Фармацевтические композиции фибринолитического агента

006600 Область, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к новым фармацевтическим композициям фибринолитического агента. Более конкретно, данное изобретение относится к замороженным жидким или лиофилизированным композициям фибролазы и, отдельно, "тромболитика нового действия" (NAT), а также к способам их получения и применения. Предпосылки создания изобретения В большинстве случаев полипептиды не очень устойчивы в водной среде и претерпевают химическое и физическое расщепление, приводящее к потере биологической активности при обработке и хранении. Другой трудностью, которая, в частности, встречается при работе в водном растворе, является гидролиз, такой как деамидирование и расщепление пептидной связи. Эти эффекты представляют собой серьзную проблему для терапевтически активных полипептидов, которые предполагается ввести человеку в определенном интервале доз, исходя из биологической активности. Для уменьшения расщепления полипептидов водные фармацевтические композиции обычно хранят в охлажднном или замороженном состоянии до момента применения. Или же для стабилизации полипептидов при длительном хранении используют лиофилизацию, особенно если полипептид сравнительно неустойчив в жидких композициях. Цикл лиофилизации обычно состоит из трх стадий: замораживание,первичная сушка и вторичная сушка; Williams and Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, Volume 38, Number 2, pages 48-59 91984). На стадии замораживания раствор охлаждают до равномерного замерзания. На этой стадии основная масса воды образует лд. Лд сублимируется на стадии первичной сушки, которую проводят при давлении ниже давления паров льда, применяя вакуум. Наконец, сорбированную или связанную воду удаляют на стадии вторичной сушки при пониженном давлении и повышенной температуре. В этом процессе получают материал, известный как лиофилизированный осадок (брикет). После этого брикет можно снова восстановить перед употреблением. Стандартная процедура восстановления лиофилизированного материала представляет собой добавление объма чистой воды (обычно эквивалентного объму, удаляемому лиофилизацией), хотя иногда при получении фармацевтических препаратов для парентерального применения используют разбавленные растворы антибактериальных агентов; Chen, Drag Development and Industrial Pharmacy, Volume 18,Number 11 and 12, pages 1311-1354(1992). Считается, что лиофилизация является лучшим методом для удаления избытка воды из растворов полипептидов. Процесс лиофилизации может дать в результате продукты, которые устойчивы и способны храниться долго. Лиофилизированные продукты могут храниться при комнатной температуре и, следовательно, с ними легче работать и их можно распространять на более широком (географически) рынке,таком, где рефрижерация может быть недоступной. Отмечено, что в некоторых случаях эксципиенты ведут себя как стабилизаторы лиофилизированных продуктов; Carpenter et al., Developments in Biological Standartization, Volume 74, pages 225-239(1991). Например, известные эксципиенты включают полиолы (включая маннит, сорбит и глицерин); сахара (включая глюкозу и сахарозу); и аминокислоты (включая аланин, глицин и глутаминовую кислоту). Кроме того, полиолы и сахара также часто используются для защиты от повреждения при замораживании и сушке и для повышения стабильности при хранении в высушенном состоянии. В большинстве случаев сахара, в частности, дисахариды, эффективны как в процессе лиофилизации, так и при хранении. Сообщалось, что другие классы веществ, включая моно- и дисахариды и полимеры, такие как PVP(ПВП), являются стабилизаторами лиофилизированных продуктов. Сущность изобретения Данное изобретение относится к устойчивым фармацевтическим композициям фибролазы и "тромболитика нового действия" (NAT), некоторые из них являются жидкими композициями, пригодными для хранения в замороженном состоянии, а