Способ получения полимерных конъюгатов доксорубицина с контролируемым ph высвобождением лекарственного средства

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ КОНЪЮГАТОВ ДОКСОРУБИЦИНА С КОНТРОЛИРУЕМЫМ pH ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА Способ получения полимерных конъюгатов N-(2-гидроксипропил)метакриламида и метакрилоиламиноацилгидразона доксорубицина с контролируемым pH высвобождением лекарственного средства, включающий следующие три стадии синтеза: (а) получение мономерного метакрилоиламиноацилгидразина, где аминоацил происходит из аминокислоты или олигопептида, путем реакции метакрилоилгалида с соответствующим пептидом, аминокислотой или производным указанных веществ, и последующий гидразинолиз, (б) синтез полимерного предшественника путем прямой сополимеризации N-(2-гидроксипропил)метакриламида и метакрилоиламиноацилгидразина и (в) связывание доксорубицина и полимерного предшественника путем реакции последнего с гидрохлоридом доксорубицина. 015091 Область техники Изобретение относится к способу получения водорастворимых полимерных противораковых лекарственных средств, позволяющих осуществлять целенаправленную доставку и контролируемое высвобождение цитостатиков в организме, предпочтительно в раковой ткани и раковых клетках. Применение полимерных конъюгатов сфокусировано на целенаправленной терапии опухолевых заболеваний при лечении человека. Уровень техники Разработка новых фармакологически активных веществ, в частности противоопухолевых лекарственных средств, все настойчивее фокусируется на таких формах, которые делают возможным специфическое действие действующего вещества только в конкретной ткани или даже только в конкретном типе клеток. Для получения таких веществ все интенсивнее использовались природные или синтетические макромолекулы - полимеры. Были получены и изучены многие противораковые полимерные конъюгаты и было показано, что в большинстве случаев необходимо, чтобы цитотоксическое вещество высвобождалось из его полимерной формы, если полимерная форма лекарственного средства является фармакологически эффективной. Кроме того, было показано, что подходящая молекулярная масса полимерного носителя может обеспечить предпочтительное депонирование полимерного лекарственного средства в раковой ткани многих солидных опухолей (так называемый EPR эффект, или эффект повышенной проницаемости и удерживания (enhanced penetration and retention) [Maeda et al. 2000]. Высвобождение цитостатического агента из полимерного носителя можно обеспечить, используя биологически разрушаемую связь, применяемую для связывания лекарственного средства с полимером, разрушение которой в целевой ткани приводит к целенаправленной и контролируемой активации лекарственного средства предпочтительно в указанной ткани. Полимерные лекарственные средства, основанные на сополимерах N-(2 гидроксипропил)метакриламида (HPMA), представляют собой важную группу таких лекарственных средств. Очень хороший обзор научных результатов в данной области, полученных вплоть до настоящих дней, можно найти в монографии G.S. Kwon и в публикации J. Kopeek et al. [Kopeek et al., 2000, Kwon,2005]. Недавно были опубликованы результаты исследований действия полимерных лекарственных средств, в которых противоопухолевое лекарственное средство доксорубицин связано с полимерным носителем, основанным на сополимерах HPMA, посредством нестабильной по отношению к гидролизу гидразоновой связки [Etrych et al., 2001 и 2002, hov et al., 2001, Ulbrich et al., 2003, 2004], и указанные вещества были запатентованы [Ulbrich et al.]