Иммуногенная композиция

012214 Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим капсульные полисахариды N. meningitidis, конъюгированные с белком-носителем. Оно также относится к вакцинам и вакцинным наборам, содержащим конъюгаты полисахаридов N. meningitidis, к способам изготовления иммуногенных композиций и вакцин и к применению вакцин и иммуногенных композиций по изобретению в терапии. Оно также относится к способам иммунизации против нейссериальной инфекции с использованием конъюгатов полисахаридов N. meningitidis и к применению конъюгатов полисахаридов N. meningitidis в изготовлении лекарственного средства.Neisseria meningitidis представляет собой грамотрицательный человеческий патоген, который вызывает бактериальный менингит. На основании капсульного полисахарида этого организма идентифицировано двенадцать серогрупп N. meningitidis (A, B, C, H, I, K, L, 29 Е, W135, X, Y и Z). Серогруппа А(MenA) вызывает наиболее распространенные случаи эпидемического заболевания в Африке к югу от Сахары. Серогруппы В и С ответственны за большинство случаев в развитых странах, тогда как остальные случаи вызывают W135 и Y. Иммуногенные композиции, содержащие сахариды N. meningitidis, конъюгированные с белкаминосителями, известны в данной области техники. Например, в WO 02/58737 раскрыта вакцина, содержащая очищенные капсульные полисахариды N. meningitidis серогрупп А, С, W135 и Y, конъюгированные с белком-носителем. Однако в этой заявке заявлено, что экстрагированные капсульные полисахариды N.meningitidis следует деполимеризовать нагреванием в растворе перекиси водорода перед конъюгацией. В WO 03/07985 раскрыты конъюгатные вакцины, содержащие сахарид N. meningitidis, выбранный из серогрупп А, С, W135 и Y. Менингококковые капсульные полисахариды экстрагируют, а затем гидролизуют с целью выбора олигосахаридов, образованных из капсульных полисахаридов, используемых для конъюгации с белком-носителем.B WO 04/103400 также раскрыт поливалентный конъюгат полисахарида менингококкового происхождения с белком, содержащий капсульные полисахариды, имеющие происхождение из N. meningitidis серогрупп А, С, W135 и Y. В этой заявке заявлено, что вместо использования нативного капсульного полисахарида большого размера предпочтительно использование менингококковых полисахаридов меньшего размера. Предполагают, что капсульные полисахариды частично деполимеризуют, используя мягкие окислительные условия, с получением среднего размера менее чем 100000 Дальтон (Да), предпочтительно от 12000 до 25000 Да. Остается необходимость в разработке усовершенствованных конъюгатных вакцин против менингита, вызванного Neisseria. Настоящее изобретение относится к разработке менингококковой полисахаридной конъюгатной вакцины, в которой размер полисахаридов больше, чем указанный в литературе. В данной области техники фокусировались на применении олигосахаридов для простоты получения конъюгатов. Авторы изобретения обнаружили, что путем использования нативных или в некоторой степени сортированных по размеру полисахаридных конъюгатов можно реализовать одно или более из следующих преимуществ: 1) конъюгат, обладающий высокой иммуногенностью, поддающийся фильтрованию; 2) иммунологическая память может быть усилена (как в примере 3); 3) изменение отношения полисахарида к белку в конъюгате, так что отношение полисахарида к белку (мас./мас.) в конъюгате можно увеличить (результатом этого может быть снижение эффекта подавления носителем); 4) иммуногенные конъюгаты, имеющие тенденцию к гидролизу (такие как конъюгаты MenA), можно стабилизировать путем использования полисахаридов большего размера для конъюгации. Результатом использования полисахаридов большего размера может быть более интенсивная поперечная сшивка с носителем конъюгата и, следовательно, в меньшей степени отщепление свободного сахарида от конъюгата. Конъюгатные вакцины, описанные в предшествующем уровне техники, имеют тенденцию к деполимеризации полисахаридов перед конъюгацией, чтобы улучшить конъюгацию. Настоящее изобретение направлено на другую стратегию и неожиданно демонстрирует, что менингококковые конъюгатные вакцины, сохраняющие более крупный размер полисахарида, дают хороший иммунный ответ против менингококкового заболевания. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция,содержащая капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа. Согласно следующему аспекту изобретения предложена вакцина, содержащая иммуногенную композицию по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно следующему аспекту изобретения предложен вакцинный набор для одновременного или последовательного введения, содержащий две поливалентные иммуногенные композиции для создания защиты в организме хозяина против заболевания, вызванного Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae и Neisseria meningitidis, где указанный набор содержит первый контейнер, содержащий столбнячный анатоксин (TT), дифтерийный анатоксин (DT) и цельноклеточные или бесклеточные коклюшные компоненты, и второй контейнер, содержащий капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y,конъюгированные с белком-носителем, где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше-1 012214 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа. Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ изготовления иммуногенной композиции или вакцины по изобретению, включающий стадию смешивания капсульных полисахаридов N.meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированных с белком-носителем, возможно с фармацевтически приемлемым эксципиентом, где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа. Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ иммунизации человека-хозяина против заболевания, вызванного Neisseria meningitidis, включающий введение указанному хозяину иммунопротективной дозы иммуногенной композиции или вакцины по изобретению. Согласно следующему аспекту изобретения предложена иммуногенная композиция по изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызванного Neisseria meningitidis. Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение иммуногенной композиции или вакцины по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызванных Neisseria meningitidis. Описание графических материалов Фиг. А - гистограмма, показывающая ответы GMC (геометрическое среднее концентрации) в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA) анти-MenY. ENYTT012 представляет собой конъюгатMenY-TT, полученный из нативного полисахарида MenY. ENYTT014 представляет собой конъюгат MenY-TT, полученный из микрофлюидизированного полисахарида MenY, который прошел 40 циклов микрофлюидизации. ENYTT015bis представляет собой конъюгат MenY-TT, полученный из микрофлюидизированного полисахарида MenY, который прошел 20 циклов микрофлюидизации. Фиг. В - гистограмма, показывающая ответы GMC в SBA-анализе анти-MenY. ENYTT012 представляет собой конъюгат MenY-TT, полученный из нативного полисахарида MenY. ENYTT014 представляет собой конъюгат MenY-TT, полученный из микрофлюидизированного полисахарида MenY, который прошел 40 циклов микрофлюидизации. ENYTT015bis представляет собой конъюгат MenY-TT,полученный из микрофлюидизированного полисахарида MenY, который прошел 20 циклов микрофлюидизации. Подробное описание Иммуногенная композиция по изобретению содержит капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белкомносителем, где средний размер (средняя молекулярная масса; Mw) по меньшей мере одного, двух, трех или четырех или каждого полисахарида N, meningitidis выше 50, 60, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа. В независимом аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере один, два, три или четыре или каждый полисахарид N.meningitidis либо представляет собой нативный полисахарид, либо сортирован по размеру с коэффициентом вплоть до 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 относительно средней молекулярной массы нативного полисахарида. Для целей изобретения "нативный полисахарид" относится к полисахариду, который не был подвергнут процессу, целью которого является уменьшение размера полисахарида. Полисахарид может слегка уменьшаться в размере во время обычных процедур очистки. Такой полисахарид все же является нативным. Только если полисахарид был подвергнут методикам сортировки по размеру, этот полисахарид не следует считать нативным. Для целей изобретения "сортирован по размеру с коэффициентом вплоть до 2" означает, что полисахарид подвергают процессу, предназначенному для уменьшения размера полисахарида, но сохранения размера, составляющего более чем половину размера нативного полисахарида. 3, 4 и так далее следует интерпретировать таким же образом, т.