другие пригодны для лиофилизации. Благодаря фибринолитическим свойствам фибролазы и NAT композиции по данному изобретению применимы для разрушения сгустков крови in vivo и могут применяться в терапии для этой цели. Для целей данного изобретения термин "NAT" относится к металлопротеиназе с фибринолитической активностью, которая характеризуется последовательностью SEQ ID NO:1. NAT-полипептид кодируется кДНК с последовательностью SEQ ID NO:2, хотя любая ДНК с вариантом последовательности,кодирующей тот же полипептид, может применяться для экспрессии и получения в соответствии со способами, представленными ниже в данном описании. Фибролаза представляет собой известную металлопротеазу, которая описана в научной и патентной литературе; см. Randolph et al., Protein Science, Cambridge University Press (1992), pages 590-600 и Европейская патентная заявка N 0323722 (Valenzuela et al.), опубликованная 12 июля 1989 г. Обычно фибролаза, применяемая в композициях по данному изобретению, имеет последовательность SEQ ID NO:3,кодируемую кДНК с последовательностью SEQ ID NO:4 (или е вариантом, кодирующим ту же самую аминокислотную последовательность). Фибролазу и NAT следует отличать от других терапевтических агентов для обработки сгустков крови in vivo, таких как урокиназа, стрептокиназа и tPА, представляющих собой активаторы плазмино-1 006600 гена. В отличие от этих (других) агентов фибролаза и NAT действуют непосредственно на сгусток, разрушая как фибрин, так и фиброген. Фармацевтические композиции по данному изобретению содержат, помимо терапевтически эффективного количества фибролазы или NAT, цинковый стабилизатор и, при необходимости, наполнитель с другими эксципиентами или без них в фармацевтически приемлемом буфере, который, в комбинации,дает стабильный замороженный или лиофилизированный продукт, который может храниться длительное время. В одном из аспектов данное изобретение включает замерзающую жидкую медицинскую композицию, содержащую фибролазу или NAT, водорастворимую цинковую соль, лимоннокислый буфер, при необходимости, дополнительный стабилизатор, выбранный из группы, состоящей из воды, растворимых солей кальция и, при необходимости, наполнитель (например, маннит). Для увеличения стабильности при замораживании-плавлении можно также добавлять поверхностно-активное вещество, такое какTween 80 (BASF, Gurnee, Illinois). Для стабилизации значений рН равным или выше 7,4 можно добавлятьTris-буфер (Sigma, St. Louis, Missouri) или другой буфер с буферной мкостью выше рН 7,0. В другом аспекте данного изобретения фармацевтическая композиция может представлять собой лиофилизируемую или лиофилизированную фармацевтическую композицию, содержащую фибролазу или NAT, цинковый стабилизатор (например, растворимую в воде соль цинка) и лимоннокислый буфер,с другими эксципиентами (например, с наполнителем, таким как маннит, глицин и т.п.) или без них. Лиофилизированная композиция может также содержать дисахарид, такой как сахароза илитрегалоза, в качестве лиопротетанта. Для защиты от металлопротеиназы (фибролазы или NAT) от стрессов при лиофилизации можно добавлять поверхностно-активное вещество, такое как Tween 80. В идеальном случае значение рН сохраняется при 8,80,5 за счт применения подходящего буфера с рКа в этом интервале(например, Tris). Изобретение также включает способ получения лиофилизированной композиции, содержащей стадии: (i) смешение фибролазы или NAT с буфером и водорастворимой солью цинка, а также с любыми требуемыми необязательными ингредиентами, и (ii) лиофилизацию этой смеси. Кроме того, изобретение включает набор для получения водной фармацевтической композиции, содержащий первый контейнер с вышеупомянутой лиофилизированной композицией и второй контейнер с физиологически приемлемым растворителем для этой композиции. Ещ один аспект этого изобретения включает способ, содержащий стадии восстановления лиофилизированной композиции и введения