Способ очистки 11&beta-21-дигидрокси-2 ‘-метил-5′ &beta н-прегна-1,4-диено – (17,16-ди)-оксазол-3,20-диона

1 В настоящем изобретении идет речь о новом способе очистки соединения 11-21 дигидрокси-2'-метил-5'Н-прегна-1,4-диено(17,16-ди-)оксазолин-З,20-диона формулы I Вышеупомянутое соединение родственно дефлазакорту (ИНН-интернациональное незапатентованное название), в котором ацетатный фрагмент С-21 дефлазакорта замещен гидроксильным фрагментом. Дефлазакорт - соединение, применяемое в терапии в течение нескольких лет в качестве удерживающего кальций глюкокортикоидного агента. Эти соединения относятся к более общему классу прегнено-оксазолинов, обладающих противовоспалительной, глюкокортикоидной и гормоноподобной фармакологическими активностями. Примеры соединений вышеупомянутого класса приведены в патентах США 3413286 и 4440764. Способ получения соединения формулы I описан в Европейском патенте ЕР-В-322630, где вышеупомянутое соединение относится к 1121-дигидрокси-2'-метил-5'Н-прегна-1,4 диено(17,16-ди-)оксазолин-3,20-диону. Согласно процессу ферментации, описанному в вышеупомянутом ЕР-В-322630, 2'-метил 4-прегнен-21-ол-(17 а,16 а-ди-)оксазолинил-3,20 дион или 2'-метил-4-прегнен-21-ацетилокси(17 а,16 а-ди-)оксазолинил-3,20-дион связывается с последовательно растущими смешанными культурами штаммов Curvularia и Arthrobacter. Более детально, согласно изобретению, вышеупомянутое соединение предпочтительно добавляют к растущей культуре C.lunata NRRL 2380 в соответствующей ферментационной среде через 12-24 ч после посева, и через 48-72 ч после посева к этой смеси добавляется 18-36 часовая растущая культура A.simplex ATCC 6946 и далее культивируется 40-55 ч; далее ферментацию проводят в следующих условиях: температура поддерживается между 27 и 32 С и рН - между 6 и 8; продукт ферментации формулы I затем извлекают, экстрагируя ферментационный бульон органическим растворителем (например, хлороформом), концентрируют органические экстракты и добавляют не-растворитель,при котором соединение преципитирует (например, петролейный эфир). В связи с тем, что концентрация соединения формулы I в ферментационном бульоне очень низкая, необходимо большое количество органического растворителя для полной экстракции соединения. Использование больших 2 количеств органических растворителей, в частности галогенированных растворителей, может вызвать некоторые проблемы, связанные с охраной труда и защитой окружающей среды. Сейчас обнаружено, что соединение формулы I может быть извлечено из водного раствора, полученного из ферментационных бульонов или из потоков в ходе процесса путем адсорбции соединения, содержащегося в вышеупомянутом водном растворе, на адсорбционной полимерной смоле, имеющей стирольный или акриловый матриксы, с последующей десорбцией вышеупомянутого соединения путем элюции смолы подходящей смесью воды с водосмешивающимися органическими растворителями. Типичными водными растворами, содержащими соединение формулы I и сопровождаемыми сопутствующими нежелательными продуктами, являются фильтраты ферментационных бульонов с соответствующих мицелиев,необязательно вместе с водными смывами вышеупомянутых мицелиев, или частично очищенные потоки в ходе процесса. Примерами нежелательных сопутствующих продуктов являются окрашенные примеси, побочные продукты, неизрасходованные исходные материалы, соли и водорастворимые компоненты ферментационной среды. В частности, процесс очистки согласно изобретению может быть успешно применен для получения соединения формулы I из фильтрата ферментационного бульона, полученного в результате ферментационного процесса, описанного в европейском патенте В-322630. Соответствующие смолы для процесса очистки могут иметь в среднем частицы размером около 20-50 меш и