. Данные лекарственные средства характеризовались значительно сниженными побочными, особенно токсическими, эффектами в отношении здорового организма,в то же время значительно увеличенным противоопухолевым эффектом по сравнению с традиционно применяемыми цитостатиками [hov et al., 2001, Kov et al., 2004, Hovorka et al., 2002]. Синтез таких конъюгатов осуществляли сначала в ходе реакции полимерных 4-нитрофениловых эфиров (ONp) с гидразином, подобной реакции полимеризации, а затем путем сополимеризации HPMA и защищенных при помощи N-Boc (t-бутилоксикарбонил) метакрилоилированных гидразидов. Ни один из способов не привел к образованию препаратов с установленным составом (в случае ONp эфиров происходят реакции переноса и гидролиза части ONp групп во время гидразинолиза; в случае Boc-гидразидов происходят реакции деградации во время снятия защитных гидразидных групп), и ни один из способов не предоставил возможности выбора из полимерных цепей в широком диапазоне молекулярных масс; синтез не позволил получать серии большого размера, и воспроизводимость способа производства индивидуальных серий была сравнительно мала. Более того, синтез включал несколько стадий, что увеличивало временные и финансовые затраты. Описание изобретения В настоящем изобретении предложен оптимизированный и воспроизводимый способ получения полимерных цитостатиков на основе сополимеров HPMA, содержащих доксорубицин, связанный чувствительной к pH гидразоновой связкой с полимерным носителем, который устраняет практически все вышеупомянутые недостатки ранее опубликованных способов получения; в частности, он позволяет увеличить выходы на стадии синтеза как мономеров, так и полимерного предшественника, точно контролировать молекулярные массы полимерных предшественников и конечного продукта, при этом структура благодаря выгодным параметрам реакции сополимеризации является установленной, синтез значительно проще и дешевле, возможно масштабирование с получением серий большого размера и воспроизводимость синтеза очень высока. Противоопухолевая активность полимерных цитостатиков, полученных в соответствии с изобретением, является такой же или даже лучшей, чем активность цитостатиков, полученных способами, известными из уровня техники. Объект изобретения представляет собой способ получения полимерного конъюгата сополимераHPMA, содержащего доксорубицин, связанный с полимером посредством различных связок, содержащих гидразоновые связи, которые могут подвергаться гидролитическому расщеплению. Способ получения основан на трехстадийном синтезе, включающем синтез мономеров, синтез полимерных предшественников и, наконец, связывание доксорубицина и полимерного носителя ковалентной гидразоновой связью. Синтез мономеров начинают с синтеза мономера HPMA согласно ранее описанному способу[Ulbrich, 2000]. Синтез метакрилоил(аминоацил)гидразинов, отличающихся структурой ацильного компонента, был очень похож для всех полученных мономеров, и его начинали с метакрилоилирования гидрохлорида метилового эфира соответствующей аминокислоты или олигопептида метакрилоилхлоридом,которое осуществляли в дихлорметане в присутствии безводного карбоната натрия. Конечный продукт превращали в метакрилоилированный аминоацилгидразин путем гидразинолиза соответствующего метилового эфира при помощи гидразингидрата, который осуществляли в растворе в метаноле в присутствии гидроксида натрия. В качестве аминоацильного остатка в метакрилоил(аминоацил)гидразинах преимущественно использовали глицил, глицилглицил, -аланил, 6-аминогексаноил, 4-аминобензоил или комплекс ацильных остатков, происходящих из олигопептидов GlyPheGly, GlyLeuGly или GlyPheLeuGly. В качестве примеров синтеза метакрилоил(аминоацил)гидразина в примере 1 показан синтез 6-метакроил(аминогексаноил)гидразина как пример синтеза для простого ацильного остатка (в качестве спейсера), метакроилглицилглицилгидразина как мономера с дипептидным спейсером и метакроилглицил фенилаланил лейцилглицилгидразина как мономера с ферментативно расщепляемым олигопептидом. Синтез полимерных предшественников - сополимеров HPMA и метакрилоилированных аминоацилгидразинов - основан на прямой радикальной сополимеризации HPMA с соответствующими метакрилоилированными гидразинами. Полимеризацию осуществляют в растворе с использованием