восстановленной композиции больному, нуждающемуся в разрушении сгустков крови (тромбов). Подробное описание изобретения Для экспрессии последовательности, кодирующей полипептид фибролазы или NAT, стандартными методами рекомбинантной экспрессии, хорошо известными специалистам в данной области техники, и получения посредством этого фибринолитически активного полипептида для композиций можно использовать ряд систем вектора-хозяина. Такие системы включают, но без ограничения, эукариотные клеточные системы, такие как млекопитающих, инфицированные вирусом (например, вирусом коровьей оспы,аденовирусом и т.д.); клеточные системы насекомых, инфицированные вирусом (например, бакуловирусом); микроорганизмы, такие как дрожжи, содержащие дрожжевые векторы; или прокариотные клеточные системы, такие как бактерии (например, Е. coli), трансформированные при участии бактериофагальной ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Элементы экспрессии этих векторов варьируются по силе и специфичности. В зависимости от используемой системы вектора-хозяина можно использовать любой из ряда пригодных элементов транскрипции и трансляции. Предпочтительно, для рекомбинантной экспрессии используют дрожжевую систему экспрессии(например, Pichia pastoris) из-за е более высокой эффективности. Подробное описание такой системы можно найти в Патентах США 4855231 (Stroman et al.), 4812405 (Lair et al.) 4818700 (Cregg et al.) 4855242 (Cregg) и 4837148 (Cregg). Экспрессия фибролазы в такой системе, как правило, включает ДНК с последовательностью SEQ ID NO:5, которая кодирует помимо "зрелого" полипептида (нуклеотиды 7841392), "препро" последовательность (нуклеотиды 1-783). Экспрессия NAT в такой системе обычно включает ДНК с последовательностью SEQ ID NO:6, которая кодирует "препро" последовательность (нуклеотиды 1-783) в дополнение к "зрелому" полипептиду (нуклеотиды 784-1386). Когда полипептид (фибролаза или NAT) получен, очищен и проанализирован на активность (известными специалистам в данной области техники методами), из него можно приготовить фармацевтические композиции по данному изобретению. В данные композиции (либо замороженные, либо лиофилизированные) добавляют стабилизатор(который также можно называть "стеклообразующая добавка") для предупреждения или уменьшения осаждения и химического расщепления фибролазы или NAT при любых обстоятельствах. Мутный или густой при комнатной температуре раствор указывает на осаждение полипептида. Термин "стабилизатор" означает, что эксципиент способен предотвращать агрегацию или другой вид физической деградации, а также химическое разложение (например, аутолиз, деамидирование, окисление и т.д.) фибролазы или NAT в водной среде.-2 006600 Было найдено, что введение цинкового стабилизатора, и более конкретно, водорастворимой соли цинка, повышает стабильность металлопротеиназы (фибролазы или NAT) в композиции каждого вида,по сравнению с препаратами, в которых для предупреждения агрегации и/или разложения полипептида используют неорганические или другие органические соединения. Конкретно, цинк при концентрации выше 0,01 миллимоля (мМ) стабилизирует металлопротеиназу при условии, что цинк при концентрации выше 1 мМ значительно ограничивает растворимость фибролазы или NAT. Следовательно, рекомендуется интервал около 0,01-1 мМ. Примерами пригодных солей цинка являются ацетат цинка, сульфат цинка и хлорид цинка. Замороженные жидкие композиции по данному изобретению, в частности, могут при необходимости (но необязательно) также включать водорастворимую соль кальция в качестве дополнительного стабилизатора. Примерами являются ацетат кальция, сульфат кальция или хлорид кальция, которые предпочтительно присутствуют в концентрации около 0,001-0,02 мМ и более предпочтительно в концентрации около 0,01-0,002 мМ. Если требуется, помимо вышеуказанных можно использовать другие стабилизаторы, обычно применяемые в фармацевтических композициях, такие как сахароза, трегалоза или глицин. Обычно такие стабилизаторы добавляют в минорных количествах, в интервале, например, около 0,1-0,5 (вес./об.)