е. полисахарид подвергают процессу, предназначенному для уменьшения размера полисахарида, но сохранения размера, составляющего более чем треть, четверть и так далее, размера нативного полисахарида, соответственно. В одном аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит капсульные полисахариды N.meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере один, два, три или четыре или каждый полисахарид N. meningitidis представляет собой нативный полисахарид. В одном аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит капсульные полисахариды N.meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере один, два, три или четыре или каждый полисахарид N. meningitidis сортирован по размеру с коэффициентом вплоть до 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Иммуногенные композиции по изобретению возможно содержат конъюгаты: капсульного полисахарида N. meningitidis серогруппы С (MenC), капсульного полисахарида серогруппы А (MenA), капсульного полисахарида серогруппы W135 (MenW), капсульного полисахарида серогруппы Y (MenY), капсульных полисахаридов серогруппы C и Y (MenCY), капсульных полисахаридов серогруппы С и А(MenAC), капсульных полисахаридов серогруппы C и W (MenCW), капсульных полисахаридов серогруппы A и Y (MenAY), капсульных полисахаридов серогруппы A и W (MenAW), капсульных полисахаридов серогруппы W и Y (Men WY), капсульных полисахаридов серогруппы А, С и W (MenACW), капсульных полисахаридов серогруппы А, С и Y (MenACY); капсульных полисахаридов серогруппы A,W135 и Y (MenAWY), капсульных полисахаридов серогруппы С, W135 и Y (MenCWY); или капсульных полисахаридов серогруппы А, С, W135 и Y (MenACWY). Это определение представляет собой определение "одной, двух, трех или четырех" или "по меньшей мере одной из" серогрупп А, С, W и Y, либо каждого полисахарида N. meningitidis, где оно упомянуто здесь. В одном воплощении средний размер (или молекулярная масса) по меньшей мере одного, двух,трех или четырех или каждого полисахарида N. meningitidis составляет 50-1500 кДа, 50-500 кДа, 50-300 кДа, 101-1500 кДа, 101-500 кДа или 101-300 кДа, как определено посредством многоугловой лазерной спектроскопии (MALLS). В одном воплощении полисахарид MenA, когда присутствует, имеет молекулярную массу 50-500 кДа, 50-100 кДа, 100-500 кДа, 55-90 кДа, 60-70 кДа или 70-80 кДа или 60-80 кДа, как определено посредством MALLS. В одном воплощении полисахарид MenC, когда присутствует, имеет молекулярную массу 100-200 кДа, 50-100 кДа, 100-150 кДа, 101-130 кДа, 150-210 кДа или 180-210 кДа, как определено посредствомMALLS. В одном воплощении полисахарид MenY, когда присутствует, имеет молекулярную массу 60-190 кДа, 70-180 кДа, 80-170 кДа, 90-160 кДа, 100-150 кДа или 110-140 кДа, 50-100 кДа, 100-140 кДа, 140-170 кДа или 150-160 кДа, как определено посредством MALLS. В одном воплощении полисахарид MenW, когда присутствует, имеет молекулярную массу 60-190 кДа, 70-180 кДа, 80-170 кДа, 90-160 кДа, 100-150 кДа, 110-140 кДа, 50-100 кДа или 120-140 кДа, как определено посредством MALLS. Молекулярная масса или средняя молекулярная масса полисахарида здесь относится к средневесовой молекулярной массе (Mw) полисахарида, измеренной до конъюгации, и ее измеряют посредствомMALLS. Методика MALLS хорошо известна в данной области техники, и ее типично проводят, как описано в примере 2. Для MALLS-анализа менингококковых сахаридов можно использовать две колонки(TSKG6000 и 5000PW1 TOSOH Bioscience) в комбинации и элюировать сахариды в воде. Сахариды обнаруживают, используя детектор светорассеяния (например, Wyatt Dawn DSP, оборудованный 10 мВт аргоновым лазером 488 нм) и интерференционный рефрактометр (например, Wyatt Otilab DSP, оборудованный ячейкой Р 100 и красным фильтром при 498 нм). В одном воплощении полисахариды N. meningitidis представляют собой нативные полисахариды или нативные полисахариды, которые уменьшены в размере во время обычного процесса экстракции. В одном воплощении полисахариды N. meningitidis сортируют по размеру путем механического расщепления, например путем микрофлюидизации или обработки ультразвуком. Микрофлюидизация или обработка ультразвуком обладают преимуществом уменьшения размера более крупных нативных полисахаридов в достаточной степени для получения поддающегося фильтрованию конъюгата. Сортировку осуществляют с коэффициентом не более чем 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1,5. В одном воплощении иммуногенная композиция содержит конъюгаты N. meningitidis, которые получены из смеси нативных полисахаридов и полисахаридов, которые сортированы по размеру с коэффициентом не более чем 20. Например, полисахариды из MenC и/или MenA являются нативными. Например, полисахариды из MenY и/или MenW сортированы по размеру с коэффициентом не более чем 20,10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1,5. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из MenY и/или MenW и/или MenC и/или MenA, которые сортированы по размеру с коэффициентом не более чем 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1,5 и/или микрофлюидизированы. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативного MenA и/или MenC и/или MenW и/илиMenY. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативного MenC. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативного MenC и MenA, который сортирован по размеру с коэффициентом не более чем 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1,5 и/или микрофлюидизирован. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативного MenC и MenY, который сортирован по размеру с коэффициентом не более чем 20, 10, 8, 6, 5,4, 3, 2 или 1,5 и/или микрофлюидизирован. В одном воплощении полидисперсность полисахарида составляет 1-1,5, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 или 11,05, и после конъюгации с белком-носителем полидисперсность конъюгата составляет 1,0-2,5, 1,0-2,0,1,0-1,5, 1,0-1,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 или 1,5-2,0. Все измерения полидисперсности проводят посредствомMALLS. Полисахариды возможно сортируют по размеру вплоть до размера, отличающегося в 1,5, 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18 или 20 раз от размера полисахарида, выделенного из бактерий. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит антигенN. meningitidis серогруппы В. Этот антиген возможно представляет собой капсульный полисахарид N.meningitidis серогруппы В (MenB) либо сортированный по размеру полисахарид или олигосахарид,имеющий такое же происхождение. Этот антиген возможно представляет собой препарат в виде везикул наружной мембраны из N. meningitidis серогруппы В, как описано в ЕР 301992, WO 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 и WO 04/14419. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит капсульный сахарид H. influenzae b (Hib), конъюгированный с белком-носителем. Полисахарид(ы) N. meningitidis (и возможно капсульный сахарид Hib), включенные в фармацевтические композиции по изобретению, конъюгируют с белком-носителем, таким как столбнячный анатоксин, фрагмент С столбнячного анатоксина, нетоксичные мутанты столбнячного токсина, дифтерийный анатоксин, CRM197, другие нетоксичные мутанты дифтерийного токсина [такие как CRM176, CRM 197,CRM228, CRM 45 (Uchida et al. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 и CRM107 и другие мутации, описанные Nicholls и Youle в Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel,Maecel Dekker Inc., 1992; делеция или мутация Glu-148 на Asp, GIn или Ser и/или AIa 158 на GIy и другие мутации, раскрытые в US 4709017 или US 4950740; мутация по меньшей мере одного или более чем одного остатка Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и другие мутации, раскрытые в US 5917017 или US 6455673; либо фрагмент, раскрытый в US 5843711], пневмококковый пневмолизин, OMPC (белок наружной мембраны менингококка, обычно экстрагируемый из N. meningitidis серогруппы В, ЕР 0372501), синтетические пептиды (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белки теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), коклюшные белки (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста или гормоны (WO 91/01146), искусственные белки, содержащие множественные эпитопы Т-лимфоцитов человека CD4+ из различных антигенов патогенного происхождения (Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824), такие как белок N19 (Baraldoi et al. (2004) Infect lmmun 72; 4884-7), поверхностный белок пневмококка(WO 01/72337), токсин А или В С. difficile (WO 00/61761) или белок D (ЕР 594610 и WO 00/56360). В одном воплощении в иммуногенной композиции по изобретению используют один и тот же белок-носитель (независимо) по меньшей мере в двух, трех, четырех или каждом из полисахаридов N. meningitidis. B воплощении, где присутствует Hib, этот Hib можно конъюгировать с тем же самым белкомносителем, что и указанные по меньшей мере один, два, три, четыре или каждый из полисахаридов N.meningitidis. Например, 1, 2, 3 или 4 полисахарида N. meningitidis независимо конъюгируют со столбнячным анатоксином с получением 1, 2, 3 или 4 конъюгатов. В одном воплощении единственный белок-носитель может нести более чем один сахаридный антиген (WO 04/083251). Например, единственный белок-носитель можно конъюгировать с MenA и MenC;MenA; Hib и MenC; Hib и MenW или Hib и MenY. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит полисахарид N. meningitidis, конъюгированный с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из TT, DT, CRM197, Сфрагмента TT и белка D. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит сахарид Hib, конъюгированный с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из TT, DT, CRM197, С-фрагмента TT и белка D. Иммуногенная композиция по изобретению возможно содержит по меньшей мере один конъюгат менингококкового сахарида (например, MenA; MenC; MenW; MenY; MenA и MenC; MenA и MenW;MenY; MenA, MenW и MenY; MenC, MenW и MenY или MenA, MenC, MenW и MenY), имеющий отношение Men-сахарида к белку-носителю между 1:5 и 5:1, между 1:2 и 5:1, между 1:0,5 и 1:2,5 или между 1:1,25 и 1:2,5 (мас./мас.). Иммуногенная композиция по изобретению возможно содержит конъюгат сахарида Hib, имеющий отношение Hib к белку-носителю между 1:5 и 5:1; 1:2 и 2:1; 1:1 и 1:4; 1:2 и 1:3,5; либо примерно или точно 1:2,5 или 1:3 (мас./мас.). Под примерно подразумевают в пределах 10% от указанного отношения. Отношение сахарида к белку-носителю (мас./мас.) в конъюгате можно определить, используя стерилизованный конъюгат. Количество белка определяют, используя анализ по Лоури (например, Lowry et(ICP-OES) для MenA, DMAP-анализ (DMAP - 4-диметиламинопиридин) для MenC и анализ с резорцином для MenW и MenY (Monsigny et al. (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530). В одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению полисахарид(ы) N. meningitidis и/или сахарид Hib конъюгированы с белком-носителем посредством линкера, например бифункционального линкера. Этот линкер возможно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным,имея, например, реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную группу карбоновой кислоты, 2 реакционноспособных аминогруппы или две реакционноспособных группы карбоновой кислоты.