следующие усредненные физические характеристики: Свободный объем Площадь поверхности Плотность скелета Примерами адсорбентов на основе стирольных полимерных смол, подходящих для вышеупомянутого процесса извлечения, являются коммерчески доступные смолы, такие какXAD/2, XAD/4 или XAD/16 (RohmHaas), или им подобные. Примерами адсорбентов на основе акриловых полимерных смол, подходящих для вышеупомянутого процесса извлечения,являются коммерчески доступные смолы, такие как Kastel S/221 или S/223 (Dow Chemical),Amberlite XAD/7 или XAD/8 (RohmHaas) или им подобные. Вообще, для процесса согласно изобретению использование смол на основе акриловых полимеров является предпочтительным, осо 3 бенно это касается смол с размером частиц около 20-50 меш, которые имеют следующие усредненные физические характеристики: Свободный объем Площадь поверхности Плотность скелета Средний диаметр пор Примеры адсорбентов полимерных смол на акриловой основе с вышеупомянутыми характеристиками, которые могут быть подходящими для работы, упоминаются ранее KastelS/221 и Amberlite XAD/7. Особенно предпочтительными для представленного процесса очистки являются полимерные смолы на акриловой основе, имеющие частицы размером около 20-50 меш и следующие усредненные физические характеристики: Свободный объем Площадь поверхности Плотность скелета Средний диаметр пор В качестве примера для работы подходит коммерчески доступная смола Kastel S/221. Подходящими для элюции являются смеси, содержащие от 0 до 80% воды с водосмешивающимися органическими растворителями,такими как низшие кетоны (например, ацетон,этилметилкетон); низшие спирты (например,метанол, этанол, пропанол, бутанол); и подобные. Предпочтительны смеси, содержащие от 10 до 50% воды с одним из вышеупомянутых органических растворителей, особенно предпочтительной является смесь, содержащая около 30% воды. Ацетон является предпочтительным растворителем. При использовании процесса согласно изобретению для очистки соединения формулыI, полученного согласно ферментационному процессу, описанному в патенте ЕР-В-322630,применяют следующие основные процедуры. Когда вышеупомянутый ферментационный процесс закончен, ферментационная масса, вопервых, фильтруется по известной технологии. Мицелиевый осадок на фильтре неоднократно промывают водой, и смывы затем объединяют с фильтратом бульона. Альтернативно, мицелий может быть отмыт органическим растворителем, выбранным из ранее перечисленных, для того, чтобы извлечь содержащуюся там активность; в этом случае смывы объединяются с фильтратом бульона только после удаления растворителя, например, отгонкой под вакуумом. Фильтрат бульона объединяют со смывами и затем наносят на колонку, содержащую адсорбционную смолу; обычно элюированный раствор содержит только следы продукта. Смола затем отмывается водой для удаления солей и других водорастворимых примесей (как и ука 4 занный выше, этот смыв также, в основном, содержит только следы продукта). Соединение формулы I затем десорбируется со смолы при элюции смесью воды и органического растворителя, как определено выше,преимущественно смесью воды с ацетоном в соотношении 30/70. Элюат концентрируют, и продукт извлекают путем фильтрации. При этой процедуре основное количество продукта получают из фильтрата бульона; показано, что, как правило, более чем 90% общего количества требуемого соединения, исходно помещенного на колонку, извлекается во время первой элюции. Остаточные количества могут быть извлечены при повторении вышеупомянутой процедуры, после объединения маточного раствора от первой элюции и смывов водой. Общий выход составляет около 96%. Для наилучшей иллюстрации изобретения даны следующие примеры. Пример 1. Последовательный рост С. lunata и A. simplex.I) Питательная среда для