%. Поверхностно-активные стабилизаторы, такие как Tween 20 или Tween 80 (BASF) можно также добавлять в обычных количествах. Если требуется, замороженные жидкие или лиофилизированные композиции могут также включать наполнитель/регулятор осмолярности. Предпочтительно, вводят маннит с концентрацией около 2-8%(вес/об.)%, и обычно с концентрацией около 5 (вес/об.)%. Найдено, что выбор фармацевтически приемлемого буфера и рН также влияют на стабильность данных композиций. Фибролаза или NAT наиболее устойчивы при значениях рН выше нейтрального(7,0). Заметное осаждение обеих металлопротеиназ происходит при рН ниже 7,0, когда замороженная композиция размораживается или лиофилизированная композиция восстанавливается. Буферная система композиций выбирается так, чтобы она была физиологически совместимой и сохраняла нужное значение рН в восстановленном растворе, а также в растворе перед лиофилизацией. Предпочтительно рН буферная мкость буферных растворов составляет около рН 7,0-8,5. Конкретно, буферы лимонной кислоты (например, лимонная кислота или соль лимонной кислоты),предпочтительно, вводятся в концентрации около 20-110 мМ и наиболее предпочтительно около 100 мМ в композиции замороженной и около 20 мМ в лиофилизированной композиции. Соли лимонной кислоты применяют как буферизаторы и стабилизаторы в композициях по данному изобретению. Используют ли кислоту как таковую, либо е соль - буфер выбирают для доведения рН композиции до значения в вышеуказанном заданном интервале (в случае лиофилизированной композиции - после восстановления). Можно добавлять в эффективных количествах дополнительные буферизаторы, такие как Tris, для сохранения адекватной буферной мкости выше рН 7,0. Предпочтительная жидкая композиция, подлежащая замораживанию, содержит, помимо солюбилизированной фибролазы или NAT, ацетат цинка с концентрацией около 0,08-0,12 мМ, ацетат кальция с концентрацией около 0,008-0,012 мМ и лимонную кислоту (или цитрат натрия) с концентрацией около 95-105 мМ при рН около 7,4. Другая предпочтительная жидкая композиция содержит фибролазу илиNAT, ацетат цинка с концентрацией около 0,08-0,12 мМ, лимонную кислоту (или цитрат натрия) с концентрацией около 18-22 мМ, Tris с концентрацией около 0,02-0,06 мМ, маннит с концентрацией около 36 (вес./об.)% мМ и Tween 80 с концентрацией около 0,008-0,012 (вес./об.)% мМ при рН около 8,0. Предпочтительная лиофилизируемая композиция содержит, помимо фибролазы или NAT, сульфат цинка с концентрацией около 0,08-0,12 мМ, лимонную (или цитрат натрия) с концентрацией около 18-22 мМ, Tris с концентрацией около 3-6 мМ, маннит с концентрацией около 3-6 (вес./об.)% мМ и Tween 80 с концентрацией около 0,008-0,012 (вес./об.)% мМ при рН около 8,0. Во всех композициях по данному изобретению фибролаза или NAT присутствуют с концентрацией около 0,1-50 мг/мл предпочтительно, с концентрацией около 5-40 мг/м, более предпочтительно, и с концентрацией около 10-15 мг/мл - наиболее предпочтительно. Относительные пропорции эксципиентов в этих композициях зависят от нескольких факторов. Например, количество металлопротеиназы и наполнителя (например, маннита) влияет на количество цинка(или кальция, если он присутствует), необходимого для стабилизации композиции. Количество стабилизатора, используемого в композициях, зависит от количества, необходимого для сохранения структурной целостности фибролазы или NAT в ходе лиофилизации или другой обработки или при хранении. Также в композицию могут быть включены другие эксципиенты при условии, что они физиологически совместимы и ни в коей мере не вредны для фибролазы или NAT. Например, композиция может содержать минорные количества добавок, таких как консерванты, тонизирующие вещества, антиоксиданты или другие полимеры (например, корректоры вязкости или наполнители). Специалисты в данной области техники могут легко определить подходящие, фармацевтически приемлемые реагенты на основе знаний и опыта в отношении других фармацевтических композиций. См., например, Remingtin's Pharmaceutical Sciences (последнее издание), Mack Publishing Company, Easton, PA.