Липополисахарид бактерий e. coli штамма dsm 6601 и способ его получения

1 Изобретение касается новых липополисахаридов из E.coli. Под эндотоксинами понимают бактериальные структурные компоненты, которые, в отличие от экзотоксинов, не выделяются живыми бактериями, но главным образом освобождаются после аутолиза. В случае так называемых классических эндотоксинов речь идет о термостабильных липополисахаридах (далее LPS) из наружных клеточных мембран грамотрицательных бактерий. LPS состоят из так называемого липоида А, олигосахарида ядра, а также специфической О-цепи, причем липоид А отвечает за токсичное действие LPS. Эндотоксины стимулируют в макроорганизме продукцию медиаторов иммунной ситемы, например интерлейкина 1, (IL-1) и фактора некроза опухоли (TNF). В отношении состава эндотоксинов бактерий кишечной группы и, в частности, E.coli, уже проведен ряд исследований, причем было установлено, что S/R-мутанты, как правило, содержат только повторения, то есть повторяющееся звено" О-цепи (ср. фиг. 1). Исходят из того, что в этих случаях ген, который кодирует фермент полимеризации О-цепи, является дефектным и поэтому будет передавать только повторяющееся звено" на олигосахарид ядра. LPSструктуры подобного типа, но отличной структуры часто находятся также в патогенных для человека микроорганизмах, например Neisseria,Vibrio, Capmylobacter, Helicobacter и т.д. Эти микроорганизмы имеют LPS, которые дают им возможность лишать хозяина иммунной защиты путем особой молекулярной мимикрии и т.п.,благодаря наличию сиалиновых кислот и содержащих сиалиновые кислоты олигосахаридов,подобных гликопротеинам и гликолипидам млекопитающих. Для E.coli DSM 6601 был установлен О 6-Серотип. Эта структура исследована и опубликована P.E.Jansson et al.,Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283. Структура соответствует формуле, представленной на фиг. 2. Различные исследовательские группы изучали липоид А колибактерий. При этом было установлено, что структура липоида А, как правило, существует в гексаацильной форме и совпадает для всех серотипов из E.coli (фиг. 3). Структура гексаацильной связи была опубликована в 1984 г. Th. Rietschel et al., Structure andRietschel, ed.), Elsevier, Amsterdam (1984), pp. 187-220 и соответствует изображению на фиг. 3. Специфическая О-цепь и липоид А связаны друг с другом через олигосахарид ядра. До настоящего времени известны пять различных олигосахаридов ядра у E.coli. Здесь также производится ссылка на О.Holst et al., Chemicalstructure of the core region of lipopolysaccharide,в: Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharides, Vol.1,Morrison D.S. and Ryan, J.L (eds.), Boca Raton,FL, USA (1992) pp. 135-170 (ср. фиг. 4). При исследованиях LPS из штамма DSM 6601 E.coli было обнаружено, что липоид А в структуре гексаацильной формы также соответствует липоиду А, описанному для Е. coli. Исследования в отношении высвобождения IL-1 и TNF в моноцитах человека подтверждают, что липоид А обладает такой же активностью и поэтому соответствует с высокой вероятностью известной структуре липоида AE.coli (ср. фиг. 5, 6). Это предположение подтверждалось химическими анализами. В структуре специфического О-антигенаDSM 6601 Е. coli поражает тот факт, что очевидно в цепи регулярно существует только единственное повторяющееся звено" (ср. фиг. 1). Отсюда можно заключить, что речь идет оS/R-мутанте у штамма DSM 6601, что является чрезвычайно необычным для человеческого изолята. Однако, как показывают серологические анализы, структура этого повторяющегося звена" соответствует основному образцу О-цепиE.coli О 6. Область ядра у штамма DSM 6601 соответствует известной R1-структуре. Структурные особенности состоят в том, что аналитически было установлено 8 фосфатных остатков на молекулу LPS, причем, как правило, на липоид А выпадают только 2 фосфатных остатка. В дальнейшем было обнаружено нестехиометрическое содержание пирофосфоэтаноламина. Таким образом, обобщение позволяет установить, что LPS штамма DSM 6601 значительно отличается от до сих пор известного LPS из E.coli, в частности, в фосфорилированной сахаридной