Противоопухолевые комбинации

007530 Изобретение относится к применению комбинаций ингибитора mTOR (например, сложного рапамицинового 42-эфира с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой (CCI-779 и противоопухолевого алкилирующего агента для лечения новообразований; к применению ингибитора mTOR и противоопухолевого алкилирующего агента для получения лекарственного средства для лечения новообразований; к продукту, включающему ингибитор mTOR и противоопухолевый алкилирующий агент в качестве комбинированного средства для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении новообразования; а также к фармацевтической композиции, включающей ингибиторmTOR, противоопухолевый алкилирующий агент и фармацевтически приемлемый носитель. Предпосылки изобретения Рапамицин представляет собой макроциклический триеновый антибиотик, продуцируемый Streptomyces hygroscopicus, который, как установлено, обладает противогрибковой активностью, в частности,против Candida albicans, как in vitro, так и in vivo [С. Vezina et al., J. Antibiot. 28, 721 (1975); S.N. Sehgal etal., J. Antibiot. 28, 727 (1975); H.A. Baker et al., J. Antibiot. 31, 539 (1978); патент США 3929992 и патент США 3993749]. Кроме того, рапамицин, применяемый отдельно (патент США 4885171) либо в комбинации с пицибанилом (picibanil) (патент США 4401653), проявляет противоопухолевую активность. Иммуносупрессорное действие рапамицина описано в FASEB 3, 3411 (1989). Циклоспорин А и FK506, другие макроциклические молекулы, также оказались эффективными в качестве иммуносупрессорных агентов, которые могут быть использованы для предотвращения отторжения трансплантата [FASEB 3, 3411 (1989); FASEB 3, 5256 (1989); R.Y. Calne et al., Lancet 1183 (1978); и патент США 5100899]. R.Martel et al. [Can. J. Physiol. Pharmacol. 55, 48 [(1977)] описывают эффективность рапамицина на экспериментальной модели аллергического энцефаломиелита, модели рассеянного склероза; модели адъювантного артрита, модели ревматоидного артрита; а также его эффективность по ингибированию образования IgE-подобных антител. Рапамицин может быть также использован для профилактики или лечения системной красной волчанки [патент США 5078999], воспаления легких [патент США 5080899], инсулинзависимого сахарного диабета [патент США 5321009], поражений кожи, таких как псориаз [патент США 5286730], поражений кишечника [патент США 5286731], пролиферации клеток гладкой мускулатуры и утолщения интимы вследствие повреждения сосудов [патенты США 5288711 и 5516781], лейкемии/лимфомы Т-клеток у взрослых [заявка на европейский патент 525960 А 1], глазных воспалений [патент США 5387589], злокачественных карцином [патент США 5206018], панкардита [патент США 5496832] и анемии [патент США 5561138]. Сложный рапамициновый 42-эфир с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой(CCI-779) представляет собой сложный эфир рапамицина, проявляющий существенное ингибирующее действие на рост опухолей на моделях как in vitro, так и in vivo. Получение и применение эфиров гидроксикислоты рапамицина, включая CCI-779, описаны в патенте США 5362718.CCI-779 обладает цитостатическими свойствами, в противоположность цитотоксическим свойствам, и может отсрочить время развития или рецидива опухолей. Считается, что CCI-779 имеет механизм действия, подобный механизму действия сиролимуса (sirolimus). CCI-779 связывается с цитоплазматическим белком FKBP и образует с ним комплекс, ингибирующий фермент, mTOR (мишень рапамицина у млекопитающих, также известная как FKBP12-рапамицин ассоциированный белок [FRAP]). Ингибирование активности киназы mTOR ингибирует различные пути трансдукции сигнала, включая цитокинстимулированную пролиферацию клеток, трансляцию мРНК для нескольких ключевых белков, регулирующих фазу G1 клеточного цикла, и IL-2-индуцированную транскрипцию, ведущую к ингибированию развития клеточного цикла от G1 до S. Механизм действия CCI-779, приводящий к блоку фазы Gl S, является новым для противоракового лекарственного средства. Было установлено, что in vitro CCI-779 ингибирует рост ряда гистологически различных опухолевых клеток. Наиболее чувствительными к CCI-779 заболеваниями являются рак центральной нервной системы (ЦНС), лейкоз (Т-клеток), рак молочной железы, рак предстательной железы и линии меланомы. Соединение останавливает развитие клеток в фазе G1 клеточного цикла. Исследования голых мышей in vivo показали, что CCI-779 проявляет активность против опухолевых ксенотрансплантатов человека различных гистологических видов. Особенно чувствительными кCCI-779 оказались глиомы, поскольку соединение проявило активность на ортотопической модели глиомы у голых мышей. CCI-779 заметно подавляет (индуцируемую тромбоцитами) стимуляцию фактора роста клеточной линии глиобластомы человека in