Предупреждение потери и восстановление костной массы некоторыми агонистами простагландина

1 Предпосылки изобретения Настоящее изобретение относится к агонистам простагландина, к фармацевтическим композициям, содержащим такие агонисты, и к применению таких агонистов для предупреждения потери кости, либо восстановления или увеличения костной массы, в том числе к лечению состояний, которые свидетельствуют о низкой костной массе у млекопитающих, в том числе у людей. Остеопороз является системным скелетным заболеванием, которое характеризуется низкой костной массой и деградацией костной ткани с последующим увеличением хрупкости кости и восприимчивости к перелому. В США это состояние поражает более 25 миллионов человек и является причиной более 1,3 миллионов переломов каждый год, в том числе 500000 переломов позвоночника, 250000 переломов шейки бедра и 240000 переломов запястья ежегодно. Переломы шейки бедра являются наиболее серьезными последствиями остеопороза,при этом в течение года умирают 5-20% пациентов, а свыше 50% оставшихся в живых имеют ухудшение физического состояния. Наиболее сильно подвергаются риску остеопороза люди пожилого возраста, и поэтому предсказывают, что эта проблема будет существенно усиливаться со старением населения. Ожидается,что общее число переломов в мире увеличится в три раза за ближайшие 60 лет, а по оценкам некоторого исследования в 2050 году в мире будет 4,5 миллиона случаев перелома шейки бедра. Женщины подвергаются риску остеопороза более сильно, чем мужчины. Они испытывают резкое ускорение потери кости в течение 5 лет после менопаузы. Другие факторы, которые увеличивают риск, включают в себя курение, злоупотребление алкоголем, сидячий образ жизни и недостаточное потребление кальция. В настоящее время существует два основных типа фармакотерапии для лечения остеопороза. Первым является применение антирезорбтивных соединений для уменьшения резорбции костной ткани. Эстроген является примером антирезорбтивного агента. Известно, что эстроген сокращает переломы. Кроме того, описано, что эстроген,особенно при пероральном приеме, понижает уровни плазмы липопротеинов низкой плотности(ЛНП) и увеличивает уровни плазмы полезных липопротеинов высокой плотности (ЛВП) (Blacket al., EP0605193A1). Однако, недостаток эстрогена заключается в том, что в восстановленном остеопорозном скелете он не возвращает кость обратно до уровней молодого взрослого человека. Более того, длительная терапия эстрогеном была,однако, причастна к ряду расстройств, включая увеличение риска рака матки, рака эндометрия и,вероятно, рака груди, заставляя многих женщин избегать этого лечения. Существенные нежелательные эффекты, связанные с терапией эстрогеном, подкрепляют необходимость разработки аль 005161 2 тернативных терапий для остеопороза, которые обладают желательным действием на сыворотку ЛНП, но не вызывают нежелательных эффектов. Вторым типом фармакотерапии для лечения остеопороза является применение анаболических агентов для стимулирования образования кости и увеличения костной массы. Предполагают, что этот класс агентов восстанавливает кость до установленного остеопорозного скелета. Известны (патент США 4112236) некоторые интерфениленовые 8-аза-9-диоксотиа-11,12 секопростагландины для лечения пациентов с нарушенной деятельностью почек. Известны(патенты Великобритании 1478281, 1479156 и патенты США 4175203,4055596, 4175203, 3987091 и 3991106) некоторые агонисты простагландина, которые можно применять, например, в качестве почечных вазодилаторов. Известны (патент США 4033996) некоторые 8-аза-9-оксо(и диоксо)тиа-11,12-секопростагландины, которые можно применять в качестве почечных вазодилаторов для предотвращения образования тромбов, для индуцирования высвобождения гормона роста и в качестве регуляторов иммунного ответа. Известны (патент Франции 897566) некоторые производные аминокислот для лечения неврологических, психических или сердечно-сосудистых заболеваний. Известна (J. Org. Chem. 26; 1961; 1437) Nацетил-N-бензил-п-аминофенилмеркаптоуксусная кислота. Обнаружено, что кроме остеопороза, только в Америке приблизительно 20-25 миллионов женщин и увеличивающееся число мужчин имеют переломы позвоночника как следствие пониженной костной массы, в дополнение к 250000 случаям переломов шейки бедра, о которых сообщают ежегодно. Последний случай ассоциируется с 12%-ной смертностью в течение первых двух лет и с 30% пациентов, которые требуют после перелома домашнего ухода под наблюдением медсестры. Несмотря на то, что это уже имеет важное значение, предполагают, что экономические и медицинские последствия выздоровления из-за медленного или неполного заживления этих переломов кости усиливаются вследствие старения основного населения. Несмотря на разработку нескольких обнадеживающих терапий (бисфосфонаты, например) для предотвращения потери кости с возрастом и, таким образом, уменьшения вероятности переломов, приводящих к ослаблению здоровья, эти терапии не предназначены для восстановления костной массы, если перелом уже произошел. Было показано, что эстроген улучшает качество заживления аппендикулярных переломовResearch Society). Таким образом, заместительная терапия эстрогенами, по-видимому, может быть способом восстановления после перело 3 мов. Однако, пациенты соглашаются с терапией эстрогеном сравнительно редко из-за побочных эффектов, в том числе возобновления менструации, мастодинии, увеличения риска рака матки,увеличения риска рака груди, и сопутствующего применения прогестина. Кроме того, мужчины,видимо, возражают против терапии эстрогеном. Очевидно, что существует потребность в терапии, которая приносила бы пользу пациентам,которые страдают от переломов, приводящих к ослаблению здоровья, или которые имеют низкую костную массу, и с которой соглашалось бы большее количество пациентов. Хотя существует множество терапий остеопороза, остается потребность в альтернативных терапиях остеопороза и продолжаются поиски в этой области. Кроме того, есть потребность в терапиях для излечивания переломов кости. Сущность изобретения Данное изобретение относится к соединению формулы I или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарству,где Y представляет собой -Н или (С 3-С 7)циклоалкил;n равно числу от 0 до 5; группировка Y-(CH2)n-C(O)- возможно моно-, ди- или тризамещена по углероду независимо гидрокси или галогеном-;-(С 1-С 5)алкилен-Х,Х представляет собой 5- или 6-членное ароматическое кольцо, которое возможно имеет один гетероатом, независимо выбранный из кислорода и серы;Z представляет собой карбоксил или (С 1 С 6)алкоксикарбонил;R4 представляет собой (С 1-С 8)алкилен; Аr является полностью ненасыщенным 58-членным кольцом или бициклическим кольцом, состоящим из двух конденсированных частично насыщенных, полностью насыщенных или полностью ненасыщенных 5- или 6 членных колец, взятых независимо, которое возможно имеет от одного до четырех гетероатомов, представляющих собой кислород;R5 представляет собой -Н; указанная группировка Аr возможно замещена по углероду на одном кольце, если группировка является моноциклической, или на одном или обоих кольцах, если группировка является бициклической, заместителями в количестве вплоть до трех, независимо выбранными изR1, R2 и R3 возможно независимо монозамещены по углероду гидрокси; и 4 при условии, что когда R4 представляет собой (С 2-С 4)алкилен, а Аr представляет собой циклопент-1-ил, циклогекс-1-ил, циклогепт-1-ил или циклоокт-1-ил, тогда указанные (С 5 С 8)циклоалкильные заместители не замещены по положению один гидрокси,и при условии, что 6-[(3-фенилпропил)-(2 пропилпентаноил)амино]капроновая кислота и ее этиловый эфир не включены. К предпочтительным относятся соединения по изобретению, как они определены выше,где Х представляет собой тиенил и Ar представляет собой фенил, бензо[b]фуранил или 2,3 дигидробензо[1,4]диоксинил,2,3-дигидробензофуранил. Также предпочтительными являются соединения по изобретению, где Х представляет собой тиенил и Ar представляет собой фенил. Из них предпочтительны соединения, где группировка СН 3-(СН 2)n-С(O)- возможно моно-, диили тризамещена по углероду независимо галогеном-; R4 представляет собой метилен и R1 представляет собой хлор-, фтор- или (С 1-С 4) алкил. К предпочтительным соединениям по изобретению также относятся соединения, охарактеризованные выше, где R4 представляет собой метилен и Ar представляет собой фенил, где -Ar замещен по меньшей мере R1; R1 представляет собой (С 1-С 7)алкил, возможно монозамещенный гидрокси. Из них особенно предпочтительными являются соединения, где n равно 2; Q представляет собой н-гексилен; Z представляет собой карбоксил; R4 представляет собой метилен и группировка -Ar-R5 представляет собой 4-(н-1 гидроксигексил)фенил. Согласно еще одному аспекту изобретения, предпочтительны соединения, охарактеризованные выше, где группировка СН 3-(СН 2)nС(O)- возможно моно-, ди- или тризамещена независимо по углероду галогеном-. Согласно еще одному аспекту предпочтительными являются соединения по изобретению, охарактеризованные выше, где группировка СН 3-(СН 2)n-С(O)- возможно моно-, ди- или тризамещена по углероду независимо галогеном- и Ar представляет собой фенил. Также, согласно следующему аспекту изобретения предложен способ лечения млекопитающего, имеющего состояние, при котором наблюдается низкая костная масса, при котором указанному млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. Предпочтительно, лечению подвергают женщин после менопаузы и мужчин старше 60 лет. Кроме того, не обращая внимания на возраст, лечат отдельных людей, которые обладают значительно уменьшенной костной массой, т.е. 1,5 s.d. (стандартное отклонение) ниже уровней среднего молодого человека. 5 В частности, этим способом предлагается лечить остеопороз, остеотомию, детскую идиопатическую потерю кости или потерю кости,связанную с периодонтитом, в частности им предлагается лечить остеопороз у человека. Данным способом можно лечить остеопороз,индуцированный глюкокортикоидом, остеопороз, индуцированный гипертиреоидизмом, остеопороз, индуцированный иммобилизацией,остеопороз, индуцированный гепарином или остеопороз, индуцированный иммуносупрессивным средством. Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ наращивания и сохранения костной массы у млекопитающего, при котором млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. Данным способом, в частности, осуществляют заживление кости после лицевой реконструкции, верхнечелюстной реконструкции или нижнечелюстной реконструкции, индуцируют вертебральный синостоз или усиливают вытяжение длинных костей, усиливают скорость заживления костного трансплантата или усиливают врастание протеза. В частности, данным способом лечат перелом кости у человека. Согласно еще одному аспекту изобретения предложена фармацевтическая композиция, которая содержит терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, определенным выше,для лечения остеопороза, где терапевтически эффективным количеством является количество,которое лечит остеопороз. Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции для наращивания костной массы, которая содержит количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, которое увеличивает костную массу, и фармацевтически приемлемый носитель. Также предложена фармацевтическая композиция, как она определена непосредственно выше, для лечения перелома кости,где используют количество соединения по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, которое лечит перелом кости. Согласно еще одному аспекту изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения состояния, при котором наблюдается низкая костная масса, у млекопитающего, которая содержит количество соединения по данному изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, которое лечит состояние низкой костной массы, и фармацевтически приемлемый носитель. 6 Еще одним аспектом данного изобретения являются комбинации соединений формулы I или их фармацевтически приемлемой соли или пролекарства и других соединений, таких как описано ниже. Еще один аспект данного изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство и антирезорбтивный агент, и к применению таких композиций для лечения (например для профилактики) состояний, при которых наблюдается низкая костная масса, в том числе остеопороза, у млекопитающих (например у человека, в особенности у женщин), или к применению таких композиций для других применений в целях наращивания костной массы. Комбинации данного изобретения включают в себя терапевтически эффективное количество первого соединения, причем первое соединение является соединением формулы I или его фармацевтически приемлемой солью или пролекарством; и терапевтически эффективное количество второго соединения, причем второе соединение является антирезорбтивным агентом, таким как агонист/антагонист эстрогена или бифосфонат. Предпочтительные агонисты/антагонисты эстрогена включают в себя дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен, 4-гидрокситамоксифен, торемифен, центхроман, левормелоксифен, идоксифен,6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)бензил]нафталин-2-ол,4-[2-(2-аза-бицикло[2.2.1]гепт-2-ил)этокси]фенил-[6-гидрокси 2-(4-гидроксифенил)бензо[b]тиофен-3-ил]метанон,цис-6-(4-фторфенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2 ол;(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-1-[6'-пирролидиноэтокси-3'-пиридил]2-фенил-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин; 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-(4"фторфенил)-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин; цис-6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-фенил 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин и их фармацевтически приемлемые соли. Особенно предпочтительные агонисты/ антагонисты эстрогена включают в себя дролоксифен; цис-6-(4-фторфенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2 ол;(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-ил-этокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-1-[6'-пирролидиноэтокси-3'-пиридил]2-фенил-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин; 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-(4"фторфенил)-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин; цис-6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-фенил 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин и их фармацевтически приемлемые соли. Предпочтительные бифосфонаты включают в себя тилудроновую кислоту, алендроновую кислоту, ибандроновую кислоту, ризедроновую кислоту, этидроновую кислоту, клодроновую кислоту и памидроновую кислоту и их фармацевтически приемлемые соли. Так, согласно еще одному аспекту изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая а) терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства; б) терапевтически эффективное количество антирезорбтивного агента и в) фармацевтический носитель. Предпочтительной, в частности, является такая вышеописанная фармацевтическая композиция, где антирезорбтивным агентом является дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен, 4 гидрокситамоксифен, торемифен, центхроман,левормелоксифен, идоксифен,6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)бензил]нафталин-2-ол,4-[2-(2-аза-бицикло[2.2.1]гепт-2-ил)этокси]фенил-[6-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)бензо[b]тиофен-3-ил]метанон,цис-6-(4-фторфенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2 ол;(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-1-[6'-пирролидиноэтокси-3'-пиридил]2-фенил-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин; 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-(4"фторфенил)-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин; цис-6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол или 1-(4'-пирролидинолэтоксифенил)-2-фенил 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин или их фармацевтически приемлемая соль. 8 Предпочтительно, если в вышеуказанной композиции антирезорбтивным агентом является тилудроновая кислота, алендроновая кислота,ибандроновая кислота, ризедроновая кислота,этидроновая кислота, клодроновая кислота и памидроновая кислота или их фармацевтически приемлемая соль. Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ лечения млекопитающего,имеющего состояние, при котором наблюдается низкая костная масса, при котором указанному млекопитающему вводят: а) терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства; и б) терапевтически эффективное количество антирезорбтивного агента. В данном способ антирезорбтивным агентом является, предпочтительно, дролоксифен,ралоксифен, тамоксифен, 4-гидрокситамоксифен, торемифен, центхроман, левормелоксифен,идоксифен,6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)бензил]нафталин-2-ол,4-[2-(2-азабицикло[2.2.1]гепт-2-ил)этокси]фенил-[6-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)бензо[b]тиофен-3-ил]метанон,цис-6-(4-фторфенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2 ол;(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-1-[6'-пирролидиноэтокси-3'-пиридил]2-фенил-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин; 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-(4"фторфенил)-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин; цис-6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол или 1-(4'-пирролидинолэтоксифенил)-2-фенил 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин или их фармацевтически приемлемая соль. Также предпочтительно, если в данном способе антирезорбтивным агентом является тилудроновая кислота, алендроновая кислота, ибандроновая кислота, ризедроновая кислота, этидроновая кислота, клодроновая кислота и памидроновая кислота или фармацевтически приемлемая соль. Другим предпочтительным аспектом данного способа является способ, где первое соединение и второе соединение по существу вводят одновременно. Другим предпочтительным аспектом данного способа является способ, где первое соединение вводят в течение периода от приблизительно одной недели до приблизительно трех лет. 9 Возможно, что за введением первого соединения следует введение второго соединения,где второе соединение является агонистом/антагонистом эстрогена, в течение периода от приблизительно трех месяцев до приблизительно трех лет без введения первого соединения во время второго периода от приблизительно трех месяцев до приблизительно трех лет. Альтернативно, за введением первого соединения следует введение второго соединения,где второе соединение является агонистом/антагонистом эстрогена, в течение периода более чем приблизительно три года без введения первого соединения в течение более длительного времени, чем приблизительно трехлетний период. Также согласно данному изобретению,предложен набор, содержащий: а) терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства и фармацевтически приемлемый носитель в первой стандартной лекарственной форме; б) терапевтически эффективное количество антирезорбтивного агента и фармацевтически приемлемый носитель во второй стандартной лекарственной форме и в) контейнер, предназначенный для указанных первой и второй лекарственных форм. Предпочтительным является вышеописанный набор, где антирезорбтивным агентом является дролоксифен, ралоксифен, тамоксифен,4-гидрокситамоксифен, торемифен, центхроман,левормелоксифен, идоксифен,6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)бензил]нафталин-2-ол,4-[2-(2-азабицикло[2.2.1]гепт-2-ил)этокси]фенил-[6-гидрокси-2-(4-гидроксифенил) бензо[b]тиофен-3-ил]метанон,цис-6-(4-фторфенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2 ол;(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-1-[6'-пирролидиноэтокси-3'-пиридил]2-фенил-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин; 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-(4"фторфенил)-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин; цис-6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол или 1-(4'-пирролидинолэтоксифенил)-2-фенил 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин или их фармацевтически приемлемая соль; еще предпочтительнее набор, где антирезорбтивным агентом является тилудроновая кислота, алендроновая кислота, ибандроновая 10 кислота, ризедроновая кислота, этидроновая кислота, клодроновая кислота и памидроновая кислота или их фармацевтически приемлемая соль. Также предложена фармацевтическая композиция, содержащая: а) терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства; б) терапевтически эффективное количество анаболического агента, иного чем соединение по п.1, или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство и в) фармацевтический носитель. Предпочтительно, в данной композиции анаболическим агентом, иным чем соединение по изобретению, является IGF-1, возможно сIGF-1-связывающим белком 3, простагландин,агонист/антагонист простагландина, фторид натрия, паратиреоидный гормон (ПТГ), активные фрагменты паратиреоидного гормона, гормон роста или средства, стимулирующие секрецию гормона роста, или их фармацевтически приемлемая соль. Согласно еще одному аспекту предложен способ лечения млекопитающего, у которого наблюдается низкая костная масса, при котором указанному млекопитающему вводят: а) терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства и б) терапевтически эффективное количество костного анаболического агента, иного чем соединение по п.1, или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство. Предпочтительно, в таком способе анаболическим агентом, иным чем соединение по п.1,являетсяIGF-1,простагландин,агонист/антагонист простагландина, фторид натрия, паратиреоидный гормон (ПТГ), активные фрагменты паратиреоидного гормона, гормон роста или средства, стимулирующие секрецию гормона роста, или их фармацевтически приемлемая соль. Согласно следующему аспекту изобретения предложен набор, включающий в себя: а) терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства и фармацевтически приемлемый носитель в первой стандартной лекарственной форме; б) терапевтически эффективное количество анаболического агента, иного чем соединение по изобретению, как оно определено выше,или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство и фармацевтически приемлемый носитель во второй стандартной лекарственной форме и 11 в) контейнер, предназначенный для указанных первой и второй лекарственных форм. Согласно еще одному аспекту изобретения предложен набор, описанный выше, где анаболическим агентом, иным чем соединение по п.1,является IGF-1, простагландин, агонист/антагонист простагландина, фторид натрия, паратиреоидный гормон (ПТГ), активные фрагменты паратиреоидного гормона, гормон роста или средства, стимулирующие секрецию гормона роста, или их фармацевтически приемлемая соль. Также, согласно изобретению, предложена фармацевтическая композиция, содержащая: а) терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства; б) терапевтически эффективное количество 2-(4-метоксифенил)-3-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)фенокси]бензо[b]тиофен-6-ола или его фармацевтически приемлемой соли или 3-[4(1,2-дифенилбут-1-енил)фенил]акриловой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и в) фармацевтический носитель. Также предложен способ лечения млекопитающего, имеющего состояние, при котором наблюдается низкая костная масса, при котором указанному млекопитающему вводят: а) терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства и б) терапевтически эффективное количество 2-(4-метоксифенил)-3-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенокси]бензо[b]тиофен-6-ола или его фармацевтически приемлемой соли, или 3-[4(1,2-дифенилбут-1-енил)фенил]акриловой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли. Согласно еще одному аспекту предложен набор, включающий в себя: а) терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства и фармацевтически приемлемый носитель в первой стандартной лекарственной форме; б) терапевтически эффективное количество 2-(4-метоксифенил)-3-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенокси]бензо[b]тиофен-6-ола или его фармацевтически приемлемой соли или 3-[4(1,2-дифенилбут-1-енил)фенил]акриловой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель во второй стандартной лекарственной форме и в) контейнер, предназначенный для указанных первой и второй лекарственных форм. Также предложен способ лечения млекопитающего, нуждающегося в регенерации почки, при котором указанному млекопитающему 12 вводят терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, как оно определено выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. Предпочтительной дозой является приблизительно от 0,001 до 100 мг/кг/день соединения по изобретению, как оно описано выше, или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. Особенно предпочтительной дозой является приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг/день соединения по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. Выражение "состояние(я), при котором наблюдается низкая костная масса" относится к состоянию, при котором уровень костной массы ниже нормального для конкретного возраста,как определено стандартами Всемирной Организации Здравоохранения "Оценка риска переломов и ее применение для скрининга постменопаузального остеопороза (1994). Доклад Рабочей группы Всемирной Организации Здравоохранения. Серия технических докладов Всемирной Организации Здравоохранения 843""Состояние(я), при котором наблюдается низкая костная масса" охватывает первичный и вторичный остеопорозы. Вторичный остеопороз включает в себя остеопороз, индуцированный глюкокортикоидом, остеопороз, индуцированный гипертиреоидизмом, остеопороз, индуцированный иммобилизацией, остеопороз, индуцированный гепарином, или остеопороз, индуцированный иммуносупрессивным средством. Охвачены также периодонтальное заболевание,альвеолярная потеря кости, остеотомия и детская идиопатическая потеря кости. "Состояние(я), при котором наблюдается низкая костная масса" также включает в себя долговременные осложнения остеопороза, такие как искривление позвоночника, потеря роста и протезная хирургия. Выражение "состояние(я), при котором наблюдается низкая костная масса" относится к млекопитающему, о котором известно, что оно имеет значительно более высокий, чем средний, шанс развития таких заболеваний, как описано выше,включая остеопороз (например к женщинам после менопаузы, мужчинам старше 60 лет). Другие применения для наращивания или усиления костной массы включают в себя увеличение скорости заживления переломов кости,усиление успешных трансплантатов кости, заживления кости после лицевой реконструкции,или верхнечелюстной реконструкции, или нижнечелюстной реконструкции, врастания протеза,вертебрального синостоза или вытяжения длинных костей. 13 Квалифицированные специалисты поймут,что термин "костная масса" по существу относится к массе кости на единицу площади, которую иногда (хотя и не совсем корректно) считают минеральной плотностью кости. Термин "лечение" или "лечить", используемый в этом документе, включает в себя превентивное (например профилактическое) и паллиативное лечение."Фармацевтически приемлемый" означает,что носитель, разбавитель, эксципиенты и/или соль должны быть совместимыми с другими ингредиентами фармацевтического препарата и не причинять вреда реципиенту. Выражение "пролекарство" относится к соединениям, которые являются предшественниками лекарственных средств и после введения высвобождают лекарственное средство in vivo химическим или физиологическим способом (например, пролекарство при физиологическом рН, или под действием фермента превращается в требуемую форму лекарственного средства). Типичные пролекарства при расщеплении высвобождают соответствующую свободную кислоту, и такие гидролизуемые эфиробразующие остатки соединений формулы I включают в себя, но не ограничены заместителями,в которых группировка Z представляет собой независимо карбоксил, а свободный водород заменен на(С 1-С 4)алкил, (С 2-С 7)алканоилоксиметил, 1-(алканоилокси)этил, имеющие от 4 до 9 атомов углерода,1-метил-1-(алканоилокси)этил, имеющий от 5 до 10 атомов углерода, алкоксикарбонилоксиметил,имеющий от 3 до 6 атомов углерода, 1-(алкоксикарбонилокси)этил, имеющий от 4 до 7 атомов углерода, 1-метил-1-(алкоксикарбонилокси)этил, имеющий от 5 до 8 атомов углерода, N-(алкоксикарбонил)аминометил, имеющий от 3 до 9 атомов углерода, 1-(N-(алкоксикарбонил)амино)этил, имеющий от 4 до 10 атомов углерода, 3-фталидил, 4 кротонолактонил, гамма-бутиролактон-4-ил, диN,N-(С 1-С 2)алкиламино(С 2-С 3)алкил (такой как bдиметиламинометил),карбамоил-(С 1-С 2)алкил,N,N-ди(С 1-С 2)алкилкарбамоил-(С 1-С 2)алкил и пиперидино-, пирролидино- или морфолино(С 2 С 3)алкил. Типичные 5-6-членные ароматические кольца, возможно имеющие один или два гетероатома,независимо выбранные из кислорода, азота и серы(т.е. Х кольца), представляют собой фенил, фурил,тиенил, пирролил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, пиридинил, пиридазинил, пиримидинил и пиразинил. Типичные частично насыщенные, полностью насыщенные или полностью ненасыщенные 5-8-членные кольца, возможно имеющие от одного до четырех гетероатомов, независимо выбранных из кислорода, серы и азота (т.е. Ar,Ar1 и Ar2), представляют собой циклопентил,циклогексил, циклогептил, циклооктил и фенил. Кроме того, типичными пятичленными кольцами являются фурил, тиенил, 2 Н-пирролил, 3Hпирролил, пирролил, 2-пирролинил, 3-пирроли 005161 14 нил, пирролидинил, 1,3-диоксоланил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, 2 Н-имидазолил, 2 имидазолинил, имидазолидинил, пиразолил, 2 пиразолинил, пиразолидинил, изоксазолил, изотиазолил, 1,2-дитиолил, 1,3-дитиолил, 3 Н-1,2 оксатиолил, 1,2,3-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,2,5-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил,1,2,3-триазолил, 1,2,4-триазолил, 1,3,4-тиадиазолил, 1,2,3,4-оксатриазолил, 1,2,3,5-оксатриазолил, 31-1-1,2,3-диоксазолил, 1,2,4-диоксазолил, 1,3,2-диоксазолил, 1,3,4-диоксазолил, 5 Н 1,2,5-оксатиазолил и 1,3-оксатиолил. Кроме того, типичными шестичленными кольцами являются 2 Н-пиранил, 4 Н-пиранил,пиридинил, пиперидинил, 1,2-диоксинил, 1,3 диоксинил, 1,4-диоксанил, морфолинил, 1,4 дитианил, тиоморфолинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, пиперазинил, 1,3,5 триазинил, 1,2,4-триазинил, 1,2,3-триазинил,1,3,5-тритианил, 4 Н-1,2-оксазинил, 2 Н-1,3 оксазинил, 6 Н-1,3-оксазинил, 6 Н-1,2-оксазинил,1,4-оксазинил,2 Н-1,2-оксазинил,4H-1,4 оксазинил, 1,2,5-оксатиазинил, 1,4-оксазинил, оизоксазинил, п-изоксазинил, 1,2,5-оксатиазинил,1,2,6-оксатиазинил,1,4,2-оксадиазинил и 1,3,5,2-оксадиазинил. Кроме того, типичными шестичленными кольцами являются азепинил, оксепинил, тиепинил и 1,2,4-диазепинил. Кроме того, типичными восьмичленными кольцами являются циклооктил, циклооктенил и циклооктадиенил. Типичные бициклические кольца, состоящие из двух конденсированных частично насыщенных, полностью насыщенных или полностью ненасыщенных пяти- или шестичленных колец, взятых независимо, возможно имеющие от 1 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из азота, серы и кислорода, представляют собой индолизинил, индолил, изоиндолил, 3 Ниндолил, 1 Н-изоиндолил, индолинил, циклопента(b)пиридинил, пирано(3,4-b)пирролил, бензофурил, изобензофурил, бензо(b)тиенил, бензо(с)тиенил, 1H-индазолил, индоксазинил, бензоксазолил, антранилил, бензимидазолил, бензтиазолил, пуринил, 4 Н-хинолизинил, хинолинил, изохинолинил, циннолинил, фталазинил,хиназолинил, хиноксалинил, 1,8-нафтиридинил,птеридинил, инденил, изоинденил, нафтил, тетралинил, декалинил, 2 Н-1-бензопиранил, пиридо(3,4-b)-пиридинил, пиридо(3,2-b)-пиридинил,пиридо(4,3-b)-пиридинил,2H-1,3-бензоксазинил, 2 Н-1,4-бензоксазинил, 1H-2,3-бензоксазинил, 4 Н-3,1-бензоксазинил, 2 Н-1,2-бензоксазинил и 4 Н-1,4-бензоксазинил. Под алкиленом подразумевается насыщенный углеводород (неразветвленный или разветвленный), в котором с каждого из концевых атомов углерода удален атом водорода. Примерами таких групп (предполагается, что указанная длина охватывает конкретный пример) яв 15 ляются метилен, этилен, пропилен, бутилен,пентилен, гексилен, гептилен. Под галогеном- подразумевается хлор-,бром-, йод- или фтор-. Под алкилом подразумевается неразветвленный насыщенный углеводород или разветвленный насыщенный углеводород. Примерами таких алкильных групп (предполагается, что указанная длина охватывает конкретный пример) являются метил, этил, пропил, изопропил,бутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изопентил, неопентил, трет-пентил, 1-метилбутил, 2 метилбутил, 3-метилбутил, гексил, изогексил,гептил и октил. Под алкокси подразумевается неразветвленный насыщенный алкил или разветвленный насыщенный алкил, связанный через окси. Примерами таких алкоксигрупп (предполагается, что