Фармацевтические композиции, усиливающие иммуногенность антигенов со слабой иммуногенностью

1 Область техники Изобретение относится к лечению человека, и в частности к профилактическим и/или терапевтическим вакцинам, которые обеспечивают защиту против инфекций, аутоиммунных заболеваний и рака; и в частности к вакцинным композициям, индуцирующим или усиливающим иммунный ответ на антигены со слабой иммуногенностью. Предшествующий уровень техники Незначительные успехи, достигнутые к настоящему времени в предупреждении и лечении группы инфекционных заболеваний, рака и аутоиммунных заболеваний при использовании вакцин, обусловлены сочетанием различных факторов. Факторами, главным образом, являются низкая иммуногенность соответствующих антигенов, незнание того, как манипулировать регуляцией иммунной системы, и стратегии устранения патогенных микроорганизмов и опухолей и иммуносупрессия хозяина. На данном этапе хорошо известно, что антигены со слабой иммуногенностью представляют собой пептиды, полипептиды и белки (или последовательности соответствующих им ДНК),которые присутствуют в опухолях и нормальных тканях или ассоциированы с патогенными микроорганизмами, которые вызывают хронические инфекции, уклоняясь от воздействия иммунной системы. Показано, что из числа антигенов со слабой иммуногенностью рецепторы факторов роста с киназной активностью по остатку тирозина тесно связаны с развитием опухолей и опухолевых метастазов, и, как было установлено, в некоторых случаях они оказываются ценными как показатели плохого прогноза при раке. Это относится к рецепторам, подобным рецептору эпидермального фактора роста (EGF-R), также известному как HER-1, рецептору 2 эпидермального фактора роста (HER-2) и рецептору фактора роста тромбоцитов (PDGF-R). Сверхэкспрессия упомянутых рецепторов при некоторых видах неоплазии, главным образом, эпителиального происхождения является мишенью иммунотерапии при раке. Это относится к опухолям молочной железы, мочевого пузыря, яичников, вульвы, прямой кишки, легкого, мозга, предстательной железы и опухолям головы и шеи. Доказано, что присутствие EGF-R является показателем плохого прогноза при раке молочной железы (Perez R. et al., 1984. BreastCancer and Treatment 4: 189-193). Хотя роль системы EGF/EGF-R в регуляции роста опухолей еще не установлена, высказано предположение,что экспрессия EGF-R в опухолевых клетках обеспечивает механизм аутокринного стимулирования, который приводит к нарушенной пролиферации названных клеток (Schlessinger J. etal., (1983) Crit. Rev. Biochem. 14 (2): 93-111). Вследствие присутствия высокоэкспрессированного рецептора эпидермального фактора 2 роста в опухолях названный рецептор становится мишенью пассивной иммунотерапии (PI) моноклональными антителами в их нативной форме, ассоциированной с лекарственными средствами, токсинами или радиоактивными изотопами (Vollmar A.M. et al. (1987) J. Cell. Physiol. 131: 418-425). Проводится целый ряд клинических испытаний с моноклональными антителами (Мab), и в некоторых из них получены многообещающие результаты, как это имело место в случае клинического исследования с Mab C225 при раке молочной железы, на клетках поджелудочной железы и клетках почек в фазе II и при опухолях головы и шеи в фазе III испытания (Mendelsohn J. et al. (1999) American Societyof Clinical Oncology Meeting). Другое клиническое исследование в фазе II, в котором получены хорошие результаты, является исследованием, проведенным в отношении Mab IOR egf/r3 на опухолях головы и шеи (Crombet Т. et al.(2000) Cancer Biotherapy and Biopharmaceutical,в печати). С другой стороны, специфическая активная иммунотерапия (SAI) с использованиемEGF-R в качестве мишени никогда не разрабатывалась по причине слабой иммуногенностиEGF-R как собственно молекулы и ее широкой экспрессии в тканях, что оказалось предметом обсуждения и привело к тому, что иммунологи вовсе исключили из рассмотрения такой подходOpinion in Immunology 8: 637-642). SAI имеет преимущество по сравнению с PI, так как PI не активирует специфический клеточный эффекторный путь иммунного ответа, и его эффект зависит от периода полураспада таких используемых антител, которые обычно являются необходимыми для проведения длительных реинфузий, чтобы достигнуть требуемого действия. Для проявления эффективных вакцин носители и адъюванты должны действовать так,чтобы преодолеть слабую иммуногенность соответствующих антигенов посредством надлежащей регуляции иммунной системы и совместно способствовать стратегии устранения патогенных микроорганизмов и опухолей. По этой причине в настоящее время поиск новых носителей и адъювантных систем представляет собой важный аспект исследований. В последние годы новые теории и неожиданно появляющиеся сведения относительно регуляции иммунной системы открывают новые области экспериментирования для разработки новых, более эффективных носителей и адъювантов. Fearon, et al., (Science, Vol. 272, pp 50-53,1996) сообщили, что защитный иммунитет является результатом взаимодействия двух решающих систем: врожденного иммунитета и приобретенного иммунитета. Клетки, ответственные за приобретенный иммунитет, не могут отличать структуры, требующие иммунного ответа, от структур, не требующих его, поэтому 3 они должны быть проинформированы клетками системы врожденного иммунитета. Необходимая связь между врожденным иммунитетом и приобретенным иммунитетом обеспечивается антиген-представляющими клетками (АРС),среди которых дендритные клетки (DC) являются наиболее эффективными индукторами иммунного ответа, как первичные, так и вторичные DC. В частности, DC являются существенными, так как они являются единственными АРС, способными активировать девственные Тлимфоциты. Недавно были идентифицированы молекулы, связанные с врожденным иммунитетом, и их можно рассматривать как новую генерацию носителей и адъювантов, так как они способны заставлять DC созревать и опосредовать перекрестное представление антигенов, связанных с ними. Существует серия работ, в известном смысле отражающая уровень развития данной области. Giroir (Crit. Care Med., Vol. 5, рр 780789, 1993), Cella, et al. (Nature, Vol. 388, pp 782787, 1997), и Hailman, et al. (J. Exp. Med., Vol. 79, pp 269-277, 1994) сообщали, что взаимодействие между липополисахаридом (LPS) и системами узнавания врожденного иммунитета является наиболее мощным из всех и стимулирует продукцию цитокина и провоспалительных медиаторов в моноцитах, макрофагах и нейтрофилах, тем самым дополнительно увеличивая экспрессию молекул адгезии. Упомянутые воспалительные цитокины являются очень важными для ответа на инфекции и опухоли, но их чрезмерная секреция приводит к септическому шоку, который может быть смертельным для пациентов и препятствует применению LPS в качестве вакцинного адъюванта. Ответ опосредуется комплексом, образованным между LPS и связывающим белком, называемым липополисахаридсвязывающий белок (LBP), который, в свою очередь, взаимодействует с CD14-молекулой. Упомянутая молекула способствует взаимодействию LPS с сигнальными молекулами, называемыми Toll-рецепторами (TLR). Многочисленные данные указывают на Toll-рецептор 4and M.J. Newman, Plenum Press, New York,1995), Tholen, et al. (Vaccine, Vol. 16, p 708,1998), De Becker, et al. (Int. Immunol, Vol. 12, pp 807-815, 2000) установили, что имеются нетоксичные производные LPS, как в случае монофосфориллипида A (MPLA), который проявляет адъювантную активность в клеточных и гуморальных путях иммунного ответа и который вводили человеку в нескольких клинических испытаниях. Хотя, если установлено, что MPLA сохраняет иммуностимулирующие свойстваMPLA индуцирует миграцию и функциональное