vitro. CCI-779 также ингибирует рост некоторых опухолей поджелудочной железы человека у голых мышей, равно как и одной из двух линий рака молочной железы, исследованных in vivo. Описание изобретения Данное изобретение предусматривает применение комбинаций производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента в противоопухолевой комбинаторной химиотерапии. В частности,такие комбинации могут быть использованы для лечения рака мягких тканей или рака ободочной кишки. Данное изобретение также охватывает комбинации производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента для использования в противоопухолевой комбинаторной химиотерапии, при этом-1 007530 используемое количество производного рапамицина или противоопухолевого алкилирующего агента,или обоих препаратов равно субтерапевтически эффективным дозам. В соответствии с другим аспектом данное изобретение предусматривает применение комбинаций производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента для получения лекарственного средства для лечения новообразований. В соответствии с дальнейшим аспектом данное изобретение охватывает продукт, включающий производное рапамицина и противоопухолевый алкилирующий агент в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения новообразования у млекопитающего. В соответствии со следующим аспектом данное изобретение охватывает фармацевтическую композицию, включающую производное рапамицина и противоопухолевый алкилирующий агент и фармацевтически приемлемый носитель. В соответствии с данным изобретением термин лечение означает лечение млекопитающего,имеющего опухолевое заболевание, путем введения указанному млекопитающему эффективного количества комбинации производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента с целью ингибирования роста опухоли у такого млекопитающего, ликвидации опухоли или достижения паллиативного эффекта у млекопитающего. В соответствии с данным изобретением термин введение относительно введения комбинации означает либо введение непосредственной комбинации, либо введение пропрепарата, производного или аналога одного или обоих компонентов комбинации, обеспечивающее наличие эффективного количества комбинации в организме. В соответствии с настоящим изобретением термин рапамицин означает класс иммуносупрессорных соединений, содержащих основное ядро рапамицина (показано ниже). Рапамицины в соответствии с данным изобретением включают соединения, которые могут быть химически или биологически модифицированы как производные ядра рапамицина, сохраняя при этом иммуносупрессорные свойства. Соответственно, термин рапамицин включает сложные эфиры, простые эфиры, оксимы, гидразоны и гидроксиламины рапамицина, а также рапамицины, в которых функциональные группы ядра рапамицина подверглись модификации, например, в результате восстановления или окисления. Термин рапамицин также включает фармацевтически приемлемые соли рапамицинов, способные образовывать такие соли благодаря наличию кислотного или основного остатка. Предпочтительно, чтобы сложные и простые эфиры рапамицина включали гидроксильные группы в положении 42 и/или 31 ядра Вторичное козий антикроличий конъюгат (Santa Cruz Cat антитело: IgG-HRP sc-2004) Способы:A. Получение клеточных лизатов Клеточные линии выращивают в оптимальной базальной среде, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и пенициллином/трептомицином. С целью исследования фосфорилирования клетки пересевают в 6-луночные планшеты. После полного прикрепления клеток их выращивают на минимальном количестве сыворотки. Обработка ингибиторами mTOR продолжается от 2 до 16 ч. После обработки лекарственным средством клетки промывают один раз, PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР) без Мg и Са), а затем лизируют в 150-200 мкл буфера для образца LDS на лунку. Лизаты подвергают краткому воздействию ультразвука, а затем центрифугированию в течение 15 мин при 14000 об./мин. До использования лизаты хранят при температуре -80 С. Процедура теста также может включать инкубирование клеток в среде для выращивания в течение ночи после их полного прикрепления. Результаты, получаемые при обоих наборах условий, должны быть одинаковыми для ингибитора mTOR.B. Вестерн-блот анализ 1) Получают образцы, состоящие из одного белка, помещая 22,5 мкл лизата в одну пробирку, а затем добавляя 2,5 мкл восстанавливающего агента для образца NuPAGE. Нагревают образцы до 70 С в течение 10 мин. Осуществляют электрофорез, используя гели NuPAGE и буферы NuPAGE SDS. 2) Переносят гель на нитроцеллюлозную мембрану с гибридизационным буфером NuPAGE. Мем-2 007530 брану блокируют в течение часа блокирующим буфером (забуференный Tris физиологический раствор с 0,1% Tween и 0,5% обезжиренного молока). Промывают мембраны 2 х буфером для промывания (забуференный Tris физиологический раствор с 0,1% Tween). 