Эталонное соединение, применимое для анализа партий левозимендана

1 Предпосылки изобретения Данное изобретение относится к 4-(2 азидо-3-метил-5-оксотетрагидрофуран-2-ил) фенил]гидразоно]пропандинитрилу (I) и к его применению в качестве эталонного соединения для анализа партий синтеза левозимендана, в частности для определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана. Данное изобретение также относится к аналитическим способам определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана при использовании 4-(2 азидо-3-метил-5-оксотетрагидрофуран-2-ил)фенил]гидразоно]пропандинитрила (I) в качестве эталонного соединения. Левозимендан, представляющий собой (-)энантиомер 4-(1,4,5,6-тетрагидро-4-метил-6 оксо-3-пиридазинил)фенил]гидразоно]пропандинитрила, а также способ его получения описаны, например, в ЕР 565546 В 1. Левозимендан эффективен при лечении сердечной недостаточности и способен к существенному кальциевозависимому связыванию с тропонином. Применение левозимендана для лечения миокардиальной ишемии описано в WO 93/21921. Гемодинамическое действие левозимендана на человека описано Sundberg, S. et al. , Am. J. Cardiol.,1995; 75: 1061-1066. Левозимендан представлен формулой Клинические испытания подтвердили целебное действие левозимендана на пациентов с сердечной недостаточностью. Левозимендан может быть получен с высокой степенью чистоты и почти количественным выходом в результате обработки (-)-6-(4 аминофенил)-5-метил-4,5-дигидро-3(2 Н)-пиридазинона нитритом натрия и малононитрилом,как описано в ЕР 565546 В 1. Однако было установлено, что образцы левозимендана после синтеза иногда проявляют потенциальные генотоксические свойства при исследовании на бактериальную мутагенность (тест Эймса). Краткое описание изобретения Было установлено, что потенциальные генотоксические свойства образцов левозимендана вызваны примесью азидопроизводного формулы (I) Это азидопроизводное является сильным мутагеном, который может быть образован во время синтеза левозимендана в количестве, достаточном для получения положительного результата при исследовании на бактериальную 2 мутагенность. Поэтому данное соединение, называемое 4-(2-азидо-3-метил-5-оксотетрагидрофуран-2-ил)фенил]гидразоно]пропандинитрил (I) может быть использовано в качестве эталонного соединения при обычном анализе партий синтеза левозимендана, особенно при определении потенциально генотоксичных примесей в партиях левозимендана. Присутствие (I) в партии левозимендана означает, что для получения левозимендана, подходящего для использования в качестве лекарственного препарата, необходима дальнейшая рекристаллизация. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - ЖХВД-хроматограмма стандартного 4-(2-азидо-3-метил-3-оксотетрагидрофуран-2-ил)фенил]гидразоно]пропандинитрила(0,4 мкг/мл); фиг. 2 - ЖХВД-хроматограмма сырого левозимендана. Подробное описание изобретения Данное изобретение представляет эталонное соединение, имеющее структуру (I), для определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана. Данное изобретение также представляет эталонный препарат для определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана, включающий соединение (I) необязательно вместе с аналитически приемлемым носителем и по существу не содержащий производных пиридазинила. Данное изобретение также предусматривает применение (I) в качестве эталонного соединения для определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана. Данное изобретение также предусматривает аналитический способ для определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана, отличающийся тем, что соединение (I) применяют в качестве эталонного соединения, особенно при анализе указанного образца левозимендана с помощью жидкостной хроматографии высокого давления(ЖХВД). Далее данное изобретение предусматривает аналитический способ определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана, включающий получение эталонного стандартного раствора путем растворения соединения (I) в растворе, получение аналитического раствора путем растворения образца партии левозимендана в растворе, получение ЖХВД-хроматограммы указанного эталонного стандартного раствора, получение ЖХВД-хроматограммы указанного аналитического раствора и определение концентрации соединения (I) в образце. Термин "аналитически приемлемый носитель" в данном описании означает носитель, не