2-фрагменты могут быть получены, например, из продуцированных гибридомой антител путем протеолитического расщепления ферментами, такими как папаин (для продуцирования Fabфрагментов) или пепсин (для продуцирования F (ab')2-фрагментов). Альтернативно, антитела настоящего изобретения могут быть продуцированы с помощью техники рекомбинантных ДНК или путем химического синтеза методом, известным специалистам. Так, например, антитела настоящего изобретения могут быть получены методами фагового представления, известными специалистам. В методах фагового представления домены функциональных антител представлены на поверхности фаговой частицы, которая несет полинуклеотидные последовательности, кодирующие эти частицы. Фаг с нужными связывающими свойствами выбирают из набора антител или из комбинаторной библиотеки антител (например, человеческих или мышиных) путем прямого отбора с использованием непосредственно антигена, обычно антигена, связанного или иммобилизованного на твердой поверхности или сфере. Фагом, используемым в этих методах, обычно является нитчатый фаг, включая fd и М 13, с Fab-доменом, Fv-доменом или стабилизированным дисульфидом Fv-доменом антитела, рекомбинантно присоединенными к фаговому белку, кодируемому либо геном III, либо геном VIII. Примерами- 26005921 методов фагового представления, которые могут быть использованы для продуцирования антитела настоящего изобретения, могут служить методы, описанные в работах Brinkman U. et al. (1995); Ames, R.S.et al. (1995); Kettleborough C.A. et al. (1994); Persic L. et al. (1997); Burton D.R. et al. (1994); PCT/GB 91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401 и в патентах США 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047,5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727 и 5733743 (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Как описано в вышеуказанных работах после фагового отбора антитело-кодирующие области данного фага могут быть выделены и использованы для генерирования целых антител, включая человеческие антитела или любой другой нужный антиген-связывающий фрагмент, и экспрессированы в любом подходящем хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии. Так, например, рекомбинантное продуцирование Fab, Fab', F(ab)2 и F(ab')2-фрагментов может быть также осуществлено известными методами, такими как методы, описанные в WO 92/22324; Mullinax R.L. et al. (1992), Sawai H. et al., (1995) и Better M. et al. (1988) (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Примерами методов, которые могут быть использованы для продуцирования одноцепочечных Fvфрагментов и антител, являются методы, описанные в патентах США 4946778 и 5258498; Huston etal. (1991); Shu L. et al. (1993); и Skerra A. et al. (1988). Для некоторых целей, включая in vivoиспользование антител у человека и использование в детектирующих in vitro анализах, предпочтительно могут быть использованы химерные, гуманизированные или человеческие антитела. Методы продуцирования химерных антител известны специалистам. См., например, Morrison (1985); Oi et al. (1986); GilliesS.D. et al., (1989) и патент США 5807715. Антитела могут быть гуманизированы с использованием ряда методов, включая CDR-"прививку" (ЕР 0239400; WO 91/09967; патенты США 5530101 и 5585089), маскировку или модификацию поверхности (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Padlan E.A. (1991); Studnicka G.M. et al. (1994); Roguska M.A. et al. (1994 и "перестановку" цепей (патент США 5565332). Человеческие антитела могут быть получены рядом методов, известных специалистам, включая методы фагового представления, описанные выше. См. также патенты США 4444887, 4716111, 5545806 и 5814318; WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24983; WO 96/34096; WO 96/33735 и WO 91/10741 (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, рекомбинантно присоединенным или химически конъюгированным (включая ковалентное или нековалентное конъюгирование) с полипептидом настоящего изобретения. Эти антитела могут быть специфичными к антигенам, не являющимся полипептидами настоящего изобретения. Так, например, антитела могут быть использованы для доставки полипептидов настоящего изобретения в клетки конкретных типов, либо in vitro, либо in vivo, путем связывания или конъюгирования полипептидов настоящего изобретения с антителами, специфичными к конкретным рецепторам клеточной