Композиции экзотрансферазы с3 clostridium botulinum и способы лечения метастазирования опухолей

008824 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к композициям и способам, которые могут использоваться для лечения злокачественных опухолей и предотвращения опухолевого роста, связанного с метастазирующей злокачественной опухолью. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим конъюгат слитого белка, способный проникать в клетку, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С 3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, которые могут использоваться для предотвращения или ингибирования неконтролируемой пролиферации и распространения или миграции метастазирующих опухолевых клеток при злокачественной опухоли млекопитающего. Предшествующий уровень техники Злокачественные опухоли млекопитающих характеризуются неконтролируемым делением популяции злокачественных клеток в ткани млекопитающего. Если популяция клеток расположена в ткани, такое неконтролируемое деление злокачественной или раковой клетки может приводить к образованию в ткани первичной злокачественной опухоли. Если одна или несколько злокачественных клеток или кластер клеток мигрирует из участка локализованной популяции, укореняясь и бесконтрольно прорастая во втором участке или в дополнительных участках ткани, которые могут находиться вблизи от первого участка опухоли или могут быть удалены от первого участка, находясь, например, в другом органе или ткани, анатомически удаленной или отличной от первой ткани, то может возникать вторая опухоль или дополнительные опухоли во втором участке или дополнительных участках, соответственно, в результате бесконтрольного деления мигрировавшей злокачественной клетки или клеток. Также может происходить миграция одной или нескольких злокачественных клеток из локуса растущих во втором участке клеток в другие участки, и так далее, с образованием злокачественных опухолей в одном или нескольких участках ткани млекопитающего. Рост таких злокачественных опухолей часто обуславливает характерный ангиогенез или процесс васкуляризации ткани вблизи развивающейся опухоли, включающий в себя развитие новых капиллярных кровеносных сосудов или прорастание сосудов и образование тубулярной сети, причем такие новые сосуды обеспечивают поступление различных факторов, таких как питательные вещества, и факторы роста, которые необходимы и обеспечивают непрерывный рост опухоли. Опухоль представляет собой патологическую массу ткани, которая является результатом интенсивного деления клеток, которое является бесконтрольным и прогрессирует, и также называется новообразованием. Опухоли могут быть доброкачественными (нераковыми) и злокачественными. В настоящее время для лечения злокачественных опухолей млекопитающих, таких как человек, используются различные способы, включая, например, хирургические процедуры, при которых, например,опухоль и обычно некоторую прилегающую или близлежащую к опухоли ткань иссекают из участка опухоли в ткани. После удаления опухоли оставшаяся или краевая ткань остается вблизи участка опухоли у млекопитающего. Однако только при хирургическом вмешательстве у многих пациентов, особенно,с определенными типами злокачественных опухолей, такими как злокачественная опухоль, выбранная из группы, включающей злокачественную опухоль молочной железы, головного мозга, кишечника, кожи(меланома), почки и печени, возникнет рецидив злокачественной опухоли в виде образования и роста по меньшей мере одной добавочной или вторичной опухоли, часто в краях, оставшихся после иссечения первой опухоли и иногда в другой ткани или органах и в местах, удаленных от участка первой опухоли. Поэтому кроме хирургических методов при многих злокачественных опухолях также проводят комбинированную терапию, такую как введение цитотоксических химиотерапевтических лекарственных препаратов (например, винкристин, винбластин, цисплатин, метотрексат, 5-FU и т.д.) и/или лучевую терапию. Одна из трудностей такого подхода, однако, заключается в том, что радиотерапевтический или химиотерапевтический агент может быть токсичным для нормальных тканей на уровнях вводимой дозы, и часто создает для пациента угрожающие для жизни побочные эффекты. Такие способы лечения злокачественных опухолей часто бывают безуспешными и могут иметь высокую вероятность ремиссии, что приводит к смерти пациента. Преимуществами некоторых наиболее современных методов лечения является нарушение регуляции клеточной передачи сигнала измененными или стимулированными генными продуктами в раковых клетках, например, применение тамоксифена при раке молочной железы и Gleevec (иматинибмезилат от Novartis) при хроническом миелоидном лейкозе (также обозначаемом как CML). Другим препятствием существующих способов является нацеленность на местный рецидив и на местный контроль заболевания при лечении злокачественных опухолей. Свыше 600000 пациентов ежегодно (в США) имеют локализованное злокачественное заболевание (без признаков отдаленного метастазирования) в момент его проявления, составляя около 64% всех пациентов с диагнозом злокачественной опухоли, исключая немеланомный рак кожи или карциному in situ. Для большинства таких пациентов хирургическая резекция заболевания является основным шансом на излечение, и свыше 400000 пациентов излечиваются после первичного лечения. К сожалению, примерно у 200000 (или около одной трети всех пациентов с локализованным заболеванием) возникает рецидив после первичного лечения. Число тех, у кого возникает местный рецидив заболевания, может составлять примерно до 133000 пациентов ежегодно (или около 21% от всех с локализованным заболеванием). Число тех, у кого рецидив возникает вследствие отдаленных метастазов заболевания, составляет около 68000 пациентов ежегодно (или-1 008824 около 11% пациентов с локализованным заболеванием). Приблизительно еще 100000 пациентов ежегодно умирают в результате неспособности контролировать местный рост заболевания. Опухоли головного мозга являются особенно страшной формой злокачественных опухолей. Примерно одна треть первичных глиом (глиомы составляют примерно 1/3 всех опухолей головного мозга) приводит к смерти, и среднее время жизни пациентов с глиомой составляет примерно от 10 до 12 месяцев. У около 9% пациентов уровень жизни составляет 5 лет. Глиомы представляют собой нейроэктодермальные опухоли нейроглиального происхождения, и включают в себя астроцитому, происходящую из астроцитов, олигодендроглиому, происходящую из олигодендроглиоцитов, и эпендимому, происходящую из эпендимальных клеток. Некоторые исследования указывают на тот факт, что для лечения этих агрессивных опухолей необходимы комбинированные способы лечения. Наиболее частый тип опухоли головного мозга обусловлен метастазами, и в течение года в США диагностируют примерно от 100000 до 170000 опухолей головного мозга. Среднее время жизни составляет примерно от 2,9 месяцев до 3,4 месяцев. Лечение метастазирующих опухолей головного мозга, главным образом, осуществляют путем радиохирургии или резекции опухоли. Имеются сообщения, что наилучшим результатом лечения является сочетание хирургических методов с облучением, чем просто облучение. Первичными опухолями,которые чаще всего дают метастазы в головной мозг, включают в себя рак молочной железы, бронхиальный рак, карциному желудочно-кишечного тракта, карциному почки и злокачественную меланому. Метастазирующие опухоли головного мозга могут иметь бурное течение, особенно после удаления первичной опухоли. Больные, у которых подозревают злокачественную опухоль ЦНС (под которой в данном описании подразумевают и опухоли головного мозга, и рак головного мозга), могут быть идентифицированы по клиническим симптомам, таким как головная боль, кашель или рвота, припадки, изменение психического состояния, нарушение речи, нарушение зрения и/или паралич. Способ ингибирования метастазов первичной опухоли ЦНС у млекопитающего также входит в объем настоящего изобретения. Ангиогенез Большое количество механизмов, которые контролируют ангиогенез в нормальных тканях, изменены в присутствии злокачественных опухолей во время опухолевого роста. В образование и метастазирование опухолей вовлечен патологический ангиогенез. Как для здоровых тканей, для опухоли необходима связь с кровеносными сосудами для получения питательных веществ и кислорода и для удаления клеточных отходов. Таким образом, патологический ангиогенез важен для роста и распространения опухолей. Опухоли, для которых важен ангиогенез, включают в себя солидные злокачественные опухоли, а также доброкачественные опухоли, например, такие как нейрома слухового нерва, нейрофиброма, трахома и пиогенные гранулемы. В метастазах патологический ангиогенез важен по меньшей мере в двух аспектах. Образование кровеносных сосудов в опухолях позволяет опухолевым клеткам проникать в кровяное русло и циркулировать по организму. Ангиогенез поддерживает образование и рост новых опухолей, рассеянных опухолевыми клетками, которые покинули первичный участок или первичную опухоль, как это используется здесь. Ангиогенез представляет собой комплексный процесс образования кровеносных сосудов. В этом процессе задействованы биохимические и клеточные события, в том числе (1) активация эндотелиальных клеток (ЕС) ангиогенным стимулом; (2) деградация внеклеточного матрикса, инвазия активированных ЕС в окружающие ткани, и миграция к источнику ангиогенного стимула; и (3) пролиферация и дифференцировка ЕС с образованием новых кровеносных сосудов (Folkman et al., 1991, J. Biol. Chem. 267: 10931-10934). Контроль ангиогенеза является строго регулируемым процессом, в который вовлечены ангиогенные стимуляторы и ингибиторы. У здоровых людей и животных ангиогенез происходит в особых, ограниченных ситуациях. Например, ангиогенез в норме наблюдается при развитии плода и эмбриона, развитии и росте нормальных тканей и органов, заживлении ран, и при образовании желтого тела, эндометрия и плаценты. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к ингибированию ангиогенеза посредством проникающего в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С 3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например, такой слитый белок как ВА-05. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к ингибированию ангиогенеза эффективным количеством фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы С 3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например, такой слитый белок как ВА-05. Передача сигнала Rho и злокачественные опухоли Семейство белков Rho (также известных как гомологи Ras) были исследованы в отношении злокачественных опухолей. Ras (и RhoB в качестве вторичной мишени) являются мишенями для лечения метастазирования молекулами, которые ингибируют посттрансляционные модификации. Однако исследования этих лекарственных средств сфокусированы на Ras и ограничены RhoB среди других представителей семейства Rho, тогда как благодаря настоящему изобретению существует возможность воздействия-2 008824 на передачу сигнала RhoA, RhoB и RhoC. RhoA, RhoB и Rho С являются членами семейства Rho, специфично ингибируемыми слитым белком ВА-05. В некоторых исследованиях изофермент С 3 применяли в качестве молекулярного зонда для определения вовлечения Rho, и были обнаружены значительные изменения в параметрах моделей in vitro, считающихся важными для злокачественных опухолей, например, для трансформации клеток. В таких исследованиях С 3 использовали в различных способах, начиная длительной инкубацией в среде культуры ткани и заканчивая экспрессией гетерологичного гена. Преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что способы по настоящему изобретению, композиции и такие как ВА-05 и введение ВА-05, вносят значительный вклад по сравнению с C3 за счет способности композиций по настоящему изобретению проникать внутрь опухолевых клеток и, таким образом, быстро инактивировать Rho при более низких дозах. Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что слитый белок по изобретению, такой как ВА-07, входящий в состав композиции,способен проникать как в опухолевые клетки, так и в эндотелиальные клетки, которые в отсутствие слитого белка могут образовывать новые кровеносные сосуды, поддерживающие рост опухоли. Мутации регуляторных белков семейства Rho были обнаружены в клинических образцах злокачественных опухолей. Их примеры включают в себя ген DLC1 в гепатоцеллюлярной карциноме; р-190-А в геномной области, которая изменена в глиомах и астроцитомах; GRAF, который имеет мутации с потерей функции при лейкозе; и LARG, обнаруженный в некоторых генных слияниях, найденных при остром миелоидном лейкозе. Точечные мутации, полученные методами генной инженерии активируют RhoA и вызывают трансформацию клеток in vitro. Экспрессия генов семейства Rho при злокачественных опухолях человека Малая ГТФаза Rho является клеточной мишенью ВА-05, и положительно регулируется при некоторых типах злокачественных опухолей, таких как злокачественная меланома и рак молочной железы. В отличие от малой ГТФазы Ras, ГТФазы Rho не были идентифицированы обычными подходами как онкогены, хотя увеличивалось количество данных о нарушенной регуляции экспрессии гена Rho при злокачественных опухолях. Например, повышенные уровни мРНК RhoA наблюдали в опухоли зародышевых клеток яичек, а повышенные уровни мРНК RhoC наблюдали при воспалительном раке молочной железы и при аденокарциноме поджелудочной железы. В проекте Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) устанавливается взаимосвязь между экспрессией генов и участком малигнизирования. Данные доступны на транскрипционном уровне в библиотеках, полученных из злокачественных и нормальных клеток (NCBI, 2002). Транскрипционные уровни измерены с использованием меток (tag), т.е., олигонуклеотидов длиной 10 оснований, которые уникально определяют ген. Имеющиеся данные по RhoA, RhoB и RhoC I показывают положительную регуляцию RhoA и, в меньшей степени в этих исследованиях положительную реакцию RhoC в злокачественных опухолях головного мозга и молочной железы. Метки последовательности Rho А чаще присутствуют в библиотеках, полученных из злокачественных опухолей мозжечка и молочной железы, чем из соответствующей нормальной ткани. Уровни экспрессии повышаются в глиобластоме, но не в астроцитоме. Результат для астроцитомы соответствует снижению уровней белка RhoA в образцах астроцитарных опухолей. В злокачественных опухолях молочной железы и, в меньшей степени, в некоторых злокачественных опухолях головного мозга повышена экспрессия мРНК Rho С, а в аденокарциноме кишечника отмечается отрицательная ее регуляция. Однако относительные уровни кДНК Rho в таких библиотеках могут не быть непосредственно связанными с действием Rho в клетке, регуляция которой сложная и в нее вовлечено большое количество других продуктов генов. Белки Rho в опухолях и опухолевых клеточных линиях Экспрессия белка Rho была исследована в некоторых опухолевых участках у людей. Повышенные уровни белка были обнаружены в опухолях толстого кишечника, молочной железы и легких. УровниRhoA и RhoB были обнаружены в срезах толщиной 5 мкм плоскоклеточных карцином головы и шеи с использованием поликлональных антител против этих белков, с последующей визуализацией с помощью набора VectaStain (Vector Labs) и анализом изображения. Близлежащие неопухолевые области использовали в качестве контролей. Хотя уровни белка Rho A повышались при опухолевой прогрессии, уровниRhoB снижались в инвазивных опухолях по сравнению с карциномой in situ и хорошо дифференцированными опухолями. Состояние активации не исследовали. Сверхэкспрессия RhoA и RhoB может возникать в аденокарциномах молочной железы и легких по сравнению с нормальной тканью, тогда как экспрессия белков Rho снижена в астроцитарных опухолях и обратно коррелирует со злокачественными опухолями II-IV степени.Rho вовлечен в регуляцию миграции и движения клеток. Клетки гепатомы крысы ММ 1, трансфицировали мутантными конструкциями Rho A (Val14 или 14Val Ile41), в результате получали конститутивную активацию Rho. В анализе инвазии in vitro процент высеянных клеток, способных инфильтрировать слой мезотелиальных клеток, согласовывался с уровнем экспрессии трансфицированного RhoA Val14. Когда такие активированные клетки, трансфицированные-3 008824 узелки по сравнению с 2 из 8 при контрольной трансфекции. Эти результаты указывают на то, что активный Rho связан с онкогенностью. На основании детального исследования генной экспрессии, в котором сравнивали две модельные системы метастазирующей меланомы, одну человеческую и одну мышиную, и наблюдали общее сходство генной экспрессии посредством микрочипа, было сделано заключение, что экспрессия RhoC меняется при повышении уровня метастазирования (Clark et al., 2000). Более того, при экспериментальном контроле за генной экспрессией