-4 012214 Этот линкер имеет, например, число атомов углерода от 4 до 20, от 4 до 12, от 5 до 10. Возможный линкер представляет собой ADH (дигидразид адипиновой кислоты). Другие линкеры включают Впропионамидо (WO 00/10599), нитрофенилэтиламин (Gever et al. (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), галогеноалкилгалогениды (US4057685), гликозидные связи (US 4673574, US 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (US 4459286). Полисахаридные конъюгаты, присутствующие в иммуногенных композициях по изобретению,можно получить любой известной методикой сочетания. Способ конъюгации может быть основан на активации сахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного эфира. Активированный сахарид можно, таким образом, подвергать сочетанию непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию с носителем через тиоэфирную связь, полученную в результате взаимодействия с белком-носителем, активированным малеимидом (например, используя GMBS), или с холоацетилированным белком-носителем (например, используя йодацетамид или N-сукцинимидилбромацетатбромацетат). Возможно, цианатный эфир (возможно полученный путем химии CDAP) подвергают сочетанию с гександиамином или ADH и аминопроизводное сахарида конъюгируют с белком-носителем,используя химию карбодиимидов (например, EDAC или EDC). Такие конъюгаты описаны в опубликованной PCT заявке WO 93/15760 Uniformed Services University и WO 95/08348, а также в WO 96/29094. В других подходящих методиках используют карбииниды, гидразиды, активные сложные эфиры,норборан, паранитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие описаны в WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может быть образован путем взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (Bethell et al. J. Biol. Chem. 1979,254; 2572-4, Hearn et al. J. Chromatogr. 1981, 218; 509-18) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. Этот процесс может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможную защиту/удаление защиты первичной гидроксильной группы при взаимодействии этой первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного CDI-карбамата и сочетание этого промежуточного CDI-карбамата с аминогруппой на белке. Конъюгаты можно также получать способами прямого восстановительного аминирования, как описано в US 4365170 (Jennings) и US 4673574 (Anderson). Другие способы описаны в ЕР-0-161-188, ЕР 208375 и EP-0-477508. Следующий способ включает сочетание сахарида, активированного цианогенбромидом (илиCDAP), дериватизированного гидразидом адипиновой кислоты (ADH), с белком-носителем путем карбодиимидной конденсации (Chu C. et al. Infect. Immunity, 1983 245 256), например, используя EDAC. В одном воплощении гидроксильную группу (возможно активированную гидроксильную группу,например гидроксильную группу, активированную цианатным эфиром) на сахариде сшивают с аминоили карбоксигруппой на белке либо непосредственно, либо опосредованно (через линкер). Когда линкер присутствует, гидроксильную группу на сахариде возможно сшивают с аминогруппой на линкере, например, путем использования конъюгации CDAP. Следующую аминогруппу в линкере, например ADH,можно конъюгировать с группой карбоновой кислоты на белке, например, путем использования химии карбодиимидов, например, используя EDAC. В одном воплощении капсульный полисахарид(ы) Hib илиN. meningitidis сначала конъюгируют с линкером, а затем линкер конъюгируют с белком-носителем. В одном воплощении сахарид Hib, когда он присутствует, конъюгируют с белком-носителем, используя цианогенбромид (CNBr) или CDAP, либо комбинацию химии CDAP и карбодиимидов (таких какEDAC), либо комбинацию CNBr и химии карбодиимидов (таких как EDAC). Возможно Hib конъюгируют, используя CNBr и химию карбодиимидов, возможно EDAC. Например, CNBr используют для соединения сахарида и линкера, а затем химию карбодиимидов используют для соединения линкера с белкомносителем. В одном воплощении по меньшей мере один из капсульных полисахаридов N. meningitidis непосредственно конъюгируют с белком-носителем; возможно сахарид(ы) Men W и/или MenY и/или MenC непосредственно конъюгируют с белком-носителем. Например, MenW; MenY; MenC; MenW и MenY;MenW и MenC; MenY и MenC; либо MenW, MenY и MenC непосредственно сшивают с белкомносителем. Возможно, по меньшей мере один из капсульных полисахаридов N. meningitidis непосредственно конъюгируют с помощью CDAP. Например, MenW; MenY; MenC; MenW и MenY; MenW и MenC;CDAP (см. WO 95/08348 и WO 96/29094). В одном воплощении все капсульные полисахариды N. meningitidis конъюгируют со столбнячным анатоксином. Возможно отношение сахарида Men W и/или Y к белку-носителю составляет между 1:0,5 и 1:2(мас./мас.) и/или отношение сахарида MenC к белку-носителю составляет между 1:0,5 и 1:4, либо 1:1,251:1,5, либо 1:0,5 и 1:1,5 (мас./мас.), в частности, когда эти сахариды непосредственно сшивают с белком,возможно используя CDAP. В одном воплощении по меньшей мере один из капсульных полисахаридов N. meningitidis конъюгируют с белком-носителем через линкер, например бифункциональный линкер. Этот линкер возможно-5 012214 является гетеробифункциональным или гомобифункциональным и имеет, например, реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную группу карбоновой кислоты, 2 реакционноспособные аминогруппы или две реакционноспособные группы карбоновой кислоты. Этот линкер имеет, например, число атомов углерода от 4 до 20, от 4 до 12, от 5 до 10. Возможный линкер представляет собой ADH. В одном воплощении MenA; MenC; либо MenA и MenC конъюгируют с белком-носителем (например, столбнячным анатоксином) через линкер. В одном воплощении по меньшей мере один полисахарид N. meningitidis конъюгируют с белкомносителем через линкер, используя CDAP и EDAC. Например, MenA; MenC; либо MenA и MenC конъюгируют с белком через линкер (например, линкер с двумя группами гидразино на его концах, такой какADH), используя CDAP и EDAC, как описано выше. Например, CDAP используют для конъюгации сахарида с линкером, и EDAC используют для конъюгации линкера с белком. Возможно, результатом конъюгации через линкер является отношение полисахарида к белку-носителю между 1:0,5 и 1:6; 1:1 и 1:5 или 1:2 и 1:4, для MenA; MenC; либо MenA и MenC. В одном воплощении капсульный полисахарид MenA, когда присутствует, является, по меньшей мере, частично О-ацетилированным, так что по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев являются О-ацетилированными по меньшей мере в одном положении. O-ацетилирование,например, присутствует, по меньшей мере, в положении О-3 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев. В одном воплощении капсульный полисахарид MenC, когда присутствует, является, по меньшей мере, частично О-ацетилированным, так что по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98%(29)-сшитых повторяющихся звеньев NeuNAc являются О-ацетилированными по меньшей мере в одном или двух положениях. О-ацетилирование, например, присутствует в положении O-7 и/или O-8 по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев. В одном воплощении капсульный полисахарид MenW, когда присутствует, является, по меньшей мере, частично О-ацетилированным, так что по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев являются О-ацетилированными по меньшей мере в одном или двух положениях. О-ацетилирование, например, присутствует в положении O-7 и/или O-9 по меньшей мере 30, 40, 50, 60,70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев. В одном воплощении капсульный полисахарид MenY, когда присутствует, является, по меньшей мере, частично О-ацетилированным, так что по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев являются О-ацетилированными по меньшей мере в одном или двух положениях О-ацетилирование присутствует в положении 7 и/или 9 по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев. Процент О-ацетилирования относится к процентному содержанию повторяющихся звеньев, содержащих О-ацетилирование. Это можно измерить в полисахариде перед конъюгацией и/или после конъюгации. В следующем воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит конъюгат сахарида Hib и по меньшей мере два конъюгата полисахаридов N. meningitidis, где конъюгат Hib присутствует в более низкой дозе сахарида, чем средняя доза сахарида по меньшей мере двух конъюгатов полисахаридов N. meningitidis. Альтернативно, конъюгат Hib присутствует в более низкой дозе сахарида, чем доза сахарида каждого из по меньшей мере двух конъюгатов полисахаридов N. meningitidis. Например, доза конъюгата Hib может быть по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% ниже, чем средняя или самая низкая доза сахарида по меньшей мере двух других конъюгатов полисахаридов N. meningitidis. Термин "сахарид" включает полисахариды или олигосахариды. Полисахариды выделяют из бактерий, либо выделяют из бактерий и сортируют по размеру до определенной степени известными способами (см., например, ЕР 497524 и ЕР 497525) и возможно путем микрофлюидизации. Полисахариды можно сортировать по размеру с целью уменьшения вязкости в образцах полисахаридов и/или улучшения фильтруемости для конъюгированных продуктов. Олигосахариды характеризуются как типично гидролизованные полисахариды с более низким числом повторяющихся звеньев (типично 5-30 повторяющихся звеньев). Среднюю дозу определяют путем суммирования доз всех других полисахаридов и деления на количество других полисахаридов. Другими полисахаридами являются все полисахариды в иммуногенной композиции, кроме Hib, и могут включать капсульные полисахариды N. meningitidis. "Доза" представляет собой количество иммуногенной композиции или вакцины, которое вводят человеку. Сахарид Hib представляет собой капсульный полисахарид полирибозилфосфат (PRP) Haemophilusinfluenzae типа b или производный от него олигосахарид. По меньшей мере два других конъюгата бактериальных сахаридов следует использовать для обозначения по меньшей мере двух других конъюгатов