Синтетические соединения, пригодные в качестве агентов формирования клубеньков бобовых растений, и способы их получения

009557 Настоящее изобретение относится к синтетическим соединениям, которые являются активными на растениях, особенно в качестве факторов формирования клубеньков, а также как стимуляторы роста растения, и к способам получения таких соединений. Известно, что процесс фиксации азота бобовыми основан на симбиозе между этими растениями и бактериями почвы, Rhizobia. Симбиоз Rhizobium-бобовое производит каждый год, посредством клубеньков корня, больше аммония, чем вся промышленность азотных удобрений. Этот симбиоз, таким образом,играет значительную агрономическую роль. Бобовые очень богаты белками и производят приблизительно одну треть потребляемых во всем мире растительных белков; это относится к таким бобовым, как соя,горох, конские бобы, арахис, бобы и люпин, и к фуражным растениям, таким как люцерна и клевер. Формирование фиксирующих азот клубеньков начинается с обмена молекулярными сигналами,флавоноидами, секретируемыми растением, и факторами формирования клубеньков (Nod-факторы), синтезируемыми бактерией. Эти факторы состоят из олигосахаридного фрагмента и липидной цепи, присоединенной к этому скелету на невосстанавливающем конце. Они имеют структурные признаки (замещения сахаров на обоих концах и изменчивости цепи), которые делают их специфичными в отношении пары бобовое-бактерия. Эти липохито-олигосахариды (LCO) могут быть выделены непосредственно из специфической культуры Rhizobia, синтезированы химически или получены хемоферментативным путем. В последнем методе олигосахаридный скелет может быть сформирован путем культивирования рекомбинантных бактериальных штаммов Escherichia coli в ферментере и липидная цепь может быть присоединена химически. Обработка семян бобовых, например сои, Nod-факторами при очень низких концентрациях может привести к большому увеличению числа фиксирующих азот клубеньков корня и существенному увеличению урожаев при агрономических условиях. Таким образом, ясно, что в будущем соединения типаNod-фактора будут производиться промышленностью для крупномасштабного агрономического использования. Однако промышленное получение и упаковка натуральных Nod-факторов имеют недостатки двух типов: (1) натуральные Nod-факторы трудно тестировать с помощью простых методов, таких как спектрометрические методы; (2) они нестабильны в присутствии растений или в почвах, в особенности потому, что они имеют связь -CO-NH-, которая может быть разорвана растением или микробным ферментом, присутствующим в ризосфере. Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу получения соединения типа Nodфактора, причем некоторые из этих соединений составляют другой аспект изобретения. В частности,определенные биологически активные соединения демонстрируют сильное поглощение в ультрафиолетовом диапазоне, что упрощает их тестирование в процессе их промышленного получения, и позволяет легко их обнаружить и оценить в продукте, предназначенном для вывода на рынок, и обеспечивает их стабильность и хранение в составе таких тестируемых продуктов. Кроме того, некоторые из этих синтезируемых соединений показывают более высокую стабильность, чем натуральные Nod-факторы. Описанные соединения могут использоваться для обработки растений или частей растения. Термин"растения" означает дикие растения, а также сельскохозяйственные культуры (включая будущие сельскохозяйственные культуры). Сельскохозяйственные культуры могут быть получены обычными методами селекции, методами генной инженерии или комбинацией этих двух методов. Термин "части растения" означает все воздушные или подземные части растения или органы, такие как семена цветковых растений, корни, клубни, ризомы, проростки, стебли, листья и цветки. Также в категорию частей растения включаются продукты урожая и также репродуктивный вегетативный или герминативный материал, такой как ризома, клубень, семя, почка или привой. Описанные соединения могут использоваться для обработки растений или частей растения непосредственно, или посредством действия окружающей среды, или их культуры или среды хранения. Обычными способами обработки являются, например, погружение, испарение, напыление, распыление,намазывание и нанесение и для репродуктивного материала, в особенности для семян, нанесение простого или многослойного покрытия. В случае обработки репродуктивного материала, особенно семян, описанные соединения могут быть нанесены индивидуально или в комбинации с другими активными молекулами, такими как фунгициды, инсектициды, акарициды, нематициды, регуляторы роста и гербициды. Описанные соединения и их комбинации с активными молекулами, принадлежащими к вышеупомянутым семействам, могут быть нанесены непосредственно или с использованием подходящего состава. Этот состав может быть разбавлен,или к нему перед использованием могут быть добавлены пленкообразующие агенты. Использование может иметь место на любой из стадий обработки семян между сбором урожая и сеянием, включая самосев.-1 009557 Подходящие составы и способы обработки семян известны специалистам и описаны, среди прочего, в следующих документах: US 4272417 A, US 4245432 A, US 4808430 A, US 5876739 A, US 2003/0176428 A1,WO 2002/080675A1, WO 2002/028186 А 2. Обычно используемыми составами могут быть растворы, эмульсии, суспензии, порошки, распыляемые порошки, пасты, растворимые пасты, гели, гранулы, концентрированные суспо-эмульсии, натуральные или синтетические пропитанные материалы, а также микроинкапсулированные формы, в которых используют полимеры. Эти составы обычно получают, например, смешивая описанные соединения и/или их комбинации с другими активными молекулами с твердыми или жидкими носителями состава, с использованием, в случае необходимости, эмульгирующих, и/или диспергирующих, и/или пенообразующих поверхностно-активных веществ. Они могут также содержать красители, такие как минеральные пигменты. Целевой Nod-фактор представляет собой в особенности фактор, связанный с люцерной (1), как описано выше. Среди всех существующих бобовых люцерна и вика были предметом многочисленных исследований. На основании нескольких тестов активности, выполненных с различными аналогами Nodфактора, была установлена связь между структурой LCO и реакцией растения. Выделенный фактор формирования клубеньков, который является самым активным на люцерне, представляет собой тетрамер,сульфатированный в положении 6 восстанавливающего сахара, ацетилированный в положении 6 сахара,расположенного на невосстанавливающем конце, и ацилированный цепью из 16 атомов углерода, содержащей две ненасыщенные связи (С 16:22 Е, 9Z) (1). Было показано, что отсутствие ацетата, добавление звена глюкозамина или потеря одной из этих двух ненасыщенных связей влечет только умеренное снижение активности. Тест изменения длины цепи показал максимальную активность для цепи из 16 атомов углерода. Наконец, сульфат имеет главное значение для распознавания Nod-фактора люцерной, но, с другой стороны, его отсутствие необходимо для действия в вике. Исследования показали, что конъюгированные ненасыщенные связи в 2 цепи липида важны для формирования клубеньков, поскольку аналог, ацилированный цепью C16:19Z, менее активен (на порядок). На основании этих результатов был получен ряд аналогов, для которых конъюгированная амидная связь имитируется бензамидной связью. Эти соединения составляют один из аспектов настоящего изобретения. Другой ряд аналогов, содержащих функцию типа бензиламина, составляет другой аспект изобретения. Такие соединения способны вызывать или промотировать явления формирования клубеньков у бобовых и стимулировать рост и развитие