метанола,этанола, диметилсульфоксида (ДМСО) или диметилформамида (ДМФА) в качестве среды полимеризации. В обоих случаях полимеризацию инициируют при помощи термически разлагаемых инициаторов радикальной полимеризации на основе азо- или пероксиинициаторов. Предпочтительно использовали азо-бис-(изобутиронитрил) (AIBN), азо-бис-(изоциановалериановую кислоту) (ABIC) или диизопропилперкарбонат (DIP). Температура полимеризации зависит от использованного инициатора и растворителя(AIBN, ABIC в метаноле, этаноле, ДМФА и ДМСО, от 50 до 60C; DIP, от 40 до 50C). Полимеризация обычно протекает в течение 15-18 ч. Получение всех полимерных предшественников путем радикальной полимеризации проводят аналогичным образом; примеры сополимеризации HPMA и метакрилированных гидразидов приведены в примерах с 2 а до 2 в. В отличие от применявшегося ранее гидразинолиза реакционноспособных сложных эфиров или сополимеризации Вос-защищенных гидразидов, прямая сополимеризация приводит к получению воспроизводимых полимеров определенной структуры, которые можно получить в виде серий больших размеров и с высокими выходами. Связывание доксорубицина и полимерного предшественника является результатом реакции связывания гидрохлорида доксорубицина и полимеризованного ацилгидразина, приводящей к образованию гидразоновой связи. Реакцию предпочтительно проводят в метаноле, причем в качестве катализатора выступает некоторое количество уксусной кислоты. Реакцию можно также проводить в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, обезвоженном этаноле и диметилацетамиде. При использовании растворителей, отличных от метанола, реакция протекает успешно, но дает более низкий выход. Влияние структуры связки на ход протекания реакции связывания является минимальным. Для обеспечения оптимального выхода реакции связывания и минимального количества несвязанного доксорубицина в продукте важно во всех случаях поддерживать следующие концентрации полимерного предшественника и уксусной кислоты в реакционной смеси: концентрация полимерного предшественника 170 мг/мл, концентрация уксусной кислоты 55 мг/мл. Оптимальное время реакции составляет 22 ч при 25C. Полимерное лекарственное средство выделяют из реакционной смеси путем осаждения в этилацетате и переосаждения из метанола снова в этилацетате. Получение полимерного доксорубицина, связанного с полимерным предшественником - сополимером поли(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) - гидразоновой связкой (PHPMAAH-NH-N=DOX) приведено в примере 3. Получение также включает, хотя это не является необходимым, конечную очистку конъюгата от свободного несвязанного лекарственного средства путем гель-фильтрации с использованием колонкиSephadex LH-20 и метанола в качестве подвижной фазы. Краткое описание чертежа На чертеже представлен график, показывающий высвобождение доксорубицина (DOX) из полимерных конъюгатов, отличающихся по структуре связки (спейсера) между лекарственным средством и полимером. Температура: 37C, фосфатный буфер, pH 5,5. GFLG представляет собой связку, образованную последовательностью -GlyPheLeuGly-, GLG представляет собой -GlyLeuGly-, аминобензойная связка (Aminobenzoic) представляет собой 4-аминобензоил и Асар представляет собой 6-аминогексаноил. Примеры Пример 1. Синтез мономеров.HPMA получали согласно ранее описанному способу [Ulbrich et al., 2000]. Элементный анализ: рассчитано: C 58,8%, H 9,16%, N 9,79%. Найдено: C 58,98%, H 9,18%, N 9,82%. Продукт являлся хроматографически чистым. 