поверхности. Антитела, связанные или конъюгированные с полипептидами настоящего изобретения, могут быть также использованы в in vitro иммуноанализах и в методах очистки, известных специалистам. См., например, Harbor et al., см. выше и WO 93/21232; ЕР 0439095;Naramura M. et al. (1994); патент США 5474981; Gillies S.O. et al. (1992); Fell H.P. et al. (1991) (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим полипептиды настоящего изобретения, связанные или конъюгированные с доменами антител, не являющимися вариабельными областями. Так, например, полипептиды настоящего изобретения могут быть связаны или конъюгированы с Fc-областью антитела или с его частью. Эта часть антитела, соединенная с полипептидом настоящего изобретения, может содержать шарнирную область, домен СН 1, домен СН 2 и домен СН 3 или любую комбинацию целых доменов или их частей. Полипептиды настоящего изобретения могут быть связаны или конъюгированы с вышеуказанными частями антител для увеличения времени полужизни полипептидов in vivo или для использования в иммуноанализах в соответствии с методами, известными специалистам. Эти полипептиды могут быть также слиты или конъюгированы с вышеуказанными частями антител с образованием мультимеров. Так, например, Fc-части, соединенные с полипептидами настоящего изобретения, могут образовывать димеры посредством дисульфидной связи между этими Fc-частями. Более крупные мультимерные формы могут быть получены путем соединения полипептидов с частямиIgA и IgM. Методы слияния или конъюгирования полипептидов настоящего изобретения с частями антител известны специалистам. См., например, патенты США 5336603, 5622929, 5359046, 5349053,5447851, 5112946; ЕР 0307434; ЕР 0367166; WO 96/04388, WO 91/06570; Ashkenazi A. et al. (1991); ZhengX.X. et al. (1995) и Vil H. et al. (1992) (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, которые действуют как агонисты или антагонисты для полипептидов настоящего изобретения. Так, например, настоящее изобретение относится к антителам, которые нарушают взаимодействие рецептор/лиганд с полипептидами настоящего изобретения, либо частично, либо полностью. В объем настоящего изобретения входят рецепторспецифические антитела и лиганд-специфические антитела. В объем настоящего изобретения входят ре- 27005921 цептор-специфические антитела, которые не предотвращают связывание с лигандом, но предотвращают активацию рецептора. Активация рецептора (т.е. передача сигнала) может быть определена методами,описанными в настоящей заявке, или какими-либо другими известными методами. Настоящее изобретение также включает рецептор-специфические антитела, которые предотвращают связывание с лигандом и активацию рецептора. Аналогичным образом, в объем настоящего изобретения входят нейтрализующие антитела, которые связываются с лигандом и предотвращают связывание лиганда с рецептором, а также антитела, которые связываются с лигандом и тем самым предотвращают активацию рецептора, но не предотвращают связывание лиганда с рецептором. Настоящее изобретение также относится к антителам, которые активируют этот рецептор. Указанные антитела могут действовать как агонисты по отношению ко всем либо не ко всем биологическим активностям, подвергающимся влиянию лигандопосредованной активации рецептора. Указанные антитела могут быть определены как агонисты или антагонисты биологических активностей, включающих описанные здесь удельные активности. Вышеуказанные антитела-агонисты могут быть получены методами, известными специалистам. См., например, WO 96/40281; патент США 5811097; Deng В. et al. (1988); Chen Z. et al. (1998); Harrop J.A. et al.(1996) (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Как обсуждалось выше, антитела для полипептидов настоящего изобретения могут быть, в свою очередь, использованы для генерирования антиидиотипических антител, которые "имитируют" полипептиды настоящего изобретения, методами, хорошо известными специалистам. См. например, GreenspanВоnа (1989); Nissinoff (1991). Так, например, антитела, которые связываются с полипептидом и конкурентно ингибируют мультимеризацию полипептида или связывание полипептида настоящего изобретения с лигандом, могут быть использованы для генерирования антиидиотипических антител, которые"имитируют" мультимеризацию или связывание домена, а, следовательно, связывание и нейтрализацию полипептида или его лиганда. Такие