Набор для анализа обратной транскриптазы и его применение

1 Настоящее изобретение относится к набору для анализа обратной транскриптазы (ОТ) для анализа активности ОТ в биологических образцах. Изобретение также относится к применению набора для анализа ОТ для качественного и количественного анализа активности ОТ в биологическом образце, возможно с последующей оценкой статуса расстройства или заболевания, связанного с активностью ОТ, на основании результата анализа активности ОТ. Предпосылки изобретения Обратная транскриптаза (ОТ) является ключевым ферментом, ответственным за синтез ДНК с вирусной РНК, для всех ретровирусов,включая вирус иммунодефицита человекаet al. - 83). В этот процесс вовлечены три различные ферментативные активности: синтез первой нити ДНК, деградация нити вирусной РНК в ДНК/РНК-гибриде и синтез второй нити ДНК (для обзора см. Goff). Ретровирусы могут существовать либо в экзогенной или в эндогенной форме, либо в обеих формах. Главное различие состоит в том,что эндогенный ретровирус проник в зародышевую линию и, следовательно, его ДНК присутствует во всех клетках организма, в противоположность экзогенному ретровирусу, который способен проникать только в клетки с подходящим рецептором для данного специфичного вируса. Эндогенные ретровирусы (endogenousretroviruses, ERV) у людей называют HERV. Интегрированная провирусная форма эндогенного ретровируса имеет такую же фундаментальную структуру, как форма экзогенного ретровируса. Считают, что интеграция некоторыхHERV в зародышевую линию произошла от 35 до 45 миллионов лет назад. Эти ретровирусные последовательности составляют 1% генома млекопитающих и, следовательно, также генома человека. Таким образом, они присутствуют во всех клетках человека и наследуются в соответствии с обычными законами Менделя. В человеческом геноме присутствует множество семейств HERV. Число копий HERV на гаплоидный геном человека варьирует между одной копией и тысячами копий для различных семейств. Самая высокая консервативность нуклеотидной последовательности обнаружена в гене poI. Этот признак использовали для того,чтобы установить взаимосвязь между семействами HERV. Хотя многие HERV и их открытые рамки считывания (ORF) являются дефектными,в нескольких типах тканей обнаружены транскрипты мРНК из большинства семейств HERV(обзор приведен в Wilkinson et al. 1994, LeibMsch and Seifarth 1996). Кроме того, вирионные частицы с активностью полимеразы и протеазы наблюдали в нормальных человеческих плацентах, ооцитах, тератокарциномах, тканях карциномы молочной железы и в слюнных железах некоторых аутоиммунных пациентов (об 004880and Murphy 1996, Tonjes et al., 1997). Стрессовые состояния, подобные гипоксии и УФоблучению, также могут индуцировать экспрессию HERV, как наблюдали для инфекционных ретровирусов (обзор приведен Duvic 1995). Несколько HERV были локализованы в точечных разрывах хромосомы в пределах геномаHERV, локализованных в различных хромосомных сайтах, может вызывать геномные перестройки, включая транслокации, инсерции, дупликации и делеции. Такие рекомбинационные события ответственны за генерирование геномной нестабильности, которая является важным признаком эволюции. Кроме того, для многих опухолей характерны специфичные геномные перестройки, которые, как считают, играют ключевую роль в образовании опухолей. Эта взаимосвязь между присутствием инфекционных ретровирусов и развитием опухолей у хозяина позволяет предположить, что HERV связаны с раком. Вирионные частицы и антигены,относящиеся к ретровирусам, часто обнаруживают в первичных образцах опухолей также в отсутствие инфекционных вирусов (Weiss 1984,Faff et al., 1992). Кроме того, антитела, направленные на ретровирусные белки, были обнаружены в сыворотках пациентов, больных раком(Weiss 1984). Более того, обнаружено, что последовательности HERV являются высоко экспрессирующими в определенных клеточных линиях опухолевого происхождения (обзор приведен в Lower et al. 1996). Эндогенные провирусы могут также рекомбинировать с экзогенными вариантами(Martinelli et al. 1990). Новые рекомбинанты получают измененный фенотип. Это может вносить вклад в быструю эволюцию новых инфекционных ретровирусов. Главным образом подвергается воздействию ген env, поскольку мутации в других участках могут быть разрушительными и несовместимыми с образованием частицы. Обнаружено, что некоторые ретровирусные штаммы являются симбиотическими у одного вида и патогенными у другого. Эти открытия указывают на сложную проблему при ксенотрансплантациях. Симбиотические ERV, предоставляемые трансплантированными тканями,могут быть патогенными у нового хозяина. Они могут обладать способностью взаимодействовать с рецепторами клеточной поверхности, необходимыми для ретровирусного слияния, присутствующими на клетках нового хозяина. Кроме того, в пределах генома реципиента ткани может происходить рекомбинация с эндогенными ретровирусными последовательностями и создавать новые инфекционные ретровирусы,которые могут распространяться в популяции. Как эндогенные, так и экзогенные ретровирусы могут вносить вклад в вертикальную и горизон 3 тальную передачу генетического материала в пределах вида