Способ очистки эритропоэтина

1 Настоящее изобретение относится к простому и эффективному способу выделения биологически активного гликопротеина из содержащей его биологической жидкости. В частности, способ по данному изобретению применим для выделения высоко гликозилированных протеинов, т.е. гликопротеинов и гликопептидов, имеющих содержание сахаров более чем 30% от их молекулярного веса. Эритропоэтин - специфический и наиболее предпочтительный пример гликопротеина, который может быть легко очищен в соответствии со способом по данному изобретению. Известен способ получения эритропоэтина из различных источников, включая клетки, полученные методами генной инженерии, рассмотренный в нескольких Европейских заявках на патенты или патентах, таких как ЕР-148605,ЕР-205564, ЕР-209539, ЕР-267678, ЕР-649464 и ЕР-672160. Используемый здесь термин "эритропоэтин" или "эритропоэтиновый продукт" включает природный человеческий эритропоэтин, выделенный из мочи, а также синтезированные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность и степень гликозилирования,почти в точности аналогичные эритропоэтину,встречающемуся в природе, проявляющие invivo определенные биологические свойства,благодаря которым из клеток костного мозга образуется повышенное количество ретикулоцитов и красных кровяных клеток, а также эритропоэтин, полученный из культуральной жидкости клеток млекопитающих, в которые введен интактный эритропоэтин-кодирующий ген, или эритропоэтин, полученный из культуральной жидкости клеток млекопитающих, в которых активирован эндогенный ген(ы) эритропоэтина,в том числе ген, охарактеризованный в опубликованной международной заявкеWO 93/09222 (международная заявка PCT/US 92/09627) или в опубликованной заявке WO 94/12650, которой соответствует приоритетная заявка США 07/985,586. Все заявки приведены здесь в качестве ссылок. Способ по данному изобретению наиболее применим для выделения эритропоэтина, содержащегося в культуральной жидкости эритропоэтинпродуцирующей культуры клеток. Используемый здесь термин "культуральная жидкость" предпочтительно относится к любой жидкости искусственного происхождения, такой как культуральная жидкость клеток млекопитающих и, в особенности, генетически измененных клеток млекопитающих. Предпочтительно, "культуральная жидкость" в контексте данного описания - это культуральная жидкость, которая была отделена от клеток и клеточного дебриса известными методами фильтрации или ультрафильтрации. Понятию "культуральная жидкость также соответст 000694"Продуцирующие клетки" - это предпочтительно стабилизированные или нестабилизированные клеточные линии эукариотического происхождения или, предпочтительнее, млекопитающих, которые способны при выращивании в подходящей среде продуцировать желаемые гликопротеины в количестве, достаточном для выделения. Типичные примеры указанных клеток включают фибробласты, кератиноциты,эпителиальные клетки (например, эпителиальные клетки млекопитающих, клетки кишечного эпителия), эндотелиальные клетки, глиальные клетки, нервные клетки, клетки крови и элементы кроветворения (например, лимфоциты, клетки костного мозга), мышечные клетки и предшественники перечисленных типов соматических клеток. Как уже упоминалось, эти клетки предпочтительно являются клетками млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика,кошки, собаки, свиньи, коровы, птицы, овцы,козла, лошади, обезьяны, человека) и более предпочтительны клетки приматов и человека. В частности, "термин продуцирующие клетки" включает в себя также трансфицированные первичные, вторичные и иммортализованные клетки позвоночных животных, в особенности, млекопитающих и, наиболее предпочтительно, взятые у приматов или человека клетки, трансфицированные экзогенным генетическим материалом, который прямо или опосредованно индуцирует клетки к образованию достаточного количества эритропоэтина, например, охарактеризованного в вышеупомянутых международных заявках WO 93/09222 или WO 94/12650. Примеры иммортализованных линий человеческих клеток, использующихся для продуцирования эритропоэтина, широко известны и доступны и включают, но не ограничиваются указанными, клетки штамма HeLa или производные клеток HeLa (такие как АТСС, CCL.2,2.1 и 2.1), MCF-7 раковые клетки молочной железы (такие как