Электронно-интерференционный способ определения местоположения и типа молекулярных групп на поверхности биообъектов, в т. ч. на последовательностях нуклеотидов, и устройство для его осуществления

012215 Изобретение относится к области определения структуры биообъектов. Оно может быть использовано для изучения структуры поверхности малых биообъектов, таких как макромолекулы, и определения местоположения и типа молекулярных групп, расположенных на ней. Известен метод рентгеноструктурного анализа (см., например, А. Гинье "Рентгенография кристаллов". М., Физматгиз, 1961 г.). Он позволяет устанавливать с высокой степенью точности местоположение атомов внутри макромолекулы независимо от того, расположены ли они на е поверхности или же находятся внутри. Но этот метод требует получения относительно большого количества исследуемого вещества очень высокой чистоты, выращивания из этого вещества монокристалла с малым числом дефектов,использования синхротронного источника рентгеновского излучения для облучения им монокристалла,регистрации отражнного рентгеновского излучения (так называемых рефлексов) и довольно сложной математической процедуры определения структуры макромолекулы по этим рефлексам. Далеко не для всех сложных макромолекул или же комплексов таких макромолекул удатся вырастить достаточно совершенный монокристалл, и даже в тех случаях, когда это получается, время выращивания такого монокристалла оказывается весьма большим. Поэтому исследование каждого вещества требует работы довольно большой лаборатории в течение длительного времени и, соответственно, стоит достаточно дорого. Известен также способ определения формы поверхности макромолекул и других малых биологических объектов с помощью туннельной и атомно-силовой микроскопии (см., например, К.Н. Ельцов, А.Н. Климов и др. "Сверхвысоковакуумный туннельный сканирующий микроскоп GPI-300" Российская Академия Наук, труды Института Общей физики им. А.Н. Прохорова, т. 59, 2003 г.). Но если при исследовании поверхности монокристаллов эти способы позволяют в ряде случаев достичь пространственного разрешения на уровне атомов, то при исследовании биообъектов пространственное разрешение оказывается существенно хуже. В частности, вследствие этого не увенчались успехом попытки использовать указанный метод для определения последовательностей нуклеотидов в нуклеиновых кислотах. Кроме того, поскольку метод использует последовательное сканирование разных участков биообъекта, время,требуемое для его исследования, оказывается в большинстве случаев достаточно большим. Недостатком известных способов является большая сложность и длительность исследования, которые к тому же достаточно быстро возрастают с увеличением размеров исследуемого объекта. Причм далеко не вся информация, получаемая в результате таких исследований, имеет равнозначную ценность. Так, наибольшую ценность во многих случаях представляет информация о поверхностях исследуемых объектов и молекулярных группах, расположенных на этих поверхностях, поскольку именно они и определяют взаимодействие указанного объекта с окружением. Технической задачей предлагаемой группы изобретений является существенное уменьшение времени исследования поверхности малых биообъектов, при одновременном увеличении информативности такого исследования, состоящей в том, что не просто определяется местоположение какой-то молекулярной группы на поверхности, но и определяется, какая именно эта группа, е тип. Это достигается путм облучения исследуемого объекта потоком электронов, летящих один за другим и находящихся в одном и том же квантовом состоянии (т.е. описываемых одной и той же волновой функцией), и регистрацией интерференционной картины, образующейся на экране, на который попадают электроны после рассеяния на исследуемом объекте и на специальном рассеивателе, расположенном вблизи этого объекта(этот рассеиватель создат дополнительную де Бройлевскую волну электрона, являющуюся аналогом опорного пучка в оптической голографии), после чего по этой интерференционной картине определяется форма поверхности объекта, а также местоположение и тип молекулярных групп, находящихся на ней. Технический результат достигается за счт того, что электронно-интерференционный способ определения местоположения и типа молекулярных групп на поверхности биообъектов предусматривает размещение исследуемого биообъекта на диэлектрической подложке в специально определенном для этого месте, после чего устройство закрывают и вакуумируют; затем производят охлаждение подложки, например, жидким газом с температурой в несколько десятков градусов Кельвина; после этого подают напряжения на фотокатод, охлаждающий и ускоряющий электроды, анод, сетку, микроканальную пластину и ПЗС матрицу (ПЗС расшифровывается как прибор с зарядовой связью); далее проверяют, есть ли сигнал на ПЗС матрице, если его нет, то включают непрерывный лазер, излучение которого сфокусировано на фотокатоде; после этого на ПЗС матрице заведомо появляется сигнал, поступающий затем в память компьютера; после этого меняют напряжение на ускоряющем электроде, и передают уже новый сигнал с ПЗС матрицы в память компьютера, и так повторяют несколько раз; далее компьютер, на основании полученной информации выдат результаты, содержащие сведения о форме поверхности исследуемого объекта, а также о местоположении и типе молекулярных групп, расположенных на ней. Изобретение в части устройства поясняется графическим материалом, где на фиг 1 схематично изображен общий вид устройства, на фиг. 2 - сечение по разрезу АА, на фиг. 3 - объемный вид устройства с удаленным корпусом, без блока откачки и блока управления, на фиг. 4 - основание с встроенными в него электродами, на фиг. 5-10 - графический материал, поясняющий сущность физических процессов, происходящих при работе устройства. Устройство состоит из основания 1, изготовленного из непроводящего материала, подложки 2, рас-1 012215 положенной на основании, также изготовленной из диэлектрика (хотя не обязательно из того же самого,что и основание). На подложке размещены фотокатод 3 с окном 4 и прорезью 5, соединяющей окно с областью вне фотокатода, в той части фотокатода, которая граничит с окном, в фотокатод встроены участки 6, выполненные из материала с пониженной работой выхода электронов по сравнению с работой выхода электронов из материала фотокатода, площадка на подложке, куда помещаются исследуемые объекты 7, рассеиватели 8 электронов, представляющие собой образования, нарушающие гладкость поверхности подложки, например выступы, впадины, наросты, причем вещество, из которого они выполнены, может отличаться от материала подложки; анод 9. Между подложкой 2 и основанием 1 на глубине примерно в 