сверхэкспрессия RhoC индуцировала переключение клеточной линии меланомы человека от низкой способности к метастазированию к более высокому. Хотя не было отмечено свехэкспрессии RhoA, доминантная негативная мутация (N19RhoA) устраняла способность к метастазированию. Был идентифицирован набор из 70 генов, экспрессия которых была связана с предрасположенностью к метастазированию рака молочной железы человека (van't Veer et al., 2002). Хотя гены Rho не были обнаружены, уровень маркера заболевания как прогностического индикатора не обязательно был связан с его значением в качестве мишени для терапии. В случае передачи сигнала семейства Rho имеется сложная регуляция ферментативной активности и белок-белковых взаимодействий, которая не очевидна только из исследований уровня транскрипции. Сущность изобретения Индивидуальные слитые белки по изобретению иногда обозначены, как ВА-05, ВА-07, и тому подобное. Изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции метастазирующих опухолевых клеток при злокачественной опухоли млекопитающего, предусматривающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка,содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазыC3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог. Изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования неконтролируемой пролиферации и распространения или миграции в пределах края резекции ткани хозяина, прилегающей к участку иссечения злокачественной опухоли млекопитающего, метастазирующей опухолевые клетки, оставшейся в крае резекции, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridiumbotulinum, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления опухоли, или перед и после иссечения или удаления опухоли. Изобретение относится к способу предотвращения роста опухоли из злокачественной клетки в ткани хозяина у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два явления, выбранных из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки. Изобретение относится к способу предотвращения или роста внутри края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первичной злокачественной опухоли у млекопитающего, вторичной опухоли, содержащей остаточную клетку злокачественной опухоли, причем данный способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления первичной опухоли, или перед и после иссечения или удаления первичной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции остаточных злокачественных клеток, пролиферации остаточных злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи остаточной злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из остаточной злокачественной клетки. Изобретение, кроме того, относится к применению определенной выше фармацевтической композиции для осуществления описанного выше способа или для производства лекарственного средства для осуществления описанного выше способа.-4 008824 В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования метастазов системной злокачественной опухоли в ЦНС (центральную нервную систему) млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например, такой слитый белок, как ВА-05. В одном из аспектов терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например, такой слитый белок, как ВА-05, может проявлять антиангиогенную активность и может использоваться для лечения злокачественных опухолей. В одном из аспектов изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции метастазирующей опухолевой клетки при злокачественной опухоли млекопитающего, предусматривающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог. Во втором аспекте изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции в пределах края резекции ткани хозяина, прилегающей к участку иссечения злокачественной опухоли у млекопитающего, метастазирующей опухолевой клетки, оставшейся в крае резекции, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка,содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазыC3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления опухоли, или перед и после иссечения или удаления опухоли. В третьем аспекте изобретение относится к способу предотвращения роста опухоли из злокачественной клетки в ткани хозяина у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки. В четвертом аспекте изобретение относится к способу предотвращения роста внутри края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первичной злокачественной опухоли у млекопитающего, вторичной опухоли, содержащей остаточную клетку злокачественной опухоли, причем данный способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления первичной опухоли, или перед и после иссечения или удаления первичной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции остаточных злокачественных клеток, пролиферации остаточных злокачественных клеток,ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи остаточной злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из остаточной злокачественной клетки. В пятом аспекте изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции метастазирующей опухолевой клетки при злокачественной опухоли млекопитающего. В шестом аспекте изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения или ингибирования бескон-5 008824 трольной пролиферации и распространения или миграции в пределах края резекции ткани хозяина, прилегающей к участку иссечения злокачественной опухоли у млекопитающего, метастазирующей опухолевой клетки, оставшейся в крае резекции, подходящего для введения непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, во временном интервале перед или после иссечения или удаления опухоли, или перед и после иссечения или удаления опухоли. В седьмом аспекте изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения роста опухоли из злокачественной клетки в ткани хозяина у млекопитающего, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки. В восьмом аспекте изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, для производства лекарственного средства для предотвращения роста внутри края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первичной злокачественной опухоли у млекопитающего, вторичной опухоли, содержащей остаточную клетку злокачественной опухоли, путем введения непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, во временном интервале перед или после иссечения или удаления первичной опухоли, или перед и после иссечения или удаления первичной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции остаточных злокачественных клеток, пролиферации остаточных злокачественных клеток,ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи остаточной злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из остаточной злокачественной клетки. В девятом аспекте изобретении относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором конъюгат слитого белка представляет собой ВА-05. В десятом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором злокачественная опухоль выбрана из злокачественной опухоли молочной железы, головного мозга, толстого кишечника, кожи, опухоли почки и печени. В одиннадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором злокачественная опухоль представляет собой опухоль головного мозга, выбранную из группы,включающей глиальные опухоли, нейрональные опухоли, опухоли шишковидной железы, менингеальные опухоли, опухоли оболочки нервов, лимфомы, недифференцированные опухоли, и метастазирующие опухоли, расположенные в головном мозге, происходящие от опухолей легких, молочной железы, меланомы, почки и желудочно-кишечного тракта. В двенадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором злокачественная опухоль представляет собой опухоль головного мозга, выбранную из группы,включающей анапластическую астроцитому, мультиформную глиобластому, волосовидную астроцитому, олигодендроглиому, эпендимому, миксопапиллярную эпендимому, субэпендимому, папиллому хориоидного сплетения, нейробластому, ганглионейробластому, ганглионейрому и медуллобластому, пинеобластому и пинеоцитому, менингиому, менингеальную гемангиоперицитому, менингеальную саркому, шванному (нейролеммому) и нейрофиброму, ходжкинскую лимфому, неходжкинскую лимфому,ходжкинскую лимфому первичного и вторичного подтипов, неходжкинскую лимфому первичного и вторичного подтипов, краниофарингиому, эпидермоидные цисты, дермоидные цисты и коллоидные цисты. В тринадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором терапевтически эффективное количество составляет примерно от 0,001 до 50 мкг на см 3 ткани. В четырнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором терапевтически эффективное количество составляет примерно от 0,0001 мкг слитого белка на кубический сантиметр (см 3) ткани до 100 мкг на кубический сантиметр ткани. В пятнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором терапевтически эффективное количество составляет примерно от 1 мкг на миллилитр до 10 мкг на мл и до 50 мкг на мл. В шестнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором введение осуществляется путем инъекции, местного нанесения или имплантации. В семнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором введение выбрано из группы, включающей внутрисуставное, внутриглазное, интраназальное, интраневральное, внутрикожное, внутрикостное, подъязычное, пероральное, местное, внутрипузырное, интра-6 008824 текальное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутричерепное, внутримышечное, подкожное введение,ингаляцию, распыление и ингаляцию непосредственно в опухоль, применение непосредственно в участок заболевания, применение непосредственно на края, оставшиеся после резекции или внутрь них, энтеральное, энтеральное введение при гастроскопической процедуре и ECRP. В восемнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором полипептидный радикал транспорта через клеточную мембрану включает в себя пептид, содержащий примерно от 5 до 50 аминокислот. В девятнадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором единица экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, включает в себя аминокислотную последовательность, определяемой как последовательность слитого белка ВА-07. В двадцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором функциональный аналог содержит белок, отличающийся активностью в интервале от 50 до 500% по сравнению с активностью экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum дикого типа. В двадцать первом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель. В двадцать втором аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, выбранный из группы, включающей сополимер этилена и винилацетата, ПВА, частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, сополимер этилена и винилацетата и винилового спирта, перекрестносвязанный сополимер этилена и винилацетата, перекрестно-связанный частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, перекрестно-связанный сополимер этилена и винилацетата и винилового спирта, поли-D,L-молочную кислоту, поли-L-молочную кислоту, полигликолевую кислоту, ПГА, сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, поликапролактон, поливалеролактон, поли(ангидриды), сополимеры поликапролактона и полиэтиленгликоля, сополимеры полимолочной кислоты и полиэтиленгликоля, полиэтиленгликоль; и их сочетания и смеси. В двадцать втором аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, включающий водный желатин, водный белок, полимерный носитель, перекрестно-связывающий агент, или их сочетания. В двадцать четвертом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов,в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, включающий матрикс. В двадцать пятом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, включающий воду, фармацевтически приемлемую буферную соль, фармацевтически приемлемый буферный раствор,фармацевтически приемлемый антиоксидант, аскорбиновую кислоту, один или несколько фармацевтически приемлемых полипептидов с низкой молекулярной массой, пептид, содержащий примерно от 2 до 10 аминокислотных остатков, один или несколько фармацевтически приемлемых белков, одну или несколько фармацевтически приемлемых аминокислот, незаменимую для человека аминокислоту, один или несколько фармацевтически приемлемых углеводов, один или несколько материалов, производных от фармацевтически приемлемого углевода, невосстанавливающий сахар, глюкозу, сахарозу, сорбит, трегалозу,маннит, мальтодекстрин, декстрины, циклодекстрин, фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, EDTA, DTPA, хелатирующий агент для двухвалентного иона металла, хелатирующий агент для трехвалентного иона металла, глутатион, фармацевтически приемлемый неспецифический сывороточный альбумин, и их сочетания. В двадцать шестом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция является стерильной. В двадцать седьмом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция может быть стерилизована. В двадцать восьмом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция стерилизована. В двадцать девятом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция находится в пробирке в количестве одной лекарственной дозы или в интегральном множестве лекарственных доз. В тридцатом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция является сухой. В тридцать первом аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит дегидратированный матрикс. В тридцать втором аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель. В тридцать третьем аспекте изобретение относится к еще одному аспекту предыдущих аспектов, в котором фармацевтическая композиция содержит слитый белок в лиофилизированном матриксе.-7 008824 Антагонизм Rho и апоптоза При злокачественных опухолях нарушена регуляция механизмов контроля клеточной пролиферации. Повышение апоптоза в клетках мышиной Т-клеточной лимфомы EL4 происходит после активацииRho рекомбинантным экзоферментом C3. В клетках NIH3t3 обработка ингибитором Rho-киназы Y-27632 значительно ингибирует независимый от прикрепления рост. В одном из вариантов осуществления инактивация Rho может предотвращать пролиферацию опухолевых клеток, и настоящее изобретение относится к снижению или прекращению клеточной пролиферации или индукции апоптоза проникающим в клетку конъюгатом слитого белка, содержащим полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например,слитым белком, таким как ВА-07. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к снижению или прекращению клеточной пролиферации или индукции апоптоза эффективным количеством фармацевтической композиции, предусматривающему проникновение в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например, слитого белка, такого как ВА-07. Антагонизм Rho и миграции клеток Метастазирующие клетки в высокой степени склонны к миграции. Инактивация Rho может предотвращать миграцию клеток в некоторых типах клеток. Трансфераза C3 и ингибитор Rho-киназы Y-27632 блокируют клеточную инвазию клеток рака толстой кишки человека НТ 29. В v-Crk-индуцируемой клеточной линии фибробластов крысы 3Y1 C3 и Y-27632 ингибировали v-Crk, что приводило к снижению подвижности клеток. Повышенный уровень апоптоза в клетках RhoB -/-, в RhoB +/- или в RhoB -/- клетках MEF, обработанных доксорубицином, облученных или обработанных таксолом, является результатом нехватки белка RhoB. В другом варианте осуществления антагонизм Rho может снижать миграцию и метастазирование клеток, и настоящее изобретение относится к ингибированию миграции клеток проникающим в клетку конъюгатом слитого белка, содержащим полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональным аналогом, например, слитым белком, таким как ВА-07. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к ингибированию миграции клеток эффективным количеством фармацевтической композиции, предусматривающему проникновение в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например,слитого белка, такого как ВА-05. Антагонизм Rho и матриксных металлопротеиназ (ММР) Инвазивные опухолевые клетки способны деградировать окружающий их внеклеточный матрикс,секретируя протеазы, которые разрушают внеклеточный матрикс. Одним из важнейших классов протеаз,которые секретируются опухолевыми клетками, являются матриксные металлопротеиназы (ММР). Эти ферменты делают доступным путь в матриксе, через который происходит инвазия и распространение опухолевых клеток. Опухолевые клетки могут продуцировать различные типы ММР, и ММР часто синтезируются в виде проферментов, которые расщепляются и высвобождаются после активации. ММР-1 расщепляет коллагеновый матрикс. ММР-2 может играть важную роль при инвазии клеток рака легких. ММР-9 также вовлечена в инвазию опухолевых клеток. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к ингибированию экспрессии ММР, процессинга ММР или секреции ММР в опухолевой клетке, причем такое ингибирование осуществляется путем проникновения в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например, слитого белка,такого как ВА-07. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к ингибированию экспрессии ММР, процессинга ММР или секреции ММР эффективным количеством фармацевтической композиции,предусматривающим проникновение в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например, слитого белка, такого как ВА-05. ВА-05 и ВА-07 в качестве антагонистов Rho ВА-05 и ВА-07 являются формами экзофермента C3, полученными методами генной инженерии. Экзофермент C3 представляет собой происходящий из бактериофага секретируемый белок, обнаруженный в некоторых штаммах Clostridium botulinum, который переносит группу ADP-рибозы на аспарагиновый остаток малых регуляторных ГТФаз RhoA, RhoB и RhoC. C3 инактивирует Rho, так как ADPрибозилирование препятствует активации Rho. Новые модификации, которыми отличаются от ВА-05 и ВА-07, включают в себя С-концевой транспортный пептид, который обеспечивает эффективный вход в цитоплазму, что приводит к образованию более мощного антагониста Rho. ВА-05 и ВА-07 отличаются молчащими мутациями в неферментативной области. ВА-07 обеспечивает экспрессию в векторе коммерческого масштаба для очистки белка, который может использоваться в качестве терапевтического лекарственного средства. В одном из аспектов изобретения слитый белок, такой как ВА-07, может рассматри-8 008824 ваться как проникающий в клетку агент, разрушающий белок-белковые взаимодействия, необходимые для передачи сигнала. Настоящее изобретение относится к вариантам ВА-05 и ВА-07, таким как проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану,аминокислотная последовательность которого может изменяться, или укорачиваться, или удлиняться,или уменьшаться так, чтобы она содержала вариант ВА-05, и единицу экзотрансферазы C3 Clostridiumbotulinum, аминокислотная последовательность которого может изменяться, или укорачиваться, или удлиняться, или уменьшаться с образованием варианта, или его функциональный аналог, в качестве против опухолевой композиции и композиции, препятствующей метастазированию, а также к способам и устройствам, в которых используют такие композиции для лечения злокачественной опухоли и других злокачественных заболеваний. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композициям и способам, предназначенным для изменения последовательности ДНК ВА-07, экспрессируемой в плазмиде для усиления способности очищать большие количества ВА-07 для композиции в фармацевтически приемлемом носителе,безопасном для терапевтического применения. ВА-05 и ВА-07 представляют собой слитые белки по изобретению Изобретение относится к вариантам ВА-05, которые сохраняют богатую пролином транспортную последовательность и часть единицы трансферазы C3, достаточную для сохранения ферментативной активности для ADP-рибозилирования Rho. Настоящее изобретение относится к конъюгату или слитому белку, содержащему терапевтически активный агент, где активный агент может доставляться через клеточную мембрану, причем конъюгат и слитый белок содержит транспортный(-е) субдомен(-ы) или радикал(-ы) в дополнение к радикалу(-ам) активного агента. Более конкретно, настоящее изобретение относится к терапевтически активному агенту в виде конъюгата или слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum в качестве терапевтически активного агента или его функциональный аналог, где терапевтически активный агент может ингибировать миграцию опухолевых клеток, способствовать апоптозу опухолевых клеток, ингибировать ангиогенез и ингибировать продукцию металлопротеиназ, связанную с опухолевым ростом. Преимуществом композиций и способов по настоящему изобретению является существенное улучшение по сравнению с предыдущими лекарственными средствами, сконструированными для предотвращения распространения опухоли или ее метастазирования, поскольку единственное соединение по изобретению может выполнять функцию комбинированной терапии и, таким образом, предотвращать несколько различных аспектов опухолевого роста и распространения. Преимуществом композиции по настоящему изобретению, например, композиции, содержащей ВА-07, является способность предотвращать, или задерживать, или ингибировать миграцию опухолевых клеток, пролиферацию опухолевых клеток, ангиогенез в участке опухоли и секрецию активных металлопротеиназ. Преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что фармацевтически активные компоненты могут проникать в раковую клетку, не используя механизм транспорта через мембрану, основанный на рецепторах. Преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что фармацевтически активные компоненты могут инактивировать ГТФазы, которые являются членами семейства Rho. Преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что фармацевтически активные соединения являются антагонистами Rho. Изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции метастазирующей опухолевой клетки при злокачественной опухоли млекопитающего, предусматривающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка,содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазыC3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог. Изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования бесконтрольной пролиферации и распространения или миграции в пределах края резекции ткани хозяина, прилегающей к участку иссечения злокачественной опухоли у млекопитающего, метастазирующей опухолевой клетки, оставшейся в крае резекции, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridiumbotulinum, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления опухоли, или перед и после иссечения или удаления опухоли. Изобретение относится к способу предотвращения роста опухоли из злокачественной клетки в ткани хозяина у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, где слитый белок одновременно предотвращает-9 008824 или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции злокачественных клеток, пролиферации злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из злокачественной клетки. Изобретение относится к способу предотвращения роста внутри края резекции ткани хозяина вблизи участка иссечения или удаления первичной злокачественной опухоли у млекопитающего, вторичной опухоли, содержащей остаточную клетку злокачественной опухоли, причем данный способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, причем указанное введение проводится непосредственно в край резекции или ниже поверхности края резекции или в ткань, приближенную к краю резекции, которая остается у млекопитающего, и указанное введение осуществляется во временном интервале перед или после иссечения или удаления первичной опухоли, или перед и после иссечения или удаления первичной опухоли, где слитый белок одновременно предотвращает или ингибирует по меньшей мере два события, выбранные из миграции остаточных злокачественных клеток, пролиферации остаточных злокачественных клеток, ангиогенеза, или образования тубулярной структуры, или роста капиллярной сети вблизи остаточной злокачественной клетки, и секреции активной металлопротеиназы из остаточной злокачественной клетки. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования метастазов системной злокачественной опухоли в ЦНС (центральную нервную систему), предусматривающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например, слитого белка, такого как ВА-07. В одном из аспектов терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции, содержит проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, например, слитого белка, такого как ВА-07, может проявлять антиангиогенную активность и использоваться при лечении злокачественной опухоли. По настоящему изобретению область активного средства слитого белка по изобретению содержит область ADP-рибозилтрансферазы C3, или ее функциональный эквивалент. По настоящему изобретению предпочтительная ADP-рибозилтрансфераза C3 может быть выбрана из группы, включающей ADPрибозилтрансферазу, происходящую из Clostridium botulinum, и рекомбинантную ADPрибозилтрансферазу. Альтернативно, C3 может происходить из других источников, таких как С. limoseum или Staphlococcus aureus. Очищенные из этих бактерий C3, обладают ферментативной активностью, как C3 из С.botulinum, которая эффективна для ADP-рибозилирования Rho и вызывает инактивацию Rho. В одном из аспектов настоящего изобретения полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану может включать в себя богатый пролином транспортный домен. Примеры богатого пролином транспортного домена или радикала могут быть найдены в заявке на выдачу патента США 10/118079,полное описание которой включено здесь в качестве ссылки в полном объеме. Используемый здесь термин богатая пролином область относится к любой линейной последовательности из 10 аминокислот,связанных вместе пептидными амидными связями в молекуле, содержащей пептид или белок, где по меньшей мере 3 из 10 аминокислот в линейной последовательности представляют собой остатки пролина, где каждый пролин ковалентно связан пептидной амидной связью с участием атома азота и другой пептидной амидной связью с участием его карбоксильной (карбонильной) группы. Богатая пролином область из любых 10 аминокислот в пептиде может содержать 2 или большее число пролиновых остатков и 9 или меньшее число непролиновых аминокислот. Например, в одном из аспектов богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 2 пролиновых остатка и 8 непролиновых аминокислотных остатков, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот. В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 3 пролиновых остатка и 7 непролиновых аминокислотных остатков, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот. В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 4 пролиновых остатка и 6 непролиновых аминокислотных остатков, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот. В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 5 пролиновых остатков и 5 непролиновых аминокислотных остатков, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот.- 10008824 В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 6 пролиновых остатков и 4 непролиновых аминокислотных остатков, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот. В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 7 пролиновых остатков и 3 непролиновых аминокислотных остатка, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот. В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 8 пролиновых остатков и 2 непролиновых аминокислотных остатка, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот. В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 9 пролиновых остатков и 1 непролиновый аминокислотный остаток, представленных в любом сочетании на протяжении этих 10 аминокислот. В другом аспекте богатая пролином область, содержащая последовательность 10 аминокислот, в пептиде, содержащем 10 и более аминокислот, может содержать 10 пролиновых остатков. В другом аспекте богатая пролином область относится к области аминокислотной последовательности, содержащей больше пролинов, чем то количество, которое в основном наблюдается во встречающихся в природе белках (например, белках, кодируемых геномом человека). Богатая пролином область пептида в композиции по настоящему изобретению может функционировать, усиливая скорость транспорта слитого белка по изобретению через клеточную мембрану. Не богатая пролином область пептида или белка может включать в себя последовательность 10 аминокислот, ковалентно связанных пептидными связями, причем такая область содержит ноль или один пролиновый остаток. Пептид, усиливающий транспорт через клеточную мембрану, в композиции по изобретению может содержать одну или несколько богатых пролином областей, каждая из которых может иметь одинаковую или различные последовательности аминокислот, и каждая из которых ковалентно связана пептидной связью или пептидными связями с одной или несколькими не богатыми пролином аминокислотными последовательностями, которые могут быть одинаковыми или различными, причем не богатая пролином аминокислотная последовательность включает в себя более 10 аминокислот. В другом аспекте изобретения полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану, подходящий для применения в композициях и способах, включающий в себя слитый белок по изобретению,может быть получен, например, способами, модифицированными и адаптированными для применения по изобретению, как описано в Rojas (1998) 16: 370-375 в отношении последовательности транслокации через мембрану; в Vives (1997) 272: 16010-16017 в отношении опосредованной Tat доставки белка; в(1996) 271: 18188-18193 в отношении Antennapedia; в патентном документе Канады 2301157 в отношении конъюгатов, содержащих гомеодомен Antennapedia; и в патентах США 5652122, 5670617, 5674980,5747641 и 5804604 в отношении конъюгатов, содержащих аминокислоты белка Tat ВИЧ (здесь белок Tat ВИЧ иногда указывается как Tat); полное описание каждой из данных ссылок включено здесь в качестве ссылки в полном объеме. Некоторые подходы опосредованного рецептором транспорта использовали с целью улучшения функции ADP-рибозилаз. Эти подходы и способы включают в себя слияние последовательностей С 2 иC3 (Wilde, et al. (2001) 276: 9537-9542) и применение опосредованного рецептором транспорта рецептора дифтерийного токсина (Aullo, et al.(1993) 12: 921-31). Эти подходы не приводили к существенному усилению мощности активности C3, в отличие от активности, которая была обнаружена у ВА-05. Более того, эти подходы требуют опосредованного рецептором транспорта. Необходимо, чтобы клетки-мишени экспрессировали специфический рецептор, и они должны экспрессировать достаточные количества такого рецептора для существенного улучшения скорости транспорта. В случае дифтерийного токсина не все клетки экспрессируют подходящий рецептор, что ограничивает его возможное применение. В отличие от указанных подходов композиция по изобретению, содержащая полипептидный транспортный радикал,например, такой как ВА-05, способна проникать сквозь плазматическую мембрану клетки по независимому от рецепторов механизму. В одном из аспектов изобретения предпочтительная композиция содержит проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий богатый пролином полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану, включающий в себя богатую пролином аминокислотную последовательность, добавленную к С-концевой области единицы экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функционального аналога, в конъюгате слитого белка. Особенно предпочтительная композиция представляет собой слитый белок, обозначенный ВА-05. Композиции слитого белка, содержащие богатую пролином аминокислотную последовательность, добавленную к N-концевой области единицы экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функционального аналога, обозначены здесь как аналоги ВА-05. В другом аспекте изобретения предпочтительная композиция содержит проникающий в клетку конъюгат слитого белка, содержащий богатый пролином полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану, включающий в себя богатую пролином аминокислотную последовательность, добав- 11008824 ленную к N-концевой области единицы экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функционального аналога, в конъюгате слитого белка. Композиции слитого белка, содержащие богатую пролином аминокислотную последовательность, добавленную к N-концевой области единицы экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функционального аналога, обозначены здесь как варианты ВА-05. Аналоги ВА-05 и варианты ВА-07 по настоящему изобретению содержат полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог. Функциональные аналоги единицы экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum могут содержать полипептиды, такие как биологически активные фрагменты и аналоги ВА-05 с измененной аминокислотной последовательностью, где биологическая активность таких фрагментов и аналогов ВА 05 с измененной аминокислотной последовательностью осуществляется по механизму действия, по существу, сходного с таковым ВА-05. Такие фрагменты включают в себя или охватывают аминокислотные последовательности, имеющие укорочения (или удаления) одной или нескольких аминокислот, относящихся к аминокислотной последовательности ВА-05, где укорочение может происходить на N-конце, на С-конце или внутри белковой последовательности. Аналоги и варианты ВА-05 по изобретению могут включать в себя вставку или замену одной или нескольких аминокислот. Композиции по изобретению включают в себя фрагменты, аналоги и варианты,которые могут использоваться по изобретению и обладают биологическими свойствами ВА-05, которые способны инактивировать ГТФазы Rho и предпочтительно способны инактивировать более одной ГТФазы Rho. В другом аспекте композиции и способы по изобретению включают в себя химерные полипептиды,содержащие аминокислотную последовательность ВА-05 или укороченную последовательность, слитые и содержащие гетерологичные аминокислотные последовательности. Такие гетерологичные последовательности включают в себя те, которые при образовании химеры с ВА-05 сохраняют одно или несколько биологических или иммунологических свойств ВА-05, более предпочтительно свойство способности к инактивации ГТФазы Rho и, даже более предпочтительно, инактивации более одной ГТФазы Rho. В другом варианте осуществления изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной или трансфицированной нуклеиновыми кислотами, кодирующими белок ВА-05 или химерный белок ВА 07. В одном из аспектов может использоваться любая клетка-хозяин, которая продуцирует белок, содержащий полипептид, который проявляет по меньшей мере одно из биологических свойств ВА-05, наиболее предпочтительно, способность к инактивации ГТФазы Rho и, еще более предпочтительно, способность к инактивации более чем одной ГТФазы Rho. Характерные примеры типов клеток-хозяев включают в себя клетки бактерий, дрожжей, растений, насекомых и млекопитающих. Кроме того, белок ВА-05 или химерный белок ВА-05 может продуцироваться в трансгенных животных. Трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева и трансгенные животные могут быть получены с использованием материалов и способов, которые хорошо известны и доступны специалисту в области молекулярной и клеточной биологии. Клетка-хозяин может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит полноразмерный ген, кодирующий белок ВА-05, и также может содержать лидерную последовательность и С-концевую последовательность мембранного якоря. Альтернативно, клетка-хозяин может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая не содержит одну лидерную последовательность, или которая не содержит обе лидерные последовательности, или которая не содержит Сконцевую последовательность мембранного якоря, или которая не содержит комбинацию данных последовательностей. Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептидный фрагмент, полипептидный вариант или полипептидный аналог, каждый из которых способен сохранять биологическую активность ВА-05, также могут присутствовать в таких экспрессирующих системах хозяина. Антагонист Rho, представляющий собой рекомбинантный белок, может быть получен технологией рекомбинантных белков, известными в данной области. Белок по настоящему изобретению может быть получен из экстракта бактериальной клетки, или используя рекомбинантные способы. ВА-05 и родственные слитые белки по изобретению могут быть получены путем трансформации (например, путем трансфекции, трансдукции, инфекции) клетки-хозяина всем кодирующим ВА-05 фрагментом ДНК или его частью в подходящем экспрессирующем носителе или векторе. Подходящие экспрессирующие носители включают в себя: плазмиды, вирусные частицы и фаг. Для клеток насекомых подходят бакуловирусные экспрессирующие векторы. Целый экспрессирующий носитель или вектор, или его часть может интегрироваться в геном клетки-хозяина способами, известными в данной области. В одном из аспектов,предпочтительно, использовать индуцируемый экспрессирующий вектор. Специалистам в области молекулярной биологии понятно, что любая из разнообразных экспрессирующих систем может использоваться для получения рекомбинантного белка. Конкретная используемая клетка-хозяин обычно не является важной для изобретения. Например, слитый белок ВА-05 и слитые белки, включающие в себя функциональные аналоги и варианты и фрагмент ВА-05 по изобретению, могут продуцироваться в прокариотическом хозяине (например, Е. coli или В. subtilis) или в эукариотическом хозяине (например, Saccharomyces или Pichia; в клетках млекопитающих, например, в клетках, обо- 12008824 значенных в данной области как клетки COS, NIH 3T3, СНО, ВНК, 293, или HeLa; или в клетках насекомых). Для определения относительной и эффективной активности антагониста Rho композиций по изобретению может использоваться система биологического анализа культуры ткани. ВА-05 может использоваться в интервале концентрации примерно от 0,01 до 10 мкг/мл и он не токсичен для клеток. ВА-05 стабилен при 37 С по меньшей мере в течение 24 ч. Стабильность ВА-05 тестировали в культуре ткани в следующем эксперименте. ВА-05 разводили в среде культуры ткани, оставляли в инкубаторе при 37 С на 24 ч, затем добавляли к описанной здесь системе биоанализа, с использованием клеток ганглия сетчатки в качестве тестируемого клеточного типа. Данные клетки способны вытягивать нейриты на ингибиторных субстратах при обработке C3, и хранении в течение 24 ч при 37 С. Достигали минимальной стабильности, равной 24 ч. В другом способе, подтверждающем, что соединение представляет собой антагонист Rho, можно использовать радиоактивный анализ для выявления ферментативной активности. В другом способе выявления активности можно использовать флуоресцентный анализ для выявления ферментативной активности. Например, ВА-05 обладает по меньшей мере двумя видами присущей ему ферментативной активности, включая активности гликогидролазы и ADP-рибозилтрансферазы. Эти виды ферментативной активности могут действовать последовательно, проводя моно-ADPрибозилирование и инактивацию GTP-связывающего белка RhoA путем захвата ADP-рибозилированногоRho в комплекс с ингибитором диссоциации гуаниннуклеотида 1 (GDI-1). На первой стадии этой реакции активность гликогидролазы гидролизует N-гликозидную связь между никотинамидом и адениндинуклотидфосфатрибозой (ADP-рибозой) в молекуле никотинамидадениндинуклеотида (NAD+). Вторая стадия, катализируемая ADP-рибозилтрансферазой, приводит к образованию ADP-рибозо-RhoA. Анализы ферментов могут измерять гликогидролазную активность слитого белка по изобретению, такого как ВА-05 и ВА-07, путем мониторинга образования ADP-рибозы. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая может использоваться для подавления злокачественной трансформации и метастазирования, причем фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый растворитель или носитель и терапевтически эффективное количество композиции по изобретению, предпочтительно слитый белок по изобретению. В одном из вариантов осуществления композиция по изобретению может содержать активный компонент, выбранный из группы, включающей описанную здесь конструкцию по доставке лекарственных средств, описанного здесь конъюгата с лекарственным средством, и описанного здесь слитого белка (например, включая его фармацевтически приемлемые химические эквиваленты). Препарат ВА-05 и другие композиции по изобретению Композиции и способы по изобретению могут включать в себя фармацевтически эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей проникающий в клетку конъюгат слитого белка,содержащий полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазыC3 Clostridium botulinum или его функциональный аналог. В одном из аспектов в препарате по изобретению могут использоваться разнообразные полимерные носители. Характерные примеры полимерных носителей включают в себя сополимер этилена и винилацетата (ПВА) и частично гидролизованный сополимер этилена и винилацетата, такой как сополимер этилена с винилацетатом и виниловым спиртом,любой из которых может необязательно перекрестно связан до 40% перекрестного связывания; полиD,L-молочную кислоту, в том числе ее олигомеры с низкой молекулярной массой и полимеры с высокой молекулярной массой; поли-L-молочную кислоту, в том числе ее олигомеры с низкой молекулярной массой и полимеры с высокой молекулярной массой; полигликолевую кислоту (PGA); сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты; поликапролактон; поливалеролактон; поли(ангидриды), сополимеры поликапролактона с полиэтиленгликолем; сополимеры полимолочной кислоты с полиэтиленгликолем,полиэтиленгликоль; и их комбинации и смеси. Сополимеры могут включать в себя примерно от 1 до 99% по массе мономерной единицы. Смеси первого полимера и второго полимера могут включать в себя примерно от 1 до 99% по массе от первого полимера и примерно от 99 до 1% от второго полимера. Применение ВА-05 для прекращения распространения опухоли Композиции по настоящему изобретению, такие как противоопухолевые композиции и композиции, препятствующие метастазированию, могут быть получены в различных формах. Например, в одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество проникающего в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, может содержать микросферу, где слитый белок смешан или введен в матрикс, содержащий фармацевтически приемлемый полимерный носитель, необязательно, в присутствии воды(примерно от 0,1 до 15% в одном из вариантов осуществления; альтернативно, микросферу суспендируют в водной среде в другом варианте осуществления), фармацевтически приемлемую буферную соль,фармацевтически приемлемый поверхностный активный агент, фармацевтически приемлемый углевод,фармацевтически приемлемое смягчающее средство и тому подобное.- 13008824 В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество проникающего в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, может включать пасту, крем, мазь, суппозиторий, суспензию в фармацевтически приемлемом масле и тому подобное. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество проникающего в клетку конъюгата слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, может включать пленку, например, в которой слитый белок смешивают с фармацевтически приемлемым носителем, таким как водный желатин или полимерный носитель, или их комбинацией, необязательно в присутствии молекулы перекрестно-связывающего агента, который может перекрестно связывать носитель, затем смесь помещают на пленку или ламинат, необязательно, в присутствии основы пленки, или подложки или матрикса, и сушат или обезвоживают, необязательно, нагреванием или путем лиофилизации. Пленки могут быть получены в единичных дозированных формах или в большом количестве, и могут быть разделены и нарезаны на единичные дозированные формы. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество проникающего в клетку конъюгата-слитого белка, содержащего полипептидный радикал переноса через клеточную мембрану и единицу экзотрансферазы C3 Clostridium botulinum, или его функциональный аналог, может включать аэрозоль или распыляемую или аэрозольную композицию,например, суспензию или раствор слитого белка в фармацевтически приемлемой жидкости, например,водный раствор буфера, необязательно, с модификатором изотоничности; в фармацевтически приемлемой жидкости, такой как сверхкритическая жидкость или сжиженный газ, такой как диоксид углерода или пропан, или низкомолекулярный фторуглерод или фторуглеводород, или хлорфторуглерод и тому подобное, каждый из которых представляет собой газ при 37 С и давлении окружающей среды, причем данная композиция может использоваться, например, при ингаляции или в качестве аэрозоля, такого как спрей для применения на поверхности ткани. В другом аспекте могут быть получены композиции по настоящему изобретению, содержащие слитый белок, такой как ВА-05, и дополнительный фактор или противоопухолевое средство, или композиции, препятствующие метастазированию. В другом аспекте могут быть получены композиции по настоящему изобретению, содержащие различные дополнительные соединения для предоставления препаратов слитого белка с определенными физиологическими свойствами (например, эластичность, связанная с введением фармацевтически приемлемого пластификатора, конкретная температура плавления, такая как примерно 30 С, за счет применения полиэтиленгликоля, или конкретная скорость высвобождения, которая может быть связана со степенью перекрестного связывания или со скоростью гидратации матрикса или солюбилизации матрикса,или с предпочтительной солюбилизацией компонента матрикса, который может покидать поры в матриксе, за счет чего жидкий носитель, например вода, может способствовать транспорту слитого белка из матрикса и в требуемый участок организма млекопитающего или на него. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции можно комбинировать для достижения требуемого эффекта (например, две или несколько композиций в микросферах по изобретению можно комбинировать для достижения модифицированной суммарной скорости высвобождения слитого белка по изобретению, например, быстрого или медленного и продленного высвобождения одного или нескольких факторов против опухоли и метастазирования). Композиции по настоящему изобретению, такие как те, что содержат ВА-05, могут вводиться отдельно или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, и/или фармацевтически и физиологически совместимыми наполнителями, растворителями, средствами модификации изотоничности, буферами и тому подобным. Предпочтительно, такие носители приемлемо нетоксичны для реципиента, при использовании в комбинации с дозировками и в терапевтически эффективных концентрациях используемого слитого белка. В одном из аспектов препарат фармацевтической композиции по изобретению содержит сочетание терапевтически эффективного количества слитого белка по изобретению с одним или несколькими компонентами носителя, такими как вода; фармацевтически приемлемая буферная соль или буферный раствор, фармацевтически приемлемый антиоксидант, такой как аскорбиновая кислота, один или несколько фармацевтически приемлемых полипептидов с низкой молекулярной массой (например, пептид, содержащий примерно от 2 до 10 аминокислотных остатков), один или несколько фармацевтически приемлемых белков, одна или несколько фармацевтически приемлемых аминокислот, таких как незаменимая для человека аминокислота, один или несколько фармацевтически приемлемых углеводов или материалов,производных от фармацевтически приемлемого углевода, таких как глюкоза, сахароза, сорбит, трегалоза,маннит, мальтодекстрин, декстрины, циклодекстрин и их комбинации, причем в одном из аспектов такой углевод, предпочтительно включающий в себя невосстанавливающий углевод, такой как невосстанавливающий сахар во избежание реакции Maillard (имеющей место, когда компоненты, такие как восстанавливающий сахар и аминокислота, или пептид, или белок взаимодействуют), является предпочтительным,- 14008824 или, в другом аспекте, такой углевод предпочтительно включает в себя восстановление углевода, такого как восстанавливающий сахар, когда требуется реакция Maillard; фармацевтически приемлемый хелатирующий агент, такой как EDTA или DTPA, являющийся хелатирующим агентом для иона металла, такого как двухвалентный ион металла (например, Са+2, Fe+2, и тому подобные) или трехвалентный ион металла (например, Fe+3, Y+3, Ln+3, Eu+3 и другие лантаниды, и тому подобные ионы, которые могут необязательно включать в себя радионуклиды); глутатион; и другие стабилизаторы и наполнители, известные в области получения препаратов из белковых веществ. Предпочтительные носители включают в себя стерильный буферный солевой раствор при рН в интервале примерно от 6 до 8, предпочтительно, примерно при рН 7,4, и стерильную изотоническую композицию, содержащую солевой раствор, смешанный с фармацевтические приемлемым неспецифическим сывороточным альбумином. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть стерильными, подлежащими стерилизации и стерилизованными. Предпочтительный способ стерилизации включает в себя фильтрование через 0,2-микронный фильтр в стерильной среде. Стерильная фильтрованная композиция может помещаться в пузырек, предпочтительно, в стерильный пузырек, в единичное дозированное объемное количество или в интегральное количество множественных единичных доз (например, в количестве 2 единичных доз, 3 единичных доз, 4 единичных доз, и т.д.), предпочтительно в инертной атмосфере, например, в стерильном азоте или аргоне, и пузырьки запечатывают фармацевтически приемлемой пробкой, необязательно, с зажимной крышкой. В другом аспекте фармацевтическую композицию сушат путем удаления воды, например, водную среду можно удалить из каждой пробирки в процессе сушки, например, лиофилизацией или упариванием, чтобы оставался сухой или обезвоженный матрикс, содержащий слитый белок по изобретению, перед закрыванием и запечатыванием пузырька. В другом аспекте носитель может включать в себя стерильный или стерилизуемый гипертонический раствор образующего фармацевтически приемлемый матрикс материала или наполнителя, который совместим со слитым белком, например,такого как фармацевтически приемлемый невосстанавливающий углевод, вместе с соединением или слитым белком по изобретению, причем гипертонический раствор может помещаться в пузырек и высушиваться (например, лиофилизацией) для предоставления матрикса, содержащего слитый белок и образующий матрикс наполнитель, который может запечатываться в пузырьке пробкой. Перед использованием в пузырек может добавляться стерильная вода, например, стерильным шприцом или канюлей, причем вода растворяется в матриксе с получением раствора или суспензии слитого белка. Для получения восстановленного раствора или суспензии, в виде изотонического раствора, подходящего для применения путем инъекции или имплантации, может добавляться достаточное количество воды. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть получены подходящими для введения млекопитающему, например, пациенту, различными путями. Предпочтительные пути введения включают в себя, например, внутрисуставной, внутриглазной, интраназальный, интраневральный, внутрикожный, внутрикостный, подъязычный, пероральный, местный, внутрипузырный, интратекальный, внутривенный, внутрибрюшинный, внутричерепной, внутримышечный, подкожный, ингаляцию, распыление и ингаляцию, применение непосредственно в опухоль, применения непосредственно в участок заболевания, применения непосредственно на края, оставшиеся после резекции или внутрь них. Другие характерные пути введения включают в себя энтеральный, необязательно с гастроскопической процедурой, и колоноскопию, каждый из которых может осуществляться путем амбулаторной процедуры и не требует операционных процедур и длительной госпитализации, но может требовать присутствия медицинского персонала. Предоставленные здесь фармацевтические композиции могут помещаться в контейнеры вместе с упаковочным материалом, в которых предоставляются инструкции по применению таких материалов. В общем, такие инструкции включают в себя описание концентрации активного средства, а также, в некоторых вариантах осуществления, относительных количеств или сущности наполнителей, ингредиентов или растворителей (например, воды, солевого раствора или PBS). Кроме того, может быть необходимым восстановление противоопухолевой композиции и композиции, препятствующей метастазированию, или фармацевтическую композицию с получением фармацевтически приемлемого раствора или суспензии добавлением воды и необязательно также при встряхивании и обработке ультразвуком. Фармацевтические композиции по изобретению могут использоваться в разнообразных хирургических процедурах. Например, в одном из аспектов настоящего изобретения фармацевтическая композиция(например, в виде раствора, суспензии или порошка, подходящего для применения в распыленной форме, или в форме аэрозоля или спрея, или покрытая пленкой) может применяться путем распыления(форма спрея или образующая аэрозоль форма) или путем ламинирования (пленки) на поверхности ткани пациента, нуждающегося в лечении, перед, во время или после хирургического удаления опухоли, такой как первичная опухоль, и необязательно на некоторой площади нормальной ткани непосредственно вблизи от опухоли, до площади ткани, удаление которой оставляет край нормальной ткани вокруг участка иссечения опухоли (край опухоли). В одном из аспектов процедура может предотвращать или, по существу, замедлять или ингибировать метастазирующий рост вторичной в нормальных окружающих тканях после удаления первичной опухоли у пациента. В другом аспекте процедура может предотвращать- 15008824 распространение заболевания (например, злокачественной опухоли) на окружающие ткани. В других аспектах настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению (например, в виде спрея или аэрозоля) может доставляться путем эндоскопической процедуры, в которой композицию распыляют внутри пациента для обеспечения покрытия, содержащего слитый белок по изобретению, на опухоли и/или окружающей ткани, ближайшей к опухоли внутри пациента, причем данная опухоль оценивается и визуализируется эндоскопическими методами. В другом аспекте покрытие фармацевтической композицией ткани вблизи опухоли или вблизи участка иссечения опухоли может ингибировать ангиогенез в области ткани, которая покрыта фармацевтической композицией. В других аспектах настоящего изобретения фармацевтическая композиция по изобретению может быть нанесена на поверхность имплантируемого устройства, такого как хирургическая сетка, проволока,стент, протезное устройство и тому подобное с образованием покрытого устройства, причем покрытие содержит слитый белок по изобретению и необязательно полимерный носитель, и данное покрытое устройство может имплантироваться в ткань или орган пациента как часть хирургического лечения, например, хирургического удаления злокачественной или доброкачественной опухоли, причем фармацевтическая композиция может предотвращать, или ингибировать, или задерживать, или замедлять рост вторичной опухоли вблизи расположения устройства, и в другом аспекте может также предотвращать, или ингибировать, или задерживать, или замедлять рост вторичной опухоли в ткани или органе, удаленном от участка имплантированного устройства. Концентрация слитого белка может составлять примерно от 0,01 до 20% от массы носителя, который образует покрытие устройства, и толщина покрытия может составлять примерно от 20 мкм до 1 мм. Покрытие может осуществляться способами покрытия, известными в области покрытых устройств. Например, покрытие, содержащее фармацевтическую композицию по изобретению может применяться на поверхности устройства посредством спрея или аэрозольного аппликатора, в котором фармацевтическая композиция в виде раствора в жидкости или текучей среде, содержащей растворитель, или в виде суспензии в жидкости или текучей среде, причем данная жидкость или текучая среда может испаряться во время и после применения в качестве спрея или аэрозоля, распыляется на поверхности устройства. Необязательно, композиция для покрытия может содержать реакционноспособные функциональные группы, такие как олефины, или ангидридные группы, или активные сложные эфиры, или акцепторы реакции Михаэля, такие как молекулы с двойной связью между двумя углеродами, конъюгированной с карбонильной группой, причем двойная связь может взаимодействовать с амином белка или пептида,или желатина, такого как белок-носитель, и данные реакционноспособные химические функциональные группы могут химически или фотохимически образовывать перекрестные связи в носителе, которые могут предотвращать солюбилизацию или ограничивать, или модифицировать, или контролировать набухание (как функция концентрации реакционноспособных групп или времени воздействия условий перекрестного связывания, таких как ультрафиолет или гамма-облучение покрытого устройства) покрывающего носителя водянистой жидкостью в ткани, в которую имплантируют устройство. Контроль набухания может использоваться для контроля скорости, с которой слитый белок по изобретению мигрирует с устройства в ткань, ближайшую к устройству, и далее в организм пациента. Различные химические способы перекрестного связывания, известные в данной области, могут использоваться в данном аспекте изобретения, при том, что биологическая активность слитого белка не отменяется или элиминируется. Если органический растворитель, или сверхкритическую жидкость, или сжиженный газ используют в процессе покрытия, то может быть выбран фармацевтически приемлемый носитель, который не растворяется в водной среде, присутствующей в ткани вблизи участка имплантации, немедленно, но обеспечивает проникание слитого белка в водную среду. Могут использоваться другие способы покрытия, такие как покрытие за счет окунания в композицию, окрашивание, покрытие, наносимое поливом, и ламинирование фармацевтической композиции по изобретению. В одном из вариантов осуществления поверхность устройства вначале может покрываться первым слоем покрытия или затравочным слоем, который впоследствии покрывают фармацевтической композицией по изобретению в качестве второго покрывающего слоя. Затравочный слой может быть выбран так,что он прилипает к поверхности металлического или полимерного устройства, и к нему прилипает носитель второго покрывающего слоя. Затравочный слой также может включать в себя химические функциональные группы (например, которые могут присоединяться к полимеру в затравочном слое) и которые могут образовывать перекрестные связи со вторым слоем. Затравочный слой может необязательно содержать относительно мобильные молекулы, включающие в себя, например, две или большее число реакционноспособных функциональных групп, причем данные молекулы могут мигрировать во второй слой и взаимодействовать там с химическими функциональными группами с образованием перекрестных молекулярных мостиков. В другом варианте осуществления фармацевтически приемлемый третий слой может быть нанесен на второй слой, причем третий слой необязательно лишен слитого белка. Третий слой может служить в качестве контроля или модификации скорости высвобождения слитого белка из устройства, например,обладая способностью растворяться или набухать или повышать свою проницаемость для воды или для- 16008824 слитого белка в зависимости от времени воздействия на второй слой, содержащий фармацевтическую композицию по изобретению, водной среды из ткани. В одном из вариантов осуществления изобретения хирургическое сетчатое устройство, содержащее фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, нанесенную на поверхность проволочной или полимерной сетки, может использоваться или имплантироваться пациенту, например во время хирургической процедуры резекции рака брюшной полости пациента (например, после резекции толстой кишки) для предоставления основы для оставшейся структуры ткани. Сетчатое устройство с покрытием может высвобождать терапевтически эффективное количество активного компонента (такого как ВА-07) фармацевтической композиции, достаточное для предотвращения рецидива злокачественной опухоли путем предотвращения роста вторичной опухоли вблизи участка имплантации устройства с покрытием. Слитый белок может мигрировать из устройства со скоростью, достаточной для предоставления интервала терапевтически эффективных концентраций в ткани вблизи устройства. Может использоваться предпочтительный в настоящее время интервал концентраций, составляющий примерно от 0,0001 мкг слитого белка на кубический сантиметр (см 3) ткани до 100 мкг на кубический сантиметр ткани. Более предпочтительно в настоящее время интервал терапевтически эффективных концентраций составляет примерно 0,001 мкг на см 3 до 50 мкг на см 3 ткани. В другом варианте осуществления сетчатое устройство с покрытием может высвобождать терапевтически эффективное количество активного компонента (такого как ВА-07) фармацевтической композиции, достаточное для предотвращения рецидива злокачественной опухоли путем предотвращения роста вторичной опухоли вдали от участка имплантации устройства с покрытием. В других аспектах настоящего изобретения предоставлены способы лечения пациента в участке ткани, оставшейся на краю иссечения первичной опухоли (в участке иссечения опухоли), предусматривающее введение фармацевтической композиции по изобретению в ткань, оставшуюся на краю резекции первичной злокачественной опухоли после иссечения первичной опухоли, так что рецидив второй злокачественной опухоли и образование новых кровеносных сосудов в участке оставшейся ткани на краю первичной опухоли ингибируется. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению, например, фармацевтическая композиция, содержащая ВА-07, вводится непосредственно в оставшуюся ткань в участке иссечения опухоли (например, наносится помазком, кистью, окрашиванием, распылением, путем аэрозоля, инъекцией, смыванием, намыливанием, или другим покрытием краев резекции опухоли фармацевтической композицией. Альтернативно, фармацевтическая композиция по изобретению, например, фармацевтическая композиция, содержащая ВА-07 в виде хирургической пасты, мази, крема, суспензии, геля и тому подобного, может наноситься на поверхность ткани. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая слитый белок, такой как ВА-07, наносится на остаточную ткань в участок иссечения опухоли печени, например, после резекции злокачественной опухоли в печени. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая слитый белок, такой как ВА-07, наносится после нейрохирургической операции (например, связанной с удалением опухоли головного мозга). В одном из аспектов настоящего изобретения фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая слитый белок, такой как ВА-07, может вводиться в ткань, оставшуюся на краю резекции опухоли, относящуюся к различным опухолям, включая, например, опухоли молочной железы, кишечника,головного мозга и печени. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая слитый белок, такой как ВА-05, может вводиться в оставшуюся ткань после удаления первичной неврологической злокачественной опухоли после иссечения первичной опухоли, так что распространение клеток злокачественной опухоли в оставшуюся ткань и образование вторичной опухоли, и образование новых кровеносных сосудов в оставшемся краевом участке первичной опухоли ингибируется. В головном мозге наблюдается высокая функциональная локализация: т.е., каждая конкретная анатомическая область специализирована для выполнения конкретной функции. Расположение злокачественной опухоли в головном мозге пациента (и патология головного мозга) может быть более значимой,чем тип ткани или тип опухоли. Относительно малая опухоль или очаг повреждения в важнейшей области головного мозга может быть намного более разрушительным, чем гораздо более крупный очаг повреждения в относительно менее важной области головного мозга. Очаг на поверхности головного мозга может быть относительно легко удален хирургическим путем, в то время как опухоль сравнимого размера, но локализованную глубоко в головном мозге, труднее удалить хирургическим путем, поскольку доступ к глубокой опухоли может потребовать разрушения лежащей на пути ткани, например, путем разреза многих жизненно важных структур для достижения доступа и удаления глубокой опухоли. Кроме того, опасными для пациента могут быть и доброкачественные опухоли головного мозга. Доброкачественная опухоль может возникнуть в важной области и вызывать значительное нарушение окружающих тканей головного мозга и функции. Хотя лечение доброкачественной опухоли может осуществляться хирургическим путем, уда- 17008824 ление опухоли из глубокой ткани может оказаться невозможным. Оставаясь незамеченной, доброкачественная опухоль может расти, увеличиваться в объеме и вызывать повышенное внутричерепное давление. Если такое состояние остается без лечения, то жизненно важные структуры головного мозга могут сдавливаться и приводить к гибели пациента. Частота возникновения злокачественных опухолей ЦНС (центральной нервной системы) составляет примерно от 8 до 16 случаев на 100000 людей. Прогноз первичной злокачественной опухоли головного мозга неутешителен, со средним временем выживания менее одного года, даже после хирургической резекции. Опухоли головного мозга, особенно глиомы, преимущественно представляют собой местное заболевание, которое может рецидивировать в пределах примерно 2 см от исходного места заболевания после хирургического удаления. Характерные примеры опухолей головного мозга, которые могут подвергаться лечению с использованием описанных здесь композиций и способов, включают в себя глиальные опухоли, такие как анапластическая астроцитома, мультиформная глиобластома, волосовидная астроцитома, олигодендроглиома,эпендимома, миксопапиллярная эпендимома, субэпендимома, папиллома хориоидного сплетения; нейрональные опухоли, такие как нейробластома, ганглионейробластома, ганглионейрома и медуллобластома; опухоли эпифиза, такие как пинеобластома и пинеоцитома; менингеальные опухоли, такие как менингиома, менингеальная гемангиоперицитома, менингеальная саркома; опухоли клеток оболочки нервов, такие как шваннома (нейролеммома) и нейрофиброма; лимфомы, такие как ходжкинская лимфома, неходжкинская лимфома, первичный и вторичный подтип ходжкинской лимфомы, первичный и вторичный подтип неходжкинской лимфомы (включая многочисленные подтипы данных опухолей, первичный и вторичные); недифференцированные опухоли, такие как краниофарингиома, эпидермоидные цисты, дермоидные цисты и коллоидные цисты; и метастазные опухоли, расположенные в головном мозге,которые могут происходить практически из любой опухоли, причем чаще всего происходят из опухолей легких, молочной железы, меланомы, почки и желудочно-кишечного тракта. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению может применяться локально, например, местно или путем местного применения, в единичном дозированном количестве. Такое введение может включать в себя применение фармацевтической композиции в отношении внешней части эпидермиса, местное введение в ткань, подлежащую местному введению через ротовую полость, и местное закапывание в экспонированную ткань глаза, уха и носа, так что не более чем примерно 10%, и предпочтительно не более чем 1% единичной дозы слитого белка по изобретению(такого как ВА-07) приникает в кровяное русло пациента непосредственно. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтические композиции по изобретению могут вводиться системно, например, путем инъекции в кровеносный сосуд или лимфатический сосуд, например путем внутривенной инъекции. Дополнительные пути введения включают в себя внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, ректальный (например, в виде дозированной формы в суппозиториях), вагинальный (например, в виде пессария) и пероральную доставку. Дозированные формы по изобретению могут действовать в качестве депо, включающих в себя слитый белок по изобретению, причем данный слитый белок может мигрировать в ткань вблизи участка депо. Композиции для применения при местном введении включают в себя, например, жидкие препараты или препараты геля, предпочтительно, подходящие для проникновения через кожу, такие как кремы,жидкие мази (т.е., применяемые на кожу путем втирания), лосьоны, масла, мази, пасты, и капли, подходящие для доставки в ткань или органы, такие как глаз, ухо, нос. В одном из вариантов осуществлении изобретения слитый белок может иметь молекулярную массу примерно от 240000 до 300000 Да. В другом варианте осуществления предоставленные здесь композиции могут образовывать пленки с толщиной от 100 мкм до 2 мм, или термически активные композиции, представляющие собой жидкость при одной температуре (например, выше, чем примерно 25 С) и твердое или полутвердое вещество при другой (например, ниже, чем примерно 25 С). В другом аспекте настоящего изобретения предоставлены способы лечения ткани, оставшейся в участке иссечения злокачественной опухоли, предусматривающие введение фармацевтической композиции по изобретению, содержащей слитый белок, такой как ВА-05, в края, оставшиеся после резекции у пациента опухоли, так что местный рецидив злокачественной опухоли и образование новых кровеносных сосудов в данном участке ингибируется. В другом аспекте настоящего изобретения предоставлены способы лечения участка иссечения опухоли, предусматривающие введение фармацевтической композиции по изобретению, содержащей слитый белок, такой как ВА-05, в край резекции опухоли после иссечения, так что местный рецидив злокачественной опухоли и образование новых кровеносных сосудов в данном участке ингибируется. Другой аспект изобретения включает в себя фармацевтическую композицию по изобретению в наборе частей, таком как набор, содержащий контейнер и фармацевтическую композицию по изобретению; набор, содержащий закупоренный пузырек и фармацевтическую композицию по изобретению; набор,содержащий стерильный шприц и фармацевтическую композицию по изобретению; набор, включающий в себя стерильный шприц, содержащий фармацевтическую композицию по изобретению; набор, содер- 18008824 жащий спрей или аэрозольный аппликатор и фармацевтическую композицию по изобретению; набор,содержащий кистевой аппликатор и фармацевтическую композицию по изобретению; набор, содержащий катетер и фармацевтическую композицию по изобретению; набор, содержащий порошковый аппликатор и фармацевтическую композицию по изобретению (причем порошковый аппликатор может использоваться для введения фармацевтической дозированной формы по изобретению в виде порошка путем посыпания сухим (например, лиофилизованным) порошком при местном применении на ткань); набор, содержащий покрытое имплантируемое устройство и фармацевтическую композицию по изобретению, причем введение осуществляется путем имплантации. Предоставляются фармацевтические продукты, содержащие, например, слитый белок, такой как ВА-05, который нарушает передачу сигнала Rho, в контейнере; и устройство, такое как шприц, или инструмент, или кисть, или устройство для нанесения (например, аппликатор спрея или аэрозоля) во втором контейнере, для использования при нанесении слитого белка, такого как ВА-05, на ткань, образующую стенки опухолевой полости после хирургического удаления опухоли, или нанесения на кожу, например после удаления злокачественной меланомы. Фармацевтическая композиция, способ и их применение по настоящему изобретению предназначены для использования на млекопитающем. В некоторых вариантах осуществления термин млекопитающее, как подразумевается, включает в себя людей, тогда как в других вариантах осуществления термин млекопитающее, как подразумевается, означает не относящееся к человеку млекопитающее. Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут понятны после ссылки на ассоциированное подробноеописание и прилагаемые фигуры. Краткое описание фигур На фиг.1 проиллюстрирован эффект композиции по изобретению, содержащей слитый белок ВА 07, на пролиферацию клеток человеческой аденокарциномы эндометрия НЕС 1 В, измеренный включением тимидина с тритием. Носитель (10) представляет собой фосфатно-солевой буфер, и ВА-07 используется в концентрациях 1 мкг/мл (11), 10 мкг/мл (12) и 50 мкг/мл (13). Пролиферация раковых клеток снижается путем, зависимым от дозы. На фиг. 2 проиллюстрирован эффект композиции по изобретению, содержащей слитый белок ВА 07, на пролиферацию клеток человеческой меланомы SK-MEL-1, измеренный введением обработанного тритием тимидина. Носитель представляет собой фосфатно-солевой буфер, и ВА-07 используют в концентрации, равной 1 мкг/мл, 10 мкг/мл и 50 мкг/мл. Пролиферация раковых клеток снижается путем,зависимым от дозы. На фиг. 3 А проиллюстрировано образование трубок эндотелиальными клетками HUVEC, культивируемыми в матриксе Matrigel. Этот анализ представляет собой анализ клеточной культуры для ангиогенеза. Образование может наблюдаться в контроле, который не содержит слитого белка по изобретению, фиг. 3 А (сектор 30). На фиг. 3 В проиллюстрировано снижение образования эндотелиальных клеток HUVEC, культивируемых в матриксе Matrigel. Культуры, обработанные композицией по изобретению, содержащей слитый белок ВА-07, содержат меньше трубок, демонстрирующих ингибированием ангиогенеза, как показано на фиг. 3 В, сектор 31. На фиг. 4 показано ингибирование роста клеток человеческой карциномы почки ТК-10 композицией по изобретению, содержащей слитый белок ВА-07, измеренное в анализе ингибирования роста сульфородамина В (SRB). Слитый белок ВА-07 используется в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл. Во всех используемых концентрациях пролиферация раковых клеток снижается. Снижение пролиферации раковых клеток является зависимым от дозы. В концентрации слитого белка 100 мкг/мл композиция по изобретению индуцировала клеточную гибель раковых клеток. На фиг. 5 показано ингибирование роста клеток немелкоклеточного рака легких HOP-62 композицией по изобретению, содержащей слитый белок ВА-07, измеренное в анализе ингибирования роста сульфородамина В (SRB). Слитый белок ВА-07 используется в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл. Во всех используемых концентрациях пролиферация раковых клеток снижается. Снижение пролиферации раковых клеток является зависимым от дозы. На фиг. 6 показано ингибирование роста клеток рака ЦН CSF-286 композицией по изобретению,содержащей слитый белок ВА-07, измеренное в анализе ингибирования роста сульфородамина В (SRB). Слитый белок ВА-07 используется в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл. Во всех используемых концентрациях пролиферация раковых клеток снижается. Снижение пролиферации раковых клеток является зависимым от дозы. На фиг. 7 показано снижение уровня активированной RhoA после инкубации с 10 микрограммами на миллилитр слитого белка через 1, 2, 4, 6 и 24 ч после введения фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. На фиг. 8 показано ингибирование роста (в виде % роста по сравнению с контролем-носителем) клеток карциномы почки Caki-1 композицией, содержащей слитые белки, например, ВА-07, причем % рост измерен анализом SRB при относительных концентрациях слитого белка, равных 0,1, 1, 10 и 100.- 19008824 Подробное описание Все приведенные здесь ссылки, которые более подробно описывают процедуры, устройства или композиции, имеющие отношение к изобретению включены в качестве ссылки в полном объеме. Способ получения слитых белков по изобретению, таких как ВА-05 ВА-05 представляет собой обозначение, данное белку по изобретению, полученному путем лигирования последовательности кДНК, кодирующей C3, с полученным в результате слияния 19-членным пептидом. Для иллюстрации способа получения слитого белка по изобретению может использоваться пример последовательности Antennapedia, добавленной к С-концу полипептида C3. Стоп-кодон на 3'-конце последовательности ДНК может замещаться участком EcoRI путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров 5'GAA TTC TTT AGG АТТ GAT AGC TGTGCC 3' (SEQ ID NO: 1) и 5' GGT GGC GAC CAT CCT CCA AAA 3' (SEQ ID NO: 2). Продукт ПЦР может субклонироваться в вектор pSTBlue-1 (Novagen, city), затем он клонируется в вектор pGEX-4 Т с использованием участка рестрикции BamН I и Not I. Данный вектор может называться pGEX-4T/C3. Последовательность Antennapedia, которая может использоваться для добавления с 3'-конца C3 в pGEX-4T/C3 может создаваться путем ПЦР из вектора рЕТ-3 а (Bloch-Gallego (1993) 120: 485-492; и Derossi (1994) 269: 10444-10450), субклонирования в вектор pSTBlue-1 с тупыми концами, затем клонирования в pGEX4T/C3, с использованием участков рестрикции EcoR I и Sal I, с образованием pGEX-4T/C3APL. Анализ последовательности ДНК может проводиться на последовательности, продуцирующей наилучший ответ по изобретению. Клон pGEX-4T/C3APL (SEQ ID NO: 3) представляет собой предпочтительную в настоящее время последовательность и предоставляет белок, который является предпочтительно композицией по изобретению. Пример C3-подобного слитого белка обозначен как pGEX-4T/C3APLT (SEQ ID NO: 4). Два ПЦР-праймера конструировали для переноса одной серии рекомбинантных конструкций (ВА 05) в систему рЕТ: верхний праймер 5' ggatctggttccgogtcatatgtctagagtcgacctg 3' (SEQ ID NO: 38) нижний праймер 5' cgcggatccattagttctccttcttccacttc 3' (SEQ ID NO: 39) . Участок BamHI находится с 5'-конца SEQ ID NO: 39 ggatccatta; TGA замещен на TAAT (atta, в SEQID NO: 39). Программа, которая может использоваться для амплификации продукта с использованием полимеразы Pfu включает в себя: 95 С 5' 1 цикл, затем 94 С 2'56 С 2'70 С 2' 10 циклов, затем 94 С 2'70 С 3' 30 циклов и выдерживание при 4 С. Набор QIAEXII (Qiagen) может использоваться для очистки из кусочка агарозного геля, содержащего требуемую полосу ДНК. Вставку и вектор расщепляют BamHI иNdeI, следуя инструкциям производителя, очищают с использованием электрофореза в агарозном геле и набора QIAEXII (Qiagen), и инкубируют вместе в течение ночи с ДНК-лигазой Т 4, следуя инструкциям производителя. Е. coli (DH5-альфа, или, предпочтительно, XLI-Blue) трансформируют смесью лигирования. Клоны могут проверяться индукцией в малом масштабе и SDS-PAGE, и могут подтверждаться иммуноблоттингом неочищенных лизатов с антителом против C3. Плазмидную ДНК очищают, и могут оценивать ее чистоту. Могут проводить секвенирование ДНК (например, технологией LiCor, в которой целую цепь секвенируют по всей длине клона). Первая конструкция, полученная таким образом (рЕТ 3 а-ВА-07, SEQ ID NO: 7), совпадала с теоретической последовательностью ДНК конструкции pGEX/APLT с небольшим изменением с 5'-конца. Вторая конструкция рЕТ 9 а-ВА-07 может быть получена субклонированием вставки их рЕТ 3 а-ВА 07 в вектор рЕТ 9 а путем расщепления конструкции рЕТ 3 а BamHI и NdeI (New England BioLabs, Beverly,Миннесота) по инструкциям производителя. Плазмидная ДНК рЕТ 9 а может расщепляться теми же самыми ферментами. ДНК вставки и ДНК вектора могут очищаться электрофорезом в агарозном геле. Вставка может лигироваться в новый вектор с использованием ДНК-лигазы Т 4 (New England BioLabs,Beverly, Миннесота). Лигированной ДНК могут трансформироваться клетки DH5-альфа, и ДНК может быть получена с использованием мини- и макси-наборов QIAGEN. Клоны могут характеризоваться расщеплением рестриктазами, и секвенированием ДНК вставки во всех направлениях (например, BioSТ.Lachine, Квебек). ДНК конструкции могут трансформироваться клетки BL21 (DE3) и клетки BL21(DE3)/pLysS. Экспрессия белка рЕТ 9 а-ВА-07 (SEQ ID NO: 57) была выше в BL21 (DE3) по сравнению с BL21(DE3)/pLysS. Белки по настоящему изобретению могут быть получены из экстрактов бактериальной клетки или путем использования рекомбинантных способов трансформации, трансфекции или инфекции клеткихозяина всем фрагментом ДНК, кодирующим слитый белок, или его частью, например, фрагментом ДНК, кодирующим ВА-05, транспортной последовательностью, происходящей из Antennapedia, в подходящем экспрессирующем носителе. Специалисту в области молекулярной биологии понятно, что различные экспрессирующие системы могут использоваться для предоставления рекомбинантного белка по изобретению. Выбор конкретной- 20008824 клетки-хозяина обычно не важен для изобретения, и возможны варианты между различными клеткамихозяевами. Слитый белок может очищаться с использованием способов очистки белка, известных в данной области, например, способов аффинной очистки или колоночной хроматографии с использованием смол,которые отделяют молекулы на основании свойств, таких как заряд, размер и гидрофобность. Подходящие способы аффинной очистки включают в себя те, которые используют антитело (например, GST),специфичное для экспрессируемого слитого белка. Помеченные гистидином белки могут селективно элюироваться имидазол-содержащими буферами. Альтернативно, рекомбинантный белок может сливаться с иммуноглобулиновым Fc-доменом. Такой слитый белок может легко очищаться с использованием колонки с белком А. Любые из данных способов могут автоматизироваться и оптимизироваться для предоставления высокой воспроизводимости и производительности с использованием коммерчески доступного оборудования для жидкостной хроматографии, специализированного для очистки белка. Представляется, что малые молекулы, пептиды, или другие миметики описанных выше антагонистов, также относятся к изобретению. Оценки биологической активности фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, такой как ВА-05 Изменение инактивации Rho Способность ВА-05 и ВА-07 инактивировать Rho может быть продемонстрирована с использованием анализа клеточной культуры. В данном анализе клеточную линию высевают в культуру ткани при соответствующих условиях. Например, клетки NG108 могут высеваться, и их оставляют пролиферировать до полусомкнутости. NG108 представляет собой нейробластому Х глиому, образованную посредством индуцированного вирусом Сендай слияния клона нейробластомы N18TG-2 и клона глиомы крысыC6BU-1. Затем клетки собирают, гомогенизируют, и проводят анализ осаждения Rho. Анализ осаждения использует приманку, которая связывается с активным Rho. В анализе авторов изобретения они могут использовать, например, домен связывания с Rho (RBD) из Rhoteckin. Другие белки, такие как Rhoкиназа, также могут использоваться. Наживка связана с гранулой, так что она может осаждаться из гомогената. RBD связывается с GTP-Rho в гомогенате и не связывается с GDP-Rho. Таким путем может активный Rho в клеточной культуре может оцениваться количественно. Степень, с которой ВА-07 инактивирует Rho в клеточной линии может демонстрироваться путем обработки образца клеток клеточной линии до выполнения анализа осаждения. Анализ осаждения может использоваться для определения количества активного Rho в солидной опухоли. Образец опухоли гомогенизируют в буфере, проводят анализ осаждения, и количество GTP Rho может сравниваться с количеством, обнаруженным в нераковой ткани. Данный анализ по выявлению активного Rho может использоваться для диагностики опухолей, при которой сравнивают клетки с высоко активированными уровнями Rho, и которые могут реагировать по изобретению, например, на терапию ВА-07. Измерение активированного Rho может быть более чувствительным, чем простое определение уровней экспрессии Rho. Анализ осаждения in situ может использоваться для выявления GTP-Rho в гистологических срезах. Для данного анализа криосрезы (каждый примерно 16 мкм в толщину) образцов опухоли после фиксации 4% PFA инкубировали с бактериальным лизатом, содержащим RBG-GST в течение ночи при 4 С. Срезы затем промывали 3 раза в TBS, блокировали в 3% BSA примерно в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали с антителом против GST (Cellsignalling, New England Biolabs, Mississauga, Канада) и со специфичными в отношении клеточного типа антителами для идентификации специфичных клеток, и инкубировали в течение ночи при 4 С. Срезы промывали в TBS и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с конъюгированным FITC, Техасским красным или родамином вторичным антителом для выявления иммунореактивности (JacksonImmunoResearch, Mississauga, Канада). Подробности последовательностей