и между видами и обеспечивать механизмы для эволюции новых патогенных агентов. Обнаружено, что как инфекционные ретровирусы, так и ERV проявляют иммунорегуляторные функции (обзор приведен в Krieg et al. 1992). Эти эффекты изучены главным образом у мышей, но имеются некоторые наблюдения,которые подтверждают существование подобных механизмов для HERV. Если последовательности HERV могут нарушать регуляцию иммунного ответа, они могут вызывать аутоиммунные заболевания. Эти эффекты могут либо прямо модулироваться белками HERV, либо косвенно посредством воздействия на экспрессию молекул, вовлеченных в иммунный ответ. Белки HERV могут быть экспонированы на клеточной поверхности. Потеря аутотолерантности по отношению к этим белковым последовательностям может вызывать аутоиммунные реакции против клеток, представляющих эти белки. Антитела, продуцируемые вслед за ретровирусной инфекцией, могут перекрестно реагировать с белками, кодируемыми HERV, и быть ответственными за потерю толерантности. Этот феномен наблюдали у трансгенных мышей (Zinkernagel et al. 1990). Кроме того, потерю толерантности к env-белкам, кодируемым ERV, наблюдали у мышей, у которых спонтанно развивался аутоиммунный гломерулонефрит (обзор приведен в Krieg et al. 1990 и 1992). Некоторые наблюдения на людях могут подтвердить существование перекрестно-реактивных антител между эндогенными и экзогенными ретровирусными белками. Антитела против ретровирусных белков обнаружены в сыворотках аутоиммунных пациентов (обзор приведен в Krieg et al. 1992,Urnovitz and Murphy 1996). В некоторых случаях было обнаружено, что сыворотки реагировали также с экзогенными ретровирусами. Ретровирусные инфекции были связаны с началом аутоиммунных заболеваний (обзор приведен вKrieg et al. 1990 и 1992). Кроме того, инфекционные ретровирусные белки проявляют частичное сходство с аутоантигенами, которые являются частыми мишенями для аутоантител (обзор приведен в Krieg et al. 1992). Они могут запускать аутоиммунные ответы, направленные на такие мишени, механизм, называемый молекулярной мимикрией. Однако сходства белковHERV с известными аутоантигенами еще не обнаружено. Анализы на активность ОТ стали общепринятыми методиками обнаружения и количественного определения ретровирусов в клеточных культурах. Вместе с анализами на антиген р 24 их используют в качестве подтверждающих тестов для выделения ВИЧ (Jackson - 88, Gupta 87). ОТ также представляет собой одну из главных мишеней при попытке найти эффективные антивирусные агенты против ВИЧ. Общеприня 004880 4 тый анализ активности ОТ проводят, используя анализ растворимого фермента с применением искусственной конструкции матрица - праймер и меченного тритием дезоксинуклеотидтрифосфата в качестве нуклеотидного субстрата (Baltimore - 71, Lee et al. - 87). Эта прежняя система была основана на обнаружении включения радиоактивности в РНК/ДНК-гибриды, осаждаемые трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Применение испускающих бета-излучение нуклеотидов требует использования сцинтилляционных жидкостей для обнаружения радиоактивности,что часто приводит в результате к плохому воспроизведению вследствие проблем гашения. Этот способ является относительно трудоемким,и его нелегко адаптировать к широкомасштабному скринингу большого числа образцов. Он также является весьма чувствительным к воздействиям мешающих факторов в образцах. В течение последнего десятилетия интенсивного исследования на ВИЧ анализ ОТ усовершенствовался путем использования различных методик. Введение субстрата, меченого I125,привело к повышенной чувствительности и исключило гашение и использование сцинтилляционных жидкостей (Neumuller et al. - 90). Введение матриц или праймеров, сшитых с твердыми фазами, упростило разделение между субстратом и продуктом, исключило необходимость осаждения ТХУ и привело к анализу ОТ в одной пробирке (Gronowitz et al. - 90, ЕР 0447442 В 1). В последнее время использование радиоактивности в качестве метки в анализе ОТ исключено благодаря использованию модифицированных нуклеотидных оснований, содержащих либо антигенные эпитопы, либо структуры с высоким сродством к желаемым лигандам. Наличие этих эпитопов или структур во вновь синтезированном РНК/ДНК-гибриде затем используют для связывания антител или лигандов,конъюгированных, например, с ферментами иммуноферментного твердофазного анализа(ELISA, enzyme-linked immunosorbent analysis). Количество связанных ферментов ELISA затем определяют во вторичном ферментативном анализе.Porstmann et al. 1991 использовали 5 бромдезоксиуридинтрифосфат (BrdU) в качестве нуклеотидного субстрата в анализе ОТ. Количество включенного BrdUMP определяют на второй стадии в иммунологическом анализе,используя моноклональные анти-ВrdUантитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой.Eberle и R. Seibl 1992 измеряли включение дУТФ (дезоксиуридинтрифосфата), меченного дигоксигенином, во вновь синтезированную ДНК вместо радиоактивно меченного дТТФ(дезокситимидинтрифосфата). Чтобы иметь возможность осуществить отделение не включенных нуклеотидов от вновь синтезированной 5 ДНК, в реакционную смесь добавляют также дУТФ, меченный биотином. После обратной