5-10 нм от поверхности подложки 2 находится охлаждающий электрод 10, выполненный из проводящего материала, он расположен так, что и окно 4, и прорезь 5 оказываются над ним. В основании 1 расположен ускоряющий электрод 11, также изготовленный из проводящего материала, но не обязательно из того же самого, из которого изготовлен охлаждающий электрод, причем расстояние, на которое он отстоит от поверхности подложки 2, больше, чем у охлаждающего электрода 10. На фотокатод 3 наводит свое излучение лазер с фокусирующей системой 12. Под основанием находится охладитель 13,внутри которого проложена трубка 14, сквозь которую может прокачиваться или жидкий газ, с помощью которого осуществляется охлаждение, или же нагретый газ в газообразном состоянии, осуществляющий разогрев. Под охладителем 13 расположен теплоизолирующий слой 15. Над подложкой 2 располагаются микроканальная пластина 16, сетка 17 и ПЗС матрица 18. Все устройство помещено в корпус 19, который закрывается крышкой 20. Вакуумирование корпуса 19 осуществляется блоком 21, например, откачки воздуха, в который входят насосы, создающие вакуум. Управление системой осуществляется управляющим блоком 22, который подает напряжение на фотокатод, охлаждающий и ускоряющий электроды,анод, сетку, микроканальную пластину, ПЗС матрицу, а также подает питание на откачивающую систему, управляет подачей жидкого газа и передает сигнал от ПЗС матрицы на компьютер. Энергия кванта излучения лазера l (связанная с длиной волны этого излучения l соотношением где е - заряд электрона, el - работа выхода электронов из участков 6, e'l - работа выхода электронов из материала фотокатода 3,(здесь m - масса электрона, а n - показатель преломления материала подложки). Направление кристаллографических осей координат материала подложки должно быть согласовано с направлением прорези 5. Причм выбирается такое направление кристаллографических осей координат, при котором пороговое напряжение на ускоряющем электроде, начиная с которого возникает резкое уменьшение потока электронов, участвующих в образовании интерференционной картины, достигает своего максимального значения. Устройство работает следующим образом. Предварительно тестируют устройство. Для этого закрывают корпус 19 крышкой 20, после чего управляющий блок 22 включает блок 21 откачки, который создат внутри корпуса вакуум. После этого блок 22 включает прокачку жидкого газа сквозь трубку 14, в результате чего происходит охлаждение охладителя 13 и лежащего на нм основания 1. Теплоизолирующий слой 15 препятствует проникновению тепла извне к охладителю 13, после этого блок 22 включает подачу напряжения на фотокатод 3, охлаждающий электрод 10, ускоряющий электрод 11, анод 9, микроканальную пластину 16, сетку 17 и ПЗС матрицу 18. Затем блок 22 проверяет, есть ли сигнал на ПЗС матрице, если сигнала нет, то блок 22 включает лазер с фокусирующей системой 12, излучение которого фокусируется на фотокатод 3 и на участок с пониженной работой выхода 6, имеющийся на фотокатоде, после чего сигнал заведомо появляется. После этого блок 22 включает подачу сигнала с ПЗС матрицы на компьютер, который фиксирует его в своей памяти. Затем блок 22 изменяет величину напряжения, подаваемого на электрод 11, и подат новый сигнал с ПЗС матрицы, полученный уже при новом значении напряжения на электроде 11, на компьютер. Эта процедура повторяется несколько раз (по меньшей мере один раз), и каждый раз результаты измерения запоминаются в памяти компьютера. После этого блок 22 выключает устройство, для этого он выключает лазер, снимает напряжение со всех устройств, выключает подачу жидкого газа в трубку 14 и подает туда разогретый газ в газообразном состоянии, чтобы поднять температуру устройства. После этого блок 22 выключает откачивающую систему 21 и осуществляет подачу газа внутрь корпуса 19. Затем открывают крышку 20 и помещают на подложку 2, в определнную область, находящуюся в пределах площадки 7, так называемый тестовый объект, представляющий собой небольшую молекулу с известным сечением упругого рассеяния электронов T, после чего повторяют всю вышеописанную процедуру измерений. После этого вновь открывают устройство, меняют положение тестового объекта на-2 012215 площадке 7 и вновь повторяют измерения. И так действуют как минимум несколько раз до тех пор, пока информации, полученной компьютером в ходе тестирования, не окажется достаточно для того, чтобы запустить работу программы, которая позволяет по информации, полученной с ПЗС матрицы 18 при различных напряжениях, подаваемых на ускоряющий электрод 11, и при различных положениях тестового объекта определять форму поверхности исследуемого объекта и местоположение и тип молекулярных групп, расположенных на ней. Математический аппарат, лежащий в основе работы подобной программы, аналогичен тому, который используется при анализе оптических голограмм, но, тем не менее, ниже будет приведен независимый вывод соответствующих формул. После того как тестирование устройства завершено, приступают к измерениям. При этом действуют в той же последовательности, как и в случае с тестовым объектом, только вместо тестового объекта на площадку 7 помещают исследуемый объект. Причм в отличие от ситуации с тестовым объектом измерения производят только один раз, при одном заданном положении исследуемого объекта на площадке 7.(Хотя в случае, если при восстановлении формы поверхности объекта и типа молекулярных групп на ней возникают какие-либо неясности, можно повторить измерения с изменнным местоположением исследуемого объекта на площадке 7). Далее, используя информацию, полученную компьютером в ходе измерения, а также программу, созданную в ходе тестирования устройства, определяют форму поверхности исследуемого объекта и местоположения и тип молекулярных групп, расположенных на ней. В частности, в качестве исследуемого объекта можно брать участки нуклеиновых кислот и определять, таким образом, последовательность оснований в этих участках. Поскольку и способ, и устройство, обсуждаемые здесь, основаны на использовании определнных физических процессов, мы полагаем уместным дополнительно изложить здесь как сущность этих процессов, так и то, каким образом они позволяют осуществить поставленную в заявке цель. Согласно положениям квантовой механики, любая частица является в то же время и волной (говоря более строго,может проявлять свойства волны)., где - постоянная Планка, m Длина этой волны (она называется волной де Бройля) есть масса частицы, a- е скорость. Например, для электрона с энергией в 3 эВ (эта энергия, которую приобретает электрон, пройдя через разность потенциалов в 3 В) и, соответственно, скоростью 9105 м/с,оказывается примерно равной 6 . Этого, в