Связывающие агенты, ингибирующие миостатин

009056 Область техники Изобретение относится к факторам роста и, в частности, к фактору роста - миостатину и агентам,которые связывают миостатин и ингибируют его активность. Уровень техники Известно, что миостатин, известный также как фактор 8 роста/дифференциации (GDF-8), являющийся представителем группы трансформирующих -факторов роста (TGF-), участвует в регулировании массы скелетных мышц. Большинство представителей TGFGDF семейства неспецифически экспрессируются в тканях различных типов и проявляют различные плейотропические воздействия. Тем не менее миостатин экспрессируется, в основном, в клетках тканей развивающихся или находящихся во взрослом состоянии скелетных мышц и играет особую роль, оказывая отрицательное влияние на рост скелетных мышц (McPherron et al. Nature (London) 387, 83-90 (1997. Недавние исследования показали, что невысокие уровни экспрессии миостатина можно зафиксировать в ткани сердца и жировой и преджировой тканях. В процессе эволюции миостатин как белок практически не претерпел изменений (McPherron et al.PNAS USA 94:12457-12461 (1997. Последовательности биологически активного С-концевого участка миостатина у человека, мыши, крысы, коровы, цыпленка, индюка имеют 100%-ю идентичность. Функция миостатина, по-видимому, так же хорошо сохранилась независимо от вида (животного). Это очевидно, исходя из фенотипов животных, имеющих мутацию в гене миостатина. Для двух пород крупного рогатого скота, Belgian Blue (Hanset R., Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to ImproveBeef Production, eds, King, J.W.G. Menissier, F. (Nijhoff, The Hague, The Netherlands), pp.450-459) характерен фенотип "двойных (парных) мышц и увеличение мышечной массы. Показано, что у этих пород есть мутации в кодирующей части гена миостатина (McPherron et al. (1997), там же). Кроме того, у мышей со специально осуществленной делецией гена, кодирующего миостатин (Mstn), наблюдали резкое увеличение мышечной массы без соответствующего нарастания массы жира. Вес отдельных мышцMstn-/- мышей приблизительно на 100-200% больше, чем соответствующих мышц контрольных животных, как результат гипертрофии и гиперплазии мышечного волокна (Zimmers et al. Science, 296, 1486(2002. Показано, что введение миостатина некоторым видам мышей приводит к состоянию, сходному с разрушающими мышечные ткани расстройствами, которые, как установлено, сопровождают такие заболевания как, например, рак, ВИЧ и мышечная дистрофия. Миостатин, введенный бестимусным бесшерстным мышам в виде продуцирующих миостатин СНО клеток, производил опустошающее действие с высокой степенью потери веса, приведя к снижению на 50% массы скелетной мускулатуры помимо потери жира и сильной гипогликемии (Zimmers et al., там же). Убыль миостатина, по-видимому, приводит к сохранению мышечной массы и уменьшению накопления жира в процессе старения. Установлено, что обусловленные старением увеличение массы жировой ткани и снижение мышечной массы пропорциональны уровня миостатина, что определено путем сопоставления массы жира и мышечной массы Mstn+/+ мышей по сравнению с Mstn-/- взрослыми нокаут-мышами (McFerron et al. J. Clin. Invest. 109, 595 (2002. Для Mstn-/- мышей было характерно пониженное накопление жира в процессе старения по сравнению с Mstn+/+ мышами. Помимо этого миостатин может участвовать в сохранении уровня содержания глюкозы в крови и может оказывать влияние на развитие диабета в некоторых случаях. Известно, например, что устойчивость скелетной мышцы инсулинстимулируемому подъему уровня глюкозы представляет собой самый ранний известный симптом неинсулинзависимого диабета (типа 2) (Corregan et al. Endocrynology,128:1682 (1991. В настоящее время установлено, что снижение миостатина отчасти ослабляет фенотипическое проявление ожирения и диабета у двух модельных типов мышей, агути летальной желтой(Аy) (Yen et al. FASEB J., 8:479 (1994 и тучных (Lepob/ob). Накопление жира и общей массы тела Аy/a,Mstn-/- мыши с двойной мутацией было намного меньше, чем у Аy/a, Mstn+/+ мыши (McPheron et al.,(2002), там же). Помимо этого, уровни глюкозы в крови у Аy/a, Mstn-/- мышей был гораздо ниже, чем у Аy/a, Mstn+/+ мышей после экзогенного поступления глюкозы, что показывало, что снижение миостатина усиливает метаболизм глюкозы. Аналогично Lepob/ob Mstn-/- мыши показали снижение накопления жира по сравнению с Lepob/ob Mstn+/+ фенотипом. Поэтому с учетом фенотипов животных со сверхэкспрессией и нокаут-животных можно с уверенностью утверждать, что миостатин определенным образом задействован в ряде метаболических расстройств, включая заболевания, приводящие к разрушению мышц, диабет, тучность и гипергликемию. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к связывающим агентам, которые связывают миостатин и ингибируют его активность. Связывающие агенты включают по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин. Миостатинсвязывающие пептиды имеют аминокислотную последовательность,включающую предпочтительно от около 5 до около 50 аминокислот, более предпочтительно от около-1 009056 10 до около 30 аминокислот и наиболее предпочтительно от около 10 до около 25 аминокислот. Один вариант миостатинсвязывающего пептида включает аминокислотную последовательность WMCPP(SEQ ID NO: 633). В другом варианте миостатинсвязывающие пептиды включают аминокислотную последовательность Ca1a2Wa3WMCPP (SEQ ID NO: 352), где a1, a2 и а 3 выбраны из нейтральной гидрофобной, нейтральной полярной или основной аминокислоты. В другом варианте миостатинсвязывающий пептид включает последовательность Cb1b2Wb3WMCPP (SEQ ID NO: 353), где b1 выбрана как любая из аминокислот Т, I или R; b2 выбрана из R, S, Q; b3 выбрана из Р, R, Q, причем пептид включает от 10 до 50 аминокислот, и ее физиологически приемлемые соли. В другом варианте миостатинсвязывающий пептид соответствует соединению формулыc1 c2 c3 c4 c5 c6 C c7 c8 W c9 WMCPP c10 c11 c12 c13 (SEQ ID NO: 354),где c1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,c2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,с 3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,c4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,c5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,c6 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту,c7 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота,c8 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота,c9 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, аc10-c13 представляют собой любые аминокислоты, причем протяженность пептида составляет от 20 до 50 аминокислот,и его физиологически приемлемым солям. Похожий вариант миостатинсвязывающего пептида соответствует соединению формулыd1 d2 d3 d4 d5 d6 C d7 d8 W d9 WMCPP d10 d11 d12 d13 (SEQ ID NO: 355),где d1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,d2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,d3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,d4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,d5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,d6 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту,d7 выбран из аминокислот Т, I или R,d8 выбран из R, S, Q,d9 выбран из Р, R и Q, аd10-d13 представляют собой любые аминокислоты, причем протяженность пептида составляет от 20 до 50 аминокислот,и его физиологически приемлемым солям. Дополнительные варианты связывающих агентов включают по крайней мере один из следующих пептидов:(1) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательностиWYe1e2 Yе 3 G, (SEQ ID NO: 356),где e1 представляет собой Р, S или Y,е 2 представляет собой С или Q, a е 3 представляет собой G или Н,протяженность пептида составляет от 7 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли;(2) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательностиf1 EML f2 SL f3 f4 LL (SEQ ID NO: 455),где f1 представляет собой М или I,f2 - любая аминокислота,f3 представляет собой L или F,f4 представляет собой Е, Q или D,протяженность пептида составляет от 7 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли;(3) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательностиLg1 g2 LL g3 g4 L, (SEQ ID NO: 456),где g1 представляет собой Q, D или Е,g2 представляет собой S, Q, D или Е,g3 - любая аминокислота,g4 представляет собой L, W, F или Y,протяженность пептида составляет от 8 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли;(4) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательностиh1 h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 h9 (SEQ ID NO: 457),где h1 представляет собой R или D,h2 - любая аминокислота,h3 представляет собой А, Т, S или Q,h4 представляет собой L или М,h5 представляет собой L или S,h6 - любая аминокислота,h7 представляет собой F или Е,h8 представляет собой W, F или С,h9 представляет собой Е, F, M или K,протяженность пептида составляет от 9 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли. Как вариант изобретения связывающие агенты данного изобретения включают также по меньшей мере один носитель, такой как полимер или Fc домен, и могут, кроме этого, включать по меньшей мере одну линкерную последовательность. Согласно этому варианту связывающие агенты настоящего изобретения конструируют так, чтобы по меньшей мере один миостатинсвязывающий пептид был присоединен по меньшей мере к одному носителю. Пептид или пептиды присоединяют непосредственно или через линкерную последовательность к носителю за счет N-концевой, С-концевой аминокислоты или состоящей из аминокислот боковой цепи пептида. В этом варианте связывающие агенты настоящего изобретения имеют следующую обобщенную структуру:(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4,где P1, P2, P3 и P4 представляют собой пептиды, способные связывать миостатин, а L1, L2, L3 и L4 каждый являются линкерами, а, b, с, d, e и f, каждый независимо, является 0 или 1, при условии, что, по крайней мере, а или b является 1,и их фармацевтически приемлемые соли. В других вариантах связывающих агентов, соответствующих этой обобщенной структуре, пептидыP1, P2, P3 и P4 могут быть независимо выбраны из одного или нескольких любых пептидов вышеприведенных последовательностей. Р 1, Р 2, Р 3 и Р 4 независимо выбраны из одного или нескольких пептидов,отвечающих любой из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457. Согласно другому варианту изобретения связывающие агенты включают пептиды, присоединенные к Fc домену с помощью чего-либо или непосредственно, что приводит к образованию пептидных антител. Пептидные антитела настоящего изобретения проявляют высокую связывающую аффинность по отношению к миостатину и могут ингибировать активность миостатина, как показано и исследованиями in vitro на клетках, так и с помощью животных. Настоящее изобретение относится также и к нуклеиновым кислотам, включающим полинуклеотиды, кодирующие пептиды, пептидные антитела, а также варианты и производные пептидов и пептидных антител настоящего изобретения. Настоящее изобретение охватывает также фармацевтически приемлемые композиции, включающие один или несколько связывающих агентов настоящего изобретения. Связывающие агенты настоящего изобретение ингибируют активность миостатина in vitro и invivo. Связывающие агенты настоящего изобретения повышают массу тощих мышц у испытуемых животных и снижают массу жира как часть веса тела животного. Миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения повышают мышечную силу исследуемых модельных животных. Настоящее изобретение предусматривает также способы ингибирования активности миостатина у животных, включая человека, путем введения субъекту эффективной дозы одного или нескольких свя-3 009056 зывающих агентов. Настоящее изобретение предусматривает способы повышения массы тощих мышц у животных, включая человека, путем введения эффективной дозы одного или нескольких связывающих агентов. Данное изобретение предусматривает также способы лечения миостатинзависимых расстройств путем введения пациенту терапевтически эффективной дозы одного или нескольких миостатинсвязывающих агентов в виде фармацевтически приемлемой композиции. Настоящее изобретение обеспечивает способы лечения разрушающих мышцы заболеваний, включающих мышечную дистрофию, разрушение мышц вследствие рака, ВИЧ, ревматоидный артрит, почечную недостаточность, уремию, хроническую сердечную недостаточность, возрастную саркопению, состояние в результате длительного постельного режима, перелом позвоночника, удар, переломы костей. Настоящее изобретение предусматривает способы лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ, таких как ожирение, диабет, гипергликемия, остеопороз. Данное изобретение включает также способ повышения мышечной массы употребляемых в пищу животных путем введения животным эффективной дозы одного или нескольких миостатинсвязывающих агентов. Настоящее изобретение предусматривает также исследования с помощью одного или нескольких миостатинсвязывающих агентов для идентификации и количественного определения миостатина в образце. Такие анализы могут быть диагностическим определением, служащим для измерения или мониторинга уровней миостатина у лиц с миостатинзависимым расстройством или заболеванием. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана активность миостатина, определенная по активности экспрессируемой люциферазы (Y-ось) против концентрации (Х-ось) TN8-19 пептида QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO: 32) и TN8-19 пептидного антитела (pb) для определения IС 50 для каждого анализа с использованием С 2 С 12pMARE люциферазы, описанного ниже в примерах. Пептидное антитело имеет более низкую величинуIC50, чем пептид. На фиг. 2 представлена кривая, показывающая увеличение общей массы тела для CD1 nu/nu мышей, получивших лечение повышенными дозами 1xm TN8-19-21 пептидного антитела в течение 14 дней, по сравнению с мышами, получившими лечение huFc контролем, как описано в примере 8. На фиг. 3 А показано повышение массы гастрокнемиальной мышечной массы при вскрытии мышей, леченных как указано в пояснении к фиг. 2 (пример 8). На фиг. 3 В показано увеличение тощих мышц при определении с помощью ЯМР на день 0 по сравнению с 13-м днем опыта, описанного в примере 8. На фиг. 4 показано увеличение массы тощих мышц как для CD1 nu/nu мышей, получавших дважды в неделю инъекции повышающихся доз 1xm TN8-19-32 пептидного антитела, при определении с помощью ЯМР на день 0 и 13-й день опыта, описанные в примере 8. На фиг. 5 А показано увеличение массы тела для CD1 nu/nu мышей, получавших дважды в неделю инъекции 1xm TN8-19-7, по сравнению с 2xm TN8-19-7 и контрольными животными в течение 35 дней как описано в примере 8. На фиг. 5 В показано увеличение веса каркаса тощих мышц при вскрытии 1 х и 2 х вариантов при 1 и 3 мг/кг по сравнению с животными, получившими среду (huFc) (контроль). На фиг. 6 А показано увеличение массы тощих мышц по сравнению с массой тела у старых mdx мышей, получавших лечение или аффинно зрелым 1xm TN8-19-33 пептидным антителом, или huFc средой, при дозе 10 мг/кг, вводимой подкожно через день в течение трех месяцев. На фиг. 6 В показано изменение массы жиры по сравнению с массой тела, определенное с помощью ЯМР для тех же самых мышей после 3 месяцев лечения. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к связывающим агентам, способным связывать миостатин и ингибировать его активность. Связывающие миостатин агенты можно использовать для определений,идентификации, количественного анализа или мониторинга содержания миостатина у животных. Миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения понижают активность миостатина. Миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения увеличивают массу тощих мышц животных, снижают массу жира как часть веса тела и повышают мышечную силу. Миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения могут использоваться для лечения многих метаболических расстройств, в которых участвует миостатин, включающих расстройства, сопровождающиеся разрушением мышц, например мышечная дистрофия, разрушение мышц вследствие рака, ВИЧ, ревматоидный артрит, почечная недостаточность, уремия, хроническая сердечная недостаточность, состояние в результате длительного постельного режима, перелом позвоночника, удар, возрастная саркопения, а также другие метаболические расстройства, включающие диабет, ожирение, гипергликемию и остеопороз, путем введения субъекту терапевтической дозы одного или нескольких связывающих агентов в виде фармацевтически приемлемой композиции. Миостатин Известно, что миостатин, фактор роста, известный как GDF-8, является обратным (негативным) регулятором тканей скелетных мышц. Миостатин синтезируется как неактивный препропротеин, кото-4 009056 рый активируется протеолитическим расщеплением (Zimmers et al., см. выше (2002. Протеинпредшественник расщепляется с образованием NH2-концевого протеина в форме гомодимера с молекулярной массой около 25 кДа, который является зрелой, активной формой протеина (Zimmers et al., см. выше (2002. В настоящее время полагают, что зрелый димер циркулирует в крови как неактивный латентный комплекс, связанный с пропептидом (Zimmers et al., см. выше (2002. В соответствии с использованным здесь значением термин полноразмерный миостатин соответствует последовательности полноразмерного препропротеина, описанного McPherron et al. (см. выше(1997, а также родственным полноразмерным пептидам, в том числе аллельным вариантам и межвидовым гомологам, которые также описываются McPherron et al. (1997). В соответствии с использованным здесь значением термин продомен или пропептид относится к неактивному NH2-концевому протеину, который отщепляется с образованием активного СООН-концевого протеина. В соответствии с использованным здесь значением термин миостатин или зрелый миостатин относится к зрелому биологически активному СООН-концевому полипептиду в мономерной, димерной, мультимерной или иной форме. Миостатин или зрелый миостатин относится также к фрагментам биологически активного зрелого миостатина, а также родственным, сходным полипептидам, включая аллельные варианты, сплайс-варианты и слитые пептиды и полипептиды. Были сообщения о