транскрипции вновь синтезированную дважды меченую ДНК иммобилизуют на лунках ELISA,покрытых стрептавидином, и оценивают фотометрическим способом путем связывания антидигоксигенин-антител, конъюгированных с пероксидазой. Эта методика составила основу набора для анализа ОТ, который имеется в продаже от Boehringer Mannheim.Urabe et al. 1994 разработали нерадиоактивный анализ ОТ, основанный на включении биотин-дУТФ в иммобилизованную конструкцию odT/prA. Количество включенного нуклеотидного субстрата измеряют фотометрическим способом после добавления щелочной фосфатазы, конъюгированной со стрептавидином. Ближайший аналог для настоящего изобретения разработали Ekstrand et al. 1996. В данном анализе полирибоадениловая кислота (поли(rА,ковалентно связанная с лунками 96-луночного титрационного микропланшета, служит в качестве матрицы для включения ВrdУМФ во время стадии обратной транскрипции. Количество ВrdУМФ, включенного в ДНК, затем определяют иммунологически согласно методике, подобной использованной Portsmann et al. 1991. Этот способ доступен в виде наборов для определения ОТ от Cavidi Tech, Uppsala, Sweden. Другим принципом для определения активности ОТ, разработанным для продажи NEN(New England Nuclear, USA), является использование специфичных для последовательности зондов для обнаружения вновь синтезированной кДНК. В этой ферментативной реакции используют гетерополимерную молекулу РНК с олигонуклеотидным праймером из 20 оснований,комплементарным последовательностям РНК вблизи 5'-конца. Полная нить кДНК продуцируется во время реакции обратной транскрипции. После гидролиза РНК-матрицы кДНК гибридизуют с двумя различными олигонуклеотидными зондами, зондом захвата и зондом обнаружения. Зонд захвата используют для связывания кДНК с лункой микропланшета. Зонд обнаружения конъюгируют с пероксидазой хрена, которая после отмывки для удаления неиспользованного нуклеотидного субстрата и свободных зондов дает цветную реакцию. Чувствительность обнаружения в этом последнем типе анализа можно повысить путем полимеразной цепной реакции амплификации кДНК, продуцируемой реакцией ОТ. После этого амплифицированную ДНК можно обнаружить различными типами меченых зондов (Silver 93, Heneine 1995, US5817457, US5849494). Для некоторых применений изучения активности ОТ в биологических образцах желательным является использование анализа ОТ,дающего количественные результаты. Такие применения включают в себя мониторинг заболевания или расстройства, в котором нужно 6 сравнивать результаты анализа ОТ из измерений, сделанных в различные промежутки времени, и диагностику заболеваний или расстройств, где уровень активности ОТ по сравнению со стандартными уровнями показывает,находится ли пациент в группе риска или действительно страдает рассматриваемым заболеванием или расстройством. В некоторых случаях желательно использовать анализ, который является чувствительным, насколько возможно, то есть обладает способностью измерять настолько малые количества активности ОТ, насколько возможно, в биологических образцах, так чтобы наличие и величину активности ОТ можно было соотнести с расстройствами и заболеваниями на ранней стадии. Описание изобретения В настоящем изобретении предложен анализ ОТ, который является простым в использовании для целей скрининга и который является очень чувствительным к активности ОТ. Более конкретно, настоящее изобретение относится к набору для анализа обратной транскриптазы (ОТ), который включает в себя одну или несколько упаковок, содержащих связанную(ые) с твердой фазой матрицу (матрицы),представляющую(ие) собой полирибоадениловую кислоту (рrА) и/или полидезоксиадениловую кислоту (pdA), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт твердой фазы на основе полистирола со связывающим раствором,содержащим 1-метилимидазол и рrА и/или pdA,с последующими инкубацией, промывкой буфером для отмывания, высушиванием и упаковкой. Этот набор содержит также адаптированные к типу ОТ отдельно упакованные компоненты анализа, выбранные из группы, состоящей из смеси, или взятых по отдельности, буфера, рН 7-8, иона двухвалентного металла, хелатирующего агента, полиамина, ингибитора РНКазы, восстанавливающего агента, соли, стабилизирующего агента и детергента, а также из смеси, или взятых по отдельности, лиофилизированного дезоксинуклеотидтрифосфата, праймера, защитного агента и концентрированного буфера для отмывания; а также письменные инструкции по применению этого набора для анализа. Возможно, этот набор содержит лиофилизированный эталонный фермент (ферменты). Возможно, этот набор дополнительно содержит компоненты системы обнаружения, содержащей лиофилизированное моноклональное анти-BrdU-антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой, буфер для субстрата щелочной фосфатазы и субстрат щелочной фосфатазы, такой как таблетки п-НФФ (паранитрофенилфосфата). В предпочтительном воплощении набора для анализа ОТ согласно настоящему изобретению упакованная(ые) связанная(ые) с твердой фазой матрица (матрицы) представляет(ют) со 7 бой связанную(ые) с титрационным микропланшетом матрицу (матрицы), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт каждой лунки