бактериальных сахаридов, кроме конъюгата Hib. По меньшей мере два других бактериальных конъюгата могут включать конъюгаты капсульных полисахаридов N. meningitidis. Иммуногенные композиции по изобретению могут содержать другие конъюгаты сахаридов, имеющих происхождение от одного или более чем одного из Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,-6 012214 стрептококков группы А, стрептококков группы В, S. typhi, Staphylococcus aureus или Staphylococcus epidermidis. B одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульные полисахариды или олигосахариды Neisseria meningitidis, имеющие происхождение от одной или более чем одной серогруппы А, С, W135 и Y. Следующее воплощение включает капсульные полисахариды или олигосахариды,имеющие происхождение от Streptococcus pneumoniae. Пневмококковые капсульные полисахаридные или олигосахаридные антигены возможно выбраны из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A,11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F (возможно из серотипов 1, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14,18 С, 19F и 23F). Следующее воплощение включает капсульные полисахариды или олигосахаридыStaphylococcus aureus типа 5, типа 8 или 336. Следующее воплощение включает капсульные полисахариды Staphylococcus epidermidis типа I, типа II или типа III. Следующее воплощение включает сахарид Vi(поли- или олигосахарид) S. typhi. Следующее воплощение включает капсульные полисахариды или олигосахариды типа Ia, типа Ic, типа II, типа III или типа V стрептококков группы В. Следующее воплощение включает капсульные полисахариды или олигосахариды стрептококков группы А, возможно дополнительно содержащие по меньшей мере один белок M и возможно множественные типы белка M. В воплощениях иммуногенная композиция по изобретению содержит каждый капсульный полисахарид N. meningitidis в дозе между 0,1-20 мкг; 1-10 мкг; 2-10 мкг, 2,5-5 мкг, примерно или точно 5 мкг; либо примерно или точно 2,5 мкг. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению, например, содержит конъюгат сахарида Hib в дозе сахарида от 0,1 до 9 мкг; от 1 до 5 мкг или от 2 до 3 мкг, либо примерно или точно 2,5 мкг, и каждого из конъюгатов полисахаридов N. meningitidis в дозе сахарида от 2 до 20 мкг, от 3 до 10 мкг или от 4 до 7 мкг, либо примерно или точно 5 мкг."Примерно" или "приблизительно" определяют как в пределах 10% больше или меньше данной цифры для целей изобретения. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит дозу сахарида сахаридного конъюгата Hib, которая составляет, например, менее чем 90, 80, 75, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10% от средней дозы сахарида по меньшей мере двух, трех, четырех или каждого из полисахаридных конъюгатов N. meningitidis. Сахаридная доза сахарида Hib составляет, например, от 20 до 60%, от 30 до 60%, от 40 до 60%, либо примерно или точно 50% от средней дозы сахарида по меньшей мере двух, трех, четырех или каждого из полисахаридных конъюгатов N. meningitidis. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит дозу сахарида сахаридного конъюгата Hib, которая составляет, например, менее чем 90, 80, 75, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10% самой низкой дозы сахарида по меньшей мере двух, трех, четырех или каждого из полисахаридных конъюгатов N. meningitidis. Сахаридная доза сахарида Hib составляет, например, от 20 до 60%, от 30 до 60%, от 40 до 60%, либо примерно или точно 50% от самой низкой дозы сахарида по меньшей мере двух,трех, четырех или каждого из полисахаридных конъюгатов N. meningitidis. В одном воплощении изобретения доза сахарида каждого из по меньшей мере двух, трех, четырех или каждого из полисахаридных конъюгатов N. meningitidis возможно одинакова или примерно одинакова. Примерами иммуногенных композиций по изобретению являются композиции, состоящие из приведенного ниже или содержащие приведенное ниже: конъюгат Hib и конъюгат MenA и конъюгат MenC, возможно при отношениях дозы сахарида 1:2:2,1:2:1, 1:4:2, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно, доза сахарида MenA выше, чем доза сахарида MenC; конъюгат Hib и конъюгат MenC и конъюгат MenY, возможно при отношениях дозы сахарида 1:2:2,1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно, доза сахарида MenC выше,чем доза сахарида MenY; конъюгат Hib и конъюгат MenC и конъюгат MenW, возможно при отношениях дозы сахарида 1:2:2,1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно, доза сахарида MenC выше,чем доза сахарида MenW; конъюгат Hib и конъюгат MenA и конъюгат MenW, возможно при отношениях дозы сахарида 1:2:2,1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно, доза сахарида MenA выше,чем доза сахарида MenW; конъюгат Hib и конъюгат MenA и конъюгат MenY, возможно при отношениях дозы сахарида 1:2:2,1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно, доза сахарида MenA выше,чем доза сахарида MenY; конъюгат Hib и конъюгат MenW и конъюгат MenY, возможно при отношениях дозы сахарида 1:2:2,1:2:1, 1:1:2, 1:4:2, 1:2:4, 1:4:1, 1:1:4, 1:3:6, 1:1:3, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно, доза сахарида MenY выше, чем доза сахарида MenW;MenA, MenC, MenW и MenY при отношениях дозы сахарида 1:1:1:1, либо 2:1:1:1, либо 1:2:1:1, либо 2:2:1:1, либо 1:3:1:1, либо 1:4:1:1 (мас./мас.). Следующий аспект изобретения составляет вакцина, содержащая иммуногенную композицию по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению забуферена или доведена до pH от-7 012214 7,0 до 8,0, pH от 7,2 до 7,6 либо pH примерно или точно 7,4. Иммуногенная композиция или вакцины по изобретению возможно лиофилизированы в присутствии стабилизирующего агента, например, полиола, такого как сахароза или трегалоза. Возможно, иммуногенная композиция или вакцина по изобретению содержит количество адъюванта, достаточное для усиления иммунного ответа на иммуноген. Подходящие адъюванты включают, но не ограничены ими, соли алюминия (фосфат алюминия или гидроксид алюминия), смеси скваленов (SAF-1),мурамилпептид, производные сапонина, препараты клеточной стенки микобактерий, монофосфориллипид А, производные миколовых кислот, неионные блок-сополимерные поверхностно-активные вещества,Quil A, субъединицу холерного токсина В, полифосфазен и его производные, а также иммуностимулирующие комплексы (ISCOM), такие как описаны Takahashi et al. (1990) Nature 344: 873-875. Для комбинаций N. meningitidis или HibMen, обсужденных выше, может быть предпочтительно не использовать какой-либо адъювант, представляющий собой соль алюминия, либо не использовать вообще никакого адъюванта. Как и для всех иммуногенных композиций или вакцин, иммунологически эффективные количества иммуногенов должны быть определены эмпирически. Факторы, которые следует учитывать, включают иммуногенность, образование или отсутствие образования иммуногеном комплекса или ковалентного присоединения к адъюванту или белку-носителю либо другому белку, путь введения и число иммунизирующих дозировок, которые нужно вводить. Такие факторы известны в области вакцин и хорошо известны иммунологам для проведения таких определений без чрезмерного экспериментирования. Активный агент может присутствовать в варьирующих концентрациях в фармацевтической композиции или вакцине по изобретению. Типично минимальная концентрация вещества представляет собой количество, необходимое для достижения его предназначенного применения, тогда как максимальное количество представляет собой максимальное количество, которое будет сохраняться в растворе или в гомогенно суспендированном состоянии в исходной смеси. Например, минимальное количество терапевтического агента возможно представляет собой количество, которое дает однократную терапевтически эффективную дозировку. Для биологически активных веществ минимальная концентрация представляет собой количество, необходимое для биологической активности после разведения, а максимальная концентрация находится в точке, при которой гомогенную суспензию невозможно поддерживать. В случае стандартных лекарственных форм с однократной дозой количество представляет собой количество для однократного терапевтического применения. В целом ожидают, что каждая доза должна содержать 1-100 мкг белкового антигена, возможно 5-50 мкг или 5-25 мкг. Примерами доз бактериальных сахаридов являются дозы 10-20 мкг, 5-10 мкг, 2,5-5 мкг или 1-2,5 мкг. Предпочтительное количество вещества варьирует от вещества к веществу, но легко может быть определено специалистами в данной области техники. Вакцинные препараты по настоящему изобретению можно применять для защиты или лечения млекопитающего (например, пациента-человека), восприимчивого к инфекции, путем введения указанной вакцины системным путем или в слизистую оболочку. Пациент-человек возможно представляет собой младенца (моложе 12 месяцев), ребенка раннего возраста (12-24, 12-16 или 12-14 месяцев), ребенка (2-10,3-8 или 3-5 лет), подростка (12-25, 14-21 или 15-19 лет) или взрослого (любой возраст старше 12, 15, 18 или 21). Эти введения могут включать инъекцию посредством внутримышечного, внутрибрюшинного,внутрикожного или подкожного путей; либо посредством введения в слизистую оболочку в пероральные/пищеварительные, дыхательные, мочеполовые пути. Интраназальное введение вакцин для лечения пневмонии или среднего отита является предпочтительным (поскольку носоглоточное носительство пневмококков может быть более эффективно предупреждено, ослабляя тем самым инфекцию на ее наиболее ранней стадии). Хотя вакцину по изобретению можно вводить в однократной дозе, ее компоненты можно также вводить совместно в одно и то же время или в разные моменты времени (например, если в вакцине присутствуют сахариды, их можно вводить по отдельности в одно и то же время или через 1-2 недели после введения бактериальной белковой вакцины для возможного координирования иммунных ответов по отношению друг к другу). Помимо одного пути введения, можно использовать 2 разных пути введения. Например, вирусные антигены можно вводить ID (внутрикожно), тогда как бактериальные белки можно вводить IM (внутримышечно) или IN (интраназально). Если сахариды присутствуют, их можно вводить IM (или ID), а бактериальные белки можно вводить IN (или ID). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить IM в случае доз первичной иммунизации и IN в случае бустерных доз. Вакцинный препарат в целом описан в Vaccine Design ("The subunit и adjuvant approach" (eds PowellM.F.Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Инкапсуляция в липосомы описана Fullerton, патент США 4235877. Следующий аспект изобретения составляет вакцинный набор для одновременного или последовательного введения, содержащий две поливалентные иммуногенные композиции для создания защиты в организме хозяина против заболевания, вызванного Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae и Neisseria meningitidis и, возможно, Haemophilus influenzae. Например, этот набор возможно содержит первый контейнер, содержащий одно или более чем одно из следующего: столбнячный анатоксин (TT), дифтерийный анатоксин (DT) и цельноклеточные или бесклеточные коклюшные компо-8 012214 ненты, и второй контейнер, содержащий либо капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа, возможно лиофилизированные, либо конъюгат сахарида Hib и капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем,где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа, возможно лиофилизированные. Примеры препаратов конъюгата Hib и конъюгатов полисахаридов N. meningitidis являются такими,как описано выше. Следующий аспект изобретения составляет вакцинный набор для одновременного или последовательного введения, содержащий две поливалентные иммуногенные композиции для создания защиты в организме хозяина против заболевания, вызванного Streptococcus pneumoniae и Neisseria meningitidis и,возможно, Haemophilus influenzae. Например, набор возможно содержит первый контейнер, содержащий один или более чем один конъюгат белка-носителя и капсульного сахарида Streptococcus pneumoniae [где капсульный сахарид возможно представляет собой сахарид пневмококка серотипа, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18C, 19 А, 19F, 20, 22F,23F и 33F], и второй контейнер, содержащий либо капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа, возможно лиофилизированные, либо конъюгат сахарида Hib и капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех из серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белкомносителем, где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа, возможно лиофилизированные. Примеры препаратов конъюгата Hib и конъюгатов полисахаридов N. meningitidis являются такими,как описано выше. Типично вакцина Streptococcus pneumoniae в вакцинном наборе по настоящему изобретению содержит сахаридные антигены (возможно конъюгированные), где полисахариды имеют происхождение из по меньшей мере четырех серотипов пневмококков, выбранных из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6 А,6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F. Возможно, эти четыре серотипа включают 6 В, 14, 19F и 23F. Возможно, по меньшей мере 7 серотипов включены в композицию, например, имеющие происхождение из серотипов 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F. Возможно, более чем 7 серотипов включены в композицию, например по меньшей мере 10, 11, 12, 13 или 14 серотипов. Например, композиция в одном воплощении включает 11 капсульных полисахаридов, имеющих происхождение из серотипов 1, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F (возможно конъюгированных). В одном воплощении изобретения включены по меньшей мере 13 полисахаридных антигенов (возможно конъюгированных), хотя дополнительные полисахаридные антигены, например 23-валентные (такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F), также предполагаются данным изобретением. Пневмококковые сахариды независимо конъюгированы с любым известным белком-носителем, например CRM197, столбнячным анатоксином, дифтерийным токсином, белком D или любыми другими белками-носителями, как упомянуто выше. Возможно, вакцинные наборы по изобретению содержат третий компонент. Например, набор возможно содержит первый контейнер, содержащий одно или более чем одно из следующего: столбнячный анатоксин (TT), дифтерийный анатоксин (DT) и цельноклеточные или бесклеточные коклюшные компоненты, и второй контейнер, содержащий один или более чем один конъюгат белка-носителя и капсульного сахарида Streptococcus pneumoniae [где этот капсульный сахарид возможно представляет собой сахарид серотипа пневмококка, выбранного из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A,11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F], и третий контейнер, содержащий капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y,конъюгированные с белком-носителем, где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа, возможно лиофилизированные, или конъюгат сахарида Hib и капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W иY, конъюгированные с белком-носителем, где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа, возможно лиофилизированные. Иммуногенные композиции, содержащие менингококковые конъюгаты, например HibMenC, HibMenAC, HibMenAW, HibMenAY, HibMenCW, HibMenCY, HibMenWY, MenAC, MenAW, MenAY,MenCW, MenCY, MenWY или MenACWY, включая наборы состава, подобного описанным выше, возможно содержат антигены кори и/или эпидемического паротита и/или краснухи и/или ветряной оспы. Например, менингококковая иммуногенная композиция содержит антигены кори, эпидемического паротита и краснухи или кори, эпидемического паротита, краснухи и ветряной оспы. В одном воплощении эти вирусные антигены возможно присутствуют в том же контейнере, что и менингококковые конъюгаты и/или конъюгат(ы) сахарида Hib. B одном воплощении эти вирусные антигены лиофилизированы.-9 012214 Следующий аспект изобретения составляет способ изготовления иммуногенной композиции по изобретению, включающий стадию смешивания капсульных полисахаридов N. meningitidis по меньшей мере одной, двух или трех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированных с белком-носителем, с конъюгатом бактериального сахарида, где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше 50, 75, 100,110, 120 или 130 кДа. Вакцинный препарат в общем описан в Vaccine Design ("The subunit и adjuvant approach" (eds PowellM.F.Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Инкапсуляция в липосомы описана Fullerton, патент США 4235877. Следующий аспект изобретения составляет способ иммунизации человека-хозяина против заболевания, вызванного инфекцией N. meningitidis и возможно Haemophilus influenzae, включающий введение указанному хозяину иммунопротективной дозы иммуногенной композиции или вакцины, либо набора по изобретению. Следующий аспект изобретения составляет иммуногенная композиция по изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызванного инфекцией N. meningitidis и возможноHaemophilus influenzae. Следующий аспект изобретения составляет применение иммуногенной композиции, или вакцины,или набора по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания, вызванного инфекцией N. meningitidis и возможно Haemophilus influenzae. Термины "содержащий", "содержать" и "содержит" здесь подразумеваются авторами изобретения как возможно заменяемые терминами "состоящий из", "состоять из" и "состоит из", соответственно, в каждом случае. Все ссылки или патентные заявки, цитируемые в данном патентном описании, включены здесь путем ссылки. Изобретение проиллюстрировано прилагаемыми примерами. Приведенные ниже примеры осуществляют, используя стандартные методики, которые являются хорошо известными и стандартными для специалистов в данной области техники, за исключением случаев, когда подробно описано иным образом. Примеры являются иллюстративными, но не ограничивают изобретение. Примеры Пример 1. Получение конъюгатов полисахаридов. Ковалентное связывание полисахарида PRP Haemophilus influenzae (Hib) с TT проводили с помощью химии сочетания, разработанной Chu et al. (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256). Полисахарид PRP Hib активировали добавлением CNBr и инкубацией при pH 10,5 в течение 6 мин. Значение pH снижали до pH 8,75, добавляли дигидразид адипиновой кислоты (ADH) и инкубацию продолжали еще в течение 90 мин. Активированный PRP подвергали сочетанию с очищенным столбнячным анатоксином путем карбодиимидной конденсации, используя 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDAC).EDAC добавляли к активированному PRP до достижения конечного соотношения 0,6 мг EDAC/мг активированного PRP. Значение pH доводили до 5,0 и добавляли очищенный столбнячный анатоксин до достижения 2 мг ТТ/мг активированного PRP. Полученный в результате раствор оставляли на трое суток при слабом перемешивании. После фильтрования через мембрану 0,45 мкм конъюгат очищали на колонке Sephacryl S500HR (Pharmacia, Швеция), уравновешенной в 0,2 M NaCl. Конъюгаты MenC-ТТ получали, используя нативные полисахариды (массой более 150 кДа по измерениям MALLS). Конъюгаты MenA-ТТ получали, используя либо нативный полисахарид, либо незначительно микрофлюидизированный полисахарид массой более 60 кДа по измерениям MALLS методом примера 2. Конъюгаты MenW и MenY-TT получали, используя сортированные по размеру полисахариды массой примерно 100-200 кДа по измерениям MALLS (см. пример 2). Сортировку по размеру проводили путем микрофлюидизации, используя аппарат для гомогенизации Emulsiflex C-50. Затем полисахариды фильтровали через фильтр 0,2 мкм. Активацию и сочетание проводили, как описано в WO 96/29094 и WO 00/56360. Кратко, полисахарид в концентрации 10-20 мг/мл в 2 М NaCl, pH 5,5-6,0, смешивали с раствором CDAP (100 мг/мл свежеприготовленного в ацетонитриле/WFI (воде для инъекций), 50/50) до конечного соотношенияCDAP/полисахарид 0,75/1 или 1,5/1. Через 1,5 мин значение pH повышали гидроксидом