том, что последовательность СООН-концевого протеина, являющегося зрелым миостатином, на 100% идентична в отношении многих видов животных, включая человека, мышь, цыпленка, свинью, индюка и крысу (Lee et al.,PNAS 98, 9306 (2001. Миостатин может включать или может не включать концевые остатки, например, последовательности направленного действия или остатки метионина и лизина и/или последовательности меченых или слитых белков, в зависимости от способа его получения. В используемом здесь значении термин способный связывать миостатин или обладающий связывающей аффинностью в отношении миостатина означает связывающий агент или пептид, который связывается с миостатином, как показано с помощью фагового ELISA-исследования, BIAcore илиKinExA исследований, описанных ниже в примерах. В используемом здесь значении термин способный модифицировать активность миостатина относится к действию такого агента, как агонист или антагонист, в отношении по крайней мере одной биологической активности миостатина. В используемом здесь значении активность агониста или миметика относится к агенту, обладающему биологической активностью, сравнимой с активностью протеина, который взаимодействует с представляющим интерес белком, как описано, например, в Международной заявке WO 01/83525, поданной 2 мая 2001 г., которая упоминается здесь как ссылка. В используемом здесь значении термин ингибирующая миостатин активность или имеющий антагонистическую активность относится к способности пептида или связывающего агента уменьшать или блокировать активность миостатина или подавать сигнал, что показано in vitro исследованиями, такими как, например, анализ активности миостатина с помощью pMAREC2C12 - клеток или invivo исследованиями на животных, как показано ниже. Структура связывающих миостатин агентов В одном варианте изобретения связывающие агенты настоящего изобретения включают по меньшей мере один связывающий миостатин пептид, ковалентно присоединенный по меньшей мере к одному носителю, такому как полимер или Fc домен. Присоединение миостатинсвязывающих пептидов по меньшей мере к одному носителю предназначается для того, чтобы повысить эффективность связывающего агента как терапевтического средства путем увеличения биологической активности агента и/или уменьшения разрушения in vivo, увеличения периода полужизни in vivo, уменьшения токсичности или иммуногенности in vivo. Связывающие агенты настоящего изобретения могут также включать линкерную последовательность, соединяющую пептид и носитель. Пептид или пептиды присоединяют непосредственно или через линкерную последовательность к носителю за счет N-концевой, С-концевой аминокислоты или состоящей из аминокислот боковой цепи пептида. В этом варианте связывающие агенты настоящего изобретения имеют следующую обобщенную структуру:(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4,где Р 1, P2, P3 и P4 представляют собой пептиды, способные связывать миостатин, a L1, L2, L3 и L4 каждый являются линкерами, а, b, с, d, е и f, каждый независимо, является 0 или 1, при условии, что, по крайней мере, а или b является 1. Любой пептид, содержащий цистеиновый остаток, может быть поперечно сшит другим Cysсодержащим пептидом, каждый из них или оба могут быть присоединены к носителю. Любой пептид,-5 009056 содержащий более одного Cys остатка, также может образовывать внутрипептидную дисульфидную связь (мостик). В одном из вариантов носителем является Fс домен, который будет описан ниже. Такой вариант называют пептидное антитело. В используемом здесь значении термин пептидное антитело относится к молекуле, включающей антительный Fc домен, соединенный по меньшей мере с одним пептидом. Получение пептидных антител в общем описано в РСТ публикации WO 00/24782, опубликованной 4 мая 2000 г., включенной здесь как ссылка. Примеры пептидных антител представляют собой 1 х и 2 х конфигурации с одним пептидом или двумя пептидами (соединенными тандемно) соответственно согласно описанному ниже в примерах. Пептиды Согласно используемому здесь значению термин пептид относится к веществам, молекулы которых состоят из приблизительно 5-90 аминокислот, связанных пептидными связями. Пептиды настоящего изобретения (по протяженности) включают предпочтительно от примерно 5 до примерно 50 аминокислот, более предпочтительно около 10-30 аминокислот и наиболее предпочтительно около 1025 аминокислот и способны связываться с миостатином. Пептиды настоящего изобретения могут включать часть последовательности протеинов природного происхождения, могут быть рандомизированными последовательностями, полученными на основе встречающихся в природе протеинов или могут быть полностью рандомизированными последовательностями. Пептиды настоящего изобретения могут быть получены любыми способами, известными в данной области, включая химический синтез, переваривание протеинов (ферментные методы) или рекомбинантные технологии. Метод фагового дисплея и РНК-пептидный скрининг, а также другие методы аффинного скринирования особенно подходят для получения пептидов, способных связывать миостатин. Технология фагового дисплея описана, например, Scott et al. Science 249:386 (1990); Devlin et al.US патент 5338665, выдан 16 августа 1994; US патент 5922545, выдан 13 июля 1999; WO 96/40987, опубл. 10 декабря 1996; WO 98/15833, опубл. 16 апреля 1998, каждый из которых приведен здесь как ссылка. С использованием библиотеки фагов показываются случайные последовательности пептидов, полученные слиянием с поверхностными протеинами нитчатого фага. Обычно выставленные пептиды являются аффинно элюируемыми со специфичностью или без специфичности по отношению к молекуле-мишени. Сохраняемые фаги могут пополняться за счет успешных циклов аффинной очистки и пересевов. Самые лучшие связывающие пептиды отбирают для дальнейшего анализа, например,используя фаговый ELISA, описанный ниже, а затем секвенируют. Необязательно, могут быть созданы библиотеки вследствие мутагенеза, которые затем подвергают скринированию для дальнейшей оптимизации последовательностей наилучших связывающих пептидов (Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol.Struct. 26:401-24 (1997. Другие методы создания миостатинсвязывающих пептидов включают дополнительные способы аффинного отбора, известные в данной области. Пептидная библиотека может быть слита с С-концомlac-репрессора и экспрессирована в Е. coli. Другой способ на основе Е. coli обеспечивает дисплей на наружной мембране клеток за счет слияния с пептидо-гликан-ассоциированным липопротеином (PAL). Здесь и далее эти и подобные методы обобщенно называются Е. coli дисплей. В другом способе трансляция случайной РНК обрывается до выхода из рибосомы, приводя к созданию библиотеки полипептидов с их ассоциированной РНК, пока присоединенной. Ниже этот и подобные методы в целом обобщенно называются рибосомный дисплей. В других способах используется химическое связывание пептидов с РНК. См. например, Roberts и Shostak, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94:12297-303 (1997). Далее этот и подобные методы обобщенно называются РНК-пептидной скрининг. Методы скрининга двугибридных дрожжей также могут использоваться для идентификации заявляемых в данном изобретении пептидов, которые связывают миостатин. Кроме этого, разработаны библиотеки химически модифицированных пептидов, которые получают иммобилизацией на стабильных небиологических материалах, таких как полиэтиленовые стержни или проницаемые для растворителя смолы. Другая библиотека химически модифицированных пептидов использует фотолитографию для сканирования пептидов,иммобилизованных на слайдах из стекла. Далее эти и подобные методы обобщенно называются скрининг химически модифицированных пептидов. Скрининг химически модифицированных пептидов имеет то преимущество, что позволяет использовать D-аминокислоты и иные аналоги, также как и непептидные элементы. И биологический, и химический методы описаны Wells и Lowman, Curr Opin Biotechnol 3: 355-62 (1992). Кроме этого выбранные пептиды, способные связывать миостатин, могут быть дополнительно усовершенствованы путем так называемого рационального конструирования. Этот подход характеризуется тем, что производятся постепенные изменения последовательности пептида и при соответствующем исследовании наблюдают влияние, оказываемое замещением, на аффинность связывания или специфичность пептида или некоторые другие его свойства. Примером этого метода является замеще-6 009056 ние какого-либо одного остатка за (один) раз аланином, который называется прогулка (проход) аланина или сканирование аланина. Если замещают два остатка, этот метод называют двойная аланиновая прогулка. Получающиеся в результате пептиды, имеющие замещения аминокислот, проверяют на повышенную активность или другие дополнительные полезные свойства. Помимо этого анализ структуры взаимодействия между одним белком и другим белком может также использоваться для того, чтобы определить пептиды, которые взаимодействуют аналогично протеинам больших размеров. При таком анализе по кристаллической структуре протеина можно получить представление об идентичности и относительной ориентации практически важных остатков молекулы протеина, исходя из которых можно сконструировать пептид. См. например, Takasari et al., Nature Biotech 15:1266 (1977). Этим методы могут также использоваться для изучения взаимодействия между целевым белком и пептидами, отобранными фаговым дисплеем или другими способами аффинного отбора, приводя тем самым к дальнейшим предположениям возможных модификации пептидов с целью увеличения аффинности связывания и способности пептида ингибировать активность протеина. В одном варианте изобретения пептиды настоящего изобретения создают как семейства родственных пептидов. Примерами таких пептидов являются представленные SEQ ID NO: с 1 по 132. Эти пептиды получены методом отбора, при котором полученные методом фагового дисплея самые лучшие связывающие агенты подвергали последующему анализу с помощью фагового ELISA, чтобы получить кандидатные пептиды с помощью аффинной избирательной технологии, например, описанным здесь методом фагового дисплея. Однако пептиды настоящего изобретения можно получить различными известными способами, включая и химический синтез, что описано ниже. Пептиды настоящего изобретения могут быть затем улучшены способом созревания аффинности. Эта процедура направлена на повышение аффинности или активности пептидов и пептидных антител настоящего изобретения с помощью фагового дисплея или других методов отбора. На основе консенсусной последовательности могут быть получены ориентированные вторичные фагдисплейные библиотеки, в которых коровые аминокислоты (установленные по консенсусной последовательности) сохраняются постоянными или имеют систематические отклонения. Или же конкретная пептидная последовательность может использоваться для получения ориентированной фагдисплейной библиотеки с систематическими отклонениями. Просеивание (сортировка) таких библиотек при более жестких условиях может приводить к получению пептидов с повышенной способностью связывать миостатин,селективностью связывания с миостатином или другими дополнительными желательными свойствами. Однако пептиды, имеющие последовательности, соответствующие аффинной зрелости, могут быть затем получены любым из известных способов, включая химический синтез и рекомбинантные методы. Эти пептиды используются для создания связывающих агентов, таких как пептидные тела самых различных конфигураций, которые проявляют более высокую ингибиторную активность в исследованиях на клетках in vivo. В примере 6, приводимом ниже, описывается созревание аффинности пептидов первого раунда,описанных выше, с получением аффинно зрелых пептидов. Примеры аффинно зрелых пептидных антител представлены в табл. IV и V. Получившиеся 1 х и 2 х пептидные антитела, полученные из этих пептидов, были затем охарактеризованы по аффинности связывания, способности нейтрализовать активность миостатина, специфичности по отношению к миостатину, по сравнению с другими представителями семейства TNF и, кроме того, по активности in vitro и in vivo, как описано ниже. Аффинно зрелые пептиды и пептидные антитела обозначаются префиксом m перед наименованием их семейства для того, чтобы отличить их от пептидов первого раунда того же семейства. Примерные пептиды первого круга, выбранные для последующего созревания аффинности, согласно изобретению включали следующие пептиды: TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO: 33) и линейные пептиды Linear-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEQ ID NO: 104), Linear-15NO: 126). Аффинно зрелые семейства каждого из них представлены ниже в табл. IV и V. Пептиды настоящего изобретения включают также и варианты и производные отобранных пептидов, которые обладают способностью связывать миостатин. В используемом здесь значении термин вариант относится к пептидам с одной или несколькими аминокислотными инсерциями, делениями или замещениями исходной аминокислотной последовательности, которые способны связывать миостатин. Варианты с инсерциями или заменами могут содержать природные аминокислоты, а также аминокислоты, не встречающиеся в природе. В используемом здесь значении термин вариант включает фрагменты пептидов, которые еще сохраняют способность связывать миостатин. В используемом здесь смысле термин производное относится к пептидам, которые химически модифицированы иным путем, чем варианты с инсерциями, делениями и замещениями. Варианты и производные пептидов и пептидных антител настоящего изобретения описываются ниже более подробно.-7 009056 Носители В используемом здесь значении термин носитель означает вещество (молекулу), которое может быть присоединено к одному или нескольким пептидам настоящего изобретения. Предпочтительно носители придают по меньшей мере какое-нибудь одно желаемое свойство связывающим агентам настоящего изобретения. Пептиды сами по себе вероятно удаляются in vivo либо почечной фильтрацией с помощью механизмов клеточного очищения ретикулоэндотелиальной системы, либо путем протеолитического расщепления. Присоединение к носителю повышает терапевтическую ценность связывающего агента в результате снижения степени разрушения связывающего агента и/или повышения времени полужизни, уменьшения токсичности, снижения иммуногенности и/или повышения биологической активности связывающего агента. Примерами носителей являются Fc домены, линейные полимеры, например, полиэтиленгликоль(PEG), полилизин, декстран; полимер с разветвленной цепью (см. например US патент 4289872 Denkenwalter et al., выданный 15 сентября 1981, US патент 5229490 Tam, выданный 20 июля 1993, WO 93/21259 Frechet et al., опубл. 28 октября 1995); липид; семейство холестеролов (например, стероиды); углевод или олигосахарид или любой природный или синтетический протеин, полипептид или пептид,который связывается с сохранившимся рецептором. В одном варианте связывающие миостатин агенты настоящего изобретения имеют по меньшей мере один пептид, присоединенный по меньшей мере к одному носителю (F1, F2) через N-конец, Сконец или боковую цепочку одного из аминокислотных остатков пептида(-ов). Могут использоваться разные носители, такие как Fc домен на каждом конце или Fc домен на одном конце и PEG-группа на другом конце боковой цепочки.Fc домен является предпочтительным носителем. В используемом здесь значении под терминомFc домен понимают молекулы нативного Fc и вариантов Fc и последовательности, определенные ниже. В используемом здесь смысле термин нативный Fc относится к неантигенному связывающему фрагменту антитела или аминокислотной последовательности этого фрагмента, которую получают методами рекомбинантных ДНК или энзиматическим или химическим расщеплением интактных антител. Предпочтительный Fc - это фактически Fc человека, он может происходить из любого из иммуноглобулинов, таких как IgG1 и IgG2. Однако Fc молекулы, которые лишь частично имеют происхождение от человека или имеют происхождение от других организмов (не от человека), могут включаться в это понятие. Молекулы нативного Fc представляют собой мономеры - полипептиды, которые могут быть ковалентно (то есть в помощью дисульфидных связей) или нековалентно связаны с димерные или мультимерные формы. Количество межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами молекул нативного Fc колеблется от 1 до 4 в зависимости от класса (например, Ig, G,IgA, IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgA2). Примером нативного Fc является содержащий дисульфидные связи димер, получающийся как результат обработки IgG папаином (см. Ellison et al. (1982), Nucl Acid Res 10:4071-9). Термин нативныйFc используется здесь для мономерных, димерных и мультимерных форм. В используемом здесь значении термин Fc вариант означает модифицированную форму последовательности нативного Fc при условии, что связывание с сохранившимся рецептором сохраняется,как описано, например, в WO 97/34631 и WO 96/32478, которые приведены здесь в качестве ссылок. Fc варианты могут создаваться, например, замещением или делецией остатков, инсерцией остатков или усечением частей, содержащихся в данном сайте. Введенные или замещенные остатки могут также замещаться аминокислотами, такими как пептидомиметики или D-аминокислоты. Fc варианты могут быть предпочтительны по целому ряду причин, некоторые из которых описываются ниже. ПримерныеFc варианты включают молекулы и последовательности, в которых: 1. Сайты, участвующие в образовании дисульфидных связей, удаляют. Такого удаления можно избежать реакцией с другими цистеинсодержащими протеинами, присутствующими в клетке-хозяине,используемой для продуцирования заявляемых веществ. Для этой цели цистеинсодержащий сегмент наN-конце может быть отсечен или цистеиновые остатки могут быть делегированы или замещены другими аминокислотами (например, аланином или серином). Даже когда цистеиновые остатки удаляют,единственная цепочка Fc доменов еще может образовать димерный Fc домен, которые удерживаются вместе не за счет валентной связи. 