3) Блот/мембрану инкубируют с первичным антителом Р-р 70 S6K (Т 389) (1:1000) в блокирующем буфере в течение ночи при температуре 4 С на вращающейся платформе. 4) Каждый блот промывают 3 х в течение 10 мин в буфере для промывания и инкубируют со вторичным антителом (1:2000) в блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. 5) После связывания вторичного антитела каждый блот промывают 3 х в течение 10 мин буфером для промывания и 2 х в течение 1 мин забуференным Tris физиологическим раствором с последующим хемилюминесцентным (ECL) анализом и проявлением на пленках для хемилюминесценции. В соответствии с настоящим изобретением термин рапамицин означает класс иммуносупрессорных соединений, содержащих основное ядро рапамицина (показано ниже). Рапамицины в соответствии с данным изобретением включают соединения, которые могут быть химически или биологически модифицированы как производные ядра рапамицина, сохраняя при этом иммуносупрессорные свойства. Соответственно, термин рапамицин включает сложные эфиры, простые эфиры, оксимы, гидразоны и гидроксиламины рапамицина, а также рапамицины, в которых функциональные группы ядра рапамицина подверглись модификации, например, в результате восстановления или окисления. Термин рапамицин также включает фармацевтически приемлемые соли рапамицинов, способные образовывать такие соли благодаря наличию кислотного или основного остатка. Предпочтительно, чтобы сложные и простые эфиры рапамицина включали гидроксильные группы в положении 42 и/или 31 ядра рапамицина, сложные и простые эфиры - гидроксильную группу в положении 27 (после химического восстановления кетона 27), а оксимы, гидразоны и гидроксиламины - кетон в положении 42 (после окисления гидроксильной группы 42) и кетон 27 ядра рапамицина. Предпочтительные простые и сложные эфиры 42 и 31 описаны в следующих патентах, приводимых здесь в качестве ссылки: сложные алкиловые эфиры (патент США 4316885); сложные аминоалкиловые эфиры (патент США 4650803); сложные фторированные эфиры (патент США 5100883); сложные амидные эфиры (патент США 5118677); сложные эфиры карбамата (патент США 5118678); сложные силиловые эфиры (патент США 5120842); сложные аминоэфиры (патент США 5130307); ацетали (патент США 551413); сложные аминодиэфиры (патент США 5162333); сложные эфиры сульфоната и сульфата (патент США 5177203); сложные эфиры (патент США 5221670); сложные алкоксиэфиры (патент США 5233036); сложные эфиры O-арила, -алкила, -алкенила и алкинила (патент США 5258389); сложные эфиры карбоната (патент США 5260300); карбаматы арилкарбонила и алкоксикарбонила (патент США 5262423); карбаматы (патент США 5302584); сложные гидроксиэфиры (патент США 5362718); блокированные сложные эфиры (патент США 5385908); сложные гетероциклические эфиры (патент США 5385909); гемдизамещенные сложные эфиры (патент США 5385910); сложные эфиры аминоалкановой кислоты (патент США 5389639); сложные эфиры фосфорилкарбамата (патент США 5391730); сложные эфиры карбамата(патент США 5411967); сложные эфиры карбамата (патент США 5434260); сложные эфиры амидинокарбамата (патент США 5463048); сложные эфиры карбамата (патент США 5480988); сложные эфиры карбамата (патент США 5480989); сложные эфиры карбамата (патент США 5489680); блокированные сложные эфиры N-оксида (патент США 5491231); сложные эфиры биотина (патент США 5504091); сложные эфиры O-алкила (патент США 5665772) и сложные эфиры ПЭГ рапамицина (патент США 5780462). Получение данных сложных и простых эфиров описано в вышеуказанных патентах. Предпочтительные сложные и простые 27-эфиры рапамицина описаны в патенте США 5256790,приведенном здесь в качестве ссылки. Получение данных сложных и простых эфиров описано в вышеуказанных патентах. Предпочтительные оксимы, гидразоны и гидроксиламины рапамицина описаны в патентах США 5373014, 5378836, 5023264 и 5563145, приводимых здесь в качестве ссылки. Получение данных оксимов,гидразонов и гидроксиламинов описано в вышеуказанных патентах. Получение 42-оксорапамицина опи-3 007530 сано в патенте 5023263, приводимом здесь в качестве ссылки. Особенно предпочтительные рапамицины включают рапамицин [патент США 3929992], CCI-779[сложный 42-эфир рапамицина с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой; патент США 5362718] и 42-O-(2-гидрокси)этилрапамицин [патент США 5665772]. При необходимости фармацевтически приемлемые соли рапамицина могут быть получены из органических и неорганических кислот, например, уксусная, пропионовая, молочная, лимонная, винная, янтарная, фумаровая, малеиновая, малоновая, миндальная, яблочная, фталевая, соляная, бромистоводородная, фосфорная, азотная, серная, метансульфоновая, нафталинсульфоновая, бензолсульфоновая,толуолсульфоновая, камфорсульфоновая