Детектирование вируса папилломы человека

010500 Область изобретения Настоящее изобретение относится к in vitro способам скрининга человека на предмет наличия вируса папилломы человека (HPV) с дефектом регуляции экспрессии мРНК Е 6/Е 7 и сниженной репликацией и/или экспрессией стабилизированной пре-мРНК, кодирующей полноразмерный белок E6. В частности, в данном изобретении предлагаются in vitro способы детектирования хронической трансформирующей инфекции HPV, которая равнозначна хроническим клеточным нарушениям или хроническим поражениям CIN III, раковой опухоли in situ или сквамозным внутриэпителиальным поражениям с высокой степенью злокачественности (HSIL). Данные способы можно использовать для скрининга рака шейки матки. Предпосылки создания изобретения Карцинома шейки матки представляет собой одно из самых распространенных в мире злокачественных заболеваний и является одной из основных причин заболеваемости и смертности среди женщин(Parkin DM, Pisani P, Ferlay J (1993) Int J Cancer 54: 594-606; Pisani P, Parkin DM, Ferlay J (1993) Int J Cancer 55: 891-903). 15700 новых случаев инвазивного рака шейки матки предсказано в Соединенных Штатах в 1996 году, а заболеваемость во всем мире по данным Всемирной Организации Здравоохранения(1990) составляет 450000 в год. Годичная заболеваемость различается в разных частях мира, варьируя от 7,6 на 100000 в западной Азии до 46,8 на 100000 в южной Африке (Parkin et al., 1993, там же). В соответствии с концепцией настоящего изобретения карцинома шейки матки представляет собой многостадийное заболевание, часто развивающееся в течение 10-25 лет. При инвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки происходит проникновение через базальную пластинку и поражение стромы или собственной пластинки эпителия. Карцинома шейки матки протекает со значительными вариациями. Прогноз зависит от клинического состояния, вовлечения лимфатических узлов, первичной массы опухоли, гистологического типа, глубины инвазии и лимфатического проникновения (Delgado G, et al.,(1990) Gynecol Oncol 38: 352-357). У некоторых пациентов с менее благоприятными характеристиками опухоли заболевание имеет относительно хороший исход, тогда как у других болезнь заканчивается смертельным исходом при изначально ограниченном заболевании. Это говорит о настоятельной необходимости в других маркерах, которые позволили бы дополнительно охарактеризовать обнаруженные карциномы шейки матки, чтобы применять адаптированную по степени риска терапию (Ikenberg H, et al.,Int. J. Cancer 59: 322-6. 1994). Показано, что эпидемиология рака шейки матки тесно связана с религиозными, брачными и сексуальными факторами. Было проведено почти 100 исследований методом случай-контроль взаимосвязи между HPV и новообразованиями в шейке матки, и все они показывают наличие положительных связей(IARC monographs, 1995). Такая связь прочна, постоянна и специфична для ограниченного числа вирусных типов (Munoz N, Bosch FX (1992) HPV and cervical neoplasia: review of case-control and cohort studies.IARC Sci Publ 251-261). В наиболее информативных исследованиях были обнаружены прочные связи с ДНК HPV 16, причем хорошо согласующиеся результаты получены для инвазивного рака и выраженных поражений CIN, исключая возможность того, что вывод о наличии указанной связи сделан на основании случайных, необъективных или ошибочных фактов (IARC monographs, 1995). Косвенные данные свидетельствуют о том, что ДНК HPV, детектируемая в раковых клетках, является хорошим маркером, указывающим на участие инфекции HPV в раннем канцерогенезе. Описаны взаимоотношения доза-ответ для повышенных вирусной нагрузки и риска карциномы шейки матки (Munoz and Bosch, 1992 там же). В некоторых более крупных сериях экспериментов до 100% опухолей были положительны по HPV, однако еще обсуждается возможность существования вирус-отрицательных карцином шейки матки (Meijer CJ, etCancer 72: 147-153). Чаще всего в плоскоклеточных карциномах шейки матки обнаруживают такие типы HPV, как HPV 16 (41-86%) и 18 (2-22%). Кроме того, встречаются HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 66 и 68 (IARC, monographs, 1995). На международной конференции HPV2000 в Барселоне было принято, чтоHPV 16, 18, 31 и 45 относятся к типам высокого риска, a HPV 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59, 68 относятся к типам среднего риска (Keerti V. Shah. P71). 13 типов HPV высокого и среднего риска часто называют типами HPV, ассоциированными с раком. В ряде исследований демонстрируется потенциальная роль тестирования HPV в скрининге шейки матки (см. Cuzick et al. A systematic review of the role of human papillomavirus testing withing a cervicalReid et al. (Reid R, et al., (1991) Am J Obstet Gynecol 164: 1461-1469) впервые продемонстрировали роль HPV в контексте скрининга. Данное исследование проводили на женщинах из группы высокого риска, наблюдающихся в клиниках венерических заболеваний и у специалистов гинекологов, используя для детектирования HPV-чувствительную (низкой жесткости) гибридизацию с применением саузернблоттинга. Всего в эксперименте участвовало 1012 женщин, причем цервикографию рассматривали как возможное дополнение к цитологии. Всего было обнаружено двадцать три поражения CIN II/III, но только 12 детектировали с помощью цитологии (чувствительность 52%, специфичность 92%). Анализ HPV показал 16 высокозлокачественных поражений.Bauer et al. (Bauer HM, et al., (1991) JAMA 265: 472-477) описали предварительное исследование с использованием ПЦР и праймеров MY09/11 (Manos M, et al., (1990) Lancet 335: 734), проводимое среди молодых женщин, регулярно сдающих обычные мазки (студенты колледжа). Они обнаружили, что частота положительного результата составляет 46% у 467 женщин, что гораздо выше, чем при использовании дот-блоттинга (11%). В исследовании, проводимом с использованием ПЦР и праймеров GP5/6 (Van DenBrule AJ, et al.,(1990) J Clin Microbiol 28: 2739-2743) van der Brule et al. (Van Den Brule AJ, et al., (1991) Int J Cancer 48: 404-408), обнаружена высокая степень корреляции присутствия HPV с новообразованиями в шейке матки, диагностируемыми методом цитологии. У более старших женщин (возрастом 35-55 лет) при отрицательной цитологии частота положительных результатов анализа на HPV составляет только 3,5% и снижается до 1,5% в случае типов 16, 18, 31 и 33, тогда как все женщины с гистологической карциномой insitu являются HPV-положительными, и у 90% обнаруживается один из четырех вышеуказанных типов. Женщины с менее тяжелыми цитологическими нарушениями имеют более низкую частоту положительных результатов анализа на HPV в градационном отношении, то есть наблюдается отчетливая тенденция.Roda Housman et al. (Roda Housman AM, et al., (1994) Int J Cancer 56: 802-806) расширили данные наблюдения путем обследования еще 1373 женщин с аномальными мазками. Данное исследование также подтверждает увеличение частоты положительных результатов при ухудшении результатов мазков. Они также отметили, что уровень гетерогенности HPV уменьшается от 22 типов для мазков с низкой степенью злокачественности до десяти типов "высокого риска" для мазков с высокой степенью злокачественности. В данном исследовании не участвовали женщины с отрицательными результатами цитологических анализов и не проводилось гистологическое подтверждение цитологического заболевания.Cuzick et al. (Cuzick J, et al., (1992) Lancet 340: 112-113; Cuzick J, et al., (1994) Br J Cancer 69: 161171) впервые показали, что тестирование HPV предоставляет полезную информацию для сортировки цитологических нарушений, детектируемых в процессе случайного скрининга. При обследовании 133 женщин с направлением на колопоскопию они обнаружили положительный предсказуемый результат 42%, который подобен результату, наблюдающемуся при дискариозе средней тяжести. Полученные данные в особенности относятся к HPV 16, поскольку обнаружено, что 39 из 42 HPV 16-положительных женщин имеют высокую степень CIN по результатам биопсии. Данное исследование подчеркивает важность определения вирусной нагрузки и только рассматривает высокие уровни типов высокого риска как положительные. Сох et al. (Cox JT, et al., (1995) Am J Obstet Gynecol 172: 946-954) продемонстрировали роль тестирования KPV с использованием системы улавливания гибридов (DIGENE Corporation, Gaithersburg, MD,USA) для сортировки женщин с пограничными результатами мазков. Данный анализ проводили на 217 таких женщинах, выбранных с помощью справочной службы колледжа, при этом для CIN II/III была получена чувствительность 93% по сравнению с 73% для повторной цитологии. Обнаружено, что высокая вирусная нагрузка также улучшает показатели путем уменьшения ошибочных положительных результатов. Если 5 RLU отбрасывают, то получают PPV приблизительно 24% при сохранении чувствительности.WO 91/08312 описывает способы установления прогноза для субъектов, инфицированных HPV, которые включают в себя измерение уровня активности HPV путем детектирования транскриптов полноразмерных, или генов HPV Е 6 и/или Е 