принципе, вполне достаточно для получения голограммы с пространственным разрешением, достаточным для определения пространственного расположения молекулярных групп на поверхности биообъекта. При этом, чтобы получить интерференционную картину,нужно сделать так, чтобы частица (например, электрон) имела бы возможность попадать на регистрирующий экран по двум путям: напрямую (это аналог опорного пучка) и после упругого рассеяния на поверхности исследуемого биообъекта. Волновая функция частицы (иначе называемая "пси-функция") может быть в этом случае представлена в виде суммы двух функций где 1(r,t) - волновая функция, описывающая движение частицы от источника к экрану напрямую, а 2(r,t) - волновая функция, описывающая движение частицы с упругим отражением от поверхности биообъекта. Вероятность поглощения частицы в данной точке экрана r1, пропорциональная усредннному по времени квадрату модуля волновой функции в этой точке,содержит член(здесь знак "звздочка" означает комплексное сопряжение), который содержит информацию о рассеивающей поверхности. При попытке получить интерференционную картину от частиц возникают существенные трудности. Если послать только одну частицу, то она попадт в какую-то конкретную точку экрана и, соответственно, никакой интерференционной картины при этом образовано не будет. Если же послать много частиц, например много электронов, то, поскольку электроны, в отличие от фотонов, являются фермионами и подчиняются запрету Паули, согласно которому в любом квантовом состоянии не может быть больше одной частицы, все посылаемые частицы окажутся в разных состояниях. Каждое такое квантовое состояние описывается своей волновой функцией, которой соответствует свой, отличный от других, член g(r1), и, следовательно, интерференционная картина на экране окажется полностью размытой. В принципе, можно избежать подобного размытия интерференционной картины, если посылать электроны не одновременно, а по очереди, так что в любой произвольный момент времени к экрану летит только один электрон. В этом случае запрет Паули влияния оказывать уже не будет, но проблема получения электронов в одном квантовом состоянии вс равно остатся. Дело в том, что число состояний (его ещ называют фазовым объмом), в которые может быть испущен электрон, обычно достаточно велико, и поэтому вероятность того, что он попадт в нужное состояние, крайне мала. Конечно, в принципе можно (можно в том смысле, что это не противоречит законам физики, технически же это очень сложная задача) поставить какие-то фильтры, пропускающие только те электроны, которые попали в нужное состояние, но поскольку такое попадание будет происходить достаточно редко, получаемый поток электронов неизбежно окажется достаточно слабым. Соответственно, время экспозиции, требуемое для получения интерференционной картины, окажется неприемлемо большим. Вторая трудность, которая препятствует получению интерференционной картины от электро-3 012215 нов, состоит в том, что обычно характерное расстояние между интерференционными полосами оказывается порядка длины волны используемого излучения, а поскольку в данном случаедолжно быть в диапазоне нескольких ангстрем, никакой экран просто не сможет зафиксировать столь мелкомасштабную картину. Увеличить поток электронов в заданном состоянии возможно лишь в том случае, если уменьшить фазовый объм, приходящийся на испускаемые электроны. Чтобы уменьшить фазовый объм какоголибо ансамбля частиц, необходимо охладить этот ансамбль, заставить его отдать часть своей энергии и энтропии другому объекту, находящемуся при более низкой температуре. (Энтропия, как известно из статистической физики, пропорциональна логарифму фазового объма, поэтому при е уменьшении фазовый объм также уменьшается). Относительно легко охладить электронный газ в тврдом теле - во многих случаях это можно сделать, просто охладив само тврдое тело. Но нам ведь нужно осуществить процесс охлаждения электронов, находящихся вне тврдого тела, что уже несколько сложнее. Поясним идею того, как это можно сделать. Для этого рассмотрим электрон, находящийся в вакууме над поверхностью монокристаллического диэлектрика с относительной диэлектрической проницаемостью . (Относительная диэлектрическая проницаемость может быть выражена через показатель преломления среды n:n2). Электрон своим электрическим полем индуцирует в диэлектрике появление зарядов противоположного знака, которые, в свою очередь, создают силу, притягивающую его к поверхности. Эту силу(которую называют силой электрического изображения) можно описать с помощью потенциала U(z),имеющего вид где е - заряд электрона, а z - расстояние до поверхности. Наиболее низкий энергетический уровень электрона в этом потенциале EC равен(записывая волновые функции, мы чаще всего не будем вводить нормировочных множителей, поскольку они только усложняют запись формул, ничего при этом принципиально не меняя). При n2,4 имеем 1,5 . Таким образом, электрон, оказавшийся в этом состоянии, локализован в очень тонком слое толщиной в несколько ангстрем, расположенном непосредственно над поверхностью диэлектрика. Можно предложить достаточно простой способ, позволяющий получать двумерный электронный газ, сосредоточенный в этом слое. Проще всего пояснить этот способ с помощью чертежа (фиг. 5). Здесь 1 - основание, 2 - подложка из диэлектрика, электроны в вакууме (что соответствует условиюz0) взаимодействуют с ним посредством сил электрического изображения (U(z) - потенциал этого взаимодействия, EC - наиболее низкий энергетический уровень в этом потенциале); 3 - фотокатод, облучаемый лучом лазера с фокусирующей системой 12; 10 - охлаждающий электрод, представляющий собой тонкий проводящий слой (например, полупроводника), расположенный на достаточно малой глубине h под поверхностью диэлектрика. Энергия световых квантов, излучаемых лазером,(здесь l - частота лазерного излучения) должна быть выбрана таким образом, чтобы выполнялось условие где el - работа выхода электрона из участков фотокатода с пониженной работой выхода (напоминаем также, что EC - отрицательная величина). При выполнении этого условия (в соответствии с законом Эйнштейна-Столетова, поскольку частота света ниже пороговой), электроны при облучении фотокатода лазером вылетать в вакуум не смогут. Но они смогут вылетать в тот тонкий приповерхностный слой над подложкой из диэлектрика, о котором шла речь выше, поскольку на это энергии светового кванта вполне достаточно. Таким образом, лазер может накачивать электроны в этот приповерхностный слой, причм чтобы ток фотоэлектронов не был бы чересчур малым, мы должны выбирать, лежащим где-то примерно посередине между el + EC и el. Кроме того, нам нужно, чтобы энергия