кислота и подобные известные приемлемые кислоты в случае,когда рапамицин содержит подходящий основный остаток. Соли могут быть также получены из органических и неорганических оснований, таких как соли щелочных металлов (например, натрия, лития или калия), соли щелочно-земельных металлов, соли аммония, соли алкиламмония, содержащие 1-6 атомов углерода, или соли диалкиламмония, содержащие 1-6 атомов углерода в каждой алкилгруппе, а также соли триалкиламмония, содержащие 1-6 атомов углерода в каждой алкилгруппе в случае, если рапамицин содержит подходящий кислотный остаток. Ингибитор mTOR, который может быть использован в противоопухолевых комбинациях в соответствии с данным изобретением, предпочтительно представляет собой рапамицин, более предпочтительно,ингибитор mTOR представляет собой рапамицин, CCI-779 или 42-O-(2-гидрокси)этилрапамицин. Согласно приведенному описанию CCI-779 подвергали испытаниям в качестве характерного ингибитора mTOR в ингибиторе mTOR плюс антиметаболические комбинации в соответствии с данным изобретением. Получение CCI-779 описано в патенте США 5362718, приводимом здесь в качестве ссылки. При использовании CCI-779 в качестве противоопухолевого средства предполагается, что первоначальная доза для внутривенной инъекции составляет приблизительно 0,1-100 мг/м 2 при ежедневной схеме введения (ежедневно в течение 5 дней, каждые 2-3 недели), и приблизительно 0,1-1000 мг/м 2 при введении один раз в неделю. Предпочтительными способами введения являются пероральный или внутривенный,при этом более предпочтительным является внутривенный путь. В соответствии с данным изобретением термин противоопухолевый алкилирующий агент означает вещество, вступающее во взаимодействие (или реакцию алкилирования) со многими обогащенными электронами атомами в клетках с образованием ковалентных связей. Наиболее важными реакциями относительно их противоопухолевой активности являются реакции с основаниями ДНК. Некоторые алкилирующие агенты являются монофункциональными и взаимодействуют только с одной цепью ДНК. Другие являются бифункциональными и взаимодействуют с атомом на каждой из двух цепей ДНК, образуя перекрестную связь, ковалентно соединяющую две цепи двойной спирали ДНК. Без репарации такое повреждение препятствует эффективной репликации клетки. Летальность монофункциональных алкилирующих агентов происходит в результате распознавания повреждения ДНК клеткой и ответа клетки на данное повреждение. (Colvin ОМ. Antitumor Alkylating Agents. In Cancer PrinciplesPractice ofOncology, 6th Edition, ed. DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA. Lippincott WilliamsWilkins. Philadelphia 2001, p.363). Противоопухолевые алкилирующие агенты приблизительно разделены в соответствии с их структурой или реакционноспособным остатком, на несколько категорий, включающих азотистые иприты,такие как мустарген, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан и хлорамбуцил; азидины и эпоксиды, такие как тиотеф, митомицин С, диангидрогалактитол и дибромдульцитол; алкилсульфонаты, такие как бусульфан; нитрозомочевины, такие как бисхлорэтилнитрозомочевины (BCNU), циклогексилхлорэтилнитрозомочевина (CCNU) и метилциклогексилхлорэтилнитрозомочевина (MeCCNU); производные гидразина и триазина, такие как прокарбазин, дакарбазин и темозоломид; а также соединения платины. Соединения платины представляют собой содержащие платину агенты, которые взаимодействуют предпочтительно в положении N7 остатков гуанина и аденина, образуя различные монофункциональные и бифункциональные аддукты. (Johnson SW, Stevenson JP, O'Dwyer PJ. Cisplatin and Its Analogues. In Cancer PrinciplesPractice of Oncology, 6th Edition, ed. DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA. Lippincott WilliamsWilkins. Philadelphia 2001, p. 378). Данные соединения включают цисплатин, карбоплатин, соединения платины IV и многоядерные платиновые комплексы. Ниже приведены характерные примеры противоопухолевых алкилирующих агентов в соответствии с данным изобретением. Меклоретамин доступен коммерчески в виде инъекций (MUSTARGEN). Циклофосфамид доступен коммерчески в виде инъекций (циклофосфамид, лиофилизированныйCYTOXAN или NEOSAR), а также в виде таблеток для перорального приема (циклофосфамид или CYTOXAN). Ифосфамид доступен коммерчески в виде инъекций (IFEX). Мелфалан доступен коммерчески в виде инъекций (ALKERAN), а также в виде таблеток для перорального приема (ALKERAN). Хлорамбуцил доступен коммерчески в виде таблеток для перорального приема (LEUKERAN).