указанная длина охватывает конкретный пример) являются метокси, этокси, пропокси, изопропокси,бутокси, изобутокси, трет-бутокси, пентокси, изопентокси, неопентокси, трет-пентокси, гексокси,изогексокси, гептокси и октокси. Если не оговорено особо, группировка(например, простое указание заместителя, такого как R1, в подродовом или зависимом пункте формулы изобретения не означает, что Ar всегда замещен группировкой R1, если не сформулировано, что группировка Ar замещена R1). Следует понимать, что если карбоциклическая или гетероциклическая группировка могут быть связаны или иным образом присоединены к обозначенному субстрату посредством различающихся кольцевых атомов без обозначения конкретного места присоединения, то подразумеваются все возможные положения, посредством ли атома углерода, или, например, посредством трехвалентного атома азота. Например, термин "пиридил" означает 2-, 3- или 4-пиридил, термин "тиенил" означает 2- или 3-тиенил и так далее. Выражение "фармацевтически приемлемая соль" относится к нетоксичным анионным солям, содержащим анионы, такие как (но не ограничены ими) хлорид, бромид, йодид, сульфат,бисульфат, фосфат, ацетат, малеат, фумарат,оксалат, лактат, тартрат, цитрат, глюконат, метансульфонат и 4-толуолсульфонат. Это выражение также относится к нетоксичным катионным солям, таким как (но не ограничены ими) соли натрия, калия, кальция, магния, аммония или соли протонированных бензатина (N,N'дибензилэтилендиамина), холина, этаноламина,диэтаноламина, этилендиамина, мегламина (Nметилглюкамина), бенетамина (N-бензилфенетиламина), пиперазина или трометамина (2 амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола). Выражения "реакционно-инертный растворитель" и "инертный растворитель", используемые в этом документе, относятся к растворителю, который не взаимодействует с исходными веществами, реагентами, промежуточными со 005161 16 единениями или продуктами в такой степени,чтобы неблагоприятно действовать на выход требуемого продукта. Заключенный в скобки знак минус или плюс, используемый в этом документе в номенклатуре, обозначает направление, в котором конкретный стереоизомер вращает плоскость поляризованного света. Химику средней квалификации будет ясно,что некоторые соединения по данному изобретению будут содержать один или более чем один атом, который может находиться в конкретной стереохимической или геометрической конфигурации, что приводит к стереоизомерам и конфигурационным изомерам. Все такие изомеры и их смеси охвачены данным изобретением. Охвачены также гидраты соединений по данному изобретению. Химику средней квалификации будет ясно,что некоторые комбинации заместителей, содержащих гетероатом, перечисленные в данном изобретении, определяют соединения, которые будут менее стабильны в физиологических условиях (например соединения, содержащие ацетальную или аминальную связи). Соответственно, такие соединения менее предпочтительны. ДТТ означает дитиотреит. ДМСО означает диметилсульфоксид. ЕДТА означает этилендиаминтетрауксусную кислоту. Результатом способов и соединений по данному изобретению является образование кости, приводящий к снижению процента переломов. Данное изобретение вносит значительный вклад в технику, предлагая соединения и способы, которые усиливают образование кости, результатом которого является предупреждение, задержка и/или регрессия остеопороза и родственных костных расстройств. Другие особенности и преимущества будут очевидны из подробного описания изобретения и формулы изобретения. Подробное описание изобретения Вообще, соединения по данному изобретению можно получать способами, которые включают в себя способы, известные в химической технике, особенно в свете описания, которое содержится в этом документе. Некоторые способы получения соединений по данному изобретению предложены в качестве дополнительных особенностей изобретения и иллюстрируются следующими схемами реакций. Другие способы могут быть описаны в экспериментальной части. Некоторые заместители (например, карбоксил) лучше всего могут быть получены посредством превращения другой функциональной группы (примерами для карбоксила являются гидроксил или карбоксальдегид) на более поздней стадии последовательности синтеза. Вообще, соединения формулы I могут быть получены последовательным алкилированием амида двумя соответствующими алкилга 17 логенидами; или восстановительным аминированием амина, содержащего необходимую кислотную функциональную группу (подходящим образом защищенную), альдегидом с последующим взаимодействием с ацилирующим агентом, с последующим гидролизом. Обычно, соединения формулы I могут быть получены в соответствии со способами, изображенными на схемах 1 и 2, приведенных ниже. Как правило, последовательности включают в себя последовательное алкилирование соответствующего амида формулы 1 двумя соответствующими алкилгалогенидами или алкилсульфонатами. Следует отметить, что схемы 1 и 2 различаются только порядком присоединения двух алкилирующих агентов. Обычно, порядок алкилирования выбирают в зависимости от реакционной способности электрофильной боковой цепи. Для того, чтобы уменьшить степень диалкилирования, которое происходит на первой стадии алкилирования, первой обычно вводят менее реакционноспособную электрофильную боковую цепь. Один из алкилирующих агентов обычно содержит карбоновую кислоту или изостерное соединение кислоты, замаскированные подходящим образом соответствующей защитной группой. На схемах 1 и 2 предшественником кислоты формулы 3 является эфир карбоновой кислоты, где R представляет собой или неразветвленный низший алкил, предпочтительно метильную или этильную, или третбутильную, или фенильную группу. Другие кислотные изостеры можно использовать путем соответствующего видоизменения этих схем с использованием способов, известных квалифицированным специалистам, (например схема 6, которая описывает получение тетразола). Типичными алкилирующими агентами являются первичные,вторичные, бензильные или аллильные, и предпочтительно, алкилбромиды или алкилйодиды. Амид формулы 1 превращают в его анион с использованием сильного основания, такого как гидрид натрия, диизопропиламид лития, бис (триметилсилил)амид лития, бис(триметилсилил) амид калия, трет-бутилат калия и т.д., в апротонном растворителе, таком как диметилформамид, тетрагидрофуран (ТГФ) или смесь диметилформамид/бензол, при температуре от приблизительно-78 С до приблизительно 100 С. Полученный анион алкилируют соответствующим алкилгалогенидом или алкилсульфонатом формулы 2 или 3(где X' представляет собой галогенид или сульфонат) при температуре от приблизительно 0 С до приблизительно 0 С с образованием соответствующего алкилированного соединения формулы 4 или 5. В некоторых случаях в результате диалкилирования амида или сульфонамида получают разные количества побочного продукта, которые могут быть удалены с использованием хроматографических методик, предпочтительно флэшхроматографией (W.C. Still, M. Kahn, A. Mitra, J. 18 подходящего основания, такого как гидрид натрия, бис(триметилсилил)амид лития, диизопропиламид лития, бис(триметилсилил) амид калия,трет-бутилат калия или карбонат калия, в апротонном растворителе, таком как диметилформамид, тетрагидрофуран (ТГФ), смесь диметилформамид/бензол или ацетон, при температуре от приблизительно -78 С до приблизительно 100 С. Алкилирование (такое, как описано выше) соответствующим вторичным алкилгалогенидом или алкилсульфонатом (соединение формулы 3 или 2) дает соответствующий сложный эфир формулы 6. Сложный эфир формулы 6 гидролизуют до соответствующей кислоты формулы I (в случаях, где R представляет собой метил или этил) в разбавленном водном основном растворе (предпочтительно гидроксиде натрия или калия в водном этаноле или метаноле), гидроксиде лития в водноспиртовом растворителе, водном тетрагидрофуране при температуре от приблизительно 0 С до приблизительно 80 С, или описанными способами Соединения формулы I также могут быть получены из аминов (например, схемы 3-4). Обычно соответствующие исходные амины (соединения формул 9 и 10) являются промышленными продуктами или могут быть получены способами, известными квалифицированным специалистам ("The Chemistry of Arnino, Nitroso and NitroWiley, New York, 1982). Например, в соответствии со схемами 3 и 4 исходные амины могут быть получены из соответствующих нитрилов формулы 7 и 8. Нитрилы являются или коммерчески доступ 19 ными, или могут быть получены способами, известными квалифицированным специалистам(Rappaport, "The Chemistry of the Cyano Group",Interscience, New York, 1970; Patai and Rappaport,"The Chemistry of Functional Groups", pt.2, Wiley,New York, 1983). Нитрил формулы 7 или 8 восстанавливают таким восстановителем, как комплекс боран-тетрагидрофуран,комплекс боранметилсульфид, алюмогидрид лития, или гидрируют в присутствии никеля Ренея или платинового или палладиевого катализатора в протонном растворителе, таком как метанол или этанол, при температуре от прибилизительно 0 до приблизительно 50 С. Полученный амин формулы 9 или 10 превращают или в сульфонамид, или в амид формулы 11 или 12 обработкой (ацилированием) хлорангидридом или сульфонилхлоридом в присутствии слабого основания, такого как триэтиламин,пиридин или 4-метилморфолин, в апротонном растворителе, таком как метиленхлорид или диэтиловый эфир, при температуре от приблизительно -20 до приблизительно 50 С. Альтернативно, для получения соединений формулы 11 или 12 сочетание аминов формул 9 или 10 с карбоновыми кислотами удобно проводить в инертном растворителе, таком как дихлорметан или N,Nдиметилформамид (ДМФ), при помощи такого реагента для реакции сочетания, как гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида(ГБТ). В случае, когда амин существует в виде гидрохлоридной соли, к реакционной смеси предпочтительно добавляют один эквивалент подходящего основания, такого как триэтиламин. Альтернативно, сочетание можно осуществлять с таким реагентом для реакции сочетания, как гексафторфосфат бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония (БОФ) в инертном растворителе, таком как метанол. Такие реакции сочетания обычно проводят при температурах от приблизительно -30 до приблизительно 80 С, предпочтительно от 0 до 25 С. Изучены другие условия для получения пептидов реакцией сочетания(Houben-Weyl, Vol. XV, part II, Е. Wunsch, Ed.,George Theime Verlag, 1974, Stuttgart). Алкилирование и, если требуется, реакция снятия защиты с соединения формулы 11 или 12, как изображено на схемах 1 и 2, приводит к соответствующей кислоте - соединению формулы 13 и 14. Амины формулы 9 и 10 также могут быть получены восстановлением амидов формулы 15 и 16. Восстановление можно успешно выполнять с использованием таких реагентов, как комплекс боран-тетрагидрофуран, комплекс боран-метилсульфид или гидрид диизобутилалюминия, в апротонном растворителе, таком как тетрагидрофуран или диэтиловый эфир, при температуре от прибилизительно -78 до приблизительно 60 С. Амины формулы 9 и 10 также могут быть получены из соответствующих нитро-предшест 005161 20 венников восстановлением нитрогруппы с использованием таких восстановителей, как цинк/HCl, гидрированием в присутствии никеля Ренея, палладиевого или платинового катализатора, и других реагентов (P.N. Rylander "Hydrogenation Methods", Academic Press, New York,1985). СХЕМА 3 Описание и получение других аминов и алкилирующих агентов, пригодных для упомянутых выше синтезов, описаны ниже в разделе Препараты. Альтернатива к описанной выше химии алкилирования для получения соединений формулы I включает в себя восстановительное аминирование амина, содержащего необходимую кислотную функциональную группу (подходящим образом защищенную), альдегидом, и показана на схеме 5. Альтернативно, альдегид может содержать кислотную функциональную группу для сочетания с амином. 21 Восстановительное аминирование обычно проводят таким восстановителем, как цианоборогидрид натрия или триацетоксиборогидрид натрия, предпочтительно при рН от 6 до 8. Реакцию обычно проводят в протонном растворителе, таком как метанол или этанол, при температурах от приблизительно -78 С до приблизительно 40 С(A. Abdel-Magid, С. Maryanoff, К. Carson, Tetrahedron Lett. 39, 31, 5595-5598, 1990). Другие условия включают в себя использование изопропилата титана и цианоборогидрида натрия (R.J. Mattson etal, J. Org. Chem. 1990, 55, 2552-4) или предварительное образование имина в условиях дегидратации, а затем восстановление. Полученный амин формулы 42, 42 А превращают в требуемый амид реакцией сочетания с хлорангидридом или карбоновой кислотой, как изображено на схемах 3 и 4. Если требуется, то гидролиз дает соответствующую кислоту. СХЕМА 5 Описание и использование альдегидов,пригодных в упомянутой выше схеме 5, можно обнаружить в разделе Препараты. Альтернативно, другой способ получения некоторых соединений формулы I (т.е. тетразолов формулы 60, где В представляет собой N, а А, K, М и Q являются такими, как описано выше) изображен на схеме 6. Для того, чтобы получить соединения формулы 59, исходный сульфонамид или амид формулы 4 алкилируют соответствующим алкилгалогенидом или сульфонатом (где X' представляет собой галогенид 22 или сульфонат), предпочтительно первичным,вторичным, бензильным или аллильным алкилбромидом, йодидом или сульфонатом, который содержит нитрил. Алкилирование успешно поводят обработкой соединения формулы 59 основанием, таким как гидрид натрия, бис(триметилсилил)амид лития, бис(триметилсилил)амид калия, трет-бутилат калия или карбонат калия, в апротонном растворителе, таком как диметилформамид, смесь диметилформамид/ бензол или ацетон. Алкилирование происходит при температуре от приблизительно -78 до приблизительно 100 С. Предпочтительные условия для превращения полученного нитрила в тетразол формулы 60 включают в себя обработку оксидом дибутилолова и триметилсилилазидом в толуоле при нагревании с обратным холодильником (S.J.Wittenberger and B.G. Donner, J. Org. Chem. 1993, 58, 4139-4141, 1993). Обзор альтернативных способов получения тетразолов смотри в R.N. Butler, Tetrazoles,Comprehensive Chemistry; Potts. K.T. Ed.; Pergamon Press: Oxford, 1984, Vol.5, pp 791-838. СХЕМА 6 Альтернативно, другой способ получения некоторых соединений формулы I изображен на схеме 7. Сложные эфиры формулы 46 могут быть получены с использованием методик, описанных ранее (схемы 1 и 2). Последующее Heck сочетание этого промежуточного соединения с арилгалогенидом (предпочтительно арилбромидом или арилйодидом), арилтрифлатом или с кольцевой системой, которая содержит винилбромид, йодид или трифлат, выполняют с палладиевым катализатором, таким как ацетат палладия или тетракис(трифенилфосфин)палладий(0), в присутствии триалкиламина, такого как триэтиламин. В некоторых случаях в реакционную смесь может быть добавлен триарилфосфин. Реакцию обычно осуществляют в апротонном растворителе, таком как диметилформамид или ацетонитрил, при температуре от приблизительно 0 до приблизительно 150 С (R.F. Heck,Сomp. Org. Syn., Vol. 4, Ch. 4.3, р. 833; Davesand Hallberg, Chem. Rev. 1989, 89, 1433). Если требуется, то соединения формулы 47 могут быть гидролизованы до соответствующей ки 23 слоты. Альтернативно, соединения формулы 47 можно гидрировать и, если требуется, далее гидролизовать до соответствующей кислоты формулы 49. Предпочтительные условия гидрирования включают в себя использование палладиевого или платинового катализатора в спиртовом растворителе, таком как этанол или метанол, при температуре от приблизительно 0 до приблизительно 50 С. В случаях, когда М представляет собой частично насыщенную кольцевую систему, гидрирование будет приводить к насыщенной кольцевой системе. СХЕМА 7 Альтернативно, другой способ получения некоторых соединений формулы I (где R является таким, как описан для схем 1 и 2) изображен на схеме 8. Соединения формулы 51 могут быть получены, как изображено на схемах 1 и 2,алкилированием соединений формулы 5 электрофилом формулы 2, который содержит соответствующую функциональную группу на кольце М, для последующего превращения в альдегид. Например, электрофилы формулы 2 (схема 2) могли бы содержать защищенную спиртовую группу на кольце М, с которой после алкилирования, можно снять защиту и окислить до альдегида с использованием реагентов, известных квалифицированным специалистам, с образованием соединений формулы 51. Альтернативный способ заключается в алкилировании электрофилом