созревание DC in vivo, но на более низких уровнях, чем LPS.Tamura, et al. (Science, Vol. 278, pp 117-120,1997) и Binder, et al. (Nature Immunol., Vol. 1, pp 151-155, 2000) сообщили, что белки теплового шока (HSP) являются эффективными носителями, которые стимулируют клеточный иммунитет через феномен перекрестного представления антигена, для их сопутствующих антигенов. Полученные из опухолей HSP демонстрируют интересные противоопухолевые эффекты на различных моделях. Идентификация CD91 как рецептора для HSP gр 96 может отражать существование специфического пути захвата дендритными клетками белков теплового шока, которые эволюционируют до эффективно рекрутирующих пептидов, ассоциированных с антигенами, инфекционными агентами или пораженными клетками и представлены в этих клетках в главном комплексе гистосовместимости типа I (MHC I). Однако применение HSP как вакцинных носителей имеет неудобства, связанные с HSP, полученными из природного источника, например из опухолей. Это делает процедуру сложной и дорогой, и никогда точно не известно, который антиген ответственен за эффект.Immunol. Vol. 12, pp 3591-3597, 2000), Hochreiter,et al. (Int. Arch. Allergy Immunol., Vol 124, pp 406-410, 2001), и Deng, et al. (Arthritis Res. Vol. 3, pp 48-53, 2001) показали, что среди молекул,связанных с врожденным иммунитетом, идентифицированных как индукторы созревания DC,обнаружены последовательности CpG бактериальной ДНК. Недавно было продемонстрировано, что клеточный ответ на последовательностиCpG опосредован TLR9, что указывает на то,что названный рецептор способен отличать бактериальную ДНК от своей собственной ДНК. Индукция цитотоксических Т-лимфоцитов(CTL) против различных растворимых антигенов была воспроизведена на генетически модифицированных мышах, негативных по маркерамCD40, CD4 или MHC II. Это позволило сделать заключение, что активация CTL, которая опосредована CpG, происходит в отсутствие помощи от СD4-Т-клеток, придавая адъювантные свойства рассматриваемому виду молекул. Тем не менее, in vivo способность последовательностей CpG отклонять характер ответа от Th2 кTh1 полностью зависит от природы антигена и условий иммунизации, делая этот факт особо справедливым, если они являются белками. Это может представлять собой препятствие для эффективного применения олигонуклеотидов CpG как адъювантов, главным образом, у иммунологически скомпрометированных хозяев. Также 5 описано, что бактериальные последовательности CpG могут быть причиной артрита.Jeannin, et al. (Nature Immunol., Vol. 6, pp 502-509, 2000), и Miconnet, et al. (J. Immunol., Vol. 166, pp 4612-4619, 2001), в частности, обнаружили важные иммуностимулирующие свойства у белка OmpA Klebsiella pneumoneae, грамотрицательных бактерий. Эксперименты, проведенные с упомянутым белком, экспрессированным рекомбинантными способами (kpOmpA), показали, что белок связывает DC и индуцирует полное созревание DC, используя молекулу TLR2 как сигнальную молекулу. Другим важным свойством,установленным для рассматриваемого белка,является его способность вести антигены по пути представления класса I, при условии, что эти антигены гидрофобно или ковалентно связаны. В действительности, это является основным ограничением для них как вакцинных носителей, поскольку способ ковалентной конъюгации имеет недостаток - образование химических модификаций как самого белка, так и антигена, и гидрофобное связывание может быть использовано только подгруппой гидрофобных антигенов.Lowell в патенте США 5726292 описывает иммунопотенцирующую систему для повышения иммуногенности пептидов, полипептидов и белков, которую можно рассматривать как ближайший прототип данного изобретения. В вышеупомянутом патенте композиции характеризуются антигенами, которые химически модифицированы посредством добавления по меньшей мере одного остатка цистеина, а затем конъюгацией с алифатической жирной кислотой или гидрофобным пептидом. Впоследствии модифицированные антигены образуют комплексы с протеосомой при диализе или лиофилизации. В частности, упомянутые композиции не включают в себя гликозиды. Краткое описание изобретения Новизна данного изобретения заключается в создании препаратов, которые придают иммуногенность пептидам, полипептидам, белкам и последовательностям их соответствующих ДНК и клеткам-мишеням для представляющих интерес вакцин посредством связывания их с протеолипосомами очень небольшого размера (VSSP) из бактерий Neisseria meningitidis, которые несут эффективные лиганды врожденного иммунитета,и ганглиозидами, без необходимости в структурных изменениях в названных антигенах. В данном изобретении показано, что иммунопотенцирующий носитель состоит именно из протеолипосом очень небольшого размера(VSSP), полученных в результате ассоциации белкового комплекса наружной мембраны(ОМРС) из грамотрицательных бактерий Neisseriameningitidis с ганглиозидами. Данное изобретение относится к композициям, которые особенно эффективны, когда выбирают антигены со слабой иммуногенностью и 6 вводят их иммунологически скомпрометированным хозяевам. Один аспект данного изобретения заключается в обеспечении иммуногенными композициями, содержащими пептиды, полипептиды,белки, последовательности соответствующих им ДНК, клетки-мишени или их лизаты в качестве антигенов и протеолипосомы очень небольшого размера (VSSP), которые образуются в результате связывания белкового комплекса наружной мембраны (ОМРС) из Neisseria meningitidis(грамотрицательных бактерий) с ганглиозидами гидрофобной связью. Кроме того, установлено,что упомянутые композиции могут быть приготовлены отдельно или в виде эмульсий с неполным адъювантом Фрейнда (IFA), а также могут быть лиофилизированы. Другой аспект изобретения заключается в обеспечении иммуностимулирующими композициями,способными вызывать антигенспецифические иммунные ответы даже у иммунологически скомпрометированных хозяев, таких как пациенты, страдающие раком или хроническими вирусными инфекциями. У названных пациентов введение вакцинных композиций, описанных в данном изобретении, позволяет восстановить функциональность иммунной системы. Кроме того, описанные в данном изобретении вакцинные композиции являются решением проблем иммуногенности рецепторов факторов роста и их влияния при лечении опухолей, так как названные рецепторы, проявляющие тирозинкиназную активность, и ганглиозиды, которые, в частности, ассоциированы с ними в мембранных молекулярных кластерах, одновременно присутствуют в иммунной системе хозяина как "red flag"-сигналы, представленные посредством VSSP, и необходимы, чтобы эффективно активировать дендритные клетки (DC) и вызывать перекрестную презентацию. Такие вакцинные композиции избавляют от применения химических способов белковой конъюгации, при которых образуются новые поддельные иммунодоминантные эпитопы, в дополнение к факту, что они представляют их компоненты в иммунной системе, имитируя молекулярные ассоциации, в которых они по природе встречаются в опухолевых клетках. С другой стороны, описанное технологическое решение позволяет использовать целостные структуры рецепторов, тем самым разрешая проблему иммунодоминантной генетической рестрикции, в противоположность остальным решениям, когда используют производные пептидов, и в этом случае может быть больше ограничений в этом отношении. Точнее, изобретением предусматриваются вакцинные композиции для лечения рака. Названные вакцинные композиции содержат в качестве активного ингредиента один или более рецепторов факторов роста или их внеклеточные домены, содержащие или не содержащие их 7 трансмембранные домены, и в качестве вакцинного носителя - протеолипосомы очень небольшого размера (VSSP), полученные из белкового комплекса наружной мембраны Neisseria meningitidis,и ганглиозиды, которые специфически ассоциированы с ними, тем самым формируя мембранные молекулярные кластеры. Названные вакцинные композиции дополнительно могут содержать подходящий адъювант. Вакцинные композиции согласно изобретению можно применять в активной иммунотерапии, особенно при опухолях, таких как рак предстательной железы, прямой кишки, легкого,молочной железы, яичника, головы и шеи, вульвы и мочевого пузыря, глиома, а также при нетрансмиссивных хронических заболеваниях. Описание изобретения Данное изобретение относится к созданию фармацевтических композиций, способных потенцировать иммуногенность антигенов со слабой иммуногенностью, содержащих(А) один или более антигенов со слабой иммуногенностью;(B) вакцинный носитель, содержащий протеолипосомы, полученные из белкового комплекса наружной мембраны штамма грамотрицательных бактерий и несущие в себе ганглиозиды; и(C) возможно, один или более адъювантов. Композиции данного изобретения усиливают иммуногенность слабоиммуногенных антигенов, которые могут быть пептидами, полипептидами, белками и соответствующими им последовательностями нуклеиновых кислот, а также клетками-мишенями для вакцин или их лизатами и их комбинациями. В антигенах со слабой иммуногенностью могут быть использованы рецепторы факторов роста или их внеклеточные домены. Названные внеклеточные домены рецепторов факторов роста могут содержать или не содержать их трансмембранные области. Рецепторами факторов роста, которые можно применять для усиления иммуногенности, являются HER-1, HER-2, PDGF-R или любые их комбинации, содержащие внеклеточный домен в отсутствие или в присутствии их трансмембранной области. Протеолипосомы для вакцинного носителя, используемого в данном изобретении, получают из белкового комплекса наружной мембраны (ОМРС) штамма грамотрицательных бактерий, предпочтительно Neisseria meningitidis,которые могут быть штаммом дикого типа или генетически модифицированным штаммом. В композициях согласно изобретению протеолипосомы, несущие в себе ганглиозиды, получают путем гидрофобного включения названных ганглиозидов в белковый комплекс наружной мембраны (ОМРС) Neisseria meningitidis. Для этой цели можно использовать ганглиозидыGM1 и GM3 или их N-гликолилированные варианты. Дополнительно композиции содержат адъювант, который может быть масляным адъювантом или природным или рекомбинантным полипептидом. Предпочтительным масляным адъювантом является неполный адъювант Фрейнда или монтанид (Montanide) ISA 51. Аналогично, если используют полипептидный адъювант, он может представлять собой цитозин, такой как гранулоцитарно-макрофагальный колoниестимулирующий фактор, или химозин. Композиции данного изобретения могут быть эффективными при профилактике и лечении рака, в особенности рака предстательной железы, прямой кишки, легкого, молочной железы, яичника, головы и шеи, вульвы и мочевого пузыря и глиомы, а также трансмиссивных хронических заболеваний. Также композиции можно применять для предупреждения и лечения вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний, и в частности композиции можно использовать для лечения синдрома приобретенного иммунодефицита, а также при лечении аутоиммунных заболеваний. Данное изобретение предусматривает композиции, которые придают иммуногенность слабоиммуногенным пептидам, рекомбинантным или природным белкам, клеточным лизатам, интактным клеткам и нуклеиновым кислотам. Иммуностимулирующие композиции могут быть охарактеризованы как препараты, обладающие способностью стимулировать как гуморальный, так и клеточный ответы против определенного антигена. Кроме того, рассматриваемые композиции обладают особым свойством восстанавливать иммунитет у иммунологически скомпрометированных индивидуумов, таких как пациенты,страдающие раком и хроническими вирусными инфекциями или особым типом аутоиммунного заболевания. В данном изобретении отмечено, что иммунопотенцирующий носитель состоит из протеолипосом очень небольшого размера (VSSP),полученных из ассоциации белкового комплекса наружной мембраны (ОМРС) штамма грамотрицательных бактерий Neisseria meningitidis с включенными в нее ганглиозидами. Компоненты ОМРС подвергают диализу, который проводят в течение 2-15 дней, в результате которого включаются гликозилированные и/или ацетилированные ганглиозиды. Невезикулярный препарат получают в результате включения ганглиозидов в комплекс наружной мембраны; полученный невезикулярный препарат имеет очень небольшой размер, является видимым при электронной микроскопии, растворимым и проявляет высокую флотационную активность.VSSP данного изобретения демонстрируют неожиданные иммунологические свойства, такие как удивительную способность вызывать созревание дендритных клеток и иммунологически восстанавливать иммуносупрессивных пациентов. VSSPs получают в соответствии с кубинскими патентами 131/93 и 130/97, патентами США 5788985 и 6149921, а также по опубликованной статье Estevez, et al. (Vaccine, Vol. 18, pp 190-197, 1999). Используемые в данном изобретении антигенные пептиды могут быть синтетическими или экстрагированными из некоторых источников. Предпочтительный размер пептидов может составлять между 7 и 25 аминокислотами, в зависимости от типа Т-клеток, которые предполагают стимулировать. Кроме того, длина может колебаться между 3 и 50 аминокислотами. Пептиды могут быть нейтральными или положительно или отрицательно заряженными. Гидрофобная природа пептидов также может варьировать. В данном изобретении в некоторой степени показано, что используемые в изобретении рекомбинантные белки можно экспрессировать в различных экспрессирующих системах, таких как бактерии, дрожжи, растения и клетки млекопитающих. В предпочтительном аспекте данного изобретения предлагается применение N.meningitidis в качестве экспрессирующей системы, в которой представляющие интерес белки экспрессируются на наружной мембране самой бактерии. Это делает возможным то, что представляющий интерес белок непосредственно будет составлять часть ОМРС. В этом случае оказывается в равной степени обоснованной экспрессия целого белка или вставка некоторых из его полипептидов или пептидов в одну или более связей белка наружной мембраны изNeisseria meningitidis, такого как ТВР, Ора, Орс,и порины P1, P2 и Р 3. В особых аспектах изобретения показано,что антигены из описываемых вакцинных композиций могут быть рецепторами факторов роста, имеющими киназную активность, которые сверхэкспрессируются в опухолевых тканях, и,альтернативно, внеклеточными доменами с трансмембранной областью или без нее, и они имеют специфическую связь с ганглиозидами,экспрессированными в мембране опухолевых клеток. Это, кроме прочего, имеет место с HER1, HER-2 и рецептором PDGF. Упоминаемые в данном изобретении рецепторы факторов роста являются белками, полученными с плазмидами, экспрессирующимися в клетках млекопитающих, по рекомбинантным способам и полимеразно-цепьевой реакции(PCR), за которыми следуют обычные процедуры, описанные в публикациях по молекулярной биологии (Sambrook J., Frisch E.F., Maniatis T.,Molecular Cloning A Laboratory Manual, secondedition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989). Плазмиды, содержащие эти гены и коди 005138 10 рующие рецепторы или их варианты, устойчиво трансфицированы в клетки млекопитающих,такие как НЕК 293 (АТСС CRL 1573), NIH-3T3(АТСС CRL 1658) и СНО. Рецепторы или их варианты экспрессируются на мембранах трансфицированных линий или секретируются в супернатант, возможен любой вариант. Рассматриваемые антигены экстрагируют из мембран клеток млекопитающих, экспрессирующих их, или из супернатанта клеточных культур и очищают методом хроматографии. Затем их фильтруют в стерильных условиях и лиофилизируют. Их хранят при 4 С. Оптимальные количества полученных антигенов в вакцинных препаратах колеблются от 1 до 1000 мкг на дозу. Для данного определенного типа антигенов VSSP, используемые в вакцинных препаратах, содержат ганглиозиды, которые выбраны из ганглиозидов, специфически связанных с рецепторами факторов роста, таких как GM3 иGM1, среди прочего, образующих мембранные молекулярные кластеры.VSSP находятся в упомянутой вакцинной композиции в количестве от 1 до 1000 мкг, в зависимости от количества ганглиозидов на дозу вакцины. Предпочтительные вакцинные композиции согласно изобретению, содержащие рецепторы факторов роста в качестве антигенов, иммуногенность которых должна быть усилена, можно получать различными способами.