-4 007530 Тиотеф доступен коммерчески в виде инъекций (тиотеф или THIOPLEX). Митомицин доступен коммерчески в виде инъекций (митомицин или MUTAMYCIN). Бусульфан доступен коммерчески в виде инъекций (BUSULFEX), а также в виде таблеток для перорального приема (MYLERAN). Ломустин (CCNU) доступен коммерчески в виде капсул для перорального приема (CEENU). Кармустин доступен коммерчески в виде внутричерепного имплантата (GLIADEL), а также в виде инъекций (BICNU). Прокарбазин доступен коммерчески в виде капсул для перорального приема (MATULANE). Темозоломид доступен коммерчески в виде капсул для перорального приема (TEMODAR). Цисплатин доступен коммерчески в виде инъекций (цисплатин, PLATINOL или PLATINOL-AQ). Карбоплатин доступен коммерчески в виде инъекций (PARAPLATIN). Следующая таблица вкратце суммирует некоторые из рекомендуемых дозировок вышеперечисленных противоопухолевых алкилирующих агентов. Таблица 1. Рекомендуемые дозировки противоопухолевых алкилирующих средств Предпочтительные комбинации в соответствии с данным изобретением mTOR ингибитора плюс противоопухолевый алкилирующий агент включают CCI-779 плюс цисплатин; CCI-779 плюс циклофосфамид; CCI-779 плюс карбоплатин; и CCI-779 плюс DCNU. Противоопухолевую активность комбинаций mTOR ингибитора плюс противоопухолевый алкилирующий агент подтверждают, применяя CCI-799 в качестве характерного ингибитора mTOR в стандартных фармакологических методиках тестов in vitro и in vivo, применяя комбинации CCI-779 плюс цисплатин; CCI-779 плюс циклофосфамид; и CCI-779 плюс DCNU в качестве характерных комбинаций в соответствии с данным изобретением. Ниже вкратце описаны применяемая методика и полученные результаты. Для комбинаторных исследований in vitro с CCI-779 и алкилирующими агентами используют линии рабдомиосаркомы человека Rh30 и Rh1, а также линию глиобластомы человека SJ-GBM2. Для исследований in vivo используют линию нейробластомы человека (NB1643) и линию ободочной кишки человекаGC3. Для каждого представляющего интерес лекарственного средства определяют кривые ответа на дозы. Клеточные линии Rh30, Rh1 и SJ-G2 помещают в шестилуночные агглютинационные планшеты в количестве 6 х 103, 5 х 103 и 2,5 х 104 клеток/лунка, соответственно. После 24-часового инкубирования лекарственные средства добавляют в 10%FBS+RPMI 1640 дляRh30 и Rh1 или 15%FBS+DME для SJ-G2. После семидневного пребывания в содержащей лекарственное средство среде ядра высвобождают, обрабатывая клетки вначале гипотоническим раствором, а затем детергентом. После этого ядра подсчитывают с помощью счетчика Coulter. Результаты экспериментов изображают в виде графика и для каждого лекарственного средства экстраполяцией определяют IC50 (концентрация лекарственного средства, обеспечивающая 50% ингибирование роста). Из-за того, что значения IC50 от эксперимента к эксперименту слегка варьируются, при исследовании взаимодействия используют две величины, заключающие в скобки IC50 каждого лекарственного средства. Точка максимального взаимодействия между двумя лекарственными средствами достигается при их наличии в соотношении 1:1 в том случае, если изобола имеет стандартную форму. Поэтому каждую из трех приблизительных концентраций IC50 CCI-779 смешивают в соотношении 1:1 с каждым из трех приблизительных IC50 цисплатина, BCNU и мелфанана. Таким образом, в каждом эксперименте получают по девять 1:1 комбинаций лекарственных средств плюс три концентрации для CCI-779 и другого лекарственного средства. Данный протокол обычно обеспечивает по меньшей мере одну комбинацию для каждого лекарственного средства, имеющего величину IC50. Затем используют 1:1 комбинацию концентраций IC50 для CCI-779 и каждого лекарственного средства для химиотерапии с целью определения аддитивности, синергизма или антагонизма, применяя формулу Berenbaum: x/X50+y/Y50, = 1,1,1. В том случае, если три концентрации испытываемого отдельно CCI-779 не дают IС, подходящий к любому из трех IС другого испытываемого отдельно соединения, то проверке подвергают все 1:1 комбинации, чтобы удостовериться в том,попадают ли их значения IС между нужными значениями IС испытываемых отдельно лекарственных средств. В положительном случае эффект считают аддитивным. Результаты проведения стандартной фармакологической процедуры in vitro при испытании против опухолевой линии Rh30 показывают, что комбинация CCI-779 плюс цисплатин является синергической; данная комбинация является более чем аддитивной, но не достигает уровня математического синергизма против опухолевой клеточной линии Rh1, а является аддитивной против опухолевой клеточной линииSJ-G2. Комбинация CCI-779 плюс BCNU является синергической против опухолевой клеточной линииSJ-G2 и более чем аддитивной, но не достигает уровня математического синергизма против клеточной линии Rh30 и аддитивности против клеточной линии Rhl. Комбинация CCI-779 плюс мелфанан является аддитивной против каждой из клеточных линий. Самок мышей CBA/CaJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) в возрасте 4 недель лишают иммунитета в результате тимоэктомии, а