АТСС НТВ 22), К-562 лейкозные клетки (такие как АТСС CCL 234), KB раковые клетки (такие как АТСС CCL 17),2780AD раковые клетки яичника. Van del Blick,A.M. et al., Cencer Res, 48: 5927-5932 (1988),клетки Раджи (АТСС CCL 86), клетки ДжуркатаCCL 1219), клетки Дауди (АТСС CCL 213),RPMI 8226 клетки (АТСС CCL 155), U-937 клетки (АТСС CRL 1593), клетки меланомы Боуеса (АТСС CRL 9607), WI-38VA13 сублинии 2RS клетки (АТСС CCL 75.1) и MOLT-4 клетки(АТСС CRL 1582). Могут использоваться и вторичные штаммы человеческих фибробластов такие, как WI-38 (АТСС CCL 75), MRC-5 3 Как отмечено выше, заявленный способ подходит для выделения желаемого гликопротеина из любой культуральной жидкости и продуцирующих клеток. Интенсивное применение технологий генной инженерии в широкомасштабном производстве биологически активного белка решило проблему его получения в тех количествах, которые могут удовлетворить высокий спрос. В некоторых случаях, однако, выделение белков из культуральной жидкости является неудобным, энергоемким и дорогостоящим процессом. Это, в особенности, касается случаев, когда белок высоко гликозилирован, как указано выше. Таким образом, существует необходимость в разработке простых и эффективных методов выделения гликозилированных белков, которые подходят для крупномасштабного производства. В контексте данного описания считается,что специфическая активность эритропоэтина определена в соответствии с методом ELISAsystems. Inc.), тогда как содержание белка в образцах определяется ВСА - анализом белка. Указанные методы описаны более детально ниже в разделе "Методы анализов". Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в разработке подходящего хроматографического этапа в полном процессе очистки эритропоэтина, в котором используют дигидроксиборонилсодержащие хроматографические носители. Хроматографический этап изза его продуктивности и гибкости может быть первым или последующим в многоступенчатой процедуре очистки. Как первая хроматографическая стадия, дигидроксиборонильная хроматография предпочтительно должна быть сопряжена с ионообменной хроматографической стадией, как описано более детально ниже, тогда как в качестве последующего этапа она может быть включена на любой стадии многоступенчатой процедуры. Эта многоступенчатая процедура может соответственно включать дополнительно любую стадию, которую осуществляют при хроматографии, например, при ионообменной, эксклюзионной, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и аффинной хроматографии. Как последующая хроматографическая стадия в многоступенчатой процедуре очистки,дигидроксиборонильная хроматография предпочтительно проводится при использовании материала, содержащего эритропоэтин, т.е. полуочищенного материала, который наносится на предварительно уравновешенный дигидроксиборонилсодержащий хроматографический носитель. Полуочищенный материал также уравновешивают на носителе с помощью буфера перед нанесением его на носителе. Этот буфер обозначается здесь как "соответствующий уравно 000694 4 вешивающий буфер" ("первый уравновешивающий буфер") и подробно описан ниже. Эта стадия способа особенно подходит для очистки эритропоэтина. Объектом настоящего изобретения является способ очистки, который включает следующие стадии: а) обеспечение контактирования отфильтрованной культуральной жидкости, содержащей выделяемый гликопротеин, с предварительно уравновешенным дигидроксиборонилсодержащим хроматографическим носителем,б) элюирование первым элюирующим буфером и обеспечение контактирования этого элюата непосредственно с анионообменным носителем, содержащим функциональные группы четвертичного аммония,в) элюирование гликопротеина вторым элюирующим буфером. Как будет видно из полного описания настоящего изобретения, указанные этапы способа позволяют осуществлять многократную очистку гликопротеина, содержащегося в культуральной среде, таким образом, они могут эффективно использоваться в качестве первой стадии в многоступенчатом способе очистки. Согласно предпочтительному варианту осуществления способа в соответствии с данным изобретением, культуральная жидкость,содержащая выделяемый гликопротеин, подвергается способу очистки, который включает следующие стадии: а) обеспечение контактирования отфильтрованной культуральной жидкости с дигидроксиборонилсодержащим хроматографическим носителем,б) элюирование первым элюирующим буфером и обеспечение контактирования полученного элюата непосредственно с анионообменным носителем, несущем функциональные группы четвертичного аммония,в) элюирование вторым элюирующим буфером,г) ультрафильтрация при использовании мембраны с отсечением по мол. массе в интервале 5,000-30,000 Да,д) необязательную диафильтрацию для замены буфера на подходящий для следующей стадии, и е) гель-фильтрацию на разделяющей смоле с отсечением по мол. массе в интервале 5,000250,000 Да. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, способ в соответствии с данным изобретением включает следующие стадии: а) обеспечение контактирования отфильтрованной культуральной жидкости с рН 7,5-9,0 с дигидроксиборонилсодержащим хроматографическим носителем, уравновешенным буфером, который является водным буфером с концентрацией компонентов буферной системы 25 5 100 мМ, ионной силой между 2 и 20 мСм (милисименс)/см 2 и рН между 7,5 и 9,0; б) последовательное промывание уравновешивающим буфером и затем тем же буфером,включающим от 10 до 100 мМ соединения с низкой мол. массой, содержащего 1,2-цисдиоловые группы; в) элюирование первым элюирующим буфером, который является водным буфером,имеющим рН между 7,5 и 11,0 и включающим соединение,имеющее 1-гидрокси-2-амино группы, в концентрации 20-200 мМ, при необходимости в присутствии от 2 до 8 М хаотропного агента, 2-40 мМ акцептора цианата и от 0,01% до 0,1% (по весу) поверхностноактивного вещества; г) обеспечение контактирования полученного элюата с анионообменным носителем, содержащим функциональные группы четвертичного аммония, уравновешенного вводным буфером, имеющим рН между 7,5 и 11,0 и содержащим от 0,01% до 0,1% (по весу) поверхностноактивного вещества; д) последовательное промывание указанным уравновешивающим буфером и тем же буфером, содержащим дополнительно до 50 мМ соли; е) элюирование вторым элюирующим буфером, имеющим рН между 7,5 и 11,0 и содержащим от 0,01% до 0,1% (по весу) поверхностно-активного вещества и от 150 до 350 мМ соли; ж) ультрафильтрацию при использовании мембраны с отсечением по мол. массе в интервале 5,000-30,000 Да; з) при необходимости диафильтрование для замены буфера на подходящий для осуществления последующей стадии гель-фильтрации и и) гель-фильтрацию на разделяющей смоле с отсечением по мол. массе в интервале 5,000 до 250,000 Да."Дигидроксиборонилсодержащий хроматографический носитель" относится к любому известному хроматографическому носителю,содержащему боронатную группу, в которой атом бора стабильно связан с атомом углерода в цепи, в которой проксимальный атом углерода обеспечивает достаточную свободную электронную плотность, чтобы оставаться связанным с бором при различных условиях использования носителя. Более предпочтительно, чтобы этот проксимальный атом углерода являлся ароматическим атомом углерода, например,атомом углерода, принадлежащим возможно замещенному бензольному кольцу. Особенно предпочтительны для осуществления заявленного способа так называемые фенилборонатные смолы. Примеры таких смол описаны в патентах США 4,562,251, 4,778,888 и 4,269,605, которые приведены здесь в качестве ссылки. Фенилборонатные агарозные носители наиболее предпочтительны. В настоящее время эти носителиInc или Grace Inc, под торговой маркой MATREX GEL, включая MATREX GEL РВА-10,РВА-30 и РВА-60. Наиболее предпочтительной фенилборонат-агарозой для применения на первой стадии очистки является носитель MATREXGEL РВА-60, в котором м-аминофенилбороновая кислота ковалентно связана с агарозой,имеющей диаметр сферических гранул в интервале 50-150 мкм, в соотношении 60-100 мкм бороновой кислоты/мл геля. Для последующей стадии очистки наиболее предпочтительны фенилборонат-агарозные носители, такие, какMATREX GEL РВА-30, в котором маминофенилбороновая кислота ковалентно связана с агарозой, имеющей диаметр сферических гранул в интервале 50-150 мкм, в соотношении 30-50 мкМ бороновой кислоты/мл геля. Наиболее предпочтительно применение этих хроматографических носителей в системах колоночной хроматографии, даже при периодических процессах или в других системах очистки. В системах колоночной хроматографии дигидроксиборонилсодержащие хроматографические носители предпочтительно используют при комнатной температуре, предпочтительно от 5 до 25 С, наиболее предпочтительно от 10 до 20 С, наиболее предпочтительно около 15 С."