растения. Соединения, являющиеся факторами формирования клубеньков согласно изобретению, предпочтительно представляют собой соединения формулы (I)n обозначает 1, 2 или 3; А обозначает заместитель, выбранный из -С(О)-, -C(S)-, -СН 2-, -CHR10-, -CR10R11-, -C(O)O-, -C(O)S-,-C(S)O-, -C(S)S-, -C(O)NH-, -C(NH)NH- и -C(S)NH-; В обозначает арилен; гетероарилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; нафтилен; гетеронафтилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов;-2 009557 двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических или гетероароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов, включая 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; бифенилен; или гетеробифенилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; причем эти группы могут быть замещены одним или двумя заместителями R12 и R13, выбранными,независимо друг от друга, из галогена, CN, С(О)OR14, С(О)NR15R16, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14,NR15R16 и C1-6-алкила; С обозначает заместитель, выбранный из -O-, -S-, -СН 2-, -CHR17-, -CR17R18- и -NR19;D обозначает прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 2 до 20 атомов углерода; Е и G обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, ОН, OR20, NH2 и NHR20;R2, R3, R6, R14, R15, R16 и R19 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н,C1-6-алкила, С(О)C1-6-алкила, -С(S)C1-6-алкила, -C(O)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2,-C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила;R10, R11, R17 и R18 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из C1-6-алкила и F;R20, R21, R22, R23, R24 и R25 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из С(О)C1-6-алкила, -C(S)C1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -С(O)NHC1-6 алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила; а также их возможные геометрические и/или оптические изомеры, энантиомеры и/или диастереоизомеры, таутомеры, соли, N-оксиды, сульфоксиды, сульфоны, металлические или металлоидные комплексы, которые являются приемлемыми с точки зрения сельского хозяйства. Среди соединений, определенных выше, самыми важными соединениями являются соли, в частности соли лития, натрия, калия или тетраалкиламмония. Предпочтительно соединения формулы (I) имеют одну или другую из следующих характеристик,взятых отдельно или в комбинации:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил. Среди этих соединений предпочтительными являются соединения формулы (I), одновременно имеющие следующие характеристики:R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; еще более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; и наиболее предпочтительно соединения формулы (I), одновременно имеющие следующие характеристики:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил. Среди этих предпочтительных соединений можно назвать соединения формулы (I), одновременно имеющие следующие характеристики:D обозначает прямую цепь на основе углеводорода, содержащую 11 атомов углерода, которая является насыщенной или ненасыщена между атомами углерода 4 и 5; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил. Среди соединений настоящего изобретения соединения, в которых А обозначает карбонильную группу, являются особенно предпочтительными и могут быть представлены формулой (Ia)n обозначает 1, 2 или 3,В обозначает арилен; гетероарилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; нафтилен; гетеронафтилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических или гетероароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов, включая 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; бифенилен; или гетеробифенилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; причем эти группы могут быть замещены одним или двумя заместителями R12 и R13, выбранными,независимо друг от друга, из галогена, CN, С(О)OR14, C(O)NR15R16, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14,NR15R16 и C1-6-алкила; С обозначает заместитель, выбранный из -O-, -S-, -CH2-, -CHR17-, -CR17R18-, -NH- и -NR19;D обозначает прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 2 до 20 атомов углерода; Е и G обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, ОН, OR20, NH2 и NHR20;R2, R3 и R6 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, C1-6-алкила,С(О)C1-6-алкила, -С(S)C1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -С(O)NHC1-6-ал-4 009557 кила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила;R10, R11, R17 и R18 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из C1-6-алкила и F;R14, R15, R16 и R19 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, C1-6-алкила,С(О)C1-6-алкила, -С(S)С 1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила;R20, R21, R22, R23, R24 и R25 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из С(О)C1-6-алкила, -C(S)C1-6-алкила, -C(O)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -С(О)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила; а также их возможные геометрические и/или оптические изомеры, энантиомеры и/или диастереоизомеры, таутомеры, соли, N-оксиды, сульфоксиды, сульфоны, металлические или металлоидные комплексы, которые являются приемлемыми с точки зрения сельского хозяйства. Среди соединений, определенных выше, самыми важными соединениями являются соли, в частности соли лития, натрия, калия или тетраалкиламмония. Среди этих соединений формулы (Ia) предпочтительными являются соединения, которые имеют следующие характеристики, взятые отдельно или в комбинации:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; еще более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает H, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил. Среди этих соединений формулы (Ia) более предпочтительными являются соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; или те, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую цепь на основе углеводорода, содержащую 11 атомов углерода, которая является насыщенной или ненасыщена между атомами углерода 4 и 5; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил. Среди соединений по изобретению соединения, в которых А обозначает метилен, также являются особенно предпочтительными и могут быть представлены формулой (Ib)n обозначает 1, 2 или 3; В обозначает арилен; гетероарилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; нафтилен; гетеронафтилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических или гетероароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов, включая 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; бифенилен; или гетеробифенилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; причем эти группы могут быть замещены одним или двумя заместителями R12 и R13, выбранными,независимо друг от друга, из галогена, CN, С(О)OR14, C(O)NR15R16, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14,NR15R16 и C1-6-алкила; С обозначает заместитель, выбранный из -O-, -S-, -CH2-, -CHR17-, -CR17R18-, -NH- и -NR19;D обозначает прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 2 до 20 атомов углерода; Е и G обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, ОН, OR20, NH2 и NHR20;R2, R3 и R6 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, C1-6-алкила,С(О)C1-6-алкила, -С(S)C1-6-алкила, -С(О)ОС 1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила;R10, R11, R17 и R18 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из C1-6-алкила и F;R14, R15, R16 и R19 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, C1-6-алкила,С(О)C1-6-алкила, -С(S)С 1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила;R20, R21, R22, R23, R24 и R25 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из С(О)C1-6-алкила, -C(S)C1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила; а также их возможные геометрические и/или оптические изомеры, энантиомеры и/или диастереоизомеры, таутомеры, соли, N-оксиды, сульфоксиды, сульфоны, металлические или металлоидные комплексы, которые являются приемлемыми с точки зрения сельского хозяйства. Среди соединений, определенных выше, самыми важными соединениями являются соли, в частности соли лития, натрия, калия или тетраалкиламмония.