Штамм бактерий bifidobacterium bifidum 791/баг, используемый для получения жидкого концентрата бифидобактерий, кисломолочных лечебно-диетических продуктов и биологически активных добавок

1 Область техники Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и представляет собой штамм бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum, который может быть использован для получения жидкого концентрата бифидобактерий, а также для приготовления кисломолочных лечебно-диетических продуктов, бифидосодержащих биологически активных добавок(БАД) и препаратов-пробиотиков на основе указанного жидкого концентрата бифидобактерий. Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная,десенсибилизирующая, дезинтоксикационная,фермeнтaтивнaя, защитная и иммуностимулирующая. Препараты и продукты, содержащие в своем составе бифидобактерии, широко используются для профилактики и лечения дисбактериозов и нормализации микрофлоры кишечника людей, перенесших стрессовые воздействия,антибиотико- и химиотерапию. Предшествующий уровень техники За рубежом широко используют препараты-пробиотики и продукты лечебного питания на основе штаммов бифидобактерий видовB. bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve,В. infantis (патент Франции 2336886; патент Франции 2411008; патент Швейцарии 637297; патент ФРГ 2421066; патент Японии 05227946; патент США 4645667). Однако штаммы бифидобактерий зарубежных фирм-разработчиков ориентированы на создание преимущественно лечебно-профилактических препаратов и БАД в сухой форме (таблетки, капсулы). Указанные штаммы имеют существенные недостатки, если их использовать для приготовления препаратов и кисломолочных продуктов в жидкой форме: малые сроки хранения указанных препаратов и продуктов,низкие органолептические качества, которые несущественны для препаратов в сухой форме. Известен штамм вида B. bifidum1, выделенный из кишечника грудного ребенка, который широко используются в России для изготовления препаратов на его основе: сухой и жидкий бифидумбактерин, кисломолочный бифидумбактерин,Недостатком штамма B. bifidum1 является то, что, наряду с медленной ферментативной активностью в отношении сквашивания молока без ростовых факторов, штамм имеет также слабую антагонистическую активность в отношении патогенных микроорганизмов: золотистого стафилококка, шигелл, протея и патогенной кишечной палочки. Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения является штаммBifidobacterium bifidum791 выделен из ки 002614 2 шечника здорового грудного ребенка, депонирован в центральном Музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ЦМПМ В-3300 и характеризуется следующими признаками. Культурально-морфологические признаки Клетки палочковидные с V-образными раздвоениями на одном или двух концах, неподвижные, в мазке образуют скопления грамположительные. В 0,72% печеночном и гидролизатномолочном агарах образует колонии в виде гречишных зерен или дисков размером до 3 мм в диаметре. В жидких питательных средax растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Пигмента не образует. Физиолого-биохимические признаки Облигатный анаэроб, оптимальная температура 37,5 С, рН 7,2-7,4. Ферментирует лактозу с образованием уксусной и + молочной кислот, (закисляя средy выращивания до рН 4,0). Арабинозу, ксилозу, маннозу, целлобиозу, инулин, маннит, сорбит, салицин не ферментирует. Сбраживает молоко с образованием к 1618 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность,разжижение желатины - отсутствует. Кислотообразующая активность: к 24 ч 70 Тернера, к 72 ч - 90-100 Тернера (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной средe- до 100 Тернера и 200 Тернера соответственно. Антагонистические свойства Проявляет активность по отношению к шигеллам Зонне, Флекснера, энтеропатогенным кишечным палочкам, стафилококкам. ДНК штамма относится к выраженному ГЦ-типу с коэффициентом специфичности 1,58, молярный процент содержания ГЦ в ДНК равен 61,35. Устойчив к канамицину, мономицину, чувствителен