-3 006600 Предполагается, что композиции устойчивы, по меньшей мере, в течение двух лет при -30 С для замороженной композиции, и в течение двух лет при 2-8 С для лиофилизированной композиции. Такая продолжительная устойчивость полезна для длительного хранения фармацевтического продукта и для перевозок на большие расстояния. В другом аспекте данное изобретение также охватывает способ получения лиофилизированной композиции, включающий стадии:(a) доведение рН смеси, содержащей ингредиенты без фибролазы или NAT, до рН 7,6-8,2,(b) буферный перенос фибролазо- или NAT-содержащего раствора в раствор композиции, полученный на стадии (а), а затем добавление эффективного количества поверхностно-активного вещества, и(c) лиофилизация смеси, полученной на стадии (b). Фибролаза или NAT и эффективные количества эксципиентов смешивают в условиях, эффективных для уменьшения агрегации высушенного полипептида фибролазы или NAT в процессе восстановления средой для восстановления, например, растворителем, совместимым со способом введения и не препятствующим действию металлопротеиназы, таким как стерильная вода, физиологический раствор, раствор глюкозы или другие водные растворители (например, спирты, такие как этиловый, н-пропиловый или изопропиловый, бутиловый или их смеси) и, при необходимости, другие компоненты, такие как антибактериальные агенты. Эксципиенты могут смешиваться с металлопротеиназой в определнное время перед лиофилизацией. Время смешения эксципиентов и металлопротеиназы должно быть достаточным для приготовления соответствующей смеси; предпочтительно смешение следует проводить в течение примерно 1-30 мин. Затем приготовленный состав с металлопротеиназой можно лиофилизировать, хранить и восстанавливать с применением стандартных методов. Конкретные условия, при которых фибролаза или NAT лиофилизируются и восстанавливаются, не особенно важны, при условии, что выбранные условия не разрушают металлопротеиназу и не вредны для стабилизатора. Предпочтительный лиофилизированный цикл включает замораживание композиции при -40 С, отжиг замороженного образца при -12 С и проведение первичной сушки при от -30 до -35 С в течение 20-50 ч, а вторичной сушки при 20 С в течение 20-40 ч. В большинстве случаев восстановленную композицию используют вскоре после восстановления(реконструкции). Как NAT, так и фибролазу лучше всего доставлять локально к месту тромба (сгустка) для наиболее эффективного лечения. Подобно фибролазе NAT ковалентно связывается 2-макроглобулином в общем потоке. В комплексе с 2-макроглобулином ни фибролаза, ни NAT не могут иметь доступ к целевому субстрату (т.е. фибрину или фибриногену) и в значительной степени неэффективны, если и до тех пор,пока не будет превышен максимальный "природный" уровень 2-макроглобулина. Следовательно, предпочтительно, чтобы композиции по данному изобретению вводились непосредственно в сгусток крови с помощью внутриартериальной или внутривенной катетеризации. Описание примеров осуществления изобретения Следующие примеры дополнительно иллюстрируют данное изобретение. Рекомбинантный NAT (SEQ ID NO:1), используемый в примерах 1-3, получают экспрессией в P.pastoris. Подробности, касающиеся подходящей системы экспрессии и способа, можно найти в патентахStroman et al., Lair et al., Cregg et al. и Cregg, ссылки на которые даны выше. Все химические реактивы имеют степень чистоты либо чда, либо USP. Пример 1. Получение замороженной жидкой композиции Водный раствор, содержащий 100 мМ лимонной кислоты, 0,01 мМ ацетата кальция и 0,1 мМ сульфата цинка, готовят, смешивая ингредиенты при рН, доведенном до 7,4. NAT-содержащий раствор подвергают буферному переносу в раствор диализом (или же можно применять ультрафильтрацию). Образующийся NATраствор концентрируют до 10 мг/мл и хранят в замороженном виде при температуре -30 С до употребления. Пример 2. Приготовление лиофилизированной композиции Водный раствор, содержащий 5 мМ Tris, 20 мМ лимонной кислоты, 5 (вес./об.)