-6 009557 Среди этих соединений формулы (Ib) предпочтительными являются соединения, которые имеют следующие характеристики, взятые отдельно или в комбинации:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; еще более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил. Среди этих соединений формулы (Ib) более предпочтительными являются соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; или те, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую цепь на основе углеводорода, содержащую 11 атомов углерода, которая является насыщенной или ненасыщена между атомами углерода 4 и 5; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил. Среди соединений по изобретению соединения, в которых С обозначает атом кислорода, также являются особенно предпочтительными и могут быть представлены формулой (Ic)n обозначает 1, 2 или 3, предпочтительно 2 или 3; А обозначает заместитель, выбранный из -С(О)-, -C(S)-, -СН 2-, -CHR10-, -CR10R11-, -C(O)O-, -C(O)S-,-C(S)O-, -C(S)S-, -C(O)NH-, -C(NH)NH- и -C(S)NH-, предпочтительно -C(O)-; В обозначает арилен; гетероарилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; нафтилен; гетеронафтилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических или гетероароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов, включая 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; бифенилен; или гетеробифенилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; причем эти группы могут быть замещены одним или двумя заместителями R12 и R13, выбранными,независимо друг от друга, из галогена, CN, С(О)OR14, C(O)NR15R16, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14,NR15R16 и C1-6-алкила;D обозначает прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 2 до 20 атомов углерода, предпочтительно прямую цепь на основе углеводорода,содержащую 11 атомов углерода, которая является насыщенной или ненасыщена между атомами углеродом 4 и 5; Е и G обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, ОН, OR20, NH2 и NHR20,предпочтительно NHC(O)CH3;R2, R3 и R6 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, C1-6-алкила,С(О)C1-6-алкила, -С(S)C1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила;R10, R11, R17 и R18 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из C1-6-алкила и F;R14, R15, R16 и R19 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, C1-6-алкила,С(О)C1-6-алкила, -С(S)С 1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила;R20, R21, R22, R23, R24 и R25 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из С(О)C1-6-алкила, -C(S)C1-6-алкила, -C(O)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила; а также их возможные геометрические и/или оптические изомеры, энантиомеры и/или диастереоизомеры, таутомеры, соли, N-оксиды, сульфоксиды, сульфоны, металлические или металлоидные комплексы, которые являются приемлемыми с точки зрения сельского хозяйства. Среди соединений, определенных выше, самыми важными соединениями являются соли, в частности соли лития, натрия, калия или тетраалкиламмония. Среди соединений формулы (Ic) предпочтительными являются соединения, которые имеют одну или другую из следующих характеристик, взятых отдельно или в комбинации:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; еще более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил,более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую цепь на основе углеводорода, содержащую 11 атомов углерода, которая является насыщенной или ненасыщена между атомами углерода 4 и 5; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил. Среди соединений по изобретению соединения, для которых А обозначает карбонильную группу и С обозначает атом кислорода, являются наиболее предпочтительными и могут быть представлены формулой (Id)n обозначает 1, 2 или 3, предпочтительно 2 или 3; В обозначает арилен; гетероарилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; нафтилен; гетеронафтилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических или гетероароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов, включая 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; бифенилен; или гетеробифенилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; причем эти группы могут быть замещены одним или двумя заместителями R12 и R13, выбранными,независимо друг от друга, из галогена, CN, С(О)OR14, C(O)NR15R16, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14,NR15R16 и C1-6-алкила;D обозначает прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 2 до 20 атомов углерода, предпочтительно прямую цепь на основе углеводорода, содержащую 11 атомов углерода, которая является насыщенной или ненасыщена между атомами углерода 4 и 5; Е и G обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, ОН, OR20, NH2 и NHR20,-9 009557 предпочтительно NHC(O)CH3;R2, R3 и R6 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, C1-6-алкила,С(О)C1-6-алкила, -С(S)C1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -C(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила, предпочтительно Н;R10, R11, R17 и R18 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из C1-6-алкила и F;R14, R15, R16 и R19 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, C1-6-алкила,-С(О)C1-6-алкила, -С(S)С 1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила;R20, R21, R22, R23, R24 и R25 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из-С(О)C1-6-алкила, -C(S)С 1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила; а также их возможные геометрические и/или оптические изомеры, энантиомеры и/или диастереоизомеры, таутомеры, соли, N-оксиды, сульфоксиды, сульфоны и металлические или металлоидные комплексы, которые являются приемлемыми с точки зрения сельского хозяйства. Среди соединений, определенных выше, самыми важными соединениями являются соли, в частности соли лития, натрия, калия или тетраалкиламмония. Среди соединений формулы (Id) предпочтительными являются соединения, которые имеют одну или другую из следующих характеристик, взятых отдельно или в комбинации:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; еще более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил,и наиболее предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую цепь на основе углеводорода, содержащую 11 атомов углерода, которая является насыщенной или ненасыщена между атомами углерода 4 и 5; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил. Среди соединений по изобретению соединения, для которых А обозначает метилен и С обозначает атом кислорода, являются также наиболее предпочтительными и могут быть представлены формулой (Ie)n обозначает 1, 2 или 3, предпочтительно 2 или 3; В обозначает арилен; гетероарилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; нафтилен; гетеронафтилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов; двухвалентный радикал, полученный из 2 конденсированных ароматических или гетероароматических колец, каждое из которых содержит 5 или 6 атомов, включая 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; бифенилен; или гетеробифенилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; причем эти группы могут