6-(Метакроиламино)гексаноилгидразин (MA-AH-NHNH2). Метил(6-аминогексаноат)гидрохлорид (30 г, 0,165 моль) растворяли при интенсивном перемешивании при комнатной температуре в 350 мл дихлорметана с добавлением приблизительно 100 мг гидрохинона. Раствор охлаждали до 10-15C, добавляли безводный карбонат натрия (50 г, 0,48 моль), понижали температуру до 5-10C и затем раствор метакроилхлорида (17,3 г, 0,165 моль (эквивалентное количест-2 015091 во в 100 мл дихлорметана добавляли по каплям с такой скоростью, чтобы температура реакционной смеси не превышала 15C. После расходования всего метакроилхлорида смесь перемешивали при 15-20C в течение еще 45 мин, затем удаляли охлаждающую баню, суспензию перемешивали в течение еще 20 мин, отсасывали через фильтр из спеченного стекла 3, промывали 300 мл дихлорметана и выпаривали фильтрат досуха в роторном вакуумном испарителе. Остаток после упаривания растворяли в 150 мл метанола, затем добавляли гидразингидрат (13 мл 13,4 г, 0,267 моль) и NaOH (1,5 г, 37,5 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. После завершения гидразинолиза pH раствора доводили до 6,2-6,5 добавлением 35% HCl (приблизительно 12 мл), добавляли 300 г безводного сульфата натрия и смесь, включая осушитель, выпаривали досуха. К упаренному остатку добавляли 500 мл дихлорметана, интенсивно перемешивали суспензию в течение 2 ч, отсасывали через фильтр из спеченного стекла 4, тщательно промывали еще 500 мл дихлорметана и концентрировали фильтрат до 150-200 мл в испарителе. Раствор разбавляли 1500 мл этилацетата, концентрировали до объема, равного 300-350 мл, в испарителе с целью провести кристаллизацию и оставляли для кристаллизации в морозильнике на 24 ч. Продукт отсасывали, промывали небольшим количеством холодного этилацетата и высушивали в вакууме. Выход после первой кристаллизации составлял 29,5 г продукта(84%) с температурой плавления, равной 79-81C; при повторной кристаллизации с использованием того же способа получили 27,0 г продукта (77%) с температурой плавления, равной 80-82C. Элементный анализ: рассчитано: C 56,32, H 8,98%, N 19,70%. Найдено: C 56,49%, H 8,63%, N 19,83%. H-NMR (ядерный магнитный резонанс для изучения динамики протонов водородной связи) при частоте 300 МГц (дейтерированный хлороформ, температура 297 К): 1,35 m (2H, CH2(CH2)2-N); 1,50-1,69 m (4H,CH2CH2CH2CH2-N); 1,95 dd (3H, CH3); 2,17 t (2H, C=O)-CH2); 3,26 dt (2H, N-CH2); 3,91 s (2H, NH2); 5,30t (1H, C=CH2 E); 5,67 t (1H, C=CH2 Z); 6,10 s (1H, NHNH2); 7,45 s (1H, NH-CH2). Продукт являлся хроматографически чистым, 1 пик при времени удерживания 4,72 мин (колонка для обращенно-фазовой хроматографии Tessek SGX C18 (7 мкм, 1254 мм), скорость потока 0,5 мл/мин, градиент от 40 до 100% раствора B в течение 35 мин (раствор A: 10% метанола, 89,9% воды, 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA); раствор B: 89,9% метанола, 10% воды, 0,1% TFA), ультрафиолетовая детекция). Метакроилглицил глицилгидразин (MA-GlyGly-NHNH2). Получение MA-GlyGly-NHNH2 проводили при условиях, схожих с условиями получения MA-AHNHNH2. Метиловый эфир глицилглицина (21,4 г, 0,1 моль) растворяли в 250 мл дихлорметана с добавлением 60 мг гидрохинона. После охлаждения до приблизительно 12C добавляли безводный карбонат натрия (30,2 г, 0,29 моль) и при охлаждении до 5-10C медленно по каплям добавляли раствор метакроилхлорида (10,4 г, 0,1 моль) в 60 мл дихлорметана. После завершения реакции, отфильтровывания и промывания осадка при помощи приблизительно 230 мл дихлорметана растворитель выпаривали досуха. Сухой остаток после упаривания растворяли в 120 мл метанола и гидразинолиз при помощи гидразингидрата (7,9 мл 8,1 г, 0,166 моль) проводили в присутствии NaOH (0,91 г, 22,7 ммоль). После завершения гидразинолиза pH раствора доводили до 6,2-6,5, добавляя 35% HCl (приблизительно 12 мл), добавляли 230 г безводного натрия сульфата и смесь, включая осушитель, выпарили досуха. После экстракции при помощи 300 мл дихлорметана суспензию отсасывали через фильтр из пористого стекла, промывали еще 300 мл дихлорметана и концентрировали фильтрат до приблизительно 120 мл. Раствор разбавили 900 мл этилацетата и после концентрирования до 250 мл в испарителе оставили кристаллизоваться в морозильнике. После повторной кристаллизации продукт выделили фильтрацией, промывали небольшим количеством охлажденного этилацетата и высушили в