планшета с аликвотой связывающего раствора, который содержит 100 мМ 1 метилимидазола, рН 5-7, и 0,5-2 мг/мл рrА и/или pdA, с последующими инкубацией при температуре 10-60 С в течение 0,5-10 ч и промывкой каждой лунки для удаления 1 метилимидазола буфером для отмывания, который содержит бис-трис-пропан, рН 5-7, с последующими высушиванием и упаковкой планшетов. В особенно предпочтительном воплощении набора для анализа ОТ согласно настоящему изобретению упакованная(ые) связанная(ые) с титрационным микропланшетом матрица(матрицы), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт в каждой лунки планшета со 100 мкл связывающего раствора, который содержит 100 мМ 1-метилимидазола, рН 6,25, и 1 мг/мл рrА и/или pdA, с последующими инкубацией при комнатной температуре в течение 2 ч, промывкой каждой лунки 2x300 мкл буфера для отмывания, который содержит 10 мМ бистрис-пропана, рН 6,25, высушиванием планшетов при 37 С в течение 25 мин и помещением этих планшетов в пакеты из фольги и вакуумным запаиванием этих пакетов. В еще одном воплощении набора для анализа ОТ согласно настоящему изобретению компоненты анализа выбраны из группы, состоящей из буферов Трис и Hepes, рН 7-8, ионов двухвалентных металлов Мg2+ и Мn2+, хелатирующих агентов этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и этиленгликоль-бис(-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тeтpayкcycнoй кислоты (ЭГТА) и полиаминов спермина и спермидина, ингибиторов РНКазы гепаринсульфата и декстрансульфата, восстанавливающих агентов дитиотреитола (ДТТ), дитиоэритритола (ДТЭ) и глутатиона, солей NaCl и KCl, стабилизирующих агентов сыворотки новорожденных телят(СНТ) и бычьего сывороточного альбумина БСА, детергентов Твин 20 и Тритон Х-100, дезоксинуклеотидтрифосфата BrdUTP, праймера олиго dT или олиго dN, где N представляет собой иной аналог Т, чем U, и защитных агентов АТФ, ГТФ и ЦТФ. Настоящее изобретение также относится к применению набора для анализа согласно настоящему изобретению для качественного и количественного анализа активности ОТ в биологическом образце, например в биологическом образце, который выбран из клеточных экстрактов и биологических жидкостей, таких как плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость,синовиальная жидкость и плевральная жидкость. 8 В предпочтительном воплощении вслед за применением согласно настоящему изобретению следует оценка статуса расстройства или заболевания, связанных с активностью ОТ, на основании результата анализа активности ОТ. Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано ссылкой на графические материалы и более подробным описанием воплощений, но эти воплощения не следует рассматривать как ограничивающие объем защиты, определенный в прилагаемой формуле изобретения. Краткое описание графических материалов Фиг.1. Активность ОТ определяли в среде из культуры клеточной линии РК 15 двумя способами. Полученные значения поглощения наносили на график против количества среды, добавленной к реакционной смеси. Фиг.2. Прямое определение ОТ в образцах синовиальной жидкости, отобранных у пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Нанесенные на график значения получили из 1 мкл образцов и реакции ОТ в течение ночи. Фиг.3. Активность ОТ определяли в экстракте из раковой опухоли молочной железы двумя способами. Полученные значения поглощения наносили на график против количества экстракта, добавленного к реакционной смеси. Фиг.4. Прямое определение ОТ в экстрактах из биопсий раковой опухоли молочной железы. Значения поглощения, нанесенные на график против концентрации белка в каждом образце, получили из 1 мкл экстракта и реакции ОТ в течение ночи. Фиг.5. Активность ОТ в А) среде культуры клеток, трансформированных HTLV1, и Б) среде из культуры, инфицированной BLV, определяли двумя способами. Полученные значения поглощения наносили на график против количества образца, добавленного к реакционной смеси. Фиг.6. Прямое определение активности ОТ в сыворотке от макак, инфицированных SIV. Значения поглощения, полученные в 4-часовом анализе ОТ, наносили на график против суток взятия образца сыворотки. Подробное описание воплощений изобретения Набор для анализа ОТ по настоящему изобретению содержит три различных типа компонентов, а именно 1) Матрицу, состоящую из полирибоадениловой кислоты (рrА) или полидезоксиадениловой кислоты (pdA), присоединенную к твердой фазе. 2) Реакционные смеси, которые дают возможность ферментам полимеризовать новую нить ДНК праймер-зависимым способом, используя присоединенный матричный полинуклеотид. 3) Компоненты системы обнаружения для иммунологического обнаружения синтезированной in vitro нити ДНК. 1) Матрица, связанная с твердой фазой. 