нейтрализующие антиидиотипические антитела могут быть использованы для связывания полипептида настоящего изобретения или для связывания с его лигандом/рецептором и, тем самым, блокирования его биологической активности. Рекомбинантные векторы Используемый здесь термин "вектор" означает кольцевую или линейную молекулу ДНК или РНК,которая является либо двухцепочечной, либо одноцепочечной, и которая содержит по крайней мере один нужный полинуклеотид, предназначенный для его переноса в клетку-хозяина, либо в одноклеточный или в многоклеточный организм хозяина. Настоящее изобретение охватывает семейство рекомбинантных векторов, включающих регуляторный полинуклеотид, происходящий от геномной последовательности РАРАР, и/или кодирующий полинуклеотид, происходящий либо от геномной последовательности либо от кДНК-последовательности РАРАР. В общих чертах рекомбинантный вектор настоящего изобретения может содержать любой из описанных здесь полинуклеотидов, включая регуляторные последовательности, кодирующие последовательности и полинуклеотидные конструкции, а также любой праймер или зонд РАРАР, определенный выше. Более конкретно рекомбинантные векторы настоящего изобретения могут содержать любой из полинуклеотидов, описанных в разделах "Геномные последовательности гена РАРАР", "кДНКпоследовательности РАРАР", "Кодирующие области", "Полинуклеотидные конструкции" и "Олигонуклеотидные зонды и праймеры". В первом предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантный вектор настоящего изобретения используется для амплификации встроенного полинуклеотида, происходящего от геномной последовательности РАРАР SEQ ID NO: 3 или кДНК РАРАР, например кДНК SEQ ID NO: 1 в подходящей клетке-хозяине, причем этот полинуклеотид амплифицируется каждый раз, когда реплицируется рекомбинантный вектор. Во втором предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам, содержащим либо регуляторный полинуклеотид, либо кодирующую нуклеиновую кислоту настоящего изобретения, либо и то, и другое. В некоторых вариантах осуществления изобретения экспрессирующие векторы используются для экспрессии полипептида РАРАР, который может быть затем очищен или, например, использован в лиганд-скринирующих анализах или в качестве иммуногена для вырабатывания специфических антител против белка РАРАР. В других вариантах осуществления изобретения экспрессирующие векторы используются для конструирования трансгенных животных, а также для генной терапии. Для экспрессии необходимо, чтобы в данных векторах вырабатывались соответствующие сигналы, где указанными сигналами являются различные регуляторные элементы, такие как энхансеры/промоторы, происходящие от вирусов или млекопитающих и регулирующие экспрессию нужных генов в клетках-хозяевах. Обычно в экспрессирующие векторы настоящего изобретения вводят маркеры доминантного отбора по лекарственному средству для получения перманентных, стабильных клеточных клонов, экспрессирующих данные продукты, поскольку они представляют собой элементы, которые осуществляют сцепление экспрессии маркера отбора по лекарственному средству с- 28005921 экспрессией данного полипептида. Более конкретно, настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам, включающим нуклеиновые кислоты, кодирующие белок РАРАР, а предпочтительно белок РАРАР аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или его варианты, или фрагменты. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному экспрессирующему вектору, используемому для экспрессии кодирующей последовательности РАРАР, где указанный вектор содержит нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 1. Некоторые из элементов, которые могут присутствовать в векторах настоящего изобретения, более подробно описаны в следующих разделах. 1. Общие признаки экспрессирующих векторов настоящего изобретения. Рекомбинантным вектором настоящего изобретения являются, но не ограничиваются ими, YAC(искусственная дрожжевая хромосома), ВАС (искусственная бактериальная хромосома), фаг, фагмида,космида, плазмида или даже линейная ДНК-молекула, которая может представлять собой хромосомную,нехромосомную, полусинтетическую и синтетическую ДНК. Такой рекомбинантный вектор может содержать единицу транскрипции, в состав которой входят(1) генетический элемент или элементы, регулирующие экспрессию, например промоторы или энхансеры. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно длиной примерно 10-300 п.