формулы 2, где М содержит винильную группу. После алкилирования окислительное расщепление двойной связи дает требуемый альдегид формулы 51. Окислительное расщепление можно выполнить каталитическим превращением двойной связи в 1,2-диол оксидом осмия (IX) и N-метилморфолином, а затем окислительным расщеплением до альдегида с использованием периодата натрия. Альтернативно, окислительное расщепление через озонолиз, а затем восстановление с использованием таких реагентов, как метилсульфид, трифенилфосфин, цинк/ уксусная кислота или тиомочевина, будет приводить к требуемому альдегиду 24 формулы 51. Присоединение LMetal, где LMetal представляет собой любой металлорганический реагент, такой как литийорганический реагент или реагент Гриньяра, в апротонном растворителе, таком как диэтиловый эфир или тетрагидрофуран, при температуре от приблизительно-78 до приблизительно 80 С, а затем гидролиз сложного эфира, как описано выше, приводит к соединению формулы 50. СХЕМА 8 Альтернативно, другой способ получения некоторых соединений формулы I изображен на схеме 9. Соответствующий амид формулы 5 алкилируют в условиях, изображенных на схемах 1 и 2, электрофилом, который содержит ароматический бромид или йодид или кольцевую систему, которая содержит винилбромид или йодид (Аr1) с образованием соединений формулы 53. Сочетание Сузуки-типа соединения формулы 53 с арилбороновой кислотой(Ar2) дает соединения формулы 53 а (обзор Сузуки-реакции: A.R. Martin and Y. Yang, ActaChem. Scand., 1993, 47, 221). Реакцию сочетания успешно выполняют с использованием приблизительно двух эквивалентов основания, такого как карбонат натрия, карбонат калия, гидроксид натрия, гидроксид таллия, фосфат калия или метилат натрия, в присутствии палладиевого катализатора, такого как тетракис(трифенилфосфин)палладий(0), ацетат палладия, хлорид палладия,трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) или [1,4-бис(дифенилфосфин)бутан] палладий(0). Реакция может протекать в водноспиртовых растворителях (метанол или этанол),водном тетрагидрофуране, водном ацетоне,водном диметиловом эфире гликоля или водном бензоле при температурах в пределах от приблизительно 0 до приблизительно 120 С. Когда Аr1 представляет собой частично насыщенное кольцо, то, для того, чтобы получить насыщенную кольцевую систему, на этой стадии выполняют восстановление кольца. Условия для выполнения этого превращения включают в себя гидрирование в присутствии катализатора, такого как палладий или платина, в спиртовом растворителе (этанол или метанол) и/или этилацетате. Эфирный гидролиз соединений формулы 53 а, если требуется, дает соответствующую кислоту. Полученные кислоты могут содержать функциональные группы на любой из кольцевых систем (Ar1 или Ar2), которые можно изменять способами, известными квалифицирован 25 ным специалистам. Примеры таких изменений показаны на схеме 10. СХЕМА 9 26 соединением такого агента для реакции сочетания, как трифенилфосфин и диэтилазодикарбоксилат (ДЭАД) или диизопропилазодикарбоксилат, в инертных растворителях, таких как метиленхлорид или тетрагидрофуран, при температуре от приблизительно 0 до приблизительно 80 С. Если требуется, то последующий гидролиз приводит к соответствующей кислоте. СХЕМА 11 Соединения формулы 54, которые содержат альдегидную функциональную группу, могут быть получены способами, изображенными на схемах 8 и 9. В соответствии со схемой 10 обработка соединения формулы 54 соответствующим металлорганическим реагентом(LМеталл), таким как литиийорганический реагент или реагент Гриньяра, в апротонном растворителе, таком как диэтиловый эфир или тетрагидрофуран, при температуре то приблизительно -78 до приблизительно 80 С, а затем гидролиз сложного эфира дают соединения формулы 56 (где В представляет собой N, a A, Q и K являются такими, как описано в разделе Сущность изобретения, и Аr1 и Ar2 являются такими, как описано на схеме 9). Альтернативно, восстановление альдегида, а затем гидролиз дают соединения формулы 55. СХЕМА 10 Альтернативно, другой способ получения некоторых соединений формулы I (т.е. соединений формулы 106, где R является таким, как описано на схемах 1 и 2, и соответственно аналогичных кислот) изображен на схеме 12. Соединение формулы 12 присоединяют к соединению формулы 105 (где Х представляет собой ароматическое кольцо, такое как бензольное кольцо или тиофеновое кольцо) в присутствии кислоты Льюиса, такой как тетрахлорид титана,или неорганической кислоты, такой как соляная кислота. Если требуется, то сложный эфир формулы 106 можно превратить в соответствующую кислоту гидролизом или реакцией снятия защиты. СХЕМА 12 Альтернативно, другой способ получения некоторых соединений формулы I (т.е. соединений формулы 57, где R является таким, как описано на схемах 1 и 2, и соответственно аналогичных кислот) изображен на схеме 11. Исходный спирт формулы 58 может быть получен способом, изображенным на схемах 1 и 2. Промежуточное соединение 58 сочетается с множеством ароматических спиртов (М представляет собой ароматическое кольцо) в условиях Mitsonobu (О. Mitsonobu, Synthesis, 1, 1981). Обычно реакцию сочетания успешно выполняют при Альтернативно, другой способ получения некоторых соединений формулы I (т.е. соединений формулы 107 или 108 и соответственно аналогичных кислот) изображен на схеме 13. Хлорметильные соединения формулы 104 обрабатывают соответствующей системой замещенных ароматических колец, М, такой как 4 этоксибензол или тиофен, в присутствии кислоты Льюиса, такой как тетрахлорид титана, или неорганической кислоты, такой как соляная кислота, в апротонном растворителе, таком как хлороформ, при температуре от приблизительно 0 до приблизительно 80 С с образованием соединения формулы 107, которое впоследствии можно подвергнуть гидролизу или реакции снятия защиты, как описано выше, с образованием соответствующей кислоты. Альтернативно,хлорметильные соединения формулы 104 можно обработать кислотой Льюиса, такой как тетрахлорид титана, и подходящим образом замещен винилсиланом в апротонном растворителе, 27 таком как метиленхлорид, при температуре от приблизительно -50 С до приблизительно 50 С с образованием соединений формулы 108, которые впоследствии можно подвергнуть гидролизу или реакции снятия защиты, как описано выше, с образованием соответствующей кислоты. Если требуется, то восстановление двойной связи можно выполнять при условиях, изображенных на схеме 7. СХЕМА 13 Альтернативно, другой способ получения некоторых соединений формулы I (т.е. соединений формулы 109 и, следовательно, соответствующих кислот) изображен на схеме 14. Хлорметильные соединения формулы 104 обрабатывают кислотой Льюиса, такой как тетрахлорид титана, и подходящим образом замещенным аллилсиланом в апротонном растворителе, таком как хлороформ, при температуре от приблизительно 0 С до приблизительно 80 С с образованием соединений формулы 109, которые впоследствии можно подвергнуть гидролизу или реакции снятия защиты, как описано выше. СХЕМА 14 Альтернативно, другой способ получения некоторых соединений формулы I (т.е. соединений формулы 112 и, следовательно, соответствующих кислот) изображен на схеме 15. Хлорметильные соединения формулы 104 обрабатывают сульфиновой кислотой формулы 111 в присутствии основания, такого как триэтиламин, в апротонном растворителе, таком как хлороформ, при 28 температуре от приблизительно -30 до приблизительно 50 С с образованием соединений формулы 112, которые впоследствии можно подвергнуть гидролизу или реакции снятия защиты, как описано выше, с образованием соответствующей кислоты. СХЕМА 15 Препараты Амины, Амиды и Сульфонамиды Некоторые амиды или сульфонамиды формул 21, 22 и 23 (где W и Z являются такими, как описано в разделе Сущность изобретения, а Х и М являются ароматическими или насыщенными кольцевыми системами) могут быть получены в соответствии со схемой 18. Алкиниламиды или сульфонамиды формул 25, 26 и 27 получают реакцией сочетания алкинилсульфонамида или амида формулы 24 с ароматическим или винилгалогенидом, предпочтительно ароматическим или винилбромидом или йодидом (где W и Z являются такими, как определено выше, и где Х и М представляют собой ароматическую или частично насыщенную кольцевую систему). Реакцию сочетания обычно выполняют в присутствии йодида меди, палладиевого катализатора, такого как хлорид палладия, дихлорид бис(трифенилфосфин) палладия или тетракис(трифенилфосфин) палладий(0), и амина, такого как триэтиламин, диизопропиламин или бутиламин, в апротонном растворителе, таком как ацетонитрил, при температуре от приблизительно 0 С до приблизительно 100 С. Полученные алкины формулы 25, 26 и 27 можно превратить в соответствующие алканы формулы 21, 22 или 23 гидрированием в присутствии палладиевого или платинового катализатора и в растворителях, таких как метанол, этанол и/или этилацетат, при температуре от приблизительно 0 С до приблизительно 50 С. Альтернативно, алкин можно превратить в цис-алкен с использованием Lindlar катализатора (Pd-СаСО 3 РbО). В случае, где М представляет собой частично насыщенную кольцевую систему, гидрирование будет превращать М в полностью насыщенную кольцевую систему. Алкилирование и реакция снятия защиты, как изображено на схемах 1 и 2, приводят к соответствующим соединениям формулы I. В соответствии со схемой 19 соединения формулы 33 (где А и Х являются такими, как описано в разделе Сущность изобретения) могут быть получены из подходящего амина формулы 32 (например метоксиарилалкиламина). Амины формулы 32 являются коммерчески доступными или могут быть получены способами, известными квалифицированным специалистам (например схема 4), и их превращают в амиды или сульфонамиды формулы 31 способами, например, изображенными на схемах 3 и 4. Полученный сложный ароматический метиловый эфир формулы 31 подвергают реакции снятия защиты при помощи таких реагентов, как трибромид бора, гидрохлорид пиридиния, бромоводород/уксусная кислота, или других описанных в литературе реагентов (Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, T.W. Greene andP.G.M. Wuts, John Wiley and Sons, Inc., 1991). Алкилирование сложным бромалкиловым эфиром с использованием мягкого основания, такого как карбонат калия, в апротонном растворителе, таком как диметилформамид или ацетон,при температуре от приблизительно 0 С до приблизительно 100 С приводит к требуемому амиду или сульфонамиду формулы 33. СХЕМА 19 Алкилирующие агенты Для синтеза требуемых алкилирующих агентов, используемых в вышеупомянутых методиках, существуют многочисленные способы,которые известны квалифицированным специалистам ("The Chemistry of the Carbon-HalogenAzides", Eds. S. Patai and Z. Rappaport, J. Wiley,New York, 1983). Некоторые примеры изображены на схемах 20-26. Как изображено на схеме 30 20, толильные или аллильные субстраты можно превратить галогенированием в бензил- или аллилбромиды (где М, X, W и Z являются такими, как указано выше). Эту реакцию обычно выполняют N-бромсукцинимидом (БСИ) в присутствии инициатора радикалов, такого какAIBN или пероксид, предпочтительно перекись бензоила. Альтернативно, реакцию может инициировать свет. Реакцию проводят в инетном растворителе, таком как четыреххлористый углерод или хлороформ, при температуре от приблизительно 50 до приблизительно 100 С. СХЕМА 20 Схема 21 показывает синтез алкилирующих агентов, используемых для получения соединений формулы I, где Ar представляет собой биарильную или арилциклическую группу. Сочетание Сузуки-типа арилйодида или бромида или кольцевой системы, содержащей винилбромид или йодид (Ar2) с метиларилбороновой кислотой (Ar1) при условиях, изображенных на схеме 9, дает соединения формулы 34. В случае,когда применяют винилбромид или йодид, соединения формулы 34 можно восстанавливать с образованием полностью насыщенного кольца. Восстановление выполняют гидрированием в присутствии палладиевого или платинового катализаторов, обычно в протонных растворителях (метаноле или этаноле), тетрагидрофуране или этилацетате. Галогенирование метильной группы с использованием реагентов и при условиях, как описано в схеме 20, дает алкилирующие агенты формулы 35. СХЕМА 21 Другим общепринятым способом для получения алкилгалогенидов является галогенирование спирта или производного спирта. Спирты являются коммерчески доступными, или они могут быть получены способами, известными квалифицированным специалистам. Например,на схеме 22 карбоновую кислоту или эфир восстанавливают до спирта с использованием таких реагентов, как борогидрид натрия, алюмогидрид лития, комплекс боран-тетрагидрофуран, комплекс боран-метилсульфид, и т.д. Соответствующие алкилхлориды обычно получают из спиртов при помощи таких реагентов, как хлороводород, тионилхлорид, пентахлорид фосфо 31 ра, хлорангидрид фосфорной кислоты или трифенилфосфин/четыреххлористый углерод. Для получения алкилбромидов спирт обычно обрабатывают такими реагентами, как бромоводород, трибромид фосфора, трифенилфосфин/ бром или карбонилдиимидазол/аллилбромидBull. 1983, 38, 4189). Для получения алкилйодидов спирт обычно подвергают взаимодействию с такими реагентами, как трифенилфосфин/йод/имидазол или йодоводород. Алкилхлориды можно превращать в более реакционноспособные алкилбромиды или алкилйодиды обработкой неорганической солью, такой как бромид натрия, бромид лития, йодид натрия или йодид калия, в растворителях, таких как ацетон или метилэтилкетон. Алкилсульфонаты также можно применять в качестве электрофилов или можно превращать в алкилгалогениды. Сульфонаты получают из спирта с использованием мягкого основания, такого как триэтиламин или пиридин, и сульфонилхлорида в инертном растворителе, таком как метиленхлорид или диэтиловый эфир. Превращение в галогенид выполняют обработкой неорганическим галогенидом Коричные кислоты или сложные эфиры являются коммерчески доступными и их можно превращать в алкилирующие агенты формулы 37 или 38 следующим образом (схема 23). Производные коричной кислоты или сложного эфира восстанавливают в присутствии палладиевого или платинового катализаторов обычно в протонных растворителях (например метаноле или этаноле), тетрагидрофуране или этилацетате. Восстановление и превращение в алкилгалогенид или сульфонат, как изображено на схеме 22, дает соединение формулы 38. Если возможно, то коричные кислоты или сложные эфиры прямо превращают в спирты формулы 39 обработкой такими реагентами, как алюмогидрид лития, в инертных растворителях, таких как тетрагидрофуран или диэтиловый эфир. Альтернативно, коричную кислоту или сложный эфир можно восстанавливать до аллильного спирта формулы 40 с использованием таких реагентов, как алюмогидрид лития/хлорид алюминия, гидрид диизобутилалюминия или борогидрид лития. Превращение в аллилгалогенид или сульфонат, как изображено на схеме 22,дает реагенты формулы 37. Получение алкилирующих агентов формулы 41 (где W и М являются такими, как описано выше) изображено на схеме 24. Соединения формулы 42 алкилируют рядом оснований, выбор которых зависит от природы W и М. Некоторыми предпочтительными основаниями являются гидроксид натрия, гидрид натрия, диизопропиламид лития, бис(триметилсилил)амид лития, бис(триметилсилил)амид калия и третбутилат калия и т.