% маннита, 0,5%(вес./об.) сахарозы и 0,1 мМ сульфата цинка готовят смешением ингредиентов при рН, доведенном до 8,0. NAT-содержащий раствор подвергают буферному переносу в раствор композиции диализом (можно вместо него использовать ультрафильтрацию). Образующийся NAT-раствор концентрируют до 10-12 мг/мл. Добавляют Tween 80 до конечной концентрации 0,01 (вес./об.)%. Раствор хранят при температуре 2-8 С до момента лиофилизации. Лиофилизированный цикл для получения лиофилизированного продукта. Приготовленную выше композицию сначала замораживают при температуре -40 С в лиофильной сушилке. Температура отжига устанавливается при -12 С; температура первичной сушки устанавливается -30 С; и температура вторичной сушки 20 С. Образующийся в результате лиофилизированный брикет ("кек") имеет хорошую морфологию и содержит менее 3% воды, как показано титрованием по методу Карла Фишера; см.Fischer, Angew. Chemie, Volume 48, page 394 (1935). По окончании процесса лиофилизации лиофилизированный брикет (осадок) помещают в пузырьки и под вакуумом плотно закрывают резиновыми пробками, прижимая верхние металлические полки в лиофильной сушке. Затем пузырьки обжимают с помо-4 006600 щью 13-миллиметрового наружного алюминиевого уплотнения и помещают в термостаты, выдерживают при различных температурах. Пример 3. Анализ восстановленных лиофилизированных образцов Анализ временных точек образца. Пузырьки с образцами вынимают из термостатов в определенные временные интервалы для анализа временных точек. Лиофилизированный образец восстанавливают 0,9 мл стерилизованной воды, т.е. "воды для инъекций" (McGaw Inc., Irvine, CA). Визуально определяют прозрачность восстановленных растворов образцов. Отфильтрованные растворы анализируют с помощью ВЭЖХ, УФ-vis-спектроскопии и определения ферментативной активности, чтобы количественно определить оставшийся растворимый NAT в этих лиофилизированных образцах. На основе вышеуказанных анализов можно сделать вывод, что более 90% NAT регенерировано после восстановаления лиофилизированного продукта. Оптическая плотность в УФ/видимой области (vis). 150-200 мкл раствора NAT помещают в ультрамикрокювету из кварцевого стекла супрасил с длиной траектории 1 см. УФ/vis-оптическую плотность определяют на спектрофотометре HP 8452A с диодной матрицей (Hewlett-Packard Co., Wilmington, DE). Концентрации NAT определяют, используя А 0,1% = 1,05 при 280 нм, с учетом расчетов на основе аминокислотного состава; ссылку см. Edelhoch, Biochemistry, Volume 6, pages 1948-1954 (1967). После повторной гидратации лиофилизированного продукта не наблюдается заметного помутнения при определении оптической плотности при длине волны 350 нанометров (нм). Высокоэффективная жидкостная хроматография. ВЭЖХ-анализ NAT-образцов осуществляют на системе для жидкостной хроматографии HP 1050, снабжнной HP 3D Chemstation для сбора данных(Hewlett-Packard Co.). Образцы NAT обнаруживают по оптической плотности при 280 и 214 нм, используя диодный детектор. Для обращнно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ, RP-HPLC) образцы впрыскивают на колонку Zorbax 300SB-CB (4,6 х 250 мм) (Hewlett-Packard Co.) в подвижной фазе, состоящей из 51,5% буфера А (2% излпропанола, 0,1% TFA (ТФК и 48,5% буфера В (90% ацетонитрила, 2% изопропанола, 0,1% ТФК) при скорости потока 0,6 мл/мин. Буфер В выдерживают 6 мин, а затем постепенно доводят до 51% в течение двадцати минут. Эту концентрацию выдерживают одну минуту с последующим постепенным доведением в течение восьми минут до 90% и выдерживают при такой концентрации в течение пяти минут. Наконец, концентрацию буфера