к антибиотикам пенициллинового ряда,кефзолу, гентамицину. Однако штамм B. bifidum791 недостаточно устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при продвижении бифидобактерий штамма в желудочно-кишечном тракте, а, следовательно, недостаточны его жизнеспособность и колонизирующие свойства. Кроме того, к недостаткам штамма B. bifidum791 относится также то, что клетки этих бифидобактерий утилизируют преимущественно четыре аминокислоты (из четырнадцати): пролин, тирозин, лизин, триптофан, и в реакциях переаминирования синтезируют из них другие аминокислоты, что энергетически неоправдано, так как те же самые аминокислоты находятся в свободной форме в питательной среде. Раскрытие изобретения Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание такого штамма вида B. bifidum791/БАГ, который был бы 3 более устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тракта человека, обеспечивал бы утилизацию более широкого спектра аминокислот, т.е. обладал бы более высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами,что обеспечивало бы получение препаратов и продуктов на его основе с более длительными сроками хранения и более высокими лечебнопрофилактическими свойствами. Для получения штамма B. bifidum791/БАГ была проведена селекция штаммаB. bifidum791. Селекция проводилась без использования каких-либо химических и физических мутагенных агентов, посредством длительного поочередного культивирования в двух различных питательных средах: среде Блаурокка и стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов в течение 50 пассажей по следующим морфо-культуральным критериям: характерная морфология для культур видаB. bifidum: в среде Блаурокка гр+ палочки с бифуркацией, а в молоке без ростовых факторов палочки; скорость свертывания стерильного молока не более 20-22 ч; достижение титра бифидобактерий должно быть не менее lg 10 за срок культивирования не более 24 ч; срок хранения бифидобактерий в жидком виде должен быть не менее двух месяцев в стерильном обезжиренном молоке без ростовых добавок. Заявляемый штамм Bifidobacteriumbifidum791/БАГ хранится в лиофилизированном виде и депонирован в коллекции НИИ коллекций культур микроорганизмов ГНЦ ВБ"Вектор" подВ-686 (справка депонента 0599 от 14.10.1999 г. прилагается к материалам заявки) и характеризуется следующими признаками. Культурально-морфологические признаки Клетки палочковидные однородной морфологии, V-образные раздвоения на одном или двух концах встречаются крайне редко, неподвижные, в мазке образуют скопления грамположительные. В гидролизатно-молочной агаризованной среде образуют колонии в виде четких гвоздиков длинной 5-10 мм, толщиной 1-2 мм. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Пигмента не образует. Физиолого-биохимические признакиOблигатный анаэроб, оптимальная температура 37,5 С, рН 7,2-7,4. Ферментирует лактозу с образованием уксусной и + молочной кислот, (закисляя среду выращивания до рН 4,0). Арабинозу, ксилозу, маннозу, целлобиозу, инулин, маннит, сорбит, салицин не ферментирует. Сбраживает молоко без ростовых факторов с образованием к 16-18 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообра 002614- до 160 Тернера и 250 Тернера соответственно. Максимальный титр бифидобактерий через 24 ч роста в гидролизатно-молочной агаризованной среде составляет 1-5 х 1010. Максимальный титр бифидобактерий в молочной среде с ростовыми факторами: гидролизатом молока и автолизатом дрожжей, через 24 ч роста составляет (5-10) х 1010, через 30 дней хранения в этой среде - 2-5 х 1010. Максимальный титр бифидобактерий в молочной среде (стерильное обезжиренное молоко) без ростовых факторов через 24 ч роста составляет 1-2 х 1010, через 30 дней хранения в этой среде - 1-2x108. Бифидобактерии штамма полностью утилизируют девять свободных аминокислот в стерильном обезжиренном молоке без ростовых добавок: глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гистидин, аргинин. ДНК штамма относится к выраженному ГЦ-типу с коэффициентом