2. Нативный Fc домен модифицируют, чтобы сделать его более совместимым с выбранной клеткой-хозяином. Например, можно удалить РА последовательность около N-конца типичного нативногоFc, который можно распознать с помощью переваривающего энзима в Е. coli, такого как пролиниминопептидаза. Можно добавить N-концевой остаток метионина, особенно, если молекула экспрессируется рекомбинантным способом в бактериальных клетках, например, Е. coli. 3. Часть N-конца нативного Fc удаляют, чтобы предотвратить гетерогенность при экспрессировании в выбранной клетке-хозяине. С этой целью можно произвести делецию любой из первых 20 аминокислотных остатков на N-конце, особенно тех, что находятся в положениях 1, 2, 3, 4 и 5.-8 009056 4. Удаляют один или несколько сайтов гликозилирования. Остатки, которые обычно являются гликозилируемыми (например, аспарагиновый), могут давать в ответ цитолитическую реакцию. Такие остатки можно делегировать или замещать негликозилируемыми остатками (например, аланиновыми). 5. Сайты, вовлеченные во взаимодействие с комплементом, такие как Clq связывающий сайт, удаляют. Например, можно делегировать или замещать ЕKK последовательность человеческого IgGl. Набор средств для комплемента может оказаться неблагоприятным для веществ данного изобретения и потому можно избежать этого с Fc вариантом. 6. Удаляют сайты, которые влияют на связывание с Fc рецепторами, отличными от выбранного рецептора. Нативный Fc может иметь сайты для взаимодействия с некоторыми белыми кровяными тельцами, которые не требуются для связывания молекул веществ настоящего изобретения и потому могут быть удалены. 7. ADCC сайт удаляют. ADCC сайты известны в данной области. См., например, Molec Immunol 29(5): 633-9 (1992) в части ADCC в IgGl. Эти сайты также не нужны для связывания веществ данного изобретения и потому могут быть удалены. 8. Если нативный Fc получают из антитела, происходящего не от человека, нативный Fc может быть гуманизирован. Как правило, чтобы гуманизировать нативный Fc, следует произвести замещение выбранных остатков в нативном Fc, происходящем не от человека, остатками, которые обычно присутствуют в Fc человека. Технология гуманизации антител хорошо известна в данной области. Термин Fc домен включает молекулы димерной или мультимерной формы, независимо от того,отщеплены ли они от целого антитела или получены иными способами и средствами. В указанном здесь значении термин мультимер, применяемый по отношению к Fc доменам или веществам, содержащим Fc домены, означает молекулы, содержащие две или более полипептидных цепочки, связанные ковалентным путем, нековалентным или и ковалентным, и нековалентным путем одновременно.IgG молекулы обычно образуют диамеры, IgM - пентамеры, IgD - димеры, a IgA - мономеры, димеры,тримеры или тетрамеры. Мультимеры можно получить, исходя из последовательности с активностью нативного IgG источника Fc, или выделяя такой нативный Fc. Термин димер применительно к Fc доменам, относится к веществам, имеющим две полипептидные цепочки, связанные ковалентно или нековалентно. Кроме этого, возможным носителем согласно данному изобретению является не -Fc доменный протеин, полипептид, пептид, антитело, фрагмент антитела или небольшая молекула (например, пептидомиметик), способные связываться с выбранным рецептором. Например, в качестве носителя использовался полипептид, что описано в US патенте 5739277, выданном Presta et al. 14 апреля 1998. Пептиды могут быть отобраны методом фагового дисплея для связывания с FcRn выбранным рецептором. Такие связывающиеся с выбранным рецептором соединения также включаются в понятие носитель и входят в объем данного изобретения. Такие носители могут выбираться по увеличенному времени полужизни (например, избегая последовательностей, на которые воздействуют протеазы) и по пониженной иммуногенности (например, предпочитая неиммуногенные последовательности, что обнаруживается при гуманизации антитела). Помимо этого, для получения связывающих агентов настоящего изобретения могут использоваться полимерные носители. В настоящее время в качестве носителей доступны различные средства для присоединения остатков химических веществ (молекул), см. например опубликованную Международную заявку РСТ WO 96/11953 под названием N-Terminally Chemically Modified Protein Composition andMethods, полностью упомянутую здесь как ссылка. В этой РСТ публикации описывается, помимо прочего, селективное присоединение водорастворимых полимеров к N-концу протеинов. Предпочтительным полимерным носителем является полиэтиленгликоль (PEG). PEG группа может иметь любую подходящую молекулярную массу и может быть линейной или разветвленной. Средняя молекулярная масса PEG должна предпочтительно варьировать от около 2 до около 100 кДа, более предпочтительно от около 5 до около 50 кДа, наиболее предпочтительно от около 5 до около 10 кДа.PEG-группы должны вообще присоединяться к соединениям данного изобретения ацилированием или восстановительным алкилированием с помощью реакционноспособных групп PEG-остатка (например,альдегидной, аминной или эфирной группы). Полезная стратегия пэгилирования синтетических пептидов заключается в комбинировании за счет создания в растворе конъюгатного соединения на основе пептида и PEG-остатка, каждый из которых несет свою функциональность, что обуславливает их взаимодействие друг с другом. Пептиды могут быть легко получены известным в данной области методом твердофазного синтеза. Пептиды преактивируют с помощью соответствующей функциональной группы в специфическом сайте. Предшественники очищают и полностью определяют их свойства до взаимодействия с PEG-остатком. Лигирование пептида с PEG обычно осуществляют в водной фазе и легко контролируют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Пэгилированные пептиды могут быть легко очищены с помощью препаративной ВЭЖХ, охарактеризованы с помощью аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и лазерной десорбционной масс-спектрометрии. Другим типом водорастворимых полимеров, которые могут использоваться для модификации протеинов, являются полимеры полисахаридной природы. Декстраны и полисахаридные полимеры со-9 009056 стоят из субъединиц глюкозы, предварительно соединенных -1-6-связями. Сам декстран пригоден при различных значениях молекулярной массы, удобно использовать декстран с молекулярной массой от около 1 до около 70 кДа. Декстран - подходящий водорастворимый полимер для использования в настоящем изобретении в качестве носителя как сам по себе, так и в сочетании с другими носителями(например, Fс). См., например, WO 96/11953 и WO 96/05309. Описано использование декстрана, конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами, см., например, ЕР публикацию 0315456, которая включена здесь как ссылка. При использовании декстрана как носителя согласно настоящему изобретению предпочтителен декстран с молекулярной массой от около 1 до около 20 кДа. Линкеры Связывающие агенты настоящего изобретения необязательно могут также содержать линкерную группу. Линкер в первую очередь служит спейсером между пептидом и носителем или между двумя пептидами связывающих средств настоящего изобретения. В одном варианте линкер состоит из аминокислот, соединенных пептидными связями, предпочтительно из 1-20 аминокислот, соединенных пептидными связями, причем аминокислоты выбраны из 20 природных аминокислот. Одна или несколько этих аминокислот могут быть гликозированы, как это известно специалистам. В одном варианте эти 120 аминокислот выбраны из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. Предпочтительно линкер получен из ряда аминокислот, которые не создают стерических затруднений, например глицина и аланина. Таким образом, примерные линкеры - это полиглициновые (в частности (Gly)5,(Gly)8), поли(Gly-Ala) и полиаланиновые. В используемом здесь значении обозначение g относится к глицин-гомопептидным линкерам. Как показано в табл. II, gn означает 5 х glu линкер на N-конце, в то время как gc означает 5 х gly линкер на С-конце. Комбинации Gly и Аlа предпочтительны. Последовательность примерного линкера, используемого для получения связывающих агентов настоящего изобретения, следующая: gsgsatggsgstassgsgsatg (SEQ ID NO: 305). Последовательность этого линкера обозначается k или 1k последовательность. Обозначение kc, как указано в табл. II, относится к k линкеру на С-конце, в то время как обозначение kn относится к k линкеру на N-конце. Линкеры настоящего изобретения могут быть также и непептидными. Например, могут использоваться алкильные линкеры, такие как -NH-(CH2)s-C(O)-, где s=2-20. Эти алкильные линкеры могут также быть замещены любой стерически не затрудняющей группой, например, низший алкил (т.е. С 1-С 6)низшим ацилом, галогеном (т.е. Cl, Br), CN, NH2, фенилом и пр. Возможным непептидным линкером является PEG линкер с молекулярной массой 100-5000 кДа, предпочтительно 100-500 кДа. Пептидные линкеры могут быть модифицированы для получения производных так же, как описано выше. Примеры связывающих агентов Связывающие агенты настоящего изобретения включают по меньшей мере один пептид, способный связывать миостатин. В одном варианте миостатинвязывающий пептид имеет аминокислотную последовательность, включающую предпочтительно от около 5 до около 50 аминокислот, в другом - от около 10 до около 30 аминокислот и наконец - от около 10 до около 25 аминокислот. Один вариант миостатинсвязывающего пептида включает аминокислотную последовательность WMCPP (SEQ IDNO: 633). В другом варианте миостатинсвязывающий пептид включает аминокислотную последовательностьCa1a2Wa3 WMCPP (SEQ ID NO: 352),где а 1, а 2 и а 3 выбраны из нейтральной гидрофобной, нейтральной полярной или основной аминокислоты. В другом варианте миостатинсвязывающий пептид включает последовательностьCb1b2Wb3WMCPP (SEQ ID NO: 353),где b1 выбрана как любая из аминокислот Т, I или R;b3 выбрана из Р, R, Q,причем последовательность пептида включает от 10 до 50 аминокислот, и ее физиологически приемлемые соли. В другом варианте миостатинсвязывающий пептид соответствует соединению формулыc1 c2 c3 c4 c5 c6 Сс 7 c8 Wc9 WMCPP c10 c11 c12 c13 (SEQ ID NO: 354),где c1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,с 2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,c3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,c4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,c5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,c6 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту,- 10009056c7 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота,c8 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота,c9 - нейтральная гидрофобная, нейтральная полярная или основная аминокислота, аc10-c13 представляют собой любые аминокислоты,причем протяженность пептида составляет от 20 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемым солям. Похожий вариант миостатинсвязывающего пептида соответствует соединению формулыd1 d2 d3 d4 d5 d6 С d7 d8 W d9 WMCPP d10 d11 d12 d13 (SEQ ID NO: 355),где d1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,d2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,d3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,d4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту,d5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту,d6 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту,d7 выбран из аминокислот Т, I или R,d8 выбран из R, S, Q,d9 выбран из Р, R и Q, ad10-d13 представляют собой любые аминокислоты,причем протяженность пептида составляет от 20 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемым солям. Дополнительные варианты связывающих агентов включают по крайней мере один из следующих пептидов:(1) пептид, способный связывать миостатин. причем данный пептид соответствует последовательностиWYe1e2 Yе 3 G, (SEQ ID NO: 356),где e1 представляет собой Р, S или Y,е 2 представляет собой С или Q, а е 3 представляет собой G или Н,протяженность пептида составляет от 7 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли;(2) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательностиf1 EML f2 SL f3 f4 LL (SEQ ID NO: 455),где f1 представляет собой М или I,f2 - любая аминокислота,f3 представляет собой L или F,f4 представляет собой Е, Q или D,протяженность пептида составляет от 7 до 50 аминокислот. и его физиологически приемлемые соли;(3) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательностиLg1 g2 LL g3 g4 L, (SEQ ID NO: 456),где g1 представляет собой Q, D или Е,g2 представляет собой S, Q, D или Е,g3 - любая аминокислота,g4 представляет собой L, W, F или Y,протяженность пептида составляет от 8 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли;(4) пептид, способный связывать миостатин, причем данный пептид соответствует последовательностиh1 h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 h9 (SEQ ID NO: 457),где h1 представляет собой R или D,h2 - любая аминокислота,h3 представляет собой А, Т, S или Q,h4 представляет собой L или М,h5 представляет собой L или S,h6 - любая аминокислота,h7 представляет собой F или Е,h8 представляет собой W, F или С,h9 представляет собой L, F, M или K,протяженность пептида составляет от 9 до 50 аминокислот, и его физиологически приемлемые соли.- 11009056 Как вариант изобретения, связывающие агенты данного изобретения включают также по меньшей мере один носитель, такой как полимер или Fc домен, и могут, кроме этого, включать по меньшей мере одну линкерную последовательность. Согласно этому варианту связывающие агенты настоящего изобретения конструируют так, чтобы по меньшей мере один миостатинсвязывающий пептид был присоединен по меньшей мере к одному носителю. Пептид или пептиды присоединяют непосредственно или через линкерную последовательность к носителю за счет N-концевой, С-концевой аминокислоты или состоящей из аминокислот боковой цепи пептида. В этом варианте связывающие агенты настоящего изобретения имеют следующую обобщенную структуру:(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4,где P1, Р 2, Р 3 и Р 4 представляют собой пептиды, способные связывать миостатин, а L1, L2, L3 и L4 каждый являются линкерами, а, b, с, d, e и f, каждый независимо, является 0 или 1, при условии, что, по крайней мере, а или b является 1. В одном варианте связывающих агентов, соответствующих этой обобщенной структуре, пептиды Р 1, Р 2, Р 3 и Р 4 могут быть независимо выбраны из одного или нескольких любых пептидов вышеприведенных последовательностей. Р 1, Р 2, Р 3 и Р 4 независимо выбраны из одного или нескольких пептидов,отвечающих любой из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457. В другом варианте носители связывающих агентов, соответствующие вышеприведенной общей формуле, являются Fc доменами. Таким образом пептиды сливают с Fc доменом, косвенным путем или непосредственно, получая в результате пептидные антитела. Пептидные антитела настоящего изобретения обладают высокой аффинностью связывания с миостатином и могут ингибировать активность миостатина, как показано с помощью in vitro исследований и in vivo испытаний на животных. Настоящее изобретение предусматривает также молекулы нуклеиновых кислот, включающие полинуклеотиды, кодирующие пептиды, пептидные антитела и варианты пептидов и пептидных антител,а также их производные. Примерные нуклеотидные последовательности даны ниже. Варианты и производные пептидов и пептидных антител Связывающие агенты настоящего изобретения включают также варианты и производные пептидов и пептидных антител, описываемых здесь. Так как и пептиды, и пептидные антитела настоящего изобретения могут быть охарактеризованы соответствующей аминокислотной последовательностью,можно сказать, что термины варианты и производные применяют к самому пептиду как таковому и к пептиду как компоненту пептидного антитела. В используемом здесь смысле термин пептидные варианты относят к пептидам или пептидным антителам с одной или несколькими аминокислотными инсерциями, делениями или замещениями в первоначальной аминокислотной последовательности, и которые сохраняют способность связывать миостатин и изменять его активность. В данном здесь значении фрагменты пептидов или пептидных антител включаются в понятие варианты. Понятно, что любой данный пептид или пептидное антитело может содержать один, два или все три типа вариантов. Варианты с инсерциями или с замещениями могут содержать природные аминокислоты, также как и неприродные аминокислоты или и те, и другие. Варианты пептидов и пептидных антител также могут включать зрелые пептиды и пептидные антитела, в которых удалены лидерные или сигнальные последовательности, и получившиеся в результате протеины с дополнительными аминоконцевыми остатками, аминокислоты которых могут быть как природного, так и неприродного происхождения. Пептидные антитела с дополнительным метионильным остатком в аминокислотном положении - 1 (Met-1 - пептидное антитело) тщательно рассматривают, т.