В опять постепенно доводят до 48,5% за три минуты. Регенерация NAT после лиофилизации, как обнаружено этим методом, составляет более 92%. Для ионообменной ВЭЖХ (ИО-ВЭЖХ, IEХ-HPLC) образцы впрыскивают на колонку TosohaasDEAE-5PW (7,5 х 75 мм) (Tosohaas, Montgomeryville, Alabama) в подвижной фазе, состоящей из 90% буфера А (20 мМ Tris, pH 8,5) и 10% буфера В (20 мМ Tris, 250 мМ NaCl, pH 8,5) при скорости потока 0,5 мл/мин. Затем применяют градиент, повышая концентрацию буфера В от 10 до 75% за 20 мин, затем от 75% буфера В до 90% буфера В за одну минуту. Затем выдерживают эту концентрацию буфера В в течение пяти минут, а далее постепенно доводят до 10% буфера В за четыре минуты. Регенерация NAT после лиофилизации, как обнаружено этим методом, составляет более 90%. Для гель-фильтрационной ВЭЖХ (ГФ-ВЭЖХ, SEC-HPLC) образцы наносят на колонку Tosohaas G2000SWXL (300 х 7,8 мм). Изократическое элюирование осуществляют при скорости потока 0,8 мл/мин,используя буфер, содержащий 15 мМ фосфата натрия, рН 7,0 и 0,140 М хлористого натрия. РегенерацияNAT после лиофилизации, как обнаружено этим методом, составляет более 95%. Биоанализ. Образцы подвергали скринингу на активность против фибриновых сгустков. Малые аликвоты серийного разведения NAT в интервале 0,01-1,0 мг/мл наносят на заранее образованные фибриновые сгустки в 96-луночных планшетах. Образцы инкубируют восемнадцать часов и лизис сгустков количественно определяют по оптической плотности при 500 нм. График зависимости оптической плотности от концентрации NAT для различных рецептур сравнивают с графиком приготовленного эталонаNAT для сравнительной активности. Не обнаруживается ощутимой разницы между фибринолитической активностью NAT после лиофилизации и активностью контрольного (нелиофилизированного) образца. Сходные результаты анализа получены и для замороженной жидкой композиции после того, как последнюю разморозили (раплавили) при 4 С и анализировали, используя те же самые протоколы. Вышеприведнное изобретение описано с представлением некоторых подробностей для большей ясности и лучшего понимания. Также станет очевидно, что можно использовать различные другие комбинации формы и деталей в объме данного изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения. Пример 4. Операции, описанные в примерах 1 и 2, повторяют с рекомбинантной фибролазой вместо NAT, получая аналогичные замороженные жидкие и лиофилизированные фармацевтические композиции. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтическая композиция, содержащая металлопротеиназный фибринолитический агент,цинковый стабилизатор и, при необходимости, наполнитель в фармацевтически приемлемом буфере,отличающийся тем, что металлопротеиназный фибринолитический агент представляет собой модифицированную фибролазу, которая связывается с цинком, непосредственно разрушает фибрин и инактивируется при вхождении в комплекс с альфа-2-макроглобулином. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что цинковый стабилизатор представляет собой водорастворимую соль цинка, выбираемую из группы, состоящей из сульфата цинка, ацетата цинка и хлорида цинка. 3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что буфер представляет собой лимонную кислоту или водорастворимую соль лимонной кислоты. 4. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что наполнитель представляет собой маннит. 5. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что значение рН составляет около 6,5-8,5. 6. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она находится в виде замороженной жидкости. 7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что содержит водорастворимую кальциевую соль. 8. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что водорастворимую кальциевую соль выбирают из группы, состоящей из ацетата кальция, сульфата кальция и хлорида кальция. 9. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она представляет собой лиофилизированную композицию. 10. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая около 0,1-50 мг/мл металлопротеиназного фибринолитического агента, около 0,08-0,12 мМ сульфата цинка, около 0,008-0,012 мМ ацетата кальция и около 95-110 мМ лимонной кислоты или цитрата натрия, при этом рН указанной композиции примерно равен 7,4. 11. Фармацевтическая композиция по п.10, отличающаяся тем, что она содержит 10 мг/мл металлопротеиназы, 100 мМ лимонной кислоты, 0,01 мМ ацетата кальция и 0,1 мМ сульфата цинка. 12. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая около 0,1-50 мг/мл металлопротеиназного фибринолитического агента, около 0,08-0,12 мМ ацетата цинка, около 18-22 мМ лимонной кислоты или цитрата натрия, около 0,02-0,06 мМ Tris, около 3-6% (вес./об.) необязательного наполнителя и около 0,008-0,012% (вес./об.) поверхностно-активного вещества, при этом рН указанной композиции примерно-9 006600 равен 8,0. 13. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая около 0,1-50 мг/мл металлопротеиназного фибринолитического агента, около 0,08-0,12 мМ сульфата цинка, около 18-22 мМ лимонной кислоты или цитрата натрия, около 3-6 мМ Tris, около 3-6% (вес./об.) необязательного наполнителя и около 0,0080,012% (вес./об.) поверхностно-активного вещества и, при необходимости, около 0,1-0,5% (вес./об.) сахарозы, причм рН указанной композиции примерно равен 8,0. 14. Фармацевтическая композиция по п.13, отличающаяся тем, что она содержит 12 мг/мл металлопротеиназы, 5 мМ Tris, 20 мМ лимонной кислоты, 5% (вес./об.) маннита, 0,5% (вес./об.) сахарозы, 0,01%(вес./об.) поверхностно-активного вещества и 0,1 мМ сульфата цинка, причм рН указанной композиции примерно равен 8,0. 15. Композиция по любому из пп.1-14 для лизиса сгустков крови. 16. Применение композиции по любому из пп.1-14 для производства лекарственного средства для лизиса сгустков крови. 17. Способ приготовления лиофилизированной композиции, включающий следующие стадии:(a) составление смеси металлопротеиназного фибринолитического агента, цинковой соли, наполнителя, стабилизирующего дисахарида и поверхностно-активного вещества в буфере, причем металлопротеиназный фибринолитический агент представляет собой модифицированную фибролазу, которая связывается с цинком, непосредственно разрушает фибрин и инактивируется при вхождении в комплекс с альфа-2-макроглобулином и(b) лиофилизацию смеси, полученной на стадии (а). 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что рН указанной комбинации доводят перед лиофилизацией примерно до 7,8-8,2. 19. Способ по п.17, отличающийся тем, что включает следующие стадии:(a) доведение значения рН раствора, содержащего соль цинка, наполнитель и стабилизирующий дисахарид до 7,6-8,2.(а), а затем добавление эффективного количества поверхностно-активного вещества, и(с) лиофилизация смеси, полученной на стадии (b). 20. Лиофилизированная фармацевтическая композиция, полученная способом по п.19. 21. Набор для приготовления водной фармацевтической композиции, включающий первый контейнер, содержащий лиофилизированную композицию цинкового стабилизатора и металлопротеиназного фибринолитического агента, представляющего собой модифицированную фибролазу, которая связывается с цинком, непосредственно разрушает фибрин и инактивируется при вхождении в комплекс с альфа-2 макроглобулином, и второй контейнер, содержащий физиологически приемлемый растворитель для лиофилизированной композиции. 22. Способ растворения сгустков крови, включающий контактирование сгустка крови in vitro с эффективным количеством композиции, включающей металлопротеиназный фибринолитический агент,цинковый стабилизатор и, при необходимости, наполнитель, в фармацевтически приемлемом буфере,причем металлопротеиназный фибринолитический агент представляет собой модифицированную фибролазу, которая связывается с цинком, непосредственно разрушает фибрин и инактивируется при вхождении в комплекс с альфа-2-макроглобулином.