7, или их части, в образце и сравнение результатов измерения активности HPV с ранее установленными взаимоотношениями между активностью и риском развития тяжелой дисплазии или карциномы шейки матки.WO 99/29890 описывает способы оценки инфекции HPV на основе измерения и анализа уровней экспрессии генов. В частности, WO 99/29890 описывает способы, основанные на измерении уровней экспрессии двух или нескольких генов HPV (например, E6, Е 7, L1 и Е 2 HPV) с последующим сравнением соотношения экспрессии сочетаний данных генов, позволяющие определять стадию HPVопосредованного заболевания у пациента. Ранее авторы настоящего изобретения установили, что можно осуществить пригодный для клинических нужд анализ HPV-ассоциированного заболевания с использованием простого определения наличия/отсутствия экспрессии транскриптов мРНК Е 6/Е 7, без необходимости точных количественных измерений уровней экспрессии. Данный способ является технически простым и в предпочтительном воплощении подходящим для автоматизации в формате пропускной способности от средней до высокой. Данный способ подробно описан в опубликованной авторами настоящего изобретения международной заявке WO 03/57914. Способ, описанный в WO 03/57914, предпочтительно проводят с использованием набора Pre-TectHPV-Proofer, который производится Norchip AS. Анализ HPV-Proofer предоставляет три уровня информации:(1) идентификация мРНК из пяти конкретных типов HPV (16, 18, 31, 33 и 45);(2) определение присутствия онкогена мРНК HPV E6/E7; и(3) определение присутствия полноразмерной мРНК Е 6/Е 7, указывающей на нарушение регуляции. Каждый образец подвергают трем дублированным реакциям NASBA, следовательно для каждого образца получают шесть результатов. Чтобы учесть возможное загрязнение, каждый раз используют от-2 010500 рицательные контроли. Чтобы учесть влияние реагентов, для всех типов HPV используют положительные контроли. Чтобы исключить возможные ошибочные отрицательные результаты, на протяжении всей процедуры тестирования присутствует внутренний клеточный контроль мРНК U1A (ген жизненно важных клеточных функций). Анализ HPV-Proofer не позволяет детектировать ДНК HPV. Автоматизированные серийные анализ, интерпретацию и предоставление данных осуществляют с помощью программного обеспечения для анализа PreTect (PAS). Применение анализа HPV-Proofer оценивают по меньшей мере в 12 клинических исследованиях. Авторы данного изобретения в настоящее время установили, что анализ Pre-Tect HPV-Proofer не позволяет детектировать вирионы HPV, несмотря на то что с его помощью можно детектировать мРНКHPV из HPV 16, 18, 31, 33 и 45. Присутствие транскрипта Е 6/Е 7, определяемое с помощью анализа HPVProofer, указывает на нарушение регуляции транскрипции и на снижение способности к репликации и/или экспрессии стабилизированного пре-мРНК Е 6/Е 7, кодирующей полноразмерный белок E6. С помощью анализа Pre-Tect HPV-Proofer нельзя детектировать инфекционные вирусные частицы HPV, поскольку после интеграции и при нарушении регуляции транскрипции вирус не способен продуцировать вирионы. У вирусов внутри клеток, которые, как обнаружено с помощью анализа HPV-Proofer, экспрессируют Е 6/Е 7, утрачивается нормальный жизненный цикл и нарушается регуляция либо в результате нарушения контролирования транскрипции промоторами из всех транскриптов Е 6/Е 7, либо в результате нарушения способности к нормальному сплайсингу, при этом остается транскрипт Е 6/Е 7, либо еще экспрессируется стабилизированная форма полноразмерного пре-мРНК, которая кодирует полноразмерный белок E6. Авторы данного изобретения также обнаружили, что экспрессия транскриптов мРНК Е 6/Е 7 в HPVинфицированных клетках коррелирует с клеточными изменениями, характеризующимися увеличением клеточных ядер, анеуплоидией (обычно более 5 или 9 центромеров на клетку), а также митозом. Клетки,положительные по экспрессии Е 6/Е 7 (например, по результатам анализа PreTect HPV-Proofer), имеют некоторые отклонения, у них обнаружены клеточные нарушения или большие зрелые клеточные ядра. Полученные результаты также коррелируют с цитологической и гистологической характеристикой поражений шейки матки. Цитологически или гистологически диагностированные поражения с низкой степнью злокачественности, не содержащие клеток с увеличенными клеточными ядрами и с менее чем 9 центромерами, не дают положительных результатов на экспрессию мРНК Е 6/Е 7 при использовании анализа HPV-Proofer. Таким образом, авторы данного изобретения обнаружили, что экспрессию транскриптов Е 6/Е 7 вируса папилломы человека можно использовать в качестве молекулярного показателя клеточных нарушений, связанных с хронической инфекцией вируса папилломы человека. Следовательно, детектирование экспрессии Е 6/Е 7 можно использовать для различения поражений матки с высокой и низкой степенью злокачественности. В частности, с помощью детектирования экспрессии Е 6/Е 7 можно различить образцы с гистологически диагностированной CIN III, содержащие и не содержащие анеуплоидные клетки; считают, что образцы, положительные по мРНК Е 6/Е 7, кодирующей полноразмерный белок E6, содержат анеуплоидные клетки. С помощью детектирования экспрессии Е 6/Е 7 также можно различить образцы с гистологически диагностированными случаями CIN III или CIN II (случаи HSIL), в которых происходит регрессия инфекции или в которых инфекция поддерживается на постоянном уровне или прогрессирует; что в образцах, положительных по мРНК Е 6/Е 7, кодирующей полноразмерный белок E6, при отсутствии лечения инфекция, скорее всего, прогрессирует. Авторы настоящего изобретения также сделали вывод, что:(1) частота обнаружения экспрессии онкогенов Е 6/Е 7 возрастает с увеличением тяжести поражения;(2) детектирование онкогенной активности HPV путем оценки экспрессии Е 6/Е 7, необязательно в сочетании с типированием HPV, является важным прогностическим фактором поражения с высокой степенью злокачественности;(3) подавляющее большинство раковых опухолей шейки матки (96%) содержит по меньшей мере один из пяти основных канцерогенных типов HPV (HPV 16, 18, 31, 33 и 45);(4) образцы, показывающие в анализе Pre-Tect HPV-Proofer положительный результат на экспрессию Е 6/Е 7, с гораздо большей вероятностью сохраняют хроническую инфекцию, чем образцы, не показывающие положительных результатов в анализе HPV-Proofer. Соответственно, в первом аспекте данное изобретение предлагает in vitro способ скрининга человека на предмет наличия вируса папиломы человека по меньшей мере в одной клетке или ткани, где у вируса папилломы человека наблюдается нарушение регуляции экспрессии мРНК Е 6/Е 7 и снижение репликации и/или экспрессии стабилизированного пре-мРНК, которая кодирует полноразмерный белок E6,причем данный способ включает в себя детектирование присутствия транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека, которые кодируют полноразмерный белок E6, в тестируемом образце, содержащем мРНК, полученную из клетки или ткани, где присутствие таких транскриптов мРНК Е 6/Е 7 в образце принимается за показатель присутствия вируса папилломы человека с нарушением регуляции экспрессии мРНК Е 6/Е 7 и сниженной репликацией и/или экспрессией стабилизированного пре-мРНК, которая кодирует полноразмерный белок Е 6 в клетке или ткани.-3 010500 Во втором аспекте данное изобретение предлагает in vitro способ скрининга человека на предмет наличия клеточных изменений, характеризующихся увеличением клеточного ядра и клеточной анеуплоидией по меньшей мере в одной клетке или ткани, причем данный способ включает в себя детектирование присутствия транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека, которые кодируют полноразмерный белок E6, в тестируемом образце, содержащем мРНК, полученную из клетки или ткани, где присутствие таких транскриптов мРНК Е 6/Е 7 в образце принимается за показатель, указывающий на то,что анализируемая клетка или ткань несут клеточные изменения. В третьем аспекте данное изобретение предлагает in vitro способ скрининга человека на наличие трансформирующей хронической инфекции вируса папилломы человека по меньшей мере в одной клетке или ткани, причем данный способ включает в себя скрининг субъектов на экспрессию транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека, который кодирует полноразмерный белок E6 в анализируемом образце, содержащем мРНК из клетки или ткани, где считается, что субъекты с положительным результатом анализа на экспрессию таких транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека имеют хроническую трансформирующую инфекцию вируса папилломы человека в клетке или ткани."