через 3 недели их тела полностью подвергают облучению (1200 cGy),применяя источник 137Cs. В течение 6-8 ч облучения мышам вводят 3 х 106 ядросодержащих клеток костного мозга. Части опухолей размером приблизительно 3 мм 3 имплантируют в область дорсального бокового пространства мышей, инициируя рост опухолей. Перед началом лечения мышей с опухолями случайным образом делят на группы по семь особей. Когда опухоли достигают приблизительно 0,20-1 см в диаметре, каждая мышь получает лекарственное средство. Размеры опухолей определяют каждые 7 дней с помощью цифрового циркуля Vernier, соединенного с компьютером. Объемы опухолей подсчитывают,предполагая, что они имеют сферическую форму, по формуле [(/6) х d3], где d означает средний диаметр. CCI-779 вводят по схеме в течение 5 дней подряд в течение 2 недель, повторяя данный цикл каждые 21 день 3 раза. Таким образом, CCI-779 вводят в дни 1-5, 8-12 (цикл 1); 21-25, 28-32 (цикл 2); и 4246, 49-53 (цикл 3). Схема введения другого химиотерапевтического лекарственного средства в каждом исследовании следующая: циклофосфамид в 1-й и 8-й день каждые 21 день в течение 3 циклов. Комбинация CCI-779 и циклофосфамида оценивают на примере рабдосаркомы человека (Rh18),применяя вышеописанную методику теста ксенотрансплантата мыши. При использовании данной методики теста активность CCI-779 с циклофосфамидом (44 мг/кг) является аддитивной. Комбинирование субоптимальных доз CCI-779 плюс циклофосфамид оказывает такое же действие, как и оптимальная доза циклофосфамида. Исходя из результатов проведения вышеописанных фармакологических испытаний, комбинации ингибитора mTOR плюс противоопухолевый алкилирующий агент могут быть использованы в противоопухолевой терапии. В частности, такие комбинации могут быть использованы для лечения карциномы почек, саркомы мягких тканей, рака молочной железы, нейроэндокринной опухоли легкого, рака шейки матки, рака матки, рака головы и шеи, глиомы, рака больших клеток легких, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, лимфомы, меланомы, рака малых клеток легких, рака яичников, рака ободочной кишки, рака пищевода, рака желудка, лейкоза, колоректального рака и первичного рака неизвестного происхождения. Поскольку указанные комбинации содержат по меньшей мере два активных противоопухолевых агента, применение таких комбинаций также обеспечивает применение комбинаций каждого из агентов, в которых один или оба агента применяют в субтерапевтически эффективных дозах,тем самым снижая токсичность каждого отдельного химиотерапевтического средства. При осуществлении химиотерапии в качестве составных частей химиотерапевтического коктейля обычно используют разнообразные агенты, оказывающие различные виды действия. Предполагается, что комбинации в соответствии с данным изобретением будут использоваться как часть коктейля для химиотерапии, который может содержать один или более дополнительных противоопухолевых агентов в зависимости от природы подвергаемой лечению неоплазии. Например, данное изобретение также охватывает применение комбинации ингибитор mTOR/алкилирующий агент вместе с другими химиотерапевтическими агентами, такими как антиметаболиты (т.е. 5-фтороурацил, флоксурадин, тиогуанин, цитарабин,флударабин, 6-меркаптопурин, метотрексат, гемцитабин, капецитабин, пентостатин, триметрексат или кладрибин); гормональные агенты (т.е. эстрамустин, тамоксифен, торемифен, анастрозол или летрозол); антибиотики (т.е. пликамицин, блеомицин, митоксантон, идарубицин, дактиномицин, митомицин или даунорубицин); иммуномодуляторы (т.е. интерфероны, IL-2 или BCG); антимитотические агенты (т.е. винбластин, винкристин, тенипозид или винорелбин); ингибиторы топоизомеразы (т.е. топотекан, иринотекан, этопозид или доксорубицин); а также другие агенты (т.е. гидроксимочевина, трастузумаб, алтретамин, ретуксимаб, паклитаксел, доцетаксел, L-аспарагиназа или озогамицин гемтузумаба). В соответствии с данным изобретением комбинация может быть введена одновременно или по частям, при этом во время курса химиотерапии ингибитор mTOR вводят в другое время, чем алкилирующий агент. Такой промежуток между введением двух агентов может составлять несколько минут, часов, дней,недель или более. Поэтому термин комбинация не обязательно означает одновременное введение или введение в составе единой дозы, а означает введение каждого компонента на протяжении желательного периода лечения. Агенты также могут быть введены различными способами. Например, что касается комбинации ингибитор mTOR плюс алкилирующий агент, предполагается, что ингибитор mTOR вводят пероральным или парентеральным способом, при этом предпочтительным является парентеральное введение, в то время как алкилирующий агент может быть введен парентеральным, пероральным или другими приемлемыми способами. Такие