части ядра и по степени полимеризации О-цепи. Липоид А структурно и биологически соответствует обычному для E.coli типу,что подчеркивает роль этого вещества в биологической активности. Описанный LPS предназначен не только для идентификации несущего его колиштамма, но и придает ему также пониженную патогенность при сохранении иммуномодулирующего действия. Тот факт, что О-цепь имеет -гликозидную связь вместо гликозидной, впервые стало возможным однозначно увидеть на примере S/R-мутанта DSM 6601 для E.coli. В случае липополисахарида (LPS) из Е.coli DSM 6601 речь идет о новой гладкошероховатой (S/R)-структуре, которая, с одной стороны, состоит из до сих пор известных частей структур (О-специфическая цепь, олигосахарид ядра и липоид А), с другой стороны,впервые и полностью структурно охарактеризована в представленной здесь комплексной форме (ср. фиг. 7). О-специфическая цепь, состоящая только из единственного повторения ("по 3 вторяющееся звено") серотипа О 6, имеет гликозидную связь с олигосахаридом ядра и,таким образом, иначе связана в пределах О-цепиR1-структуру, химическое состояние которой подтверждается серологическими исследованиями с R1-специфическими антителами. Компонент липоида А обладает характерной определенной для липоида А Е. coli химической конституцией.LPS из штамма DSM 6601 E.coli обладает удивительной гомогенностью. Гетерогенность может быть установлена только в отношении заместителей фосфатов (РР и P-Etn vs. P и Р),что впервые описывается в этой форме. Посредством комплексных NMR-анализов можно четко определить P-Etn-заместитель в олигосахариде ядра R1-олигосахарида ядра в позиции 2 второй гептозы (Hep"). Окончательная структура LPS штаммаDSM 6601 представлена на фиг. 7. В дальнейшем изобретение более подробно поясняется с помощью примеров: Пример 1. Получение LPSLPS получали из промытой и высушенной бактериальной массы после модифицированной экстракции фенол/вода; как указано O.Westphalpp.83-91. 47 г лиофилизированных бактерий, которые перед этим дважды промывали дистиллированной водой, экстрагировали по Westphal иJann в соответствии с модифицированной инструкцией. Модификация состояла в дополнительной ферментативной обработке (ДНКазой,РНКазой, протеиназой К) водного экстракта,которая служит для удаления случайных чужеродных белков и ДНК/РНК-составных частей. Далее к водной фазе (около 1,2 л) при комнатной температуре примешивали 20 мг ДНКазы(рибонуклеаза А, бычья поджелудочная железа,Sigma) и 20 мг ДНКазы (ДНКаза I, бычья поджелудочная железа, степень II, Sigma), смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 ч. Далее добавляли 20 мг протеиназы К (Tritirachium album, Boehringer, Mannheim),затем перемешивали 12 ч. Полученную суспензию трижды подвергали диализизу через 15 л дистиллированной воды при 4 С в течение 24 ч и затем лиофилизировали. Ферментсодержащий экстракт промывали в дистиллированной воде до тех пор, пока не была достигнута окончательная концентрация около 50 мг/мл. Суспензию три раза центрифугировали с ультразвуком в холоде (155.000 х г, 4 С, 4 ч). Осадок (LPS) помещали в 150 мл дистиллированной воды и еще один раз подвергали диализу через воду в течение трх дней и после этого лиофилизировали (выход LPS: 1,45 г, 3.1% м/м). Пример 2. Анализ LPS из штамма DSM 6601 E.coli. Гексозамин (HexN) (обозначаемый здесь как глюкозамин + галактозамин, GlcN+GaLN) определяли по модифицированному тесту Моргана-Эльсона(в 1959, и кроме того также посредством HPLS(PICO-TAG, Waters). В противоположность тесту Моргана-Эльсона при этом методе анализа можно не только определить количественно и по-отдельности GlcN и GalN, но также можно параллельно установить еще и наличие GlcNфосфата, 2-этаноламина (Etn) и 2-этаноламинфосфата (Etn-P), которые часто встречаются в LPS. Газожидкостную хроматографию (GC) проводили на Varian 3700 GC или Hewlett Packard (HP 5890 серия II) газовом хроматографе на капиллярной колонке (заполненной диоксидом кремния SPB-5, 30 м, Supelco). Комбинированную газожидкостную хроматографию/массспектрометрию (GC-MS) проводили в массспектрометре (HP модель 5989), который оснащен НР-1 