быть замещены одним или двумя заместителями R12 и R13, выбранными,независимо друг от друга, из галогена, CN, С(О)OR14, C(O)NR15R16, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14,NR15R16 и C1-6-алкила;D обозначает прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 2 до 20 атомов углерода, предпочтительно прямую цепь на основе углеводорода,содержащую 11 атомов углерода, которая является насыщенной или ненасыщена между атомами углерода 4 и 5; Е и G обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, ОН, OR20, NH2 и NHR20,предпочтительно NHC(O)СН 3;R2, R3 и R6 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, C1-6-алкила,С(О)C1-6-алкила, -С(S)С 1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -C(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила, предпочтительно Н;R10, R11, R17 и R18 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из C1-6-алкила и F;R14, R15, R16 и R19 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, C1-6-алкила,-С(О)C1-6-алкила, -С(S)С 1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -С(S)NHC1-6-алкила и -С(NH)NHC1-6-алкила;R20, R21, R22, R23, R24 и R25 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из С(О)C1-6-алкила, -C(S)C1-6-алкила, -С(О)OC1-6-алкила, -C(O)NH2, -C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(O)NHC1-6-алкила, -C(S)NHC1-6-алкила и -C(NH)NHC1-6-алкила; а также их возможные геометрические и/или оптические изомеры, энантиомеры и/или диастереоизомеры, таутомеры, соли, N-оксиды, сульфоксиды, сульфоны и металлические или металлоидные комплексы, которые являются приемлемыми с точки зрения сельского хозяйства. Среди соединений, определенных выше, самыми важными соединениями являются соли, в частности соли лития, натрия, калия или тетраалкиламмония. Среди соединений формулы (Ie) предпочтительными являются соединения, которые имеют одну- 11009557 или другую из следующих характеристик, взятых отдельно или в комбинации:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил; еще более предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 3 до 17 атомов углерода; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(C1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил,и наиболее предпочтительно соединения, которые одновременно имеют следующие характеристики:D обозначает прямую цепь на основе углеводорода, содержащую 11 атомов углерода, которая является насыщенной или ненасыщена между атомами углерода 4 и 5; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R8 обозначает Н, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, SO3N(С 1-8 алкил)4, фукозил или метилфукозил. Среди соединений формулы (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) или (Ie) согласно изобретению предпочтительными являются соединения, в которых В обозначает заместитель, выбранный изR12 и R13 обозначают два заместителя, выбранных, независимо друг от друга, из галогена, CN, CF3,- 12009557OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14, NR15R16 и C1-6-алкила. Среди соединений формулы (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) или (Ie) согласно изобретению предпочтительными являются соединения, в которых В обозначает арилен; гетероарилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; нафтилен; или гетеронафтилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; причем эти группы могут быть замещены одним или двумя заместителями R12 и R13, выбранными,независимо друг от друга, из галогена, CN, С(О)OR14, C(O)NR15R16, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14,NR15R16 и C1-6-алкила; предпочтительно соединения, для которых В обозначает арилен; или гетероарилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; причем эти группы могут быть замещены одним или двумя заместителями R12 и R13, выбранными,независимо друг от друга, из галогена, CN, С(О)OR14, C(O)NR15R16, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14,NR15R16 и C1-6-алкила; более предпочтительно соединения, для которых В обозначает фенилен; или гетерофенилен, содержащий 1 или 2 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы; причем эти группы могут быть замещены одним или двумя заместителями R12 и R13, выбранными,независимо друг от друга, из галогена, CN, С(О)OR14, C(O)NR15R16, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14,NR15R16 и C1-6-алкила; в частности, можно назвать соединения, для которых В обозначает фенилен В 1, который может быть замещен одним или двумя заместителями R12 и R13, выбранными, независимо друг от друга, из галогена, CN, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14, NR15R16 и C1-6-алкила. Среди предпочтительных соединений по изобретению можно также назвать соединения, которые имеют одну из следующих характеристик, взятых отдельно или в комбинации:R9 обозначает атом водорода; еще более предпочтительно соединения, которые имеют следующую комбинацию характеристик:D обозначает прямую, насыщенную или ненасыщенную цепь на основе углеводорода, содержащую от 7 до 15 атомов углерода; предпочтительно цепь на основе углеводорода согласно одной из формул,представленных ниже:s=5-13; причем m+р 12 и m+р 4; еще более предпочтительно цепь на основе углеводорода согласно одной из формул, представленных ниже:q=6-14; причем m+р 12 и m+р 4; и наиболее предпочтительно прямую цепь на основе углеводорода, содержащую 11 атомов углерода, которая является насыщенной или ненасыщена между атомами углерода 4 и 5; Е и G обозначают NHC(O)CH3;R27 и R28 обозначают, независимо друг от друга, заместитель, выбранный из Н, С(О)CH3, SO3H,SO3Li, SO3Na, SO3K и SO3N(С 1-8 алкил)4, предпочтительно R27 и R28 обозначают Н. В качестве примеров соединений согласно изобретению, которые являются особенно выгодными и предпочтительными, могут быть названы соединения, соответствующие одной из следующих формул:- 15009557 в которых, когда присутствует М, он обозначает катион, выбранный из Н+, Li+, Na+, K+ и (C1-8 алкил)4N+. Помимо соединений по изобретению, которые были только что специфически описаны, варианты комбинаций возможных заместителей, особенно для формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) и (Ie), также являются частью изобретения. Известно, что олигомер хитина, не содержащий липидную цепь, не активен и что деградация Nodфакторов путем разрушения амидной связи в ризосфере, таким образом, приводит к потере активности. Чтобы ограничить или даже предотвратить эту деградацию, был получен ряд аналогичных соединений, некоторые из которых более устойчивы, чем природные Nod-факторы. Структура соединений согласно изобретению Были получены соединения, содержащие метазамещенную бензамидную группу. Предпочтительно сохранять идентичным общее число атомов в цепи (16) и также ненасыщенность цис-типа в положении 9. Практически, для получения исходных материалов липидная цепь может быть связана с ароматическим кольцом через атом кислорода. Также синтезировали аналог 4, содержащий метазамещенную бензиламиногруппу, а также N-ацетилированный аналог 5, который позволяет достичь полного заряда природного продукта. Эти аналоги были получены в виде сульфатированного ряда. Два других сульфатированных аналога, один из которых содержит полностью насыщенную цепь, а другой ненасыщенную цепь типа алкина, позволяют изучить эффект ненасыщенности типа Z в положении 9, имеющейся в природном продукте. Наконец, два сульфатированных аналога, замещение на ароматическом кольце которых находится в орто-положении для одного и в пара-положении для другого, позволяют изучить эффект ненасыщенности транс-типа, расположенного в положении 2 в природном продукте.