д. Обработка полученного аниона рядом диалкилгалогенидов приводит к требуемым алкилирующим агентам формулы 41. Для получения соединений, где W представляет собой кислород, и М представляет собой ароматическое кольцо, предпочтительные условия включают в себя образование с гидроксидом натрия аниона алкоголята, а затем присоединение дигалогеналкана, например дибромалкана. Реакцию обычно выполняют в воде при от приблизительно 75 до приблизительна 25 С. СХЕМА 24 Альдегиды, применяемые для химии, описанной на схеме 5, являются коммерчески доступными или могут быть получены из доступных промежуточных соединений способами,известными квалифицированным специалистам. Схема 25 показывает типичный способ, используемый для получения оксиальдегидов формулы 43 (где М в схеме 5 содержит алкильную группу, замещенную гидрокси). Обработка диальдегида, где один из альдегидов защищен в виде ацетали формулы 44 (где OR группы являются традиционными заместителями, используемыми в ацетальной защитной группе), металлорганическим реагентом (LМеталл), предпочтительно литийорганическим реагентом или реагентом Гриньяра, в инертном растворителе, таком как тетрагидрофуран или диэтиловый эфир, дает соединения формулы 45. Последующий гидролиз ацетали в мягкой кислой среде, например,разбавленной соляной кислоте, смоле Amberlyst-15, силикагеле или других реагентах, дает 33 требуемые оксиальдегиды формулы 43 ("Protecting Groups in Organic Synthesis", Second Edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, John Wiley Хлорметильные промежуточные соединения Промежуточные хлорметильные соединения могут быть получены, как изображено на схемах 26 и 27. Обычно, соответствующий сульфонамид или карбоксамид формулы 101 или 103 обрабатывают эквивалентом формальдегида, таким как параформальдегид, в инертном органическом растворителе, таком как метиленхлорид или хлороформ, с подходящим катализатором, таким как HCl, хлорид цинка или триметилсилилхлорид, при температурах в пределах от приблизительно 0 до приблизительно 60 С с образованием хлорметильных производных формулы 102 и 104, соответственно. СХЕМА 26 Квалифицированным специалистам будет ясно, что антирезорбтивные агенты (например прогестины, полифосфонаты, бифосфонат(ы),агонисты/антагонисты эстрогена, эстроген, комбинации эстроген/прогестин, Premarin, эстрон,эстриол или 17- или 17-этинилэстардиол) можноприменять вместе с соединениями по данному изобретению. Типичные прогестины являются коммерчески доступными и включают в себя: алгестон ацетофенид, алтреногест, амадинонацетат, ана 005161 34 гестонацетат, хлормадинонацетат, цингестол,клогестонацетат, кломегестонацетат, делмадинонацетат, десогестрел, диметистерон, дидрогестерон, этинерон, этинодиолдиацетат, этоногестрел, фторгестонацетат, гестацион, гестоден,гестоноронкапроат, гестринон, галогенпрогестерон, гидроксипрогестеронкапроат, левоноргестрел, линестренол, медрогестон, медроксипрогестеронацетат, меленгестролацетат, метинодиолдиацетат, норетиндрон, норетиндронацетат, норетинодрел, норгестимат, норгестомет,норгестрел, оксогестонфенпропионат, прогестерон, хингестанолацетат, хингестрон и тигестол. Предпочтительными прогестинами являются медроксипрогестерон, норетиндрон и норетинодрел. Типичные полифосфонаты, ингибирующие резорбцию кости, включают в себя полифосфонаты известного типа (патент США 3683080,выданный 8 августа 1972, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Предпочтительными полифосфонатами являются геминальные дифосфонаты(также называемые бисфосфонаты). Динатрийтилудронат является особенно предпочтительным полифосфонатом. Ибандроновая кислота является особенно предпочтительным полифосфонатом. Алендронат является особенно предпочтительным полифосфонатом. Другими предпочтительными полифосфонатами являются 6 амино-1-гидроксигексилиденбисфосфоновая кислота и 1-гидрокси 3(метилпентиламино)пропилиденбисфосфоновая кислота. Полифосфонаты можно вводить в виде кислоты, или в виде растворимой соли щелочного металла, или щелочно-земельного металла. Также включают гидролизуемые сложные эфиры полифосфонатов. Конкретные примеры включают в себя этан-1-гидрокси 1,1-дифосфоновую кислоту,метандифосфоновую кислоту, пентан-1-гидрокси-1,1-дифосфоновую кислоту, метандихлордифосфоновую кислоту, метангидроксидифосфоновую кислоту, этан-1-амино-1,1-дифосфоновую кислоту, этан-2-амино-1,1-дифосфоновую кислоту, пропан-3-амино-1-гидрокси-1,1 дифосфоновую кислоту, пропан-N,N-диметил-3 амино-1-гидрокси-1,1-дифосфоновую кислоту,пропан-3,3-диметил-3-амино-1-гидрокси-1,1-дифосфоновую кислоту, фениламинометандифосфоновую кислоту, N,N-диметиламинометандифосфоновую кислоту, N(2-гидроксиэтил) аминометандифосфоновую кислоту, бутан-4 амино-1-гидрокси-1,1-дифосфоновую кислоту,пентан-5-амино-1-гидрокси-1,1-дифосфоновую кислоту,гексан-6-амино-1-гидрокси-1,1-дифосфоновую кислоту, и их фармацевтически приемлемые сложные эфиры и соли. В частности, соединения по данному изобретению могут быть объединены с агонистом/антагонистом эстрогена у млекопитающего. Любой агонист/антагонист эстрогена можно применять в качестве второго соединения по 35 данному изобретению. Термин агонист/ антагонист эстрогена относится к соединениям, которые связываются с рецептором эстрогена, ингибируют обновление кости и предупреждают потерю кости. В частности, в этом документе агонисты эстрогена определены как химические соединения, которые способны связываться с сайтами рецептора эстрогена в ткани млекопитающего и имитировать действия эстрогена в одной или более чем одной тканях. В этом документе антагонисты эстрогена определены как химические соединения, которые способны связываться с сайтами рецептора эстрогена в ткани млекопитающего, и блокировать действия эстрогена в одной или более чем одной тканях. Квалифицированные специалисты легко определяют такие активности по данным стандартных анализов, включая анализ связывания с рецептором эстрогена, стандартными костными гистоморфометрическими и денситометрическими методами (Eriksen E.F. et. al, Bone Histomorphometry, Raven Press, New York, 1994, pages 1-74; Grier S.J. et. al., The Use of Dual-Energy XRay Absorptiometry In Animals, Inv. Radiol.,1996, 31(1):50-62; Wahner H.W. and Fogelman I.,The Evaluaton of Osteoporosis: Dual-Energy XRay Absorptiometry in Clinical Practice., MartinDunitz Ltd., London 1994, pages 1-296). Ряд этих соединений описаны и упоминаются ниже. Предпочительным агонистом/антагонистом эстрогена является дролоксифен: (фенол, 3[1-[4[2-(диметиламино)этокси]фенил]-2-фенил 1-бутенил]-, (Е)-) и ассоциируемые с ним соединения (патент США 5047431, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Другим предпочительным агонистом/антагонистом эстрогена является тамоксифен:(этанамин, 2-[4-(1,2-дифенил-1-бутенил)фенокси]-N,N-диметил-, (Z)-2-, 2-гидрокси 1,2,3 пропантрикарбоксилат (1:1 и ассоциируемые с ним соединения (патент США 4536516, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Другим родственным является 4-гидрокситамоксифен (патент США 4623660, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Предпочительным агонистом/антагонистом эстрогена является ралоксифен: (метанон,[6-гидрокси 2-(4-гидроксифенил)бензо[b]тиен-3 ил][4-[2-(1-пиперидинил)этокси]фенил]-, гидрохлорид) (патент США 4418068, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Другим предпочительным агонистом/ антагонистом эстрогена является торемифен: (этанамин,2-[4-(4-хлор-1,2-дифенил-1-бутенил) фенокси]-N,N-диметил-, (Z)-, 2-гидрокси 1,2,3 пропантрикарбоксилат (1:1 (патент США 4996225, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки).(патент США 3822287, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Также предпочтительным является левормелоксифен. Другим предпочительным агонистом/антагонистом эстрогена является идоксифен: пирролидин,1-[-[4-[1-(4-йодфенил)-2-фенил-1 бутенил]фенокси]этил] (патент США 4839155,раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Другим предпочительным агонистом/антагонистом эстрогена является 6-(4 гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-ил-этокси)бензил]нафталин-2-ол (патент США 5484795,раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Другим предпочительным агонистом/антагонистом эстрогена является 4-[2-(2-азабицикло[2.2.1]гепт-2-ил)этокси]фенил-[6-гидрокси 2-(4-гидроксифенил)бензо[b]тиофен-3-ил] метанон (публикация РСТWO 95/10513, переуступленная компании Pfizer Inc.). Другим предпочтительным агонистом/антагонистом эстрогена является GW5638: 3-[4(1,2-дифенилбут-1-енил)фенил]акриловая кислота (Wilson, T.M. and coworkers, Endrocrinology 1997, 138, 9, 3901-3911). Другие предпочтительные агонисты/антагонисты эстрогена включают в себя другие соединения, как они описаны в надлежащим образом переуступленном патенте США 5552412,раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки. Особенно предпочтительными соединениями, описанными в нем, являются: цис-6-(4-фторфенил)-5-[4-(2-пиперидин-1 илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2 ол;(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,б,7,8-тетрагидронафталин-2-ол; цис-1-[6'-пирролидиноэтокси-3'-пиридил]2-фенил-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин; 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-(4"фторфенил)-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин; цис-6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ол и 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-фенил 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин. Описаны другие агонисты/антагонисты эстрогена (патент США 4133814, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Известны производные 2 37 фенил-3-ароилбензотиофена и 2-фенил-3-ароилбензотиофен-1-оксида (патент США 4133814). Квалифицированным специалистам будет ясно, что другие костные анаболические агенты(агенты, увеличивающие костную массу) могут быть использованы в сочетании с соединениями по данному изобретению. Известно, что агентом, наращивающим костную массу, является соединение, которое наращивает костную массу до уровня, который выше, чем порог перелома кости (World Health Organization Study WorldGroup. World Health Organization Technical Series 843"). Любой простагландин или агонист/антагонист простагландина можно применять в качестве второго соединения по данному изобретению (изобретение будет включать в себя применение двух разных соединений формулы I по данному изобретению). Квалифицированные специалисты поймут, что также можно применять IGF-1 с или без IGF-1-связывающего белка 3, фторид натрия, паратиреоидный гормон(ПТГ), активные фрагменты паратиреоидного гормона, гормон роста или средства, стимулирующие секрецию гормона роста. Следующие абзацы более детально описывают типичные вторые соединения по данному изобретению. Любой простагландин можно применять в качестве второго соединения по данному изобретению. Термин простагландин относится к соединениям, которые являются аналогами природных простагландинов PGD1, PGD2, PGE2,PGE1 и PGF2, которые можно применять при лечении остеопороза. Эти соединения связываются с рецепторами простагландина. Квалифицированные специалисты легко определяют такое связывание по данным стандартных анализов (например, An S. et al., Cloning and Expression of the EP2 Subtype of Human Receptors forResearch Communications, 1993, 197(1): 263-270). Простагландины представляют собой алициклические соединения, родственные основному соединению простаноидной кислоте. Атомы углерода основного простагландина нумеруют последовательно от карбоциклического атома углерода по циклопентильному кольцу к концевому атому углерода на соседней боковой цепи. Обычно соседние боковые цепи находятся в транс ориентации. Наличие оксогруппы при С-9 циклопентильной группировки служит признаком простагландина в пределах Е класса,тогда как PGE2 содержит транс ненасыщенную двойную связь по положению C13-C14 и цис двойную связь по положению C5-C6. Известен ряд простагландинов, на которые ссылаются ниже, однако, квалифицированным специалистам будут известны и другие простагландины. Известны типичные простагландины(патент США 4171331 и 3927197, раскрытие которых приводится в настоящем документе посредством ссылки).Essential Fatty Acids 41, 139-150, 1990) является обзором костных анаболических простагландинов. "The In Vivo Anabolic Actions of Prostaglandins in Bone" (Jee and Ma, Bone, 21: 297-304) является современным обзором костного анаболического действия простагландинов. Любой агонист/антагонист простагландина можно применять в качестве второго соединения по данному изобретению. Термин агонист/антагонист простагландина относится к соединениям, которые связываются с рецепторами простагландина (например, J.W. Regan etal., Cloning of a Novel Human Prostaglandin Receptor with Characteristics of the Pharmacologically Defined EP2 Subtype, Molecular Pharmacology, 46: 213-220, 1994) и имитируют действие простагландина in vivo (например стимулируют образование кости и увеличивают костную массу и прочность). Квалифицированные специалисты легко определяют такие действия по данным стандартных анализов (Eriksen E.F. et al.,Bone Histomorphometry, Raven Press, New York,1994, pages 1-74; Grier S.J. et al., The Use of DualEnergy X-Ray Absorptiometry In Animals, Inv.Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice.,Martin Dunitz Ltd., London 1994, pages 1-296). Описан ряд этих соединений, на которые ссылаются ниже, однако, квалифицированным специалистам будут известны и другие агонисты/антагонисты простагландины. Типичные агонисты/антагонисты простагландина раскрыты следующим образом. Известно, что 2-дезкарбокси 2-(тетразол-5 ил)-11-дезокси-15-замещенные-омега-простагландины являются полезными относительно активности образование кости (надлежащим образом переуступленный патент США 3932389, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Известно, что 16-арил-13,14-дигидро-РGЕ 2 п-бифениловые сложные эфиры являются полезными относительно активности образование кости (надлежащим образом переданный патент США 4018892, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Известно, что 2,3,6-замещенные-4-пироны являются полезными относительно активности образование кости (надлежащим образом переданные патенты США 4219483 и 4132847, раскрытие которых приводится в настоящем документе посредством ссылки). Известно, что 16-арил-13,14-дигидро-РGЕ 2 п-бифениловые сложные эфиры являются полезными относительно активности образование кости (патенты США 4000309 и 3982016, рас 39 крытие которых приводится в настоящем документе посредством ссылки). Известно, что замещенные циклопентаны являются полезными относительно активности образование кости (патент США 4621100, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Известно, что циклопентаноны являются полезными относительно активности образование кости (патент США 5216183, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Фторид натрия можно применять в качестве второго соединения по данному изобретению. Термин фторид натрия относится к фториду натрия во всех его формах (например фторид натрия медленного высвобождения, фторид натрия пролонгированного высвобождения). Описан фторид натрия пролонгированного высвобождения (патент США 4904478, раскрытие которого приводится в настоящем документе посредством ссылки). Квалифицированные специалисты легко определяют активность фторида натрия по биологическим протоколам (например, Eriksen E.F. et al., Bone Histomorphometry,Raven Press, New York, 1994, pages 1-74; Grierof Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice., Martin Dunitz Ltd.,London 1994, pages 1-296). Любой паратиреоидный гормон (ПТГ) можно применять в качестве второго соединения по данному изобретению. Термин паратиреоидный гормон относится к паратиреоидному гормону, его фрагментам или метаболитам и его структурным аналогам, которые могут стимулировать образование кости и увеличение костной массы. Также включают пептиды, родственные паратиреоидному гормону, и активные фрагменты и аналоги пептидов, родственных паратиреоидному гормону (WO 94/01460). Квалифицированные специалисты легко определяют такую функциональную активность по данным стандартных анализов (например, EriksenH.W. and Fogelman I., The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice., Martin Dunitz Ltd., London 1994,pages 1-296). Описан ряд этих соединений, на которые ссылаются ниже, однако, квалифицированным специалистам будут известны и другие паратиреоидные гормоны. Примеры типичных паратиреоидных гормонов приведены в следующих ссылках:Added Hormone Replacement Therapy: Biochemical, Kinetic and Histological Responses", Osteoporosis Int. 1:162-170. Любой гормон роста или средства, стимулирующие секрецию гормона роста, можно применять в качестве второго соединения по данному изобретению. Термин средства, стимулирующие секрецию гормона роста, относится к соединениям, которые стимулируют выделение гормона роста или имитируют действие гормона роста (например увеличивают образование кости, приводя к увеличенной костной массе). Квалифицированные специалисты легко определяют такие действия по данным стандартных анализов. Ряд этих соединений включен в следующие опубликованные РСТ патентные заявки:WO 95/14666; WO 95/13069; WO 94/19367; WO 94/13696 и WO 95/34311. Однако, квалифицированным специалистам будут известны и другие гормоны роста или средства, стимулирующие секрецию гормона роста. Особенно предпочтительным средством,усиливающим секрецию гормона роста, являетсяN-[1(R)-[1,2-дигидро-1-метансульфонилспиро[3 Н-индол-3,4'-пиперидин]-1'-ил-карбонил]-2-(фенилметилокси)этил]-2-амино-2-метилпропанамид: МК-667. Другие предпочтительные средства, стимулирующие секрецию