капиллярной колонкой (30 м, HewlettPackard). GC- и соответственно GC-MS анализы применяли для определения нейтрального сахара (Glc, Gal, Hep, Man) в качестве их алдитолацетатов (Sawardeker, J.S., Slonerker, J.H.Jeanes,A. Anal. Chem. 37, 1602-1604 (в 1967, а также для качественного и количественного определения жирных кислот в качестве производных сложных эфиров жирных кислот и метилового эфира после сильного метанолиза (2 Мand Rietschel, E.Th., Analysis of lipopolysaccharide (lipid A) fatty acids, J. Microbiol. Meth. 11,(1990) 195-211) и экстракции с хлороформом. Оба GC-метода анализа начинали при 150 С(изотерма для 3 мин) и посредством линейного температурного градиента повышали от 5 С/мин до 320 С. Фосфат определяли по Lowry(1954 и 2-кето-3-дезокси-D-маннооктулозоновую кислоту (Kdo) посредством теста тиобарбитуровой кислоты (Waravdekar, V.C.Saslaw,L.D., J. Biol. Chem. 234, 1945-1950 (1959. Получение и очистка свободного липоида А и олигосахарида ядраLPS (258,8 мг) суспендировали в 25 мл 0,1 М NaOAc/HOAc (pH 4.4) и подвергали мягкому кислотному гидролизу при 100 С в течение 1 ч. Затем экстрагировали три раза липофильную часть (липоид А) из гидролизата с 25 мл хлороформа (выход 23,2 мг). Далее липоид А из органической фазы очищали с помощью препаративной слоевой хроматографии (PSC) (2 мм PSC силикагеля 60 пластин, E.Merck, Daamstadt),хроматографировали с хлороформом-метанолом-водой 100:75:15 (объем/объем/объем) и вы 5 деляли погружением в дистилированную воду. Таким образом получали 6 фракций, из которых основная фракция (Rf=0,4) представляла собой очищенный дифосфорилированный гексаациллипоид A (DPHLA-Ec6601). Очищенный DPHLAEc6601 (выход 2,06 мг) растворяли в хлороформметаноле 8:2 (объем/объем) и обрабатывали перед MALDI-TOF-MS с ионообменником (Amberlite IRA 120, Н+-форма). Аликвоту (250 г) очищенного DPHLA-Ec6601 использовали для биологических экспериментов. Водную фазу экстракции хлороформа лиофилизировали (выход: 272 мг) и далее очищали олигосахарид с помощью TSK-колонки[3,5 х 90 см, TSK HW-40(S), E.Merck] в пиридине - уксусной кислоте - воде 8:20:2000 (объем/объем/объем). Отдельные фракции олигосахаридов (пул А, В, С и D) анализировали с помощью GC-MS и NMR-спектроскопии. Далее очищали основные фракции (пул А, 28-41; 49,05 мг), которые содержали как составные части сахара О-цепи (Man, GalNac), так и такие же части олигосахарида ядра (Hep, Kdo). Другие фракции содержали моносахариды, не исследованные ближе артефакты Kdo (ангидро- и лактон) и, наконец, соль. В основной фракции TSKразделения все составные части олигосахарида ядра (Kdo, Gal, Hep) и О-цепи (Man, GalNAc) были обнаружены не только при GC-MSанализе, но и при NMR-анализе. Поэтому обработку продолжали далее. Кроме того, в первую очередь проверяли,подходит ли для очистки олигосахарида до гомогенности аналитическая анионно-обменная хроматография при высоком давлении НРАЕС(high pressure anion exchange chromatography). Для этого применяли специфическую HPLCметодику для анализа комплексных структур сахара (DIONEX-система) с аналитической CarboPac PA1 колонкой; (4,6 мм х 250 мм) и линейными градиентами соли (5 мин при 0, затем при 50 мин на 0,52 NaOAc) при скорости тока 1 мл/мин. Элюат определяли с помощью пульсамперометрического детектора (PAD) на восстановительном эквиваленте (молекула сахара). Таким образом получали четыре олигосахаридные фракции, которые далее очищали с помощью семипрепаративной НРАЕС аналогичным способом. Семипрепаративную НРАЕС осуществляли с помощью CarboPac PA1 колонки [(9 мм х 250 мм) Dionex система] с такими же градиентами соли, как при аналитической НРАЕС (5 мин при 0, затем 50 мин на 0,5 М NaOAc) и скорости тока 4 мл/мин. Нанесение олигосахарида(42 мг; пул А из TSK-колонки) при семипрепаративной НРАЕС осуществляли в двух аналогичных НРАЕС-направлениях. Элюат собирали в фракции каждую минуту, и их по отдельности исследовали с помощью аналитической НРАЕС. Таким образом, с помощью семипрепаративной НРАЕС получали две основных фракции (фрак 005217 6 ция I, время удержания tR12 мин и фракция II,tR15 мин). Обе НРАЕС-фракции должны были