(а) Данное количество растворов VSSP добавляют к лиофилизированным рецепторам факторов роста или их внеклеточным доменам(содержащим или не содержащим трансмембранную область) (1-100 мг белка) так, чтобы массовое соотношение рецептор/ганглиозид составляло от 0,1/1 до 1/1. Смесь перемешивают при 4-20 С в течение периода времени от 5 мин до 24 ч. Полученный препарат сохраняют при температуре 4 С до его введения хозяину. Непосредственно перед введением хозяину вышеупомянутый препарат добавляют к IFA в соотношении от 40/60 до 60/40, объем/объем, и перемешивают в течение 10-30 мин при комнатной температуре. Для требуемого типа эмульсии объемные соотношения охватывают адекватный диапазон в соответствии с используемым способом вакцинации.(b) Другой, в равной степени подходящий,способ приготовления заключается в хранении в отдельных контейнерах для лиофилизированных рецепторов факторов роста или их внеклеточных доменов (содержащих или не содержащих трансмембранную область) и для растворовVSSP, сохраняемых при 4 С. Определенное количество раствора VSSP добавляют к рецепторам факторов роста прямо перед введением хозяину; затем вакцинную композицию получают таким же способом, как описанный в п.(а).(c) Третий способ получения заключается в комбинировании в вакцинной композиции более одного рецептора фактора роста или его внеклеточного домена (содержащего или не содержащего трансмембранную область) с соответствующими растворами VSSP. Количество каждого антигена в вакцинной композиции и соотношения между ними должны находиться в пределах от 1 до 1000 мкг на дозу вакцины. Аналогично, количество каждого ганглиозида вVSSP в вакцинной композиции должно соответствовать области 1-1000 мкг на дозу вакцины. Для того чтобы приготовить комбинированную вакцину, рецепторы ростовых факторов или их внеклеточные домены (содержащие или не содержащие трансмембранную область), которые будут частью композиции, лиофилизируют в вышеупомянутых количествах, как указано в соответствующем пункте. Впоследствии определенные количества раствора VSSP добавляют так, чтобы соотношение масс рецептор/ганглиозид соответствовало диапазону от 0,1/1 до 1/1. Затем смесь перемешивают при 420 С в течение от 5 мин до 24 ч. Полученный препарат хранят при температуре 4 С до его введения хозяину. Непосредственно перед введением хозяину вышеупомянутый препарат смешивают взбалтыванием с IFA в соотношении между 40/60 и 60/40, объем/объем, в течение от 10 до 30 мин при комнатной температуре. Указанные объемные соотношения охватывают область, подходящую для требуемого типа эмульсии в соответствии с используемым способом вакцинации.(d) Другим способом приготовления комбинированной вакцины, упомянутой в п.(с), является способ, рассматриваемый в п.(b). С другой стороны, мультиантигенные системы, будучи клетками, взятыми из установленных опухолевых линий или непосредственно полученными от раковых больных, также используют в композициях данного изобретения. Инактивацию клеток проводят посредством гамма-лучевой терапии или обработкой митомицином С. Другая, в равной степени подходящая альтернатива представляет собой применение онколизатов, полученных механическим разрушением или вирусным инфицированием опухолевых клеток. Иммунопотенцирующие препараты данного изобретения могут быть успешно использованы в ДНК- и РНК-вакцинах. Иммуногенность ретро- и аденовирусных векторов, используемых в качестве вакцинных носителей, также возрастает при комбинировании их с описанными препаратами согласно изобретению. Упомянутые векторы содержат гены, кодирующие рассматриваемые антигенные белки. Обычно различные иммуногенные препараты получают при комбинировании разных антигенных систем с предварительно получен 005138 12 ными VSSP. Антигены, которые непосредственно вводят по рекомбинантному способу в наружную мембрану N. meningitidis, и антигены,которые вводят в протеолипосомы в процессе диализа, включаются уже в конце процесса получения VSSP. Кроме того, названные модифицированные протеолипосомы также могут быть использованы с другими, не включенными антигенами. Это дает возможность получения мультивалентных вакцин. Белковые антигенные препараты получают путем смешивания от 10 до 1000 мкг антигенного пептида или белка с определенными количествами VSSP, так, чтобы общее массовое соотношение белок/ганглиозид составляло от 1 до 3. Препараты хранят при температуре 4 С до введения хозяину. Другой, в равной степени подходящий способ получения заключается в отдельном хранении антигенных растворов и растворов VSSP при 4 С и смешивании их прямо перед введением. Композиции с нуклеиновыми кислотами получают путем непосредственного смешивания VSSP с растворами ДНК или РНК. Смешивание проводят при 4 С, используя 2-100 мкг нуклеиновой кислоты на 0,1 мг ганглиозида вVSSP. Описанный способ оказался осуществимым благодаря отсутствию нуклеаз в препаратах VSSP. В особо благоприятном способе, описанном в изобретении, живые вирусные векторы(вирус коровьей оспы, оспы птиц и другие вирусы), содержащие последовательности ДНК белков, представляющих интерес, вводят хозяину в/в (внутривенно) в количестве, колеблющемся от 106 до 5 х 107 бляшкообразующих единиц. VSSP вводят внутримышечным, подкожным, внутрикожным, пероральным или внутриназальным способом за 12 ч до и через 12 ч после введения вирусного вектора. Препараты с представляющими интерес клетками-мишенями или их лизатами получают сначала посредством осаждения соответствующих культур при центрифугировании и затем повторным суспендированием клеточного осадка в определенном количестве VSSP так, чтобы получить от 103 до 5 х 106 клеток на 0,1 мг ганглиозида. Названные количества непосредственно перемешивают взбалтыванием при 4-20 С в течение от 5 до 24 ч. Препараты хранят при температуре 4 С до введения хозяину. Другой, в равной степени подходящий способ приготовления заключается в хранении отдельно клеточных суспензий или их соответствующих лизатов и растворов VSSP при 4 С и смешивании их вместе непосредственно перед введением. Описанные в данном изобретении препараты, в которых антигены смешиваются с VSSP или включаются в VSSP, можно вводить отдельно или в виде эмульсии с неполным адъю 13 вантом Фрейнда (IFA). Эмульсии готовят непосредственно перед введением хозяину. Каждый препарат смешивают взбалтыванием с адъювантом в соотношении в диапазоне от 40/60 до 60/40, объем/объем, в течение от 10 до 30 мин при комнатной температуре. Названный диапазон объемного соотношения охватывает соответствующий требованиям диапазон для желаемого типа эмульсии согласно используемому способу вакцинации. В другом предпочтительном аспекте изобретения описанные препараты, в которых антигены смешивают с VSSP или включают вVSSP, лиофилизируют перед применением или отдельно, или в виде