9 Разработан способ, посредством которого рrА или pdA можно присоединить к определенным типам титрационных микропланшетов методом, который дает возможность полинуклеотидам служить в качестве матриц для праймерзависимого включения дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТФ) вирусными и клеточными РНК- и ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами(обратными транскриптазами, ОТ). Показано,что способ работает на двух имеющихся в продаже титрационных микропланшетах,CovalLink и NucleoLink от Nalge Nunc International. Титрационные микропланшеты, связанные с рrА, используемые для наборов для анализа согласно настоящему изобретению, получают из полос от NucleoLink. Методика и буферы описаны в табл. 1. Механизм связывания неизвестен, так как методика не соответствует способам, рекомендуемым или предложенным изготовителем или подробно описанным в литературе. В возможный механизм реакции вовлечены реактивные группы, введенные в процессе производства, но иные, чем те, которые трансплантированы для известного и рекомендуемого применения данной конкретной поверхности. Ожидают, что подобные результаты будут получены с другими титрационными микропланшетами на основе полистирола из других коммерческих источников. Способ химической активации полистирола для получения поверхности со свойствами, равными свойствам планшетов CovalLink, опубликован(Zammatteo et al. - 96). Некоторые другие способы присоединения полинуклеотидов к пластиковым поверхностям также опубликованыMusso - 87). 2) Реакционные смеси, адаптированные к типу ОТ. Общие условия для получения включения нуклеотида РНК- и ДНК-зависимыми ДНКполимеразами в растворимых системах с использованием очищенных ферментов, являются простыми и хорошо известными. Они включают в себя буфер, поддерживающий рН около 7,5,ион двухвалентного металла, Мg2+ или иногда Мn2+, соль для регулирования ионной силы, для некоторых ферментов восстанавливающий агент и немного детергента. В условиях этого простого реакционного буфера ферменты будут обладать способностью к утилизации добавленной матрицы, праймера и дезоксинуклеотидтрифосфатов для синтеза нити ДНК. Эта общая концепция не учитывает различия в оптимальных или особенно адаптированных условиях реакции, которые являются необходимыми, между различными классами или типами обратных транскриптаз. Другим важным аспектом является желаемая способность реакционной смеси выдерживать добавление необработанных биологических жидкостей или клеточных экс 004880 10 трактов в качестве источника ферментативной активности ОТ. Систематическое тестирование при использовании как неочищенных образцов, таких как супернатанты клеточных культур, так и очищенных ферментов позволило выявить другие компоненты реакции, которые использовали для создания реакционных смесей, оптимизированных или особенно адаптированных для конкретных обратных транскриптаз. Табл. 2 содержит список компонентов, используемых для составления реакционных смесей, адаптированных к индивидуальному типу ОТ. Составы типичных реакционных смесей представлены в табл. 3. Способ анализа обратной транскриптазы по настоящему изобретению осуществляют, как описано ниже. На первой стадии анализа в каждую лунку prA-связанного титрационного микропланшета добавляют 100 мкл реакционной смеси с последующей преинкубацией при 33 С в течение 20-60 мин. Затем образец, содержащий обратную транскриптазу, добавляют в 50 мкл буфера с получением конечного объема анализа 150 мкл, а затем титрационный микропланшет инкубируют при 33 С. Каждый образец добавляют в два экземпляра титрационных микропланшетов, что дает возможность проведения двух периодов анализа, стандартизированных для 3 ч и в течение ночи, что означает 16-20 ч. Постадийная методика приведена в письменных инструкциях или в руководстве для пользователя, включенных в каждый набор. Он содержит предложения или инструкции о том,как адаптировать общие компоненты анализа обратной транскриптазы для некоторых или для всех из следующих применений: 1) количественный анализ активности ОТ; 2) скрининг активности ОТ в клеточных экстрактах, клеточных супернатантах и/или биологических жидкостях, включая, но не ограничиваясь ими, плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, синовиальную жидкость и плевральную жидкость; 3) определение антитела, блокирующего активность ОТ; 4) определение значений IC50 веществ, ингибирующих активность ОТ. Используя эти реакционные смеси и матрицы, связанные с твердой фазой, авторы изобретения разработали заявленные анализы, которые либо являются более чувствительными при прямых измерениях активности ОТ, чем другие ранее описанные анализы на основе матриц, связанных с твердой фазой, либо дают возможность обнаружения ранее неизвестных активностей обратных транскриптаз. 3. Иммунологическое обнаружение нити ДНК, синтезированной in vitro. Полимераза в образце синтезирует нить ДНК, используя бромдезоксиуридинтрифосфат 11 Включенный BrdUMP обнаруживают с помощью моноклонального антитела, связывающего BrdU, конъюгированного со щелочной фосфатазой. Активность щелочной фосфатазы связанного антитела затем определяют количественно путем добавления раствора субстрата,содержащего паранитрофенилфосфат, п-НФФ. Раствор субстрата становится желтым, когда пНФФ расщепляется щелочной фосфатазой. Оптическую плотность (OD) измеряют в стандартном аппарате для считывания планшетов дляELISA при длине волны 405 нм. Значение OD,скорректированное по отношению к фону, пропорционально активности ОТ в образце. Стадию обнаружения осуществляют, как описано ниже. Постадийная методика приведена в письменных инструкциях или в руководстве для