обессоливать перед MALDI-TOF-MS и NMRанализом с помощью G-10-колонки (2,5 х 120 см) (выход: фракция I 4,68 мг; фракция II 4,39 мг). Усиленная матрицей лазерная десорбция/ионизация времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии Усиленную матрицей лазерную десорбцию/ионизацию времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии проводили в Bruker-ReflexII времяпролетном спектрометре (Bruker-FranzenAnalytik, Bremen), a также в линейной конфигурации и в отрицательном режиме при ускоряющем напряжении 20 кВ и запаздывающей экстракции ионов". Пробы вначале растворяли в хлороформе (липоид А) или дистиллированной воде (олигосахаридные фракции) в концентрации 10 мкг/мкл, и 2 мкл их аликвоты растворяли в 2 мкл раствора матрицы, состоящего из 0,5 м 2,4,6-тригидроксиацетофенона (Aldrich, Steinheim) в метаноле. Аликвоты (0,5 мкл) этой смеси наносили на металлический держатель и высушивали феном.Avance DRX-600 спектрометре (Bruker, Rheinstetten) и 13C NMR-спектры на Bruker АМХ-360 спектрометре при 300 К в 2 Н 2 О. Перед каждым измерением пробы дважды лиофилизировали с дейтеризированной водой (2 Н 2 О). В качестве внешнего контрольного сигнала использовали ацетон (Н 2,225 частей на миллион, С 31,45 частей на миллион) или 85% Н 3 РО 4 ( 0 частей на миллион). Для получения NMR-данных использовали стандартное программное обеспечение Bruker (XWINNMR 1.3). Продолжительность перемешивания для TOCSY (total correlated spectroscopy - общей коррелированной спектроскопии) и соответственно NOESY (Nuclear Overhauser enhancement spectroscopy ядерной супер-увеличенной спектроскопии) составляла 100 и соответственно 500 мс. Серологические анализы Серологические анализы проводили как вестерн-блоттинг анализы, которые разрабатывали с тремя различными антителами. 1. Поликлональную анти-О 6-антисыворотку (кролик) получали от штамма DSM 6601 Е. coli (серотип О 6:К 5:Н 1) в Институте гигиены в Гамбурге (профессор Бокемюль). 2. Поликлональную анти-E.coli R1 антисыворотку (кролик, внутреннее обозначение: K299/d58) получали иммунизацией с мутантами шероховатой формы, один из которых имел R1-ядро (анти-R1). 3. Использовали моноклональное антитело(WN1-222-5, внутреннее обозначение F 167),которое широко перекрестно реагирует против 7 всех олигосахаридов ядра Е. coli с минимальной структурой (Rd). Таблица. Анализ компонентов, экстрагированных из Е. coli LPS из штамма DSM 6601 Молярное соотношение отдельных компонентов (в скобках) было стандартным благодаря наличию GalNAc и ClcNAc в О-цепи, при значении миристиновой кислоты (14:0) (1.0 моль 14:0/моль LPS).GlcN определено с помощью анализатора аминокислоты. Значение получено из суммыn.b. не определено. Полученные согласно описанному способуLPS-препараты подвергали электрофорезу на полиакриаламидном геле (PAGE) вместе со сравниваемыми LPS (ср. фиг. 1). Для полученияLPS-полосы окрашивали с помощью чувствительного щелочного метода серебрения ( С.М.gels, Anal. Biochem., 119, 1982, 115-119). Результат исследований представлен на фиг. 1. Пример 3. Биологическая активностьIL-1-активность определяли с помощью анализа MNC-пролиферации в надосадочной жидкости культуры. Моноциты человека (MNC) изолировали из периферической крови добровольных доноров (8 х 105 MNC/200 мл) и их переводили на стекло и одновременно перемещали с тестовым веществом. Для тестирования биологической активности in vitro клетки вначале стимулировали с LPS (10 нг/мл). После периода инкубации продолжительностью 8 ч исследовали 150 мл надосадочной жидкости культуры на высвобождение цитокинов. IL-1 активность определяли с помощью анализа пролиферации фибробластов в надосадочной жидкости культуры. Необходимые для этого фибробласты получали из крайней плоти человека. Пролиферация этих фибробластов повышалась 8 благодаря IL-1. Сравнением кривой действия дозы надосадочной жидкости культуры с кривой стандарта в пробит-анализе определяли биологическую активность в надосадочной жидкости культуры. LPS из известных эндотоксически активных штаммов бактерий (Salmonella friedenau) служит как ссылка (положительный контроль) и поэтому представлен на фиг. 