скошенного агара Среда СабуроKH2PO4 5 г/л Декстроза 10 г/л Пептон 5 г/л Перед автоклавированием устанавливают рН 6,5-7,5. б) для A. simplex Декстроза 1,0 г/л Соевая мука 5,0 г/л Пептон 5,0 г/лNaCl 5,0 г/л Силикон 0,1 мл/л Перед автоклавированием устанавливают рН 6,5-7,5.Ill)Ферментационная среда Ферментационная среда имеет тот же состав, что и предкультуральная среда для С.lunata, о которой сообщалось выше.IV)Методика ферментации Скошенный агар использовали в отдельных посевных 500 мл флаконах, которые культивировали при температуре около 28 С в течение 12-24 ч (С. lunata) или 18-36 ч (A. simplex) в присутствии 100 мл вегетативной среды, указанной выше. Этот посевной материал использовали в методе, описанном ниже. Аликвоты (от 1 до 5%) культуры С. lunata,полученные, как описано выше, переносили в 8 литровый ферментер, содержащий ферментационную среду, о которой сообщалось выше, и культивировали около 24 ч при 29-32 С. 5 Затем добавляли 4 г 2'-метил-4-прегнен-21 ол-(17 а,16 а-ди)-оксазолинил-3,20-диона и продолжали ферментацию около 36-72 ч, считая от посева. Далее в ферментер добавляли 18-36 часовую культуру А. simplex, и ферментацию продолжали в течение последующих 40-55 ч. Течение реакции контролировали с помощью известного метода ТСХ или, что предпочтительнее, ВЭЖХ, наблюдая за исчезновением исходного материала и/или появлением конечного продукта. В качестве дополнительного контроля можно следить за появлением или исчезновением промежуточных продуктов. Выход превращенного продукта, определяемого при помощи ВЭЖХ, составлял 70-75%. Пример 2. Получение соединения формулы I. Через 40-55 ч после добавления A. simplex превращение вещества в основном можно считать завершенным, и ферментационная масса может быть использована для выделения требуемого вещества формулы I. рН ферментационной массы доводили приблизительно до 3-4 с помощью Н 2SO4, эту смесь фильтровали с помощью фильтрационных приспособлений через отфильтрованный мицелий, затем неоднократно промывали подкисленной водой (3 рН 4). Профильтрованный бульон и смывы объединяли, получая при этом 11 л смеси, содержащей соединение формулы I,имеющее характеристику 270 ppm (полученную с помощью ВЭЖХ на силикагеле; колонкаNaH2PO4: CH3CN 7:3, УФ-регистрация при длине волны 254 нм). Указанную смесь затем наносили при комнатной температуре на верхнюю часть хроматографической колонки (6 х 11 см),содержащей около 300 мл набухшей в воде полимерной смолы на основе акрила (KastelS/221, Dow Chemical), при скорости протекания около 300 мл/ч. Не связавшийся на колонке материал (маточные растворы), который содержал менее 2 ppm активности, собирали отдельно. Смолу затем промывали 600 мл деионизованной воды для удаления солей и других водорастворимых примесей. И в этом случае смывы,содержащие менее 2 ppm активности, собирали отдельно. Связавшийся на колонке со смолой продукт затем десорбировали, элюируя его смесью ацетона с водой в соотношении 70/30 со скоростью около 150 мл/ч, собирая около 200 мл элюата. Элюат концентрировали под вакуумом приблизительно до объема 100 мл, при этом продукт преципитировал. Суспензию охлаждали приблизительно до 5 С и через 2 ч преципитат отделяли фильтрацией и промывали холодной водой. После вы 000789 6 сушивания под вакуумом при 50 С получали 2,8 г соединения формулы I (чистота 98%). Маточные растворы и смывы объединяли и после разбавления водой (около 1-2 объемов воды по отношению к 1 объему маточного раствора) наносили прямым током на колонку (2 х 13 см), содержащую 40 мл вышеуказанной набухшей смолы, со скоростью около 40 мл/ч. После того как смолу отмывали 80 мл воды, связавшийся на колонке продукт десорбировали элюцией, используя смесь ацетона и воды в соотношении 70/30 со скоростью 20 мл/ч. После