пользователя, включенных в каждый набор. Составы буферных растворов приведены в табл. 4. После анализа обратной транскриптазы титрационный микропланшет отмывают, либо используя одну из имеющихся в продаже отмывок для планшетов ELISA, либо с помощью серийного погружения планшета в сосуды с буфером для отмывания. Конъюгированное антитело возможно предлагается в наборе в лиофилизированной форме. После растворения 1%-ным тритоном X-100 в дважды дистиллированной воде 100 мкл раствора антитела добавляют в каждую лунку, и титрационный микропланшет инкубируют при 33 С в течение 90 мин. Чтобы удалить избыток антитела, планшет последовательно отмывают тем же способом второй раз. Раствор субстрата готовят из буфера и таблеток п-НФФ, возможно предложенных в наборе. Затем измеряют значения OD через соответствующие интервалы времени. Линейная зависимость между количеством связанного фермента щелочной фосфатазы и концентрацией продукта желтого цвета нарушается при высоких значениях OD. Измеряя OD через различные промежутки времени, возможно получить действительные значения, то есть значения OD в пределах линейного диапазона считывания конкретного инструмента, для образцов как с высокими, так и с низкими количествами продукта, образованного во время стадии анализа обратной транскриптазы. Эталонные ферменты ОТ, возможно включенные в некоторые, но не во все наборы, калибруют для получения кривых титрования с действительными значениями OD, когда OD измеряют через 30 мин, 2 ч и 16-20 ч, то есть в течение ночи. Усовершенствованные показатели, полученные с использованием наборов для анализа ОТ по настоящему изобретению, продемонстрированы в табл. 5. Кривые титрования ОТ HIV1 получили с использованием ранее известного набора ОТ Lenti от Cavidi Tech AB и с использованием набора для анализа по настоящему изобретению. Значения OD можно нанести на 12 график против концентрации фермента ОТ и подогнать до прямой линии, используя метод наименьших квадратов. Значения k в табл. 6 представляют собой отклонения от вычисленных прямых линий и являются мерой чувствительности анализа. Можно видеть, что наборы для анализа по настоящему изобретению имеют значения k, которые на порядок выше. В практическом отношении это означает действительные измерения от образцов, содержащих значительно более низкую концентрацию обратной транскриптазы HIV-1 и/или экономию времени. Более короткие периоды времени анализа обратной транскриптазы и/или более короткие периоды времени считывания щелочной фосфатазы означают более короткое время оборота для пользователей наборов по настоящему изобретению. Типичные компоненты набора по настоящему изобретениюA. Два 96-луночных титрационных микропланшета с присоединенными рrА и/или pdA. Б. Буфер для разведения образца и реакционный буфер, содержащий адаптированную к типу ОТ смесь компонентов I-IX, список которых приведен в табл. 2.B. Лиофилизированные компоненты реакции Х-ХII, смешанные или поставляемые в отдельных флаконах. Г. Лиофилизированный эталонный фермент либо рекомбинантных, очищенных природных, либо вирусных частиц. Д. Концентрированный буфер для отмывания. Е. Лиофилизированное моноклональное анти-ВrdU-антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой, обозначенное RT ProductTracer (индикатор продукта ОТ). Ж. Буфер для субстрата щелочной фосфатазы и таблетки п-НФФ. 3. Письменные инструкции или Руководство. Примеры Пример 1. Усовершенствованное обнаружение ОТ PERV (эндогенного ретровируса свиньи, porcine endogenous retrovirus) в клеточных супернатантах. Известно, что линия клеток свиньи РK-15(свиные почки) постоянно продуцирует малые количества PERV. Делали серийные разведения супернатантов из культуры клеток РК-15. Тестировали способность анализа ОТ С-типа отCavidi Tech AB и Мn2+-анализа по настоящему изобретению обнаруживать активность ОТ при каждом разведении. Данные, представленные на фиг.1, получены в результате анализа ОТ в течение ночи. Набор для анализа по настоящему изобретению демонстрирует чувствительность, увеличенную приблизительно в 25 раз по сравнению с одним из анализов предшествующего уровня техники. Было невозможно использовать боль 13 шее количество образца, чтобы компенсировать различие в чувствительности обнаружения, поскольку анализ С-типа допускал повышенные уровни фона и отклонения от линейности со временем и/или количеством образца при более высоких концентрациях супернатанта (2 мкл/лунку). Набор для анализа по настоящему изобретению можно использовать в исследованиях,рассматривающих возможный перенос экзогенного ретровируса и/или активацию эндогенного ретровируса в связи с ксенотрансплантацией. Пример 2. Прямое измерение обратной транскриптазы в синовиальных жидкостях. Недавние эксперименты по гибридизации ДНК позволили предположить взаимосвязь между некоторыми ревматическими расстройствами и присутствием последовательностей,связанных с ретровирусами. Замороженные образцы синовиальных жидкостей от пациентов с ревматоидным артритом получили с кафедры Ревматологии Karolinska sjukhuset, Stockholm,Sweden. Эти образцы очищали от клеток и дебриса путем низкоскоростного центрифугирования перед замораживанием. Образцы