к. есть пептидные антитела с дополнительными остатками метионина и лизина в положениях -2 и-1 (Met-2 - Lys-1 -). Варианты с дополнительными остатками Met, Met - Lys, Lys (или с одним или более основными остатками, в общем) являются особенно полезными для повышенного продуцирования рекомбинантного белка в бактериальных хозяйских клетках. Варианты пептидов или пептидных антител настоящего изобретения включают также пептиды,имеющие дополнительные аминокислотные остатки, которые являются результатом использования специальных экспрессионных систем. Например, использование коммерчески доступных векторов,которые экспрессируют желаемый полипептид как часть продукта слияния с помощью глутатион-Sтрансферазы (GST), обеспечивает желаемый полипептид, имеющий дополнительный глициновый остаток в аминокислотном положении -1 после отщепления GST компонента от желаемого полипептида. Варианты, которые получаются как результат экспрессии в других векторных системах, также тща- 12009056 тельно изучаются, включая те, где гистидиновые метки включены в аминокислотную последовательность, обычно в карбокси- и/или аминосодержащий конец последовательности. В примере инсерционные варианты получаются, когда один или несколько аминокислотных остатков встречающихся или не встречающихся в природе аминокислот добавляются к аминокислотной последовательности пептида. Инсерции могут быть либо на каком-нибудь конце протеина, либо на обоих концах или могут быть внутри аминокислотной последовательности пептидного антитела. Инсерционные варианты с дополнительными остатками на одном или обоих концах могут включать, например, слитые протеины и протеины с аминокислотными метками и ярлычками. Инсерционные варианты включают пептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавляют в аминокислотную последовательность пептида или его фрагмента. Инсерционные варианты могут также включать слитые белки, в которых амино- и/или карбоксисодержащие концы пептида или пептидного антитела слит (слиты) с другим полипептидом, его фрагментом или аминокислотами, в отношении которых вообще неизвестно, являются ли они частью какойлибо определенной последовательности протеина. Примерами таких слитых белков являются иммуногенные полипептиды, протеины с продолжительным временем полужизни, такие как константные области иммуноглобулинов, маркерные белки, протеины или полипептиды, которые облегчают выделение целевого пептида или пептидного антитела, и последовательности полипептидов, которые являются промоторами образования мультимерных протеинов (таких как лейцин-зипперные мотивные последовательности, которые используют при создании и стабилизации димеров). Такой тип инсерционного варианта вообще представляет собой всю или существенную часть нативной молекулы, связанную по N- или С-концу со вторыми полипептидом (целиком или с его частью). Например, в слитых белках обычно используются лидерные последовательности от других видов, допускающих рекомбинантную экспрессию белка в гетерологичном хозяине. Другие полезные слитые белки включают добавленный иммунологически активный домен, например эпитоп антитела, для облегчения выделения слитого белка. Включение сайта расщепления в точку слияния или вблизи нее облегчит удаление ненужного, чужеродного полипептида после выделения. Другие полезные сливания включают связывания функциональных доменов, например, активных центров ферментов, доменов гликозилирования, специально намеченных клеточных сигналов или трансмембранных областей. Существуют различные коммерчески доступные системы экспрессии слитых белков, которые могут использоваться в настоящем изобретении. Особенно полезные системы включают, например, глутатион-S-трансферазную (GST) систему (Pharmacia), мальтозную систему связывания белков (NEB,Beverley, MA), FLAG систему (IBI, Hew Haven, СТ) и 6 х His систему (Qiagen, Chatsworth, CA). Эти системы способны продуцировать рекомбинантные пептиды и/или пептидные антитела, несущие только небольшое количество дополнительных аминокислот, которые, похоже, не оказывают заметного влияния на активность пептида или пептидного антитела. Например, и FLAG система, и 6 х His система добавляют только короткие последовательности, о которых известно, что они являются слабоантигенными и не могут быть помехой для складывания полипептида, обеспечивающего нативную конформацию. Другим типом N-концевого слияния, которое анализируется, насколько оно полезно, является слияние Met-Lys дипептида в N-концевой области протеина или пептидов. Такое слияние может вызывать благоприятное повышение экспрессии белка или его активности. Другие системы слияния продуцируют гибридные полипептиды, причем желательно отсечь слитый компонент от целевого пептида или пептидного антитела. В одном варианте слитый компонент связан с рекомбинантным пептидным антителом пептидной последовательностью, содержащей специфическую узнаваемую протеазой последовательность. Примерами таких пригодных последовательностей являются распознаваемые с помощью протеазы вируса гравировки табака (Life Technologies,Gaithersburg, MD) или Xa Factor (New England Biolabs, Beverley, MA). Изобретение также предусматривает слитые белки, которые представляют собой пептид или пептидное антитело настоящего изобретения в комбинации с усеченным тканевым фактором (tTF). tTF представляет собой васкулярный нацеливающий агент, состоящий из усеченной формы вызывающего коагуляцию белка человека, который действует как коагулянт в кровеносных сосудах опухолей, что описано в US патентах 5877289, 6004556, 6132729, 6132730, 6156321 и Европейском патенте ЕР 0988056. Слияние tTF с антимиостатиновым пептидным антителом, или белком, или их фрагментами облегчает доставку антимиостатиновых антагонистов к клеткам-мишеням, например клеткам скелетных мышц, клеткам мышечной ткани сердца, фибробластам, преадипоцитам и, возможно, андроцитам. В другом аспекте изобретения предлагаются делеционные варианты, которые характеризуются тем, что в пептиде или пептидном антителе удалено один или несколько аминокислотных остатков. Делеции могут осуществляться на одном или на обоих концах антитела или за счет удаления одного или более остатков внутри аминокислотной последовательности пептидного антитела. Делеционные варианты обязательно включают все фрагменты пептида или пептидного антитела. Еще в одном варианте изобретения предлагаются варианты пептидов или пептидных антител, характеризующиеся заменами. Такие варианты с заменами включают такие пептиды и пептидные антитела, в которых один или несколько аминокислотных остатков удаляют и заменяют одним или несколь- 13009056 кими другими аминокислотами, причем эти аминокислоты могут быть как природного, так и неприродного происхождения. Варианты с заменами порождают пептиды или пептидные антитела, которые подобны первоначальным пептидам или пептидным антителам, при том, что две молекулы имеют определенную долю аминокислот, которые идентичны. Варианты с заменами включают замещения 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 и 20 аминокислот в пептиде или пептидном антителе, причем число замен может достигать 10% аминокислот пептида или пептидного антитела. В одном варианте эти замены являются по природе своей консервативными, изобретение также включает замены, которые являются неконсервативными, и также включает и замены нетрадиционного характера. Идентичность и подобие рассматриваемых пептидов и пептидных антител может быть легко рассчитана известными способами. Такие методы включают (но не ограничиваются ими) те, что описаны вMath., 48:1073(1988). Предпочтительные способы для определения гомологичности или процентной идентичности двух пептидов или полипептидов, или полипептида и пептида предназначены для того, чтобы показать наибольшее соответствие между исследуемыми последовательностями. Методы для определения идентичности описаны в коммерчески доступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные методы для установления идентичности между двумя последовательностями включают (но не ограничиваются) пакет программ GGP, в том числе GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984);NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra (1990. Известная программа Smith Waterman также может использоваться для определения идентичности. Некоторые схемы подгонки для выравнивания двух аминокислотных последовательностей могут приводить к сопоставлению только короткого участка двух последовательностей, и этот небольшой выравненный участок может обладать очень высокой (долей) идентичности последовательностей, даже несмотря на то, что отсутствует сколько-нибудь существенная связь между полноразмерными последовательностями. Соответственно в некоторых вариантах выбранный метод подгонки будет приводить к выравниванию, которое при совмещении будет занимать промежуток, соответствующий по меньшей мере 10% полной длины целевого полипептида, например по меньшей мере 40 смежных аминокислот при сравнении последовательностей длиной по меньшей мере 400 аминокислот, 30 смежных аминокислот при сравнении последовательностей по меньшей мере от 300 до 400 аминокислот, по меньшей мере 20 смежных аминокислот при сравнении последовательностей от 200 до около 300 аминокислот и по меньшей мере 10 смежных аминокислот при сравнении последовательностей от около 100 до 200 аминокислот. Например, с помощью компьютерной программы GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) два полипептида, для которых нужно определить процент идентичности последовательностей, выравнивают для оптимального сопоставления их соответственных аминокислот(сопоставлений matched span, no определению программы). В некоторых вариантах брешь, открывающая пенальти (которая обычно вычисляется как 3 Х средняя диагональ; средняя диагональ представляет собой среднее диагонали используемой матрицы сравнения; диагональ - это множество или число, приписываемое каждому произведенному аминокислотному сопоставлению конкретной матрицей сравнения), и брешь расширения пенальти (которое обычно 1/10 бреши, открывающей пенальти),также как и матрицу сравнения, например, РАМ 250 или BLOSUM 62 используют вместе с программой. В некоторых вариантах стандартную матрицу сравнения (см. Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) для РАМ 250 матрицы сравнения; Henikoff et al. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89:10915-10919 (1992) для BLOSUM 62 матрицы сравнения) также используют в программе. В некоторых вариантах, например, условия сравнения полипептидных последовательностей могут быть реализованы с помощью следующего: Алгоритм: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970); матрица сравнения: BLOSUM 62 от Henikoff et al., см. выше (1992); ГЭП - пенальти: 12; Gap LengthPenalty: 4; Порог гомологии : 0; далее без какого-либо пенальти за концевые ГЭПЫ. В некоторых вариантах условия сопоставления последовательностей молекул полинуклеотидов (в противоположность аминокислотной последовательности) реализуют следующим образом: АлгоритмGap Length Penalty: 3. Другие возможные программы (алгоритмы), ГЭП, открывающие пенальти, матрицы сравнения,порог гомологии и т.д., могут быть использованы и те, которые изложены в Руководстве и Программе,Wisconsin Package, Version 9, September, 1997.- 14009056 Конкретный выбор, который нужно сделать, будет оговорен для специалиста в данной области и будет зависеть от того, какое конкретное сравнение нужно выполнить, например, ДНК-ДГК, протеинпротеин, протеин-ДНК, и, кроме того, оттого, сравниваются ли определенные части последовательностей (в этом случае GAP или BestFit в целом предпочтительны) или некая последовательность и обширная база данных последовательностей (в этом случае FASTA или BLASTA предпочтительны). Стереоизомеры (например, D-аминокислот) двадцати традиционных (встречающихся в природе) аминокислот, не встречающихся в природе аминокислот, например ,-дизамещенные аминокислоты,N-алкиламинокислоты, молочной кислоты и других нетрадиционных аминокислот также могут быть пригодными исходными компонентами для пептидов настоящего изобретения. Примеры не встречающихся в природе аминокислот включают, например, аминоадипиновую кислоту, бета-аланин, бетааминопропионовую аминокислоту, аминомасляную кислоту, пиперидиновую кислоту, аминокапроновую кислоту, аминогептановую кислоту, аминоизомасляную кислоту, аминопимелиновую кислоту,диаминомасляную кислоту, десмозин, диаминопимелиновую кислоту, диаминопропионовую кислоту,N-этилглицин, N-этиласпарагин, гидроксилизин, алло-гидроксилизин, гидроксипролин, изодесмозин,алло-изолейцин, N-метилглицин, саркозин, N-метилизолейцин, N-метилвалин, норвалин, норлейцин,орнитин, 4-гидроксипролин, -карбоксиглутамат, -N,N,N-триметиллизин, -N-ацетиллизин, Oфосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, -Nметиларгинин и другие аналогичные аминокислоты и аминокислоты (например, 4-гидроксипролин). Остатки природных (незаменимых) аминокислот могут быть распределены на (перекрывающиеся) классы в зависимости от свойств, обусловленных боковыми цепями: 1) нейтральные гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Met, Phe; 2) нейтральные полярные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Gly; 3) кислые: Asp, Glu; 4) основные: His, Lys, Arg; 5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro; 6) ароматические Trp, Туr, Phe. Замены аминокислот могут быть консервативными, в результате которых получаются пептиды,имеющие функциональные и химические характеристики, подобные характеристикам исходного пептида. Консервативные аминокислотные замены включают замену представителя одного из вышеперечисленных классов другим представителем того же класса. Консервативные изменения охватывают остатки нетрадиционных аминокислот, которые обычно соединяют химическим способом пептидного синтеза, а не синтезом в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие измененные и инвертированные формы аминокислотных остатков. Неконсервативные замены могут включать обмен представителя одного из этих классов на представителя другого класса. Эти замены могут приводить к существенному изменению функциональных и/или химических характеристик пептидов. Осуществляя такого рода изменения, согласно некоторым вариантам изобретения, можно рассчитать гидропатический индекс аминокислот. Каждой аминокислоте приписан свой гидропатический индекс, исходя из ее гидрофобных и электростатических характеристик. Они таковы: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин(-3,5); лизин (-3,9); аргинин (-4,5). Значение гидропатического аминокислотного индекса, придающего белку согласованность его биологических функций, общепризнана специалистами. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами с аналогичным или близким по значению гидропатическим индексом и все же сохраняющими аналогичную биологическую активность. При осуществлении изменений, основанных на гидропатическом индексе, в некоторых вариантах возможна замена аминокислот, у которых гидропатические индексы в пределах 2. В некоторых вариантах включают аминокислоты с индексами 1, а в других 0,5. Специалистам в данной области понятно также, что замена таких аминокислот может быть эффективно осуществлена на основе гидрофильности, особенно, когда есть намерение использовать созданное биологически функциональное пептидное антитело или пептид в иммунологической практике,как в данном случае. В определенных вариантах самая большая непосредственная средняя гидрофильность протеина, установленная по гидрофильности его смежных аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, то есть с биологическим свойством протеина. Нижеследующие значения гидрофильности были установлены для следующих аминокислотных остатков: аргинин (+3,0), лизин (+3,0), аспарат (+3,01), глутамат (+3,01), серин (+0,3), аспарагин(-2,5) и триптофан (-3,4). При осуществлении изменений, основанных на близких к этим значениям гидрофильности, в некоторых вариантах возможны замены аминокислот, значения гидрофильности кото- 15009056 рых находятся в диапазоне 2, в некоторых вариантах - те, которые находятся в диапазоне 1, а в других вариантах - в диапазоне 0,5. Можно также идентифицировать эпитопы по первичным аминокислотным последовательностям на основе гидрофильности. Такие участки называют также эпитопные коровые области. Примерные замены аминокислот приведены в табл. 1 ниже. Таблица 1 Аминокислотные замены Специалист в данной области сумеет получить варианты пептидов и пептидных антител настоящего изобретения, например, путем произвольных замен и проверки получившихся пептидов и пептидных антител на связывающую активность, используя описанный здесь метод анализа. Кроме того, специалист сможет проанализировать исследования структуры и функции или исследование трехмерной структуры для того, чтобы идентифицировать остатки в схожих полипептидах,значимые для активности или структуры. Ввиду такого сопоставления можно предугадать важную роль аминокислотных остатков в протеине, которые соответствуют аминокислотным остаткам, которые важны для активности или структуры подобных белков. Специалист может сделать выбор химически схожих аминокислотных замен для таких заранее определенных важных аминокислотных остатков. Эти варианты могут быть проверены скринированием по данным анализа активности, как описано здесь. Ряд научных публикаций посвящено прогнозированию вторичной структуры. См. Moult. J., Curr. Ор. in Biotech, 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou etal., Ann. Rev. Biochem, 47:251-276 and Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Кроме того, в настоящее время компьютерные программы могут помочь в предсказании вторичной структуры. Один метод- 16009056 прогнозирования вторичной структуры основан на моделировании гомологов. Например, два полипептида или белка, которые имеют последовательности, идентичные более чем на 30%, или подобие более 40% часто имеют аналогичную структурную топологию. Наблюдаемое в последние годы увеличивающееся количество информационных баз данных по структуре белков (PDB) обеспечило повышенную возможность предсказания вторичной структуры, включая и возможное число изгибов в структуре белка. См. Holm et al., Nucl. Acid. Res, 27(1):244-247 (1999). Было высказано предположение о том, что конкретный протеин имеет ограниченное количество изгибов цепи и что определенное число структур является урегулированным, поэтому прогнозирование структуры должно стать гораздо более точным. Другие способы прогнозирования вторичной структуры включают метод протягивания нитиGribskov et al., Proc. Nat Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987 и метод эволюционной связи (См. Holm,см. выше (1999) и Brenner, см. выше (1997. В некоторых вариантах изобретения варианты пептидов или пептидных антител включают их разновидности, полученные гликозилированием, когда один или несколько сайтов гликозилирования,например сайт N-связанного гликозилирования, вносят в пептидное антитело. Сайт гликозилирования по N-связи характеризуется последовательностью Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где аминокислотный остаток, обозначенный X, может быть остатком любой аминокислоты, кроме пролина. Замена или добавление аминокислотных остатков для создания этой последовательности обеспечивает эффективный новый сайт для присоединения N-связанной углеводной цепочки. Или же замены, которые устраняют эту последовательность, будут обеспечивать удаление существующего N-связанной углеводной цепи. Также предусматривается перестановка N-связанных углеводных цепей, при которой один или несколькоN-связанных сайтов гликозилирования (обычно тех, что являются природными) удаляются, а один или несколько новых N-связанных сайтов создаются. Изобретением также предусматриваются производные пептидов или пептидных антител настоящего изобретения. В данном здесь значении термин производное относится к модификациям,отличным или дополняющим инсерции, делеции или замены аминокислотных остатков, которые сохраняют способность связывать миостатин. Предпочтительно модификации, которым подвергаются пептиды настоящего изобретения для получения производных, являются ковалентными по своей природе и включают, например, химическое связывание с полимерами, липидами, другими остатками органической и неорганической природы. Производные данного изобретения могут быть получены для повышения времени полужизни циркулирования пептидного антитела или могут предназначаться для улучшения нацеливания пептидного антитела на выбранные клетки, ткани или органы. Изобретение также касается и производных связывающих агентов, ковалентно модифицированных для включения одного или нескольких присоединяемых водорастворимых полимеров, например,полиэтиленгликоля, полиоксиэтиленгликоля или полипропиленгликоля, как описано в US патентах 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. Помимо этого специалистам известны и другие пригодные полимеры, которые включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу или другие полимеры на основе углеводов,гомополимеры поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоля, пропиленгликоля, полипропиленоксид/этилен оксидный сополимер, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и поливиниловый спирт, а также смеси этих полимеров. Особенно предпочтительными являются пептидные антитела, ковалентно модифицированные полиэтиленгликолевыми (PEG) субъединицами. Водорастворимые полимеры могут быть присоединены в определенных положениях, например, по аминоконцам пептидных антител, или произвольно присоединены к одной или нескольким боковым цепям полипептида. Использование PEG для улучшения терапевтической способности связывающих агентов, например, пептидных антител и гуманизированных антител, описано в US патенте 6133426, выданном Gonzales et. al., 17 октября 2000 г. Изобретение также включает процесс получения пептидных производных (их дериватизацию) и/или части носителя миостатинсвязывающих агентов. Такие производные могут улучшать растворимость, поглощение, биологическое время полужизни и т.