специфичности 1,58,молярный процент содержания ГЦ в ДНК равен 61,35. Антагонистические свойства, устойчивость к антибиотикам Проявляет активность по отношению к шигеллам Зонне, Флекснера, энтеропатогенным кишечным палочкам, стафилококкам. Устойчив к кананицину, мономицину, чувствителен к антибиотикам пенициллинового ряда, кефзолу, гентамицину (см. табл. 1). Таблица 1 Сравнительные данные об антибиотической устойчивости штаммов В. Bifidum 791 и 791/БАГ Антибиотики Ампициллин Карбенициллин Оксациллин Кефзол Стрептомицин Канамицин Мономицин Тентамицин Левомицитин Тетрациклин Штамм бифи- Штамм бифидобактерий Вдобактерий 3330 ( 791)791/БАГ 0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 4 4 8 8 256 256 256 256 16 16 32 32 1 1 Анализ табл. 1 показывает, что заявляемый штамм и штамм-прототип в равной степени обладают устойчивостью к антибиотикам. Условия хранения (консервации и расконсервации) заявляемого штамма Штамм В. bifidum791/БАГ. 1-2-3 пассажей культивируют в молочной ростовой среде при температуре 37,5-38 С в течение 16-18 ч до формирования сгустка. Кислотность - 100 5- до 160 Тернера и 250 Тернера соответственно. Максимальный титр бифидобактерий через 24 ч роста в гидролизатно-молочной агаризованной среде составляет 1-5 х 1010. Максимальный титр бифидобактерий в молочной среде с ростовыми факторами: гидролизатом молока и автолизатом дрожжей, через 24 ч роста составляет (5-10) х 1010, через 30 дней хранения в этой среде - 2-5 х 1010. Максимальный титр бифидобактерий в молочной среде (стерильное обезжиренное молоко) без ростовых факторов через 24 ч роста составляет 1-2 х 1010, через 30 дней хранения в этой среде -1-2 х 108. Бифидобактерии заявляемого штамма полностью утилизируют девять свободных аминокислот в стерильном обезжиренном молоке без ростовых добавок: глицин; аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гистидин, аргинин. Результаты исследований, подтверждающие полезные свойства заявляемого штаммаB. bifidum791/БАГ Пример 1. Для выявления технологических особенностей и свойств заявляемого штамма проведены исследования штаммов B. bifidum791 и B.bifidum791/БАГ в молочной среде без ростовых факторов. Ниже (табл. 2) приведены ростовые и технологические характеристики штаммов Bifidumbifidum 791 и Bifidumbifidum 791/БАГ в молочной среде без ростовых факторов. 120 Тернера. К выращенной биомассе добавляют защитную среду высушивания с рН=7,4 (сахароза - 10%, желатин - 7-10%, пептон - 1-3%,аскорбиновая кислота) в количестве 25% от объма биомассы и обезжиренное молоко в количестве 25% биомассы. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при температуре -40-45 С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах в течение 24-36 ч. Полученный препарат содержит 0,5-1 х 109 живых клеток бифидобактерий. Согласно НТД на сухой бифидумбактерин (ФС 42-132 ВС-94) допускается содержание в одной дозе препарата не менее 107 живых клеток бифидобактерий. Лиофилизированный штамм B. bifidum791/БАГ в пеннициллиновых флаконах отличается хорошей сохранностью при температуре 6-8 С (в течение 3-4 лет без потери титра бифидобактерий). Поддержание жизнеспособности штамма производится из лиофилизированного препарата через 6-12 месяцев путем пяти пересевов (пассажей) в пробирках на печночной среде Блаурокка. На шестом пассаже пересев делается в молочную ростовую среду с ростовыми добавками вышеуказанного состава с целью получения биомассы для последующей лиофильной сушки и хранения в высушенном состоянии. Маркерными признаками штамма В.bifidum 791/БАГ, отличающими его от штамма-прототипа B. bifidum791 (ЦМПМ В 3300), являются следующие. Клетки палочковидные однородной морфологии. В гидролизатно-молочной агаризованной среде образуют колонии в виде четких гвоздиков длиной 5-10 мм, толщиной 1-2 мм. Таблица 2 Ростовые и технологические характеристики штаммов B. bifidum791 и B. bifidum791/БАГ в молочной среде без ростовых факторов Штамм Титр через Титр через 7 суток,30 суток,КОЕ/мл КОЕ/мл Анализ табл. 2 показывает, что