5.TNF-активность в надосадочной жидкости культуры определяли анализом цитотоксичности с помощью TNF-чувствительной клеточной линии L929. Сравнение кривой действия дозы надосадочной жидкости культуры с кривой стандарта в пробит-анализе позволяет определить TNF-активность. Также здесь в качестве положительного контроля служит известный эндотоксически активный LPS из Salmonellafriedenau. Результаты представлены графически на фиг. 6. Результаты показывают, что в отношенииIL-1- и TNF-выделения нет никаких значительных различий между LPS из Salmonella friedenau, который служит в качестве стандарта и положительного контроля, и LPS, обнаруженном в штамме DSM 6601 (фиг. 5 и 6 изображения внизу). Это подтверждается также тем, что липоид А штамма DSM 6601 имеет почти одинаковую активность по покрытию как и высоко очищенный липоидом А из Е. coli (фиг. 5 и 6,изображения сверху). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Липополисахарид бактерий E.coli штамма DSM 6601, содержащий 8 фосфатных остатков и 0,5 моль P-Etn в расчете на молекулу,имеющий структуру, представленную на фиг. 7. 2. Способ получения липополисахарида по п.1, заключающийся в том, что промытую и высушенную бактериальную массу E.coli штаммаDSM 6601 подвергают экстракции смесью фенол/вода и полученный экстракт обрабатывают РНКазой, ДНКазой и протеиназой K. 3. Применение липополисахарида бактерий E.coli штамма DSM 6601 по п.1, в частности полученного в соответствии с п.2, для модулирования иммунной системы человека и животных, изменения биологической активности других микроорганизмов, получения иммуномодулирующих лекарственных средств для человека и животных, а также в качестве маркера или эталонного вещества для микробиологической или медицинской диагностики in vitro, в качестве иммуностимулятора для вакцинации человека и животных, в качестве основного материала для биотехнологического синтеза и изготовления иммуномодулирующих веществ.Hoist (1999) Eur. J. Biochem., 261, 629-639. Все сахара представлены в D-пиранозной форме. L,D-Hep, L-глицеро-D-манно-гептоза; Kdo Dманно-окт-2-улозоновая кислота, Р, фосфат. Замещение О-цепи на расположенной в стороне глюкозе (GlcIII), вместе с ее аномерией, впервые определено и изображено в настоящей заявке на выдачу патентаII,82) 2 LPS препарат 2 3 LPS препарат 3 4 свободно 5 E. coli O111 LPS 6 Pseudomonas aeruginosa тип Фишера 2 LPS 7 Salmonella minnesota R60 LPS Стрелки указывают на LPS полосы олигосахарида ядра и повторяющееся звено (R/S-мутант,полоса А) и соответственно на LPS со сложным олигосахаридом ядра (полоса В).Res., 131, 277-283. Все сахара находятся в D-пиранозной форме. В противоположность опубликованной Janssonet al. структуре О-цепи E.coli 06 первое повторяющееся звено S/R-мутанта E.coli DSM 6601 связано ргликозидически и впервые определено в настоящей заявке на патент, вместе с местом замещения на расположенной в стороне глюкозе (GlcIII) олигосахарида ядра (см. фиг. 4). Фиг. 3. Структура гексаацильного липоида A Escherichia coliBiochem., 50 (1994)211-276) Цифры в кружках обозначают число атомов углерода настоящей жирной кислоты. Свободная гидроксигруппа GlcN (II) представляет место связывания для Kdo (I) олигосахарида ядра. Фиг. 4. Структура основного каркаса углевода главной фракции в олигосахариде ядра E.coli R1: Фиг. 5. Зависимость от дозы высвобождения IL1 из моноцитов человека, индуцируемое с помощью: 1. липода A Escherichia coli (слева вверху) или липоидом А из штамма DSM 6601 E.coli (справа вверху) и 2. LPS из S.friedenau (слева внизу) и Escherichia coli штамм DSM 6601 (справа внизу). Фиг. 6. Зависимость от дозы высвобождения TNF из моноцитов человека, индуцируемое с помощью: 1. липоида A Escherichia coli (слева вверху) или липоида А из штамма DSM 6601 E.coli (справа вверху); и 2. Фиг. 7. Структура сложного липополисахарида (LPS) из Е. coli DSM 6601. В олигосахариде ядра фосфатные заместители Ри Etn в обеих гептозах HepI и HepII не являются стехиметрическими и поэтому обозначены закрашенными линиями. Позиция и аномерное связывание KdoI с липоидом А происходит по аналогии с другими LPS-структурами Е.