эмульсии с неполным адъювантом Фрейнда (IFA). Вакцинные композиции согласно изобретению можно вводить пациенту парентеральными способами (внутримышечным, внутрикожным, подкожным) или непосредственным нанесением на слизистые оболочки. Примеры Пример 1. Получение антигена вакцинной композиции, представляющего собой внеклеточный домен (ECD) мышиного EGF-R (ECDmEGF-R). Ген, кодирующий ECD-mEGF-R, амплифицировали, используя способ PCR, из комплементарной ДНК (кДНК) из печени крысы. PCR проводили смешиванием 1 мкг кДНК с 10 пмоль каждого специфического праймера. Позднее добавляли 0,2 мМ каждого dNTP и 1 ед. Таgполимеразы. Осуществляли все из 30 цикловPCR: 9 С, 1 мин (исключение для первого цикла, который продолжался 3 мин); 56 С, 1 мин; 72 С, 1 мин и 30 с (исключение для последнего цикла, который продолжался 5 мин). Амплифицированный ген клонировали в экспрессирующий вектор pcDNA3 клеток млекопитающих(Ampr, fori, ColE ori, CMV-промотор, SV40 ori,SV40pa, неомицин, Invitrogen), а затем клеточную линию НЕK-293 устойчиво трансфицировали упомянутой плазмидой. Трансфекцию осуществляли по обычным способам и клетки выращивали в селективной среде. ECD-mEGF-R получали из супернатанта линии HEK-293/ECDmEGF-R, которая устойчиво экспрессируетECD-mEGF-R, полученный в супернатанте культуры, очищали методами аффинной хроматографии посредством связывания лиганда с матриксом (Affinity Chromatography Principlesand Methods 3:12, Pharmacia fine Chemicals); в дальнейшем стерилизовали через фильтр и лиофилизировали. Пример 2. Получение вакцинной композиции, содержащей ECD-mEGF-R, VSSP-GM3 и неполный адъювант Фрейнда (IFA), и объединение всех компонентов непосредственно перед введением. 14 Протеолипосомы, извлеченные из белкового комплекса наружной мембраны (ОМРС) изNeisseria meningitidis, содержащего включенный ганглиозид GM3, получали, как описано в патенте США 6149921. Используемый для этой цели комплекс ОМРС из N. meningitidis поставлялся институтом "Carlos J. Finlay" (С. Campa et al., EP 301992). 10 мг упомянутого комплекса ОМРС диспергировали в 0,5% растворе дезоксихолата натрия и 0,1% растворе додецилсульфата натрия, дополнительно содержащего 10 мгNGcGM3, при осторожном перемешивании в течение ночи при 4 С. Отделение растворенного OMPC-NGcGM3 от детергентов осуществляли путем диализа в течение 14 дней, используя мембрану 3,5 кДа. Диализат центрифугировали на ультрацентрифуге при 100000 g в течение 1 ч, а иммуногенный комплекс, присутствующий в супернатанте, стерилизовали через фильтр. Степень включения ганглиозида в белок определяли, используя реагент Bio-Rad для белков и резорцин для сиаловой кислоты. Этим способом получали включение 1 мгNGcGM3 на мг ОМРС. Количество вакцинного носителя, который предварительно получали, составляло 120 мкг по количеству ганглиозидов, включенных в протеолипосомы на дозу вакцины. Для приготовления иммуногенного материала 1 мг ECD-mEGF-R лиофилизировали и хранили при 4 С до иммунизации. Непосредственно перед введением мышам к антигену добавляли 2,4 мг VSSP-GM3 (на основании количества ганглиозида) в объеме 1 мл и оба компонента смешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем добавляли 1 мл IFA и смешивали взбалтыванием при комнатной температуре в течение 20 мин. Пример 3. Получение вакцинной композиции, содержащей ECD-mEGF-R, VSSP-GM3 иIFA, путем смешивания части этих компонентов и хранения смеси до введения. Протеолипосомы, происходящие из белкового комплекса наружной мембраны (ОМРС) изNeisseria meningitidis, содержащего включенный ганглиозид GM3, получали, как описано в патенте США 6149921. Количество используемого вакцинного носителя составляло 120 мкг на основании количества включенных ганглиозидов на дозу вакцины. Для приготовления иммуногенного материала 1 мг ECD-mEGF-R лиофилизировали, а затем добавляли 2,4 мг VSSP-GM3 (по количеству включенных ганглиозидов) в объеме 1 мл. Оба компонента смешивали при комнатной температуре в течение 15 мин и смесь хранили при 4 С до иммунизации. Непосредственно перед введением мышам добавляли 1 мл IFA и смешивали, взбалтывая при комнатной температуре в течение 20 мин. Пример 4. Получение комбинированной вакцины, содержащей ECD-HER-1, ECD-HER-2,VSSP-GM3 и IFA. Протеолипосомы, полученные из белкового комплекса наружной мембраны (ОМРС) изNeisseria meningitidis, содержащего включенный ганглиозид GM3, получали, как описано в патенте США 6149921. Количество используемого вакцинного носителя составляло 120 мкг на основании количества ганглиозидов, включенных в протеолипосомы, на дозу вакцины. Для приготовления иммуногенного материала 1 мг ECD-HER-1 и 1 мг ECD-HER-2 лиофилизировали вместе и хранили при 4 С до иммунизации. Непосредственно перед введением мышам добавляли 2,4 мг VSSP-GM3 (по количеству ганлиозида) в объеме 1 мл. Все компоненты смешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем добавляли 1 мл IFA и смешивали, взбалтывая при комнатной температуре в течение 20 мин. Пример 5. Индукция специфического иммунного ответа против аутогенного EGF-R с помощью вакцинной композиции. Мышей линии C57BL/6 иммунизировали вакцинной композицией, содержащей ECDmEGF-R/VSSR-GM3 и IFA, полученной, как описано в примере 2. Доза иммуногенного материала составляла 50 мкг на мышь по количеству антигена в композиции. Схема иммунизации заключалась в трех дозах, вводимых внутримышечно (в.м.) каждые 15 дней, с взятием крови на 0, 21, 35 и 56 день после первой иммунизации (группа II). В качестве контрольной группы, мышей той же линии иммунизировали 50 мкг ECD-mEGF-R, химически сопряженного с KLH и внесенного в полный адъювант Фрейнда (CFA) и IFA, следуя той же схеме иммунизации (группа I). Полученную сыворотку анализировали методом ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) для определения ECDmEGF-R. ELISA осуществляли, покрывая плашки 10 мкг/мл ECD-mEGF-R. После блокирова 16 ния плашки PBS/5% телячьей сывороткой сыворотки от контрольных и иммунизированных животных инкубировали в сериях различных разведений. Затем добавляли анти-IgG-антитела мыши (специфичные в отношении Fc), конъюгированные с щелочной фосфатазой (Sigma). Все вышеупомянутые инкубированные пробы оставляли на 1 ч при 37 С и после каждой из упомянутых стадий проводили три отмывкиPBS/0,05% твином 20. Реакцию начинали добавлением 1 мг/мл субстрата (паранитрофенилфосфата) в диэтаноламин-буфере, рН 9,8. Оптическую плотность при 405 нм измеряли с помощью ELISA-ридера через 30 мин. У 100% мышей, иммунизированных вакцинной композицией согласно изобретению,индуцировался ответ антител, специфичных кECD-mEGF-R; ответ становился более выраженным в процессе иммунизации, и достигались титры антител вплоть до 1/160000, тогда как преиммунные сыворотки не распознавалиECD-mEGF-R. Изотипом ответа антител, в основном, был тип IgG. Распределение подклассов антител индуцированного ответа определяли методом ELISA. 