затрудняющий качественный или количественный анализ соединения (I). Методы выбора под 3 ходящего, аналитически приемлемого носителя хорошо известны специалистам в данной области. Примером аналитически приемлемого носителя служит диметилсульфоксид. Соединение (I) может быть получено в результате обработки 6-(4-аминофенил)-5-метил 4,5-дигидро-3(2 Н)-пиридазинона нитритом натрия и малононитрилом, при этом нитрит натрия применяют в молярном избытке, и отделения (I) от реакционной смеси. Эта процедура подробно описана в примере 1. Продукт партии левозимендана предпочтительно анализируют, применяя жидкостную хроматографию высокого давления (ЖХВД). Подходящее оборудование включает, например,колонку для ЖХВД с обращенной фазой С-8 с УФ-детектированием при 360 нм. Подвижной фазой является, например, смесь фосфатного буфера, имеющего рН 2,1, и ацетонитрила. Образец левозимендана растворяют в подходящем растворителе, таком как смесь диметилсульфоксида, метанола и воды. Эталонные растворы получают, растворяя соединение (I) в подходящем растворителе. Время удерживания левозимендана и соединения (I) либо их диастереомеров определяют в применяемых хроматографических условиях. Количество (I) в образце левозимендана определяют, сравнивая хроматограммы раствора образца и раствора эталона. Эта процедура подробно описана в примере 2. Количество нежелательной примеси (I) в партии левозимендана может быть снижено способами, известными в данной области, такими как, перекристаллизация. Левозимендан может быть подвергнут перекристаллизации из любого подходящего растворителя, при этом предпочтительным растворителем является ацетон. Примеры Пример 1. Получение 4-(2-азидо-3-метил 5-оксотетрагидрофуран-2-ил)фенил]гидразоно] пропандинитрила (смесь диастереомеров). 6-(4-Аминофенил)-4,5-дигидро-5-метил 3(2 Н)-пиридазинон (153 г, 0,75 мол.) растворяют в уксусной кислоте (750 мл). К раствору медленно добавляют твердый нитрит натрия(210 г, 3,0 мол.) при 10-20 С. После добавления смесь перемешивают в течение 90 мин при 1020 С. Реакционную смесь быстро выливают в раствор малононитрила (150 г, 2,3 мол.) и воды(1500 мл), имеющий температуру 20 С. Полученную смесь перемешивают при 20-25 С в течение 60 мин, а затем фильтруют и промывают водой. Влажное твердое вещество экстрагируют последовательно тетрагидрофураном (300 мл) и этилацетатом (1900 мл). Соединенные экстракты сушат сульфатом натрия, а растворители выпаривают в вакууме. Остаток измельчают в порошок с этилацетатом (200 мл), фильтруют и фильтрат выпаривают в вакууме. Остаток (8,0 г) подвергают хроматографическому очищению на силикагеле, применяя толуол-этилацетат (2:1) в 4 качестве растворителя для элюирования. После кристаллизации из толуола выход чистой смеси диастереомеров составляет 1,0 г. Основной компонент смеси может быть обогащен многократной кристаллизацией из толуола, однако смесь годится для аналитических целей. 1Hz), 7,54 (d, 1H, J=9 Hz), 7,61 (d, 1H, J=9 Hz),12,6 (широкий s, 1H). Пример 2. Применение 4-(2-азидо-3-метил-5-оксотетрагидрофуран-2-ил)фенил]гидразоно]пропандинитрила (I) в качестве эталонного соединения для ЖХВД. Метод ЖХВД (жидкостная хроматография высокого давления) для анализа соединения (I) в сыром левозимендане основан на применении колонки для ЖХВД с обращенной фазой С-8 с УФ-детектированием при 360 нм. Подвижная фаза состоит из ацетонитрила и фосфатного буфера, имеющего рН 2,1. Реактивы: 1. Метанол, чистоты для ЖХВД; 2. Дигидрофосфат натрия, NaH2PO4 x H2O,Merck; 3. Ортофосфорная кислота, Н 3 РO4, Merck; 4. Фосфатный буфер, рН 2,1: растворяют 1,8 г дигидрофосфата натрия (NaH2PO4) в воде и добавляют 2,0 мл фосфорной кислоты. При необходимости доводят рН 2 М гидроокисью натрия или 1 М фосфорной кислотой. Разбавляют до 1000,0 мл водой. 5. Диметилсульфоксид, BDH; 6. Ацетонитрил, чистоты для ЖХВД; 7. Растворитель: смешать 200 мл метанола с 800 мл воды; 8. 4-(2-Азидо-3-метил-5-оксотетрагидрофуран-2-ил)фенил]гидразоно]пропандинитрил,эталонный стандарт. Стандартные растворы (эталонные препараты соединения (I. Маточный раствор: 10,00 мг 4-(2-азидо-3 метил-5-оксотетрагидрофуран-2-ил)фенил]гидразоно]пропандинитрила растворяют в 100-мл мерной колбе в 20 мл диметилсульфоксида и доводят до нужного объема метанолом. Стандартный раствор 1 (50 мкг/мл): 5,00 мл маточного раствора разбавляют до 10,0 мл растворителем. Стандартный раствор 2 (0,4 мкг/мл =40 частей на млн.): 1,00 мл маточного раствора разбавляют до 250,0 мл растворителем. Количественный предельный раствор (0,1 мкг/мл = 10 ч. на млн): 5,00 мл стандартного раствора 2 разбавляют до 20,0 мл растворителем. 