гормона роста, включают в себя: 2-амино-N-[2-(3 а-(R)-бензил-2-метил-3 оксо-2,3,3 а,4,6,7-гексагидро-пиразоло-[4,3-с] пиридин-5-ил)-1-(R)-бензилоксиметил-2-оксоэтил]изобутирамид или его соль L-винной кислоты; 2-амино-N-1-(R)-бензилоксиметил-2-[3 а(R)-(4-фторбензил)-2-метил-3-оксо-2,3,3 а,4,6,7 гексагидропиразоло-[4,3-с]пиридин-5-ил]-2-оксоэтилизобутирамид и 2-амино-N-[2-(3 а-(R)-бензил-3-оксо-2,3,3 а,4,6,7-гексагидропиразоло-[4,3-с]пиридин-5-ил)1-(R)-бензилоксиметил-2-оксо-этил]изобутирамид; 2-амино-N-1-(2,4-дифтор-бензилоксиметил)-2-оксо-2-[3-оксо-3 а-пиридин-2-илметил-2(2,2,2-трифторэтил)-2,3,3 а,4,6,7-гексагидропиразоло-[4,3-с]пиридин-5-ил]этил-2-метилпропионамид. Некоторые способы получения, полезные для получения соединений, описанных в этом документе, могут требовать защиты отдаленной функциональной группы (например первичной аминогруппы, вторичной аминогруппы, карбоксила в предшественниках формулы I). Потребность в такой защите будет зависеть от природы отдаленной функциональной группы и условий способов получения. Квалифицированные специалисты легко определяют потребность в такой защите, а также применяют такие способы защиты/снятия защиты. Общие защитные группы и их применение описаны в литературе(T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis. John WleySons, New York, 1991). Исходные вещества и реагенты для описанных выше соединений являются легкодоступными или могут быть легко синтезированы квалифицированными специалистами традиционными способами органического синтеза. Например, многие из соединений, применяемых в этом документе, относятся к, или их получают из соединений, находящихся в природе, к которым существует большой научный интерес или промышленная потребность, и, следовательно,многие такие соединения являются коммерчески доступными, или о них сообщают в литературе, или их легко получают из других общедоступных веществ способами, о которых сообщают в литературе. Такие соединения включают в себя, например, простагландины. Некоторые соединения по данному изобретению имеют асимметрические атомы углерода и, следовательно, являются энантиомерами или диастереомерами. Диастереомерные смеси могут быть разделены на свои индивидуальные диастереомеры на основе своих физикохимических различий способами, по существу известными, например хроматографией и/или фракционной кристаллизацией. Энантиомеры можно разделять путем превращения энантиомерной смеси в диастереомерную смесь взаимодействием с соответствующим оптически активным соединением (например спиртом), разделения диастереомеров и превращения (например гидролизом) индивидуальных диастереомеров в соответствующие чистые энантиомеры. Все такие изомеры, в том числе диастереомеры, энантиомеры и их смеси, рассматриваются как часть данного изобретения. Также, некоторые соединения по данному изобретению являются атропоизомерами (например замещенные биарилы) и их рассматривают как часть данного изобретения. Многие соединения по данному изобретению являются кислотными, и они образуют соль с фармацевтически приемлемым катионом. Многие соединения по данному изобретению являются основными, и они образуют соль с фармацевтически приемлемым анионом. Все такие соли включены в рамки данного изобретения, и они могут быть получены традиционными способами. Например, они могут быть легко получены при контакте кислотного и основного веществ, обычно в стехиометрическом соотношении, в любой водной, неводной или частично водной среде, такой, которая является наиболее подходящей. Соли извлекают таким способом, который является наиболее подходящим: либо фильтрованием, либо осаждением при помощи соединения, в котором они нерастворимы, а затем фильтрованием, либо выпариванием растворителя, либо, в случае водных растворов, лиофилизацией. 42 Кроме того, если соединения по данному изобретению образуют гидраты или сольваты,то они также включены в рамки изобретения. Все соединения по данному изобретению являются адаптированными для терапевтического применения в качестве агентов, которые стимулируют образование кости и увеличивают костную массу у млекопитающих, особенно у человека. Так как образование кости тесно связано с развитием остеопороза и родственных костных расстройств, эти соединения, благодаря своему действию на кость, предупреждают, задерживают и/или регрессируют остеопороз. Активность соединений по данному изобретению в традиционных анализах, в том числеin vivo анализе, анализе связывания с рецепторами, анализе циклического АМФ и анализе заживления перелома (все из которых описаны ниже) демонстрирует полезность соединений по настоящему изобретению в качестве медицинских средств при лечении состояний, при которых наблюдается низкая костная масса (например остеопороза) у млекопитающих (например у человека, в особенности у женщин). In vivo анализ (с соответствующими модификациями в пределах уровня квалификации в данной области) можно применять для установления активности других анаболических агентов, также как и агонистов простагландина по данному изобретению. Протокол агониста/антагониста эстрогена можно применять для определения активности агонистов/антагонистов эстрогена (в особенности), а также других антирезорбтивных агентов (с соответствующими модификациями в пределах уровня квалификации в данной области). Комбинацию и последующий протокол лечения, описанный ниже, можно применять для того, чтобы продемонстрировать полезность комбинаций анаболических агентов (например соединений по данному изобретению) и антирезорбтивных агентов (например агонистов/антагонистов эстрогена), описанных в этом документе. Также такие анализы предлагают способ,посредством которого активности соединений по данному изобретению (или других анаболических агентов и антирезорбтивных агентов,описанных в этом документе) можно сравнивать друг с другом и с активностями других известных соединений. Результаты этих сравнений являются полезными для определения уровней доз при лечении таких заболеваний у млекопитающих, в том числе у людей.In vivo анализ анаболического агента Активность костных анаболических агентов в стимулировании образования кости и увеличении костной массы можно проверить на интактных крысах-самцах или крысах-самках и крысах-самцах (орхидэктомия) или крысахсамках (овариэктомия) с недостаточным количеством половых гормонов. При исследовании можно применять крыссамцов или крыс-самок разного возраста (таких 43 как в возрасте 3 месяцев). Крысы являются или интактными, или кастрированными (овариэктомированными или орхидэктомированными). Им подкожно или через желудочный зонд вводят различные дозы агонистов простагландина (такие как 1, 3 или 10 мг/кг/день) в течение 30 дней. Обработку кастрированных крыс начинают на следующий день после операции (с целью предотвращения потери кости) или в то время,когда уже произошла потеря кости (с целью восстановления костной массы). Во время исследования всем крысам предоставляют свободный доступ к воде и коммерческий пищевой рацион в виде пилюль (Teklad Rodent Diet 8064, Harlan Teklad, Madison. WI), который содержит 1,46% кальция, 0,99% фосфора и 4,96 МЕ/г (IU/g) Витамина D3. Всем крысам подкожно вводят 10 мг/кг кальцеина на 12 день и 2 день перед умерщвлением. Крыс умерщвляют. Определяют следующие крайние точки: Минеральные измерения бедренной кости: У каждой крысы во время аутопсии удаляют правую бедренную кость, которую сканируют с использованием двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Walthaman, MA) с программным обеспечением "Regional High Resolution Scan" (Hologic Inc., Waltham, MA). Размеры области сканирования составляют 5,08 х 1,902 см, разрешение - 0,0254 х 0,0127 см, а скорость сканирования - 7,25 мм/с. Анализируют сканированные изображения бедренной кости и определяют площадь кости, минеральный состав кости (МСК) и минеральную плотность кости(МПК) целых бедренных костей (ЦБК), дистальных бедренных метафизов (ДБМ), бедренного стержня (БС) и проксимальных частей бедренной кости (ПЧ). Гистоморфометрические анализы большеберцовой кости Правую большеберцовую кость удаляют во время аутопсии, отрезают мышцу и рубят кость на три части. Проксимальную часть большеберцовой кости и стержень большеберцовой кости фиксируют в 70%-ном этаноле,дегидратируют в этаноле при градиурованных концентрациях, обезжиривают в ацетоне и заливают метилметакрилатом (Eastman OrganicChemicals, Rochester, NY). Фронтальные срезы проксимальных большеберцовых метафизов толщиной 4 и 10 мкм готовят с использованием микротома ReichertJung Polycut S. Срезы 4 мкм окрашивают модифицированным красителем Masson's трихром, в то время как срезы 10 мкм оставляют неокрашенными. Для гистморфометрии губчатого вещества кости применяют один срез 4 мкм и один срез 10 мкм от каждой крысы. Поперечные срезы стержня большеберцовой кости толщиной 10 мкм готовят с использованием микротома Reichert-Jung Polycut S. Эти 44 срезы применяют для гистоморфометрического анализа кортикального слоя кости. Гистоморфометрия губчатого вещества кости Для статического и динамического гистоморфометрических измерений вторичного спонгиоза проксимальных большеберцовых метафизов между 1,2 и 3,6 мм дистально к месту соединения растущей пластинки и эпифиза используют Bioquant OS/2 гистоморфометрическую систему (RM biometrics, Inc., Nashville,TN). Первыми 1,2 мм области, относящейся к метафизу большеберцовой кости, следует пренебречь, для того, чтобы ограничить измерения до вторичного спонгиоза. Срезы 4 мкм используют для определения индексов, связанных с объемом кости, структурой кости и резорбцией кости, в то время как срезы 10 мкм используют для определения индексов, связанных с образование костиом и обновлением кости.I) Измерения и расчеты, связанные с трабекулярным костным объемом и структурой(1) Общая площадь метафиза (ОМП, мм 2): площадь метафиза между 1,2 мм и 3,6 мм дистально к месту соединения растущей пластинки и эпифиза. (2) Трабекулярная костная площадь(ТКП, мм 2): общая площадь трабекул внутри ОМП. (3) Трабекулярный костный периметр(ТКПР, мм): длина общего периметра трабекул.(4) Трабекулярный костный объем (ТКП/ОМП,%): ТКП / ОМП х 100. (5) Трабекулярное костное число (ТКЧ, /мм): 1,199/2 х ТКПР/ОМП.(6) Трабекулярная костная толщина (ТКТ, мкм):(2000 /1,199) х (ТКП/ТКПР). (7) Трабекулярное костное разделение (ТКР, мкм): (2000 х 1,199) х(1) Число остеокластов (ЧО, ): общее количество остеокластов в пределах общей площади метафиза. (2) Периметр остеокласта (ПО,мм): длина трабекулярного периметра, покрытого остеокластом. (3) Число остеокластов/мм(ЧО/мм, /мм): ЧО/ТКПР. (4) Процент периметра остеокласта (%ПО,%):ПО/ТКПРх 100.(1) Периметр, меченый кальцеином один раз (МОП, мм): общая длина трабекулярного периметра, меченого одной кальцеиновой меткой. (2) Периметр, меченый кальцеином два раза (МДП, мм): общая длина трабекулярного периметра, меченого двумя кальцеиновыми метками. (3) Ширина между метками (ШММ,мкм): среднее расстояние между двумя кальцеиновыми метками. (4) Процент минерализации периметра (ПМП, %): (МОП/2 + МДП)/ТКПР х 100. (5) Скорость минеральной аппозиции (СМА, мкм/день): (ШММ/интервал между метками). (6) Скорость образования кости/поверхность ref. (СКО/ТКПР, мкм 2/день/ мкм): (МОП/2 + МДП) х СМА/ТКПР. (7) Ско 45 рость обновления кости (СТК, %/год): (МОП/2+ МДП) х СМА/ТКП х 100. Гистоморфометрия кортикального слоя кости Для статического и динамического гистоморфометрических измерений кортикального слоя стержня большеберцовой кости используют гистоморфометрическую систему BioquantOS/2 (RM biometrics, Inc., Nashville, TN). Измеряют общую площадь ткани, площадь полости костного мозга, периостеальный периметр,эндокортикальный периметр, периметр, меченый один раз, периметр, меченый два раза и ширину между метками как периостеальной, так и эндокортикальной поверхности, и рассчитывают площадь кортикального слоя кости (общая площадь ткани - площадь полости костного мозга), процент кортикального слоя кости (площадь кортикального слоя/общая площадь ткани х 100), процент периостеального и эндокортикального меченого периметра [(периметр, меченый один раз/2 + периметр, меченый два раза)/общий периметр х 100], скорость минеральной аппозиции (ширину между метками/интервалы), скорость образования кости[скорость минеральной аппозиции х (периметр,меченый один раз/2 + периметр, меченый два раза)/ общий периметр]. Статистика Статистические данные можно рассчитать с использованием пакетов StatView 4.0 (AbacusConcepts, Inc., Berkeley, CA). Для того, чтобы сравнить различия между группами, используют дисперсионный анализ (ANOVA), а затем FisherPLSD. Определение увеличения цАМФ в клеточных линиях 293-S устойчиво суперэкспрессирующих рекомбинантные рецепторы ЕР 2 и ЕР 4 человека. кДНК, представляющие собой законченные открытые рамки считывания рецепторов человека ЕР 2 и ЕР 4, синтезируют обратной транскриптазной полимеразной цепной реакцией с использованием олигонуклеотидных праймеров на основании опубликованных последовательностей (1, 2) и РНК от первичных почечных клеток человека (ЕР 2) или первичных легочных клеток человека (ЕР 4) в качестве матриц. кДНК клонируют во множественный сайт клонирования pcDNAS (Invitrogen) и используют для трансфекции почечных эмбриональных клеток человека 293-S через соосаждение фосфатом кальция. G418-резистентные колонии увеличиваются и их проверяют на специфическое связывание [3-H]PGE2. Трансфектанты,проявляющие высокие уровни специфического связывания [3-H]PGE2, в дальнейшем охарактеризовывают анализом Скэтчарда для определения Вmax и Kds для PGE2. Линии, выбранные для скрининга соединений, имеют приблизительно 338,400 рецепторов на клетку и Kd = 12 нМ для PGE2 (ЕР 2) и приблизительно 256,400 46 рецепторов на клетку и Kd = 2,9 нМ для PGE4(ЕР 4). Конституитивная экспрессия обоих рецепторов в родительских клетках 293-S является незначительной. Клетки хранят в RPMI с добавлением коровьей фетальной сыворотки (конечная концентрация 10%) и G418 (конечная концентрация 700 мкг/мл). Отклики цАМФ в линиях 293-S/EP2 и 293S/EP4 определяют отделением клеток из колб для культивирования в 1 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) с недостатком Са и Мg через энергичное растирание, добавлениеRPMI (без сыворотки) до конечной концентрации 1 х 106 клеток/мл и добавления 3-изобутил-1 метаксантина (IВМХ)до конечной концентрации 1 мМ. 1 мл суспензии клеток сразу же аликвотируют в индивидуальные 2 мл микроцентрифужные пробирки с завинчивающимися пробками и культивируют незакрытыми в течение 10 мин при 37 С, 5% СO2 и относительной влажности 95%. Затем к клеткам добавляют тестируемое соединение в разведении 1:100, так,чтобы конечная концентрация ДМСО или этанола составляла 1%. Сразу же после добавления соединения, пробирки закрывают, содержимое перемешивают, переворачивая пробирки 2 раза,и инкубируют при 37 С в течение 12 мин. Затем образцы лизируют путем инкубирования при 100 С в течение 10 мин и сразу же охлаждают во льду в течение 5 мин. Клеточные обломки осаждают центрифугированием при 1000 х g в течение 5 мин и осветленные лизаты переносят в новые пробирки. Концентрации цАМФ определяют с использованием коммерчески доступного набора для радиоиммунного анализа цАМФ (NEK-033, NEN/DuPont) после разведения осветленных лизатов в буфере для радиоиммунного анализа (RIA) цАМФ (1:10). Обычно, клетки обрабатывают 6-8 концентрациями тестируемого соединения с логарифмической дискретностью, равной 1. Расчеты ЕС 50 выполняют на карманном калькуляторе Hewlett Packard 32SII методом линейной регрессии на линейном участке кривых доза-ответ. Ссылки: 1. Regan, J.W. Bailey, T.J. Pepperl, D.J.Chem. Vol 269,16:11873-11877. Анализ связывания с рецепторами простагландина Е 2 Приготовление мембран: все процедуры выполняют при 4 С. Трансфецированные клетки, экспрессирующие рецепторы простагланди 47 на E2 1 типа (ЕР 1), 2 типа (EP2), 3 типа (ЕР 3) или 4 типа (ЕР 4) отделяют и суспендируют до концентрации 2 миллиона клеток на мл в Буфере А [50 мМ Трис-НСl (рН 7.4), 10 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA, 1 мМ пептида Pefabloc, (Sigma, St.Elastatinal, (Sigma, St. Louis, МО), 100 мкМ пептида Antipain (Sigma, St. Louis, МО)]. Их лизируют ультразвуком (sonification) с использованием Branson Sonifier (Model 250, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) двумя пятнадцатисекундными импульсами. Нелизированные клетки и обломки удаляют центрифугированием при 100 х g в течение 10 