Соответствующий уравновешивающий буфер" предпочтительно выбирают из глицинового, фосфатного, триалкиламмоний бикарбонатного буфера, содержащего 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиноэтансульфоновую кислоту(HEPES) при указанном диапазоне концентраций, ионной силе и рН. Особенно предпочтительная концентрация компонентов буферной системы уравновешивающего буфера составляет около 50 мМ, тогда как наиболее предпочтительная величина рН составляет около 8,5, а предпочтительная ионная сила - около 2,5 мСм/см 2. Эти условия являются предпочтительными как для первой стадии, так и для последующих стадий очистки."Соединение, содержащее 1,2-цис-диоловые группы" является любым из известных соединений с низкой молекулярной массой,имеющее 1,2-цис-диоловые функциональные группы, т.е., по меньшей мере, две гидроксильные группы на смежных атомах углерода, которые занимают или могут принимать копланарную или квазикопланарную конфигурацию. Типичными примерами этих известных соединений являются полиолы с короткой открытой цепью, такие как сорбитол, маннитол, адонитол,арабитол, глицерол, эритритол и цис-инозитол,и циклические моносахариды, такие как рибоза и манноза, причем сорбитол обычно наиболее предпочтителен. Особенно предпочтительно использование соединений, содержащих 1,2 цис-диоловые группы, имеющих низкую молекулярную массу, в концентрации около 50 мМ 7 на первой стадии очистки, тогда как на последующей стадии очистки обычно предпочтительна концентрация 20-100 мМ, наиболее предпочтительная концентрация составляет 100 мМ."Соединение, имеющее 1-гидрокси-2 амино группы", являющееся главным компонентом "первого элюирующего буфера", представляет собой любое соединение, имеющее такие функциональные группы и способное образовывать водный буфер с указанным выше интервалом рН. Типичными примерами таких соединений являются: 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол, который также известен как TRIS или трис(гидроксиметил)аминоэтан; бис(гидроксиметил)аминоэтан;N-[2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметилэтил)]глицин, который также известен как трицин; и N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин, который также известен как бицин. Указанные соединения предпочтительно используются в концентрации около 20-100 мМ, причем на первой стадии очистки наиболее предпочтительной концентрацией является около 50 мМ. Предпочтительно, чтобы рН первого элюирующего буфера составлял около 8,5. Для применения на последующей стадии очистки предпочтительный диапазон концентраций составляет 20-150 мМ, наиболее предпочтительный 100 мМ. Предпочтительно использование TRIS-буфера. Наиболее предпочтительно при осуществлении на второй стадии очистки хроматографии с фенилборонат-агарозным носителем использовать для элюирования буфер, который содержит 100 мМ TRIS и 100 мМ сорбитола. Предпочтительно,"соответствующий уравновешивающий буфер" и "второй элюирующий буфер" включают указанное выше соединение, имеющее 1-гидрокси-2-амино группы, в качестве главного компонента. В этом случае его предпочтительная концентрация находится между 20 и 200 мМ."Хаотропный агент" является агентом,способствующим образованию солей белкового материала и, таким образом, его растворимости в водной среде, обычно за счет диссоциирующих свойств. Типичными примерами хаотропных агентов являются мочевина и ее производные и гуанидин. Хаотропный агент используется в концентрации между 2 и 8 М, предпочтительно около 4-6 М. Цианатным акцептором является любое из известных веществ, способных к легкому связыванию СNОионов, которые могут образовываться в результате гидролиза мочевины. В качестве акцептора цианата предпочтительно используют глицин. Предпочтительная концентрация глицина, используемая при осуществлении заявленного способа, составляет от 2 до 40 мМ и наиболее предпочтительно около 20 мМ. 8 Термин "поверхностно-активное вещество" означает любое из известных веществ, которые уменьшают поверхностное натяжение, т.