электронов удовлетворяла бы условию испускаемых фотокатодом в приповерхностный слой, е, равная, где kB - постоянная Больцмана, a Td - температура диэлектрика (который, как указывается в заявке, нужно специально охлаждать как минимум до температуры жидкого азота, а лучше и до более низких температур). (Причм если мы охлаждаем диэлектрик, то для выполнения указанного условия-4 012215 ничего специально делать не надо: оно выполняется автоматически). Под поверхностью подложки из диэлектрика расположен тонкий проводящий слой. Температура электронов в этом слое Те равна температуре диэлектрика Td (и, следовательно, выполняется условие). Если бы фотоэлектроны оказались внутри этого слоя, то они очень быстро отдали бы свою избыточную энергию имеющимся там электронам. Таким образом, произошло бы их охлаждение. Но оказывается, что если только сделать h достаточно малым, фотоэлектронам, чтобы остынуть, нет необходимости попадать внутрь охлаждающего слоя, даже находясь в приповерхностном слое, они все равно будут отдавать свою энергию электронам полупроводника. Дело в том, что характерный масштаб кулоновского взаимодействия rk, который определяет сечение при столкновении электронов друг с другом(именно при таких столкновениях и происходит выравнивание температур между горячими и холодными электронами), в этих условиях довольно велик. Для rk можно записать оценку,и при типичных e, меньших 0,5 эВ, он оказывается порядка 1-3 нм. Если только взять h ненамного больше rk, например h 5-10 нм, (что и указано в заявке), то охлаждение электронов в приповерхностном слое будет происходить примерно так же, как если бы эти электроны оказались непосредственно в охлаждающем слое и сталкивались бы там с холодными электронами. Чтобы исключить возврат электронов из приповерхностного слоя обратно в фотокатод, следует подать на охлаждающий слой электрическое напряжение, чтобы между ним и фотокатодом образовалась бы небольшая разность потенциалов s. (При этом охлаждаемый слой находится под плюсовым потенциалом). Величина этого потенциала определяется условием и обычно лежит в пределах 0,1-0,2 В. Электроны, вырываясь из фотокатода, добавочно ускоряются этим потенциалом, но потом все равно теряют приобретенную энергию при столкновениях с электронами охлаждающего слоя. После этого они уже неспособны преодолеть запирающий потенциал и вернуться на фотокатод. Поскольку h составляет всего лишь несколько нанометров, то даже при небольших s 0,1-0,2 В, напряженность электрического поля между фотокатодом и охлаждающим электродом достаточно велика. Если же поверхность фотокатода в той области, где приложено поле высокой напряженности (т.е. в местах контакта с подложкой из диэлектрика, под которой расположен охлаждающий электрод), не является гладкой, например на ней имеются какие-то выступы или острия, то величина поля на таких неоднородностях еще добавочно возрастает и может оказаться достаточной для того, чтобы возникла автоэлектронная эмиссия. При этом электроны в основном как раз и будут эмитироваться в приповерхностный слой, поскольку энергетический барьер, определяющий величину автоэлектронной эмиссии, оказывается для такой эмиссии меньше, чем для эмиссии в вакуум. Так что в принципе возможна ситуация,что фотокатод будет эмитировать электроны в приповерхностный слой даже при выключенном лазере. Разумеется, это не только не мешает работе устройства, но даже могло бы позволить упростить его, исключив, если удастся подобрать такой катод, при котором автоэлектронная эмиссия в приповерхностный слой заведомо имеет место, лазер. Охлажденные электроны, оказавшиеся в приповерхностном слое, накапливаются внутри специального окошка, сделанного в фотокатоде (наличие там этого окошка оговорено в заявке), из которого они в дальнейшем попадают в область, где и используются для электронной голографии. Как это происходит,можно понять из фиг. 6. Здесь 2 - подложка из диэлектрика; 3 - фотокатод, причм наружная часть фотокатода изготовлена из материала с работой выхода е'l, превышающей el настолько, чтобы выполнялось условие(в этом случае наружная часть фотокатода не будет инжектировать фотоэлектроны в приповерхностный слой); 10 - охлаждающий электрод, расположенный под поверхностью подложки из диэлектрика на глубине h; 4 - окно в фотокатоде, в котором происходит накопление электронов, инжектированных в приповерхностный слой; 5 - прорезь в фотокатоде, сквозь которую могут вылетать охлажднные электроны, накопленные в окне 4; 11 - ускоряющий электрод, расположенный под поверхностью диэлектрика на глубине h', существенно большей, чем h; 7 - площадка на подложке, куда помещается исследуемый объект; 8 - рассеиватели электронов, 9 - анод. В соответствии с тем, что обсуждалось выше, фотоэлектроны, инжектируемые фотокатодом, облучаемым светом лазера (той частью фотокатода, которая имеет пониженную работу выхода), попадают в приповерхностный слой внутри окошка 4, где они охлаждаются до температуры Те и накапливаются. Уходить же оттуда они могут только через прорезь 5. Если длина и ширина прорези (которые мы обозначим соответственно lp и dp) удовлетворяют условиям(при Те 30 K эта оценка дат dp 10 нм), и, то прорезь представляет собой не просто путь ухода электронов из окна 4, но и своего рода фильтр, сквозь который проходят только те электроны,-5 012215 волновая функция которых внутри прорези имеет вполне определнную, заданную зависимость от х. Именно волновая функция внутри прорези r(x,y,z,t) может быть представлена в виде где поперечная часть волновой функции р(х) имеет вид(здесь точка х=0 соответствует середине прорези 5), а q(y,t) описывает продольную часть волновой функции в прорези, но е явный вид прорезью не фиксируется. Почему р(х) имеет такой вид Это связано со следующим обстоятельством. На границах прорези при. В общем случае, при выполнении этого условия, r(x,y,z,t) может быть представлена в виде Здесь функции q,1(n,y,t) и q,2(n,y,t) описывают продольную часть волновой функции в прорези. В принципе, функции q,1(n,y,t) и q,2(n,y,t) могут содержать члены, которые экспоненциально быстро убывают по мере увеличения у (т.