н., которые воздействуют на промотор и, тем самым, усиливают транскрипцию;(2) структурная или кодирующая последовательность, которая транскрибируется в мРНК и, в конечном счете, транслируется в полипептид, причем указанная структурная или кодирующая последовательность функционально присоединена к регуляторным элементам, описанным в (1); и(3) соответствующая последовательность инициации и терминации транскрипции. Структурные единицы, предназначенные для использования в дрожжевых или эукариотических экспрессирующих системах предпочтительно включают лидерную последовательность, обеспечивающую внеклеточную секрецию транслированного белка клеткой-хозяином. Альтернативно, если рекомбинантный белок экспрессируется в отсутствие лидерной или транспортной последовательности, то он может включать N-концевой остаток. Затем этот остаток может или не может отщепляться от экспрессируемого рекомбинантного белка с образованием конечного продукта. В основном, рекомбинантные экспрессирующие векторы включают сайты инициации репликации,селективные маркеры, осуществляющие трансформацию клетки-хозяина, и промотор, происходящий от высокоэкспрессируемого гена, для регуляции транскрипции расположенной ниже структурной последовательности. Гетерологичная структурная последовательность подвергается укладке в соответствующей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции, а предпочтительно с лидерной последовательностью, способной регулировать секрецию транслируемого белка в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду. В конкретном варианте осуществления изобретения, где вектор адаптирован для трансфекции и экспрессии нужных последовательностей в клетках-хозяевах млекопитающего,предпочтительные векторы содержат сайты инициации репликации в нужном хозяине, подходящие промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания с рибосомой, сигнал полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. ДНК-последовательности, происходящие от вирусного генома SV40, например ранний промотор, энхансер, сигналы сплайсинга и полиаденилирования, могут быть использованы для получения необходимых нетранскрибируемых генетических элементов.In vivo-экспрессия полипептида РАРАР SEQ ID NO: 2, или его фрагментов, или вариантов может быть использована для коррекции генетического дефекта, ассоциированного с экспрессией нативного гена в организме хозяина или для продуцирования биологически неактивного белка РАРАР. Следовательно, настоящее изобретение также относится к рекомбинантным экспрессирующим векторам, сконструированным, главным образом, для продуцирования in vivo полипептида РАРАР SEQ IDNO: 2, или его фрагментов, или вариантов путем введения соответствующего генетического материала в организм пациента, подвергаемого лечению. Этот генетический материал может быть введен in vitro в клетку, которая была предварительно экстрагирована из этого организма, после чего указанную модифицированную клетку-хозяина снова вводят в указанный организм, непосредственно in vivo в подходящую ткань. 2. Регуляторные элементы. Промоторы Подходящие промоторные области, используемые в экспрессирующих векторах настоящего изобретения, выбирают с учетом клетки-хозяина, в которой должен экспрессироваться гетерологичный ген. Какой именно промотор используется для регуляции экспрессии нужной последовательности нуклеиновой кислоты не имеет решающего значения, если только он способен регулировать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетках-мишенях. Таким образом, если клеткой-мишенью является человеческая клетка, то предпочтительно, чтобы положение данной кодирующей области нуклеиновой кислоты было- 29005921 смежным с данным промотором и находилось под контролем указанного промотора, способного регулировать ее экспрессию в человеческой клетке, например человеческого или вирусного промотора. Подходящий промотор может быть гетерологичным по отношению к нуклеиновой кислоте, экспрессию которой он регулирует, или, альтернативно, он может быть эндогенным по отношению к нативному полинуклеотиду, содержащему экспрессируемую кодирующую последовательность. Кроме того,указанный промотор является, в основном, гетерологичным по отношению к рекомбинантным векторным последовательностям, в которые была встроена конструкция "промотор-кодирующая последовательность". Промоторные области могут быть выбраны