е. ту силу, которая действует на поверхности жидкостей, уменьшая площадь поверхности. Предпочтительными примерами поверхностноактивных веществ являются полиоксиэтилен сорбитановые производные жирных кислот,известные как "Твин", наиболее предпочтительно "Твин 20" (т.е. полиоксиэтилен сорбитан монолаурат). Обычно поверхностно-активное вещество, используют в количестве около 0,010,1% (по весу), наиболее предпочтительно, около 0,01%. Анионообменный носитель, содержащий функциональные группы четвертичного аммония, является любым из известных и промышленно доступных анионообменных носителей,имеющих указанные функциональные группы. Предпочтительными для осуществления заявленного способа являются носители на основе агарозы или целлюлозы, такие как микрокристаллическая целлюлоза или поперечно сшитая агароза. Также особенно предпочтительными являются носители, имеющие диэтиламиноэтил,триэтиламинометил или триметиламинометил функциональные группы. Особенно предпочтительным анионообменным носителем является триметиламинометил поперечно сшитая агароза, коммерчески доступная, например, под торговой маркой QSepharose (Pharmacia AB). Хроматографическую стадию с использованием указанных носителей,предпочтительно, проводят на колонках при комнатной температуре. Известно, что добавление соли к промывающему или элюирующему буферу (например,описанным выше) приводит к увеличению ионной силы буфера. Любые соли, традиционно используемые на практике, могут быть использованы и при осуществлении заявленного способа в аналогичных целях, при этом NaCl является одной из наиболее часто и широко применяемых солей. Ультрафильтрацию проводят по стандартной методике, используя тангенциальную проточную систему или ячейку с системой перемешивания. Предпочтительно, мембрана представляет собой полисульфоновую мембрану или регенерированную целлюлозную мембрану,поставляемые, например, от Millipore Inc. илиAmicon Inc. Для осуществления заявленного способа предпочтительно использование мембран с отсечением по мол. массе 10,000 Да. Ультрафильтрат затем при необходимости подвергают диафильтрации, предпочтительно в том же буфере, который будет использоваться для последующей стадии гель-фильтрации. Буфер для гель-фильтрации является водным буфером, имеющим рН от 6 до 8. Этот буфер предпочтительно содержит от 100 до 200 мМ 9 соли и, еще более предпочтительно, 100 мМ соли и имеет рН около 7,4-7,5. На этой стадии способа могут быть использованы традиционные гель-фильтрационные носители. Типичные примеры таких носителей - это полидекстраны, поперечно сшитые с акриламидами, такие, как композитные гидрофильные гели высокой механической прочности, полученные ковалентным поперечным сшиванием аллилдекстрана сN,Nметиленбисакриламидом, и поперечно сшитые целлюлозные гели. Коммерчески доступные поперечно сшитые декстран-акриламиды известны под торговой маркой SEPHACRYL и поставляются фирмой Pharmacia АВ. Предпочтительным гелем марки SEPHACRYL являетсяSEPHACRYL S-200 HR, который имеет размер гранул 25-75 мкм и его сшивание контролируется таким образом, что интервал отсечения глобулярного белка по мол. массе составляет 5,000250,000 Да. Примерами поперечно сшитых целлюлозных гелей являются коммерчески доступные поперечно сшитые пористые целлюлозные гели,например, GLC 300 (средний размер частиц 44125 мкм) или GLC 1,000 (средний размер частиц 53-125 мкм), которые поставляются Amicon Inc. Заявленный способ наиболее применим в крупномасштабном производстве, поскольку он состоит из последовательных этапов, которые легко комбинируются на основе известных методик без существенных трудностей. Более того, в данном способе используют только водные растворители, что является дополнительным преимуществом. Кроме того, заявленный способ позволяет переходить от первой хроматографической стадии очистки (с дигидроксиборонилсодержащей матрицей) ко второй (т.