концентрирования под вакуумом, охлаждения, фильтрации, промыва холодной водой и высушивания получали следующие 0,14 г соединения формулы I. Общий выход вещества из ферментационной массы составлял обычно около 96%. При повторении методов, описанных в примерах 1 и 2, но при использовании 2'-метил 4-прегнен-21-ацетилокси-(17 а,16 а-ди)-оксазолинил-3,20-диона вместо 2'-метил-4-прегнен-21 ол-(17 а,16 а-ди)-оксазолинил-3,20-диона, было получено соединение формулы I практически с тем же выходом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ очистки соединения 11-21 дигидрокси-2'-метил-5'Н-прегна-1,4-диено[17,16-ди-]-оксазолин-3,20-дион формулы который включает: а) адсорбцию вышеназванного соединения,содержащегося в водном растворе, полученном из ферментационных бульонов или из потоков в ходе процесса на адсорбирующей полимерной смоле, имеющей в основе стирольный или акриловый матриксы,б) промыв смолы водой,в) десорбцию соединения формулы I со смолы путем элюции смесью, содержащей 1050% воды и смешивающегося с водой органического растворителя,г) концентрирование элюата и извлечение из него соединения формулы I путем фильтрации. 2. Способ по п.1, в котором ферментационный бульон, содержащий соединение формулы I, был получен в результате процесса ферментации для получения названного соединения, который, в свою очередь, включает взаимодействие 2'-метил-4-прегнен-21-ол-(17a,16 ади-) оксазолинил-3,20-диона или 2'-метил-4 прегнен-21-ацетилокси-(17 а,16 а-ди)оксазолинил-3,20-диона с последовательно рас 7 тущими смешанными культурами штаммовCurvularia и Arthrobacter. 3. Способ по п.1 или 2, в котором элюирующая смесь этапа в) содержит около 30% воды. 4. Способ по пп.1 и 2, в котором а) ферментационная масса вначале фильтруется, мицелиевый осадок на фильтре неоднократно промывается водой, а смывы объединяются с фильтратом бульона; б) отфильтрованный бульон, объединенный со смывом, затем наносится на верхнюю часть колонки, содержащей набухшую в воде адсорбционную смолу; б') смолу промывают водой; в) соединение формулы I десорбируют со смолы путем элюции смесью воды с ацетоном в соотношении 30/70; г) элюат концентрируют и соединение формулы I извлекают путем фильтрации. 5. Способ по п.4, в котором процесс очистки повторяют на объединенной фракции маточных растворов и смывов, полученных при элюировании на этапах б) и б'). 6. Способ по пп.1, 2, 3, 4 или 5, в котором в качестве адсорбционной полимерной смолы применяется полимерная смола на основе стирольного или акрилового матриксов с размером частиц 20-50 меш, обладающая следующими усредненными физическими характеристиками: Свободный объем около Площадь поверхности около Плотность скелета 8 для стирольных смол около для акриловых смол около Средний диаметр пор около 7. Способ по пп.1, 2, 3, 4 или 5, в котором в качестве адсорбционной полимерной смолы используется полимерная смола на основе акрила, имеющая частицы размером около 20-50 меш и следующие усредненные физические характеристики: Свободный объем около Площадь поверхности около Плотность скелета около Средний диаметр пор около 8. Способ по пп.1, 2, 3, 4 или 5, в котором в качестве адсорбционной полимерной смолы используется полимерная смола на основе акрила, имеющая частицы размером около 20-50 меш и следующие усредненные физические характеристики: Свободный объем около Площадь поверхности около Плотность скелета около Средний диаметр пор около 9. Способ по пп.1, 2, 3, 4, 6 или 7, в котором смешивающийся с водой органический растворитель является низшим кетоном или низшим спиртом. 10. Способ по пп.1, 2, 3, 4, 6 или 7, в котором органическим растворителем является ацетон. 11. Способ по пп.1, 2, 3, 6 или 7, в котором элюирующая смесь является смесью воды с ацетоном в соотношении 30/70.