натрия до pH 10,0. Через 3 мин добавляли столбнячный анатоксин до достижения соотношения белок/полисахарид 1,5/1 для MenW, 1,2/1 для MenY, 1,5/1 для MenA или 1,5/1 для MenC. Реакцию продолжали в течение 1-2 ч. После стадии сочетания добавляли глицин до конечного соотношения глицин/PS (полисахарид)(мас./мас.) 7,5/1 и значение pH доводили до pH 9,0. Смесь оставляли на 30 мин. Конъюгат осветляли, используя фильтр Kleenpak 10 мкм, а затем наносили на колонку Sephacryl S400HR, используя буфер для элюции 150 мМ NaCl, 10 мМ или 5 мМ Трис, pH 7,5. Клинические партии фильтровали на стерилизующей мембране Opticap 4. Полученные в результате конъюгаты имели среднее соотношение полисахарид:белок 1:1-1:5 (мас./мас.). Для конъюгирования капсульного полисахарида MenA со столбнячным анатоксином через спейсер использовали следующий способ. Ковалентное связывание полисахарида и спейсера (ADH) проводят с- 10012214 помощью химии сочетания, посредством которой полисахарид активируют в регулируемых условиях цианилирующим агентом тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламино-пиридиния (CDAP). Спейсер взаимодействует с цианилированным PS через его группы гидразино с образованием стабильной изомочевинной связи между спейсером и полисахаридом. Раствор MenA, 10 мг/мл, обрабатывали свежеприготовленным раствором CDAP, 100 мг/мл, в ацетонитриле/воде (50/50 (об/об до получения соотношения CDAP/MenA 0,75 (мас./мас.). Через 1,5 мин значение pH повышали до pH 10,0. Через три минуты добавляли ADH до получения соотношенияADH/MenA 8,9. Значение pH раствора понижали до 8,75 и реакцию проводили в течение 2 ч. Перед реакцией конъюгации очищенный раствор TT и раствор PSAAH разбавляли до достижения концентрации 10 мг/мл для PSAAH и 10 мг/мл для TT.EDAC добавляли к раствору PSAAH до достижения конченого отношения 0,9 мг EDAC/мг PSAAH. Значение pH доводили до 5,0. Очищенный столбнячный анатоксин добавляли перистальтическим насосом (за 60 мин) до достижения 2 мг ТТ/мг PSAAH. Полученный в результате раствор оставляли на 60 мин при +25C при перемешивании до достижения конечного времени сочетания 120 мин. Конъюгат осветляли, используя фильтр 10 мкм и очищали, используя колонку Sephacryl S400HR. Пример 2. Определение молекулярной массы с использованием MALLS. Детекторы соединяли с колонкой для эксклюзионной ВЭЖХ, из которой элюировались образцы. С одной стороны, детектор лазерного светорассеяния измерял интенсивности света, рассеиваемого при 16 углах макромолекулярным раствором, и, с другой стороны, интерферометрический рефрактометр, подключенный к системе, давал возможность определения количества элюированного образца. На основании этих интенсивностей можно определить размер и форму макромолекул в растворе. Средневесовую молекулярную массу (Mw) определяют как сумму масс всех видов молекул, умноженную на их соответствующую молекулярную массу и разделенную на сумму масс всех видов молекул. а) Средневесовая молекулярная масса: -Mw б) Среднечисловая молекулярная масса: -Mn в) Среднеквадратичное значение радиуса: -Rw- и R2W, представляет собой квадратичный радиус,определяемый уравнением-mi- представляет собой массу центра рассеяния l, и -ri- представляет собой расстояние между центром рассеяния i и центром тяжести макромолекулы. г) Полидисперсность определяют как соотношение -Mw/Mn-. Менингококковые полисахариды анализировали посредством MALLS путем нанесения на две колонки ВЭЖХ (TSKG6000 и 5000PWxI), используемые в комбинации. 25 мкм полисахарида наносили на колонку и элюировали 0,75 мл фильтрованной воды. Полисахариды определяли, используя детектор светорассеяния (Wyatt Dawn DSP, оборудованный 10 мВт аргоновым лазером при 488 нм) и интерферометрический рефрактометр (Wyatt Otilab DSP, оборудованный ячейкой Р 100 и красным фильтром при 498 нм). Полидисперсности молекулярной массы и выходы всех образцов вычисляли методом Дебая, используя полиномиальное соответствие порядка 1 в программном обеспечении Astra 4.72. Пример 3. Сравнительное клиническое исследование иммунизации Meninqitec или конъюгатомMenC-ТТ большего размера. Открытое контролируемое исследование, фаза II, проводили для сравнения конъюгатной вакциныGSK Biological's серогруппы С (MenC) менингококка с конъюгатной вакциной GSK Biological's Haemophilus influenzae b - менингококка серогруппы С (Hib-MenC) или Meningitec. Каждая доза Meningitec содержит 10 мкг олигосахарида менингококка серогруппы С, конъюгированного с 15 мкг CRM197, и изготавливается фирмой Wyeth. Конъюгаты GSK MenC содержали нативные полисахариды массой примерно 200 кДа, конъюгированные со столбнячным анатоксином (TT). В исследование было включено пять групп, каждая планировалась как содержащая 100 субъектов,разделенных на две параллельных ветви следующим образом. В данном настоящем исследовании все субъекты в обеих ветвях получали одну пятую (1/5) дозыMencevax ACWY и одновременную дозу Infanrix hexa в возрасте 12-15 месяцев (месяц исследования 0). Два образца крови собирали от всех субъектов (месяц исследования 0 и месяц исследования 1). Ветвь 1 состояла из четырех групп исследования первичной вакцинации, которым проводили первичную иммунизацию в возрасте 3, 4 и 5 месяцев следующими вакцинами:- 11012214 Группа K: MenC (10 мкг), не адсорбирован на солях алюминия (без адъюванта), конъюгат столбнячного анатоксина (TT) и Infanrix hexa (MenC10-TT + Infanrix hexa) Группа L: Hib (10 мкг)-MenC (10 мкг), без адъювантов, конъюгат TT и Infanrix penta (Hib10MenC10-TT + Infanrix penta) Группа M: Hib (5 мкг)-MenC (5 мкг), без адъювантов, конъюгат TT и Infanrix penta (Hib5-MenC5TT + Infanrix penta) Группа N: Meningitec и Infanrix hexa (Meningitec + Infanrix hexa) Две вакцинные группы Hib-MenC-TT (группы L и M) сохранили в слепом методе исследования бустерной иммунизации для точного определения состава вакцины-кандидата. Ветвь 2 (группа О) состояла из субъектов одного возраста, прежде не вакцинированных вакциной менингококка серогруппы С (не подвергнутые воздействию), но которые получали традиционные педиатрические вакцины в соответствии с Постоянной комиссией по иммунизации Германии. Критерии оценки. Иммуногенность: определение титров бактерицидных антител против менингококка С (SBA-MenC) с использованием бактерицидного теста (предельное значение: разведение 1:8) и измерение посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) антител против менингококка серогруппы С (предельное значение: 0,3 мкг/мл), полисахарида PRP Hib (предельное значение: 0,15 мкг/мл) и столбнячного анатоксина (предельное значение: 0,1 международных единиц (МЕ)/мл) в образцах крови, полученных перед вакцинацией и примерно через месяц после вакцинации у всех субъектов. Статистические методы. Демографические данные: определение среднего возраста в месяцах (с медианой, интервалом и стандартным отклонением [CO]), а также расового и полового состава ATP и суммарных вакцинируемых групп. Иммуногенность: два анализа иммуногенности проводили на основе группы ATP на иммуногенность (для анализов иммунологической памяти и бустер-ответа) или группы ATP на безопасность (для анализа персистенции). Они включали следующее: оценка иммунологической памяти для MenC и бустер-ответа для Hib и Tetanus (до и спустя один месяц после введения 1/5 дозы плановой полисахаридной вакцины): определение геометрического среднего титров и концентраций (GMT и GMC) при 95% доверительных интервалах (95% ДИ); определение процента субъектов с титром/концентрацией антител предложенных выше предельных значений с точностью 95% ДИ (показатели серопозитивной реакции/серопрофилактики); исследование титров/концентрации антител после вакцинации с использованием обратных кумулятивных кривых; компьютерный анализ стандартизованных асимптотических 95% ДИ для разности показателя серопозитивной реакции/серопрофилактики между группой первичной иммунизации (группы K, L, M и N) и невакцинированной группой (группа О); определение геометрического среднего индивидуального отношения титра SBA-MenC к концентрации анти-PSC при 95% ДИ; определение 95% ДИ для отношения GMT/C после вакцинации между группами K, L, M и контрольной группой N для анти-PRP и анти-Tetanus и между каждой из групп первичной иммунизации Группа K: субъекты, первично иммунизированные MenC10-TT + Infanrix. hexa; Группа L: субъекты,первично иммунизированные Hib10-MenC10-TT + Infanrix. penta; Группа M: субъекты, первично иммунизированные Hib5-MenC5-TT + Infanrix. penta; Группа N: субъекты, первично иммунизированные Meningitec + Infanrix. hexa; Группа О: контрольные субъекты (т.е. субъекты, не вакцинированные конъюгатной вакциной MenC).N: число субъектов с доступными результатами. Более высокие титры антител против MenC и более высокие титры SBA были достигнуты в резуль- 12012214 тате первичной иммунизации конъюгатными вакцинами на основе полисахарида MenC большего размера (группы K, L и M) по сравнению с олигосахаридной конъюгатной вакциной Meningitec. Таблица 2 Отношение геометрического среднего титра SBA MenC/концентрации анти-PSC Во всех четырех группах первичной иммунизации (группы K, L, M и N) GMR значимо повышалось от момента до ревакцинации до момента после ревакцинации, что указывает на наличие созревания и функциональности антител. GMR в группе M (первичной иммунизации Hib5-MenC5-TT) было выше, чем в группе N (первичной иммунизации Meningitec). Таблица 3 Персистенция в возрасте 12-15 месяцев непосредственно перед введением бустер-вакцинN: число субъектов с доступными результатами. Более высокие титры SBA против MenC были достигнуты в результате первичной иммунизацииMenC большего размера (группы К, L и M) по сравнению с первичной иммунизацией конъюгатом MenCолигосахарид Meningitec. Иммунологическая память (группа ATP на иммуногенность). Введение 1/5 дозы плановой полисахаридной вакцины ACWY вызвало очень высокий титр SBAMenC во всех четырех группах первичной иммунизации, где 98,7-100% и 97,5-100% субъектов, подвергнутых первичной иммунизации в режиме вакцины-кандидата, проявляли титры 1:8 и 1:128, соответственно. В группе, подвергнутой первичной иммунизации в режиме Meningitec, была тенденция к более низкому проценту субъектов с титрами 1:128 (91,8%). В сравнении, 17,6% невакцинированных субъектов имели титры SBA MenC 1:8 и 1:128. Пример 4. Фаза II клинического исследования конъюгатной вакцины HibMenAC-TT, смешанной сDTPw-HepB. Схема исследования: открытое рандомизированное (1:1:1:1:1) одноцентровое исследование с использованием пяти групп. Указанные пять групп получали следующий режим вакцинации, соответственно, в возрасте 6, 10 и 14 недель:Tritanrix.