е. анионообменной) при непосредственном переносе элюата с первой стадии на вторую без какой-либо замены растворителя или корректирующих процедур. В дополнение к тому, что способ, разработанный в соответствии с настоящим изобретением, более легко осуществим, он приводит и к увеличению выхода продукта. Заявленный способ позволяет выделить эритропоэтиновый продукт, имеющий в среднем специфическую активность 145,000-174,000ELISA единиц/мг, при том, что отфильтрованная клеточная жидкость имеет среднюю специфическую активность 500-2,000 ELISA единиц/мг. Более того, объединенные первая и вторая хроматографические стадии позволяют обеспечить 60-100-кратную очистку исходной культуральной жидкости с получением по завершении процесса 110-150-кратной степени очистки. Как в случае эритропоэтина конечный гликопротеиновый продукт может быть получен в виде твердого вещества после использования известных методов удаления соли и лиофилиза 000694 10 ции, или в виде раствора, в котором растворитель может быть заменен, например, диафильтрацией с целью получения раствора, пригодного для фармацевтического применения, например,описанного в европейском патенте ЕР 430200,который приведен здесь в качестве ссылки. Нижеследующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, не ограничивая его объем. Пример 1. Фенил-боронатная хроматография как первая стадия при очистке эритропоэтина. Супернатант культуры эритропоэтинпродуцирующих клеток человека, полученный,как описано в примере 21 заявки WO 93/09222 или заявки WO 94/12650, содержащий приблизительно 20 мг эритропоэтина, фильтруют на смешанном мембранном картридже (1,2 и 0,5 мкм; Opticap, Millipore Inc.), затем проводят ультрафильтрацию на регенерированном целлюлозном спиральном картридже с отсечением по мол. массе S1Y30 (Amicon, Inc.) 30,000 Да и диафильтруют водой и 0,05 М(HEPES с рН 8,5 и ионной силой 2,5 мСм/см 2. Ультрафильтрат помещают на фенилборонат-агарозную хроматографическую колонку (120 мл набухшей смолы; РВА-60, Amicon Inc.), уравновешенную 0,05 М HEPES, с рН 8,5, содержащим 0,01% Твина 20 (Буфер А) и выдерживают при температуре около 10-15 С при охлаждении водой. Скорость потока устанавливают около 2-4 объемов колонки (ОК) в час. После промывания буфером А до стабилизации основной линии [оптическая плотность(OD) при 280 нм], промывание продолжают 0,05 М HEPES с рН 8,5, содержащим 0,01% Твина 20 и 0,05 М сорбитола (Буфер Б). Элюирование выполняют 0,02 М TRIS с рН 8,5, содержащим 6 М мочевины, 0,02 М глицина и 0,01% Твина 20 (Буфер С) и определяют пик (OD при 280 нм) элюируемого соединения (около 4-5 объемов колонки; выход 70-80%, степень очистки около 20-кратной), и непосредственно загружают элюат на триметиламинометил поперечно сшитую агарозную анионообменную смолу (25 мл набухшей смолы; Q-Sepharose FF,Pharmacia AB), уравновешенную 0,02 М TRIS с рН 8,5, содержащим 0,01% Твина 20 (Буфер D). После промывания при постоянной скорости потока буфером D до стабилизации основной линии и затем буфером D, содержащим также 0,05 М NaCl (Буфер Е), элюирование проводят 0,02 М TRIS с рН 8,5, содержащим 0,01% Твина 20 и 0,15 М NaCl (Буфер F). Определяют пик приOD 280 нм (выход около 80%) и фракцию концентрируют ультрафильтрацией в перемешиваемой ячейке, оснащенной мембраной, с отсечением по мол. массе 10,000 Да (YM10, Amicon). Концентрированный раствор наносят на поперечно сшитую декстран-акриламидную гель-фильтрационную колонку (Sephacryl S 200;Pharmacia AB), уравновешенную 0,02 М TRIS с рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl (Буфер G) и элюируют тем же буфером. Собирают фракции и те из них, которые содержат эритропоэтин(твердофазный иммуноферментный (ELISA) анализ), объединяют и концентрируют ультрафильтрацией, как описано выше. Пример 2. Фенил-боронатная хроматография как последующая стадия при очистке эритропоэтина. Раствор полуочищенного человеческого эритропоэтинаWO 93/09222 или заявки WO 94/12650), содержащий приблизительно 20 мг эритропоэтина,диафильтруют или диализуют водой и 0,05 МHEPES с рН 8,5 и 0,15 М NaCl, с удельной электропроводностью 18 мСм/см 2, и наносят на фенил-боронатную агарозную хроматографическую колонку (120 мл набухшей смолы; РВА 30,Amicon Inc.), уравновешенную 0,05 HEPES с рН 8,5, содержащим 0,15 М NaCl (Буфер А), и выдерживают при температуре около 10-15 С при охлаждении водой. Скорость протока устанавливают около 2-4 объемов колонки (ОК)/ч. После промывания буфером А до стабилизации основной линии [оптическая плотность (OD) при 280 нм], элюирование выполняют 0,1 МTRIS с рН 8,5, содержащим 0,1 М сорбитол (Буфер В) и определяют элюирующийся пик (OD при 280 нм) (около 4-5 объемов колонки; выход около 90%). Методы анализа. ЕLISА (твердофазный иммуноферментный анализ). Специфическую активность эритропоэтинового продукта, полученного в