- 16009557 Наконец, был получен аналог, полученный из пентамера фукозила, имеющий метазамещение на цепи. Контролем для биологических тестов являются следующие соединения: Синтез различных ароматических цепей Для бензамидных LCO сочетание с аминотетрамером осуществляли с бензоилхлоридом (ацилирование), а для бензильных LCO - с бензальдегидом (восстановительное алкилирование). Синтез ароматических цепей, метазамещенных ундец-4Z-енилоксицепью Согласно схеме реакции, приведенной ниже, получали сложный метиловый эфир 15, который может быть восстановлен до альдегида или омылен до кислоты (ацилхлоридного предшественника). Для этого используют 1-иодундец-4Z-ен 13, чтобы алкилировать метил-3-гидроксибензоат. Выделяли сложный эфир 15 с выходом 76%. Преобразование сложного эфира в альдегид 17 выполняли в две стадии.- 17009557 Кроме того, ацилхлорид 19 получали омылением сложного эфира 15 с последующей реакцией с оксалилхлоридом. Синтез ароматических цепей, метазамещенных ундеканилокси и ундец-4-инилоксицепями Та же самая процедура с 1-бромундеканом или 1-иод-ундец-4-ином в безводном ДМФА с последующим омылением и формированием хлорида приводит к хлорангидридам кислоты 23 и 27. Синтез ароматических цепей, орто- или паразамещенных ундец-4Z-енилоксицепью Хлорангидриды кислоты 31 и 35 получают сходным образом из 29 и 33, которые получены, как описано ранее, сочетанием по Williamson 1-иод-ундец-4Z-ена 13 с метил-2-гидроксибензоатом 28 (или метилсалицилатом) с выходом 66% и с метил-4-гидроксибензоатом 32 с выходом 79%. Омыления и преобразования в хлорид являются количественными в обоих случаях. Сочетание может быть выполнено путем растворения исходного материала в смеси ДМФА-вода в присутствии гидрокарбоната натрия. При этих условиях только свободный амин ацилируется. С 6 экв. хлорида и после реакции в течение 18 ч достигнуто преобразование приблизительно 60%, но реакция является высоко селективной. Таким образом, выделяют 33% целевого продукта 3. Чистоту продукта проверяют ВЭЖХ. Ультрафиолетовый (УФ) спектр поглощения продукта 3 существенно отличается от спектра поглощения контрольного соединения 12, особенно из-за присутствия в 3 пика поглощения при 289 нм. Такой пик, вследствие наличия бензамидной группы, не существует для соединения 12. Это иллюстрирует УФ свойства некоторых из соединений согласно изобретению, делающие легким их тестирование, в отличие от естественных Nod-факторов. В отличие от соединения 12, соединение 3 также имеет характерную флуоресценцию при 345 нм при возбуждении при 289 нм.- 19009557 Сочетание с 3-(ундеканилокси)бензоилхлоридом 23 и 3-(ундец-4-инилокси)бензоилхлоридом 27 Повторяют ту же самую процедуру, как в случае предыдущего производного, т.е. растворение в смеси ДМФА-вода и использование нескольких эквивалентов хлорида. При этих условиях получают насыщенный аналог 6 с выходом 32% (и 47% преобразованием) и аналог 7, содержащий тройную связь, с выходом 31% (и 70% преобразованием). Чистоту также проверяют ВЭЖХ. Сочетание с 2-(ундец-4Z-енилокси)бензоилхлоридом 31 и 4-(ундец-4Z-енилокси)бензоилхлоридом 35 Для этих двух аналогов, используя подобный протокол, получали выход 48% для ортозамещенных производных 8 и выход 40% для паразамещенных производных 9. Для обеих реакций использовались 4 экв. хлорида. Чистоту также проверяют ВЭЖХ. Реакцию осуществляли, как в предыдущем случае, в смеси ДМФА-вода, в которой исходный материал и хлорид являются растворимыми. Для облегчения финальной очистки реакцию осуществляли в- 20009557 присутствии основной смолы Dowex (НСО 3-). В конце реакции реакционную среду разбавляли смесью ацетонитрил/вода и целевое соединение очищали фильтрованием смолы через кислотную смолу Dowex (H+), концентрировали и промывали твердый остаток этилацетатом и затем водой. Таким образом выделяли 22% целевого продукта 2. Реакцию осуществляли, как в предыдущем случае, в смеси ДМФА-вода, в которой исходный материал и хлорид являются растворимыми. Для облегчения финальной очистки реакцию осуществляли в присутствии основной смолы Dowex (НСО 3-). В конце реакции реакционную среду разбавляли смесью ацетонитрил/вода и целевое соединение очищали фильтрованием смолы через кислотную смолу Dowex (H+), концентрировали и промывали твердый остаток этилацетатом и затем водой. Таким образом выделяли 28% целевого продукта 10. Восстановительное алкилирование сульфатированного тетрамера с использованием 3-(ундец-4Z-енилокси)бензальдегида Алкилирование тетрамера CO-IV (NH2, S) Реакцию восстановительного алкилирования осуществляли в безводном ДМФА в присутствии бромида лития. С 12 экв. альдегида и 15 экв. цианоборгидрида натрия 71% ожидаемого продукта сочетания 4 выделяли хроматографией на силикагеле через 24 ч. Реакцию осуществляли в смеси этилацетат-метанол-вода путем добавления уксусного ангидрида в присутствии гидрокарбоната натрия. Через 12 ч исходный материал 4 удаляют пропусканием через смолу Н+. После очистки на силикагеле выделяли целевой продукт 5 с выходом 77%. Чистоту проверяли ВЭЖХ.- 21009557 Тесты на активность Тест активности на умеренных бобовых группы Galegoid Умеренные бобовые группы Galegoid содержат в клубеньках Rhizobia, которые продуцируют Nodфакторы с гидрофобной цепью, имеющей двойную связь, сопряженную с карбонильной группой. Эта группа включает важные бобовые культуры, такие как люцерна, горох, кормовые бобовые, нут и клевер. Сульфатированные продукты тестировали на люцерне на индукцию формирования клубеньков корня и на модели бобового Medicago truncatula для индукции экспрессии симбиотического гена, кодирующего ранний нодулин. Тесты формирования клубеньков на люцерне Проростки люцерны выращивают при аксенических условиях в пробирках на бедной азотом агаровой среде (Demont-Caulet et al., Plant Physiol., 120, 83-92, 1999). Необработанные проростки служат контролем. Природные Nod или синтетические LCO-факторы добавляют в указанных концентрациях. Результат тестов формирования клубеньков Бензамидное производное 3, метазамещенное ундец-4Z-енилоксицепью, демонстрирует выгодную активность, подобную активности сульфатированного тетрамера 11, ацилированного контрольной цепью А: 11; В: 3; контроль: без LCO Бензильное производное 4 имеет умеренную активность по сравнению с бензамидным производным 3. А: 11; В: 3; С: 4; контроль: без LCO На фиграх выше 10-7 М (и т.д.) означает 10-7 М (и т.д.). Наконец, N-ацетилирование бензильного производного 4 приводит к улучшению ответа, но активность остается ниже, чем активность бензамидного производного 3. А: 3 до 10-7 М; В: 4 до 10-7 М; С: 5 до 10-7 М; D: 11 до 10-7 М; Е: 11 до 10-9 М; контроль: без LCO Эти результаты указывают важность амидной связи. Результаты, полученные с этими бензамидными производными, подтверждают эффект сопряжения двойной амидной связи, присутствующего в природном соединении. Бензамид 7, метазамещенный ундец-4-инилоксицепыо, показывает активность, сопоставимую с активностью бензамидного производного 3, тогда как бензамидное соединение 6, замещенное полностью насыщенной цепью, показывает несколько меньшую активность. Эти результаты показывают, что ненасыщенность в положении 4 может привести к повышению активности. А: 3; В: 9; С: 8; D: 7; Е: 6; контроль: без LCO Тесты, касающиеся бензамидных производных 8 и 9, орто- и паразамещенных ундец-4Z-енилоксицепью, показывают аналоги, которые являются менее активными, чем метазамещенное бензамидное производное 3. Таким образом, метазамещение является предпочтительным в качестве имитации ненасыщенности транс-типа. Тесты индукции раннего нодулина на Medicago truncatula Эти тесты выполняют, чтобы определить, индуцируют ли синтетические LCO симбиотические ответы активацией того же самого пути трансдукции сигнала, как и естественные Nod-факторы. Тесты выполняют на модели бобового Medicago truncatula. Активность сульфатированного бензамидного производного 3, метазамещенного ундец-4Z-енилоксицепью, которое является самым активным синтетическим соединением в тесте формирования клубеньков на люцерне, изучали на растениях дикого типа и на мутанте по гену DMI1, который изменен в отношении трансдукции сигнала Nod-фактора (Catoira et al.,Plant Cell, 12, 1647-1665, 2000). Соединением, которое служит контролем, является сульфатированный тетрамер 12, ацилированный цепью C16:22E,9Z, который является аналогом естественного Nod-фактора. Контроль - растение, культивируемое в отсутствие LCO.