Хроническая трансформирующая инфекция" одного из типов HPV 16, 18, 31, 33 или 45, идентифицированная по присутствию транскриптов мРНК Е 6/Е 7, кодирующих полноразмерный белок E6, из одного из указанных подтипов HPV, считается равнозначной хроническим клеточным нарушениям или хроническим поражениям CIN III, раковой опухоли in situ или сквамозным внутриэпителиальным поражениям с высокой степенью злокачественности (HSIL), диагностированным с помощью цитологического или гистологического анализа. Таким образом, способ третьего аспекта данного изобретения включает в себя скрининг на хроническую трансформирующую инфекцию вируса папилломы человека, которая равнозначна хроническим клеточным нарушениям или хроническим поражениям CIN III, раковой опухолиin situ или сквамозным внутриэпителиальным поражениям с высокой степенью злокачественности(HSIL). Хроническая трансформирующая инфекция HPV, диагностированная по устойчивому присутствию мРНК Е 6/Е 7 HPV, кодирующей полноразмерный белок E6, может непосредственно коррелировать с хронической CIN II+ и, следовательно, служить прогностическим маркером в программе скрининга шейки матки. В частности, способ данного изобретения можно использовать для сортировки женщин, у которых с помощью цитологического/гистологического анализа обнаружены нетипичные сквамозные клетки с неопределенной функцией (ASCUS) или сквамозное внутриэпителиальное поражение с низкой степенью злокачественности (LSIL). Лечение таких больных является проблематичным, поскольку только у некоторых из них происходит прогрессия нарушения до внутриэпителиальной неоплазии шейки матки(CIN) III и инвазивной карциномы шейки матки (ICC). Повторное цитологическое/гистологическое обследование не позволяет выявить женщин с повышенным риском CIN II+. В описанных здесь клинических исследованиях детектирование экспрессии полноразмерной мРНК Е 6/Е 7, кодирующей полноразмерный белок E6, в значительной степени специфична для высокозлокачественных поражений шейки матки, следовательно, присутствие таких транскриптов можно использовать в качестве прогностического маркера. Результат скрининга в способах данного изобретения считается положительным в случае детектирования экспрессии транскриптов мРНК Е 6/Е 7, которые кодируют полноразмерный белок E6. Положительный результат анализа на экспрессию мРНК Е 6/Е 7 показывает, что субъект несет вирус с нарушенной регуляцией экспрессии Е 6/Е 7, или экспрессирующий стабилизированный пре-мРНК, кодирующей полноразмерный белок E6, кроме того, он указывает, что субъект имеет аномальные клеточные изменения. Термин "нарушение регуляции Е 6/Е 7" в данном описании означает либо нарушение контролирования транскрипции промоторами из всех транскриптов Е 6/Е 7, либо нарушение способности к нормальному сплайсингу в открытых рамках считывания Е 6/Е 7. Термин "стабилизированный пре-мРНК" относится к первичному транскрипту Е 6/Е 7, который не подвергается никаким событиям сплайсинга в открытой рамке считывания Е 6 и, следовательно, кодирует полноразмерный белок и является более стабильным (т.е. имеет более продолжительный период полужизни), чем любой эквивалентный первичный (несплайсированный) транскрипт Е 6/Е 7, кодирующий полноразмерный белок Е 6, экспрессирующийся в нативном или дикого типа вирусе папилломы человека такого же подтипа HPV. Нативный или дикого типа вирус папилломы человека относится к вирусу, который не имеет геномной модификации, связанной с хронической инфекцией человека-хозяина, и не интегрируется в геном человека. Такие нативные и дикого типа вирусы характеризуются также тем, что сплайсинг пре-мРНК Е 6/Е 7 или полноразмерных транскриптов мРНК происходит сразу после транскрипции, поэтому полноразмерные пре-мРНК не накапливаются в клетке в какой-либо значительной степени. Таким образом, пре-мРНК, как правило, не транслируется в полноразмерный белок Е 6 в клетках, инфицированных нативным или дикого типа вирусом, поскольку пре-мРНК подвергается процессингу под действием аппарата сплайсинга перед трансляцией. Однако в клетке с нарушениями, связанными с хронической трансформирующей инфекцией HPV, пре-мРНК стабилизируется и/или не подвергается сплайсингу и, следовательно, может накапливаться в клетке на уровне, который не наблюдается в-4 010500 обычных клетках, или в обычных пролиферирующих клетках, например, в клетках, инфицированных реплицирующимся HPV. По сравнению с первичными (несплайсированными) транскриптами Е 6/Е 7, экспрессирующимися в нативном или дикого типа вирусе, стабилизированый пре-мРНК можно модифицировать, например путем добавления последовательностей мРНК, транскрибируемых из человеческого генома после интеграции вируса или путем делеции последовательностей HPV в участке транскрипта, находящегося вне открытой рамки считывания, кодирующей белок E6. Таким образом, стабилизированный пре-мРНК может иметь последовательность и структуру, отличающиеся от последовательности и структуры первичных(несплайсированных) транскриптов Е 6/Е 7, экспрессирующихся в нативном или дикого типа вирусе, но при этом кодировать полноразмерный белок E6. Термин "аномальные клеточные изменения" охватывает клеточные изменения, характерные для более тяжелых заболеваний, чем поражения шейки матки с низкой степенью злокачественности или сквамозные внутриэпителиальные поражения с низкой степенью злокачественности, в том числе клеточные изменения, характерные для заболеваний с такой же или более высокой тяжестью, чем у CIN с высокой степенью злокачественности (определяемой как неопластический рост трансформированных клеток),CIN (внутриэпителиальная неоплазия шейки матки) III, или высокозлокачественной сквамозной внутриэпителиальной неоплазии (HSIL), включающие в себя поражения с мультиплоидным профилем ДНК и"злокачественные" CIN-поражения с повышенными средними значениями ДНК-показателя, высоким процентом анеуплоидии ДНК и превышающими скоростями 2,5 с (Hanselaar et al., 1992, Anal Cell Pathol.,4: 315-324; Rihet et al., 1996, J. Clin Pathol 49: 892-896; and McDerraott et al., 1997, Br. J. Obstet Gynaecol. 104: 623-625). Внутриэпителиальная неоплазия шейки матки (сокращенно обозначаемая "CIN"), также называемая дисплазия шейки матки, представляет собой заболевание шейки матки, вызываемое вирусом папилломы человека. CIN подразделяют на типы I, II или III в зависимости от тяжести заболевания. Она считается предраковым нарушением, а не настоящим раковым заболеванием. Самая легкая форма, CIN I, обычно проходит сама по себе, но изредка она прогрессирует до ракового заболевания. Более тяжелые формы,CIN II и CIN III, чаще всего остаются на одном уровне или ухудшаются со временем. Они могут превратиться в раковое заболевание, но при правильном лечении этого почти никогда не происходит.HPV был идентифицирован как этиологический фактор развития клеточных изменений в шейке матки, который может вызывать развитие карциномы шейки матки. Указанные клеточные изменения связаны с конститутивной или устойчивой экспрессией белков Е 6/Е 7 из вирусного генома HPV. Таким образом, можно сделать вывод, что субъекты, у которых детектируется экспрессия мРНК Е 6/Е 7, особенно субъекты с устойчивой экспрессией Е 6/Е 7, определяемой в течение определенного приода времени,уже имеют клеточные изменения в шейке матки. Данные изменения могут иметь место в очень небольшом количестве клеток шейки матки и могут не детектироваться с помощью традиционных цитологических методов. Однако с помощью чувствительных, специфичных и точных способов детектирования мРНК Е 6/Е 7 можно идентифицировать субъекты, уже имеющие клеточные изменения в шейке матки, на гораздо более ранних стадиях, чем это позволяют сделать традиционные цитологические анализы. Это позволяет раньше начать лечение, помогающее предотвратить развитие карциномы шейки матки. В результате интеграции HPV в человеческий геном или в результате "модификации" модифицированного эписомального генома HPV, нарушается нормальная регуляция транскрипции вирусного онкогена Е 6/Е 7 (Durst et al., 1985, J Gen Virol, 66 (Pt 7): 1515-1522; Pater and Pater, 1985 Virology 145: 313-318;Schwarz et al., 1985, Nature 314: 111-114; Park et al., 1997, там же). Наоборот, в участках предраковых поражений и HPV-инфицированного нормального эпителия вирусы папилломы преимущественно находятся в "немодифицированной" эписомальной форме, следовательно, транскрипция онкогена (Е 6/Е 7) может отсутствовать или может происходить эффективная понижающая регуляция (Johnson et al., 1990, J GenVirol, 71 (Pt 7): 1473-1479; Falcinelli et al., 1993, J Med Virol, 40: 261-265). Обнаружено, что в результате интеграции ДНК вируса папилломы человека типа 16 в человеческий геном клеточная активность/геном становятся менее стабильными, а стабильность мРНК Е 6 и Е 7 увеличивается (Jeon and Lambert, 1995,ProcNatl Acad Sci USA 92: 1654-1658). Таким образом, интеграция HPV, часто наблюдающаяся при раке шейки матки и только иногда в участках поражения CIN (Carmody et al., 1996, Mol Cell Probes, 10: 107116), является важным событием в канцерогенезе шейки матки. Клиническое применение способов, основанных на анализе экспрессии только мРНК Е 6/Е 7, сильно зависит от способности достоверно оценить отрицательный результат анализа на экспрессию мРНК Е 6/Е 7. Для получения достоверных результатов нужен способ детектирования, обладающий максимальной чувствительностью и обеспечивающий минимальную вероятность получения ошибочных отрицательных результатов. В предпочтительном воплощении это