соответствии с описанным выше способом, измеряютELISA-методом для эритропоэтина человека,который известен, и наборы для его осуществления коммерчески доступны под торговой маркой QUANTIKINE IVD (RD SYSTEMSInc.). Анализ белка. Анализ белка проводят методом ВСА(Pierce Chemical Со), который сочетает биуретовую реакцию (восстановление Cu2+ до Cu1+ в щелочной среде) с высокоспецифической реакцией, основанной на использовании бицинхониновой кислоты (ВСА), выявляющей Сu1+. Специфическая активность. Специфическая активность для образцов рассчитывается по следующей формуле: Специфическая активность = Общее число единиц эритропоэтина в ELISA/общее количество мг белка в соответствии с ВСА. Очищенный препарат эритропоэтина имеет специфическую активность около 200,000 единиц ELISA/мг белка в соответствии с ВСА. Специфическая активность, рассчитанная на основе ELISA, используемого для определения единиц эритропоэтина, только косвенно связана с действительной биологической активностью эритропоэтина. 12 Тестом, обычно проводимым для определения специфической активности in vivo, является экзогипоксический полицитемический биоанализ на мышах, известный специалистам в данной области (такой анализ может определять специфическую активность в IV (иммунизирующих единицах)/мг, как известно специалисту в данной области исследований). Анализ ЖХВР (жидкостная хроматография высокого разрешения). Прибор: система Warers 616 LC, оборудованная детектором PDA модели 996; Колонка: белок Vydac C4, 3 мкм, 4,6 х 250 мМ; Подвижная фаза: А) 0,1% водная трифторуксусная кислота : ацетонитрил, 95:5, В) 0,1% водная трифторуксусная кислота : ацетонитрил,5:95; Градиент: мин.(% В): 5(5), 50(95); Скорость потока: 1 мл/мин.SDS-PAGE анализ выполняют при использовании системы Phast, Pharmacia AB, а измерения плотности проводят на сканирующем измерителе плотности Flying Spot CS-9301 НС, Shimadzu Co, согласно инструкциям производителя и общим знаниям в данной области. Аналитические данные и результаты. Просуммировав данные, полученные после осуществления нескольких циклов очистки, авторы определили специфическую активность эритропоэтинового продукта, выделенного из клеточного супернатанта, которая составила от 500 до 2,000 ELISA единиц/мг; специфическая активность эритропоэтинового продукта, выделенного после первой хроматографической стадии очистки, составила около 35,000-95,000ELISA единиц/мг; специфическая активность конечного эритропоэтинового продукта, полученного как описано в примере 1, составляет, в среднем, около 145,000-175,000 ELISA единиц/мг. ЖХВР-анализ, так же как и SDS-PAGE анализ, выполненные согласно представленным выше описаниям, показали, что конечный эритропоэтиновый продукт имеет основной пик,который занимает более 92% площади под кривой. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ очистки эритропоэтина, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии: а) обеспечивают контактирование материала, содержащего эритропоэтин, с дигидроксиборонилсодержащим хроматографическим носителем, предварительно уравновешенным соответствующим буфером; 13 б) промывают носитель указанным буфером,в) проводят элюирование первым буфером,представляющим собой водный буфер с рН 7,511, включающий соединение, имеющее 1 гидрокси-2-аминогруппы, или, дополнительно,соединение с низкой молекулярной массой, содержащее 1,2-цис-диоловые группы, и собирают целевой продукт. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии а) в качестве материала, содержащего эритропоэтин, используют отфильтрованную культуральную жидкость и при этом дополнительно осуществляют следующие стадии: г) обеспечивают непосредственное контактирование полученного на стадии в) элюата с анионообменным носителем,содержащим функциональные группы четвертичного аммония; д) проводят элюирование вторым буфером и собирают целевой продукт. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют следующие стадии: е) проводят ультрафильтрацию при использовании мембраны с отсечением по мол. массе в интервале 5000 - 30000 Да; ж) при необходимости проводят диафильтрацию для замены буфера на подходящий для осуществления последующей стадии гельфильтрации и з) проводят гель-фильтрацию на разделяющей смоле с отсечением по мол. массе в интервале 5000 - 30000 Да. 4. Способ по любому из пп. 2 или 3, отличающийся тем, что используемая на стадии а) культуральная жидкость имеет рН 7,5-9,0, в качестве уравновешивающего буфера используют водный буфер с концентрацией компонентов буферной системы 25-100 мМ, ионной силой 220 мСм/см 2 и рH 7,5-9,0; на стадии б) осуществляют дополнительное промывание носителя уравновешивающим буфером, включающим от 10 до 100 мМ соединения с низкой молекулярной массой, содержащего 1,2-цис-диоловые группы; на стадии в) в качестве первого элюирующего буфера используют водный буфер с рН 7,5-11,0, включающий соединение, имеющее 1-гидрокси-2-аминогруппы, в концентрации 20-200 мМ и, при необходимости, 2-8 мМ хаотропного агента, 2-40 мМ акцептора цианата и 0,02-0,1 вес.% поверхностно-активного вещества (ПАВ); на стадии г) в качестве анионообменного носителя используют носитель, предварительно уравновешанный водным буфером с рН 7,5-11,0, содержащим 0,01-0,1 вес.% ПАВ и после нанесения элюата на анионообменный носитель осуществляют последовательное промывание указанным уравновешивающим буфером и затем тем же самым буфером, дополнительно содержащим до 50 мМ соли; 14 на стадии д) в качестве второго элюирующего буфера используют буфер с рH 7,5-11,0,содержащий 0,01-0,1 вес.% ПАВ и 150-350 мМ соли. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что дигидроксиборонилсодержащий хроматографический носитель представляет собой фенилборонат-агарозу. 6. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что уравновешивающий буфер выбран из группы, включающей глициновый,фосфатный, триалкиламмоний бикарбонатный буфер или буфер,содержащий 4-(2 гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что уравновешивающий буфер представляет собой буфер,содержащий 4-(2-гидроксиэтил)-1 пиперазинэтансульфоновую кислоту в концентрации около 0,05 М. 8. Способ но любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что рН уравновешивающего буфера составляет около 8,5. 9. Способ по любому из пп.1 или 4-8, отличающийся тем, что соединение с низкой молекулярной массой, содержащее 1,2-цисдиоловые группы, выбрано из группы, включающей нециклические полиолы с короткой цепью, такие как сорбитол, маннитол, адонитол,арабитол, глицерол, эритриол и цис-инозитол, и циклические моносахариды, такие как рибоза и манноза. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что концентрация соединения с низкой молекулярной массой, содержащего 1,2-цис-диоловые группы, составляет около 0,05 М. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что соединение с низкой молекулярной массой, содержащее 1,2-цис-диоловые группы, представляет собой сорбитол. 12. Способ по любому из пп.4-11, отличающийся тем, что анионообменный носитель уравновешивают буфером, который содержит соединение, имеющее 1-гидрокси-2-аминогруппы, в концентрации 0,02-0,2 М. 13. Способ по любому из пп.4-11, отличающийся тем, что второй элюирующий буфер содержит соединение, имеющее 1-гидрокси-2 аминогруппы, в концентрации 0,05 М. 14. Способ по любому из пп.4-13, отличающийся тем, что соединение, имеющее 1 гидрокси-2-аминогруппы, представляет собой 2 амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол,или бис(гидроксиметил)аминоэтан, или N[2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметилэтил)]-глицин, илиN,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин. 15. Способ по любому из пп.4-14, отличающийся тем, что хаотропный агент представляет собой мочевину или ее производное или гуанидин. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что хаотропный агент представляет собой 6 М мочевину. 17. Способ по любому из пп.4-16, отличающийся тем, что цианатный акцептор представляет собой глицин. 18. Способ по любому из пп.2-17, отличающийся тем, что анионообменный носитель,содержащий функциональные группы четвертичного аммония, представляет собой микрокристаллическую целлюлозу или поперечно 16 сшитую агарозу, имеющую диэтиламиноэтил,триэтиламинометил или триметиламинометил функциональные группы. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что анионообменный носитель представляет собой триметиламинометил агарозу. 20. Способ по любому из пп.3-19, отличающийся тем, что гель-фильтрацию проводят на поперечно сшитой декстраноакриламидной гелевой матрице с контролируемым размером пор.