ДНК и белковых последовательностей ВА-05 В отношении изобретения подходящие слитый белок, обозначенный как ВА-05, имеет следующую кодирующую последовательность ДНК, показанную здесь с использованием общепринятой номенклатуры G, А, Т, и С. В олигонуклеотидных последовательностях по изобретению символы G, С, А и Т имеют их общепринятое значение. Кодирующая последовательность белка pGEX-4TBA-05 Праймер 1, который может использоваться для продукции ВА-07: Праймер 2, который может использоваться для продукции ВА-07:- 22008824 Кодирующая последовательность ДНК рЕТ 9 а-ВА-07 Последовательность белка рЕТ 9 а-ВА-07 Аминокислотный остаток включает в себя группу -NH-CR1R2-СО-, причем аминокислотный остаток локализован внутри пептида. Остаток образован из соответствующей аминокислоты NH2-CR1R2 СООН, где R1 и R2 представляют собой заместители, противолежащие у центрального углерода аминокислоты, составляя оставшуюся часть аминокислоты после потери Н 2O с образованием амидной или пептидной связи с другими аминокислотами, одну у атома азота и одну на карбониле карбоновой кислоты. Аминокислотный остаток с N-конца пептида включает группу NH2-CR1R2-CO-, в которой карбонил связан пептидной связью с другим аминокислотным остатком в пептиде. Аминокислотный остаток с Сконца пептида включает в себя группу -NH-CR1R2-COOH, в которой азот связан пептидной связью с другим аминокислотным остатком пептида. Аминокислотные остатки, которые могут присутствовать в пептидных и белковых последовательностях по изобретению иногда обозначаются трехбуквенными кодами или однобуквенными кодами,обычно используемыми в данной области, причем данные коды включают в себя глицин как Gly или G; аланин как Аlа или А; валин как Val или V; лейцин как Leu или L; изолейцин как Ilе или I; метионин как Met или М; фенилаланин как Phe или F; триптофан как Trp или W; пролин как Pro или Р; серин как Ser или S; треонин как Thr или Т; цистеин как Cys или С; тирозин как Tyr или Y; аспарагин как Asn или N; глутамин как Gln или Q; аспарагиновую кислоту как Asp или D; глутаминовую кислоту как Glu или Е; лизин как Lys или K; аргинин как Аrg или R; и гистидин как His или Н. Другие аминокислоты, которые не являются незаменимыми аминокислотами, могут вводиться с использованием способов пептидного синтеза, известных в данной области, или химической модификации, например, ацилирования (например, реакцией эпсилонаминогруппы лизина с активным эфиром, содержащим карбонильную группу, с образованием связи ме- 23008824 жду эпсилонаминогруппой и карбонильной группой), алкилирования, образования мочевины, образованием уретана и тому подобного, с добавлением к пептидной цепи химических функциональных групп,содержащих гидрофобные группы (например, с С-1 по С-18 алкил и/или аралкил, который может быть насыщенным, ненасыщенным, или содержать карбоксильные группы, такие как пролинамид), с добавлением положительно заряженных групп, таких как группы четвертичных аминов алкилов или основные аминогруппы, которые могут быть протонированными при рН, имеющемся у пациента со злокачественной опухолью, или с добавлением обоих видов групп. В пептидах и белках по изобретению относительно неполярные и гидрофобные аминокислотные остатки могут включать в себя G, А, V, L, I, M, F, W и Р; относительно полярные и гидрофильные аминокислотные остатки могут включать в себя S, Т, С, Y, N и Q; анионные и гидрофильные аминокислотные остатки могут включать в себя D и Е, где в каждом из D и Е функциональная группа карбоновой кислоты может находиться в депротонированной форме, такой как анионный карбоксилат; катионные гидрофильные аминокислотные остатки могут включать в себя K, в котором основная первичная эпсилонаминогруппа может быть в протонированной форме в виде катионной аминогруппы, Н, в котором азот имидазола может находиться в протонированной форме с обеспечением катионной группы имидазола, и R, который может включать в себя протонированную амидную группу. Противометастазные свойства фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению В одном из аспектов фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению,может вводиться, например, инъекцией или местным применением, например, способом покрытия или другим способом, описанным здесь, на ткань вблизи первичной опухоли, или на ткань самой этой опухоли, млекопитающему, нуждающемуся в лечении и может ингибировать миграцию метастазирующей опухолевой клетки в млекопитающем, причем данная опухолевая клетка происходит из участка первичной опухоли млекопитающего, в участок здоровой или нормальной ткани млекопитающего, которая функционально связана и расположена вблизи ткани, в которой находится первичная опухоль. Например, фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться в ткань почки вблизи опухоли почки млекопитающего или в ткань, содержащую эту опухоль, и может ингибировать миграцию метастазирующей опухолевой клетки почки из опухоли почки в здоровую ткань в той же почке, где находится первичная опухоль. В другом аспекте фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться, например, путем инъекции, или покрытия, или другим описанным здесь способом, в ткань вблизи первичной опухоли или в содержащую опухоль ткань нуждающегося в этом лечении млекопитающего, и может ингибировать миграцию метастазирующей опухолевой клетки в млекопитающем,причем данная опухолевая клетка происходит из участка первичной опухоли млекопитающего, в участок здоровой или нормальной ткани млекопитающего, которая функционально отделена и расположена вдали от ткани, в которой находится первичная опухоль. Например, фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться в головной мозг, содержащий опухоль головного мозга, и может ингибировать миграцию метастазирующей опухолевой клетки в здоровые ткани по всему организму, например, в ткань печени, селезенки или легкого. В другом аспекте после введения пациенту, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, метастазирующая миграция злокачественной опухолевой клетки по изобретению предотвращается или ингибируется, и может существенно снижать или полностью предотвращать образование вторичной опухоли и может предотвращать распространение вторичной злокачественной опухоли у пациента. Демонстрация того, что слитый белок по изобретению, такой как ВА-07, может снижать подвижность клеток. Терапевтическая эффективность фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению (такой как ВА-05), в качестве средства против метастазирования может быть продемонстрирована, например, количественно, посредством анализа двухмерной инвазии клеток in vitro. В одном из таких анализов ингибирование способности к метастазирующей миграции злокачественной клетки может измеряться с использованием имеющихся в продаже камер Бойдена. Камеры Бойдена имеют два отделения, где верхнее и нижнее отделения разделены мембраной. Степень миграции клеток выявляется высеванием общего количества клеток в верхнее отделение, и подсчетом доли их общего количества,которые мигрируют в нижнее отделение. В нижнее отделение могут добавляться факторы роста для усиления миграции клеток. Данная модель может использоваться в качестве модели миграции клеток злокачественной опухоли in vivo у млекопитающего. Для тестирования способности фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению (такой как ВА-07 в стерильном фосфатно-солевом буфере, который изотоничен в отношении крови млекопитающего) блокировать миграцию опухолевых клеток, композицию, содержащую ВА-07, добавляют при различных концентрациях ВА-07 к клеткам злокачественной опухоли в верхнем отделении. Долю общего числа клеток, которые мигрируют в нижнее отделение в присутствии композиции слитого белка, подсчитывают и сравнивают с контролями, в которых слитый белок находится в нулевой концентрации.- 24008824 Число раковых клеток, которые мигрируют в контрольном эксперименте моделирует такую миграцию в пациенте со злокачественной опухолью, которого не лечат композицией по изобретению. Число раковых клеток, которые мигрируют в присутствии аликвоты композиции по изобретению, моделирует такую миграцию в пациенте со злокачественной опухолью, которого лечат аликвотой композиции по изобретению. Разница между последним числом и числом миграции клеток в контрольном эксперименте может выражаться в процентах и может изменяться от 100% (т.е., полное ингибирование миграции метастазирующей клетки) примерно до 5%, предпочтительно, примерно от 100 до 50%, более предпочтительно примерно от 100 до 75%, и, наиболее предпочтительно примерно от 100 до 90%. Количество 0% может наблюдаться, когда первый контрольный носитель сравнивают со вторым контрольным носителем,который может быть тем же, что и первый контрольный носитель. Вычисление данного процента дается решением выражения = (число клеток, мигрирующих в контроле, минус число клеток, мигрирующих в присутствии слитого белка) разделить на (число клеток мигрирующих в контроле), умножить на 100%. Терапевтическая эффективность фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению (например, ВА-05) в качестве средства против метастазирования может быть продемонстрирована, по меньшей мере, количественно и в одном аспекте посредством трехмерного анализа клеточной инвазии in vitro. В одном из таких анализов ингибирование способности к местастазирующей миграции злокачественной клетки может измеряться изменением относительной способности злокачественной клетки мигрировать через матрикс MATRIGEL после обработки клеток фармацевтически приемлемым препаратом, содержащим слитый белок по изобретению в носителе, по сравнению к способности злокачественной клетки мигрировать через матрикс MATRIGEL после обработки клеток носителем в качестве контроля сравнения, причем носитель не содержит слитый белок. В одном из аспектов слитый белок по изобретению может ингибировать миграцию метастазирующей опухолевой клетки в модели тканевого матрикса с продукцией ингибиторного изменения в виде снижения скорости миграции клетки или в виде снижения расстояния миграции клеток в период времени. Относительное изменение расстояния миграции злокачественной клетки через модельный матрикс равно разнице в расстоянии миграции клетки в присутствии слитого белка и носителя и расстоянию миграции клетки в присутствии контрольного носителя в отсутствие слитого белка, причем данная разница делится на расстояние миграции контрольного носителя. Относительные изменения могут выражаться в процентах и могут изменяться от 100% (полное ингибирование миграции метастазирующей клетки) примерно до 5%, предпочтительно от 100% примерно до 50%, более предпочтительно, примерно от 100 до 75%, и наиболее предпочтительно примерно от 100 до 90%. Количество 0% может наблюдаться, когда первый контрольный носитель сравнивают со вторым контрольным носителем, который может быть таким же как первый контрольный носитель. В одном варианте осуществления сравнение эффективностей двух слитых белков А и В по изобретению, причем данные слитые белки отличаются один от другого по их аминокислотной последовательности, например, по их соответствующей повышающей проникновение через мембрану последовательности, может обеспечивать различные наблюдаемые процентные доли ингибирования миграции данного типа опухолевых клеток, вызванные воздействием А и В. Относительные различия (абсолютная процентная доля, такая как 100% для А, по сравнению с 80% для В, или качественные отличия, например А лучше В) по ингибированию могут быть одинаковыми от одного типа опухоли до другого или могут изменяться от одного типа опухоли до другого. В одном из аспектов слитый белок по изобретению может существенно (100%) ингибировать метастазирующую миграцию по меньшей мере одного типа опухолевой клетки. В другом аспекте слитый белок по изобретению может существенно (100%) ингибировать метастазирующую миграцию, по меньшей мере, двух типов опухолевой клетки. Полезный анализ основан на наблюдаемой способности инвазивной опухолевой клетки мигрировать через искусственную базальную мембрану (MATRIGEL). В данном анализе изменение способности различных клеточных типов злокачественной опухоли, каждого с отличающейся способностью мигрировать через MATRIGEL в отсутствие обработки композицией по изобретению и, следовательно, с отличающейся метастазирующей инвазивностью оценивают воздействием интервалом концентрации или дозы слитого белка по изобретению от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл. Предпочтительный интервал концентрации составляет примерно от 0,0001 мкг слитого белка на кубический сантиметр (см 2) ткани до 100 мкг на кубический сантиметр ткани. Матрикс Matrigel (BD Biosciences) представляет собой солюбилизированную базальную мембрану, выделенную из мышиной саркомы EHS, опухоли, богатой белками ЕСМ. Его важнейшими компонентами являются ламинин, коллаген IV, гепарансульфатпротеогликаны, и энтактин. При комнатной температуре матрикс BD Matrigel полимеризуется с продукцией биологически активного матриксного материала, который может имитировать базальную мембрану клеток млекопитающих, где клетки могут вести себя in vitro путем, сходным с условиями in vivo. Матрикс Matrigel может предоставлять биологически релевантной окружение для исследований клеточной морфологии, биохимической функции,миграции или инвазии и генной экспрессии.- 25008824 Ингибирование ангиогенеза фармацевтической композицией, содержащей слитый белок по изобретению, такой как ВА-05, и ее эффект на капилляроподобные или тубулярные структуры В одном из аспектов фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению,может вводиться, например, инъекцией или покрытием или другим описанным здесь способом в ткань вблизи первичной опухоли или в содержащую данную опухоль ткань нуждающемуся в лечении млекопитающему и может ингибировать процесс ангиогенеза метастазирующей опухолевой клетки или группы опухолевых клеток млекопитающего, причем опухолевая клетка или группа клеток происходит из участка первичной опухоли млекопитающего, в участок здоровой или нормальной ткани млекопитающего, которая функционально связана и расположена вблизи ткани, в которой находится первичная опухоль. Например, фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться в ткань почки вблизи опухоли почки млекопитающего или в ткань, содержащую эту опухоль, и может ингибировать процесс ангиогенеза метастазирующей опухолевой клетки почки из опухоли почки в здоровую ткань в той же почке, где находится первичная опухоль. В другом аспекте фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться, например, путем инъекции, или покрытия, или другим описанным здесь способом, в ткань вблизи первичной опухоли или в содержащую опухоль ткань нуждающегося в этом лечении млекопитающего, и может ингибировать процесс ангиогенеза, ассоциированный с ростом метастазирующей опухолевой клетки в млекопитающем, причем данная опухолевая клетка происходит из участка первичной опухоли млекопитающего, в участок здоровой или нормальной ткани млекопитающего, которая функционально отделена и расположена вдали от ткани, в которой находится первичная опухоль. Например,фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по изобретению, может вводиться в головной мозг, содержащий опухоль головного мозга, и может ингибировать ангиогенез метастазирующей опухолевой клетки в здоровые ткани по всему организму, например, в ткань печени, селезенки или легкого. В другом аспекте после введения пациенту, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, ангиогенез, ассоциированный с образованием метастазов и ростом злокачественной опухолевой клетки, может предотвращаться или ингибироваться. Введение пациенту, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, может существенно снижать или полностью предотвращать ангиогенез, ассоциированный с образованием вторичной опухоли и может предотвращать распространение и укоренение злокачественной опухоли у пациента. Образование новых кровеносных сосудов при ангиогенезе важно для роста первичной опухоли и последующего роста вторичной опухоли, образованной из клетки или группы клеток первичной опухоли метастазированием. Ингибирование ангиогенеза фармацевтической композицией, содержащей слитый белок по изобретению, такой как ВА-07, может оцениваться в системе in vitro, которая может использоваться для исследования ангиогенеза при росте опухоли, т.