мин. Затем центрифугированием при 45,000 х g в течение 30 мин отделяют мембраны. Осажденные мембраны ресуспендируют до концентрации белка 3-10 мг на мл, причем концентрацию белка определяют в соответствии со способом Бредфорда[Branford, M., Anal. Biochem., 72, 248 (1976)]. Затем ресуспендированные мембраны хранят в замороженном состоянии при -80 С до применения. Анализ на связывание: замороженные мембраны, приготовленные вышеупомянутым способом, размораживают и разводят в Буфере А до концентрации 1 мг белка на мл. Один объем препарата мембран объединяют с 0,05 объема тестируемого соединения или буфера и одним объемом 3 нМ 3 Н-простагландина Е 2(TRK 431, Amersham, Arlington Heights, IL) в Буфере А. Смесь (общий объем 205 мкл) инкубируют в течение 1 ч при 25 С. Затем мембраны извлекают фильтрованием через стекловолоконный фильтр типа GF/C (1205-401, Wallac,Gaithersburg, MD) с использованием Tomtec harvester (Model Mach II/96, Tomtec, Orange, CT). Мембраны со связанным 3 Н-простагландином Е 2 остаются на фильтре, а буфер и несвязанный 3 Н-простагландин Е 2 направляются через фильтр в отходы. Затем каждый образец промывают 3 раза 3 мл [50 мМ Трис-НСl (рН 7.4), 10 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA]. Затем фильтры сушат нагреванием в микроволновой печи. Для определения количества 3 Н-простагландина, связанного с мембранами, высушенные фильтры помещают в пластиковые контейнеры со сцинтилляционной жидкостью и подсчитывают счетчиком LKB 1205 Betaplate (Wallac, Gaithersburg,MD). ИК 50 определяют исходя из концентрации тестируемого соединения, требуемой для замещения 50% специфически связанного 3 Нпростагландина Е 2. АНАЛИЗЫ НА ЗАЖИВЛЕНИЕ ПЕРЕЛОМА АНАЛИЗ В ОТНОШЕНИИ ВЛИЯНИЯ НА ЗАЖИВЛЕНИЕ ПЕРЕЛОМА ПОСЛЕ СИСТЕМНОГО ВВЕДЕНИЯ Методика перелома: крыс линии SprageDawley в возрасте 3 месяцев анестезируют ке 005161 48 тамином. Выполняют 1 см надрез на переднемедиальной стороне проксимальной части правой большеберцовой кости или бедренной кости. Хирургическую методику для большеберцовой кости проводят следующим образом. Надрез доводят до кости, и просверливают отверстие 1 мм (4 мм проксимально к дистальной стороне бугристости большеберцовой кости и 2 мм медиально к переднему гребню). Выполняют интрамедуллярную установку штифта в виде 0.8 мм трубки из нержавеющей стали (максимальная нагрузка 36,3 Н, максимальная прочность 61,8 Н/мм, трубка проверена в условиях, которые являются такими же, что и условия для костей). Никакого рассверливания медуллярного канала не выполняли. Стандартный закрытый перелом получают 2 мм выше большеберцового-малоберцового соединения сгибанием в трех точках с использованием специально сконструированных регулируемых щипцов с тупыми губками. Для сведения к минимуму повреждения мягкой ткани требуется осторожно выполнять перелом, чтобы его не сместить. Кожу зашивают нейлоновым шовным материалом в одну нить. Операцию выполняют в стерильных условиях. Сразу после установки штифта выполняют рентгенограммы всех переломов и исключают животных с переломами вне специфической диафизарной области или со смещенными штифтами. Оставшихся животных произвольно распределяют на следующие группы по 10-12 животных в каждой подгруппе для проверки заживления перелома. Первая группа ежедневно получает растворитель через желудочный зонд (вода:100%-ный этанол = (95:5) в количестве 1 мл на крысу), в то время как другие ежедневно получают через желудочный зонд от 0,01 до 100 мг/кг/день тестируемого соединения (1 мл на крысу) в течение 10, 20, 40 и 80 дней. На 10, 20, 40 и 80 день 10-12 крыс из каждой группы анестезируют кетамином и подвергают аутопсии через обескровливание. Отрезают обе большеберцовые и малоберцовые кости и отделяют все мягкие ткани. Кости от 5-6 крыс каждой группы хранят в 70%-ном этаноле для гистологического анализа, а кости от других 5-6 крыс каждой группы хранят в буферном растворе Рингера (+4 С, рН 7.4) для рентгенограмм и биомеханического анализа, который впоследствии выполняют. Гистологический анализ: способы гистологического анализа сломанной кости известныon Fracture Healing in Rats: A Histological Description. Bone, 14:19-27, 1993). Кратко, по обе стороны линии перелома отпиливают по 8 мм сломанной части, недекальцинированные заливают метилметакрилатом и готовят фронтальные срезы толщиной 8 мкм на микротоме Reichert-Jung Polycut. Для визуализации клеточной или тканевой реакции на заживление перелома 49 при лечении и без лечения применяют средние фронтальные срезы, окрашенные красителемMasson's трихром (в том числе как большеберцовой, так и малоберцовой кости). Срезы, окрашенные сириусом красным, используют для демонстрации характеристик структуры костной мозоли и для дифференцирования между слившейся костной тканью и пластинчатой костной тканью в месте перелома. Выполняют следующие измерения: (1) промежуток перелома - измеряют как кратчайшее расстояние между концами кортикального слоя кости при переломе, (2) длина костной мозоли и диаметр костной мозоли, (3) площадь всего костного объема костной мозоли (4) площадь костной ткани на площадь ткани внутри области костной мозоли,(5) фиброзная ткань в костной мозоли, (6) площадь хряща костной мозоли. Биомеханический анализ: способы биомеханического анализа известны (Bak and Andreassen, The Effects of Aging on Fracture Healing inRats. Calcif Tissue Int 45:292-297, 1989). Кратко,до биомеханического испытания снимают рентгенограммы всех переломов. Механические свойства переломов, которые лечат, анализируют деструктивной методикой сгибания в трех или четырех точках. Определяют максимальную нагрузку, прочность, энергию при максимальной нагрузке, деформацию при максимальной нагрузке и максимальное напряжение. АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ НА ЗАЖИВЛЕНИЕ ПЕРЕЛОМА ПОСЛЕ МЕСТНОГО ВВЕДЕНИЯ Методика перелома: для исследования используют гончих собак в возрасте двух лет. Поперечные радиальные переломы получают медленной непрерывной нагрузкой в три точки сгибания (Lenehan, T.M.; Balligand, М.; Nunamaker,D.M.; Wood, F.E.: Effects of EHDP on FractureHealing in Dogs. J. Orthop. Res. 3:499-507; 1985). Чтобы обеспечить полное анатомическое разрушение кости по месту перелома натягивают проволоку. После этого, выполняют местную доставку агонистов простагландина в область перелома посредством медленного высвобождения доставляемого соединения или медленного высвобождения пилюль или мининасосамиAlzet в течение 10, 15 или 20 недель. Гистологический анализ: способы гистологического анализа сломанной кости известныDescription. Bone, 14:19-27, 1993). Кратко, по обе стороны линии перелома отпиливают по 8 мм сломанной части, недекальцинированные заливают метилметакрилатом и готовят фронтальные срезы толщиной 8 мкм на микротомеReichert-Jung Polycut. Для визуализации клеточного или тканевого ответа на заживление пере 005161 50 лома при лечении и без лечения используют средние фронтальные срезы, окрашенные красителем Masson's трихром (в том числе как большеберцовой, так и малоберцовой кости). Срезы, окрашенные сириусом красным, используют для демонстрации характеристик структуры костной мозоли и для дифференцирования между слившейся костной тканью и пластинчатой костной тканью в месте перелома. Выполняют следующие измерения: (1) промежуток перелома - измеряют как кратчайшее расстояние между концами кортикального слоя кости при переломе, (2) длина костной мозоли и диаметр костной мозоли, (3) площадь всего костного объема костной мозоли, (4) площадь костной ткани на площадь ткани внутри области костной мозоли, (5) фиброзная ткань в костной мозоли,(6) площадь хряща костной мозоли. Биомеханический анализ: способы биомеханического анализа известны (Bak and Andreassen, The Effects of Aging on Fracture Healing inRats. Calcif Tissue Int 45:292-297, 1989; and Peter,C.P.; Cook, W.O.; Nunamaker, D.M.; Provost,M.T.; Seedor, J.G.; Rogan, G.A. Effects of Alendronate On Fracture Healing And Bone Remodeling In Dogs. J. Orthop. Res. 14:74-70, 1996). Кратко, до биомеханического испытания снимают рентгенограммы всех переломов. Механические свойства переломов, которые лечат, анализируют деструктивной методикой сгибания в трех или четырех точках. Определяют максимальную нагрузку, прочность, энергию при максимальной нагрузке, деформацию при максимальной нагрузке и максимальное напряжение. ПРОТОКОЛ АГОНИСТА/АНТАГОНИСТА ЭСТРОГЕНА Агонисты/антагонисты эстрогена являются классом соединений, которые ингибируют обновление кости и предупреждает потерю кости,индуцированную дефицитом эстрогена. В качестве модели постменопаузальной потери кости широко используют модель потери кости у овариэктомированной крысы. Используя эту модель можно проверить эффективность соединений агонистов/антагонистов эстрогена для предупреждения потери кости и ингибированя резорбции кости. В этих исследованиях используют крыссамок Sprague-Dawley (Charles River, Wilmington, MA) различного возраста (такого как 5 месяцев). Во время экспериментального периода крысы живут в отдельных клетках 20 см х 32 см х 20 см. Всем крысам предоставляют свободный доступ к воде и коммерческий пищевой рацион в виде пилюль (Agway ProLab 3000, AgwayCounty Food, Inc Syracuse, NY), содержащий 0,97% кальция, 0,85% фосфора и 1,05 МЕ/г Витамина D3. Группу крыс (от 8 до 10) "ложно" оперируют и перорально обрабатывают растворителем (10% этанола и 90% солевого раствора, 1 51 мл/день), в то же время оставшихся крыс билатерально подвергают овариэктомии (OVX) и обрабатывают любым растворителем (перорально), 17-эстрадиолом (Sigma, Е-8876, E2, 30 мкг/кг, ежедневная подкожная инъекция) или агонистами/антагонистами эстрогена (такими как дролоксифен, 5, 10 или 20 мг/кг, ежедневное введение через рот) в течение некоторого периода (такого как 4 недели). Всем крысам подкожно вводят 10 мг/кг кальцеина (флюорохромный костный маркер) за 12 дней и 2 дня перед умерщвлением для того, чтобы проверить динамические изменения костной ткани. После 4 недель обработки крыс умерщвляют и подвергают аутопсии. Определяют следующие конечные точки: увеличение веса тела: вес тела во время аутопсии минус вес тела во время операции. Вес матки и гистология: у каждой крысы во время аутопсии удаляют матку и сразу же взвешивают. После этого, матку подвергают гистологическим измерениям, таким как площадь ткани поперечного сечения матки, стромальная толщина и люминальная толщина эпителия. Полный сывороточный холестерин: кровь добывают кардиальной пункцией и оставляют свертываться при 4 С, а затем центрифугируют при 2000 g в течение 10 мин. Образцы сыворотки анализируют на полный сывороточный холестерин, используя высокоэффективный холестерин-калориметрический анализ (BoehringerMannheim BioChemicals, Indianapolis, IN). Минеральные измерения бедренной кости У каждой крысы во время аутопсии удаляют правую бедренную кость, которую сканируют с использованием двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DEXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Walthaman, MA) с программным обеспечением "Regional High Resolution Scan" (Hologic Inc., Waltham, MA). Размеры области сканирования составляют 5,08 х 1,902 см, разрешение - 0,0254 х 0,0127 см, а скорость сканирования - 7,25 мм/с. Анализируют сканированные изображения бедренной кости и определяют площадь кости, минеральный состав кости (МСК) и минеральную плотность кости(МПК) целых бедренных костей (ЦБК), дистальных бедренных метафизов (ДБМ), бедренного стержня (БС) и проксимальных частей бедренной кости (ПЧ). Гистоморфометрические анализы проксимальных большеберцовых метафизов, губчатого вещества кости. Правую большеберцовую кость удаляют во время аутопсии, отрезают мышцу и рубят кость на три части. Проксимальную часть большеберцовой кости и стержень большеберцовой кости фиксируют в 70%-ном этаноле,дегидратируют в этаноле при градиурованных концентрациях, обезжиривают в ацетоне и заливают метилметакрилатом (Eastman OrganicChemicals, Rochester, NY). Фронтальные срезы проксимальных большеберцовых метафизов толщиной 4 и 10 мкм готовят с использованием микротома Reichert-Jung Polycut S. Для гистморфометрии губчатого вещества кости применяют один срез 4 мкм и один срез 10 мкм от каждой крысы. Срезы 4 мкм окрашивают модифицированным красителем Masson's трихром, в то время как срезы 10 мкм оставляют неокрашенными. Для статического и динамического гистоморфометрических измерений вторичного спонгиоза проксимальных большеберцовых метафизов между 1,2 и 3,6 мм дистально к месту соединения растущей пластинки и эпифиза используют гистоморфометрическую системуBioquant OS/2 (RM biometrics, Inc., Nashville,TN). Первыми 1,2 мм области, относящейся к метафизу большеберцовой кости, пренебрегают,чтобы ограничить измерения до вторичного спонгиоза. Срезы 4 мкм используют для определения индексов, связанных с объемом кости,структурой кости и резорбцией кости, в то время как срезы 10 мкм используют для определения индексов, связанных с образование костиом и обновлением кости.I) Измерения и расчеты, связанные с трабекулярным костным объемом и структурой 1. Общая площадь метафиза (ОМП, мм 2): площадь метафиза между 1,2 мм и 3,6 мм дистально к месту соединения растущей пластинки и эпифиза. 2. Трабекулярная костная площадь (ТКП,мм 2): общая площадь трабекул внутри ОМП. 3. Трабекулярный костный периметр(ТКПР, мм): длина общего периметра трабекул. 4. Трабекулярный костный объем(ТКП/ОМП, %): ТКП/ОМП х 100. 5. Трабекулярное костное число (ТКЧ,/мм): 1,199/2 х ТКПР/ОМП. 6. Трабекулярная костная толщина (ТКТ,мкм): (2000/1,199) х (ТКП/ТКПР). 7. Трабекулярное костное разделениеII) Измерения и расчеты, связанные с резорбцией кости 1. Число остеокластов (ЧО, ): общее количество остеокластов в общей площади метафиза. 2. Периметр остеокласта (ПО, мм): длина трабекулярного периметра, покрытого остеокластом. 3. Число остеокластов/мм (ЧО/мм, /мм): ЧО/ТКПР. 4. Процент периметра остеокласта (%ПО,%): ПО/ТКПР х 100.III) Измерения и расчеты, связанные с образование костиом и обновлением кости: 1. Периметр, меченый кальцеином один раз (МОП, мм): общая длина трабекулярного периметра, меченого одной кальцеиновой меткой. 53 2. Периметр, меченый кальцеином два раза(МДП, мм): общая длина трабекулярного периметра, меченого двумя кальцеиновыми метками. 3. Ширина между метками (ШММ, мкм): среднее расстояние между двумя кальцеиновыми метками. 