20,21% антител составляли IgG2a, 36,03% - IgG1 и 38,93% составляли IgG2b, определяя сдвиг относительно характера ответа Тh1 по сравнению с контрольной группой (фиг. 1). Хотя исследуемую вакцинную композицию сравнивали с композицией, в которой ECDmEGF-R химически связан с KLH и в которойCFA использовали как адъювант, индуцированные титры антител для препаратов оказались выше, а тенденция распределения подклассов оказалась тенденцией структуры Тh1, являясь благоприятной для эффективности названной вакцины. Мыши, иммунизированные ECD-mEGFR/VSSP-GM3/IFA, не проявляли клинических симптомов токсичности, а биохимические тесты, выполненные на сыворотках названных животных, не выявили отличий от сывороток неиммунизированных животных (табл. 1). Таблица 1 17 Пример 6. Распознавание сыворотками мышей, иммунизированных ECD-HER-1/VSSPGM3/IFA, клеток, экспрессирующих EGF-R человека. Линию клеток А 431 (10000 клеток/лунку),экспрессирующую рецептор эпидермального фактора роста, инкубировали с преиммунной сывороткой мышей C57BL/6, разведенной до 1/5 (А); моноклональными антителами ior egf-r3 против EGF-R в качестве позитивного контроля в концентрации 10 мкг/мл (В); и сыворотками иммунизированных мышей C57BL/6, разведенными до 1/5 (С), в течение 30 мин при комнатной температуре. Промывками фосфатным буфером/0,5% раствором телячьей сыворотки удаляли избыток антител, не связанных с рецептором или связанных с ним неспецифическим образом. Иммунодетекцию клеток осуществляли инкубацией клеток с вторичными антимышиными антителами, конъюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом, разведенными до 1/50, в течение 30 мин при комнатной температуре. Интенсивность флуоресценции измеряли в проточном цитометре (FC). Сыворотки мышей, иммунизированных вакцинным препаратом, распознавали клетки, экспрессирующие EGF-R, при интенсивности, сравнимой с интенсивностью экспериментального позитивного контроля, в отличие от преиммунных сывороток от тех же самых животных (фиг. 2). Пример 7. Цитолитическая активность сывороток мышей, иммунизированных ECD-HER1/VSSR-GM3/IFA. Клеточные линии А 431 (3 х 106 клеток) инкубировали с радиоактивным хроматом натрия 51 Сr в течение 1 ч и удаляли избыток радиоактивной соли трехкратным промыванием культуральной средой. Клетки, меченные Сr51, инкубировали сiv) сыворотками от мышей C57LB/6, иммунизированных ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA,разведенными до 1/20. После 1 ч инкубации при 37 С добавляли 40 мкл кроличьего комплемента, продолжая инкубацию при 37 С. Позднее пробирки центрифугировали и по 100 мкл супернатанта использовали для измерения в гамма-счетчике высвобождения 51 Сr как оценку клеточного лизиса, опосредованного антителами и комплементом. Тотальное включение измеряли при тотальном лизисе под действием детергента. Сыворотки мышей, иммунизированных названной вакцинной композицией, вызывали 80% 18 лизис клеток А 431, экспрессирующих EGF-R, с другой стороны, преиммунные сыворотки указанных мышей вызывали только 35% лизис (фиг. 3). Пример 8. Нейтрализующая способность сывороток мышей, иммунизированных ECDHER-1/VSSP-GM3/IFA. Сыворотки мышей, иммунизированных вакцинной композицией данного изобретения,анализировали, чтобы определить их способность ингибировать связывание EGF с его рецептором на мембране клеток А 431. Для этого клетки А 431 выращивали в культуральных планшетах до конфлуэнтности. Как только достигалась конфлуэнтность, добавляли пул иммунных сывороток в различных разведениях(1/5, 1/10, 1/20, 1/40), а затем добавляли EGF-125I в соотношении 100000 число импульсов/лунку. Емкость каждой лунки заполняли вплоть до 500 мкл PBS/1% BSA. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, после инкубации реакцию гасили добавлением 2 мл холодной смеси PBS/1% BSA. После этого жидкость из каждой лунки удаляли, а лунки осторожно промывали PBS/1% BSA и добавляли 300 мкл 2 М NaOH в каждую лунку. После 30 мин экспозиции при комнатной температуре отбирали по 200 мкл из каждой лунки и регистрировали счет в гамма-счетчике. Показано, что пул иммунных сывороток ингибирует связывание EGF-125I с его рецептором в мембране клеток А 431. Степень ингибирования зависела от разведения сывороток (фиг. 4). Пример 9. Жизненный цикл мышей, иммунизированных ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA. Мышей линии C57/BL6, иммунизированных ECD-mEGF-R/VSSP-GM3/IFA (тремя дозами 50 мкг, каждые 15 дней внутримышечно),вакцинировали 100000 клетками Льюиса (Lewis) и за мышами наблюдали, чтобы определить их жизненный цикл. Клетки Льюиса получали из аденокарциномы легких мыши, экспрессирующей EGF-R. Жизненный цикл исследуемых мышей сравнивали с циклом группы мышей,иммунизированных ECD-mEGF-R/CFA (тремя дозами по 50 мкг каждые 15 дней подкожно). У мышей, иммунизированных вакцинной композицией с ECD-mEGF-R/VSSP-GM3/IFA, установлен жизненный цикл, значительно более продолжительный (р 0,05), чем у контрольной группы (фиг. 5). Пример 10. Получение вакцинной композиции, содержащей химерные моноклональные антитела Р 3 (Р 3 сМАb), VSSP(GM3) и IFA. Протеолипосомы, происходящие из белкового комплекса наружной мембраны Neisseria 19 Для приготовления иммуногенного материала раствор, содержащий 2 мг/мл химерных моноклональных антител Р 3 (Р 3 сМАb) (патент США 5817513), смешивали в забуференном фосфатом физиологическом растворе с полученными VSSP(GM3) в соотношении 1/1 (объем/объем). Процесс смешивания заключался в перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин. Потом добавляли IFA в соотношении 1/1 (объем/объем). Пул перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин до тех пор, пока не получали эмульсию. Другой, в равной степени подходящий способ заключался в смешивании раствора, содержащего 2 мг/мл сМАb Р 3 в забуференном фосфатом физиологическом растворе с полученнымиVSSP(GM3) в соотношении 1/1 (объем/объем). Процесс смешивания заключался в перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин, а полученный раствор стерилизовали путем фильтрации через ацетатцеллюлозную мембрану 0,2 мкм. После измерения, заполнения в контейнеры и герметического закупоривания контейнеров препарат хранили при 4 С вплоть до 1 года. Непосредственно перед введением хозяину добавляли препарат IFA в соотношении 1/1 (объем/объем) и эмульсификацию получали перемешиванием при комнатной температуре в течение 15 мин. Пример 11. Получение вакцинной композиции, содержащей пептид из вариабельной области тяжелой цепи сМАb Р 3 (CDR3/VH-P3) и VSSP(GM3). Протеолипосомы, происходящие из белкового комплекса наружной мембраны NeisseriaVSSP(GM3) хранили в концентрации 4,8 мг/мл в растворе трис/HCl, рН 8,9, при температуре 4 С до применения. Непосредственно перед введением хозяину иммуногенный материал получали сначала посредством растворения лиофилизированного пептида CDR3/VH-P3 в забуференном фосфатом физиологическом растворе до концентрации 4 мг/мл. Затем раствор смешивали с препаратом VSSP(GM3) в соотношении 1/1 (объем/объем). Процесс смешивания заключался в перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин. Другой, в равной степени подходящий способ заключался сначала в растворении лиофилизированного пептида CDR3/VH-P3 в забуференном фосфатом физиологическом растворе до концентрации 4 мг/мл. Затем раствор смешивали с препаратом VSSP(GM3) в соотношении 1/1 (объем/объем). Процесс смешивания заключался в перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин, а полученный раствор стерилизовали путем филь 005138 20 трации через ацетатцеллюлозную мембрану 0,2 мкм. После измерения, заполнения в контейнеры и герметического закупоривания контейнеров препарат хранили при 4 С вплоть до 1 года. Пример 12. Получение вакцинной композиции, содержащей онколизат меланомы В 16,VSSP(GM3) и IFA. Протеолипосомы, происходящие из белкового комплекса наружной мембраны NeisseriaVSSP(GM3) хранили в концентрации 2,4 мг/мл в растворе трис/HCl, рН 8,9, при температуре 4 С до применения. Для получения иммуногенного материала суспензию линии клеток меланомы В 16 мыши(50 х 106 клеток/мл) подвергали 5 циклам замораживания/оттаивания, чередованию инкубации в банях с жидким азотом и банях с дистиллированной Н 2O при 37 С. Полученный клеточный лизат центрифугировали при 500 х g в течение 10 мин. Полученный осадок повторно суспендировали в VSSP(GM3) до концентрации клеточного осадка, соответствующей 10 х 106 клеток на 2,4 мг GM3 в VSSP. Смесь перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем препарат добавляли к IFA в соотношении 1/1 (объем/объем). Смесь перемешивали при комнатной температуре приблизительно в течение 15 мин до тех пор, пока не была получена эмульсия. Пример 13. Получение вакцинной композиции, содержащей клетки меланомы В 16,VSSP(GM3) и IFA. Протеолипосомы, происходящие из белкового комплекса наружной мембраны NeisseriaVSSP(GM3) хранили в концентрации 2,4 мг/мл в растворе трис/HCl, рН 8,9, при температуре 4 С до применения. Для получения иммуногенного материала суспензию линии клеток меланомы В 16 мышиg в течение 10 мин. Полученный осадок повторно суспендировали в VSSP(GM3) до концентрации 10 х 106 клеток на 2,4 мг GM3 в VSSP. Смесь перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем препарат добавляли к IFA в соотношении 1/1 (объем/объем). Смесь перемешивали при комнатной температуре приблизительно в течение 15 мин до получения эмульсии. Пример 14. Получение вакцинной композиции, содержащей плазмиду с геном, кодирующим внеклеточный домен рецептора EGF человека (ECD-HER-1), VSSP(GM3) и IFA. Протеолипосомы, происходящие из белкового комплекса наружной мембраны NeisseriaVSSP(GM3) хранили в концентрации 4,8 мг/мл в растворе трис/HCl, рН 8,9, при температуре 4 С до применения. Вектором для инсерции представляющей интерес ДНК была экспрессирующая плазмидаpcDNA3 млекопитающего, содержащая ориджин репликации участок SV40, а также промотор гена раннего ответа человека и промотор цитомегаловируса (IECP). В названную плазмиду вставляли ген, кодирующий внеклеточный домен рецептора EGF (ECD-HER-1) человека. Полученную плазмиду (ECD-HER-1/pcDNA3) использовали для получения иммуногенного материала. Для получения иммуногенного материала раствор плазмиды (ECD-HER-1/pcDNA3) доводили до концентрации 2 мг/мл в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Затем раствор смешивали с препаратом VSSP(GM3) в соотношении 1/1 (объем/объем). Смешивание заключалось в перемешивании при комнатной температуре в течение 5 мин. Впоследствии препарат добавляли к IFA в соотношении 1/1 (объем/объем). Смесь перемешивали при комнатной температуре приблизительно в течение 15 мин до тех пор, пока не была получена эмульсия. Пример 15. Индукция созревания дендритных клеток препаратом VSSP(GM3) in vitro. Дендритные клетки человека получали из моноцитов, выделенных из периферической крови, и выращивали в течение 7 дней в присутствии рекомбинантного GM-CSF человека (hr)(50 нг/мл) и hr-IL4 (1000 ед./мл). На 7-й день полученные дендритные клетки или подвергали, или не подвергали действию VSSP(GM3) (1 мкг/мл) в течение 18 ч. Как контроль, дендритные клетки инкубировали с 0,1 мкг/мл LPS, очищенного из штамма Neisseria meningitidis 44/76, или сMPLA (Sigma). Фенотип каждого препарата исследовали методом проточной цитометрии. Как показано в табл. 2, обработка посредством VSSP(GM3) вызывала повышение экспрессии CD11c и значительное изменение маркера созревания DC CD83. Наблюдали увеличение уровней экспрессии молекулы HLA-DR.VSSP-(GM3) индуцировал увеличение количества клеток, экспрессирующих молекулу CD86.VSSP и LPS продемонстрировали одинаковую способность индуцировать созревание обработанных DC. С другой стороны, обеззараженный вариант LPS, MPLA номинально ниже. Таблица 2 Индукция созревания дендритных клеток различными препаратами in vitro Культуральн. среда 22 Средние величины интенсивности флуоресценции определяли посредством FACS. Пример 16. Индукция специфического гуморального иммунного ответа на химерныеcMAb P3 (Р 3 с Маb), ассоциированная с введением вакцинной композиции. Мышей штамма C57BL/6 иммунизировали вакцинной композицией, упомянутой в примере 10. Делали прививку 50 мкг химерных моноклональных антител посредством внутримышечной инъекции, применяя две дозы (каждую каждые 14 дней). Образцы сывороток отбирали на 21-й день после первой иммунизации. В качестве контрольной группы, мышей того же самого штамма иммунизировали аналогично P3cMab, растворенными в IFA или гидроокиси алюминия. Полученные сыворотки анализировали методом ELISA для того, чтобы определить присутствие анти-Р 3-сМаb-антител. 100% мышей, иммунизированных вакцинной композицией, описанной в данном изобретении, продуцировали более высокие титры специфических IgG-антител против P3 cMab относительно контрольных групп (табл. 3). Таблица 3 Ответ антител против Р 3 с Маb,индуцированный у мышей C57BL/6,иммунизированных различными препаратами Препарат Р 3 сМаb/VSSP/IFA Р 3 сМАb/IFA Р 3 сМаb/алюминий Пример 17. Индукция пролиферативного клеточного ответа, специфичного в отношении пептида CDR3/VH-P3 и ассоциированного с введением вакцинной композиции. Мышей штамма MC57BL/6 иммунизировали вакцинной композицией, упоминаемой в примере 11. Прививку делали 100 мкг пептида посредством внутримышечной инъекции в четырех дозах (каждую каждые 14 дней). В качестве контрольной группы, мышей той же самой линии аналогичным образом иммунизировали пептидом CDR3/VH-P3, растворенным вIFA или в квасцах. Паховый лимфатический узел удаляли у животных на 7-й день после введения последней дозы и выделяли лимфоциты посредством органной перфузии. Лимфоциты выращивали в течение 96 ч с пептидомCDR3/VH-P3 (50 мкг/мл). Во время последних 18 ч культивирования клетки обрабатывали 1 мкКи тритированного тимидина (Amersham,United Kingdom), а затем клетки собирали и определяли -эмиссию в сцинтилляционном счетчике (LKB Wallac, Finland). Определяли уровни клеточной пролиферации как индекс стимуляции (SI). Полученные в данном исследовании результаты представлены в табл. 4. 23 Таблица 4 Индукция пролиферативного клеточного ответа,специфичного в отношении пептида CDR3/VH-P3,у мышей C57BL/6, иммунизированных различными препаратами 50 мкг/млVSSP(GM3), способен индуцировать специфическую антигенную пролиферацию. Пример 18. Индукция цитотоксического клеточного ответа, специфичного в отношенииECD-mEGF-R и ассоциированного с введением вакцинной композиции, содержащей рекомбинантные APV, ECD-mEGF-R/APV, VSSP(GM3) и IFA. Протеолипосомы, происходящие из белкового комплекса наружной мембраны NeisseriaVSSP(GM3) хранили в концентрации 2,4 мг/мл в растворе трис/HCl, рН 8,9, при температуре 4 С до применения. Вирусным вектором для инсерции представляющей интерес ДНК был вирус оспы птиц(APV). Ген, кодирующий внеклеточный домен рецептора EGF мыши (ECD-mEGF-R), вставляли в APV посредством гомологичной рекомбинации. Раствор рекомбинантного вектора ECDmEGF-R/APV доводили до концентрации 108 бляшкообразующих единиц/мл. Одновременно получали эмульсиюVSSP(GM3), добавляя раствор носителя к IFA в соотношении 1/1 (объем/объем). Смесь перемешивали при комнатной температуре приблизительно в течение 15 мин. Впоследствии мышей Balb/c иммунизировали IP (внутрибрюшинно) 200 мкл раствораECD-mEGF-R/APV и впоследствии 100 мкл внутримышечно VSSP(GM3)/IFA. Контрольная группа состояла из мышей, которым вводилиECD-mEGF-R/APV и забуференный фосфатом физиологический раствор (SPBS). Две дозы вводили каждые 2 недели, и через 21 день после начала экспериментальных мышей умерщвляли,с тем чтобы получить соответствующие клетки селезенки. CD8-T-клетки выделяли из спленоцитов, используя способ магнитных зерен. Названные Т-клетки стимулировали в течение 5 дней дендритными клетками, полученными из костного мозга (bmDC), предварительно меченные ECD-mEGF-R-иммунодоминантным пептидом 'NYGTNRTGL' в соотношении 10:1(T:bmDC) в присутствии IL-2 (50 ед./мл). В конце стимуляции проводили цитотоксический эксперимент, в ходе которого оценивали высвобождение Сr51 при сопоставлении различных 24 количеств названных клеток с линией Р 815, меченной