-HepB/Hib-MenAC, 2,5 мкг/2,5 мкг/2,5 мкг: здесь ссылаются как на 2,5/2,5/2,5;Tritanrix.-HepB/Hib-MenAC, 2,5 мкг/5 мкг/5 мкг: здесь ссылаются как на 2,5/5/5;Tritanrix.-HepB/Hib-MenAC 5 мкг/5 мкг/5 мкг: здесь ссылаются как на 5/5/5;Tritanrix.-HepB + Hiberix.: здесь ссылаются как на Hiberix;Tritanrix.-HepB/Hiberix. + Meningitec: здесь ссылаются как на Meningitec. Образцы крови брали в момент получения первой дозы вакцины (до) и через месяц после получения третьей дозы вакцины (после дозы 3).Tritanrix представляет собой вакцину DTPw, продаваемую GlaxoSmithKline Biologicals S.A. 105 субъектов использовали в каждой из пяти групп с получением суммарно 525 субъектов в исследовании. Таблица 4 Содержание вакцинных препаратов GSK Вакцина 2,5/2,5/2,5 представляла собой разведение дозы вакцины GSK Biologicals' Hib-MenAC 5/5/5, содержащее 2,5 мкг каждого из PRP-TT, MenA-ТТ и MenC-ТТ. Вакцинные препараты Hib-MenAC смешивали сразу перед применением с Tritanrix-HepB. Комбинированная вакцина GSK Biologicals' дифтерия - столбняк - цельноклеточные Bordetella pertussis - гепатит В (DTPw-HB) (Tritanrix-НерВ) содержит не менее чем 30 Международных Единиц (ME) дифтерийного анатоксина, не менее чем 60 ME столбнячного анатоксина, не менее чем 4 ME убитых Bordetella pertussis и 10 мкг рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В. Базовая терапия, доза, режим введения,партии. Режим вакцинации/место введения: одна группа получала вакцину Tritanrix.-HepB внутримышечно в область левого бедра и Hiberix внутримышечно в область правого бедра в возрасте 6, 10 и 14 недель. Другая группа получала вакцину Tritanrix-HepB/Hiberix внутримышечно в область левого бедра и вакцину Meningitec внутримышечно в область правого бедра в возрасте 6, 10 и 14 недель. Вакцина/состав/доза/номер партии: используемая вакцина Tritanrix-НерВ является такой, как описано выше. Одна доза (0,5 мл) конъюгатной вакцины GSK Biologicals' Haemophilus influenzae тип b: Hiberix содержала 10 мкг PRP, конъюгированного со столбнячным анатоксином. В группе Hiberix ее смешивали со стерильным разбавителем, а в группе Meningitec ее смешивали с Tritanrix-HepB. Одна доза (0,5 мл) вакцины Wyeth Lederle's MENINGITEC содержала 10 мкг капсульного олигосахарида менингококка группы С, конъюгированного с 15 мкг белка Corynebacterium diphtheria CRM197,и алюминий в виде солей. Результаты - иммунные ответы, полученные против Hib, MenA и MenC Таблица 5 а Анти-PRP (мкг/мл) Вывод. Сравнение результатов иммуногенности, достигнутой с использованием конъюгатной вакцины олигосахарид MenC-CRM197 и трех препаратов GSK, которые содержали конъюгаты полисахаридов MenAТТ и MenC-ТТ, показало, что конъюгаты полисахаридов Men были способны вызывать хороший иммунный ответ, подобный ответу, достигнутому с использованием конъюгатной олигосахаридной вакциныMeningitec. Все тестируемые препараты давали ответ на MenC у 100% пациентов. Пример 5. Фаза II клинического исследования введения Hib MenCY одновременно с Infanrix penta в соответствии с 2-, 3- и 4-месячным режимом. Схема исследования: фаза II, открытое (частично двойное слепое) рандомизированное контролируемое многоцентровое исследование с использованием 5 групп, получающих режим первичной иммунизации тремя дозами вакцин следующим образом: Группа Hib-MenCY 2,5/5/5: Hib-MenCY (2,5/5/5 ) + Infanrix penta Группа Hib-MenCY 5/10/10: Hib-MenCY (5/10/10) + Infanrix penta Группа Hib-MenCY 5/5/5: Hib-MenCY (5/5/5) + Infanrix penta Группа Hib-MenC: Hib-MenC (5/5) + Infanrix penta Группа Menjugate: Menjugate + Infanrix hexa (контроль).Hib-MenCY 2,5/5/5, Hib-MenCY 5/10/10 и Hib-MenC вводили двойным слепым методом, тогда как группа Hib-MenCY 5/5/5 и группа Menjugate были открытыми. Препараты 2,5/5/5, 5/10/10 и 5/5/5 HibMenCY содержат нативные полисахариды MenC и полисахариды MenY, которые являются микрофлюидизированными.Menjugate содержит 10 мкг олигосахаридов MenC, конъюгированных с 12,5-25 мкг CRM197, на дозу и изготавливается Chiron. Вакцинация в возрасте +/- 2, 3, 4 месяца (исследование в месяц 0, месяц 1 и месяц 2) и образцы крови (3,5 мл) от всех субъектов до и через месяц после первичной вакцинации (исследование в месяц 0 и месяц 3). Исследуемая вакцина, доза, режим введения,партии. Три дозы инъецировали внутримышечно через интервалы в один месяц в возрасте примерно 2, 3 и 4 месяца, как описано ниже: Таблица 6 Вводимые вакцины (исследование и контроль), группа, режим/место и доза- 15012214 Иммуногенность. Измерение титров/концентраций антител против каждого антигена вакцины. Перед получением первой дозы (месяц 0) и примерно через месяц после получения третьей дозы(месяц 3) у всех субъектов на SBA-MenC и SBA-MenY, анти-PSC и анти-PSY, анти-PRP, анти-Т, антиFHA, анти-PRN и анти-РТ. Использовали сывороточную бактерицидную активность N. meningitidis серогрупп C и Y (предельные значения SBA-MenC и SBA-MenY: 1:8 и 1:128); анализы ELISA с предельными значениями: 0,3 мкг/мл и 2 мкг/мл для антител против полисахаридов N. meningitidis серогруппC и Y (анти-PSC IgG и анти-PSY IgG); 0,15 мкг/мл и 1,0 мкг/мл для полисахарида Hib полирибозилрибитолфосфата (анти-PRP IgG); 5EL.U/мл для анти-FHA, анти-PRN, анти-РТ; 0,1 МЕ/мл для антител против столбнячного анатоксина (анти-TT). Только через месяц после получения третьей дозы (месяц 3) у всех субъектов на анти-D, анти-HBs и анти-Polio 1, 2 и 3. Использовали анализы ELISA с предельными значениями: 0,1 МЕ/мл на антитела против дифтерии (анти-D); 10 мМЕ/мл на антитела против гепатита В (анти-HBs); и предельное значение в тесте микронейтрализации: 1:8 для анти-Polio типа 1, 2 и 3 (антиPolio 1,2 и 3). Статистические методы. Показатели серопрофилактики/серопозитивной реакции и геометрические средние концентраций/титров (GMC/GMT) при 95% доверительных интервалах (95% ДИ) оценивали на группу для SBAMenC, анти-PSC, SBA-MenY, анти-PSY, анти-PRP, анти-Tetanus, анти-РТ, анти-FHA и анти-PRN перед вакцинацией и через месяц после вакцинации; для анти-Diphtheria, анти-HBs, анти-Polio 1, анти-Polio 2 и анти-Polio 3 через месяц после вакцинации. Ответ на вакцину (появление антител у субъектов, исходно серонегативных, или по меньшей мере сохранение концентраций антител у субъектов, исходно серопозитивных) при 95% ДИ для анти-РТ, анти-PRN и анти-FHA также оценивали через месяц после вакцинации. Обратные кумулятивные кривые для каждого антитела на месяц 3 также представлены. Различия между группами Hib-MenCY и Hib-MenC по сравнению с контрольной группой Menjugate оценивали исследовательским способом для каждого антитела, за исключением SBA-MenY и анти-PSY в отношении (1) различия между группой Menjugate (минус) группы Hib-MenCY и Hib-MenC в отношении процента субъектов выше указанных предельных значений или с ответом на вакцину при их стандартизованных асимптотических 95% ДИ, (2) отношений GMC или GMT группы Menjugate по сравнению с группами Hib-MenCY и Hib-MenC при их 95% ДИ. Такие же сравнения проводили для оценки различия между каждой парой препаратов Hib-MenCY для антител анти-PRP, SBA-MenC, анти-PSC, SBA-MenY,анти-PSY и анти-ТТ. Показатели серопрофилактики/серопозитивной реакции и GMC/T (группа ATP на иммуногенность). Таблица 7 а Анти-PRP (мкг/мл)GMC/T: геометрическое среднее концентраций/титров 95% ДИ = 95% доверительный интервал; НП = нижний предел; ВП = верхний предел Вывод. Конъюгаты полисахаридов MenC и Y давали хороший иммунный ответ у всех субъектов, причем 100% субъектов давали ответы выше 0,3 мкг/мл против MenC и MenY. Пример 6. Фаза II сравнительного клинического исследования трех препаратов MenACWY-TT с олигосахаридной конъюгатной вакциной Meningitec MenC-CRM197. В данном примере приведены результаты открытого (частично слепого), рандомизированного, с контролируемым интервалом дозировки исследования фазы II по оценке иммуногенности трех различных препаратов вакцины GlaxoSmithKline Biological's, представляющей собой конъюгат менингококка серогрупп A, С, W-135, Y со столбнячным анатоксином (MenACWY-TT), в сравнении с вакциной, представляющей собой конъюгат олигосахарид MenC -CRM197 (Meningitec), при введении в виде однократной дозы детям в возрасте 12-14 месяцев. Клиническое исследование представляло собой открытое (частично двойное слепое), контролируемое многоцентровое исследование, в котором подходящих субъектов 12-14 месяцев рандомизировали(1:1:1:1) в одну из четырех параллельных групп по 50 субъектов, получающих однократную дозу первичной иммунизации при визите 1, как описано ниже. Форма 1 Т: MenACWY-TT в дозе 2,5 мкг полисахарида MenA, конъюгированного со столбнячным анатоксином (TT), 2,5 мкг полисахарида MenC, конъюгированного с TT, 2,5 мкг полисахарида MenW,конъюгированного с TT, и 2,5 мкг полисахарида MenY, конъюгированного с TT. Форма 2 Т: MenACWY-TT в дозе 5 мкг полисахарида MenA, конъюгированного с TT, 5 мкг полисахарида MenC, конъюгированного с TT, 5 мкг полисахарида MenW, конъюгированного с TT, и 5 мкг полисахарида MenY, конъюгированного с TT. Форма 3 Т: MenACWY-TT в дозе 2,5 мкг полисахарида MenA, конъюгированного с TT, 10 мкг полисахарида MenC, конъюгированного с TT, 2,5 мкг полисахарида MenW, конъюгированного с TT, и 2,5 мкг полисахарида MenY, конъюгированного с TT. Контроль T: 10 мкг олигосахарида MenC, конъюгированного с 12,5-25 мкг CRM197(Meningitec). Три различных препарата MenACWY-TT вводили двойным слепым методом.