достигается путем применения способа определения присутствия или отсутствия мРНК Е 6/Е 7, включающего в себя чувствительную амплификацию и детектирование в реальном времени. Наиболее предпочтительным способом является амплификация NASBA в реальном времени с применением молекулярных сигнальных зондов, описанная Leone etal., Nucleic Acids Research., 1998, Vol 26, 2150-2155. Благодаря чувствительности данного метода получение ошибочных отрицательных результатов минимизируется и результат "отрицательная экспрессия-5 010500 Е 6/Е 7" можно оценить с более высокой достоверностью. Это имеет большое значение для применения анализа в программе клинического скрининга. Предпочтительно анализировать экспрессию транскриптов мРНК Е 6/Е 7 одного или нескольких(более предпочтительно, всех) из типов HPV 16, 18, 31, 33 и 45. В одном воплощении анализ позволяет детектировать только указанные типы HPV. Среди норвежских женщин, принимающих участие в исследовании, более чем в 96% образцов карциномы шейки матки была обнаружена ДНК типов HPV 16, 18, 31 и 33. Другие исследования показали, что Е 6 и Е 7 почти всегда сохраняются при раке шейки матки, так как их экспрессия по всей вероятности необходима для развития и поддержания злокачественного состояния (Choo et al., 1987, J Med Virol 21: 101-107; Durst et al., 1995, Cancer Genet Cytogenet, 85: 105-112). В отличие от систем детектирования HPV, в основе которых лежит детектирование неповрежденного генома или последовательности гена L1, мРНК HPV, экспрессируемую участком Е 6/Е 7, можно детектировать более чем у 90% пациентов, непосредственно связанных с риском развития карциномы шейки матки. В клинике способы, основанные на детектировании мРНК Е 6/Е 7, можно использовать после скрининга или сортировки больных, т.е. для дополнительного обследования субъектов, имеющих первичный диагноз ASCUS, CIN I или кондилома. Данный способ можно использовать для выявления субъектов с высоким риском развития карциномы шейки матки среди группы пациентов с первичным диагнозомASCUS, CIN I или кондилома. ASCUS, кондилома и CIN I имеют более или менее одинаковый диагноз вследствие низкой воспроизводимости результатов разными цитологами и разными цитологическими учреждениями. Ostor (Int J. Gyn Path. 12: 186-192.1993) обнаружили, что только около 1% случаев CIN I могут развиваться до карциномы шейки матки. Таким образом, существует настоятельная потребность в эффективном способе выявления субъектов с ASCUS, кондиломой или CIN I, которые имеют существенный риск развития карциномы шейки матки. Один из типов HPV 16, 18, 31 или 33 обнаруживается в 87% случаев карциномы шейки матки, исследованных Karlsen et al., 1996. После включения HPV 45 обнаружено, что около 90% образцов карциномы шейки матки связано с указанными пятью типами HPV. Следовательно, из данных, предоставленных Ostor (Int J. Gyn Path. 12: 186-192, 1993), рассчитано, что более 99,9% случаев с диагнозом ASCUS, CIN I или кондилома пропущены при использовании набора настоящего изобретения HPV-Proofer. Благодаря высокой чувствительности и специфичности способа настоящего изобретения его можно использовать для первичного скрининга, набора ответ-тестирование или рутинной диагностики для выявления женщин с высоким или очень высоким риском развития карциномы шейки матки. В способе данного изобретения термин "положительный результат анализа на экспрессию" мРНК означает, что средний уровень экспрессии превышает фоновые значения. Не существует абсолютных требований для точного количественного определения уровня экспрессии мРНК Е 6/Е 7. В некоторых воплощениях способы данного изобретения могут включать в себя количественное определение уровней экспрессии мРНК. В предпочтительном воплощении, чтобы провести четкое различие между "положительным результатом анализа на экспрессию" и "отрицательным результатом анализа на экспрессию", принимают, что "положительным результатом анализа на экспрессию" считается присутствие более 50 копий соответствующей мРНК (в мл образца, или в общем объеме образца), тогда как "отрицательным результатом анализа на экспрессию" считается присутствие менее 1 копии соответствующей мРНК (в мл образца, или в общем объеме образца). Способы данного изобретения предпочтительно включают в себя анализ мРНК Е 6/Е 7 с использованием метода, который позволяет специфично детектировать мРНК Е 6/Е 7 из ассоциированных с раком типов HPV, более предпочтительно из типов HPV, ассоциированных с "высоким риском" ракового заболевания. В наиболее предпочтительном воплощении способы включают в себя анализ мРНК Е 6/Е 7 с использованием метода, который позволяет специфично детектировать мРНК E6 из типов HPV 16, 18, 31,33 и предпочтительно также 45. Наиболее предпочтительно, данный способ позволяет специфично детектировать экспрессию мРНК Е 6/Е 7 по меньшей мере из одного из типов HPV 16, 18, 31, 33 и предпочтительно также 45, и, наиболее предпочтительно, из всех пяти типов. Однако женщины, имеющие положительные результаты анализа на экспрессию Е 6/Е 7 из типов, отличных от 16, 18, 31, 33 и 45, например 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 и 68, также могут обладать клеточными нарушениями. Таким образом, данный способ может включать в себя анализ экспрессии мРНК Е 6/Е 7 из одного или нескольких из указанных типов HPV, наиболее предпочтительно, в дополнение к анализу мРНК Е 6/Е 7 из типов HPV 16, 18,31, 33 и 45. Некоторые типы HPV имеют заметное географическое/популяционное распространение. Поэтому иногда удобно использовать праймеры, специфичные для типа HPV, преобладающего в исследуемой популяционной/географической области, например в дополнение к анализу на типы HPV 16, 18, 31,33 и 45. Способы данного изобретения основаны на детектировании полноразмерных транскриптов мРНК Е 6/Е 7 некоторых или всех типов HPV, кодирующих полноразмерный белок Е 6. В данных воплощениях присутствие полноразмерной мРНК Е 6/Е 7 считается положительным результатом анализа. Термин "полноразмерные транскрипты мРНК Е 6/Е 7" не относится к природным вариантам сплайсинга, но включает в себя бицистронные транскрипты, которые кодируют функциональные полнораз-6 010500 мерные белки Е 6 и Е 7. До настоящего времни в клетках, инфицированных HPV 16, было обнаружено четыре вида мРНК Е 6/Е 7, а именно, несплайсированный транскрипт Е 6 и три сплайсированных транскрипта, обозначаемых Е 6I, E6II и E6III (Smotkin D, et al., J Virol. 1989 Mar 63 (3): 1441-7; Smotkin D,Wettstein FO. ProcNatl Acad Sci USA. 1986 Jul 83 (13): 4680-4; Doorbar J. et al., Virology. 1990 Sep 178(1): 254-62; Cornelissen MT, et al. J Gen Virol. 1990 May 71 (Pt 5): 1243-6; Johnson MA, et al. J Gen Virol. 1990Cancer. 1992 Feb 50 (3): 356-64). Все четыре транскрипта транскрибируются под контролем одного промотора (р 97), расположенного по ходу считывания сразу выше второго ATG E6 ORF. В случае HPV 16 термин "полноразмерные транскрипты Е 6/Е 7" относится к транскриптам, которые содержат весь или по существу весь участок от нуклеотида (нт) 97 до нт 880 в Е 6 ORF, включая нт 97 и 880. Нумерация нуклеотидов соответствует стандартной номенклатуре HPV (см. Human Papillomavirus Compendium OnLine,доступный через Интернет или из базы данных HV, Mail Stop K710, Los Alamos National Laboratory, LosAlamos, NM 87545, USA). В отношении типов HPV, отличных от HPV 16, термин "полноразмерные" транскрипты Е 6/Е 7 может включать транскрипты, которые содержат последовательность, гомологичную вышеуказанному участку транскрипта Е 6/Е 7 HPV 16, но не относится к сплайсинг-вариантам Е 6. Сравнительные анализы последовательностей типов HPV можно найти в открытом доступе в the Human Papillomavirus Compendium OnLine. Специфичное детектирование полноразмерных транскриптов мРНК Е 6/Е 7 можно проводить, например, с использованием праймеров или зондов, специфичных для участка, присутствующего только в полноразмерных транскриптах Е 6/Е 7, но не в сплайсинг-вариантах. Транскрипт Е 6I не содержит кодирующую последовательность, находящуюся между нуклеотидами 226 и 409 (в HPV типа 16), а транскрипт Е 6II не содержит кодирующую последовательность, находящуюся между нуклеотидами 226 и 526 (в HPV типа 16). Следовательно, предпочтительно использовать по меньшей мере один праймер или зонд из участка, расположенного между нуклеотидами 226 и 409HPV типа 16, или из гомологичного участка одного из типов HPV 18, 31, 33 или 45. Специфичности по отношению к полноразмерным транскриптам можно достичь путем применения пар праймеров, в которых один праймер специфичен для последовательности, расположенной в указанном участке, а второй праймер специфичен для последовательности, расположенной вне указанного участка, или в которых оба праймера специфичны для последовательностей, расположенных в указанном участке, предпочтительно в сочетании с зондом, специфичным для последовательности, расположенной в указанном участке. В других воплощениях, чтобы обеспечить специфичность для мРНК, кодирующей полноразмерный Е 6,можно использовать пару праймеров, в которой оба праймера специфичны для последовательностей,расположенных вне указанного участка, в сочетании с зондом, специфичным для последовательности,расположенной в указанном участке. Разные типы HPV имеют разный характер экспрессии мРНК Е 6/Е 7. Карты транскриптов, относящихся к разным типам HPV, в том числе к типам HPV 16 и 31, которые можно использовать при создании зондов или праймеров, используемых для детектирования полноразмерных транскриптов Е 6/Е 7,можно найти в открытом доступе в the Human Papillomavirus Compendium OnLine (как указано выше). Методология анализа Способы данного изобретения включают в себя анализ присутствия транскриптов Е 6/Е 7 по меньшей мере в одной клетке или ткани, и, более конкретно, в образце, содержащем Е'НК по меньшей мере из одной клетки или ткани. По меньшей мере одна клетка или ткань может включать в себя по меньшей мере одну клетку шейки матки, относящуюся к типу, восприимчивому к инфекции вируса папилломы человека, т.