е. по мере углубления частицы в прорезь). Но при условии lp(5-10)dp,частицы, волновая функция которых описывается этими членами, сквозь прорезь не пройдут. Поэтому если мы записываем волновую функцию только для тех частиц, которые могут пройти сквозь прорезь,этими членами можно пренебречь. Оценим энергию частиц, проходящих сквозь прорезь, волновые функции которых описываются членами с различными n. Из всех слагаемых, входящих в сумму по n,самая низкая энергия соответствует члену с n=0, в то время как всем остальным членам с n1 (и при выполнении условия соответствуют энергии, существенно превосходящие kBTe. Но в соответствии со статистическим распределением частиц по энергиям, число частиц с энергиями, существенно превосходящими kBTe, экспоненциально мало. Соответственно, из всей суммы остатся только член с n=0, зависящий от х по закону. Укажем также, что прорезь, кроме того, не позволяет электронам вылетать одновременно: чтобы вылетать одновременно, электроны должны были бы двигаться достаточно близко друг к другу, а они,обладая малой энергией порядка kBTe, не могут преодолеть кулоновское расталкивание, которое имеет место между ними как между одноимнными зарядами. К ускоряющему электроду 11 приложен потенциал а (этот потенциал отсчитывается от потенциала охлаждающего электрода 10). Под действием этого потенциала происходит ускорение электронов, вылетающих из прорези, и, соответственно, энергия их возрастает. Вследствие этого, становится возможным целый ряд процессов, основными из которых являются рассеяние на кристаллической рештке, при котором электроны могут менять направление своего движения и даже покидать приповерхностный слой,рассеяние на фононах (включая процессы с рождением фононов), рождение электрон-дырочных пар в материале подложки. Часть из них, а именно рассеяние на кристаллической решетке и рождение электрон-дырочных пар в материале подложки, являются пороговыми, т.е. они становятся возможными лишь в том случае, если энергия электронов превысит определенный порог. На величину порога влияет как материал подложки, так и ориентация кристаллографических осей координат монокристалла подложки относительно направления, в котором движутся ускоренные электроны. Соответственно, если мы хотим,чтобы эти электроны оставались бы в приповерхностном слое и не меняли бы направление своего движения, эта ориентация должна подбираться таким образом, чтобы сделать порог максимально большим. Максимально, в лучшем случае, величина порога не может превзойти примерно 5 эВ. Неупругое рассеяние, к которому относятся рассеяние на фононах и рождение электрон-дырочных пар, изменяет энергию электрона, вследствие чего он уже становится непригодным для формирования интерференционной картины. Рассеяние на кристаллической решетке является упругим. Поэтому несмотря даже на то, что в результате такого рассеяния электрон в ряде случаев и уходит из приповерхностного слоя, он, тем не менее, все же может участвовать в формировании интерференционной картины. Более того, выход электрона из приповерхностного слоя может, в принципе, даже оказаться полезным. Действительно, если вследствие каких-либо упругих процессов электрон выходит из приповерхностного слоя, то он заведомо избежит неупругого рассеяния на пути следования к рассеивателям и исследуемому объекту. Но зато возникают добавочные трудности, связанные с необходимостью подбирать формы электродов (фотокатода, охлаждающего, ускоряющего, а, возможно, и каких-либо других вспомогательных-6 012215 электродов, осуществляющих дополнительное ускорение и корректировку движения электронов) таким образом, чтобы образующееся между ними электрическое поле фокусировало бы такие электроны на область, где расположены рассеиватели и исследуемый объект. Более простой и надежный способ избежать нежелательного рассеяния состоит в том, чтобы настолько уменьшить расстояние между выходом из прорези и площадкой на подложке, куда помещается исследуемый объект, чтобы электрон не успел бы на этом пути рассеяться. По порядку величины, это расстояние должно составлять примерно 100 нм. Электроны, прошедшие прорезь и ускоренные потенциалом а, выбираемым в интервале примерно от 2 до 5 В, остаются в этом случае в приповерхностном слое. После того как они попадают в область, расположенную над электродом 11, они уже движутся там без ускорения. При этом длина волны де Бройля для электрона, оказавшегося в этой области, которую можно с хорошей точностью оценить по формуле,оказывается порядка (5-8) , что уже сравнимо с межатомными расстояниями. (Причем размеры, которые может разрешать голограмма, можно даже сделать за счт соответствующей математической обработки интерференционной картины в несколько раз меньше ). Чтобы избежать ненужного и даже очень вредного здесь охлаждения таких электронов на электронах, имеющихся в материале ускоряющего слоя,глубина h', на которую помещн этот слой, выбирается существенно большей, чем rk. При этом столкновений электронов, движущихся в приповерхностном слое, и электронов в ускоряющем слое не происходит. Запишем выражение для волновой функции электрона, движущегося в приповерхностном слое над ускоряющим электродом. Приближнно в той области у, в которой выполняется неравенство(здесь у=0 соответствует началу ускоряющего электрода; при y 100 нм это неравенство заведомо выполняется), можно записать, имеющая размерность длины, является аналогом того, что в оптике называется длиной когерентности. Она определяет размеры области, внутри которой электрон можно считать находящимся в одном состоянии (что является полным аналогом когерентности). Например, при Те 30 K и а 5 В, Lk составляет примерно 200 нм, что вполне хватает для исследования многих биологических объектов. Ширина же площадки L, как следует из (2), оказывается всего лишь порядка dp. При необходимости, если бы таковая возникла, можно увеличить величину L, изменив форму того зазора, в котором происходит ускорение электронов. На фиг. 6 этот зазор изображн плоским. Но, в принципе, зазор мог бы иметь и другую форму. Одна из них представлена, например, на фиг. 7. Фотокатод на этой фигуре имеет форму, напоминающую острие. (Все позиции на фиг. 7 те же самые и обозначены теми же номерами, что и на фиг. 6). В отличие от плоского зазора здесь имеется зависящая от координат компонента электрического поля, направленная вдоль оси х; эта компонента изменяет волновую функцию таким образом, чтобы ширина той области, в которой она отлична от нуля, возросла бы. Рядом с той площадкой, куда помещается исследуемый объект, расположены рассеиватели, взаимодействующие с электронами, движущимися в приповерхностном слое. Они представляют собой образования, нарушающие гладкость поверхности подложки, например небольшие выступы, высота которыхhr должна быть того же порядка, что и толщина приповерхностного слоя, т.