оттаивали,делали серийные разведения и исследовали на активность ОТ. Полученные активности пересчитывали наOD405/ч. На фиг.2 представлены активности ОТ,обнаруженные при использовании 1 мкл образца и ферментативной реакции в течение ночи в анализе ОТ по настоящему изобретению в синовиальной жидкости. Ни в одном из образцов,исследованных с помощью анализа ОТ Lenti или анализа ОТ С-типа от Cavidi Tech AB, не было обнаружено активности ОТ. Пример 3. Обнаружение активности ОТ в экстрактах из раковой опухоли молочной железы человека. В этиологию рака молочной железы человека вовлечен экзогенный или эндогенный человеческий аналог MMTV (вирус опухоли молочной железы мыши, mouse mammary tumorvirus). Используя ОТ рекомбинантного MMTV для оптимизации условий анализа, можно обнаружить активность ОТ в экстрактах из раковой опухоли молочной железы без предварительного концентрирования или очистки. Замороженные экстракты из раковой опухоли молочной железы получили с кафедры онкологии Academiska sjuhuset, Uppsala, Sweden. Опухолевую ткань гомогенизировали и суспендировали в стандартном буфере (рН 7,4). Супернатанты собирали после очистки путем низкоскоростного центрифугирования. Образцы оттаивали, делали серийные разведения и исследовали на наличие активности ОТ в Мg2+-анализе ОТ по настоящему изобретению и в анализе ОТ Lenti или анализе ОТ С-типа от Cavidi Tech AB. На фиг. 3 показан репрезентативный пример результатов, полученных с использованием реакции ОТ в течение ночи, объединенной с 2 004880 14 часовой реакцией со щелочной фосфатазой(АР). Различие в чувствительности обнаружения между Мg2+-анализом ОТ по настоящему изобретению и анализом ОТ Lenti или анализом ОТ С-типа от Cavidi Tech AB составляло примерно в 400 раз. Никакой активности не обнаружили в анализе ОТ С-типа от Cavidi Tech AB. На фиг.4 проиллюстрирована разновидность активностей ОТ, обнаруженных с помощью Мg2+-анализа ОТ в опухолевых экстрактах от различных пациентов. Набор для анализа по настоящему изобретению можно использовать в исследованиях,рассматривающих возможную роль экзогенных или эндогенных ретровирусов в этиологии рака молочной железы, а также его можно использовать для диагностических целей. Пример 4. Обнаружение вирусов, подобных HTLV (вирус лейкемии Т-клеток человека,human T-cells leukemia virus), в супернатантах из клеточных культур. У некоторых индивидуумов, инфицированных HTLV, продолжается развитие онкологических или миелопатических расстройств. В некоторых частях Японии и Южной Азии впервые описано заболевание, связанное с Тклеточной лейкемией взрослых. Неврологическое расстройство, тропический спастический парапарез, впервые описано у пациентов из района Карибского бассейна. Способы, способные обнаружить контакт с вирусом и/или продолжительное присутствие низких уровней вирусной активности, являются желательными. Близкородственный бычий вирус, вирус лейкемии быков (BLV, bovine leukemia virus),представляет собой патоген у коров, имеющий значительные экономические последствия для молочной и скотоводческой промышленности.BLV также использовали для оптимизации анализа на BLV/HTLV-активности ОТ. На фиг.5 А проиллюстрировано различие в чувствительности обнаружения между набором для анализа по настоящему изобретению и Lenti анализом ОТ от Cavidi Tech AB. Делали серийные разведения супернатантов клеточных культур из клеточной линии МТ-2, трансформированной HTLV-1, и использовали два анализа ОТ для определения количества активности ОТ в каждом образце. Использованное время реакции ОТ составляло время в течение ночи (14 ч). На фиг. 5 Б показаны соответствующие данные из серии разведения супернатантов из клеток FLK-BLV. (Эта клеточная линия хронически инфицирована BLV). Общее увеличение чувствительности обнаружения составило приблизительно в 25 раз для фермента HTLV и в 30 раз для ферментаBLV, соответственно. Повышение чувствительности было существенным для получения значимого сигнала от супернатанта клеток МТ-2. 15 Пример 5. Прямое определение активности ОТ в неочищенной сыворотке от макак, инфицированных SIV. Количественное определение активности ОТ можно использовать для обнаружения вирусной репликации в течение острой лентивирусной инфекции. Активность ОТ в сыворотке впоследствии подавляется продуцированием антитела, ингибирующего ОТ. Группу из четырех макак cynomolgus (Macaca fascicularis), подвергнутых клиническим исследованиям в качестве необработанных контролей, инфицировали десятью инфекционными для обезьян дозами (MID50) SIVsm. Образцы сыворотки, отобранные через указанные промежутки времени после инфицирования, серийно разводили и анализировали на активность ОТ, используя Lenti анализ ОТ по настоящему изобретению. Пять мкл образца сыворотки включали в четырехчасовую реакцию ОТ, и полученные значения поглощения пересчитывали на ОD405/ч и наносили на график против суток после инфицирования, см. фиг.6.Lenti анализ ОТ по настоящему изобретению является достаточно чувствительным для обнаружения вирусной репликации путем анализа образцов сыворотки, отобранных в течение острой стадии инфекции. Тесты, используемые в настоящее время для скрининга на положительный анализ ВИЧ среди людей-доноров