е. к клеткам эпителия шейки матки. Раскрываемые способы анализа можно проводить на препарате нуклеиновой кислоты, выделенном из клинического или биопсийного образца, содержащего клетки шейки матки и взятого у субъекта, участвующего в исследовании. Подходящие образцы, которые можно использовать в качестве источника нуклеиновой кислоты, включают в себя (но не только) мазки, взятые из шейки матки, биопсийные образцы, взятые из шейки матки, соскобы, взятые из шейки матки, образцы, которые берут с помощью щеток,тампонов и так далее, биопсийные образцы кожи/бугорков, а также погруженные в парафин ткани и клетки, фиксированные формалином или метанолом. Препарат нуклеиновой кислоты, подлежащий анализу с использованием раскрываемых способов,должен содержать мРНК, однако он не должен представлять собой препарат очищенной поли А+ мРНК,для реакции NASBA в качестве исходного вещества можно использовать препараты общей РНК или неочищенные препараты суммарных нуклеиновых кислот, содержащие как РНК, так и геномную ДНК, или даже неочищенные клеточные лизаты. Для выделения нуклеиновой кислоты из анализируемого образца можно использовать практически любой известный в данной области метод получения препарата нуклеиновой кислоты, содержащего мРНК. Предпочтительным методом является метод выделения "Boom",описанный в US-A-5234809 и ЕР-В-0389063. Данный метод, который можно использовать для получения препарата нуклеиновых кислот, содержащего и РНК, и ДНК, основан на способности нуклеиновых кислот связываться с частицами диоксида кремния в присутствии агента, вызывающего диссоциацию ком-7 010500 плексов, тиоцианата гуанидина (GuSCN). Способы данного изобретения основаны на оценке активной транскрипции генома HPV. Данные способы не ограничиваются точным методом, использующимся для детектирования экспрессии мРНК. В данной области существует много методов детектирования конкретных последовательностей мРНК, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. Например, конкретные мРНК можно детектировать методами гибридизации, амплификации или секвенирования. Лучше всего детектировать экспрессию мРНК методом амплификации, наиболее предпочтительно,изотермической амплификации, такой как NASBA, опосредованная транскрипцией амплификация, сигналопосредованная амплификация РНК-технологии, изотермическая амплификация в жидкой фазе и так далее. Все указанные методы хорошо известны в данной области. Более предпочтительно, экспрессию мРНК детектируют методом изотермической амплификации в сочетании с детектированием продукта амплификации в реальном времени. Наиболее предпочтительным сочетанием является амплификация методомNASBA и детектированием продукта амплификации в реальном времени с использованием технологии молекулярных сигналов, как описано Leone et al., Nucleic Acids Research, 1998, Vol 26, 2150-2155. Способы детектирования HPV в тестируемом образце с помощью метода NASBA, как правило,включают в себя следующие стадии:(a) получение реакционной среды, содержащей подходящие пары праймеров, РНК-зависимую ДНК-полимеразу, рибонуклеазу, которая гидролизует цепь РНК в гибриде РНК-ДНК, но не гидролизует одно- или двухцепочечные РНК или ДНК, РНК-полимеразу, которая распознает указанный промотор, а также рибонуклеозид- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;(b) инкубацию реакционной среды с препаратом нуклеиновой кислоты, выделенным из тестируемого образца, который предположительно содержит HPV, в условиях, которые обеспечивают протекание реакции амплификации по методу NASBA; и(c) детектирование и/или количественное определение любого HPV-специфичного продукта реакции амплификации по методу NASBA. Детектирование специфичного продукта (продуктов) реакции NASBA (т.е. смысловых и/или антисмысловых копий целевой РНК) можно проводить разными способами. В одном способе продукт(ы)NASBA можно детектировать с помощью HPV-специфичного гибридизационного зонда, способного к спицифической ренатурации с продуктом NASBA. Гибридизационный зонд может быть приссединен к детектируемой метке, например к флуоресцентному, люминесцентному, радиоактивному или хемилюминесцентному соединению, или к ферментной метке, или к метке любого другого типа, известной специалисту в данной области. Конкретная природа метки не является критической, однако метка должна быть способной продуцировать сигнал, детекируемый внешними средствами, либо сама по себе, либо в сочетании с одним или несколькими вспомогательными веществами (например, с субстратом фермента). Предпочтительным методом детектирования является так называемый метод "NASBA в реальном времени", который позволяет непрерывно отслеживать образование продукта реакции NASBA в течение реакции. В предпочтительном воплощении данный метод проводят с использованием "молекулярного сигнального" зонда, содержащего HPV-специфичную последовательность, способную к ренатурации с продуктом NASBA, олигонуклеотидную последовательность, образующую дуплексную основу, и пару фрагментов люминофор/гаситель, как известно в данной области и описано в данном документе. Если молекулярный сигнальный зонд добавляют в реакционную смесь перед амплификацией, образование продукта NASBA можно отслеживать в режиме реального времени (Leone et al., Nucleic Acids Research,1998, Vol 26,2150-2155). Наборы реагентов и приборное обеспечение для проведения детектированияNASBA в режиме реального времени являются коммерчески доступными (например, системаNucliSens EasyQ от Organon Teknika). В другом способе молекулярные сигналы могут быть включены в олигонуклеотидный праймер 2,что позволяет отслеживать реакцию NASBA в режиме реального времени без необходимости использовать отдельный гибридазационный зонд. В следующем способе продукты реакции NASBA можно регистрировать с помощью типового меченого детектируемого зонда, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью на 5'-конце олигонуклеотидного праймера 2. Для проведения данного способа можно использовать детектируемую систему "NucliSens", поставляемую Organon Teknika. В данной системе специфичности продуктов NASBA, полученных из целевой мРНК HPV, можно достичь путем применения HPV-специфичных улавливающих зондов, включающих в себя олигонуклеотидные зонды, как описано в данном документе, присоединенные к такому твердому носителю, как магнитные микросферы. Наиболее предпочтительно, типовой меченый детектируемый зонд представляет собой детектируемый зонд ECL, поставляемый Organon Teknika. Ампликоны NASBA гибридизуются с HPV-специфичными улавливающими зондами и типовым зондом ECL (при посредстве комплементарной последовательности праймера 2). После гибридизации комплексы микросферы/ампликон/зонд ECL могут улавливаться на магнитном электроде автоматического ридера ECL (например,ридера NucliSens, поставляемого Organon Teknika). После чего импульс напряжения запускает реакцию-8 010500 В основе предпочтительных воплощений данного способа лежит амплификация мРНК Е 6/Е 7 по меньшей мере из основных ассоциированных с раком типов HPV 16, 18, 31 и 33, и предпочтительно также из HPV 45. Существует несколько разных способов проведения данной амплификации. В одном воплощении для отдельной амплификации транскриптов из каждого типа HPV можно использовать отдельные пары праймеров, специфичные для каждого из типов HPV 16, 18, 31 и 33, и предпочтительно также HPV 45. Альтернативно, для мультиплексирования реакций амплификации можно использовать смеси двух или более пар праймеров в одном контейнере. В другом воплощении можно использовать одну пару праймеров, способную амплифицировать участок гена Е 6/Е 7 из типов HPV 16, 18, 31 и 33, и предпочтительно также HPV 45, которая обеспечивает всех четырех (предпочтительно пяти) типов в одной реакции амплификации. Этого можно достичь, например, путем применения пары вырожденных праймеров, или путем выбора участка мРНК Е 6/Е 7, который является высоко консервативным для всех типов HPV. Пара праймеров Е 6/Е 7 может соответствовать любому участку мРНК Е 6/Е 7 и может обеспечивать амплификацию всей или части открытой рамки считывания E6 и/или