5 Аналитический раствор 100 мг исследуемого образца растворяют в 10 мл мерной колбе в 3 мл диметилсульфоксида и доводят до нужного объема растворителем. Условия для хроматографии: Прибор Жидкостной хроматограф Детектор УФ-VIS, длина волны детектирования 360 нм Колонка Симметричная С 8, 3,0 мкм 7,5 см х 4,6 мм Температура термостата Окружающей среды Подвижная фаза А: фосфатный буфер, рН 2,1 В: ацетонитрил%В 0 мин 20% 5 мин 30% 15 мин 30% 30 мин 90% Скорость потока 0,8 мл/мин Объем инжектирования 100 мкл Рабочий период 30 мин Период после процедуры 10 мин Время удерживания: Левозимендан - около 13 мин; соединение (I), дополнительный диастереомер: около 24 мин; соединение (I), основной диастереомер: около 25 мин Соответствие системы 1. Репликативные инъекции количественных предельных растворов должны быть повторяемыми; 6 инъекций, RSD (относительное стандартное отклонение) - 10,0%. Процедура После удовлетворения всех критериев соответствия системы приступают к инъекциям стандарта и образцов. Расчеты Концентрацию основного диастереомера соединения (I) в частях на млн. рассчитывают в соответствии со следующим уравнением:Cst = концентрация основного диастереомера соединения (I) в стандартном растворе 4(2-азидо-3-метил-5-оксотетрагидрофуран-2-ил) фенил]гидразоно]пропандинитрила (мг/мл);Rx = площадь пика основного диастереомера соединения (I) в в хроматограмме аналитического раствора;Rst = площадь пика основного диастереомера соединения (I) в хроматограмме стандартного раствора 4-(2-азидо-3-метил-5-оксатетрагидрофуран-2-ил)фенил]гидразоно]пропандинитрила(мл). Концентрацию дополнительного диастереомера соединения (I) в частях на млн. рассчитывают в соответствии со следующим уравнением. Основной диастереомер соединения (I) применяют в качестве эталонного стандарта.Cst = концентрация дополнительного диастереомера соединения (I) в стандартном растворе 4-(2-азидо-3-метил-5-оксотетрагидро 002854Rx = площадь пика дополнительного диастереомера соединения (I) в хроматограмме аналитического раствора;Rst = площадь пика дополнительного диастереомера соединения (I) в хроматограмме стандартного раствора 4-(2-азидо-3-метил-5 оксотетрагидрофуран-2-ил)фенил]гидразоно] пропандинитрила;(мл); 1,023 = поправочный коэффициент дополнительного диастереомера соединения (I). Хроматограмма полученного стандарта 4-(2-азидо-3-метил-5-оксотетрагидрофуран-2 ил)фенил]гидразоно]пропандинитрила(0,4 мкг/мл) представлена на фиг. 1. Время удерживания основного диастереомера соединения (I) составляет 25,180 мин, а дополнительного диастереомера соединения (I) - 24,866 мин. Хроматограмма сырого левозимендана представлена на фиг. 2. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Соединение, отличающееся тем, что оно имеет структуру формулы I и его диастереомеры. 2. Эталонный препарат для определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана, содержащий соединение по п.1. 3. Препарат по п.2, по существу, не содержащий соединений пиридазинила. 4. Эталонный препарат для определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана, содержащий соединение по п.1 вместе с аналитически приемлемым носителем. 5. Препарат по п.4, по существу, не содержащий соединений пиридазинила. 6. Применение соединения по п.1 в качестве эталонного соединения для определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана. 7. Аналитический способ определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана, отличающийся тем, что соединение по п.1 применяют в качестве эталонного соединения. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что образец партии левозимендана анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД). 9. Аналитический способ определения потенциально генотоксичных примесей в образцах партии левозимендана, включающий получение эталонного стандартного раствора путем растворения соединения по п.1 в растворе, получение аналитического раствора путем растворения образца партии левозимендана в растворе, получение ЖХВД-хроматограммы указанного эталонного стандартного раствора, получение ЖХВД-хроматограммы указанного аналитического раствора и определение концентрации соединения по п.1 в образце.