п. для данных соединений. Эти остатки могут устранять или ослаблять любой нежелательный побочный эффект соединений. Возможно, приемлемые производные включают соединения, в которых: 1. Производное или какая-то его часть является циклической структурой. Например, пептидная часть может быть модифицирована, чтобы содержать два или более Cys остатков (например, в линкере), которую можно сделать циклической путем образования дисульфидных связей. 2. Производное является поперечно-сшитым или его делают способным к поперечному сшиванию молекул. Например, пептидная часть может быть модифицирована таким образом, чтобы в ней содержался один Cys остаток и вследствие этого она была бы способна образовать межмолекулярную дисульфидную связь с подобной молекулой. Это производное может быть также поперечно-сшитым через его С-концы.- 17009056 3. Одна или несколько пептидных [-C(O)NR-] связей заменяется непептидной связью. Возможными пептидными связями являются -CH2-карбамат [-CH2-OC(O)NR-], фосфонатная, -СН 2- сульфонамид[-CH2-S(O)2NR-], мочевино[-NНС(O)NН-], -СН 2- втор-аминная и алкилпептидная [-C(O)NR6-, где R6 низший алкил]. 4. N-конец дериватизируют. Как правило, N-конец может быть ацилирован или модифицирован до замещенного амина. Примерные N-концевые группы включают -NRR1 (отличные от -NH2),-NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, сукцинимидную или бензилоксикарбонил -NH(CBZ -NH-), где R и R1, каждый независимо, представляет собой водород или низший алкил и где фенильное кольцо может быть замещено 1-3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из С 1-С 4 алкила, С 1-С 4-алкокси, хлора и брома. 5. Свободный С-конец дериватизируют. Обычно С-конец этерифицируют или амидируют. Например, можно использовать известные и описанные методы, чтобы присоединить (NH-CH2-CH2-NH2)2 к соединениям данного изобретения по С-концу. Аналогично можно использовать уже описанные методы, чтобы присоединить -NH2 (или кэппинг с -NH2-группой) к соединениям данного изобретения к их С-концу. Подходящими С-концевыми деривативными группами являются, например, -C(O)R2, гдеR2 - низший алкокси или -NR3R4, где R3 и R4 являются независимо водородом или C1-C8-алкилом(предпочтительно С 1-С 4-алкил). 6. Дисульфидная связь заменяется другой, предпочтительно более стабильным поперечносшивающим остатком (например, алкиленовым). См. например, Bhatnagar et al., J. Med. Chem. 39:38149 (1996), Albert et al., Thirteenth Am Pep Symp, 357-9 (1993). 7. Один или несколько конкретных аминокислотных остатков модифицируют. Известны различные дериватизирующие агенты, специфически взаимодействующие с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками, как описывается ниже. Остатки лизина и остатки, содержащие на своем конце аминогруппу, могут прореагировать с ангидридами янтарной или другой карбоновой кислоты, которые меняют заряд остатков лизина на противоположный. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфа-аминосодержащих остатков включают имидоэфиры, такие как пиколин-имидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид,тринитробензолсульфокислота, O-метилизомочевину и глиоксилат в реакции, катализируемой трансаминазой. Аргинильные остатки могут быть модифицированы реакцией с одним или несколькими обычно применяемыми в комбинации агентами, включающими фенилглиоксаль, 2-3-бутандион, 1,2 циклогександион и нингидрин. Для дериватизации остатков аргинина требуется, чтобы ее проводили в щелочных условиях из-за высокого рKа функциональной гуанидиновой группы. Более того, эти реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также эпсилон-аминогруппой аргинина. Специфическая модификация остатков тирозина хорошо изучена, причем особый интерес вызывает введение спектральных меток в остатки тирозина реакцией с ароматическими диазониевыми соединениями или тетранитрометаном. Главным образом N-ацетилимидазол и тетранитрометан используют для получения O-ацетилпроизводных тирозина и 3-нитропроизводных соответственно. Карбоксильные группы боковых цепей (аспартил или глутамил) могут быть селективно модифицированы реакцией с карбодиимидами (R'-N=C=N-R'), например, 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4 этил)карбодиимидом или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимидом. Кроме этого, остатки аспартата и глутамата могут быть переведены в остатки аспарагина и глутамина путем взаимодействия с ионами аммония. Остатки глутамина и аспарагина могут быть деамидированы в соответствующие остатки глутамата и аспартата. Или же эти остатки могут быть деамидированы в мягких кислых условиях. Любая форма этих остатков подпадает под объем данного изобретения. Остатки цистеина могут быть заменены аминокислотными или другими остатками либо для исключения дисульфидного связывания, либо, наоборот, чтобы стабилизировать поперечное сшивание. См., например, Bhatnagar et al. (выше). Дериватизация бифункциональными агентами применяется для поперечного пришивания пептидов или их функциональных производных к матрице водонерастворимого носителя (подложки) или другим макромолекулярным носителям. Обычно используемыми поперечно-сшивающими реагентами являются, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, N-гидроксисукцинимидные эфиры, например, эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3[(n-азидофенил)дитио]пропиоимидат, позволяют получать активируемые светом производные, которые способны образовать поперечные сшивки на свету. Альтернативно реакционноспособные водонерастворимые матрицы, такие как активированные цианобромидом углеводы, и реакционноспособные субстраты, описанные в US патентах 3969287, 3691016, 4195128, 4247642, 4229537 и 4330440, используются для иммобилизации протеинов.- 18009056 Углеводные (олигосахаридные) группы обычно можно присоединить к сайтам, известным как сайты гликозилирования в протеинах. Обычно O-связанные олигосахариды присоединяют к остаткам серина (Ser) или треонина (Thr), несмотря на то, что N-связанные олигосахариды присоединяются к остаткам аспарагина (Asn), если они являются частью последовательности Asn-X-Ser/Thr, где Х может быть любой аминокислотой кроме пролина. Х является предпочтительно одной из 19 незаменимых аминокислот кроме пролина. Структуры N-связанных и O-связанных олигосахаридов и сахаридные остатки в каждом типе различаются. Общим сахаридом для обоих типов является Nацетилнейраминовая кислота (называемая сиаловой кислотой). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком и N-связанных и O-связанных олигосахаридов и вследствие своего отрицательного заряда может придавать кислые свойства гликозилизованному соединению. Такие сайты (сайт) могут быть включены в линкер соединений данного изобретения и предпочтительно гликозилируются клеткой в процессе рекомбинантного продуцирования полипептидов (например, клетками млекопитающего, такими как СНО, ВНК, COS). Однако такие сайты, кроме этого, могут быть гликозилированы синтетическими или полусинтетическими способами, известными в данной области. Другие возможные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серина или треонина, окисление атома S в Cys, метилирование альфа-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина [см., например, Creighton, Proteins:Structure and Molecule Properties (W.H. FreemanCo., San Francisco), pp. 79-86 (1983)]. Соединения настоящего изобретения могут быть также изменены и на ДНК-уровне. В последовательности ДНК любой части соединения могут быть изменены кодоны - на более совместимые с выбранной хозяйской клеткой. Для Е. coli, которая является предпочтительной клеткой-хозяином, оптимизируемые кодоны уже известны. Кодоны могут быть заменены, чтобы исключить сайты рестрикции или чтобы включить молчащие сайты рестрикции (их можно включать при процессинге ДНК в выбранной клетке-хозяине). Носитель, линкер и ДНК последовательности пептидов могут быть модифицированы для осуществления любого из вышеприведенных изменений последовательностей. Другие производные, включающие непептидные аналоги, которые обеспечивают стабилизированную структуру или уменьшение биодеградации, также здесь рассматриваются. Пептидные аналогимиметики можно получить на основе выбранного ингибирующего пептида заменой в нем одного или нескольких остатков остатками непептидной природы. Предпочтительно непептидные остатки позволяют пептиду сохранить свою природную конформацию или стабилизировать предпочтительную, например, биоактивную структуру, благодаря чему сохраняется способность распознавать и связывать миостатин. Один пример из способов получения из пептидов непептидных миметических аналогов описан Nachman et al., Regul. Pept. 57:359-370 (1995). При желании пептиды настоящего изобретения могут быть модифицированы, например, гликозилированием, амидированием, карбоксилированием или фосфорилированием или созданием кислых солей, амидов, эфиров, в особенности С-концевых эфиров и N-ацильных производных пептидов данного изобретения. Пептидные антитела также могут быть модифицированы для получения пептидных производных путем образования ковалентно или нековалентно связанных комплексов с другими остатками. Ковалентно-связанные комплексы могут быть получены сшиванием остатков химических молекул с функциональными группами боковых цепей аминокислот, входящих в состав пептидных антител, или N- или С-концевых участков. В частности, предполагают, что пептиды можно конъюгировать с репортерной группой, включающей (но без ограничения) радиоактивную метку, флуоресцентную метку, энзим (например, который катализирует колориметрическую или флуорометрическую реакцию), субстрат, твердую матрицу или носитель (например, биотин или авидин). Данное изобретение предусматривает соответственно молекулу, которая включает молекулу пептидного антитела, причем эта молекула, кроме того, предпочтительно включает репортерную группу, выбранную из радиоактивной метки, флуоресцентной метки, энзима, субстрата, твердой матрицы и носителя. Такие метки хорошо известны специалистам в данной области, например биотиновые метки особенно приемлемы. Использование таких меток известно и описано, например, в US патентах 3817837, 3850752, 3996345 и 4277437. Другие метки, которые тоже могут быть использованы, включают радиоактивные метки, флуоресцентные метки и хемилюминесцентные метки. В US патентах рассматривается использование таких меток, например, в US патентах 3847837, 3850752, 3939350 и 3996345. Любое из пептидных антител настоящего изобретения может включать одну, две или более каких-либо меток из числа перечисленных. Способы получения пептидов и пептидных антител Пептиды настоящего изобретения могут быть получены самыми разнообразными способами, известными в данной области. Например, такие пептиды можно синтезировать в растворе или на твердой подложке в соответствии с известными методиками. Различные синтетические синтезаторы являются коммерчески доступными и могут использоваться согласно известным инструкциям. См., например,Stewart and Young (supra); Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Memfield, Science 232:341-347Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987); и US патент 5424398, включенные здесь как ссылки.- 19009056 Методы твердофазного синтеза пептидов используют стирол-дивинилбензольные сополимеры,содержащие 0,1-1,0 мМ аминов/г полимера. В этих методах пептидного синтеза используется бутилоксикарбонильная (t-BOC) или 9-флуоренилметилоксикарбонильная (FMOC) защита альфа-аминогрупп. Оба метода включают постадийный синтез, при котором на каждой стадии, начиная с С-конца пептида,прибавляют по одной аминокислоте (См. Coligan et al., Curr Prot Immunol, Wiley Interscience, 1991, Unit 9). По завершении химического синтеза снимается защита синтетического пептида удалением блокирующих аминогрупп t-BOC или FMOC-групп и проводится отсоединение пептида от полимера путем обработки кислотой при пониженной температуре (например, жидким HF-10% анизолом в течение от около 0,25 до около 1 ч при 0 С). После выпаривания реагентов пептиды экстрагируют с полимера 1% раствором уксусной кислоты и затем лиофилизируют, получая грубый неочищенный продукт. Он может быть нормально очищен такими методами как гель-фильтрация на Сефадексе G-15 с использованием 5% уксусной кислоты в качестве растворителя. Лиофилизация соответствующих фракций с колонки приведет к получению гомогенных пептидов или производных пептидов, которые затем можно охарактеризовать с помощью таких стандартных способов как аминокислотный анализ, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, ультрафиолет-абсорбционная спектроскопия, молярная ротация, растворимость, и количественно оценить с помощью твердофазного расщепления по методу Edman. Метод фагового дисплея может быть особенно эффективным при идентификации пептидов настоящего изобретения, как описано выше. Кратко говоря, библиотеку фагов создают (используя, например, ml 13, fd или лямбда фаг), выставляя инсерты от 4 до примерно 80 аминокислотных остатков. Инсерты могут представлять собой, например, абсолютно вырожденные или смещенные фрагменты. Выбирают несущие фаг инсерты, которые связывают желаемый антиген, и этот процесс повторяют на протяжении нескольких циклов реселекции фагов, которые связывают этот выбранный антиген. ДНК секвенирование проводят для того, чтобы идентифицировать последовательности экспрессируемых белков. Таким путем может быть установлена минимальная линейная часть последовательности, которая связывается с желаемым антигеном. Эта процедура может быть повторена с использованием библиотеки, содержащей инсерты, включающие часть или всю целиком минимальную линейную часть плюс один или более дополнительных вырожденных остатков в направлении вверх по течению (upstream) или вниз по течению (downstream). Этими методами можно идентифицировать пептиды данного изобретения с еще большей аффинностью связывания миостатина, чем уже упомянутые здесь средства. Безотносительно способа, которым получают пептиды, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая каждый такой пептид, может быть создана с использованием стандартных методов рекомбинантных ДНК. Нуклеотидную последовательность таких молекул можно соответственно использовать без изменения аминокислотной последовательности, которую они кодируют для объяснения вырожденности кода нуклеиновой кислоты, а также для того, чтобы получить представление о предпочтительных кодонах в конкретных хозяйских клетках. Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, включающие нуклеотидные последовательности, которые кодируют пептиды и пептидные антитела данного изобретения. Эти нуклеиновые кислоты включают векторы и конструкции, содержащие полинуклеотиды, кодирующие пептиды и пептидные антитела данного изобретения, также как и варианты и производные этих пептидов и пептидных антител. Примеры таких нуклеиновых кислот приводятся далее в примерах. Метод рекомбинантных ДНК обеспечивает удобный способ получения полноразмерных пептидных антител и других крупных полипептидных связывающих агентов данного изобретения или их фрагментов. Полинуклеотид, кодирующий пептидное антитело или его фрагмент, может быть инсертирован в вектор экспрессии, который, в свою очередь, может быть введен в клетку-хозяин для получения связывающих агентов настоящего изобретения. Получение примерных пептидных антител настоящего изобретения описывается далее в примере 2. Целый ряд экспрессионных систем вектор/хозяин может использоваться для экспрессии пептидов и пептидных антител данного изобретения. Такие системы включают (но не только): микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидным или космидным ДНК векторами экспрессии; дрожжи, трансформированные дрожжевыми векторами экспрессии; системы клеток насекомых, инфицированных вирусными векторами экспрессии (например,бакуловирусами); системы растительных клеток, трансфицированные вирусными векторами экспрессии (например, вирусом табачной мозаики, TMV) или трансформированные бактериальными векторами экспрессии (например, Ti или BR 322 плазмидой) или системы животных клеток. Линия предпочтительных хозяйских клеток представляет собой штамм Е. coli 2596 (АТСС 202174), используемый для экспрессии пептидных антител, как описано далее в примере 2. Клетки млекопитающих, пригодные для получения рекомбинантных белков, включают (но не только) VERO клетки, HeLa клетки, линии клеток хозяина китайского хомяка (СНО), COS-клетки (такие как COS-7), W 138, ВНК, HepG2, 3 Т 3, RIN,MDCK, A549, РС 12, К 562 и 293 клетки.