вакууме. Выход продукта составил 15,0 г (70%),температура плавления 172-174C. Элементный анализ: рассчитано C 44,86%, H 6,54%, N 26,16%. Найдено: C 45,01%, H 6,57%, N 26,02%. Продукт являлся хроматографически чистым, 1 пик при времени удерживания 21,97 мин. Метакроилглицил фенилаланил лейцил глицилгидразин (MA-Gly-D,L-PheLeuGly-NHNH2). Синтез этого мономера осуществляли способом, аналогичным обоим предыдущим случаям (см. выше). Состав реакционной смеси и условия были следующими: метиловый эфир глицил фенилаланил лейцилглицина (22,32 г, 0,05 моль), дихлорметан 510 мл (270 + 240 мл), гидрохинон (60 мг), натрия карбонат (15,1 г, 0,145 моль) и метакроилхлорид 5,2 г (0,05 моль) использовали для получения метакрилированного метилового эфира. 4,1 г (0,085 моль) гидразингидрата в 120 мл метанола и 0,46 г (11,3 ммоль)NaOH использовали для гидразинолиза. 210 г безводного натрия сульфата использовали для осушения, и 2290 мл дихлорметана использовали для экстракций. Продукт кристаллизовали из смеси дихлорметанэтилацетат. Выход продукта составил 60%, температура плавления 139-140C. Элементный анализ: рассчитано: C 58,10%, H 7,36%, N 17,68%. Найдено: C 58,21%, H 7,39%, N 17,54%. Продукт был хроматографически чистым, имели место 2 пика, имеющих одинаковую площадь, при времени удерживания 19,39 мин (L-Phe содержащий мономер) и 19,91 мин (D-Phe). Пример 2 а. Синтез полимерного предшественника - сополимера HPMA и 6-(метакроиламино)гексаноилгидразина (поли(HPMA-со-МА-AH-NHNH2. Сополимер поли(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) получили радикальной сополимеризацией в раствореHPMA и MA-AH-NHNH2, инициированной при помощи AIBN в метаноле при 60C. 122,8 г HPMA и-3 015091 13,94 г MA-AH-NHNH2 (18 мас.% мономеров) растворяли в 780 мл метанола и добавляли к раствору 6,06 г AIBN (0,8 мас.%). После фильтрации реакционную смесь реакции полимеризации помещали в атмосфере аргона в реактор полимеризации (объем 1,5 л), размещенный в термостате. Реакционную смесь реакции полимеризации перемешивали с высокой скоростью (примерно 100 об/мин). Над поверхностью создавали атмосферу азота на срок несколько минут. Температура реакционной смеси реакции полимеризации была установлена на 60C, и реакция полимеризации продолжалась при перемешивании(50 об/мин) в атмосфере азота. Азот удаляли через барботирующее устройство. Через 17 ч реакционную смесь реакции полимеризации вынимали из термостата, охлаждали на водяной бане до комнатной температуры и выделяли полимер осаждением в этилацетате (в общей сложности 8 л). Осажденный полимер подвергали седиментации в течение приблизительно 0,5 ч, раствор над осадком удаляли высасыванием и выделяли полимер фильтрацией через фильтр из спеченного стекла S4. Осадок промывали этилацетатом, переносили на чашки Петри большого размера и высушивали при комнатной температуре в вакууме с использованием мембранного вакуумного насоса в течение приблизительно 1 ч. Используя ультразвук, полимер растворяли в 550 мл метанола (в колбе Эрленмейера вместимостью 1 л) и осаждали в 7,5 л этилацетата таким же образом, что и во время первой стадии выделения. После седиментации в течение приблизительно 0,5 ч осажденный полимер выделяли фильтрацией через фильтр из спеченного стекла S4, промывали этилацетатом, высушивали до постоянной массы с использованием мембранного вакуумного насоса (приблизительно 5 ч) и завершали процесс высушивания с использованием масляного диффузионного насоса. Характеристика сополимера. Выход 114 г (83%), содержание гидразидных групп 5,83 мол.%, молекулярная масса Mw = 28500 г/моль,индекс полидисперсности In = 1,9. Пример 2 б. Синтез полимерного предшественника - сополимера HPMA и метакроилглицилглицилгидразина (поли(HPMA-со-MA-GlyGly-NHNH2. Конфигурация и методика реакции полимеризации были такими же, как и в примере 2 а, с разницей в составе реакционной смеси реакции полимеризации. Состав реакционной смеси реакции полимеризации был следующим: HPMA 10 г (70 ммоль), MA-GlyGly-NHNH2 1,5 г (7 ммоль), диизопропилперкарбонат 1,15 г (0,91 масс.