крови, основаны на обнаружении антител, направленных на белки HIV-1, и не способны обнаружить инфицированных лиц в течение острой стадии инфекции. В некоторых странах эти тесты дополнены обнаружением вирусного антигена с помощью ELISA или вирусного генома с помощью ПЦР. Оба типа тестов могут оказаться неспособными обнаружить отклоняющиеся формы вирусных штаммов вследствие большой генетической и иммунологической вариабельности среди вирусов ВИЧ. ОТ обладает необходимой функцией для репликации всех ретровирусов, и настоящий анализ предлагает привлекательную альтернативу для обнаружения острых инфекций. Добавить 100 мкл связывающего раствора в каждую лунку. Инкубировать планшеты при комнатной температуре в течение 2 ч. Отмыть каждую лунку 2x300 мкл буфера для отмывания. Высушить планшеты при 37 С в течение 25 мин. Поместить планшеты в пакеты из фольги и запаять их под вакуумом. Хранить при -20 С. Компоненты в оптимизированном Мg2+анализе обратной транскриптазы по настоящему изобретению Компоненты в анализе обратной транскриптазы синовиальной жидкости по настоящему изобретениюVirus-induced autoantibody response to a transgenic viral antigen. Nature 345: 68-71. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Набор для анализа обратной транскриптазы (ОТ), включающий в себя одну или несколько упаковок, содержащих связанную(ые) с твердой фазой матрицу (матрицы), представляющую(ие) собой полирибоадениловую кислоту (рrА) и/или полидезоксиадениловую кислоту(pdA), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт твердой фазы на основе полистирола со связывающим раствором, содержащим 1 метилимидазол и рrА и/или pdA, с последующими инкубацией, промывкой буфером для отмывания, высушиванием и упаковкой; адаптированные к типу ОТ отдельно упакованные компоненты анализа, выбранные из группы,состоящей из смеси или взятых по отдельности буфера, рН 7-8, иона двухвалентного металла,хелатирующего агента, полиамина, ингибитора РНКазы, восстанавливающего агента, соли, стабилизирующего агента и детергента, а также из смеси или взятых по отдельности лиофилизированного дезоксинуклеотидтрифосфата, праймера, защитного агента и концентрированного буфера для отмывания; а также, возможно, лиофилизированный эталонный фермент (ферменты) и, возможно, компоненты системы обнаружения, содержащей лиофилизированное моноклональное антибромдезоксиуридинтрифосфат(анти-BrdU) антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой, буфер для субстрата щелочной фосфатазы и субстрат щелочной фосфатазы, а также письменные инструкции по применению этого набора для анализа. 2. Набор для анализа ОТ по п.1, где упакованная(ые) связанная(ые) с твердой фазой матрица (матрицы) представляет(ют) собой связан 23 ную(ые) с титрационным микропланшетом матрицу (матрицы), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт каждой лунки планшета с аликвотой связывающего раствора, который содержит 100 мМ 1-метилимидазола, рН 5-7, и 0,5-2 мг/мл рrА и/или pdA, с последующими инкубацией при температуре 10-60 С в течение 0,5-10 ч и промывкой каждой лунки для удаления 1-метилимидазола буфером для отмывания,который содержит бис-трис-пропан, рН 5-7, с последующими высушиванием и упаковкой планшетов. 3. Набор для анализа ОТ по п.2, где упакованная(ые) связанная(ые) с титрационным микропланшетом матрица (матрицы) представляет собой матрицу (матрицы), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт каждой лунки планшета со 100 мкл связывающего раствора, который содержит 100 мМ 1-метилимидазола, рН 6,25, и 1 мг/мл рrА и/или pdA, с последующими инкубацией при комнатной температуре в течение 2 ч, промывкой каждой лунки 2x300 мкл буфера для отмывания, который содержит 10 мМ бис-трис-пропана,рН 6,25, высушиванием планшетов при 37 С в течение 25 мин и помещением этих планшетов в пакеты из фольги и вакуумным запаиванием этих пакетов. 4. Набор для анализа ОТ по любому из пп.1-3, где компоненты анализа выбраны из группы, состоящей из буферов Трис и Hepes,pH7-8, ионов двухвалентных металлов Мg2+ и Мn2+, хелатирующих агентов этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и этиленгликольбис(-аминоэтиловый эфир)-N,N,N,'N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА) и полиаминов спермина и спермидина, ингибиторов РНКазы гепаринсульфата и декстрансульфата, восстанавливающих агентов дитиотреитола (ДТТ), дитиоэритритола (ДТЭ) и глутатиона, солей NaCl иKCl, стабилизирующих агентов сыворотки новорожденных телят (СНТ) и бычьего сывороточного альбумина (БСА), детергентов Твин 20 и Тритон Х-100, дезоксинуклеотидтрифосфата(агентов) АТФ, ГТФ и ЦТФ. 5. Применение набора для анализа по любому из пп.1-4 для качественного и количественного анализа активности ОТ в биологическом образце. 6. Применение по п.5, где биологический образец выбран из биологических жидкостей и клеточных экстрактов. 7. Применение по п.6, где биологическая жидкость выбрана из плазмы, сыворотки, спинно-мозговой жидкости, синовиальной жидкости и плевральной жидкости. 8. Применение по любому из пп.5-7 с последующей оценкой статуса расстройства или заболевания, связанного с активностью ОТ, на основании результата анализа активности ОТ.