е., в системе, включающей в себя культивирование эндотелиальных клеток в присутствии экстракта базальной мембраны (Matrigel). В условиях экспериментального наблюдения капилляроподобные структуры или тубулы, ассоциированные с ангиогенезом или образованием капилляров крови, могут наблюдаться в микроскопе. Ингибиторные эффекты слитого белка по изобретению, такого как ВА-05, в отношении прогрессирования ангиогенеза или образования тубулярной капиллярной сети или в отношении нарушения процесса или прогресса ассоциированного с опухолью ангиогенеза, может наблюдаться путем слежения за исчезновением тубулярных структур в анализе с использованием Matrigel. В анализе с использованием Matrigel его (примерно 12,5 мг/мл) оттаивают примерно при 4 С. Матрикс (примерно 50 мкл) добавляют в каждую лунку 96-луночного планшета и позволяют ему затвердевать примерно в течение 10 мин примерно при 37 С. Лунки, содержащие твердый Matrigel, инкубируют примерно в течение 30 мин с клетками HUVEC в концентрации примерно 15000 клеток на лунку. Когда клетки прилипают, среду удаляют и заменяют свежей средой, дополненной слитым белком по изобретению, таким как ВА-05, и инкубируют при 37 С примерно в течение 6-8 ч. Контрольные лунки инкубируют с одной средой. Для анализа роста образование трубок может визуализироваться микроскопией,например, при 50 Х увеличении. Относительная средняя длина YX происходящей вследствие ангиогенеза капиллярной сети, наблюдаемой при оценке фармацевтической композиции, содержащей слитый белок х по изобретению, может подвергаться количественному анализу с использованием программного обеспечения Northern Eclipse по инструкциям. Данные обычного эксперимента по анализу с использованием Matrigel, например, относящиеся к эффекту фармацевтической композиции, содержащей слитый белок, обозначенный как ВА-05, в отношении длины происходящей вследствие ангиогенеза капиллярной сети, суммированы в табл. 1. Эти данные показывают, что образование сети ингибируется примерно на 13-20% при использовании условий дозы и препарата по сравнению с ингибированием, продуцируемым контрольным носителем, где нулевое ингибирование предоставляет 100% роста. Данное действие на ангиогенез может усиливаться с использованием более высоких доз слитого белка и предварительной инкубации клеток HUVEC с ВА-05 перед добавлением клеток на Matrigel.- 26008824 Таблица 1. Эффект против ангиогенеза фармацевтической композиции, содержащей слитый белок ВА 05, в отношении средней длины капиллярной сети, в анализе с использованием матрикса Matriqel Активность против пролиферации фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по изобретению, такой как ВА-07 Демонстрация того, что слитый белок по изобретению, такой как ВА-07, может воздействовать на множественные аспекты фенотипов злокачественных клеток, может быть проведена за счет мониторинга включения меченного тритием тимидина в пролиферирующие и растущие клетки, где меченный тритием тимидин, добавленный в среду для культивирования клеток, захватывает клетками и становится в них частью пула тимидинтрифосфатов, который используется каждой клеткой для синтеза ДНК. Меченный тритием тимидин становится ковалентно введенным в макромолекулы ДНК в каждой клетке. В клетки,которые не растут или в клетках, которые гибнут за счет апоптоза или некроза, меченный тритием тимидин не захватывается или высвобождается в среду после лизиса клеток. Включение меченного тритием тимидина может использоваться в качестве общего измерения эффекта слитого белка по изобретению,такого как ВА-07 в отношении роста клеток, деления клеток, покоя клеток и гибели клеток. Клеточные линии, в которых ВА-07 индуцирует снижение включения 3H-тимидина, включают в себя клеточную линию рака эндометрия человека НЕС 1 В, клеточную линию колоректального рака человека СаСо 2, клеточную линию меланомы человека SK-MEL-2, и клеточную линию злокачественной опухоли ЦНС человека А-172. Данные в табл. 2 иллюстрируют эффекты изменений в дозированном количестве композиции, содержащей слитый белок по изобретению ВА-07, введенной к каждой из восьми репрезентативных раковых клеточных линий человека в отношении включения меченного тритием тимидина в клетки восьми раковых клеточных линий человека: НЕС 1 В, Сасо-2, SK-MEL-1, HT1080, MCF7, SW480, 293S и А 172. Доза вводимого слитого белка ВА-07 изменялась 50-кратно примерно от 1 микрограмма на миллилитр до 10 микрограммов на миллилитр и до 50 микрограммов на миллилитр (мкг/мл). Таблица 2. Данные по реакции опухолевых клеточных линий человека в отношении введения слитого белка ВА-07, измеренные по включению меченного тритием тимидина Неожиданно было обнаружено, что данные опухолевые клеточные линии характеризуются сниженной пролиферацией клеток в присутствии слитого белка. На табл. 2 показан процент роста по сравнению с контрольным значением, равным 100%. Опухолевые клеточные линии могут подразделяться на три отдельных группы в отношении включения меченного тритием тимидина. Композиция по изобретению, содержащая слитый белок ВА-07, характеризуется выраженным эффектом на пролиферацию клеток в клеточной линии НЕС 1 В, которая представляет собой клеточную линию карциномы эндометрия, с ингибированием пролиферации, относящимся к 50% ингибирующей концентрации (IC50), меньшей чем 1 мкг/мл. В дополнение к ингибированию имеет место зависимый от дозы эффект повышения ингибирования при более высоких концентрациях ВА-07.- 27008824 В клеточных линиях Сасо 2 и SK-MEL-1, показанных в табл. 2, слитый белок характеризуется сильным ингибирующим эффектом на клеточную пролиферацию, что подтверждается высоким уровнем включения меченного тритием тимидина в клетки каждой клеточной линии. Аббревиатуры, используемые в данном описанииADP -адениндинуклеотидфосфат АТСС - Американская коллекция типовых культурSRB -сульфородамин В ТСА - трихлоруксусная кислота Изобретение далее иллюстрируется в различных вариантах осуществления и аспектах следующими неограничивающими примерами. Пример 1. Общий способ, который может использоваться для получения слитого белка по изобретению Для демонстрации способа, который может использоваться для получения слитого белка по изобретению, используется пример последовательности Antennapedia, добавленный к С-концу полипептида C3. Последовательность ДНК, подлежащая добавлению к С-концу, может представлять собой любую последовательность ДНК, которая в результате будет иметь добавление по меньшей мере одной аминокислоты с С-конца полипептида C3. Стоп-кодон с 3'-конца ДНК может замещаться участком EcoRl за счет полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров 5'GAA ТТС ТТТ AGG АТТ GAT AGCTGT GCC 3' (SEQ ID NO: 1) и 5' GGT GGC GAC CAT ССТ ССА ААА 3' (SEQ ID NO: 2). Продукт ПЦР можно субклонировать в вектор pSTBlue-1 (Novagen, Madison, Висконсин), затем клонировать в векторpGEX-4T (Amersham Biosciences, Baie d'Urfe, Квебек) с использованием участка рестрикции BamН I иNot I. Данный вектор может называться pGEX-4T/C3 и предоставляет общий способ для получения слитого белка по изобретению. Последовательность Antennapedia, которая может использоваться для добавления к 3'-концу C3 в pGEX-4T/C3, может создаваться посредством ПЦР из вектора рЕТ-3 а, содержащего последовательность Antennapedia (Bloch-Gallego (1993) 120: 485-492; и Derossi (1994) 269: 1044410450), субклонированную в вектор pSTBlue-1 с тупыми концами, затем клонировали в pGEX-4T/C3, с использованием участков рестрикции EcoR I и SalI, что создает pGEX-4T/BA-14. Манипуляции с целевой плазмидной последовательностью, такие как с использованием нуклеаз, присутствующих в плазмидной ДНК, или коммерчески доступных ферментов, что приводит к новым последовательностям ДНК,расщепление экзонуклеазой III или сайт-специфический мутагенез с использованием двух синтетических олигонуклеотидов, содержащих требуемую последовательность, введенную в pGEX4T/BA-14, может использоваться для продукции новых последовательностей ДНК, которые при экспрессии в подходящих системах продуцируют белки, которые могут очищаться стандартными способами, такими как аффинная хроматография или стандартная хроматография с использованием способов, таких как ионообменная хроматография для разделения по заряду, гель-фильтрация для разделения по размеру, и другие способы очистки белков. Белки тестируют в анализах на способность проникать в клетки, и белки тестируют в анализах на их способность противостоять активности Rho. Анализ последовательности ДНК может проводиться на плазмидных последовательностях, которые продуцируют реакции более эффективно, чемC3-экзотрансфераза, каждый раз сравниваемая в качестве контроля. Клон pGEX-4T/BA-14 (SEQ ID NO: 3) представляет собой предпочтительную в настоящее время последовательность и предоставляет белок,который входит в состав предпочтительной композиции по изобретению. Пример C3-подобного слитого белка обозначен pGEX-4T/BA-05 (SEQ ID NO:37). Белки по настоящему изобретению могут быть получены из экстрактов бактериальной клетки, или путем использования рекомбинантных способов за счет трансформации, трансфекции, или инфекции клетки-хозяина всем фрагментом ДНК, кодирующим слитый белок (таким как кодирующий ВА-05 фрагмент ДНК), или его частью с происходящей из Antennapedia транспортной последовательностью в подходящем экспрессирующем носителе. Пример 2. Получение слитого белка ВА-05 Способ примера 1 может использоваться для получения слитого белка, обозначенного ВА-05, причем данный слитый белок содержит аминокислотную последовательность. ВА-05 представляет собой обозначение белка, полученного путем лигирования кДНК, кодирующей C3 с кДНК, кодирующей полученный в результате слияния 19-членный пептид. Пример C3-подобного слитого белка обозначен как pGEX-4T/BA-05 (SEQ ID NO: 37). Данный C3-подобный слитый белок получен способом, описанным для манипуляции ДНК Antennapedia с использованием ДНК pGEX4T/C3. Двадцать или большее число C3-подобных слитых белков- 28008824 экспрессированы и очищены, как описано производителем (Amersham BioSciences, BaieD'Urfe, Квебек). Двадцать белков оцениваются на предмет способности инактивировать Rho в системе in vitro. Белки,инактивирующие Rho в большей степени, что измерено по повышенному разрастанию нейритов по сравнению к контролем-нсоителем или контрольным белком глутатион-3-трансферазой (GST), подвергали дальнейшему анализу. Продукты данного процесса могут включать в себя белки, такие как ВА-14, белок,описанный в общем примере, или новые слитые белки, продуцированные способом клонирования, причем данные слитые белки имеют свойства, такие как молекулярная масса и активность в биоанализах инактивации Rho, отличные от молекулы слитого белка ВА-14 или отличные от контроля, представляющего собой белок C3, не являющийся слитым белком. Новые слитые белки могут содержать аминокислотную последовательность C3, но изменены с С-конца из-за используемого способа. Пример 3. Получение слитого белка ВА-07 Способ примера 1 может использоваться для получения ВА-07, который содержит следующую аминокислотную последовательность: Два ПЦР-праймера конструировали для переноса одной серии рекомбинантных конструкций (ВА 05) в вектор рЕТ-9 а (Novagen, Madison, Висконсин) для создания белка ВА-07 при экспрессии в подходящей системе экспрессии: верхний праймер 5' ggatctggttccgcgtcatatgtctagagtcgacctg 3' (SEQ ID NO: 38); нижний праймер: 5' cgcggatccattagttctccttcttccacttc 3' (SEQ ID NO: 39); участок BamHI с 5'-конца SEQ IDNO: 39 ggatccatta; TGA замещен TAAT (atta, в SEQ ID NO: 39). Программа, которая может использоваться для амплификации продукта с использованием полимеразы Pfu, включает в себя: 95 С 5' 1 цикл, затем 94 С 2' 56 С 2' 70 С 2' 10 циклов, затем 94 С 2' 70 С 3' 30 циклов и держали при 4 С. Набор QIAEXII (Qiagen) может использоваться для очистки из ломтика агарозного геля, содержащего требуемую полосу ДНК. Вставку и вектор расщепляли BamHI иNdeI по инструкциям производителя (New England BioLabs, Beverly, Миннесота), очищали с использованием электрофореза в агарозном геле и набора QIAEXII (Qiagen), и инкубировали вместе в течение ночи с ДНК-лигазой Т 4 по указаниям производителя. Е. coli (DH5-альфа или, предпочтительно, XLl-Blue) трансформировали смесью лигирования. Клоны могут проверяться маломасштабной индукцией и SDS-PAGE, и могут быть подтверждены иммуноблоттингом грубых лизатов антителом против C3. Плазмидную ДНК очищают и могут оценивать на предмет чистоты. Может проводиться секвенирование ДНК (например, с использованием технологииLiCor, в которой целая цепь секвенируется по полной длине клона). Первая конструкция, полученная таким путем (рЕТ 3 а-ВА-07, SEQ ID NO: 7), соответствовала теоретической последовательности ДНК конструкции pGEX/BA-05 с небольшим отличием на 5'-конце из-за стратегии клонирования. Вторая конструкция рЕТ 9 а-ВА-07 может быть получена субклонированием вставки из рЕТ 3 а-ВА 07 в вектор рЕТ 9 а путем расщепления конструкции рЕТ 3 а BamHI и NdeI (New England BioLabs, Beverly,Миннесота) по инструкциям производителя. Плазмидную ДНК рЕТ 9 а можно расщепить теми же ферментами. ДНК вставки и ДНК вектора может очищаться посредством электрофореза в агарозном геле. Вставку можно лигировать в новый вектор с использованием ДНК-лигазы Т 4 (New England BioLabs,Beverly, Миннесота). Лигированную ДНК можно трансформировать в клетки DHS-альфа, и ДНК может быть получена с использованием мини- и макси-наборов QIAGEN. Клоны могут характеризоваться путем расщепления рестриктазами и секвенирования ДНК вставки в обоих направлениях (например, посредством BioST, Lachine, Квебек). ДНК конструкции могут трансформироваться клетки BL21 (DE3),клетки BL21 (DE3)/pLysS (Novagen, Madison, Висконсин) или другие подходящие системы экспрессии. Пример 4. Общий способ для захвата меченного тритием тимидина в качестве меры пролиферации клеток, который может использоваться для демонстрации того, что слитый белок ВА-07 снижает пролиферацию раковых клеток Анализы включения 3H-тимидина Среда и клеточные линии Клеточные линии тестировали на микоплазму, и подтверждали ее отсутствие перед началом исследований. Клеточные линии получают из АТСС. Линию НЕС-1 В культивируют в Е-МЕМ, дополненной 10% FBS и 1% HEPES. Линию Сасо-2 культивируют в Е-МЕМ, дополненной 20% FBS, 1% HEPES, 1 мМ пируватом натрия, и 0,1 мМ не незаменимой аминокислоты. Линию SK-MEL-1 культивируют в среде Маккоя, дополненной 10% FBS и 1% HEPES. Объемы 100 мкл каждого из 2 х рабочих растворов слитого белка, положительные и относящиеся к носителю контроли помещали в трех параллелях в 96-луночные планшеты для микротитрования, содержащие клетки (4x103/100 мкл), с получение конечного объема 200 мкл. Планшеты помещали в инкубатор на 37 С с 100% влажностью и 5% СO2. Примерно через 54 ч инкубации объем из 20 мкл меченного тритием тимидина (3H-тимидина) (ICN, Montreal, Канада), содержащий 1,0 мКи, добавляют в каждую лунку. 3H-тимидин получают в RPMI-1640, дополненной 10% FBS. Культуры инкубируют в тех же условиях,как указано выше, примерно в течение 18 ч. В конце инкубации клетки собирают автоматическим устройством для сбора клеток (Tomtec), и включенный 3H-тимидин в количестве импульсов в минуту (cpm) измеряют в сцинтилляционном счетчике для микропланшетов (TopCount NXT, Packard). Демонстрация того, что слитый белок по изобретению, такой как ВА-07, может влиять на множественные аспекты фенотипов злокачественных клеток, может осуществляться мониторингом включения меченного тритием тимидина в пролиферирующих и растущих клетках, где меченный тритием тимидин,добавленный к среде клеточной культуры, захватывается клетками и становится частью пула тимидинтрифосфатов, который используется там каждой клеткой для синтеза ДНК. Меченный тритием тимидин становится ковалентно введенным в макромолекулы ДНК в каждой клетке. В клетки, которые не растут,или в клетках, которые гибнут за счет апоптоза или некроза, меченный тритием тимидин не захватывается или высвобождается в среду после лизиса клеток. Включение меченного тритием тимидина может использоваться в качестве общего измерения эффекта слитого белка по изобретению, такого как ВА-07 в отношении роста клеток, деления клеток, покоя клеток и гибели клеток. Клеточные линии, в которых ВА-07 индуцирует снижение включения 3H-тимидина, включают в себя клеточную линию рака эндометрия человека НЕС 1 В, клеточную линию колоректального рака человека СаСо 2, клеточную линию меланомы человека SK-MEL-2, и клеточную линию злокачественной опухоли ЦНС человека А-172. Данные в табл. 2 иллюстрируют эффекты изменений в дозированном количестве композиции, содержащей слитый белок по изобретению ВА-07, введенной к каждой из восьми репрезентативных раковых клеточных линий человека в отношении включения меченного тритием тимидина в клетки восьми раковых клеточных линий человека: НЕС 1 В, Сасо-2, SK-MEL-1, HT1080, MCF7, SW480, 293S и А 172. Доза вводимого слитого белка ВА-07 изменялась 50-кратно примерно от 1 микрограмма на миллилитр до 10 микрограммов на миллилитр и до 50 микрограммов на миллилитр (мкг/мл). Пример 5. Общий способ для определения ингибирования ангиогенеза Образование новых кровеносных сосудов исследуют на модели клеточной культуры путем выращивания эндотелиальных клеток в присутствии матрикса базальной мембраны (Matrigel).