%) и диметилформамид 115 мл. Температура реакции полимеризации составляла 50C, и реакция полимеризации продолжалась в течение 16 ч. Перед осаждением в избытке этилацетата раствор реакции полимеризации сконцентрировали до приблизительно 2/3 его первоначального объема в вакуумном испарителе, и осаждение полимерного продукта осуществляли при 20-кратном увеличении объема среды осаждения. Полимер отделяли от низкомолекулярных примесей осаждением из метанола в этилацетате. Выход составил 8,5 г (70%), содержание гидразидных групп 9,5 мол%, молекулярная массаMw = 41700 г/моль, индекс полидисперсности In = 2,1. Пример 2 в. Синтез полимерного предшественника - сополимера HPMA и метакроилглицил фенилаланил лейцил глицилгидразина (поли(HPMA-со-МА-GlyPheLeuGly-NHNH2. Методика реакции полимеризации была такой же, как и в примере 2 а, с разницей снова только в составе реакционной смеси реакции полимеризации. Состав реакционной смеси реакции полимеризации был следующим:HPMA 10 г (70 ммоль), MA-GlyPheLeuGly-NHNH2 2,5 г (5,6 ммоль), азо-бис-(изоциановалериановая кислота) 1,125 г (1 мас.%) и диметилсульфоксид 100 мл. Полимеризацию проводили при 55C и завершали через 18 ч. Полимер выделяли из реакционной смеси реакции полимеризации осаждением в 20-кратном избытке этилацетата. Полимер очищали переосаждением из метанола в этилацетате. Выход составлял 9,75 г (78%), содержание гидразидных групп 5,5 мол.%, молекулярная массаMw = 43200 г/моль, индекс полидисперсности In = 2,1. Пример 3. Получение полимерного конъюгата PHPMA-AH-NH-N=DOX. Сополимеры с DOX, связанным с носителем PHPMA (полиНРМА) посредством гидролитически расщепляемой гидразоновой связки, получали, подвергая реакции сополимеры поли(HPMA-co-MA-AHNHNH2), содержащие гидразидные группы, с DOXHCl в метаноле с катализом уксусной кислотой. Раствор 15,384 г сополимера поли(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) в 92,1 мл метанола (167 мг полимера/мл) помещали в термостатируемую ячейку, в которую вносили 2,5 г DOX-HCl (4,3 ммоль). Негомогенную суспензию перемешивали в темноте при 25C в течение 1 мин, после чего добавляли 4,9 мл уксусной кислоты (общий объем 116 мл). В ходе реакции суспензия постепенно растворялась, и после 22 ч протекания реакции полимерный продукт выделяли из гомогенного раствора осаждением в 1 л этилацетата; осадок полимерного лекарственного средства выделяли фильтрацией через фильтр из спеченного стекла S4, промывали 150 мл этилацетата и высушивали до постоянной массы. Общее количество DOX определяли спектральными методами. Mw(cp.) и Mn(ср.) определяли жидкостной хроматографией на приборе LC AKTA с детекцией методом светорассеяния (DAWN DSP многоугловой детектор, Wyatt). Характеристика полимерного лекарственного средства. Общий выход реакции связывания лекарственного средства: 17,2 г (96%), общее содержание DOX: 11,3 мас.%, свободный DOX: 1,52% от общего содержания DOX.-4 015091 Пример 4. Высвобождение доксорубицина из полимерных конъюгатов. Высвобождение доксорубицина из конъюгатов, отличающихся структурой связки (спейсера) между лекарственным средством и полимером, осуществляли путем инкубирования в 0,1 М фосфатном буфере,содержащем 0,15 М NaCl, при 37C. pH буфера регулировали в соответствии с условиями в клеточных эндосомах, т.