- 20009056 Термин вектор экспрессии относится к плазмиде, фагу, вирусу или вектору для экспрессирования полипептида на основе полинуклеотидной последовательности. Вектор экспрессии может включать транскрипционный элемент, включающий совокупность (1) генетического элемента или элементов, играющих регуляторную роль при экспрессии гена, например, промоторов или энхансеров, (2) структуру или последовательность, которая кодирует связывающий агент, который транскрибируется в мРНК и транслируется в белок и (3) соответственные последовательности начала и завершения транскрипции. Структурные элементы, которые предназначаются для использования в дрожжевых или эукариотических экспрессионных системах, предпочтительно включают лидерную последовательность,обеспечивающую внеклеточное выделение транслируемого белка клеткой-хозяином. Или же, если рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать остаток метионина на аминосодержащем конце. Этот остаток впоследствии можно отсоединить (или можно не отсоединять) от экспрессионного рекомбинантното белка для получения целевого пептидного продукта. Например, пептиды или пептидные антитела могут быть рекомбинантно экспрессированы в дрожжах с использованием коммерчески доступной экспрессионной системы, например, Pichia ExpressionSystem (Invitrogen, San Diego, CA), согласно инструкциям производителя. Эта система при управлении выделением зависит также от пре-про-альфа последовательности, а транскрипция инсерта запускается алкоголь-оксидазным (АОХ 1) промотором после индукции метанолом. Секретированный пептид выделяют из культуральной среды с помощью способов, используемых для выделения пептидов из супернатантов бактериальных культур или культур клеток млекопитающих. Альтернативно, кДНК, кодирующая пептид и пептидные антитела, может быть клонирована в бакуловирусном векторе экспрессии pVL1393 (Phar-Mingen, San Diego, CA). Этот вектор можно использовать в соответствии с указаниями производителя (Phar-Mingen) для того, чтобы инфицировать клеткиSpodoptera frugiperda в sF9 безбелковой среде и получить рекомбинантный белок. Этот рекомбинантный белок можно выделить из среды и сконцентрировать с помощью колонки с гепарин-Сефарозой(Pharmacia). Альтернативно, пептид или пептидное антитело может экспрессироваться в системе клеток насекомых. Такие системы на основе клеток насекомых для экспрессии белков хорошо известны специалистам в данной области. В одной из таких систем может использоваться вирус ядерного полиэдрозаAutographa californica (AcNPV) как вектор для экспрессирования чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или в Trichoplusia larvae. Кодирующая пептид последовательность может быть клонирована в несущественном участке вируса, таком как ген полиэдрина, и помещена под контроль полиэдринового промотора. Успешная инсерция пептида инактивирует ген полиэдрина и приводит к созданию белковой оболочки рекомбинантного вируса. Рекомбинантные вирусы могут использоваться для инфицирования клеток S. frugiperda или Trichoplusia larvae, в которых экспрессируется белок (Smith et al., J.Virol. 46:584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci (USA) 91:3224-7 (1994. В другом примере последовательность ДНК, кодирующая пептид, может быть амплифицирована с помощью ПЦР и клонирована в соответствующем векторе, например, pGEX-3 Х (Pharmacia). pGEX вектор предназначают для продуцирования слитого белка, включающего глутатион-S-трансферазу(GST), кодируемую вектором, и белок, кодируемый фрагментом ДНК, инсертированного в сайт клонирования вектора. Праймеры ПЦР могут быть созданы такими, чтобы включать, например, соответствующий сайт расщепления. Если слитый остаток используется исключительно для облегчения экспрессии или иначе говоря, он является нежелательным остатком, присоединяемым к интересующему пептиду, рекомбинантный слитый белок может быть отщеплен от GST-части слитого белка. pGEX-3 Х конструкцию специфического пептидного связывающего агента трансформируют в Е. coli XL-1 Blue cells(Stratagene, La Jolla CA) и отдельные конкретные трансформанты, выделенные и культивируемые. Плазмидная ДНК от конкретных трансформантов может быть выделена и частично секвенирована с помощью автоматического секвенатора для подтверждения местонахождения в соответствующем участке нуклеотидного инсерта, кодирующего последовательность специфического интересующего связывающего агента. Слитый белок, который может быть получен как нерастворимые тельца включения в бактериях,может быть выделен и очищен следующим образом. Хозяйские клетки собирают центрифугированием; промывают 0,15 М NaCl, 10 мМ Трис-буфером, рН 8,1 мМ ЭДТА и обрабатывают 0,1 мг/мл раствором лизоцима (Sigma, St. Louis, МО) в течение 15 мин при комнатной температуре. Лизат можно очистить ультразвуковой обработкой, а клеточные остатки можно осадить центрифугированием в течение 10 мин при 12000 xg. Осадок, содержащий слитый белок, можно ресуспендировать в 50 мМ Трисе, рН 8 и 10 мМ ЭДТА, на котором наслоен 50% глицерина, и процентрифугировать в течение 30 мин при 6000xg. Осадок можно снова ресуспендировать в стандартном солевом фосфатном буферном растворе(PBS) без ионов Mg и Са. Слитый белок может быть затем выделен фракционированием ресуспендированного осадка в денатурирующем SDS-PAGE (Sambrook et аl., см. выше). Гель может быть насыщен 0,4 М KСl для визуализации протеина, который можно иссечь и подвергнуть электроэлюированию при пропускании через гель буфера, не содержащего SDS. Если GST/слитый белок продуцируется бак- 21009056 териями в виде растворимого протеина, его можно выделить с помощью GST Модуля Выделения(Pharmacia). Слитый белок может быть подвергнут перевариванию для того, чтобы отщепить GST от пептида настоящего изобретения. Реакцию переваривания (20 - 40 мг слитого пептида, 20 - 30 единиц тромбина человека (4000 U/мг, Sigma) в 0,5 мл PBS проводят при инкубировании в течение 16-48 ч при комнатной температуре и нагружают на денатурирующий SDS-PAGE гель для фракционирования продуктов реакции. Этот гель может быть пропитан 0,4 М KСl для визуализации полос белка. Идентичность полос белков, соответствующих пептидам с ожидаемой молекулярной массой, может быть подтверждена анализом аминокислотной последовательности с помощью автоматического секвенирующего устройства (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, CA). Альтернативно эта идентичность может быть установлена путем проведения ВЭЖХ и/или масс-спектрометрии пептидов. В другом случае последовательность ДНК, кодирующая пептид, может быть клонирована в плазмиде, содержащей желаемый промотор, и необязательно - лидерную последовательность (Better et al.,Science, 240:1041-43 (1988. Последовательность этого конструкта может быть подтверждена автоматическим секвенированием. Плазмиду можно затем трансформировать в штамм Е. coli MC1061 с помощью стандартных методов, в которых применяется инкубация в СаСl2 и обработка бактерий тепловым шоком (Sambrook et al., см. выше). Трансформированные бактерии можно выращивать в LB среде с добавлением карбенициллина, а продуцирование экспрессируемого белка может быть индуцировано культивированием в подходящей среде. Лидерная последовательность, в случае ее присутствия, может способствовать выделению пептида и отщепляться в процессе его выделения. Системы хозяйских клеток животного происхождения для экспрессии рекомбинантных пептидов и пептидных антител хорошо известны специалистам в данной области. Штаммы клеток-хозяев можно подбирать с учетом их индивидуальной способности вырабатывать экспрессируемый протеин или продуцировать определенные посттрансляционные модификации, которые должны оказаться полезными для обеспечения активности белка. Такие модификации белка включают (но не только) ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. Различные хозяйские клетки, такие как СНО, HeLa, MDCK, 293, WI38 и подобные, имеют специфические клеточные приспособления и обеспечивают характерные механизмы таких посттрансляционных видов активности и могут специально подбираться для того, чтобы обеспечить корректное модифицирование и процессинг интродуцированного чужеродного белка. Предпочтительным является использование трансформированных клеток в течение продолжительного периода времени при высоком выходе продуцируемого белка. Такие клетки трансформируют векторами, которые содержат отобранные специально маркеры, а также желаемую кассету экспрессии,затем клеткам дают подрасти в течение 1-2 дней на обогащенных средах прежде, чем перевести на селективные среды. Селектируемый маркер предназначен для того, чтобы обеспечить рост и выделение клеток, которые успешно экспрессируют включенные последовательности. Устойчивые колонии стабильно трансформированных клеток могут быть размножены с помощью методов культур тканей, соответствующих применяемым клеточным линиям. Множество селекционных систем может использоваться для выделения клеток, которые были трансформированы для производства рекомбинантных белков. Такие системы селекции включают (но не только): гены HSV тимидинкиназы, гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы и аденинфосфорибозилтрансферазы в tk-, hgprt- или aprt-клетках соответственно. Антиметаболитная устойчивость также может использоваться как основа селекции в отношении dhfr, который придает устойчивость по отношению к метотрексату, gpt, который придает устойчивость по отношению к микофеноловой кислоте, neo, который придает устойчивость к аминогликозиду G418 и придает устойчивость к хлорсульфурону, и hygro, который придает устойчивость к гигромицину. Другими генами, которые можно успешно использовать для селекции, являются trpB, который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана, или hisD, который позволяет клеткам утилизировать гистинол вместо гистидина. Маркеры, которые обеспечивают визуальную индикацию при идентификации трансформантов, включают антоцианины, -глюкуронидазу и ее субстрат, GUS, люциферазу и ее субстрат-люциферин. Выделение и повторное сворачивание (аминокислотной цепи) связывающих агентов В некоторых случаях для того, чтобы связывающие агенты, такие как пептиды и/или пептидные антитела, данного изобретения были активными, может понадобиться их сворачивание и окисление,чтобы воспроизвести соответствующую третичную структуру с дисульфидными связями. Сворачивание можно осуществить с помощью известных в данной области способов. Такие способы включают,например, выдерживание солюбилизированного полипептидного средства при рН, обычно равного около 7, в присутствии хаотропного агента. Выбор хаотропа подобен выбору, который делается для солюбилизации телец включения, однако хаотроп обычно применяют при более низких концентрациях. Примерами хаотропных агентов являются гуанидин и мочевина. В большинстве случаев раствор для сворачивания/окисления должен также содержать восстанавливающий агент вместе с его окисленной формой в определенном их соотношении для создания конкретного окислительно-восстановительного потенциала, что позволит произойти дисульфидной перестройке, приводящей к образованию цистеи- 22009056 новых мостиков. Некоторые часто используемые редокс-пары включают цистеин/цистамин, глутатион/дитиобис GSH, хлорид меди, дитиотреитол ДТТ/дитиан ДТТ и 2-меркаптоэтанол (bМЕ)/дитио-bМЕ. Во многих случаях можно использовать сорастворитель для увеличения эффективности сворачивания. Наиболее часто применяемые сорастворители включают глицерин, полиэтиленгликоль самых различных молекулярных масс и аргинин. Может быть желательным выделение пептидов или пептидных антител данного изобретения. Методы выделения белков хорошо известны специалистам в данной области. Эти методы включают, с одной стороны, грубое фракционирование белковых и небелковых фракций. Отделив пептиды и/или пептидные антитела от других белков, можно потом выделить интересующий пептид или полипептид,используя хроматографические или электрофоретические способы, чтобы добиться частичной или полной очистки (или очистки до гомогенного состояния). Аналитические методы, особенно пригодные для получения пептидных антител и пептидов настоящего изобретения, включают ионообменную хроматографию, разделительную хроматографию, электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование. Особенно эффективным методом очистки пептидов является быстрая жидкостная хроматография белков или ВЭЖХ. Определенные аспекты настоящего изобретения касаются очистки, и в отдельных вариантах - существенной очистки пептидного антитела или пептида настоящего изобретения. Подразумевается, что термин очищенное пептидное антитело или пептид в употребляемом здесь значении означает композицию, которую можно отделить от других компонентов, причем пептидное антитело или пептид очищены до степени, которая соотносится с его природной формой. Очищенное пептидное антитело или пептид относится также и к пептидному антителу или пептиду, который свободен от примесей и иных веществ, которые он может содержать в природном состоянии. Вообще термин очищенный следует относить к композиции пептидов или композиции пептидных антител, которая была подвергнута фракционированию, чтобы удалить различные другие компоненты, и при этом в существенной степени сохранила свою экспрессируемую биологическую активность. При использовании термина существенно очищенный это обозначение следует относить к пептидной композиции или композиции пептидных антител, в которой пептидное антитело или пептид является главным компонентом композиции, составляя таким образом около 50, около 60, около 70,около 80, около 90, около 95% или более белков в композиции. Для оценки степени очистки пептида или пептидного антитела специалистам в данной области должны быть известны самые различные методы в свете раскрытия данного изобретения. Они включают, например, определение специфической связывающей активности активной фракции или определение количества пептида или пептидного антитела во фракции с помощью SDS/PAGE анализа. Предпочтительный способ определения чистоты фракции пептида или пептидного антитела состоит в вычислении связывающей активности этой фракции, сравнении ее со связывающей активностью первоначального экстракта и дальнейшем подсчете степени очистки, названной здесь- кратная степень очистки. Фактические величины, используемые для характеристики величины связывающей активности,будут, конечно, зависеть от конкретного способа анализа, выбранного для оценки степени очистки, и от того, проявляет ли пептидное антитело или пептид связывающую активность, которую можно детектировать. Различные способы, пригодные для использования с целью очистки, хорошо известны специалистам в данной области. Они включают, например, осаждение сульфатом аммония, ПЭГ, антитела (иммунопреципитация) и т.