заявляемый штамм по сравнению с прототипом наиболее полно использует ростовые ресурсы относительно бедной ростовой среды (обезжиренное молоко без ростовых факторов), имеет более высокие ростовые и технологические характеристики по сравнению со штаммом-прототипом,а именно: сокращено время сквашивания на 4 ч,повысился на порядок титр в готовом продукте,а по истечении 30 суток хранения в условиях холодильной камеры биологическая активность заявляемого штамма выше на два порядка. Кроме того, заявляемый штамм по сравнению с прототипом имеет высокую активность кислотообразования, что способствует накоплению летучих кислот в концентрате бифидобактерий,и, следовательно, повышенную антагонистическую активность продуктов, полученных с использованием данного штамма. При этом, как видно из табл. 2, заявляемый штамм является более устойчивым к действию летучих жирных кислот, поскольку длительное время сохраняет высокое количество жизнеспособных клеток при хранении (в 100 раз более высокое, чем штамм-прототип). Это очень важно при производстве лечебно-диетических кисломолочных продуктов, которые содержат ацидофильные бактерии или болгарскую палочку, являющиеся очень активными кислотообразователями. Кроме того, исследовались ростовые свойства штаммов B. bifidum 791 и B. bifidum 791/БАГ в гидролизатно-молочной агаризованной среде. Данные приведены в табл 3. Таблица 3 Рост штаммов в гидролизатно-молочной агаризованной среде Штамм Таким образом, из табл. 3 видно, что ростовая активность штамма 791/БАГ в гидролизатно-молочной агаризованной среде заметно выше при меньшей конечной кислотности(135 Т ) вместо (159 Т). При одинаковой кислотности титр у штамма 791/БАГ на один порядок выше. Пример 2. Использование штамма В. bifidum791/БАГ для приготовления жидкого концентрата бифидобактерий (ЖКБ). Штамм B. bifidum 791/БАГ выращивают в обезжиренном молоке, обогащенном гидролизатно-молочной и автолизатной ростовой добавкой, при температуре 37,5-38C в течение 1618 ч, до кислотности 100-130 Тернера. К 16-18 ч культивирования титр активных клеток бифидобактерий в 1 мл среды составляет lg 10,5-11 (с использованием штамма B. bifidum 791 накопление биомассы происходит к 18-24 ч и составляет lg 9,0-9,3). Биологически активную добавку (БАВД)"жидкий концентрат бифидобактерий" используют в качестве самостоятельного лечебнопрофилактического средства, в качестве биологически активной добавки, а также в качестве закваски для изготовления бифидосодержащих кисломолочных продуктов. Новые полезные биосинтетические и анаболические свойства отселектированного штамма позволили получить жидкий концентрат бифидобактерий с повышенными биологическими характеристиками: титр бифидобактерий в продукте увеличился с 1 х 109 до 3-5 х 1010 КОЕ/мл; сбалансировано потребление и содержание аминокислот в конечном продукте. Пример 3. Исследование аминокислотного состава продуктов, приготовленных на основе штамма B. bifidum 791/БАГ. Исследования аминокислотного состава продуктов, приготовленных на основе штаммаB. bifidum 791/БАГ, проводились на аминокислотном анализаторе "Biotronik" производства США. 8 Условия эксперимента 1. Подготовка пробы: осаждение общего белка сульфосалициловой кислотой; удаление белков центрифугированием. 2. Определение содержания свободных аминокислот в пробе выполнялось на аминокислотном анализаторе "Biotronik LC 5001" при следующих параметрах: колонка 3,2 х 385 мм "Biotronik resin 2710"; подвижная фаза: последовательность из пяти цитратных буферных растворов различной кислотности и ионной силы; скорость потока: буфер - 0,3 мл/мин, реагент - 0,55 мл/мин; объем пробы: 50 мкл; количественное определение с использованием калибровочного раствора аминокислот"Hamilton" (USA); детектирование: постколоночное окрашивание раствором нингидрина в ДMCO,Lvis-570 нм. Результаты анализа аминокислотного состава жидкого концентрата бифидобактерий приведены в табл. 4. Таблица 4 Содержание свободных аминокислот в жидком концентрате бифидобактерий на основе штаммаB. bifidum 791/БАГ (418,39 мг/л) Наименование Наименование Содержание,Содержание,незаменимых заменимых мг/л мг/л аминокислот аминокислот Треонин 13,11 Серин 7,72 Валин 34,67 Глутаминовая кислота 14,88 Метионин 12,87 Пролин 27,47 Изолейцин 15,51 Глицин 2,71 Лейцин 56,20 Аланин 27,37 Фенилаланин 38,0 Цистин Триптофан Тирозин 51,10 Лизин 32,38 Гистидин 45,04 Глутамин 6,83 Аспарагиновая кислота 0,4 Аргинин 32,13 ИТОГО 50% (209,57) ИТОГО 208,82 В жидком концентрате бифидобактерий на основе штамма B. bifidum 791 БАГ содержание свободных аминокислот повышено и достигает порядка 14,7%, из которых доля незаменимых аминокислот достигает 50.01%. Повышенное количество незаменимых аминокислот из общей суммы свободных аминокислот, особенно таких как валин - 8,3%, лейцин -13,4%, лизин - 7,7%, а также метионин - 3,1%, аминокислот с "разветвленной цепью" имеет важное физиологическое значение, поскольку эти аминокислоты наиболее активно участвуют в процессах синтеза белка. Так, недостаток валина приводит к расстройству координации движений, недостаток лейцина вызывает изменения в почках и щитовидной железе, недостаток лизина приводит к нарушению процессов кровообразования. В жидком концентрате бифидобактерий содержание аргинина повышено до 7,7%. Повышенное содержа 9 ние аргинина биологически важно, поскольку свободный аргинин способствует стимуляции иммунной системы организма, кроме того, он обладает антиоксидантными свойствами, что благоприятно сказывается на увеличении срока хранения жидкого концентрата бифидобактерий. Несмотря на повышенную утилизацию штаммом В. bifidum 791/БАГ свободных аминокислот во время роста бифидобактерий в молочной ростовой среде, обогащенной ростовыми факторами, в конечном продукте - жидком концентрате бифидобактерий, остается достаточно большое количество свободных аминокислот - 418,39 мг/л, особенно незаменимых. Кроме того, набор свободных аминокислот физиологичен, что подтверждается отношением концентраций аминокислот метионина/изолейцина, равным коэффициенту 0,83, достаточно близким к коэффициенту 1 (оптимальное физиологическое соотношение). В табл. 5 приведены данные аминокислотного анализа в молочной средe культивирования (обезжиренное молоко 11% СОМ без ростовых факторов) после 24 ч культивирования штаммов B. bifidum791 и B.bifidum791/БАГ. Таблица 5 Содержание свободных аминокислот в молочной среде Аминокислота Аспарагиновая к-та Треонин Серин Глутаминовая к-та Пролин Глицин Аланин Валин Метионин Изолейцин Лейцин Тирозин Фенилаланин Гистидин Лизин Аргинин Триптофан Содержание свободных аминокислот в гидролизатно-молочной среде культивирования после 24 ч культивирования штаммов B. bifidum 791 и B. bifidum 791/БАГ приведены в табл. 6. Таблица 6 Содержание свободных аминокислот в гидролизатно-молочной среде культивирования штаммов B. bifidum 791 и B. bifidum 791/БАГ Аминокислота Аспарагиновая к-та Треонин Серин Глутаминовая к-та Пролин 10 Глицин Аланин Валин Метионин Изолейцин Лейцин Тирозин Фенилаланин Гистидин Лизин Аргинин Триптофан Анализ табл. 5 показывает, что заявляемый штамм по сравнению с прототипом наиболее полно использует ростовые ресурсы относительно бедной молочной среды (обезжиренное молоко без ростовых факторов), максимально полно используя набор аминокислот, некоторые аминокислоты утилизируются в 15-20 раз лучше, чем у штамма-прототипа (за исключением пролина). Таким образом, заявляемый штамм имеет хорошие технологические характеристики при росте на простых молочных средах без добавления специализированных ростовых добавок, что дает возможность удешевить производство жидкого концентрата бифидобактерий. Из табл. 6 следует, что отмеченная высокая утилизирующая способность аминокислот из простой молочной среды (в обезжиренном молоке без ростовых добавок) практически не влияет на аминокислотный состав продуктов,полученных с использованием гидролизатов молока и автолизатов дрожжей. Это позволяет получать обогащенные витаминами и аминокислотами биологически активные добавки и продукты питания на основе данного штамма так же, как и с использованием штаммапрототипа. Пример 4. Исследование антагонистической активности штамма B. bifidum 791/БАГ. Антагонистическая активность штамма В. bifidum 791/БАГ была изучена методом invitro при совместном выращивании с патогенными тест-штаммами по зоне задержки роста тест-микробов методом штриховых кодов. Таблица 7 Сравнение антагонистических свойств штаммов Зоны задержки роста тест-культур,ммB. bifidum 791/БАГ и его колонизационная активность наиболее полно была изучена in vivo на организменно-популяционной модели - лабораторных мышах в хроническом эксперименте. Исследования были проведены на племенных мышах обоего пола колонии ICR в течение 3 лет на 18 поколении рандомбринга в количестве 900 самок и 450 самцов. Жидкий концентрат бифидобактерий производился на основе штамма B. bifidum 791/БАГ на молочной среде с добавлением ростовых факторов. Концентрат бифидобактерий применялся в дозе 0,1 мл на голову в сутки в течение 1 месяца ежедневно. Бактериологические исследования фекалиев мышей проводились в соответствии с методическими указаниями "Дисбактериоз кишечника и методы его лабораторной диагностики". Проводилось наблюдение за выживаемостью, весом мышей. На основании данных о числе желтых тел и мест имплантации живых и мертвых эмбрионов определяли пост- и преимплантационную смертность зародышей. Результаты бактериологического исследования молодняка 1 поколения, полученного от родителей, получавших жидкий концентрат бифидобактерий, показали, что произошло не только значительное снижение уровня патогенной и условно-патогенной микрофлоры, но и увеличение бифидо- и лактобактерий почти в равной степени с 105 до 108-109 микробных тел в 1 г фекалий (табл. 8). Бактериологические исследования фекалий племенного молодняка следующих поколе 12 ний показали наличие сформировавшегося барьерного эффекта гастро-инстестинальной микрофлоры по отношению к таким патогенным микроорганизмам, как Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium digficile, грибы Candida, Proteus и др. Это является результатом колонизирующей способности кишечника мышей штаммом B. bifidum 791/БАГ. Более раннее становление микрофлоры новорожденных мышат через коррекцию микрофлоры родителей обеспечило хорошую защищенность организма и возможность противостоять инфекции извне. Было исследовано влияние жидкого концентрата бифидобактерий на плодовитость животных (табл. 9). Величина помета мышей определяется количеством овулированных яйцеклеток, гибелью эмбрионов до и после имплантации. Гибель эмбрионов на ранней стадии до имплантации может увеличиваться с нарастанием степени инбридинга. Поздняя эмбриональная смертность - показатель состояния организма и проявляется на поздних сроках беременности. Как видно из табл. 9, прием концентрата бифидобактерий на основе нового штамма привел к полному исключению поздней эмбриональной смертности спустя 3 года, тогда как в начале экспериментов (1 год) она составляла 14,9%. Таблица 8 Бактериологические исследования кишечной микрофлоры молодняка мышей колонии ICR по годам Название микроорганизмов Количество микробов в 1 г фекалий мышей Племенной молодняк Племенной молодняк 1-й год 2-й год 108 106-109 9 10 106-1010 106-108 106-109 5 8 10 -10 105-108 105-106 105 105-106 105 105-107 105-106 105-107 105-108 102 104 103 Таблица 9 Влияние концентрата бифидобактерий на раннюю и позднюю эмбриональную смертность мышей в колонии ICR в течение 3-х лет Показатели биологической плодовитости Живые эмбрионы Мm Желтые тела Мm Места импланта Мm Смертность эмбриональная, % Анализ табл. 8 и 9 показывает, что применение жидкого концентрата бифидобактерий в течение трех лет, изготовленного на основе заявляемого штамма бифидобактерий B. bifidum791/БАГ, привело к элиминации из кишечника мышей патогенной микрофлоры и устойчи Потребление B. bifidum 791/БАГ 2-й год 13,40,2 14,50,6 13,60,4 4,5 1,3 вой колонизации бифидобактериями, что в итоге позволило значительно уменьшить падеж и позднюю эмбриональную смертность у мышей. Пример 5. Исследование длительности хранения штамма бифидобактерий В. bifidum 791/БАГ в жидком концентрате бифидобактерий. Увеличение сроков хранения жидкого концентрата бифидобактерий связано с решением проблемы нейтрализации активной кислотности препарата, наблюдающейся при хранении препарата, что приводит к отмиранию клеток бифидобактерий и, следовательно, к снижению их титра в препарате. Решением данной проблемы является выполнение, по крайней мере,двух условий: снижение начальной кислотности в готовом концентрате бифидобактерий до величин порядка 140 Т и получение исходного титра бифидобактерий (не ниже 3-5x1010 КОЕ/мл). Однако одновременное выполнение этих двух условий сталкивается с противоречием,поскольку увеличение титра бифидобактерий приводит к естественному повышению продуктов их метаболизма - молочной и уксусной кислот, следовательно, к повышению кислотности концентрата бифидобактерий (если не прибегать к искусственной коррекции рН продукта,нейтрализуя кислоты щелочными растворами). Указанные выше проблемы решены методом селекции при получении заявляемого штамма В.bifidum 791/БАГ, что подтверждается данными, приведенными в табл. 10. Таблица 10 Сохранность бактериальных клеток в жидком концентрате бифидобактерий при хранении в стандартных условиях и в условиях нейтрализации щелочью Штамм/исх. титр Титр бифидобактерий Услопри хранении, КОЕ/мл вия хране 2 4 6 2 мес. ния недели недели недель Как показали эксперименты, проведенные на концентрате бифидобактерий, полученных с использование штамма B. bifidum791/БАГ,нейтрализация активной кислотности от рН 5,6 ед. до рН 7,0 ед. (при помощи 10% раствораNaHCO3) существенно не влияет на сохранность бифидобактерий штамма B. bifidum791/БАГ(см. табл. 10). Однако добавление соды резко снижает органолептические показатели, создавая горький привкус. Разница в титрах бифидобактерий в экспериментальных образцах концентратов бифидобактерий, приготовленных с использованием заявляемого штамма, незначительно различается в процессе хранения, что свидетельствует о значительной кислотоустойчивости штамма. Это свойство позволяет использовать заявляемый штамм для производства продукции с длительным сроком хранения без гашения кислотности щелочными агентами. 14 Лучшие варианты применения заявляемого штамма B. bifidum791/БАГ Пример 6. Применение жидкого концентрата бифидобактерий в качестве БАД для иммунокоррекции организма человека. У вида бифидобактерий В. bifidum обнаружено наличие некоторых иммуностимулирующих и противовирусных свойств при вирусной (гриппозной) инфекции у детей дошкольного возраста. Снижение заболеваемости острой вирусной диареей (ротавирусы) также было отмечено у грудных детей в США после обогащения пищи бифидобактериями вида В. bifidum(Biotechnol. News, 1994,14, с.3). В этой связи применение препарата ЖКБ на основе штамма B. bifidum791/БАГ в условиях клиники на волонтерах проводилось в отделениях раннего детского возраста и эндокринном отделении Областной больницы г.Новосибирска. Концентрат бифидобактерий назначался не только с целью нормализации микрофлоры кишечника, но также в качестве иммуномодулятора. Обоснование лечебных доз концентрата бифидобактерий для человека, а также длительности их применения было проведено экспериментально на животных и на основе анализа литературных данных, касающихся применения указанных продуктов. Курс лечения составлял 4 недели. Бифидоконцентрат вводили перорально в организм детей в дозе lg 10 КОЕ/кг веса. У 80% больных отделения раннего детского возраста наблюдалась ликвидация дистрофического синдрома (10 человек из 15). У 60% больных отмечена тенденция увеличения содержания альбумина в сыворотке крови на 10-13%. Это свидетельствует о нормализации работы печени и селезенки,усилении их защитных функций. Причем жидкий концентрат бифидобактерий на основе штамма B. bifidum791/БАГ обладал свойствами иммунокоррекции. У одной больной из 12 наступила полная нормализация иммунологических показателей (по IgG) крови. Снижение уровня гликемии от 5,0 до 9,6 ммоль/л наблюдалось у всех больных. У 6 больных из 12 отмечена нормализация общего количества кишечных палочек. У 4 больных из 12 уменьшалось количество лактозонегативных энтеробактерий. У 8 больных из 12 нормализовалось количество бифидобактерий. Экспериментальные исследования на животных, профилактика и лечение больных людей в условиях стационара и амбулаторно показывают, что концентрат бифидобактерий, изготовленный на основе заявляемого штамма, обладает высокой антагонистической активностью и повышенным сроком сохранности при высоком титре, что позволяет использовать ЖКБ как серийный препарат для иммунокоррекции организма, лечить дисбактериозы бактериального и вирусного происхождения, диспепсию и дизентерию без применения антибиотиков. Пример 7. Получение лечебно-диетического кисломолочного продукта на основе концентрата бифидобактерий B. bifidum791/БАГ. Закваска - основная часть первичной микрофлоры кисломолочных продуктов, обогащает молоко микроорганизмами более чем в 100 раз. От ее свойств зависят процесс выработки и качество кисломолочных продуктов. Жидкий концентрат бифидобактерий, приготовленный на основе нового штамма B. bifidum791/БАГ,был использован для приготовления бифидосодержащих кисломолочных продуктов лечебнодиетического питания. В качестве основы используют молоко, которое нормализуют по массовой доле жира. Затем молоко подвергают "глубокой" пастеризации при температуре (922)С с выдержкой не менее 15 мин и охлаждают до температуры заквашивания 35 С. Сквашивают молоко в резервуарах для кисломолочных напитков с охлаждаемой рубашкой и снабженных специальными мешалками для равномерного перемешивания молочного сгустка. В молоко вносят производственную закваску на основе жидкого концентрата бифидобактерий (штамм В. bifidum791/БАГ) в количестве (2-5)% от массы нормализованной смеси. Полученную смесь сквашивают при температуре (351)С в течение (4,05,0) ч. Окончание сквашивания определяют по образованию достаточно прочного сгустка и кислотности, которая должна быть не более 80 Т. По окончании сквашивания продукт охлаждают до температуры (25-30)С, подавая в межстенное пространство резервуара ледяную воду. Затем сгусток перемешивают (10-15) мин. Перемешанный сгусток сразу же подают на розлив, а затем доохлаждают до температуры(62)С в холодильной камере в упакованном виде. Срок годности кисломолочного продукта,упакованного в тару с герметичной укупоркой,16 5 суток. Продукт прошел сертификацию в Центре сертификации пищевых продуктов Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава РФ, на него подучен Гигиенический Сертификат, согласованы ТУ и ТИ. Таким образом, из вышеизложенного следует, что для патентования предлагается новый отселектированный штамм бифидобактерийBifidobacterium bifidum791/БАГ, обладающий устойчивым проявлением вышеперечисленных свойств при последующем пассировании музейной культуры штамма на печеночной среде Блаурокка. Всего заявляемый штамм прошел 70 пассажей без изменения отселектированных свойств. Предлагаемый штамм бифидобактерийBifidobacterium bifidum791/БАГ по сравнению со штаммом-прототипом имеет следующие преимущества: увеличена биосинтетическая активность штамма и его ростовая активность по утилизации свободных аминокислот молочных питательных сред, которая возросла в 9-13 раз в отношении большинства свободных аминокислот; сохранность живых бифидобактерий в молочной среде культивирования увеличилась на 1-2 порядка; штамм обладает более высокими лечебнопрофилактическими свойствами; штамм обладает более длительными сроками хранения в жидком концентрате бифидобактерий. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм Bifidobacterium bifidum791/БАГ(коллекционныйВ-686 НИИ коллекций культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор"), используемый для получения жидкого концентрата бифидобактерий, кисломолочных лечебнопрофилактических продуктов и биологически активных добавок.