- 17012214 Режим вакцинации/место введения: однократную дозу вакцины вводили внутримышечно в левую дельтовидную мышцу при визите 1 (месяц исследования 0) в соответствии с рандомизированным распределением. Все вакцины-кандидаты поставляли в виде лиофилизированной гранулы во флаконе с однократной дозой (0,5 мл после разведения поставляемым разбавителем, представляющим собой физиологический раствор). Иммуногенность: измерение титров/концентраций антител против антигенных компонентов менингококковой вакцины в образцах крови, полученных перед введением дозы исследуемой вакцины (месяц 0) и примерно через месяц после введения дозы исследуемой вакцины (месяц 1) у всех субъектов. Определение бактерицидных титров антител против N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y (SBA-MenA,SBA-MenC, SBA-MenW и SBA-MenY) с помощью бактерицидного теста (предельные значения анализа: разведение 1:8 и 1:128) и измерения посредством ELISA антител против N. meningitidis серогрупп А, С,W-135 и Y (анти-PSA, анти-PSC, анти-PSW и анти-PSY, предельные значения анализа 0,3 мкг/мл и 2 мкг/мл) и столбнячного анатоксина (анти-Tetanus, предельные значения анализа 0,1 МЕ/мл). Результаты. Ответ в виде антител, выраженный как процент имеющих ответ на SBA-MenA, SBA-MenC, SBAMenW и SBA-MenY через месяц после вакцинации (первичный критерий оценки), показан в табл. 8. Ответ определяют как более высокий или равный 4-кратному повышению числа серопозитивных субъектов или сероконверсии для серонегативных субъектов до вакцинации. Таблица 8 Ответы на вакцину для SBA антитела через месяц после вакцинации В табл. 9 показано число субъектов, у которых титры SBA достигают значения выше точек предельных значений 1:8 и 1:128, а также GMT. Таблица 9 Показатели серопозитивной реакции и GMT для SBA антител через месяц после вакцинации Вакцинация всеми тремя препаратами полисахаридного конъюгата ACWY-TT привела к хорошимSBA ответам против MenA, MenC, MenW и MenY при 95-100% субъектов с титрами выше чем 1:8. В частности, препараты полисахаридных конъюгатов 5/5/5/5 и 2,5/10/2,5/2,5 давали более высокий ответ против MenC, чем олигосахаридная вакцина Meningitic, что видно на основании более высокой доли субъектов, имеющих титр выше 1:128, и значения GMT.- 18012214 Таблица 10 Показатели серопозитивной реакции и GMC для антиполисахаридных антител через месяц после вакцинации Все три препарата полисахаридной конъюгатной вакцины ACWY-TT дали хорошие иммунные ответы против MenA, MenC, MenW и MenY при 93% и 100% субъектов, у которых титры достигали значений выше чем 0,3 мкг/мл. Высокие значения GMC были достигнуты при использовании препаратов 5/5/5/5 и 2,5/10/2,5/2,5 полисахаридной конъюгатной вакцины ACWY-TT по сравнению с Meningitec. Пример 7. Сравнение иммуногенности конъюгатов нативных и сортированных по размеру полисахаридов MenY. Мыши (самки DBA/2 6-8 недель) получали две инъекции с интервалом 2 недели PSY-TT подкожным путем. Образцы крови брали через 14 суток после второй инъекции для проведения ELISA и SBA на анти-PSY, используя линию S1975 MenY. Ha инъекцию мыши получали 1 мкг PSY-TT (лиофилизированный препарат без адъювантов). Использовали конъюгаты, описанные в таблице 11. Таблица 11 Результаты. Результаты (фиг. А, В) показывают тенденцию к более высокой иммуногенности для конъюгатов,полученных с использованием сортированных по размеру PSY. На фиг. А показаны результаты GMC,полученные в анализе ELISA на антисыворотки, полученные против конъюгатов, изготовленных из нативного MenY (ENYTT012), микрофлюидизированного MenY - 40 циклов (ENYTT014) и микрофлюидизированного MenY - 20 циклов (ENYTT015 бис). Более высокие GMC были получены, когда MenY-TT готовили из микрофлюидизированного MenY. Подобные результаты были получены, когда антисыворотки оценивали путем анализа SBA(фиг. В). Снова более высокие значения GMT были достигнуты при использовании конъюгатов, изготовленных из микрофлюидизированного MenY. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Иммуногенная композиция, содержащая капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной из серогрупп А, С, W135 и Y, содержащая капсульный полисахарид N. meningitidis серогруппы С, имеющий средний размер выше 75 кДа, конъюгированные с белком-носителем с получением конъюгата капсульного полисахарида N. meningitidis, где средний размер каждого полисахарида N. meningitidis выше 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа. 2. Иммуногенная композиция по п.1, содержащая капсульные полисахариды N. meningitidis по меньшей мере одной из серогрупп А, С, W135 и Y, конъюгированные с белком-носителем с образованием конъюгатов N. meningitidis, где каждый полисахарид N. meningitidis либо представляет собой нативный полисахарид, либо сортирован по размеру с коэффициентом не более чем 10. 3. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, где каждый капсульный полисахарид N. meningitidis представляет собой нативный полисахарид. 4. Иммуногенная композиция по любому из пп.1 или 2, где по меньшей мере один капсульный полисахарид N. meningitidis сортирован по размеру путем микрофлюидизации. 5. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, где каждый капсульный полисахарид N. meningitidis- 19012214 сортирован по размеру с коэффициентом не более чем 10. 6. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, где конъюгаты N. meningitidis получены из смеси нативных полисахаридов и полисахаридов, которые сортированы по размеру с коэффициентом не более чем 10. 7. Иммуногенная композиция по п.6, где капсульные полисахариды серогруппы Y сортированы по размеру с коэффициентом не более чем 10. 8. Иммуногенная композиция по п.6 или 7, где капсульные полисахариды серогрупп А и С являются нативными, а полисахариды серогрупп W135 и Y сортированы по размеру с коэффициентом не более чем 10. 9. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-8, где средний размер каждого капсульного полисахарида N. meningitidis составляет между 50 и 300 кДа или 50 и 200 кДа. 10. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-9, содержащая капсульный полисахарид MenA,имеющий средний размер выше 50, 75, 100 кДа или средний размер между 50-100, либо 55-90, либо 6080 кДа. 11. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-10, содержащая капсульный полисахарид MenC,имеющий средний размер выше 100 кДа или между 100-200, 100-150, 80-120, 90-110, 150-200, 120-240,140-220, 160-200 или 190-200 кДа. 12. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-11, содержащая капсульный полисахарид MenY,имеющий средний размер выше 50, 75, 100 кДа или между 60-190, либо 70-180, либо 80-170, либо 90160, либо 100-150, 110-145 или 120-140 кДа. 13. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-12, содержащая капсульный полисахарид MenW,имеющий средний размер выше 50, 75, 100 кДа или между 60-190, либо 70-180, либо 80-170, либо 90160, либо 100-150, 140-180, 150-170 или 110-140 кДа. 14. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-13, где каждый капсульный полисахарид N. meningitidis конъюгирован с белком-носителем, независимо выбранным из группы, состоящей из столбнячного анатоксина (TT), дифтерийного анатоксина (DT), CRM197, С-фрагмента TT и белка D. 15. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-14, где каждый капсульный полисахарид N. meningitidis конъюгирован с одним и тем же белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из TT, DT,CRM197, C-фрагмента TT и белка D. 16. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-15, дополнительно содержащая капсульный сахарид H. influenzae b, конъюгированный с белком-носителем. 17. Иммуногенная композиция по п.16, где капсульный сахарид H. influenzae b конъюгирован с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из TT, DT, CRM197, С-фрагмента TT и белка D. 18. Иммуногенная композиция по любому из пп.16, 17, содержащая сахаридный конъюгат Hib и по меньшей мере два других бактериальных сахаридных конъюгата, где конъюгат Hib присутствует в более низкой дозе, чем средняя доза указанных двух других бактериальных сахаридных конъюгатов. 19. Иммуногенная композиция по п.18, где конъюгат Hib присутствует в более низкой дозе, чем доза каждого из указанных по меньшей мере двух других бактериальных сахаридных конъюгатов. 20. Иммуногенная композиция по любому из пп.16-19, где один и тот же белок-носитель используют в конъюгате Hib и двух или более чем двух из указанных по меньшей мере двух других бактериальных сахаридных конъюгатов. 21. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-20, содержащая препарат везикул наружной мембраны или капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы В. 22. Вакцина, содержащая иммуногенную композицию по любому из пп.1-21 и фармацевтически приемлемый носитель. 23. Вакцинный набор для одновременного или последовательного введения, содержащий две поливалентные иммуногенные композиции для создания защиты в организме хозяина против заболевания,вызванного Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae иNeisseria meningitidis, где указанный набор включает первый контейнер, содержащий столбнячный анатоксин (TT), дифтерийный анатоксин (DT) и цельноклеточные или бесклеточные коклюшные компоненты, и второй контейнер, содержащий иммуногенную композицию по любому из пп.1-21. 24. Способ изготовления вакцины по п.22, включающий стадию смешивания иммуногенной композиции по любому из пп.1-21 с фармацевтически приемлемым носителем. 25. Способ иммунизации человека-хозяина против заболевания, вызванного инфекцией Neisseriameningitidis, включающий введение указанному хозяину иммунопротективной дозы иммуногенной композиции или вакцины по пп.1-23. 26. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-21 в лечении или предупреждении заболевания, вызванного инфекцией Neisseria meningitidis. 27. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-21 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызванных инфекцией Neisseria meningitidis.