д. или тепловая денатурация с последующим центрифугированием, постадийная хроматография, например аффинная хроматография (например, на протеин А - сефарозе), ионообменная, гель-фильтрационная, с обращенной фазой, гидроксиапатитная и аффинная хроматография,изоэлектрическое фокусирование, гель-электрофорез и комбинации этих и других методов. Как в принципе известно специалистам, полагают, что порядок проведения различных процедур очистки может быть изменен, а некоторые стадии исключены, что все равно обеспечит в результате приемлемый способ получения существенно очищенного связывающего агента. Необязательно, чтобы связывающие агенты настоящего изобретения были самой высокой степени очистки. На самом деле предполагается, что менее очищенные связывающие агенты настоящего изобретения будут использоваться в некоторых вариантах. Частичная очистки обеспечивается за счет комбинации меньшего числа стадий очистки или использования различных форм одной и той же общей схемы выделения. Например, отмечается, что катионообменная колоночная хроматография, выполняемая при использовании ВЭЖХ аппаратуры, будет приводить к большей степени очистки, чем тот же способ, использующий хроматографическую систему низкого давления. Методы, обеспечивающие более низкую степень относительной очистки, могут иметь преимущества в отношении всего процесса выделения пептида или пептидного антитела в целом или в отношении поддержания связывающей активности пептида или пептидного антитела. Известно, что миграция пептида или полипептида может колебаться, иногда существенно, при различных условиях SDS/PAGE (Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm, 76:425 (1977. Поэтому- 23009056 отмечается, что при различающихся условиях проведения электрофореза явные молекулярные массы очищенных или частично очищенных продуктов экспрессии связывающих агентов могут варьироваться. Активность миостатинсвязывающих агентов Полученные связывающие агенты настоящего изобретения проверяются в отношении способности связывать миостатин и ингибировать или блокировать активность миостатина. Любое числе анализов или тестов на животных может быть использовано для определения способности конкретного агента ингибировать или блокировать активность миостатина. Различные исследования, используемые для определения свойств пептидов и пептидных антител настоящего изобретения, описываются ниже в примерах. Одно исследование представляет собой C2C12pMARE - luc анализ, в котором используется линия миостатин-чувствительных клеток (С 2 С 12 миобласты), трансфицированных люциферазным репортерным вектором, содержащим элементы реакции миостатин/активин (MARE). Возможные пептидные антитела исследуют, проводя преинкубирование серий разведении пептидных антител с миостатином и затем выдерживая клетки в инкубационной смеси. Активность получившейся в результате люциферазы определяют и на основе серий разведении пептидных антител строят калибровочную кривую. Затем определяют IC50 (концентрация пептидного антитела, при которой достигается 50% ингибирование активности миостатина, определяемое по активности люциферазы). Второе исследование, описанное ниже, представляет собой BIAcore - анализ для определения кинетических параметров ka (постоянная скорости ассоциации), kd (постоянная скорости диссоциации) и KD (постоянная равновесия диссоциации) миостатинсвязывающих агентов. Более низкие константы равновесия (KD, выражаемая в мМ) показали более высокую аффинность пептидного антитела к миостатину. Другие исследования включают анализ блокирования - для определения, является ли связывающий агент, такой как пептидное антитело, нейтрализующим (предотвращает или связывание миостатина с его рецептором) или ненейтрализующим (не предотвращает связывание миостатина с его рецептором); анализ селективности,с помощью которого узнают, селективно ли связывают миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения или неселективно - другие представители TGF-семейства; и KinEx A - анализы или анализы равновесия раствора, в которых также определяются KD, и делается заключение о большей их чувствительности при некоторых обстоятельствах. Эти анализы описаны в примере 3. На фиг. 1 показана IC50 пептида по сравнению с IC50 формы пептидного антитела этого пептида. Это показывает, что пептидное антитело значительно более эффективно при ингибировании активности миостатина, чем один пептид. Кроме того, аффинно зрелые пептидные антитела в целом показывают улучшенные значения величин IC50 и KD в сравнении с их исходными родительскими пептидами и пептидными антителами. Величины IC50 для ряда аффинно зрелых пептидных антител показаны в таблице VII, примере 7 ниже. Кроме того, в некоторых случаях, производя 2 х версии пептидного антитела, когда два пептида тандемно соединены, увеличивают активность пептидного антитела как in vitro,так и in vivo.In vivo активности показаны в примерах ниже. Активности связывающих агентов включают анаболическую активность, повышающую массу тощих мышц у модельных животных и повышение мышечной силы у этих животных. Применение миостатинсвязывающих агентов Миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения связывают миостатин и блокируют или ингибируют передачу сигнала миостатином внутри намеченных клеток. Данное изобретение предлагает способы и реагенты для снижения количества или активности миостатина у животных путем введения животному эффективной дозы одного или нескольких миостатинсвязывающих агентов. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы и средства для лечения миостатинзависимых расстройств у животных, включающие введение животному эффективной дозы одного или нескольких связывающих агентов. Эти миостатинзависимые расстройства включают (но не только) различные формы потери мышечной массы, а также метаболические расстройства, например диабет и связанные с ним расстройства, и дегенеративные заболевания костной системы, например остеопороз. Как показано в примере 8 ниже, пептидные антитела из примеров настоящего изобретения очень существенно повышают массу тощих мышц в эксперименте на мышах C1 nu/nu. Эта in vivo активность коррелирует с in vitro связывающей и ингибиторной активностью, тех же пептидных антител, описанными ниже. Расстройства, характеризующиеся потерей мышечной массы, включают различные виды дистрофии, такие как Duchenn's мышечная дистрофия, прогрессирующая мышечная дистрофия, Becker's типичная мышечная дистрофия, Dejerine-Landouzy мышечная дистрофия, Erb's мышечная дистрофия и детская (инфантильная) нейроаксональная дистрофия. Например, блокирование миостатина с помощью антител in vivo улучшило дистрофический фенотип mdx у модельных мышей с Duchenn мышечной дистрофией. (Bogdanovich et al., Nature, 420, 28 (2002. Пептидные антитела настоящего изобретения повышают массу тощих мышц по отношению к массе тела и снижают жировую массу по отношению к массе тела при введении их взрослым mdx модельным мышам.- 24009056 Другие разрушающие мышцы расстройства возникают из-за хронических заболеваний, таких как амиотрофический латеральный склероз, застойное обструктивное легочное заболевание, рак, ВИЧ, почечная недостаточность и ревматоидный артрит. Например, у бестимусных бесшерстных мышей вызвали кахексию или истощение мышц и потерю массы тела путем систематического введения миостатина (Zimmers et al., см. выше). В другом примере было обнаружено, что сывороточное и внутримышечные концентрации миостатин-иммунореактивного белка были повышенными у людей, страдающих от обусловленной ВИЧ потери мышечной массы, и были обратно-пропорциональны количеству безжировой массы (Gonzaleg-Cadavid et al., PNAS USA, 95:14938-14943 (1998. Дополнительные условия,приводящие к потере мышечной массы, могут возникать вследствие бездеятельности, пассивности,обусловленной ограничением возможности движения и неспособности двигаться из-за использования инвалидной коляски, продолжительного пребывания в постельном режиме вследствие удара, болезни,повреждения позвоночника, перелома костей или травмы и состояния невесомости (в космическом полете). Например, было установлено, что содержание миостатин-иммунореактивного белка в плазме увеличивается после продолжительного периода постельного режима (Zachwieja et al., J. Gravit Physiol.,6(2): 11 (1999. Установлено также, что в мышцах крыс, пребывавших в состоянии невесомости во время космического полета, экспрессировалось повышенное количество миостатина по сравнению с тем, что было в мышцах крыс, которые не были в состоянии невесомости (Labani et al., J. Endocrin.(67(3):417-28 (2000. Кроме того, обусловленное старением повышение соотношения между массой жира и мышечной массой и связанная с возрастом атрофия мышц, по-видимому, зависит от миостатина. Например, среднее количество сывороточного миостатин-иммунореактивного белка повышалось с возрастом в группах молодых (19-35 лет), среднего возраста (36-75 лет) и старшей возрастной группы (76-92 года) мужчин и женщин, тогда как средние величины мышечной массы и безжировой массы снижались с возрастом в этих группах (Jarashevski et al., J. Nutr Aging 6(5):343-8 (2002. Было также показано, что нокаут гена миостатина мыши повышал миогенез и понижал адипогенез (Lin et al., Biochen Biophys. Res.Commun. 291(3):701-6 (2002, приводя у взрослых особей к повышению мышечной массы, снижению накопления жира и выделению лептина. Пептидные антитела, представленные в примерах, повышают соотношение масс мышц и жира у взрослых mdx мышей согласно показанному ниже. Помимо вышесказанного в настоящее время установлено, что миостатин экспрессируется в мышце сердца и в кардиомиоцитах экспрессия окончательно регулируется после инфаркта (Sharma et al., J.Clin. Physiol. 100(1):1-9 (1999. Поэтому снижение уровня миостатина в сердечной мышце может улучшить восстановление сердечной мышцы после инфаркта. Похоже, миостатин также влияет на метаболические расстройства, включая диабет 2 типа, инсулин-независимый диабет, гипергликемию и ожирение. Например, на двух питательных типах мышей показано, что убыль миостатина улучшала фенотип при ожирении и диабете (Yen et al., см. выше). В примерах, приводимых ниже, показано, что снижение активности миостатина путем введения ингибиторов настоящего изобретения будет приводить у животных к снижению соотношения масс жира и мышц, включая и старых модельных животных. Следовательно, снижение содержания жирового компонента введением ингибиторов настоящего изобретения будет улучшать состояние животных при диабете, ожирении и гипергликемии. Кроме этого, повышение мышечной массы в результате снижения уровней миостатина может улучшить силу костей, уменьшить остеопороз и другие дегенеративные заболевания костей. Установлено, что у дефицитных по миостатину мышей наблюдалось повышенное содержание минералов и плотность плечевой кости мыши и повышенное содержание минералов трабекулярной и кортикальной костей в участках прикрепления мышц, а также повышенная мышечная масса (Hambrik et al., Calcif.Tissue Int, 71(1):63-8 (2002. Настоящее изобретение обеспечивает также методы и средства его повышения мышечной массы животных, мясо которых употребляется в пищу, путем введения животному эффективной дозы миостатинсвязывающего агента. Так как зрелый С-концевой полипептид миостатина идентичен во всех исследованных видах, следует предположить, что миостатинсвязывающие агенты будут эффективными для повышения мышечной массы и снижения доли жира в любых видах сельскохозяйственных животных, включая крупный рогатый скот, цыплят, индюков и свиней. Связывающие агенты настоящего изобретения могут использоваться сами по себе или в комбинации с другими терапевтическими средствами для повышения их терапевтического действия или снижения возможных побочных эффектов. Связывающие агенты настоящего изобретения обладают одним или несколькими желательными, но неизвестными ранее неожиданными сочетаниями свойств, улучшающими терапевтическую ценность этих средств. Эти свойства включают повышенную активность,увеличенную растворимость, пониженную способность к деградации, увеличенное время полужизни,сниженную токсичность и сниженную иммуногенность. Таким образом, связывающие агенты настоящего изобретения пригодны для применения в режимах продолжительного лечения. Кроме того, гидрофильность и гидрофобность соединений данного изобретения хорошо сбалансированы, что повышает их пригодность для использования как in vitro, так и in vivo в особенности. В частности, соединения- 25009056 настоящего изобретения обладают соответствующей степенью растворимости в водных средах, что обеспечивает поглощение и биодоступность в организме, несмотря на то, что, обладая также определенной растворимостью в липидах, эти соединения могут проникать через клеточные мембраны в направлении к предполагаемому месту действия, например к конкретной мышечной массе. Связывающие агенты настоящего изобретения пригодны для лечения субъекта (пациента) или какого-либо животного, включая человека, путем введения их в виде подходящей композиции и в эффективных дозах. Кроме того, миостатинсвязывающие агенты настоящего изобретения могут применяться для детектирования и количественного определения миостатина в ряде аналитических процедур. Эти анализы более детально описаны ниже. Вообще связывающие агенты настоящего изобретения используются как средства захвата, чтобы связать и иммобилизовать миостатин в целом ряде исследований, подобных тем, что описываются,например, Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology. Academic Press, Inc., Neu Jork(1993). Связывающие агенты могут быть каким-то образом помечены или могут взаимодействовать с третьим веществом, таким как антитело к связывающему агенту, которое является меченым, чтобы обеспечить детектирование и количественное определение миостатина. Например, связывающий агент или третье вещество (третья молекула) может быть модифицирована детектируемым остатком, например, биотином, который потом может связаться с четвертой молекулой, например, меченным энзимом стрептавидином или другими белками (Akerstrom, J. Immunol. 135:2589 (1985); Chaubert, Mod. Pathol. 10:585 (1997. Во время проведения любого конкретного исследования стадии инкубирования и/или промывания могут потребоваться после каждого сочетания реагентов. Стадии инкубации могут продолжаться от около 5 с до нескольких часов, предпочтительно от около 5 мин до около 24 ч. Однако время инкубации будет зависеть от масштаба исследования, объема раствора, концентраций и т.п. Обычно эти анализы проводятся при комнатной температуре, хотя они могут проводиться в широком диапазоне температур. Анализ неконкурентного связывания Исследование связывания может быть анализом неконкурентного связывания, при котором непосредственно измеряют количество захваченного миостатина. Например, в одном предпочтительном сэндвич-анализе связывающий агент может быть непосредственно связан с твердой подложкой и таким образом он становится иммобилизованным. Такие иммобилизованные агенты затем связывают миостатин, содержащийся в испытуемом образце. Иммобилизованный миостатин затем связывают с метящим средством, таким как меченое антитело к миостатину, который теперь можно определить. В других предпочтительных сэндвич-анализах может добавляться второй агент, специфичный к связывающему агенту, содержащий детектируемый остаток, например, биотин, к которому может специфически присоединяться третье меченое вещество, такое как стрептавидин (См. Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch. 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), которое включено здесь как ссылка). Анализ конкурентного связывания Анализ связывания может быть анализом конкурентного связывания. Количество миостатина, содержащегося в образце, измеряют непосредственно путем определения количества миостатина, замещенного или вытесненного от связывающего агента миостатином, содержащимся в образце. В одном предпочтительном анализе связывания известное количество миостатина, как правило меченого, добавляют к образцу и образец потом взаимодействует со связывающим агентом. Количество меченого миостатина, связанного со связывающим агентом, обратно пропорционально концентрации миостатина, содержащегося в образце (после протокольных записей, приведенных, например, в руководствеHarlow and Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Ch 14, pp. 579-583, см. выше). В другом предпочтительном анализе конкурентного связывания связывающий агент иммобилизуют на твердой подложке. Количество миостатина, связанного со связывающим агентом, можно определить, либо измеряя количество миостатина, содержащегося в комплексе миостатин/связывающий агент, либо, как альтернатива, измеряя количество оставшегося миостатина, не вошедшего в состав комплекса. Другие анализы связывания Настоящее изобретение предусматривает также Вестерн-блот методы для того, чтобы детектировать или количественно определять присутствие миостатина в образце. Метод в целом включает выделение белков пробы гель-электрофорезом на основе молекулярной массы и перенос белков на подходящую твердую подложку, например, нитроцеллюлозный фильтр, нейлоновый фильтр или фильтр на основе производных нейлона. Образец инкубируют со связывающими агентами или их фрагментами,которые связывают миостатин, и детектируют получившийся комплекс. Эти связывающие агенты могут быть непосредственно меченными или могут в последующем определяться с помощью меченых антител, которые специфически связываются со связывающими агентами.- 26009056 Диагностические исследования Связывающие агенты или их фрагменты настоящего изобретения могут применяться для диагностики состояний или заболеваний, которые могут характеризоваться повышенными количествами миостатина. Диагностические исследования при высоких уровнях миостатина включают методы, использующие связывающий агент и метку, чтобы детектировать миостатин в жидкостях организма человека,клеточных экстрактах и специфических тканевых экстрактах. Например, уровни миостатина в сыворотке можно измерять у пациента в течение некоторого времени, чтобы определить начало потери мышечной массы, обусловленное старением или обездвиженностью, как описано, например, у Yarasheskiet al., см. выше. Показано, что повышенные уровни миостатина коррелируют со средней уменьшившейся мышечной массой и безжировой массой в группах мужчин и женщин преклонного возраста(Yarasheski et al., см. выше). Связывающие агенты настоящего изобретения могут оказаться полезными при мониторинге увеличения или снижения уровня содержания миостатина у данного конкретного индивидума в течение времени, например. Связывающие агенты могут использоваться в таких исследованиях с модификациями или без модификаций. В предпочтительном диагностическом исследовании связывающие агенты следует пометить, присоединив, например, метку или репортерную молекулу. Известно огромное количество меток и репортерных молекул, некоторые из которых уже описаны здесь. В частности, настоящее изобретение может применяться для диагностики заболеваний человека. Известен ряд предложений для измерения уровней миостатиновых белков с помощью миостатинсвязывающих агентов. Примеры включают энзимсвязанный иммуносорбентный метод анализа(ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) и сортинг флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Для применения в диагностике в некоторых вариантах связывающие агенты настоящего изобретения обычно следует пометить детектируемым остатком. Детектируемый остаток может быть любым,но способным продуцировать, прямо или косвенно, сигнал, который можно уловить. Например, детектируемый остаток может быть радиоизотопом, таким как 3H, 14 С, 32P или 125I, флуоресцирующим или хемилюминесцирующим соединением, например, изотиоцианатом флуоресцеина, родамином или люциферином, или ферментом, таким как щелочная фосфатаза, -галактозидаза или пероксидаза хрена(Bager et al., Meth. Enz. 184:138 (1990. Фармацевтические композиции Фармацевтические композиции миостатинсвязывающих агентов, таких как пептидные антитела,описанные здесь, подпадают под объем настоящего изобретения. Такие композиции включают терапевтически или профилактически эффективное количество миостатинсвязывающего агента, его фрагмента, варианта или производного, согласно описанному здесь, в смеси с фармацевтически приемлемым средством. В предпочтительном варианте фармацевтические композиции включают антагонистсвязывающие агенты, которые ингибируют миостатин частично или полностью в смеси с фармацевтически приемлемым средством. Обычно миостатинсвязывающие агенты должны быть существенно очищенными при введении животным. Фармацевтическая композиция может содержать компоненты состава для модификации, сохранения или предохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности,запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или выделения, поглощения или проникновения композиции. Такие подходящие компоненты включают (но не имеют ограничивающего характера) аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); антимикробные средства; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или кислый сульфит натрия); буферы (такие как боратный, бикарбонатный, трис НСl, цитратный, фосфатный, на других органических кислотах); придающие объем средства (такие как маннитол или глицин), хелатирующие агенты(например, этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА, комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклобекстрин); наполнители; моносахариды, дисахариды и другие углеводы (например, глюкоза, манноза или декстрины),белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красители; ароматизирующие и разбавляющие агенты; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (например, натрий); консерванты (например, бензалконий - хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимерозал, фенэтиловый спирт, метилпарабен; пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты(например, манитол или сорбитол); суспендирующие агенты; сурфактанты или увлажнители (такие как плуроникс, ПЭТ, эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тритон,прометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал); повышающие стабильность агенты (сахароза или сорбитол); повышающие тонус средства (такие как галоиды щелочных металлов (предпочтительно натрий или калий хлорид, маннитол, сорбитол; средства доставки; разбавители; наполнители и/или фармацевтические адъюванты (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990). Оптимальная фармацевтическая композиция должна быть составлена специалистом в данной области, в зависимости, например, от предполагаемого способа введения, масштаба доставки и желаемой- 27009056 дозы. См. например, Remington's Pharmaceutical Sciences, см. выше. Такие композиции могут оказывать влияние на достижение состояния, стабильность, скорость in vivo выделения, скорость in vivo клиренса связывающего агента. Основной носитель (средство доставки) или связующее в фармацевтической композиции может быть либо водным, либо неводным по своей природе. Например, подходящим носителем или средством доставки может быть вода для инъекций, физраствор или искусственная цереброспинальная жидкость, возможно, дополненные другими веществами, обычно применяемыми в композициях для парентерального введения. Нейтральные солевые буферы или соли, смешанные с сывороточным альбумином, также представляют собой хорошие носители. Другие примерные фармацевтические композиции включают трис-буфер с рН примерно 7,0-8,5 или ацетатный буфер с рН примерно 4,0-5,5, которые могут также включать сорбитол или его подходящий заменитель. В одном варианте настоящего изобретения композиции связывающих агентов могут готовиться для хранения путем смешивания выбранной композиции, имеющей желаемую степень чистоты, с необязательными компонентами состава Remington's Pharmaceutical Sciences (см. выше) в форме лиофилизированной таблетки или водного раствора. Далее продукт на основе связывающего агента может быть приготовлен как лиофилизированное средство с использованием соответствующих наполнителей, таких как сахароза. Фармацевтические композиции могут подбираться и для парентерального введения. Альтернативно композиции могут подбираться для ингаляций или для энтерального введения, такого как орального, ушного, офтальмологического, ректального или вагинального. Приготовление таких фармацевтических композиций несложно для специалистов в данной области. Компоненты содержатся в концентрациях, которые приемлемы для места введения композиции. Например, используются буферы для поддержания композиции при физиологических значениях рН или при слегка пониженных рН, обычно в пределах интервала рН от около 5 до около 8. Если предполагается парентеральное введение, терапевтические композиции для использования в данном изобретении могут быть в форме апирогенного парентерально приемлемого водного раствора,включающего желаемый связывающий агент в фармацевтически приемлемой среде. Особенно пригодной средой для парентерального введения является стерильная дистиллированная вода, в которой содержится связывающий агент, и композиция представляет собой стерильный изотонический раствор,надлежащим образом предохраненный от порчи. Еще один тип препарата может включать композицию желаемого вещества с таким средством, как, например, инъецируемые микросферы, частицы, способные к биоразложению, полимерные соединения (полимолочная кислота, полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которые обеспечивают контролируемое или непрерывное выделение продукта,который может затем доставляться через инъекционное депо. Гиалуроновая кислота также может использоваться и это может способствовать увеличению продолжительности циркулирования. Другие пригодные свойства для введения желаемого вещества включают свойства доставки лекарств, которые можно имплантировать. В другом аспекте изобретения фармацевтические составы, пригодные для парентерального введения, могут быть составлены в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как Hanks' раствор, раствор Рингера или физиологический солевой буферный раствор. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии,например карбоксиметилцеллюлоза, сорбитол или декстран. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть приготовлены как соответствующие масляные инъекционные суспензии. Подходящие липофильные растворители или среды включают жирные кислоты, такие как кунжутное масло или эфиры синтетических жирных кислот, например этилолеат, триглицериды или липосомы. Нелипидные поликатионные аминополимеры также могут использоваться для доставки. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или средства, чтобы увеличить растворимость соединений и обеспечить получение высококонцентрированных растворов. В другом варианте фармацевтическая композиция может быть приготовлена для ингаляции. Например, связывающий агент может быть в форме сухого порошка для ингаляции. Ингаляционные растворы на основе полипептидов или нуклеиновых кислот могут также быть с пропеллантом для обеспечения аэрозольной доставки. В другом варианте растворы могут быть распылены. Легочное введение описано в РСТ заявке PCT/US 94/001875, где охарактеризована доставка в легкие химически модифицированных белков. Предполагают, что некоторые составы могут вводиться орально. В одном варианте настоящего изобретения молекулы связывающего агента, которые надо ввести таким образом, можно соединить(или можно не соединять) с носителями, обычно используемыми при изготовлении твердых дозировочных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, капсула может быть предназначена для выделения активного элемента композиции в определенной точке желудочно-кишечного тракта, когда биодоступность максимизирована, а пресистемная деградация минимизирована. Могут быть включены дополнительные агенты, чтобы облегчить поглощение молекулы связывающего агента. Разбавители,ароматизаторы, низкоплавящиеся воска, растительные масла, любриканты, суспендирующие агенты,дезинтегрирующие таблетку агенты (разрыхлители) и связующие также могут применяться.- 28009056 Фармацевтические композиции для орального введения могут готовиться с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в данной области в дозировках, приемлемых для орального введения. Такие носители дают возможность изготовить фармацевтические композиции как таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкие растворы, гели, сиропы, пюре, суспензии и т.п. для проглатывания пациентом. Фармацевтические композиции для орального использования могут быть получены объединением активного компонента с твердым наполнителем и обработкой получившейся смеси гранул (необязательно после размалывания) с получением таблеток и дражированных сердцевинок. При желании могут быть добавлены подходящие вспомогательные вещества. Подходящие наполнители включают углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, например, лактозу, сахарозу, маннитол и сорбитол, крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений, целлюлозу, например, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу или натрий-карбоксиметилцеллюлозу, камеди, включая аравийскую и трагакант, белки, такие как коллаген и желатин. При желании могут быть добавлены дезинтегрирующие и солюбилизирующие агенты, такие как поперечносшитый поливинилпирролидон,агар и альгиновая кислота или ее соль, например, альгинат натрия. Сердцевинки драже могут использоваться вместе с подходящими покрытиями, например, концентрированными сахарными растворами, которые могут также содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы глазури и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут быть также добавлены к таблеткам или покрытиям драже для идентификации продукта или для характеристики количества активного вещества, например дозы. Фармацевтические препараты, которые могут использоваться орально, включают также заталкиваемые (push-fit) капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие запечатанные капсулы, изготовленные из желатина с покрытием из глицерина и сорбитола. Заталкиваемые капсулы могут содержать активные ингредиенты, смешанные с наполнителями или связующими, такими как лактоза или крахмалы, любриканты, такие как тальк или стеарат магния и, необязательно, стабилизаторы. В мягких капсулах активные ингредиенты могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как масла, жидкие растворы или жидкий полиэтиленгликоль со стабилизаторами или без них. Другая фармацевтическая композиция может включать эффективное количество связывающего агента в смеси с нетоксичными наполнителями, которые пригодны для производства таблеток. Растворив таблетки в стерильной воде или другой соответствующей среде, можно приготовить растворы в форме единичной дозы. Подходящие наполнители включают (но без ограничения) инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактозу или фосфат кальция, или связывающие агенты, такие как крахмал, желатин или (камедь) акации, или смазывающие средства,такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Другие фармацевтические композиции должны быть очевидны специалистам в данной области, в их составы водят молекулы связывающих агентов в виде средств непрерывной или регулируемой доставки. Способы приготовления целого ряда других средств непрерывной и регулируемой подачи (доставки), такие как липосомные носители, биоразлагающиеся микрочастицы или пористые гранулы и инъекционное депо - хорошо известны специалистам. См., например, PCT/US 93/00829, где описано контролируемое выделение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтической композиции. Другие примеры непрерывно выделяющихся препаратов включают полупроницаемые полимерные матрицы в виде частиц определенной формы, например пленок или микрокапсул. Непрерывно выделяющие лекарство капсулы могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (US 3773919, ЕР 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Е-глутамата (Sidman et al., Biopolymers,22:547-556 (1983, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277(1981); Langer et al., Chem. Tech., 12:98-105 (1982 этиленвинил-ацетат (Langer et al., см. выше) или D(-)-3-гидроксимасляная кислота (ЕР 133988). Непрерывно выделяющиеся композиции включают также липосомы, которые можно приготовить любым известным в данной области способом. См., например,Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985); ЕР 36676, ЕР 88046, ЕР 143949. Фармацевтические композиции, которые следует использовать для in vivo введения, как правило,должны быть стерильными. Это может быть достигнуто фильтрованием через стерильные фильтрационные мембраны. Если композицию лиофилизируют, стерилизация, которую проводят этим способом,может проводиться либо до, либо после лиофилизации и восстановления. Композиция для парентерального введения может храниться в лиофилизированной форме или в растворе. Кроме того, парентеральные композиции вообще должны находиться в емкости со стерильным входом для доступа, например, в сумке для внутривенного раствора или в сосуде с пробкой, которую можно проколоть гиподермической инъекционной иглой. Как только фармацевтическая композиция получена, ее можно хранить в стерильных сосудах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного или лиофилизи- 29009056 рованного порошка. Такие составы могут храниться либо в готовой для использования форме, или в форме (например, лиофилизированной), требующей восстановления перед введением. В конкретном варианте настоящее изобретение касается наборов для производства единичных доз для введения. Наборы могут содержать по две емкости: одну - с высушенным белком, другую - с водным составом. В объеме данного изобретения включаются также наборы, содержащие единичные и мультикамерные предварительно заполненные шприцы (например, жидкостные шприцы и лиошприцы). Эффективное количество фармацевтической композиции, предназначенной для терапевтического применения, будет зависеть, например, от терапевтической цели и обстоятельств. Специалисту должно быть понятно, что соответствующие уровни доз для лечения будут, таким образом, зависеть частично от доставляемого вещества, индикации, какой связывающий агент используется, способа введения и размера (веса тела, поверхности тела или размера органа) и состояния (возраста и общего состояния здоровья) пациента. Соответственно врач может подкорректировать дозу и модифицировать тип введения для достижения оптимального терапевтического эффекта. Обычная доза может колебаться от около 0,1 до около 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. В других вариантах доза может колебаться от 0,1 до около 100 мг/кг, или от 1 до около 100 кг/кг, или от 5 до около 100 мг/кг. Для любого соединения терапевтически эффективная доза может быть определена сначала с помощью исследований на культурах клеток или на модельных животных, таких как мыши, крысы, кролики, собаки, свиньи или обезьяны. Животные могут также использоваться для определения соответствующего диапазона концентраций и способа введения. Такая информация может потом использоваться для установления приемлемых доз и путем введения человеку. Точные дозы следует определять исходя из факторов, связанных с субъектом, которому требуется лечение. Дозы и путь введения регулируются, чтобы обеспечить существенные уровни активного соединения или поддержать желаемый эффект. Факторы, которые могут быть приняты во внимание,включают тяжесть заболевания, общее состояние здоровья больного, возраст, вес, пол, время и частота введения, лекарственное сочетание (сочетания), реакционную чувствительность и реакцию на лечение. Долго действующие фармацевтические композиции могут вводиться каждые 3-4 дня, каждую неделю или раз в две недели в зависимости от времени полужизни и скорости клиренса конкретного состава. Частота дозирования будет зависеть от фармакокинетических параметров молекулы связывающего агента в используемом составе. Обычно композицию вводят до тех пор, пока применяемая доза не даст возможности достичь желаемого эффекта. Композиция может, следовательно, вводиться в виде единичной дозы или как мультидоза (при той же или другой концентрации/дозах) за раз или как непрерывная инфузия. Подкорректировать соответствующую дозу нетрудно. Убедиться, что дозы являются уместными, можно используя соответствующие данные по их эффективности. Способы введения фармацевтической композиции соответствуют известным способам, например,орально, инъекции внутривенные, внутрибрюшинные, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, внутримышечно, интраокулярно, интраартериально, интрапортально, интралезиональным путем, интрамедулярно, интратекально, интравентрикулярно, трансдермально, подкожно, внутрибрюшинно, интраназально, энтерально, местно, сублингвально, уретрально, вагинально или ректально, с помощью средств непрерывной доставки или путем имплантируемых средств. При желании композиции могут вводиться инъекцией болюса или непрерывно - инфузией или с помощью имплантируемого средства. Альтернативно или дополнительно - композиции могут вводиться локально путем имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, на котором желаемая молекула адсорбирована или инкапсулирована. Если используется имплантируемое средство, то оно может быть имплантировано в любую подходящую ткань или орган, и доставка желаемого вещества происходит посредством диффузии, выделения с течением времени из болюса или непрерывного введения. В некоторых случаях желательно использовать фармацевтические композиции ех vivo способом. Тогда клетки, ткани или органы, которые были удалены у пациента, выдерживают в фармацевтических композициях, после чего указанные клетки, ткани и/или органы впоследствии имплантируют обратно пациенту. В других случаях, связывающий агент настоящего изобретения, такой как пептидное антитело,может быть доставлен имплантированием определенных клеток, были генетически трансформированы с помощью методов, подобных тем, что описаны здесь, чтобы экспрессировать полипептид и обеспечить его выделение. Такие клетки могут быть животными или от человека, они могут быть автологичными, гетерологичными или ксеногенными. Необязательно клетки могут быть иммортализованными. Для того чтобы уменьшить возможность иммунологической реакции, клетки могут быть инкапсулированы с тем, чтобы избежать инфильтрации окружающих тканей. Инкапсулирующие материалы должны быть в целом совместимыми, полупроницаемыми полимерными контурами или мембранами, которые позволяют выделяться белковому продукту (продуктам), но предохраняют от деструкции клетки за счет иммунной системы пациента или других причиняющих вред факторов окружающих тканей. Фармацевтические композиции, содержащие связывающие агенты настоящего изобретения, вводят субъекту для лечения какого-либо миостатинзависимого расстройства. Они включают расстрой- 30