- 23009557 Репортерный ген Обычно трудно определить регулирование экспрессии отдельного гена в ходе биологического процесса, поскольку большинство специфических продуктов этих генов трудно обнаружимы или измеримы. Чтобы преодолеть эту проблему, используют технику слияния с "репортерными генами", то есть с генами, кодирующими легко обнаружимый белок. Слияние состоит в объединении последовательности ДНК,содержащей регуляторные области гена, который требуется изучить, с последовательностью ДНК репортерного гена. Затем эту конструкцию повторно вводят в растение путем трансформации. Таким образом,если экспрессируется целевой ген, автоматически экспрессируется репортерный ген. Это тогда становится вопросом изучения белка репортерного гена. Чтобы избежать отрицательного взаимодействия с активностью растения, используют репортерные гены, которые не кодируют какой-либо фермент, обычно образующийся в растениях. Одним из обычно используемых ферментов является -глюкуронидаза (GUS) Escherichia coli, гидролаза, которая катализирует расщепление большого разнообразия -глюкуронидов. В качестве коммерческого субстрата этого фермента можно использовать X-Gluc (Sigma B-4782): 5-бром-4-хлор-3-индолилглюкуронид; образующийся анион имеет синий цвет.Enod11: GUSA Гены бобовых, участвующие в модулировании, могут быть классифицированы в два главных типа: ранние гены нодулина (ENOD), которые активированы в первые дни инфекции и активации процесса формирования клубеньков; поздние гены нодулина, которые активируются только спустя несколько дней после нанесения бактерий и не проявляются до периода созревания клубеньков. Был идентифицирован новый ген Medicago truncatula, MtENOD11, кодирующий RPRP (богатый пролиновыми повторами белок) и транскрибируемый в течение первых стадий инфекции формирования клубеньков на корнях с клубеньками и тканях (Journet et al. Mol. Plant-Microbe Interact., 14, 737-748,2001). Используя трансгенное растение Medicago truncatula, экспрессирующее слитый белокMtENOD11GUSA, возможно определить, индуцировал ли аналог Nod-фактора, добавленный к среде культуры растения, транскрипцию гена ENOD11. Для тестов транскрипции ENOD11 используется среда Fahraeus, как и для тестов по модулированию, но без агара. Рассаду помещают в бумажные конверты, содержащие культуральную среду. Сравнивали ответы двух типов трансгенных растений, имеющих слияние MtENOD11GUS: растения Jemalong"дикого типа" (WT) и растения, имеющего мутацию в гене DMI1, который является не способным к трансдукции сигнала Nod-фактора. Растения оставляют для роста в течение 5 дней и затем проростки обрабатывают различными концентрациями LCO. После 6 ч проростки удаляют и помещают в водную среду, содержащую X-Gluc, на 1-2 ч. Подсчитывают число корней, дающих характерный синий ответ. Этот тест относительно чувствителен, до такой степени, что можно работать при концентрацияхLCO, которые ниже, чем концентрации для тестов формирования клубеньков.- 24009557 Обнаружено, что бензамидное производное 3 приблизительно в 10 раз менее активно, чем контрольное соединение, ацилированный тетрамер 12. Кроме того, что касается контрольного соединения 12, бензамидное производное 3 не вызывает никакого ответа на растениях, имеющих мутацию DMI1. Таким образом, может быть сделано заключение, что синтетическое соединение бензамидного типа активирует транскрипцию гена ENOD11 через тот же самый путь трансдукции, что и активизируемый естественными Nod-факторами. Тесты активности на других бобовых Было показано, что сульфатированные бензамидные производные имеют подобную биологическую активность в отношении корней видов Medicago, как и главный естественный сульфатированный Nodфактор Sinorhizobium meliloti, который является N-ацилированным цепью С 16:2. Было сделано предположение, что бензамидное производное является структурным миметиком естественных Nod-факторов S.meliloti, имеющих амидную связь между хитиновым олигомерным скелетом и гидрофобной цепью с двойной связью, сопряженной с карбонильной группой. Этот тип альфа-бета-сопряженной двойной связи характерен для Nod-факторов Rhizobia, которые вызывают образование клубеньков у умеренных бобовых типа люцерны, клевера, гороха, кормовых бобовых, нута и т.д. Напротив, Rhizobium, которые вызывают образование клубеньков у бобовых тропического происхождения, типа сои, арахиса, боба, вигны и т.д., продуцируют Nod-факторы, в которых карбонильная группа не сопряжена с двойной связью. Было,таким образом, важно определить, продемонстрирует ли бензамидный аналог естественного Nod-фактора без сопряженной двойной связи также биологическую активность на родственном бобовом. К этому вопросу обращались при использовании биопробы деформации волосков корня Lotus corniculatus.Lotus corniculatus представляет собой фуражную культуру, на которой клубеньки образуют Rhizobia, которые продуцируют Nod-факторы, подобные продуцируемым Rhizobia, которые вызывают образование клубеньков у сои: хитиновый олигомерный скелет имеет пять остатков глюкозамина, N-ацильная цепь,по существу, представлена вакценовой кислотой (С 18:1), и восстанавливающий остаток глюкозамина не сульфатирован и О-замещен остатком фукозила. Lotus corniculatus был выбран в качестве модельной системы в силу небольших размеров саженцев и проростков и легкости в работе. Испытание деформации волосков корня на Lotus corniculatus Семена Lotus comiculatus (cv Rodeo) стерилизовали. Проросшие семена с корешками приблизительно 1 см длиной были асептически перенесены на мягкие агаровые пластины Farhaeus. Пластины были запечатаны Парафильмом и размещены вертикально в течение 2 дней в камере для роста растения (при 25 С с легким периодом в 16 ч при относительной влажности 75%, OsramVFluora L 77 в качестве типа освещения и с небольшой интенсивностью на уровне вершины пластин 30 мкЕ. м-2. с-1), чтобы обеспечить рост растения и развитие волосков корня. Затем вливали 2 мл стерильного раствора производногоNod-фактора, чтобы покрыть корневую систему Lotus, и через 30 мин лишнюю жидкость удаляли. Дальнейшую инкубацию проводили в течение 16 ч в камере для роста растения. Корни этих 5 растений помещали между предметным и покровным стеклом и наблюдали с помощью световой микроскопии после окрашивания метиленовым синим. Активность в отношении деформации волосков (Had) оценивали методом предела растворения. Производные Nod-фактора были применены при концентрациях в пределах от 10-7 до 10-11 М. Сравнивали активность двух производных хитина DP5, Nod-фактора сои и его бензоилированного аналога 10. Оба соединения были O-фукозилированы на восстанавливающем конце, но отличались N-замещением на концевом невосстанавливающем остатке глюкозамина, которое может представлять собой С 18:1 N-ацилирование,как в случае Nod-фактора сои, или N-бензоилирование. Каждое соединение растворяли в смеси вода/этанол 50/50; добавляли 0,01% Chaps в концентрации 1 мМ. Эти сток-растворы затем разбавляли водой. Для оценки ответа растения был выбран критерий четкого ветвления волосков (многочисленные ветвления на более чем одном участке на корневой системе), и растения, демонстрирующие выраженные реакции,были классифицированы как +. Статистическую значимость (Р=0,05) пропорции ответов + вычисляли,используя сравнения отношения, основанные на Точном тесте Фишера (программное обеспечение SAS). Эксперименты были выполнены дважды. Данные приведены в следующей таблице. Оценка деформации волосков корня на Lotus corniculatus 15 растений использовались для каждой обработки и каждого разведения. 