открытой рамки считывания Е 7. Предпочтительно, она обеспечивает амплификацию полноразмерных транскриптов, которые кодируют полноразмерный белок E6. В другом способе специфичности для нескольких типов HPV можно достичь путем применения вырожденных олигонуклеотидных праймеров или сложных смесей полинуклеотидов с незначительными вариациями последовательности, предпочтительно соответствующих участкам вариаций последовательностей среди генотипов HPV. Логическое обоснование применения таких вырожденных праймеров или смесей заключается в том, что смесь может содержать по меньшей мере одну пару праймеров, способную обеспечить детектирование каждого типа HPV. В следующем способе специфичности для нескольких типов HPV можно достичь путем включения в праймеры одного или нескольких инозиновых нуклеотидов, предпочтительно в участках вариаций последовательностей среди генотипов HPV. Списки подходящих праймеров и зондов, которые можно использовать для детектирования мРНК Е 6/Е 7 из разных типов HPV, можно найти в WO 03/057914 и в WO 03/057927. Полное содержание WO 03/057914 и WO 03/057927 включено в данное описание в качестве ссылки. Способ данного изобретения предпочтительно проводят с использованием анализа и набора PreTect HPV-Proofer. Однако следует понимать, что данное изобретение не ограничивается применением данного специфичного анализа. Считается, что способ настоящего изобретения имеет отрицательный результат для реального гистологического отрицательного результата и типичных образцов из целой или части шейки матки, корпуса и/или канала шейки матки. Это обеспечивает выдающуюся специфичность, которая делает PreTectHPV-Proofer одним из наиболее обещающих способов первичного скрининга, которые были когдалибо разработаны. Доказано, что специфичность отдельного применения PreTect HPV-Proofer для диагностики женщин с риском развития карциномы шейки матки не зависит от возраста и более, чем в три раза превосходит специфичность коммерческого анализа на основе ДНК при его отдельном применении. Детектирование транскриптов Е 6/Е 7 позволяет идентифицировать инфекции высокого риска, которые способны устойчиво существовать, без проведения повторного анализа. Число случаев экспрессии из онкогенов Е 6/Е 7 увеличивается с возрастанием тяжести поражения. Способы данного изобретения можно проводить в сочетании с генным типированием HPV любым подходящим методом. Термин "генное типирование HPV" относится к любому методу, который позволяет идентифицировать подтип(ы) HPV, присутствующий у конкретного субъекта. Ожидается, что оценка онкогенной активности HPV путем детектирования экспрессии Е 6/Е 7 в сочетании с типированием HPV будет служить важным инструментом, позволяющим предсказывать высокозлокачественные поражения. Данное изобретение далее разъясняется со ссылкой на нижеследующие экспериментальные примеры. Анализ Pre-Tect HPV Proofer Во всех экспериментальных примерах, относящихся к применению набора и анализа Pre-Tect HPVProofer, анализ проводят с использованием коммерчески доступного набора в соответствии с прилагающимися инструкциями. Дополнительную информацию, касающуюся выполнения анализа с детектированием мРНК Е 6/Е 7 HPV в реальном времени, можно найти в WO 03/057914, полное содержание которого включено в данное описание в качестве ссылки. В нижеследующем экспериментальном разделе приведены результаты клинических анализов, полученные с использованием анализа и набора Pre-Tect HPV-Proofer. Пример 1. Экспрессия мРНК Е 6 и Е 7 из канцерогенного вируса папилломы человека (HPV) в 4136 образцах шейки матки, собранных в группе амбулаторных больных. Целью данного исследования является идентификация присутствия мРНК и ДНК Е 6/Е 7 в образцах с HGSIL/CIN3, диагностированных цитологическим методом с гистологическим подтверждением.-9 010500 Материалы и методы Образцы берут у группы тщательно отобранных амбулаторных больных, включающей в себя женщин старше 30 лет (n=4136). Транскрипты Е 6/Е 7 из каждого типа HPV высокого риска 16, 18, 31, 33 и 45 детектируют с помощью анализа PreTect HPV-Proofer (NorChip AS, Klokkarstua, Norway), с использованием мультиплексной NASBA в режиме реального времени. Присутствие ДНК HPV определяют с помощью Gp5+/6+ консенсусной ПЦР и затем ДНК HPV-положительные образцы подвергают типспецифичной ПЦР для выявления типов HPV 16, 18, 31, 33 и 45. Женщин с диагнозом HGSIL по данным цитологического анализа направляют на биопсию и гистологию. Гистологически подтвержденные случаи регистрируют в Норвежской онкологической регистратуре(Norwegian Cancer Registry). В Норвегии цитологический диагноз HGSIL может подразделяться наHGSIL/AGUS, HGSIL/ASC-H, HGSIL/CIN2 и HGSIL/CIN3. Результаты Из 25 цитологических случаев HGSIL 14 по результатам гистологического анализа диагностированы как CIN2+. Два гистологических случая CIN2+ по результатам цитологического анализа диагностированы как HGSIL/ASC-H и HGSIL/CIN2. С помощью анализа PreTect HPV Proofer диагностировано 52%(13/25) цитологических случаев HGSIL, 86% (12/14) гистологических случаев CIN2+ и 9% (1/11) цитологических случаев HGSIL, не подтвержденных гистологией. Соответствующие значения для Gp5+/6+ ПЦР составляют 64% (16/25), 93% (13/14) и 27% (3/11). Один гистологический образец CIN2+, положительный по результатам консенсусной ПЦР, но отрицательный по результатам PreTect HPV-Proofer,идентифицируют как HPV 35. Встречаемость HGSIL/CIN3 составляет 0,29% (12/4136), а встречаемость гистологического CIN2+ составляет 56% (14/25). Значения чувствительности, специфичности, а также положительные и отрицательные прогностические значения для PreTect HPV-Proofer и консенсусной ПЦР приведены в табл. 1. Таблица 1PPV = Положительное прогностическое значение NPV = Отрицательное прогностическое значение Обсуждение и выводы Цитологический HGSIL/CIN3 и гистологический CIN2+ диагнозы хорошо согласуются и только один цитологический диагноз HGSIL/CIN3 не подтверждается как CIN2+ с помощью гистологического анализа. В гистологически подтвержденных случаях CIN2+ уровни детектирования для ДНК и для мРНКHPV являются высокими и почти идентичными. В цитологических случаях HGSIL, не подтвержденных гистологией, уровень детектирования в PreTect HPV-Proofer ниже, чем в консенсусной ПЦР. Вместе цитологические HGSIL/CIN3 PreTect HPV-Proofer детектируют все гистологические CIN2+. В заключение необходимо отметить, что транскрипты Е 6/Е 7 HPV из пяти наиболее часто встречающихся канцерогенных типов HPV, HPV 16, 18, 31, 33 и 45, по-видимому, присутствуют почти во всех гистологических случаях CIN2+. Высокая специфичность и высокое положительное прогностическое значение для PreTect HPV-Proofer являются преимуществом в диагностике HPV и, следовательно, детектирование мРНК является подходящим дополнением к цитологии и гистологии. Пример 2. Детектирование HPV как повторное обследование поражений с низкой степенью злокачественности в Шведской программе гинекологического скрининга. В Швеции приблизительно 40000 цитологических диагнозов в год имеют отклонения, которые требуют повторного обследования. Большая часть случаев спонтанно регрессирует, но некоторые прогрессируют при отсутствии лечения. Также существует проблема низкой чувствительности цитологического анализа при повторной процедуре. При детектировании предраковых поражений было обнаружено, что специфичность и чувствительность существенно возрастают, если анализ HPV проводится после цитологического диагностирования ASCUS или CIN I. Основной целью является оценка относительного значения анализов РНК и ДНК HPV по сравнению с цитологией и гистологией в Шведской программе скрининга. Другой важной целью является оценка риска упущения CIN II+ у женщин с диагнозом CIN I или ASCUS, но имеющих отрицательные- 10010500 результаты анализов на РНК или ДНК HPV. Материал для анализа получают от 15000 женщин после обычной программы скрининга в центральной части Швеции. Женщин с диагнозом ASCUS или CIN I по данным цитологического анализа отбирают для дальнейших исследований. Все цитологические или гистологические материалы заново оцениваются вслепую опытным патологом. Образцы, положительные по ASCUS и CIN I (N=240), анализируют методом PreTect HPV-Proofer (N=240), и через 4 месяца образцы, выбранные случайным образом,анализируют методом Hybrid Capture II (HCII) и цитологии (N=127) и только цитологии (N=112). Полученные результаты сравнивают с результатами гистологического анализа биопсийных образцов LEEP(N=126) через 7 месяцев и с результатами анализов PreTect HPV-Proofer (N=240), HCII и цитологии через 12 месяцев (табл. 2). Все образцы с ASCUS и CIN I анализируют на мРНК. Колоноскопия-направленные биопсийные образцы LEEP (N=126) берут как часть повторного обследования женщин с аномальным цитологическим диагнозом и/или положительным результатом анализа на ДНК HPV (через 4 месяца). ДНК HPV детектируют с помощью анализа HCII (Digene, Gatesburg, MD, USA). Идентификацию и индивидуальное типирование транскриптов мРНК Е 6/Е 7 из HPV 16, 18, 31, 3 3 и 45 проводят с помощью анализа PreTect HPV-Proofer (NorChip AS, Klokkarstua, Norway). Результаты Результаты анализов HPV сравнивают с результатами цитологических анализов через 4 и 12 месяцев и с гистологическим диагнозом через 7 месяцев после положительного цитологического диагноза. Частота и распределение типов HPV приведены в табл. 3. Соответствие результатов цитологических и гистологических анализов обнаружено в 19% случаев. Результаты цитологических анализов и анализов на ДНК гораздо чаще бывают положительными в случае доброкачественных и низкозлокачественных поражений, диагностированных с помощью гистологии, чем результаты анализа на РНК. При применении гистологии в качестве "золотого стандарта", анализ на РНК имеет более высокое положительное прогностическое значение и более высокую специфичность (46 и 85,3%, соответственно), чем анализ на ДНК (31 и 51%, соответственно). Однако анализ на ДНК имеет более высокую чувствительность (91%),чем анализ на РНК (81%). 