комбинации могут быть введены ежедневно, еженедельно или ежемесячно. Как характерно для химиотерапевтических схем, курс химиотерапии может быть повторен через несколько недель и может следовать за такой же временной схемой введения двух агентов или может быть модифицирован в зависимости от реакции пациента. Как это обычно происходит при химиотерапии, схемы введения лекарственных средств тщательно контролируются лечащим врачом с учетом многих факторов, включая тяжесть заболевания, реакцию на-8 007530 заболевание, общую токсичность, связанную с лечением, возраст, здоровье пациента и другие сопутствующие нарушения или курсы лечения. Исходя из результатов, обеспечиваемых применением комбинаций CCI-779 плюс алкилирующий агент, предполагается, что начальная доза для внутривенной инъекции ингибитора mTOR составляет приблизительно 0,1-100 мг/м 2, при этом предпочтительная доза составляет приблизительно 2,5-70 мг/м 2. Предпочтительным также является внутривенное введение ингибитора mTOR, обычно в течение 30 мин и приблизительно один раз в неделю. Первоначальные дозы такого компонента, как алкилирующий агент, зависят от применяемого компонента и вначале основаны на опыте работы врача с выбранными агентами. Через один или более циклов лечения дозы могут быть повышены или понижены в зависимости от получаемых результатов и наблюдаемых побочных эффектов. Коммерчески доступные алкилирующие агенты могут иметь известные лекарственные формы, при этом дозы могут быть разделены в зависимости от необходимости. Альтернативно, такие агенты или алкилирующие агенты, недоступные коммерчески, могут быть получены в соответствии с обычной фармацевтической практикой. Составы для перорального введения, содержащие активные соединения в соответствии с данным изобретением, могут включать любые обычно используемые пероральные формы,включая таблетки, капсулы, трансбуккальные формы, пастилки, лепешки и жидкости, суспензии или растворы для перорального использования. Капсулы могут содержать смеси активного соединения (активных соединений) с инертными наполнителями и/или разбавителями, такими как фармацевтически приемлемые крахмалы (к примеру, кукурузный, картофельный крахмал или крахмал тапиока), сахара,искусственные подсластители, измельченные в порошок целлюлозы, такие как кристаллическая и микрокристаллическая целлюлозы, различные виды муки, желатины, смолы и т.д. Применимые составы таблеток могут быть получены путем обычного прессования, мокрого или сухого гранулирования и включать фармацевтически приемлемые разбавители, связующие агенты, смазывающие агенты, расщепляющие агенты, модификаторы поверхности (включая поверхностно-активные вещества), суспендирующие или стабилизирующие агенты, включая, но не ограничиваясь ими, стеарат магния, стеариновую кислоту,тальк, лаурилсульфат натрия, микрокристаллическую целлюлозу, кальций карбоксиметилцеллюлозы,поливинилпирролидон, желатин, альгиновую кислоту, смолу акации, ксантановую смолу, цитрат натрия,сложные силикаты, карбонат кальция, глицин, декстрин, сахарозу, сорбит, дифосфат кальция, сульфат кальция, лактозу, каолин, маннит, хлорид натрия, тальк, сухие крахмалы и порошковый сахар. Предпочтительные модификаторы поверхности включают неионные и анионные модифицирующие поверхность агенты. Характерные примеры модификаторов поверхности включают, но не ограничиваются ими, полоксамер 188, хлорид бензалкония, стеарат кальция, цетостериловый спирт, цетомакроголэмульгирующий воск, сложные эфиры сорбита, коллоидный диоксид кремния, фосфаты, додецилсульфат натрия, силикат магния алюминия и триэтаноламин. Составы для перорального введения могут включать известные пролонгированные или высвобождающие через определенное время составы с целью изменения абсорбции активного соединения (активных соединений). Составы для перорального использования также могут быть предназначены для введения активного ингредиента в воде или фруктовом соке, содержащем соответствующие необходимые солюбилизаторы или эмульгаторы. В некоторых случаях может возникнуть необходимость введения соединений непосредственно в дыхательные пути в виде аэрозоля. Соединения также могут быть введены парентеральным или интраперитонеальным способом. Растворы или суспензии таких активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемой соли могут быть получены в воде, соответствующим образом смешанной с поверхностноактивным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также могут быть получены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях в маслах. При обычных условиях хранения и использования данные препараты содержат консервант, предотвращающий рост микроорганизмов. Фармацевтические формы, подходящие для инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для незапланированного получения