66 необработанных контрольных растений использовались для оценки внутренней изменчивости растений в отношении характера деформации волосков. Ответы были классифицированы "+", когда пропорция Had+ была значитель- 25009557 но выше (на уровне вероятности Р=0,05) среди рассмотренных растений по сравнению с необработанным контролем. Данные были проанализированы с использованием "Точного" теста Фишера. Эти эксперименты показывают, что бензамидное производное 10 имеет высокую активность в биопробе волосков корня Lotus corniculatus с существенной активностью при наномолярной концентрации. Может, таким образом, быть сделан вывод, что бензамидное производное может быть использовано для стимуляции симбиотической активности у бобовых, у которых образование клубеньков обеспечивается Rhizobia, которые продуцируют Nod-факторы, не имеющие альфа-бета-сопряженных двойных связей на ацильной цепи, таких как соя. Примеры Для ароматических производных кольцо пронумеровано согласно официальной номенклатуре. Для описания спектров ЯМР для СО и LCO сахара пронумерованы, начинаясь с восстанавливающего конца: Обычная нумерация использована для каждого сахара. 2-Ацетамидо-4-O-2-ацетамидо-4-O-[2-ацетамидо-2-дезокси-4-О-(2-дезокси-2-(N-3-(ундец-4Z-енилокси) бензоил)аминоD-глюкопиранозил)D-глюкопиранозил]-2-дезоксиD-глюкопиранозил-2-дезоксиD-глюкопираноза (2). 7,2 мг CO-IV(NH2) растворяли в 200 мкл воды и 500 мкл ДМФА и затем нагревали до 40 С. Добавляли 36 мг смолы Dowex 12-100 (НСО 3-) с последующим добавлением 160 мкл раствора 19 в дистиллированном ТГФ (26 мкмоль). 108 мг смолы НСО 3- и 480 мкл раствора 19 в дистиллированном ТГФ (78 мкмоль) добавляли тремя порциями в течение 48 ч. Реакционную среду разбавляли 3 мл смеси 1/1 ацетонитрил/ вода, реакционную среду собирали, оставляя смолу, и затем фильтровали через вату, чтобы удалить бусинки смолы. Фильтраты пропускали через смолу Dowex 508-100 (Н+) и затем концентрировали и промывали твердый остаток этилацетатом, а затем водой. Получали 2 мг белого порошка, т.е. выход 22%. 1 Н ЯМР (400 МГц, 20/1 ДМСО-d6/D2O)(ч./млн): 7,40-7,31 (м, 3H, ArH-2, ArH-6 и ArH-5), 7,04 (м,1 Н, ArH-4), 5,41-5,35 (м, 2 Н, СН=СН), 4,87 (д, 0,7 Н, J1,2=2,3 Гц, H-1I), 4,52 (д, 1 Н, J=8,3 Гц, H-1IV), 4,42 15 мг CO-IV(NH2, S) (17 мкмоль) растворяли в 100 мкл воды и 250 мкл ДМФА. Затем добавляли 3 мг гидрокарбоната натрия (34 мкмоль) с последующим добавлением 20 мкл раствора 19 в ТГФ в концентрации 0,25 г/мл (16,4 мкмоль). Реакционную среду нагревали до 60 С и добавляли 100 мкл раствора 48 и 10 мг гидрокарбоната натрия в виде шести порций в течение 18 ч. После концентрирования остаток очищают,помещая его в смесь дихлорметан (DCM)/метанол (5/1) на колонке с силикагелем, с сильным разбавлением, чтобы удалить липидную цепь. Затем осуществляют элюирование смесью E/M/W (7/2/1 этилацетат/метанол/вода). Таким образом выделяют 6,5 мг твердого вещества белого цвета, т.е. выход 33%. 1 Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-CD3OD (1/2(ч./млн): 7,48 и 7,41 (м, 2 Н, ArH-2 и ArH-6), 7,36 (дд, 1 Н,ArH-5, J5,6=7,7 Гц и J5,4=8,1 Гц), 7,07 (ддд, 1 Н, ArH-4, J4,2J4,6=1,4 Гц), 5,41 (м, 2 Н, СН=СН), 5,03 (д, 0,8 Н,H-1I, J1a,2=3,2 Гц), 4,68-4,59-4,50 (3d, 3H, H-1II,III,IV, J1,2=8,4 Гц, 8,5 Гц и 8,7 Гц), 4,56 (д, 0,2 Н, H-1I,J1,2=7,7 Гц), 4,25-3,30 (м, 26 Н, CH2-OAr, другие Н сахаров), 2,25 (тд, 2 Н, СН 2-СН=СН-СН 2, J=6,7 Гц и 11 мг CO-IV(NH2,S) (12 мкмоль) растворяли в 0,5 мл ДМФА, к которому добавляли 12 мг бромида лития. Добавляли 2 мг цианоборгидрида натрия (32 мкмоль) и 100 мкл раствора 17 в ТГФ в концентрации 73 мг/мл (26 мкмоль). Реакционную среду нагревали при 40 С в течение 4 ч. Каждые 2 ч добавляли 2 экв. альдегида и 2,5 экв. цианоборгидрида натрия, т.е., в целом, 12 экв. альдегида и 15 экв. цианоборгидрида натрия. Хотя преобразование не является полным, реакцию останавливают, разрушая избыток цианоборгидрида натрия 0,5 н. соляной кислотой. По завершении выделения газа среду разбавляют в воде и высушивают сублимацией. Полученный материал суспендируют в воде, добавляют 5 мг гидрокарбоната натрия(59 мкмоль) для возврата к основному рН и полученный материал упаривают дважды с метанолом. Остаточное твердое вещество белого цвета помещают в DCM/метанол (5/1) на колонке с силикагелем при сильном разведении, чтобы удалить липидную цепь. Затем осуществляют элюирование смесью простой эфир/ метанол/вода (E/M/W) (5/2/1) и затем (4/1/1). Таким образом получают 10 мг белых игл, т.е. выход 71%. 1 Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-CD3OD (2/1(ч./млн): 7,31 (дд, 1 Н, ArH-5, J4,5=8,2 Гц и J5,6=7,8 Гц),7,02 (м, 2 Н, ArH-2 и ArH-6), 6,90 (дд, 1 Н, ArH-4, J4,6=2,3 Гц), 5,51 (м, 2 Н, СН=СН), 5,08 (д, 0,8 Н, H-1I,J1,2=3,1 Гц), 4,67 (м, 2,2 Н, H-1I,II,III), 4,47 (д, 1 Н, H-1IV, J1,2=8,0 Гц), 4,06 (т, 2 Н, CH2-OAr, J=6,3 Гц),3,94 (с, 2 Н, NH-CH2-Ar), 4,25-3,45 (м, 23 Н, другие Н сахаров), 2,45 (дд, 1 Н, H2IV, J1,2J2,3=8,8 Гц), 2,312,12 (2 м, 4 Н, СН 2-СН=СН-СН 2), 2,07-2,04-2,01 (3 с, 9 Н, 3 СН 3 СО), 1,89 (тт, 2 Н, ArO-CH2-CH2-CH2CH=CH, J=6,9 Гц), 1,45-1,25 (м, 8 Н, 4 СН 2), 0,97 (т, 3H, CH3, J=6,8 Гц). 13 С ЯМР (50 МГц, ДМСО-CD3OD (2/1(ч./млн): 172 (3 CH3CO), 160 (ArC-3), 132-131-130 (ArC-1,ArC-5, СН=СН), 122 (ArC-6), 115 (ArC-2, ArC-4), 105 (C-1II,III,IV), 98 (C-1I), 92 (C-1I), 82-53 (21 С сахаров и Ar-CH2-NH), 68 (СН 2-OAr), 33-23 (10 СН 2 и 3 CH3CO), 14 (CH3). Масс-спектр: отрицательная электроспрей-ионизация (ESI) m/z=1125,4 [M-Na]-. 2-Ацетамидо-4-O-(2-ацетамидо-4-O-[2-ацетамидо-2-дезокси-4-О-(2-дезокси-2-(N-3-(ундец-4Z-енилокси) бензил)ацетамидоD-глюкопиранозил)D-глюкопиранозил]-2-дезоксиD-глюкопиранозил-2-дезокси 6-О-сульфо-D-глюкопираноза, натриевая соль (5). 20 мг гидрокарбоната натрия и 15 мкл уксусного ангидрида добавляли к раствору 13 мг соединения 4 (11 мкмоль) в 0,3 мл E/M/W (1/1/1). Реакционную среду перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. После концентрирования остаточное масло суспендировали в E/M/W (1/1/1) и добавляли смолу Dowex 508-100 Н+. Смесь фильтровали и к фильтрату добавляли смолу Amberlite IR120 Na+. После фильтрования и концентрирования продукт очищают хроматографией в E/M/W (4/1/1). Таким образом выделяют 10 мг твердого вещества белого цвета, т.е. выход 77%. 1 Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-CD3OD (2/1(ч./млн): 7,25-7,18 (2 т, 1 Н, ArH-5, J5,4=7,8 Гц и J5,6=7,9 Гц),7,10-6,85 (м, 2 Н, ArH-2 и ArH-6), 6,82-6,75 (2 д, 1 Н, ArH-4), 5,40 (м, 2 Н, СН=СН), 5,06 (д, 0,6 Н, H-1I,J1,2=3,4 Гц), 4,75-4,35 (м, 3,4 Н, H-1I,II,III,IV), 4,30-4,05 (м, 2 Н, Н-6a,bI), 4,00-3,30 (м, 25 Н, другие Н сахаров и СН 2-OAr), 3,80 (с, 2 Н, NAc-CH2-Ar), 2,90 (м, 1 Н, H-2IV), 2,23-2,03 (2 м, 4H, CH2-CH=CH-CH2), 1,99-1,90 (м,12H, CH3CO), 1,80 (тт, 2 Н, ArO-CH2-CH2-CH2-CH=CH, J=6,9 Гц), 1,35-1,20 (м, 8 Н, 4 СН 2), 0,87 (м, 3H, СН 3). 13 С ЯМР (50 МГц, ДМСО-CD3OD (2/1(ч./млн): 176 (CH3CON), 174-173-173 (3 CH3CO), 161 15 мг CO-IV(NH2,S) (17 мкмоль) растворяли в 100 мкл воды и 250 мкл ДМФА. Затем добавляли 6 мг гидрокарбоната натрия (71 мкмоль), потом 25 мкл раствора соединения 23 в ТГФ в концентрации 210 мг/мл(17 мкмоль). Реакционную среду нагревали до 60 С и 200 мкл раствора хлорида и 16 мг гидрокарбоната натрия добавляли в виде восьми порций в течение 24 ч. После концентрирования остаток очищают, помещая в смесь DCM/метанол (5/1) на колонке с силикагелем при сильном разведении для удаления липидной цепи. Затем проводят элюирование смесью E/M/W (4/1/1). Получают 6,3 мг твердого вещества белого цвета, т.