е. порядка . Электроны, движущиеся в приповерхностном слое, рассеиваются и на этих образованиях, и на самом исследуемом объ-7 012215 екте. Поскольку энергия этих электронов, с хорошей точностью равная еa, существенно больше энергии, требуемой для отрыва их от поверхности (энергия отрыва равна ЕС), то в результате такого рассеяния они покинут приповерхностный слой. Подобная ситуация изображена на фиг. 8. Здесь 2 - подложка из диэлектрика, 8 - рассеиватель, 24 - исследуемый объект, 23 - де Бройлевская волна электрона, движущегося в приповерхностном слое, 25 - де Бройлевская волна электрона после взаимодействия его с рассеивателем, 26 - де Бройлевская волна электрона после рассеяния его на исследуемом объекте. Те же из электронов, которые не провзаимодействовали ни с рассеивателем, ни с исследуемым объектом, или же, провзаимодействовав с ними, остались все-таки в приповерхностном слое, в конце концов попадают на анод (позиция 9 на фиг. 6), представляющий собой проводящий слой, нанесенный на поверхность подложки. К аноду прикладывается небольшое, порядка десятых вольта, положительное напряжение относительно ускоряющего электрода. Таким образом, анод выполняет задачу удаления этих электронов с поверхности подложки. (Если их не удалять, то, накопившись, они могут своим электрическим полем создать искажения). Перейдем теперь к вопросу о регистрации интерференционной картины. Минимальное расстояние между интерференционными полосами, при котором еще возможна их регистрация на экране, составляет где-то от 10 до 20 мкм. Эта величина на несколько порядков превосходит длину де Бройлевской волны,которая, как было сказано выше, составляет всего лишь несколько ангстрем. Существует, однако, достаточно простой способ, дающий возможность увеличить при фиксированной длине волны излучения расстояние между интерференционными полосами - для этого нужно установить экран как можно дальше от той области, в которой находятся источники излучения. Чтобы понять, почему так происходит, давайте рассмотрим образование интерференционных полос в ситуации, представленной на фиг. 9. Здесь 2 - как и прежде, диэлектрическая подложка, 27 - излучатели де Бройлевских волн, причем расстояние между этими источниками равно а, 28 - экран, расположенный на расстоянии H от диэлектрической подложки. Поскольку принципиально это ничего не меняет, но несколько упрощает выкладки,будем полагать, что фазы де Бройлевских волн у обоих излучателей одинаковы. Тогда в центре экрана, в точке, где фазы приходящих волн совпадают, будет максимум интерференционной картины, а симметрично с двух сторон на расстоянии A от центра будут располагаться минимумы. В точке минимума должно выполняться условие, получим, что расстояние между минимумами интерферен Таким образом, увеличивая Н, мы увеличиваем расстояние и между минимумами. При а 200 нм,H10-2 м и 5 , получим 2 А 20 мкм, что уже вполне доступно для регистрации. Если же еще более увеличить H, то это позволит даже ослабить требования к регистрирующему экрану. Перейдем теперь к вопросу о том, как зарегистрировать электроны, попадающие на экран. Существует принципиальное положение, согласно которому, для того, чтобы зарегистрировать наличие какогото элемента на исследуемом объекте, на нем должно произойти как минимум хотя бы одно рассеяние электрона. Правда, если в среднем на элемент приходится только одно рассеяние, то вероятность ошибки при его регистрации оказывается слишком большой. Для того чтобы вероятность ошибки при регистрации была бы достаточно мала, число электронов, рассеянных таким элементом за время экспозиции,должно быть больше хотя бы нескольких десятков. Имеет смысл выбирать его где-то в районе сотни. Меньше брать нельзя, чтобы не увеличить вероятность ошибки, но и больше брать тоже нежелательно,поскольку при этом растет время экспозиции. Однако если требуется регистрировать столь малые количества электронов, то требования к регистрирующему устройству оказываются достаточно высокими. Нужно, чтобы такое устройство было способно регистрировать единичные электроны и при этом определять место их попадания с точностью не хуже 10 мкм. В принципе, такую задачу можно было бы решить с помощью фотопленок, используемых в ядерной физике для регистрации треков частиц. Но это очень неудобно. Поэтому в заявке предлагается иной способ регистрации электронов, который мы поясним с помощью фиг. 10. Здесь 17 - сетка, к которой приложено напряжение в несколько десятков вольт, 16 - микроканальная пластина (типа тех, которые используются в приборах ночного видения), 18 - ПЗС матрица, 29 - поток падающих электронов. Микроканальная пластина работает следующим образом. К пластине приложено напряжение, которое создает электрическое поле, направленное по оси каналов, проходящих сквозь пластину, которое ускоряет оказавшиеся внутри них электроны. Эти ускоренные электроны сталкиваются со стенками каналов и рождают за счет вторичной электронной эмиссии новые электроны, которые, в свою очередь,также ускоряются и порождают еще одну порцию электронов и так далее. Даже единичный электрон, если только его энергия достаточна для того, чтобы рождать вторичные-8 012215 электроны, попав в такой канал, способен создать в нем электронную лавину, которую уже вполне можно зарегистрировать с помощью ПЗС матрицы. В свою очередь, ПЗС матрица передает информацию о том, что в данном месте появилась электронная лавина, на компьютер. Конечно, энергия тех электронов, которые оторвались в результате рассеяния от диэлектрической подложки, недостаточна для эффективной вторичной эмиссии, но ее легко увеличить, сделав так, чтобы электроны ускорялись, проходя сквозь зазор между сеткой 17 и микроканальной пластиной 16. Для этого всего лишь нужно приложить между сеткой и микроканальной пластиной напряжение, которое будет ускорять электроны. В результате, появится возможность регистрировать оторвавшиеся от подложки электроны, а следовательно, и возможность регистрации интерференционной картины. Обсудим теперь вопрос о том, каким образом по этой интерференционной картине можно восстановить вид объекта. Ситуация здесь во многом сходна с той, которая имеет место в оптике при восстановлении внешнего вида объекта по его голограмме. И в том, и в другом случае используется очень похожий математический аппарат, поскольку ни различия в длине волны, ни различия в ее природе не являются в данном случае принципиальными. Действительно, де Бройлевская волна, образующаяся при взаимодействии электронов в приповерхностном слое с рассеивателем, является полным аналогом опорного пучка в оптике, а де Бройлевская волна, образующаяся при рассеянии электронов на исследуемом объекте, несет, так же как и в оптике, информацию о том, что собой представляет его поверхность. Тем не менее, учитывая, что здесь все же имеется определенная специфика, представляется целесообразным привести независимый вывод формул, позволяющих по известной интерференционной картине восстановить вид объекта. Информация об интерференционной картине поступает в компьютер в виде набора из N чисел, задающих распределение зарядов на поверхности экрана. Именно, каждое из чисел характеризует заряд,образовавшийся в какой-то малой области экрана (например, характеризует заряд на участке площадьюs, всего же имеется N таких участков, причм Ns=S, где S - площадь экрана). Как следует из изложенного выше, заряд, регистрируемый на произвольном i-м участке, пропорционален числу попавших на этот участок электронов, которое мы обозначим ni. Так что фактически компьютер получает информацию обо всм наборе ni. С другой стороны, ni пропорционален усредннному по времени квадрату модуля волновой функции,где 1(r,t) - часть волновой функции, соответствующая взаимодействию с рассеивателем, 2(r,t) - часть волновой функции, соответствующая рассеянию на исследуемом объекте, а для g(ri) имеем мы можем измерить заранее, ещ до того, как поместим исследуемый Величину объект на подложку. (Величину ni, полученную в таком измерении, мы обозначим, чтобы не путать с тем, что измерено при наличии исследуемого объекта, как n'i). В принципе, мы могли бы предварительно. Это можно сделать разными способами. измерить и Например, произвести съмку объекта на другом таком же устройстве, отличающимся только одним - в нм вообще отсутствуют рассеиватели. Или даже не менять устройство, но просто увеличить расстояние между рассеивателями и исследуемым объектом. В результате произойдт полное размывание и подавление интерференционной картины. Однако во всех таких процедурах, в сущности, нет даже особой необходимости. Подбирая соответствующим образом рассеиватели (например, меняя их размеры и местоположение, что полностью в нашей власти), мы можем добиться того, чтобы рассеяние на них доминировало бы над рассеянием на исследуемом объекте. В этом случае членом можно просто пренебречь, поскольку он вносит малый вклад в интерференционную картину по сравнению с членами В этом случае член g(ri), в котором содержится информация об интерференции функций 1(r,t) и 2(r,t), будет просто пропорционален разности ni-n'i ( мы будем обозначать эту разность как ni"). Представим себе, что та площадка, куда помещн исследуемый объект, разделена на N областей. Все эти области перенумерованы, то есть каждой такой области присвоен свой номер. Рассмотрим какую-то произвольно выбранную j-тую область. Возможно, что в эту область попадает та или иная часть исследуемого объекта (предполагается, что каждая такая часть существенно меньше всего исследуемого объекта в целом, соответственно, мы будем называть е элементом объекта). Каждый такой элемент объекта, попавший в j-тую область, характеризуется своим сечением рассеяния электронов (в данном случае речь идт о сечении упругого рассеяния, которое мы приближнно считаем изотропным). Мы будем обо-9 012215 значать это сечение как j. Фактически, набор величин j при Nj1, если только N достаточно велико, и определяет искомую форму поверхности исследуемого объекта. Поэтому наша задача состоит в том, чтобы по известному набору величин ni (Ni1) определить набор величин j (Nj1). Прежде всего, отметим следующее обстоятельство. Предположим, что мы имеем два или более элементов объекта, и каждому такому элементу соответствует своя интерференционная картина (или, что то же самое, свой набор ni (Ni1. Если только эти элементы объекта не располагаются слишком близко друг к другу, если расстояние между ними превышает хотя бы половину длины де Бройлевской волны, то интерференционная картина, соответствующая рассеянию на всех этих элементах одновременно, с хорошей точностью равняется сумме интерференционных картин от каждого из элементов по отдельности. На языке математики это означает, что можно записать следующее соотношение:(здесь ai,j - коэффициенты, вопрос о том, как их можно определить, будет обсуждаться ниже; по повторяющимся индексам, как принято в линейной алгебре, производится суммирование). Это соотношение может быть записано в матричной форме. Если записать как вектора в N-мерном пространстве (мы обозначим их как n" и ), то связь между ними может быть представлена в виде n" = A, где А - квадратная матрица размерности N на N с элементами ai,j. В матричном виде очень легко выразитьчерез n". Именно:= А-1n", где А-1 - обратная матрица, коэффициенты которой bi,j связаны с ai,j условием ai,jbj,k=i,k (где i,k=1 при i=k, i,k=0 при ik). Это условие позволяет выразить bi,j через ai,j. Таким образом, если мы сможем определить коэффициенты ai,j, то мы, далее,уже вычислим bi,j, после чего уже сможем определять j по ni". Тем самым, мы, фактически, решим задачу о восстановлении внешнего вида исследуемого объекта по его интерференционной картине. Перейдм к задаче об определении коэффициентов ai,j. Это можно сделать следующим образом. Поместим в какую-либо j-тую область (обозначим номер этой области как j1) так называемый тестовый объект, представляющий собой небольшую молекулу с известным сечением упругого рассеяния электронов T, и зарегистрируем полученную интерференционную картину (т.е. измерим все ni"). Имеем Мы можем повторить эту процедуру при другом j, которое мы обозначим как j2 и определим ai,j2. Действуя подобным образом, мы можем перебрать все j, и в результате определить все ai,j. Но в реальности ситуация оказывается ещ проще. Оказывается, что нам даже не нужно перебирать все j. Достаточно взять всего лишь несколько разных j. В принципе, могло бы даже хватить и одного. Дело в том, что де Бройлевскую волну, создаваемую тестовым объектом, можно аналитически рассчитать при любом его положении, в какую бы область он ни был бы помещен. Это, в свою очередь, позволяет рассчитать те изменения, которые возникают в интерференционной картине при изменении местоположения тестового объекта. Мы приведем здесь только приближнные формулы (к сожалению, даже они весьма громоздкие), позволяющие рассчитать ni" для случая, когда тестовый объект помещен в j-тую область (мы будем обозначать такое ni" как ni"(j, при условии, что мы провели два измерения и определили ni"(j1 и ni"(j2). Введем обозначения расстояние от i-й области на экране до ja-й области на подложке, a L'ja - расстояние от ближайшего к рассеивателям электронов края площадки, на которую помещается исследуемый объект (см. позиции 7 и 8 на фиг. 6), до ja-й области на подложке; (величины Li,jb и L'jb определяются аналогично). Введем также величины Fi(j1,j2) и Gi(j1,j2) Теперь мы можем записать ni" для какой-то произвольной области j3 что, в свою очередь, дат возможность определить для этой области искомый набор коэффициентов ai,j3. Перейдм теперь к вопросу о том, как определить, какие именно молекулярные группы находятся на поверхности исследуемого объекта. В принципе, это можно было бы сделать даже по деталям рельефа- 10012215 поверхности. Но для этого потребовалось бы фиксировать эти детали с очень высоким пространственным разрешением - меньше размеров атома, т.