е. слегка кислые условия с pH 5,5. Через определенные интервалы отбирали пробы в виде аликвот из среды инкубирования и определяли содержание DOX после добавления карбонатного буфера(0,1 М Na2CO3 + 4 М NaCl), после экстракции хлороформом и после упаривания растворителя и переноса в раствор в метаноле при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (прибор ShimadzuVP) с использованием колонки с обращенной фазой (Tessek SGX C18, 7 мкм, 1254 мм), скорость подачи элюента: 0,5 мл/мин, градиент от 40 до 100% раствора В в течение 35 мин (раствор А: 10% метанола,89,9% воды, 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ); раствор В: 89,9% метанола, 10% воды, 0,1% TFA). Для определения использовали флуоресцентный детектор (Shimadzu RF-10AXL) (exc = 480 нм, em = 560 нм). Калибровочную кривую строили на основе доксорубицина. Результаты определения высвобождения лекарственного средства из конъюгатов, отличающихся структурой связки (спейсера), показаны на фиг. 1. Список литературы. Т. Etrych, M. Jelinkov, В. hov, K. Ulbrich, New HPMA copolymers containing doxorabicin bound viaK. Ulbrich, T. Etrych, B. hov, M. Jelinkov, M. Kov: pH-Sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy. CZ 293787; WO 03/0534. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения полимерных конъюгатов N-(2-гидроксипропил)метакриламида и метакрилоиламиноацилгидразона доксорубицина с контролируемым pH высвобождением лекарственного средства,отличающийся тем, что включает следующие стадии:(а) получение мономерного метакрилоиламиноацилгидразина, где аминоацил происходит из аминокислоты или олигопептида, путем реакции метакрилоилгалида с пептидом или аминокислотой с последующим гидразинолизом и получением хроматографически чистого мономерного метакрилоиламиноацилгидразина,(б) синтез полимерного предшественника путем прямой сополимеризации(в) связывание доксорубицина с полимерным предшественником путем взаимодействия предшественника с гидрохлоридом доксорубицина. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ацилирование на стадии (а) осуществляют путем реакции гидрохлорида метилового эфира аминокислоты или олигопептида с метакрилоилхлоридом в хлориро-5 015091 ванном углеводороде в присутствии безводного карбоната натрия. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что гидразинолиз осуществляют путем реакции метилового эфира метакрилоилированной аминокислоты или олигопептида с гидразингидратом в присутствии сильного основания. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что на стадии (б) проводят радикальную сополимеризацию N-(2-гидроксипропил)метакриламида и метакрилоиламиноацилгидразина, причем ее инициируют при помощи термически разлагаемых инициаторов на основе азо- или пероксиинициаторов,предпочтительно азо-бис-(изобутиронитрила), азо-бис-(изоциановалериановой кислоты) или диизопропилперкарбоната. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что полимеризацию осуществляют либо в растворителе, выбранном из низших спиртов, содержащих 1-5 атомов углерода, либо в апротонном полярном растворителе. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что растворитель выбирают из метанола, этанола, диметилформамида или диметилсульфоксида. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что инициатор выбирают из азо-бис-(изобутиронитрила) или азо-бис-(изоциановалериановой кислоты) и полимеризацию осуществляют при 45-70C или в качестве инициатора используют диизопропилперкарбонат и полимеризацию осуществляют при 30-60C. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что реакцию с полимерным предшественником на стадии (в) осуществляют в растворителе, выбранном из безводных спиртов, содержащих 1-5 атомов углерода, или полярных апротонных растворителей с катализом уксусной кислотой, и полученный конъюгат осаждают при помощи этилацетата. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что растворитель выбирают из метанола, обезвоженного этанола, диметилформамида или диметилсульфоксида. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что исходную концентрацию полимерного предшественника выбирают в пределах от 100 до 190 мг/мл, а концентрацию уксусной кислоты в пределах от 30 до 80 мг/мл. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что концентрация полимерного предшественника составляет 170 мг/мл, а концентрация уксусной кислоты составляет 55 мг/мл при 25C. 12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что полученный продукт очищают гельфильтрацией.