е. выход 32%. 1 Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-CD3OD (1/3(ч./млн): 7,44 (м, 2 Н, ArH-2 и ArH-6), 7,39 (дд, 1 Н, ArH-5,J5,4J5,6=7,9 Гц), 7,10 (ддд, 1 Н, ArH-4, J4,6J4,2=2,1 Гц), 5,05 (д, 0,7 Н, H-1I, J1,2=3,0 Гц), 4,70-4,40 (м, 3,3H,H-1I,II,III,IV), 4,22 (м, 1 Н, H-6aI), 4,10-3,20 (м, 24 Н, СН 2-OAr и другие Н сахара), 2,03-1,99-1,96 (3 с, 9 Н,CH3CO), 1,80 (м, 2 Н, ArO-СН 2-СН 2-СН 2), 1,35-1,25 (м, 8 Н, 4 СН 2), 0,92 (т, 3H, СН 3, J=6,5 Гц). Масс-спектр: отрицательная электроспрей-ионизация (ESI) m/z=1141,5 [M-Na]-. 2-Ацетамидо-4-O-2-ацетамидо-4-O-[2-ацетамидо-2-дезокси-4-О-(2-дезокси-2-(N-3-(ундец-4Z-инилокси) бензоил)аминоD-глюкопиранозил)D-глкисопиранозил]-2-дезоксиD-глюкопиранозил-2-дезокси 6-O-сулъфо-D-глюкопираноза, натриевая соль (7). 14 мг CO-IV(NH2,S) (16 мкмоль) растворяли в 100 мкл воды и 250 мкл ДМФА. Добавляли 5 мг гидрокарбоната натрия (60 мкмоль) и затем 25 мкл раствора соединения 27 в ТГФ в концентрации 190 мг/мл(16 мкмоль). Реакционную среду нагревали до 60 С и 200 мкл раствора хлорида и 16 мг гидрокарбоната натрия добавляли в виде восьми порций в течение 24 ч. После концентрирования остаток очищают, помещая в смесь DCM/метанол (5/1) на колонке с силикагелем, при сильном разведении, чтобы удалить липидную цепь. Затем осуществляют элюирование смесью E/M/W (4/1/1). Таким образом получают 5,7 мг целевого продукта в форме твердого вещества белого цвета, т.е. выход 31%. 1 Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-CD3OD (1/2(ч./млн): 7,43 (м, 2 Н, ArH-2 и ArH-6), 7,37 (дд, 1 Н, ArH-5,J5,4=8,1 Гц и J5,6=8,0 Гц), 7,10 (ддд, 1 Н, ArH-4, J4,2J4,6=2,0 Гц), 5,04 (д, 0,7 Н, H-1I, J1,2=3,3 Гц), 4,65-4,59 10 мг CO-IV(NH2,S) (11 мкмоль) растворяли в 100 мкл воды и 250 мкл ДМФА. Добавляли 2 мг гидрокарбоната натрия (24 мкмоль) и затем 15 мкл раствора соединения 31 в ТГФ в концентрации 115 мг/мл(6 мкмоль). Реакционную среду нагревали до 60 С и 105 мкл раствора хлорида и 6 мг гидрокарбоната- 28009557 натрия добавляли в виде семи порций в течение 18 ч. После концентрирования остаток очищают, помещая в смесь DCM/метанол (5/1) на колонке с силикагелем, при сильном разведении, чтобы удалить липидную цепь. Затем осуществляют элюирование смесью E/M/W (9/2/1). Таким образом выделяют 6,2 мг твердого вещества белого цвета, т.е. выход 48% (но преобразование только 50%). 1 Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-CD3OD (1/2(ч./млн): 7,99 (дд, 1 Н, ArH-6, J6,5=7,5 Гц и J6,4=1,8 Гц),7,55 (ддд, 1 Н, ArH-4, J4,3=8,3 Гц и J4,5=7,8 Гц), 7,20 (д, 1 Н, ArH-3), 7,10 (дд, 1 Н, ArH-5), 5,52 (м, 2 Н,СН=СН), 5,06 (д, 0,7 Н, H-1I, J1,2=3,0 Гц), 4,70-4,60-4,53 (4 д перекрыв., 3, 6 Н, H-1I,II,III,IV), 4,20-3,40 (м,25 Н, другие Н сахаров и СН 2-OAr), 2,33-2,11 (2 м, 4 Н, СН 2-СН=СН-СН 2), 2,03-2,01-2,00 (3 с, 9 Н, 3 СН 3 СО), 2,05 (м, 2 Н, ArO-СН 2-СН 2-СН 2), 1,50-1,20 (м, 8 Н, 4 СН 2), 0,94 (т, 3H, СН 3, J=6,8 Гц). 13 С ЯМР (62,5 МГц, ДМСО-CD3OD (1/2(ч./млн): 172 (3 СН 3 СО), 171 (NCOAr), 158 (ArC-1), 133 10 мг CO-IV(NH2,S) (11 мкмоль) растворяли в 100 мкл воды и 250 мкл ДМФА. Добавляли 2 мг гидрокарбоната натрия (24 мкмоль) и затем 15 мкл раствора соединения 35 в ТГФ в концентрации 115 мг/мл(6 мкмоль). Реакционную среду нагревали до 60 С и 105 мкл раствора хлорида и 6 мг гидрокарбоната натрия добавляли в виде семи порций в течение 17 ч. После концентрирования остаток очищают, помещая в смесь DCM/метанол (5/1) на колонке с силикагелем, при сильном разведении, чтобы удалить липидную цепь. Затем осуществляют элюирование смесью E/M/W (9/2/1). Таким образом выделяют 5,2 мг твердого вещества белого цвета, т.е. выход 40% (но преобразование только 60%). 1 Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-CD3OD (1/2(ч./млн): 7,89 (д, 2 Н, ArH-2 и ArH-6, J2,3=J6,5=8,8 Гц), 7,04 Пентамер фукозила CO-V(NH2, Fuc) (7,3 мг, 6,4 мкмоль) растворяли в Н 2 О (140 мкл) с последующим добавлением ДМФА (350 мкл) и смесь доводили до 30 С. Затем добавляли смолу Dowex 12-100(НСО 3) с последующим добавлением раствора (ТГФ, 110 мкл) хлорангидрида кислоты 19 (6 мг). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч, причем в течение этого времени сделаны три дополнительных добавления смолы и раствора хлорангидрида кислоты. Реакционную среду затем разбавляли вH2O/CH3CN (1/1,2 мл), нагревали до 56 С и супернатант фильтровали через вату. Бусинки смолы и стенки сосуда экстрагировали несколько раз при 56 С смесью H2O/CH3CN (4/1, 7/3, 3/2, 1/1, 2/3, 3/7 и 1/4,2 мл). Различные фракции пропускали через смолу Dowex 508-100 (Н+) и затем объединяли и концентрирова- 29009557 ли. Остаток последовательно промывали EtOAc (31 мл) и затем Н 2 О (31 мл), а затем повторно растворяли в H2O/CH3CN (1/1,10 мл), нагревали при 56 С и затем обрабатывали ультразвуком. Затем раствор высушивают сублимацией и получают целевой продукт в форме белого порошка (2,5 мг, 28%). Исходный материал, сохраненный на кислотной смоле, подвергают элюированию (2,3 мг, 31%) с использованием водного раствора гидроксида аммония (H2O, 2%). 1 Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6/D2O 20/1)(ч./млн): 7,43-7,30 (м, 3H, ArH-2, ArH-6 и ArH-5); 7,05 (м,1 Н, ArH-4); 5,45-5,32 (м, 2 Н, СН=СН); 4,84 (д, 0,8 Н, J1,2=1,9 Гц, H-1I); 4,66 (д, 0,8 Н, J1,21,0 Гц, H-1FucGlcNAc), 4,65 (д, 0,2 Н, J1,21,0 Гц, H-1Fuc-GlcNAc), 4,52 (д, Н, J=8,5 Гц, H-1IV), 4,45/4,35/4,33 (4 д, 4 Н,J=8,5 Гц, H-1II-IV), 4,42 (д, 0,2 Н, J=7,0 Гц, Н-1I); 3,99 (т, 2 Н, J=6,1 Гц, ArOCH2-СН 2), 3,88 (дт, 1 Н, H5Fuc), 3,78-3,05 (м, 33H, другие Н сахаров), 2,17 (дт, 2 Н, J=6,0 и J=6,8 Гц, СН 2 СН=СН), 1,99 (дт, 2 Н, J=5,9 и J=6,2 Гц, СН=СН-СН 2), 1,82/1,81/1,81/1,79 (4 с, 12 Н, 4 COCH3), 1,80-1,72 (м, 2 Н, ArOCH2-СН 2), 1,31-1,15(6,07 ммоль) в безводном ДМФА (20 мл). После реакции в течение 4 ч при 90 С реакционную среду концентрируют, суспендируют в DCM и промывают водой. Получают 1,87 г желтого масла, которое подвергают хроматографии на силикагеле в смеси пентан/этилацетат (50/1). Выделяют 1,37 г желтого масла, т.е. выход 76%. 1 35 мг гидрида лития-алюминия (922 мкмоль) добавляли при 0 С к 140 мг соединения 15 (460 мкмоль) в простом эфире (3 мл). После реакции в течение 1 ч 30 мин реакционную среду разбавляли эфиром и гидролизовали двумя каплями воды. После пропускания через Celite, сушки над Na2SO4 и концентрирования выделяли 127 мг бесцветного масла, т.е. выход 99%. 1 Н ЯМР (250 МГц, CDCl3)(ч./млн): 7,18 (дд, 1 Н, ArH-5, J5,6=8,0 Гц и J5,4=8,3 Гц), 6,84 (м, 2 Н, ArH2 и ArH-4), 6,75 (дд, 1 Н, ArH-4, J4,2=2,9 Гц), 5,32 (м, 2 Н, СН=СН), 4,58 (с, 2 Н, СН 2 ОН), 3,89 (т, 2 Н, CH2OAr, J=6,3 Гц), 2,16-1,95 (2 м, 4 Н, СН 2-СН=СН-СН 2), 1,76 (тт, 2 Н, ArO-CH2-CH2-CH2-CH=CH, J=6,8 Гц),1,45-1,18 (м, 8 Н, 4 СН 2), 0,84 (т, 3H, СН 3, J=6,3 Гц). 13 С ЯМР (62,5 МГц, CDCl3)(ч./млн): 159 (С-3), 142 (С-1), 131-130-128 (С-5, СН=СН), 119 (С-6),114 (С-4), 113 (С 2), 67 (СН 2-OAr), 65 (СН 2 ОН), 32-23 (7 СН 2), 14 (СН 3). Масс-спектр: положительная электроспрей-ионизация (ESI) m/z=299,2 [M+Na]+. Высокое разрешение. Вычислено для C18H28O2Na: 299,198700; найдено: 299,199250. ИК (см-1): 3329, 3005, 2940, 2925, 2855, 1669, 1602, 1452, 1264. 3-(Ундец-4Z-енилокси)бензальдегид (17). 10 мл безводного DCM и затем 190 мг РСС (881 мкмоль) добавляли в атмосфере аргона к 120 мг спирта 16 (434 мкмоль), высушенного выпариванием с толуолом. Реакционную среду нагревали при тем- 30