е. меньше одного ангстрема. Чтобы иметь такое пространственное разрешение, нужно использовать де Бройлевские волны с длиной волны не более 1-2 , а в этом случае энергия электронов превысит 10 эВ. В подавляющем числе случаев рассеяние электронов таких энергий будет происходить неупругим образом, что разрушает интерференцию, а кроме того, будет происходить ионизация и повреждение исследуемого объекта. Электрон в приповерхностном слое чаще всего даже и не удастся ускорить до таких энергий, поскольку в этом случае длина его де Бройлевской волны окажется гораздо меньше параметров кристаллической рештки диэлектрика. В результате,начнется дифракция де Бройлевской волны на кристаллической рештке диэлектрика, приводящая к уходу подавляющего большинства электронов из приповерхностного слоя. Поэтому нам нужно искать другие возможности для решения этой задачи. Оказывается, что здесь нам может помочь именно неупругое рассеяние - то явление, которое с самого начала рассматривалось нами как нежелательное, разрушающее интерференцию. Дело в том, что неупругое рассеяние представляет собой пороговый процесс - пока энергия электрона ниже энергии возбуждения какого-либо электронного уровня, возбудить его электроны не могут. Когда же энергия электрона превысит порог, часть электронов начнет рассеиваться неупругим образом, отдавая свою энергию на возбуждение этого уровня, и это будет заметно по уменьшению числа электронов, рассеянных упруго. Если мы будем менять энергию электронов и измерять сечение упругого рассеяния как функцию этой энергии, мы сможем определить точки, в которых эта функция испытывает излом, и по этим точкам определить энергии возбуждения (если не все такие энергии, то хотя бы часть их). А далее, по этим уровням, сопоставляя их с известными уровнями энергии различных молекулярных групп, уже можно решить, с какой именно молекулярной группой (или с какими молекулярными группами, если их больше одной) мы имеем дело. Кроме того, сечение упругого рассеяния само по себе, даже без учта влияния неупругого рассеяния, зависит от энергии электрона, что также может быть использовано для выяснения типа молекулярных групп. Таким образом, чтобы определить, какие именно молекулярные группы находятся на поверхности исследуемого объекта, мы должны действовать следующим образом. Мы должны провести серию съмок исследуемого объекта при различных потенциалах а, прикладываемых к ускоряющему электроду, и каждый раз определять величину j. Таким образом, мы получим j как функцию от потенциала a, или, что, в сущности, одно и то же,как функцию от энергии электрона Ееeа. По этой функции, сравнивая е с такими же функциями для известных молекулярных групп, уже можно определить, какая именно молекулярная группа (или какие именно молекулярные группы) находится в той или иной j-й области. Существует ещ одна причина, по которой имеет смысл проводить съмку исследуемого объекта при различных потенциалах а. Каждому потенциалу а соответствует своя длина де Бройлевской волны,а набор голограмм, полученных с использованием когерентных излучений различных длин волн, нест существенно больше информации, чем единственная голограмма, полученная при фиксированной длине волны. В силу этого, такой набор голограмм позволяет уточнять детали формы объекта, а также корректировать возможные искажения и неоднозначности, которые имеют место при восстановлении формы объекта только по одной голограмме. Заявляемые способ и устройство позволяют существенно уменьшить время, требуемое для определения формы поверхности микроскопических биологических объектов и дающее возможность определять местоположение и тип молекулярных групп, присутствующих на этих поверхностях. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Устройство для электронно-интерференционного определения местоположения и типа молекулярных групп на поверхности биообъектов, в т.ч. на последовательностях нуклеотидов, включающее основание из непроводящего материала, подложку, размещенную на основании, установленные на подложке фотокатод и анод, между которыми установлена площадка для размещения исследуемого объекта,фотокатод выполнен по меньшей мере с одним окном и участками из материала с пониженной работой выхода электронов по сравнению с работой выхода электронов из материала фотокатода, причем участки встроены в части фотокатода, граничащие с окном, окно соединено с областью вне фотокатода по меньшей мере одной прорезью, имеющей прямоугольную форму, причм е длина превосходит е ширину,порядок величины которой определяется длиной де Бройлевской волны электрона, энергия которого равна средней тепловой энергии электрона при температуре подложки, а направления кристаллографических осей координат материала подложки в месте расположения прорези согласованы с направлением прорези; между фотокатодом и площадкой в подложке выполнены рассеиватели электронов, расположенные при этом рядом с площадкой, под поверхностью подложки расположены на глубине h по меньшей мере один охлаждающий и на глубине h' по меньшей мере один ускоряющий электроды, причм охлаждающий электрод размещен под окном и прорезью, ускоряющий - под областью подложки между фотокатодом и анодом, а h' превышает h, под основанием установлен охладитель с теплоизолятором; над подлож- 11012215 кой установлена ПЗС матрица, снабжнная микроканальной пластиной и сеткой; также над подложкой установлен непрерывный лазер с фокусирующей системой, оптически связанной с фотокатодом, причм длина волны лазера выбрана больше пороговой длины волны для материала с пониженной работой выхода; также устройство содержит компьютер и блок управления для управления охлаждением, подачей напряжения на фотокатод, охлаждающий и ускоряющий электроды, анод, сетку, микроканальную пластину и ПЗС матрицу, а также и передачей информации с ПЗС матрицы на компьютер. 2. Электронно-интерференционный способ определения местоположения и типа молекулярных групп на поверхности биообъектов, в т.ч. на последовательностях нуклеотидов, с использованием устройства по п.1, заключающийся в том, что подают на ускоряющий электрод напряжение разной величины и регистрируют ряд интерференционных картин от потока электронов, движущихся один за другим в одинаковом квантовом состоянии, причм интервалы между ними таковы, что в каждый данный момент времени в области между фотокатодом и анодом имеется не больше одного электрона, провзаимодействовавшего с исследуемым объектом и провзаимодействовавшего с рассеивателями, и по этим интерференционным картинам рассчитывают форму исследуемого объекта, а также местоположение и тип молекулярных групп на его поверхности.