из любого нужного гена с использованием, например,векторов CAT (хлорамфеникол-трансферазы), а более предпочтительно векторов рКК 232-8 и рСМ 7. Предпочтительными бактериальными промоторами являются промоторы LacI, LacZ, промоторы РНК-полимеразы бактериофага Т 3 или Т 7, промоторы gpt, лямбда PR, PL и trp (EP 0036776), промотор полиэдрина или промотор белка р 10 бакуловируса (Kit Novagen) (Smith et al., 1983; O'Reilly et al., 1992),промотор лямбда PR или также промотор trc. Эукариотическими промоторами являются предранний промотор CMV, промотор тимидинкиназыHSV, ранний и поздний промотор SV40, LTR от ретровируса и промотор мышиного металлотионеина-L. Выбор подходящего вектора и промотора может быть сделан любым специалистом. Выбор промотора может быть сделан любым специалистом в области генной инженерии. Для этого специалист может, например, обратиться к книге Sambrook et al. (1989) или также к описанию соответствующих процедур, приведенному в работе Fuller et al. (1996). Другие регуляторные элементы Если используется кДНК-вставка, то для эффективного осуществления полиаденилирования генного транскрипта необходимо ввести сигнал полиаденилирования. Природа сигнала полиаденилирования не имеет решающего значения для успешного осуществления настоящего изобретения, и для этих целей может быть использована любая последовательность, такая как сигналы гормона роста человека и сигналы полиаденилирования SV40. Элементом экспрессионного кластера может быть также терминатор. Эти элементы могут служить для увеличения уровней транскрипта и для минимизации считывания информации с кластера в другие последовательности. 3. Селектируемые маркеры. Указанные маркеры должны вводить в данную клетку идентифицируемые изменения, которые позволяют легко идентифицировать клетки, содержащие экспрессионную конструкцию. Такими селективными маркерными генами для отбора трансформированных клеток-хозяев являются предпочтительно ген дигодрофолат-редуктазы или ген резистентности к неомицину для эукариотической клеточной культуры, TRP1 для S. cerevisiae или ген резистентности к тетрациклину, рифампицину или ампициллину дляE.coli, или ген левансахаразы для микобактерий, причем этот последний маркер является маркером негативного отбора. 4. Предпочтительные векторы. Бактериальные векторы В качестве репрезентативного, но неограничивающего примера, могут служить используемые в бактериях векторы, которые содержат селективный маркер и бактериальный сайт инициации репликации и которые могут быть получены из коммерчески доступных плазмид, содержащих генетические элементы pBR322 (ATCC 37017). Такими коммерчески доступными векторами являются, например, рKK223-3(Pharmacia, Uppsala, Sweden) и GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Специалистам известно большое число других подходящих и коммерчески доступных векторов, таких как следующие бактериальные векторы: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript,psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, PNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3,pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3,pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (QIAexpress). Бактериофаговые векторы Вектор на основе бактериофага Р 1 может содержать крупные вставки, составляющие примерно от 80 до 100 т.п.н. Конструирование векторов на основе бактериофага Р 1, таких как р 158 или р 158/nео 8, конкретно описаны у Sternberg (1992, 1994). Рекомбинантные клоны Р 1, содержащие нуклеотидные последовательности РАРАР, могут быть сконструированы путем встраивания крупных нуклеотидов, составляющих более чем 40 т.п.н. (Linton et al. 1993). Для генерирования ДНК Р 1 в целях проведения трансгенных экспериментов предпочтительным протоколом такого генерирования является протокол, описанныйMcCormick et al. (1994). Вкратце, E.coli (предпочтительно, штамм NS3529), содержащую плазмиду Р 1,культивируют в течение ночи в подходящей питательной среде, содержащей 25 мкг/мл канамицина. ДНК Р 1 выделяют из E.coli путем щелочного лизиса с использованием набора Qiagen Plasmid Maxi kit (Qiagen,Chatsworth, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителей. Затем ДНК Р 1 очищают от бактериального лизата на двух колонках Qiagen-tip 500 с использованием промывочных и элюирующих буферов, содержащихся в данном наборе. После экстракции фенолом/этанолом осуществляют преципитацию