пептидом 'NYGTNRTGL' (табл. 5). Таблица 5 Цитотоксический клеточный ответ,специфичный в отношении ECD-mEGF-R Иммунизированы ECD- Иммунизированы ECDmEGFR/APV+VSSP(GM3) Введение животным VSSP(GM3) вызывало 2-кратное усиление индуцирующей способности цитотоксических Т-клеток по сравнению с APV. Пример 19. Иммуновосстановительные свойства вакцинного носителя VSSP. Вакцинный носитель VSSP, описанный в данном изобретении, вводили внутримышечной инъекцией пациентам с метастатической меланомой в фазе I клинического испытания. Пациенты получали девять доз (200 мкг NGcGM3 вVSSP) в течение 6 месяцев. Первые пять доз вводили в течение первых 2 месяцев, а четыре оставшиеся дозы вводили ежемесячно. У пациентов брали кровь в 0 день (до введения первой дозы), а также на 56-й день (пятая доза). Одновременно кровь брали у 8 здоровых волонтеров. Соответствующие периферические мононуклеарные клетки (РМС) получали из названных образцов методом градиента фиколла,а методом проточной цитометрии определяли % клеток CD3+, CD4+ и CD8+. Как показано в табл. 6, относительная экспрессия маркеровCD3, CD4 и CD8 Т-клеток из РМС 3 пациентов оказалась ниже, чем средняя экспрессия у здоровых доноров в 0 день. Очевидно, что уровни относительной экспрессии маркеров CD3, CD4 и CD8 Т-клеток в РМС тех же самых больных возвращались к нормальным уровням на 56-й день, то есть после получения четырех инъекций VSSP(NGcGM3). Таблица 6 Сравнительная экспрессия Т-клеточных маркеров на мононуклеарных клетках периферической крови (РМС) у 3 пациентов с меланомой и у здоровых доноров Краткое описание фигур Фиг. 1. Распределение подклассов индуцированных антител в результате иммунизацииECD-mEGF-R/VSSP-GM3/IFA. Сыворотки мышей C57BL/6, иммунизированных ECD-mEGF-R/KLH/CFA (I) или ECDmEGF-R/VSSP-GM3/IFA (II), анализировали ме 25 тодом ELISA, чтобы определить распределение подклассов IgG, индуцированных иммунизацией. Фиг. 2. Распознавание сывороток мышей,иммунизированных ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA,клетками, экспрессирующими EGF-R. Линию клеток А 431 инкубировали вместе с преиммунной сывороткой мышей C57BL/6(А); моноклональными антителами ior egf-r3 в качестве позитивного контроля (В); сывороткой иммунизированных мышей C57BL/6. Для иммунодетекции использовали вторичные антимышиные антитела, конъюгированные с флуорофором. Интенсивность флуоресценции определяли проточной цитометрией. Фиг. 3. Цитолитическая активность сывороток мышей, иммунизированных ECD-HER-1/C57BL/6; IV) сывороткой мышей C57BL/6, иммунизированных ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA; и V) одинаковым количеством тех же самых клеток,которые лизировали с детергентами, чтобы определить величину общего включения Сr51. Результаты представляли в % специфического лизиса. Фиг. 4. Нейтрализующая способность сывороток, полученных у мышей, иммунизированных ECD-HER-1/VSSP-GM3/IFA. Клетки А 431, полученные из пула сывороток мышей, иммунизированных ECD-HER-1/VSSPGM3/IFA, инкубировали в разведениях 1/5, 1/10,1/20 и 1/40 или полученные из пула преиммунных сывороток инкубировали в тех же разведениях. EGF-125I (100000 число импульсов в минуту) добавляли в каждую лунку и определяли общее связывание инкубацией клеток с EGF125I. Число импульсов в минуту определяли в гамма-счетчике. Фиг. 5. Жизненный цикл мышей, иммунизированных ECD-mEGF-R/VSSP-GM3/IFA, с трансплантированной опухолью Льюиса. Мышам C57BL/6, иммунизированным, как описано в примере 9, трансплантировали 100000 клеток опухоли Льюиса и наблюдали, чтобы определить жизненный цикл. В контрольную группу включали мышей той же линии, иммунизированных ECD-mEGF-R/CFA, которым трансплантировали клетки таким же образом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтическая композиция, усиливающая иммуногенность антигенов со слабой иммуногенностью, содержащая(A) один или более антигенов со слабой иммуногенностью; 26 белкового комплекса наружной мембраны штамма грамотрицательных бактерий (Neisseriameningitidis), который содержит включенные в него ганглиозиды; и(C) возможно, один или более адъювантов. 2. Композиция по п.1, в которой антигены со слабой иммуногенностью могут быть выбраны из группы, состоящей из пептидов, полипептидов, белков или последовательностей соответствующих им нуклеиновых кислот или клеток-мишеней вакцин, представляющих интерес,или их лизатов, или их комбинаций. 3. Композиция по п.2, в которой антигены со слабой иммуногенностью являются рецепторами факторов роста или их внеклеточными доменами. 4. Композиция по п.3, в которой внеклеточные домены рецепторов факторов роста могут содержать или не содержать трансмембранную область. 5. Композиция по пп.3 и 4, в которой рецепторами факторов роста являются HER-1,HER-2, PDGF-R или любые разновидности, содержащие внеклеточный домен с трансмембранной областью или без нее. 6. Композиция по п.1, в которой протеолипосомы вакцинного носителя получены из белкового комплекса наружной мембраны либо из штамма дикого типа, либо генетически модифицированного штамма Neisseria meningitidis. 7. Композиция по п.1, в которой протеолипосомы вакцинного носителя с включенными в них ганглиозидами получены путем гидрофобного введения указанных ганглиозидов в белковый комплекс наружной мембраны Neisseriameningitidis. 8. Композиция по п.7, в которой ганглиозиды, которые гидрофобно включены в белковый комплекс наружной мембраны Neisseriameningitidis, представляют собой GM1, GM3 или их N-гликолилированные варианты. 9. Композиция по п.1, в которой адъювант является масляным адъювантом либо природным или рекомбинантным полипептидом. 10. Композиция по п.9, в которой масляный адъювант представляет собой неполный адъювант Фрейнда. 11. Композиция по п.10, в которой неполный адъювант Фрейнда представляет собой монтанид ISA 51. 12. Композиция по п.9, в которой полипептидный адъювант представляет собой цитозин или химозин. 13. Композиция по п.12, в которой цитозин является гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором. 14. Композиция по пп.1-13 для предупреждения и лечения рака, в частности рака предстательной железы, прямой кишки, легкого,молочной железы, яичника, опухолей головы и шеи, рака вульвы, мочевого пузыря и мозга,глиомы, а также нетрансмиссивных хронических заболеваний. 15. Композиция по пп.1-13 для предупреждения и лечения вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний. 16. Композиция по п.14 для лечения синдрома приобретенного иммунодефицита. 17. Композиция по пп.1-13 для лечения аутоиммунных заболеваний. 18. Применение композиции по пп.1-17 для предупреждения и лечения рака, в частности рака предстательной железы, прямой кишки, легкого, молочной железы, яичника, опухолей головы и шеи, рака вульвы, мочевого пузыря и мозга, глиомы, а также нетрансмиссивных хронических заболеваний. 19. Применение композиции по пп.1-17 для предупреждения и лечения вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний. 20. Применение композиции по пп.1-17 для лечения аутоиммунных заболеваний. 28 21. Применение протеолипосом очень малого размера (VSSP), полученных из ассоциации белкового комплекса наружной мембраныNeisseria meningitidis с ганглиозидами, включенными в нее, для производства лекарственного средства для применения при лечении для восстановления иммунитета у иммуносупрессивных пациентов. 22. Применение по п.21, при котором протеолипосомы с включенными в них ганглиозидами получают путем гидрофобного включения указанных ганглиозидов в белковый комплекс наружной мембраны Neisseria meningitidis. 23. Применение по п.22, при котором ганглиозиды, которые гидрофобно включены в белковый комплекс наружной мембраны Neisseria