стерильных растворов или дисперсий для инъекций. В любом случае форма должна быть стерильной и жидкой до такой степени, чтобы обеспечить ее легкое набирание в шприц. Она должна быть стойкой в условиях производства и хранения и должна быть ограждена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носителем может служить растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол,полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), их подходящие смеси и растительные масла. В данном описании под трансдермальным введением подразумеваются все виды введения через поверхность организма и внутренние выстилки проходов тела, включая эпителиальные и слизистые ткани. Такое введение может быть осуществлено с применением данных соединений или их фармацевтически приемлемых солей в виде лосьонов, кремов, пены, накладок, суспензий, растворов и суппозиториев (ректальных и вагинальных). Трансдермальное введение может быть осуществлено путем применения трансдермальной накладки, содержащей активное соединение и носитель, который инертен к активному соединению, нетоксичен для кожи и обеспечивает доставку агента для системного всасывания в ток крови через кожу. Носитель-9 007530 может иметь различные формы, такие как кремы и мази, пасты, гели и окклюзионные устройства. Кремы и мази могут представлять собой вязкие, жидкие или полутвердые эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле. Также подходят пасты из абсорбирующих порошков, диспергированных в вазелине или гидрофильном вазелине, содержащем активный ингредиент. Для высвобождения активного ингредиента в ток крови могут быть использованы различные окклюзионные устройства, такие как полупроницаемая мембрана, закрывающая емкость, содержащая активный ингредиент с носителем или без него, или матрица, содержащая активный ингредиент. Другие окклюзионные устройства описаны в литературе. Составы для суппозиториев могут быть изготовлены из традиционных материалов, включая масло какао, с добавлением различных видов воска или без них с целью изменения температуры плавления суппозитория, а также глицерин. Могут быть также использованы водорастворимые основы для суппозиториев, такие как полиэтиленгликоли с различным молекулярным весом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения новообразования у нуждающегося в этом млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества комбинации, включающей производное рапамицина и противоопухолевый алкилирующий агент, при этом новообразованием является саркома мягких тканей или рак ободочной кишки. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что производным рапамицина является сложный 42-эфир рапамицина 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислоты (CCI-779). 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что противоопухолевый алкилирующий агент выбран из группы, состоящей из циклофосфамида, кармустина и цисплатина. 4. Способ лечения опухоли у нуждающегося в этом млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества комбинации, включающей производное рапамицина и противоопухолевый алкилирующий агент, при этом производное рапамицина, или алкилирующий агент или оба соединения вводят в субтерапевтически эффективных количествах. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что производным рапамицина является сложный 42-эфир рапамицина 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислоты (CCI-779). 6. Способ по пп.1, 3 или 4, отличающийся тем, что производным рапамицина является 42-O-(2 гидрокси)этилрапамицин. 7. Применение производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента для получения лекарственного средства для лечения новообразования, при этом новообразованием является саркома мягких тканей или рак ободочной кишки. 8. Применение по п.7, отличающееся тем, что производным рапамицина является сложный 42-эфир рапамицина 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислоты (CCI-779). 9. Применение по п.7 или 8, отличающееся тем, что противоопухолевый алкилирующий агент выбран из группы, включающей циклофосфамид, кармустин и цисплатин. 10. Применение по любому из пп.7-9, отличающееся тем, что производное рапамицина, или алкилирующий агент или оба соединения вводят в субтерапевтически эффективном количестве. 11. Продукт, включающий производное рапамицина и противоопухолевый алкилирующий агент,выбранный из циклофосфамида и кармустина в виде комбинированного препарата для одновременного,раздельного или последовательного использования для лечения новообразования у млекопитающего, при этом новообразованием является саркома мягких тканей или рак ободочной кишки. 12. Продукт по п.11, отличающийся тем, что производным рапамицина является сложный 42-эфир рапамицина 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислоты.