Способ лечения устойчивой к медикаментам инфекции mycobacterium tuberculosis

1 Область изобретения Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения устойчивой к медикаментам инфекции Mycobacterium Tuberculosis. В соответствии с настоящим изобретением обеспечивается способ использования пенициллина с ИНГ(изониазид, или гидразаин изоникотина) (INH). Это уменьшает МИК (минимальную ингибирующую концентрацию) (MIC) ИНГ и делает устойчивые организмы чувствительными. Существующий уровень техники Изониазид является наиболее широко используемым противотуберкулезным медикаментом. Штаммы mycobacterium обычно ингибируются при концентрации 0,2 мкг/мл или менее. Если определенный штамм не ингибируется концентрацией ИНГ 1,0 мкг/мл, он помечается как устойчивый к медикаментам штамм. InhA, зависимая от NADH (аденинового динуклеотида никотинамида) эноцилациловая несущая белковая редуктаза, является первичной целью для данного медикамента (Miesel L. et al., 1998). Реактивная форма изониазида ингибирует inh-A путем реагирования с кофактором NADH в активном ферментном сайте, формируя ковалентную добавку (изоникотиновый ациловыйNADH), которой свойственно связываться с высоким сродством. Существует более чем один механизм, посредством которого mycobactertium становится устойчивой к ИНГ. Сопротивляемость к изониазиду может появляться при увеличении экспрессии inh-A или за счет мутаций, которые снижают сродство фермента с NADH (Miesel L.et al., 1998). Оба этих механизма сопротивляемости наблюдаются в 30% клинических туберкулезных изолятов. Мутации в katG, который кодирует пероксидазу каталазы, являются наиболее общим источником сопротивляемости(Miesel L. et al., 1998). Еще один механизм устойчивости к изониазиду заключается в дефектах NADH-дегидрогеназы(Ndh) дыхательной цепи. Генетические исследования показывают, что мутации Ndh обеспечивают сопротивляемость путем снижения скорости окисления NADH и увеличения внутриклеточного соотношения NADH/NAD+. Увеличенная экспрессия AphC предполагается в качестве еще одного механизма сопротивляемости mycobacteria к ИНГ (Telenti A. etT.M. et al., 1996). Для лечения устойчивого к ИНГ туберкулеза, в том числе туберкулеза, устойчивого к комбинациям медикаментов, используются такие медикаменты, как ципрофлоксацин, канамицин, протионамид и т.д. вместе с прочими первичными медикаментами. Инфекция, вызванная устойчивыми организмами, встречается все чаще и становится главной проблемой. Предпринимаются попытки открыть новые режимы, новые медикаменты 2 для минимизации возникновения этой проблемы, а также для ее эффективного решения. Обработка устойчивой инфекции содержит использование медикаментов, к которым чувствительны организмы. Пенициллин является старейшим доступным антибиотиком и все еще используется сегодня. Он был оценен для лечения различных инфекций, в том числе микобактериальных инфекций (US Public Health Service General Research Support, 1973). Было обнаружено, что использование только пенициллина не является терапевтически эффективным при лечении туберкулеза. МИК пенициллинов против mycobacterium достаточно высока. Существует возможность достичь терапевтической концентрации пенициллинов, требуемой для эффективного лечения инфекции. Предпринимались попытки преодоления данной проблемы путем комбинирования пенициллинов с ингибиторами бета-лактамазы. Одно из таких исследований оценивало ампициллин в комбинации с ингибитором бета-лактамазы(клавулановая кислота, BL-P2013 или BLP2090) в соотношении 1:1, исследование проводилось Sorg T.B. et al., 1987. МИК одного ампициллина составляла 32 мкг/мл, но в комбинации с клавулановой кислотой она составляла 4 мкг/мл. Комбинация клавулановой кислоты и ампициллина была наиболее активной комбинацией при МИК 90, равной 11 мкмоль. Использование только ингибиторов бета-лактамазы было неэффективным при наивысших протестированных концентрациях. Другие исследования показали, что ампициллин-сульбактам имеет бактерицидный эффект при очень высоких концентрациях (15 мкг ампициллина на мл) in vitro на экспоненциально-фазовых культурах М. tuberculosis, что показывает его полезность только на ранней стадии противотуберкулезного лечения (Herbert D. etal., 1996). Однако мала вероятность их эффективности в качестве стерилизующих медикаментов, помогающих убить устойчивые поражающие бациллы. Исследования, проведенныеCynamon C.H. et al., 1983, и Wong C.S., 1988,открыли, что комбинация амоксициллинклавулановая кислота была бактерицидной при концентрациях амоксициллина 4 мкг/мл и клавулановой кислоты 2 мкг/мл в 14 из 15 протестированных штаммах. Даже в этом случае требуемая доза очень велика. Все вышесказанное относится к штаммам,чувствительным к медикаментам. Вышеупомянутое использование комбинации ингибитор бета-лактамазы-пенициллин не фокусировалось на устойчивых ко многим медикаментам штаммах М. tuberculosis. Пенициллин до сих пор не испытывался для обращения сопротивляемостиmycobacterium к ИНГ. Он также не был успешно использован при лечении устойчивой микобактериальной инфекции. 3 Комбинация амоксициллина и ингибитора бета-лактамазы, клавулановой кислоты, была оценена клинически для лечения устойчивого к нескольким медикаментам М. tuberculosis как не имеющая успеха (Nadler J.P. et al., 1991). В еще одном исследовании, проведенном Nakagawa etal. (1999), комбинация ингибитора беталактамазы и пенициллина оценивалась клинически на 4 пациентах с устойчивым к нескольким медикаментам туберкулезом. 2 пациента прекратили терапию из-за диареи, а оставшиеся двое продолжили лечение, но устойчивый к нескольким медикаментам туберкулез оставался положительным в ходе оставшегося периода терапии. Добавление этамбутола значительно снижает МИК амоксициллина для изолятов с 16 мг/л до 0,5 мг/л (Abate G. et al., 1998). Альтернативными подходами были использование альтернативных медикаментов,таких как кларитромицин, для преодоления проблемы сопротивляемости нескольким медикаментам (Cavaliery S.J. et al., 1995). Ципрофлоксацин использовался в случаях вновь продиагностированного легочного туберкулеза (Frederick A. et al., 1997). Однако опасность устойчивости к ципрофлоксацину для устойчивых к нескольким медикаментам штаммов вызвала озабоченность (Fattorini L. et al., 1999). Была сделана одна попытка увеличения восприимчивости устойчивого к нескольким медикаментам М. tuberculosis по отношению к противотуберкулезным медикаментам (Jagannath С. et al., 1995). Данное исследование использовало этамбутол и диметилсульфоксид. Предварительная обработка этими соединениями усиливала активность противотуберкулезных медикаментов по отношению к устойчивым к нескольким медикаментам штаммам М. tuberculosis. Ссылки 1. Sacchettini J.C., Blanchard J.S. The structure and function of the isoniazid target in M. tuberculosis. Res. Microbiol. 1996; 147: 36-43. 2. Zhang Y., Young D. Strain variation in theof ampicillin/sulbactam against intracellular mycobacteria. Int. J. Antimicrob. Agents 1999; 13(2): 133-5. Сущность изобретения Настоящее изобретение преодолевает проблему устойчивости к ИНГ посредством пенициллина. В соответствии с настоящим изобретением обнаружено, что пенициллины вызывают уменьшение МИК ИНГ для устойчивых к нескольким медикаментам штаммов Mycobacterium tuberculosis и делают их чувствительными к ИНГ. Штаммы mycobacterium, которые не ингибировались ИНГ при концентрации 1,0 мкг/мл посредством способа агаровой пластины, ингибировались ИНГ при добавлении к ним от 1,0 до 2,0 мкг/мл пенициллинов. Данная концентрация пенициллина может быть достигнута путем использования терапевтической дозы пенициллина. Описание изобретения Настоящее изобретение использует пенициллины для преодоления проблемы устойчивости к ИНГ. Это было достигнуто за счет использования пенициллинов в комбинации с ИНГ. Сами по себе пенициллины не обладают активностью против М. tuberculosis при дозировке, которая используется или может быть использована. Но при комбинировании с ИНГ они улучшают профиль чувствительности(МИК) ИНГ. Штаммы, устойчивые к ИНГ, становятся чувствительными к ИНГ. Штамм считается устойчивым, если он не ингибируется при 1,0 мкг/мл. В целях демонстрации обращения микобактериальной устойчивости к ИНГ был использован способ агаровой пластины. Пример.I. Приготовление среды LJ с помощью комбинации медикаментов (пенициллина и ИНГ). Раствор изониазида и пенициллина был приготовлен так, чтобы получить эффективность 10000/мл. Использовались три концентрации ИНГ(0,1, 0,2 и 1,0 мкг/мл) совместно с пенициллином. Подходящий раствор смешивался со сре 7 дой LJ так, чтобы получались желательные конечные концентрации, как показано ниже. Все колбы и трубки маркировались перед использованием с помощью обозначения медикамента и его конечной концентрации. Примечание: Подчеркнутые значения относятся к изониазиду. Значения, приведенные жирным шрифтом, относятся к пенициллину. ИНГ 0,1+пенициллин: 8 ции, (0,25, 0,5, 1,0 и 2,0) для определения МИК. В третьей группе брались ИНГ 0,1 и клоксациллин, и снова использовались четыре подобные концентрации. Таким образом, в каждой группе использовалось 4 бутылки LJ для каждого штамма М. tuberculosis. В целом для одного штамма для определения МИК использовалось 12 бутылок. Эксперименты проводились более 1 раза для достоверности. В конце срока все бутылки исследовались на наличие или отсутствие роста. Результаты для 10 штаммов показаны ниже в таблице:II. Оценка различных пенициллинов для обращения устойчивости mycobacterium к ИНГ. Пример IIА. Клоксациллин. 10 штаммов (клинические изоляты) М. tuberculosis с различными чувствительностями и устойчивостями к противотуберкулезным медикаментам первого ряда оценивались с помощью различных комбинаций концентраций ИНГ (0,1,0,2 и 1,9) и клоксациллина (0,25, 0,5, 1,0 и 2,0), и для каждой группы была определена МИК. Были составлены три группы: одна группа содержала ИНГ 0,2 и клоксациллин, и в ней использовались четыре концентрации, 0,25, 0,5,1,0 и 2,0 для определения МИК. В другой группе использовались ИНГ 0,2 и клоксациллин, и в ней также использовались четыре концентра Примечания: ОР: отсутствие роста Все концентрации медикаментов приводятся в мкг/мл ИНГ - изониазид, РИФА - рифампицин,ЭМБ - этамбутол, CM -стрептомицин. Было обнаружено, что штаммы, устойчивые к ИНГ при более чем 1,0 мкг/мл, становятся чувствительными к ИНГ при 0,1 мкг/мл, если вместе с ним используется клоксациллин с концентрацией 2,0 мкг/мл. Все штаммы становятся чувствительными к ИНГ с концентрацией 1,0 мкг/мл в присутствии 1,0 мкг/мл клоксациллина. Изменение профиля чувствительности зависит от количества ИНГ+клоксациллина. Открытия также предполагают, что требуется количество ИНГ и клоксациллина больше,если организм устойчив по отношению к большему количеству медикаментов. Также предполагается, что концентрация клоксациллина более важна, чем концентрация ИНГ, поскольку 2,0 мкг/мл клоксациллина являются эффективной концентрацией для всех штаммов, независимо от концентрации ИНГ. Пример IIB. Амоксициллин. Подобным же образом был также оценен амоксициллин. Амоксициллин оценивался при концентрациях 1,0 и 2,0 мкг/мл. Примечания: ОР: отсутствие роста Все концентрации медикаментов приводятся в мкг/мл ИНГ - изониазид, РИФА - рифампицин,ЭМБ - этамбутол, CM - стрептомицин Эти данные показывают, что результаты,полученные для амоксцилина, идентичны тем,то наблюдались для клоксациллина. 1. Для штаммов, устойчивых только к ИНГ, МИК представляется равной 1 мкг/мл. 2. Для штаммов, устойчивых к ИНГ, рифампицину и этамбутолу, МИК находится в диапазоне от 1 до 2 мкг/мл. 3. Для штаммов, устойчивых ко всем 4 медикаментам, может потребоваться МИК, равная 2 или выше. Пример IIC. Комбинация пенициллина. Клоксациллин является пенициллином узкого спектра с большим воздействием на организм, производящий бета-актамазу и/или пенициллиназу, в то время, как амоксициллин является пенициллином широкого спектра, но не имеет активности на организмы, производящие бета-лактамазу или пенициллиназу. Чтобы установить, какой из них более полезен, те же самые клинические изоляты, для которых оценивался амоксициллин, оценивались с различными концентрациями комбинаций амоксициллина и клоксациллина. Использованные комбинации содержали амоксициллин и клоксациллин в соотношении 1:1, 1:2 и 1:4 соответственно. Примечания: ОР: отсутствие роста Все концентрации медикаментов приводятся в мкг/мл ИНГ - изониазид, РИФА - рифампицин,ЭМБ - этамбутол, CM - стрептомицин Примечания: ОР: отсутствие роста Все концентрации медикаментов приводятся в мкг/мл ИНГ - изониазид, РИФА - рифампицин,ЭМБ - этамбутол, CM - стрептомицин Примечания: ОР: отсутствие роста Все концентрации медикаментов приводятся в мкг/мл ИНГ - изониазид, РИФА - рифампицин,ЭМБ - этамбутол, CM - стрептомицин Результаты показывают, что для обращения устойчивости к ИНГ все пенициллины имеют идентичное воздействие при использовании отдельно или в сочетании друг с другом. Вышеприведенный пример ясно демонстрирует, что пенициллины обращают устойчивость mycobacterium к ИНГ. Примеры также показывают требуемое количество пенициллинов для снижения МИК ИНГ для устойчивых к ИНГ mycobacterium. Требуемое количество легко достигается в клинических условиях без обратных эффектов. Известно, что требуемое количество пенициллинов для обращения устойчивости к ИНГ(от 1 до 2 мкг/мл для клоксациллина, амоксициллина или их комбинации) достигается и поддерживается посредством терапевтических доз амоксициллина или клоксациллина. Соответственно, впервые демонстрируется, что устойчивые к нескольким медикаментамmycobacterium могут обрабатываться терапевтическими количествами двух медикаментов,например, пенициллинами и ИНГ. Оба медикамента используются на протяжении долгого времени, и установлена их безопасность и эф 11 фективность даже после длительного использования. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения устойчивой к медикаментам туберкулезной инфекции у животного,включающий введение упомянутому животному пенициллина и изониазида (ИНГ). 2. Способ по п.1, в котором пенициллин вводится одновременно с ИНГ. 3. Способ по п.1, в котором пенициллин и ИНГ вводятся последовательно. 4. Способ по пп.1-3, в котором пенициллин может быть пенициллином широкого спектра или пенициллином узкого спектра. 5. Способ по пп.1-4, в котором пенициллин может быть любым отдельным пенициллином или комбинацией более чем одного пенициллина. 6. Способ по пп.1-5, в котором пенициллин может иметь активность по отношению к производящему бета-лактамазу организму. 12 7. Способ по пп.1-4, в котором пенициллин может быть активным по отношению к производящему пенициллиназу организму. 8. Способ по пп.1-5, в котором пенициллин может выбираться из группы пенициллинов,содержащей бензилпенициллин, феноксиметилпенициллин, пропициллин, клемизол пенициллин, прокаин пенициллин, фенетициллин, гетациллин, метамипициллин, пивампициллин, циклациллин, эпициллин, певмециллинам, апалциллин, аспоксициллин, темоциллин, метициллин, оксациллин, нафциллин, ампициллин,амоксициллин, карбенициллин, тикарциллин,азлоциллин, мезлоциллин, пиперациллин, клоксациллин, диклоксациллин, ленампициллин,бакампициллин, азидоциллин, талампициллин,мециллинам, флуклоксациллин, азтреонам,имипинем, меропенем и тому подобные. 9. Способ по п.1, в котором пенициллин может вводиться по пероральному, парентеральному или ректальному маршруту. 10. Способ по п.1, в котором пенициллин и ИНГ могут вводиться отдельно или в виде комбинации в одной фиксированной дозировке.