19% случаев, обработанных конизацией LEEP, имеют аберрантную цитологию через 5 месяцев после обработки, 0,5% диагностируются как CIN II+. ДНК HPV детектируют в 24% случаев, а РНК HPV детектируют в 6% указанных случаев (табл. 2). Таблица 2. Общие результаты Таблица 3. Сравнение результатов гистологических анализов с результатами анализов на ДНК, РНК HPV и цитологических анализов- 11010500 Обсуждение и выводы Более высокое положительное прогностическое значение и более высокая специфичность анализа по РНК по сравнению с анализом по ДНК могут объясняться тем, что экспрессия онкогенов Е 6/Е 7 необходима для развития и поддержания злокачественного фенотипа. Риск упущения диагноза CIN II+ у женщин с CIN I или ASCUS, но имеющих отрицательный результат анализа РНК или ДНК HPV, является крайне низким (0,2%), подтверждая, что анализ HPV может использоваться как дополнение к цитологической диагностике ASCUS или CIN I. Пример 3. Инфекции HPV высокого риска с отсутствием экспрессии онкогена у женщин моложе 30 лет. Вирус папилломы человека (HPV) является распространенной вирусной инфекцией у женщин, особенно, в более молодых возрастных группах, хотя большинство инфекций является временным и бессимптомным. В скандинавских странах встречаемость HPV у женщин старше 30 лет варьирует от 5 до 15%, а встречаемость HPV у более молодых женщин может достигать 30-40%. Кроме того, 70-80% сексуально активных женщин в некий момент жизни приобретают инфекцию HPV. Однако большая часть инфекций спонтанно выводится и только небольшая часть сохраняется и развивается до внутриэпителиальной неоплазии шейки матки (CIN). Целью данного исследования является сравнение детектирования транскриптов Е 6/Е 7 и детектирования ДНК HPV у женщин моложе 30 лет. Материалы и методы Анализируют всего 282 образца шейки матки женщин моложе 30 лет (средний возраст 26,9 лет). РНК и ДНК экстрагируют с помощью экстрактора NucliSens и экспрессию мРНК Е 6/Е 7 из канцерогенных типов HPV 16, 18, 31, 33 и 45 детектируют методом PreTect HPV-Proofer (NorChip AS, Klokkarstua,Norway). Присутствие ДНК HPV определяют с помощью Gp5+/6+ консенсусной ПЦР и затем ДНК HPVположительные образцы подвергают тип-специфичной ПЦР на такие же 5 типов HPV. Результаты Всего 32,6% (n=92) образцов имеют положительный результат анализа ДНК HPV методом Gp5+/6+ ПЦР, причем обнаружено, что 24,8% (n=70) принадлежат к типам 16, 18, 31, 33 и 45. мРНК Е 6/Е 7 из этих же пяти типов HPV детектируется только в 15,2% (n=43) случаев. Пять канцерогенных типов HPV 16, 18, 31, 33 и 45 встречаются у 76% (70/92) ДНК HPVположительных образцов, тогда как экспрессия мРНК Е 6/Е 7 детектируется у 61% (43/70) данных случаев. Положительный результат цитологического анализа получают в 8/282 случаев (2,8%), из которых в 5/8 случаев наблюдается ASCUS и в 3/8 случаев наблюдается кондилома HPV. В случаях ASCUS ДНКHPV детектируют методом Gp5+/6+ консенсусной ПЦР и тип-специфичной ПЦР в 4/5 случаев, тогда как мРНК HPV обнаруживают только в одном образце. Однако в случае кондиломы HPV, ДНК HPV детектируют методом Gp5+/6+ консенсусной ПЦР во всех образцах (n=3), и методом тип-специфичной ПЦР в 2/3 случаев, тогда как экспрессия мРНК HPV E6/E7 обнаружена методом PreTect HPV-Proofer только в 1 случае. Обсуждение У женщин моложе 30 лет HPV встречается чаще, чем у более старших женщин. У них также чаще других типов встречаются канцерогенные типы HPV 16, 18, 31, 33 и 45. Уменьшение транскриптов Е 6/Е 7 может отражать эписомальное состояние вируса и, следовательно, контролируемую регуляцию процесса транскрипции. Указанные инфекции, скорее всего, выводятся. Однако интеграция вируса может нарушить ген Е 2 и, посредством этого, его функцию как регулятора транскрипции Е 6/Е 7. Вывод В указанной популяции молодых амбулаторных больных инфекцию HPV с экспрессией онкогена детектируют у менее 50% образцов, имеющих положительные результаты по данным консенсусной ПЦР. Таким образом, регистрация экспрессии гена Е 6/Е 7 типов HPV 16, 18, 31, 33 и 45 может служить ценным диагностическим анализом в добавление к цитологии. Детектирование мРНК позволяет лучше выявлять молодых женщин с прогрессирующим заболеванием. Пример 4. Способы тестирования HPV на основе анализа ДНК по сравнению со способами на основе анализа РНК. Целью данного исследования является проверка возможности применения двух коммерчески доступных анализов HPV для определения встречаемости инфекций HPV с высоким риском у женщин с отрицательными и положительными результатами цитологического анализа, а также сравнение результатов анализов на основе ДНК и РНК с результатами цитологических и гистологических анализов. Материалы и методы Женщин для исследования выбирают из обследующихся в амбулаторных учреждениях и у частных гинекологов. В данном исследовании участвуют 628 женщин со средним возрастом 40 лет (возраст участниц варьирует от 19 до 85). Вначале берут традиционный мазок Рар и оставшийся материал переносят во флакон PreservCyt (Cytyc Corporation). Анализ ДНК HPV высокого риска (типы 16, 18, 31, 33, 35, 39,45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68) проводят методом Hybrid Capture II (Digene Corporation), a индивидуальную- 12010500 идентификацию транскриптов мРНК Е 6/Е 7 из HPV 16, 18, 31, 33 и 45 проводят методом Pre Tect HPVProofer (NorChip AS) с использованием NASBA в режиме реального времени. Если анализ HPV показывает положительный результат или с помощью цитологического анализа обнаруживают HSIL, то проводят биопсию. Гистологический анализ используют в качестве "золотого стандарта". Результаты Соответствие цитологических и гистологических анализов обнаружено в 53% случаев. С помощью гистологического анализа высокозлокачественные (CIN 2+) поражения обнаруживают у 61% женщин, у которых по данным цитологического анализа диагностированы доброкачественные или низкозлокачественные поражения. Значение каппа составляет 0,31. Разные результаты двух анализов получены в 17%(109/628) случаев (табл. 4). Таблица 4. Анализ HPV по сравнению с гистологическим анализом в случаях с разными результатами двух анализов HPV Оба анализа HPV в значительной степени соответствуют степени злокачественности повреждений(р 0,001). Анализ ДНК чаще дает положительные результаты при доброкачественных и низкозлокачественных поражениях. Анализ ДНК имеет более высокую чувствительность, но более низкую специфичность по сравнению с анализом РНК (табл. 5). Таблица 5. Проведение анализа HPV для детектирования гистологически диагностированного CIN 2+ Вывод Анализ РНК имеет более высокое прогностическое значение и более высокую специфичность, чем анализ ДНК. Пример 5. Тип-специфичное устойчивое присутствие ДНК и РНК HPV. Продолжительность и устойчивость инфекции HPV анализируют у 54 женщин, которые являютсяHPV-положительными и не имеют заболевания по данным цитологического анализа, с использованием генного типирования HPV методом одномерной матрицы. Влияние инфекции HPV на развитие клеточных отклонений в шейке матки (дискариоз) изучают путем повторения генного типирования HPV и цитологического анализа через 2 года. Детектирование транскриптов HPV известных онкогенов HPV E6 и Е 7 методом HPV-Proofer также можно проводить в оба момента времени. Материалы и методы Жидкие образцы для цитологии (LBC) берут у 2000 из более чем 3000 женщин как часть непрерывного исследования, предпринятого для оценки устойчивого присутствия HPV (фоновый уровень). LBC чаще получают путем смыва образца шейки матки во флакон, содержащий раствор для консервации клеток, чем путем непосредственного нанесения его на предметное стекло, как это делают при традиционном анализе мазка Papanicalou. Младший медико-санитарный персонал проводит сбор образцов, плоские слои получают с помощью процедуры ThinPrep, а цитологическое определение степени злокачественности проводят в соответствии с руководствами Британского общества клинической цитологии. Составляют группу из 54 женщин, которые имеют нормальный результат цитологического анализа на уровне фона, но при этом имеют положительный результат анализа ДНК HPV по меньшей мере для одного из следующих типов HPV "высокого риска": 16, 18, 31, 33 и 45, которые считаются наиболее распростра- 13010500 ненными типами высокого риска в Европе и обнаруживаются в 90% случаев раковых опухолей. Через два года после фонового уровня женщин вызывают для взятия повторного мазка LBC и проводят цитологический анализ и анализ ДНК и РНК HPV. После цитологического анализа клетки, оставшиеся в образце LBC, центрифугируют при 3500 об./мин в течение 10 мин и хранят в виде разделенных на части клеточных осадков при -70 С перед экстракцией нуклеиновых кислот и детектированием HPV. Автоматизированную экстракцию ДНК проводят с помощью BioRobot 9604 (QIAGEN Ltd., Crawley, UK), используя реагенты, поставляемые в набореQIAamp 96 DNA Swab BioRobot, тогда как экстракцию РНК проводят с помощью колонок RNeasy(QIAGEN Ltd.), следуя инструкциям производителя для выделения из животных клеток. Перед детектированием HPV нуклеиновые кислоты хранят при -70 С. Генное типирование ДНК HPV проводят с помощью анализа гибридизации с одномерной матрицей(LA), коорый включает в себя гибридизацию ПЦР-ампликона размером 450 нт, полученного путем помещения праймера PGMY на нейлоновую пластинку, содержащую иммобилизованные зонды [Gravitt etal., 2000; Coutlee et al., 2002]. Пластинка содержит два уровня -глобиновых контрольных зондов, 18 зондов HPV высокого риска (HR-HPV); 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68, 73, 82, 83, и 9 зондов HPV низкого риска (LR-HPV): 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66, 84. Реагенты для ПЦР, пластинки с зондами и проявляющие реагенты получают от Roche Molecular Systems, Inc. (Alameda). Любой отрицательный по -глобину образец должен быть исключен из анализа. Амплфикацию РНК проводят методом изотермической амплификации NASBA, а тип-специфичное детектирование проводят с использованием молекулярных сигнальных (MB) зондов, направленных против полноразмерной мРНК Е 6/Е 7 типов HPV 16, 18, 31, 33, 45. Все реагенты, необходимые для амплификации NASBA и детектирования HPV, получают в составе набора PreTect HPV-Proofer, (NorChip, Klokkarstua, Norway). Детектирование флуоресценции накопленного продукта мРНК проводят в режиме реального времени с использованием анализатора NucliSens EasyQ, а профили флуоресценции анализируют с помощью программного обеспечения PreTect (PAS, NorChip). Результаты Через 2 года дискариоз развивается у 11/54 (20%) женщин и 31/54 и 23/54 женщин имеют временные и хронические инфекции, соответственно, регистрируемые путем генного типирования ДНК. У женщин с тип-специфической хронической инфекцией HPV дискариоз развивается с гораздо большей вероятностью, чем у женщин с временной инфекцией (Р 0,001). При повторном обследовании наличие транскриптов мРНК HPV E6-E7 позволяет диагностировать заболевание с меньшей чувствительностью,но с большей специфичностью. Кроме того, женщины с положительными результатами анализа ДНК и одновременно транскриптов мРНК более подвержены хронической инфекции, чем женщины, у которых ДНК детектируется только на фоновом уровне (Р 0,013). Данное исследование подчеркивает значение детектирования тип-специфичной хронической инфекции HPV для выявления женщин с повышенным риском нарушений в шейке матки. Детектирование транскриптов Е 6/Е 7, кодирующих полноразмерный белок E6, позволяет идентифицировать хронические инфекции HPV высокого риска, даже если детектирование проводится единовременно, без повторного анализа. Детектирование транскриптов мРНК Е 6/Е 7 позволяет идентифицировать инфекции, которые с большей вероятностью могут быть хроническими. Таблица 6. Соотношение детектируемых хронических инфекций HPV у субъектов,имеющих или не имеющих сопутствующих результатов по дискариозу при повторном анализе, определяемое с помощью генного типирования ДНК и детектирования транскриптов РНК HPV Таблица 7. Сравнение результатов генного типирования ДНК и детектирования транскриптов РНК при диагностике 11 случаев дискариоза Пример 6. В нижеследующих таблицах приведены результаты детектирования олноразмерных транскриптов мРНК Е 6/Е 7 методом PreTect HPV-Proofer по сравнению с результатами детектирования- 14010500 ДНК HPV методом консенсусной и тип-специфичной ПЦР в образцах от группы африканских амбулаторных пациентов. Образцы с результатом гистология (+) диагностируют как CIN II+ на основании гистологического анализа. Результаты данного исследования иллюстрируют специфичность анализа на основании детектирования транскриптов Е 6/Е 7, которые кодируют полноразмерный белок любого из типов HPV 16, 18, 31, 33 или 45 (например, PreTect HPV-Proofer), для образцов, имеющих клеточные нарушения, с диагнозом CINII+ на основании гистологического анализа. Анализ РНК имеет такую же специфичность, что и гистологический анализ, но более высокую чувствительность.- 15010500 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. In vitro способ скрининга человека на предмет наличия вируса папилломы человека по меньшей мере в одной клетке или ткани, при этом в вирусе папилломы человека (HPV) наблюдается нарушение регуляции экспрессии мРНК Е 6/Е 7 и снижение репликации и/или экспрессии стабилизированной премРНК, которая кодирует полноразмерный белок E6, причем данный способ включает в себя детектирование присутствия транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека, которые кодируют полноразмерный белок E6, в тестируемом образце, содержащем мРНК, полученную из клетки или ткани, где присутствие таких транскриптов мРНК Е 6/Е 7 в образце принимают за показатель присутствия вируса папилломы человека с нарушением регуляции экспрессии мРНК Е 6/Е 7 и сниженной репликацией и/или экспрессией стабилизированной пре-мРНК, которая кодирует полноразмерный белок E6 в клетке или ткани. 2. In vitro способ скрининга человека на предмет наличия клеточных изменений, характеризующихся увеличением клеточного ядра и клеточной анеуплоидией по меньшей мере в одной клетке или ткани,причем данный способ включает в себя детектирование присутствия транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека, которые кодируют полноразмерный белок E6, в тестируемом образце, содержащем мРНК, полученную из клетки или ткани, где присутствие таких транскриптов мРНК Е 6/Е 7 в образце принимают за показатель того, что анализируемая клетка или ткань несут клеточные изменения. 3. In vitro способ скрининга человека на наличие хронической трансформирующей инфекции вируса папилломы человека по меньшей мере в одной клетке или ткани, причем данный способ включает в себя скрининг субъекта на предмет экспрессии транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека, который кодирует полноразмерный белок E6 в анализируемом образце, содержащем мРНК, полученную из клетки или ткани, при этом считают, что субъекты с положительным результатом анализа на экспрессию таких транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека имеют хроническую трансформирующую инфекцию вируса папилломы человека в клетке или ткани. 4. Способ по любому из пп.1-3, который включает в себя детектирование наличия транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека с помощью метода, позволяющего детектировать мРНК Е 6/Е 7 по меньшей мере из одного ассоциированного с раком типа HPV. 5. Способ по п.4, который включает в себя детектирование наличия транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека с помощью метода, позволяющего детектировать мРНК Е 6/Е 7 из 16, 18, 31,33 и предпочтительно 45 типов HPV. 6. Способ по п.4, который включает в себя детектирование экспрессии транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 из любого одного или из любого сочетания двух или более из типов 16, 18, 31, 33 или 45 HPV, при этом наличие в образце транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 вируса папилломы человека из любого одного из тестируемых типов HPV принимают за положительный результат. 7. Способ по любому из пп.1-6, где детектирование экспрессии транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 проводят, используя реакцию амплификации для амплификации участка мРНК, с последующим детектированием продуктов реакции амплификации в режиме реального времени. 8. Способ по п.7, где детектирование экспрессии транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 проводят с помощью [реакции] NASBA в режиме реального времени. 9. Способ по п.8, где детектирование экспрессии транскриптов мРНК гена Е 6/Е 7 проводят с помощью набора для анализа Pre-Tect HPV-Proofer. 10. Способ по любому из пп.1-9, где человек является субъектом, у которого ранее было диагностировано инфицирование ДНК вируса папилломы человека, предпочтительно в анализируемой клетке или ткани. 11. Способ по любому из пп.1-10, где человек является субъектом с предварительным диагнозом поражения ASCUS, CIN 1 или кондиломы. 12. Способ по любому из пп.1-10, используемый для первичного скрининга субъектов, не имеющих по данным цитологического анализа предварительного диагноза нарушений в шейке матки.