4. Процент минерализации периметра+ МДП) х СМА/ТКПР. 7. Скорость обновления кости (СТК,%/год): (МОП/2 + МДП) х СМА/ТКП х 100. Статистика Статистические данные можно рассчитать с использованием пакетов StatView 4.0 (AbacusConcepts, Inc., Berkeley, CA). Для того, чтобы сравнить различия между группами используют дисперсионный анализ (ANOVA), а затем FisherPLSD. ПРОТОКОЛ КОМБИНИРОВАННОЙ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОЙ ОБРАБОТКИ Следующие протоколы, конечно, могут быть изменены квалифицированными специалистами. Например, можно использовать интактных крыс-самцов или крыс-самок и крыссамцов (орхидэктомия) или крыс-самок (овариэктомия) с недостаточным количество половых гормонов. Кроме того, при исследовании можно применять крыс-самцов или крыс-самок разного возраста (таких как в возрасте 12 месяцев). Крысы могут быть или интактными, или кастрированными (овариэктомированными или орхидэктомированными), и им можно вводить анаболические агенты, такие как соединения по данному изобретению в различных дозах (таких как 1, 3 или 6 мг/кг/день) в течение некоторого периода (такого как от двух недель до двух месяцев), а затем антирезорбтивный агент, такой как дролоксифен в различных дозах (таких как 1, 5, 10 мг/кг/день) в течение некоторого периода (такого как от двух недель до двух месяцев),или можно осуществлять комбинированную обработку как анаболическим агентом, так и антирезорбтивным агентом в различных дозах в течение некоторого периода (такого как от двух недель до двух месяцев). Обработку кастрированных крыс можно начинать на следующий день после операции (с целью предотвращения потери кости) или в то время, когда уже произошла потеря кости (с целью восстановления костной массы). Крыс умерщвляют под анестезией кетамином. Определяют следующие конечные точки Минеральные измерения бедренной кости: у каждой крысы во время аутопсии удаляют правую бедренную кость, которую сканируют с использованием двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA, QDR 1000/W, 005161(Hologic Inc., Waltham, MA). Размеры области сканирования составляют 5,08 х 1,902 см, разрешение - 0,0254 х 0,0127 см, а скорость сканирования - 7,25 мм/с. Анализируют сканированные изображения бедренной кости и определяют площадь кости, минеральный состав кости(МСК) и минеральную плотность кости (МПК) целых бедренных костей (ЦБК), дистальных бедренных метафизов (ДБМ), бедренного стержня (БС) и проксимальных частей бедренной кости (ПЧ). Минеральные размеры кости поясничного позвонка Двухэнергетическую рентгеновскую абсорбциометрию (QDR 1000/W, Hologic Inc.,Walthaman, MA) с программным обеспечением"Regional High Resolution Scan" (Hologic Inc.,Waltham, MA) используют для определения площади кости, минерального состава кости(МСК) и минеральной плотности кости (МПК) целого поясничного отдела позвоночника и каждого из шести поясничных позвонков (ПП 1-6) у анестезированных крыс. Крыс анестезируют внутрибрюшинной инъекцией 1 мл/кг смеси кетамина и rompun (соотношение 4:3), а затем помещают на площадку для крыс. Размеры области сканирования составляют 6 х 1,9 см, разрешение - 0,0254 х 0,0127 см, а скорость сканирования - 7,25 мм/с. Получают и анализируют сканированное изображение целого поясничного отдела позвоночника. Определяют площадь кости (ПК) и минеральный состав кости (МСК),а минеральную плотность кости рассчитывают(МСК делят на ПК) для целого поясничного отдела позвоночника и каждого из шести поясничных позвонков (ПП 1-6). Гистоморфометрические анализы проксимальных большеберцовых метафизов, губчатого вещества кости Правую большеберцовую кость удаляют во время аутопсии, отрезают мышцу и рубят кость на три части. Проксимальную часть большеберцовой кости и стержень большеберцовой кости фиксируют в 70%-ном этаноле,дегидратируют в этаноле при градиурованных концентрациях, обезжиривают в ацетоне и заливают метилметакрилатом (Eastman OrganicChemicals, Rochester, NY). Фронтальные срезы проксимальных большеберцовых метафизов толщиной 4 и 10 мкм приготавливают с использованием микротома Reichert-Jung Polycut S. Для гистморфометрии губчатого вещества кости применяют один 4 мкм срез и один 10 мкм срез от каждой крысы. 4 мкм срезы окрашивают модифицированным красителем Masson's трихром,в то время как 10 мкм срезы оставляют неокрашенными. Для статического и динамического гистоморфометрических измерений вторичного спонгиоза проксимальных большеберцовых метафи 55 зов между 1,2 и 3,6 мм дистально к месту соединения растущей пластинки и эпифиза применяют Bioquant OS/2 гистоморфометрическую систему (RM biometrics, Inc., Nashville, TN). Первыми 1,2 мм области, относящейся к метафизу большеберцовой кости, следует пренебречь, для того, чтобы ограничить измерения до вторичного спонгиоза, 4 мкм срезы применяют для определения индексов, связанных с объемом кости, структурой кости и резорбцией кости, в то время как 10 мкм срезы применяют для определения индексов, связанных с образование костиом и turnover кости.I) Измерения и расчеты, связанные с трабекулярным костным объемом и структурой 1. Общая площадь метафиза (ОМП, мм 2): площадь метафиза между 1,2 мм и 3,6 мм дистально к месту соединения растущей пластинки и эпифиза. 2. Трабекулярная костная площадь (ТКП,мм 2): общая площадь трабекул внутри ОМП. 3. Трабекулярный костный периметр(ТКПР, мм): длина общего периметра трабекул. 4. Трабекулярный костный объем(ТКП/ОМП, %): ТКП/ОМП х 100. 5. Трабекулярное костное число (ТКЧ,/мм): 1,199/2 х ТКПР/ОМП. 6. Трабекулярная костная толщина (ТКТ,мкм): (2000/1,199) х (ТКП/ТКПР). 7. Трабекулярное костное разделениеII) Измерения и расчеты, связанные с резорбцией кости 1. Число остеокластов (ЧО, ): общее количество остеокластов в общей площади метафиза. 2. Периметр остеокласта (ПО, мм): длина трабекулярного периметра, покрытого остеокластом. 3. Число остеокластов/мм (ЧО/мм, /мм): ЧО/ТКПР. 4. Процент периметра остеокласта (%ПО,%): ПО / ТКПР х 100.III) Измерения и расчеты, связанные с образование костиом и turnover кости 1. Периметр, меченый кальцеином один раз (МОП, мм): общая длина трабекулярного периметра, меченого одной кальцеиновой меткой. 2. Периметр, меченый кальцеином два раза(МДП, мм): общая длина трабекулярного периметра, меченого двумя кальцеиновыми метками. 3. Ширина между метками (ШММ, мкм): среднее расстояние между двумя кальцеиновыми метками. 4. Процент минерализации периметра 56 6. Скорость образования кости/поверхность ref. (СКО/ТКПР, мкм 2/день/ мкм): (МОП/2 + МДП) х СМА/ТКПР. 7. Скорость обновления кости (СТК,%/год): (МОП/2 + МДП) х СМА/ТКП х 100. Статистика Статистические данные можно рассчитать с использованием пакетов StatView 4.0 (AbacusConcepts, Inc., Berkeley, CA). Для того, чтобы сравнить различия между группами, используют дисперсионный анализ (ANOVA), а затем FisherPLSD. Применение агониста рецептора простагландина в регенерации почки Роль агониста простагландина в регенерации почки исследуют по способности PGE2 или агониста простагландина индуцировать экспрессию Костного Морфогенетического Белка 7(BMP) в клетках 293S дикого типа и в клетках 293S, трансфецированных рецептором ЕР 2. Способы: клетки 293S и ЕР 2 293S выращивают в модифицированной Дульбекко (Dulbecco) среде Игла (DMEM, Gibco, BRL;Gaithersburg, MD). За один день до обработкиPGE2 или агонистом простагландина, клетки помещают в количестве 1,5 х 106 клеток на 100 мм чашку. На следующий день монослой клеток один раз промывают OptiMEM (Gibco, BRL), а затем добавляют 10 мл OptiMEM на чашку в присутствии или отсутствии растворителя(ДМСО), PGE2 (10-6 М) или агониста простагландина (10-6 М). Клетки отделяют и экстрагируют РНК на 8, 16 и 24 час. Проводят нозернблоттинг анализ всего материала (20 мг на дорожку) зондированием блотов зондом ВМР-7,меченым 32P. При нанесении РНК блоты стандартизируют гибридизацией с зондом на 18s рибосомальную РНК, меченую 32P. Обнаружено,что в зависимости от времени как PGE2, так и агонист простагландина индуцируют экспрессию ВМР-7 в клетках EP2 293S, но не индуцируют в родительской клеточной линии. Таким образом, приведены известная роль ВМР-7 в регенерации почки и способность агониста простагландина индуцировать экспрессию ВМР-7 в почечных клетках 293S в зависимости от времени, а специфичность действия рецептора показывает роль агониста простагландина в регенерации почки. Соединения по данному изобретению можно вводить любым способом, который доставляет соединение по данному изобретению системно и/или местно (например в область перелома кости, остеотомии или ортопедической операции). Эти способы включают в себя пероральные, парентеральные, интрадуоденальные пути и т.д. Обычно, соединения по данному изобретению вводят перорально, но можно применять парентеральное введение (например,внутривенное, внутримышечное, подкожное или интрамедуллярное), например, когда пероральное введение является неподходящим для 57 органа-мишени, или когда пациент не способен проглотить лекарственное средство. Соединения применяют для лечения и активации заживления переломов костей и остеотомии путем местного употребления (например,в областях костных переломов или остеотомии) соединений по данному изобретению или их композиций. Соединения по данному изобретению употребляют в области переломов костей или остеотомий, например либо инъекцией соединения в соответствующем растворителе (например масляном растворителе, таком как арахисовое масло) в хрящевую растущую пластинку, либо, в случаях открытой хирургии, местным употреблением таких соединений в подходящем носителе, таком как костный воск, деминерализованный костный порошок, полимерные костные цементы, костные пломбировочные материалы и т.д. Альтернативно, местное применение можно успешно выполнить путем употребления раствора или дисперсии соединения в подходящем носителе на поверхности,или включения его в твердые или полутвердые имплантаты, традиционно применяемые в ортопедической хирургии, такие как dacron-mesh,Gore-tex, гель-пена и kiel bone или протезы. Соединения по данному изобретению также можно употреблять местно в области перелома или остеотомии в подходящем носителе в сочетании с одним или более чем одним анаболическими агентами или костными антирезорбтивными агентами, описанными выше. Два различных соединения по данному изобретению можно вводить совместно: одновременно или последовательно в любом порядке, или можно вводить единую фармацевтическую композицию, содержащую соединение формулы I, такое как описано выше, и второе соединение, такое как описано выше, в фармацевтически приемлемом носителе. Например, можно применять только костный анаболический агент или в сочетании с антирезорбтивным агентом в течение от одной недели до трех лет, а впоследствии только антирезорбтивный агент в течение от трех месяцев до трех лет с возможным повтором полного цикла лечения. Альтернативно, можно применять только костный анаболический агент или в сочетании с антирезорбтивным агентом в течение от трех месяцев до трех лет, а впоследствии только антирезорбтивный агент в течение оставшейся жизни пациента. Например, в одном предпочтительном пути введения соединение формулы I, такое как описано выше, можно вводить один раз каждый день, а второе соединение, такое как описано выше (например, агонист/антагонист эстрогена) можно вводить ежедневно в однократной или многократных дозах. Альтернативно, например, в другом предпочтительном пути введения два соединения можно вводить последовательно, где соединение формулы I, такое как описано выше, можно вводить 58 один раз каждый день в течение периода времени, достаточного для увеличения костной массы до уровня, который выше, чем порог перелома кости (World Health Organization Study WorldOrganization Study Group. World Health Organization Technical Series 843"), за которым следует введение второго соединения, такого как описано выше (например, агониста/антагониста эстрогена) ежедневно в однократной или многократных дозах. Предпочтительным является введение первого соединения, такого как описано выше, один раз каждый день в форме быстрой доставки, такой как пероральная доставка(например предпочтительно избегают доставку непрерывным высвобождением). Так или иначе, количество и выбор определенного времени для соединений, которые следует вводить, конечно, будут зависеть от пациента, которого лечат, от тяжести страдания от болезни, от способа введения и от мнения врача, прописывающего лекарство. Поэтому,вследствие различия среди пациентов, дозы,данные ниже, являются ориентировочными, и врач может изменять дозы для успешного осуществления лечения (например, увеличения костной массы), таким образом, который, как он считает, является подходящим для пациента. Принимая во внимание уровень требуемого лечения, врач должен обдумывать ряд факторов,таких как начальный уровень костной массы,возраст пациента, наличие заболеваний, существующих до лечения, также как и наличие других заболеваний (например, сердечно-сосудистой болезни). Обычно, применяют такое количество соединения по данному изобретению, чтобы оно было достаточным для увеличения костной массы до уровня, который выше, чем порог перелома кости (подробно изложено в World HealthOrganization Study). Обычно, эффективная доза для анаболических агентов, описанных выше, находится в пределах от 0,001 до 100 мг/кг/день, предпочтительно от 0,01 до 50 мг/кг/день. В следующих абзацах предлагаются предпочтительные пределы доз для различных антирезорбтивных агентов. Количество антирезорбтивного агента, который следует применять, устанавливают по его активности, как агента, ингибирующего потерю кости. Эту активность устанавливают при помощи фармакокинетик для индивидуальных соединений и их минимальной и максимальной эффективной дозе в ингибировании потери кости, с использованием протокола, такого как описано выше (например в ПРОТОКОЛ АГОНИСТА/АНТАГОНИСТА ЭСТРОГЕНА). Обычно, эффективная доза для антирезорбтивных агентов представляет собой от прибли 59 зительно 0,001 до приблизительно 20 мг/кг/ день. Обычно, эффективная доза для прогестинов представляет собой от приблизительно 0,1 до 10 мг в день; предпочтительная доза представляет собой от приблизительно 0,25 до 5 мг в день. Обычно, эффективную дозу для полифосфонатов устанавливают по их эффективности как агентов, ингибирующих резорбцию кости в соответствии со стандартными анализами. Суточное введение некоторых полифосфонатов находится в пределах от приблизительно 0,001 мг/кг/день до приблизительно 20 мг/кг/ день. Обычно, эффективная доза для лечения по данному изобретению, например, лечения резорбции кости по данному изобретению, агонистов/антагонистов эстрогена по данному изобретению, находится в пределах от 0,01 до 200 мг/кг/день, предпочтительно от 0,5 до 100 мг/кг/день. В частности, эффективная доза для дролоксифена находится в пределах от 0,1 до 40 мг/кг/день, предпочтительно от 0,1 до 5 мг/кг/день. В частности, эффективная доза для ралоксифена находится в пределах от 0,1 до 100 мг/кг/день, предпочтительно от 0,1 до 10 мг/кг/день. В частности, эффективная доза для тамоксифена находится в пределах от 0,1 до 100 мг/кг/день, предпочтительно от 0,1 до 5 мг/кг/день. В частности, эффективная доза для цис-6(4-фторфенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси) фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ола;(-)-цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2 ола; цис-6-фенил-5-[4-(2-пирролидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ола; цис-1-[6'-пирролидиноэтокси-3'-пиридил]2-фенил-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталина; 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-(4"фторфенил)-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина; цис-6-(4-гидроксифенил)-5-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенил]-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ола или 1-(4'-пирролидиноэтоксифенил)-2-фенил 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина находится в пределах от 0,0001 до 100 мг/кг/день, предпочтительно от 0,001 до 10 мг/кг/день. В частности, эффективная доза для 4 гидрокситамоксифена находится в пределах от 0,0001 до 100 мг/кг/день, предпочтительно от 0,001 до 10 мг/кг/день. Соединения по настоящему изобретению обычно вводят в форме фармацевтической ком 005161 60 позиции, содержащей по меньшей мере одно из соединений по данному изобретению вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем или разбавителем. Таким образом, соединения по данному изобретению можно вводить индивидуально или вместе в любой традиционной пероральной, парентеральной, ректальной или трансдермальной лекарственной форме. Для перорального введения фармацевтическая композиция может принимать форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, порошков и им подобных. Таблетки, содержащие различные эксципиенты, такие как цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция, применяют вместе с различными разрыхлителями, такими как крахмал, предпочтительно картофельный крахмал или крахмал тапиоки, и некоторыми комлексными силикатами, вместе со связывающими агентами, такими как поливинилпирролидон, сахароза, желатин и аравийская камедь. Кроме того, часто являются полезными для целей изготовления таблеток смазывающие агенты, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. Твердые композиции подобного типа также применяют в качестве наполнителей в мягких и твердо-наполненных желатиновых капсулах; в этой связи предпочтительные материалы включают в себя лактозу или молочный сахар, а также полиэтиленгликоли с высокой молекулярной массой. Когда для перорального введения требуются водные суспензии и/или эликсиры, то соединения по настоящему изобретению можно объединять с различными подсластителями, корригентами, красителями,эмульгаторами и/или суспендирующими агентами, а также с такими разбавителями, как вода,этанол, пропиленгликоль, глицерин и различными их комбинациями. Для парентерального введения можно употреблять растворы в кунжутном или арахисовом масле, или в водном пропиленгликоле, а также стерильные водные растворы соответствующих водорастворимых солей. Такие водные растворы, если необходимо, могут быть подходящим образом смешаны с буферным раствором, а жидкий разбавитель может быть приведен к изотоническому состоянию достаточным количество соли или глюкозы. Эти водные растворы особенно подходят для внутривенных,внутримышечных, подкожных и внутрибрюшинных инъекций. В этой связи все употребляемые стерильные водные среды получают стандартными методиками, хорошо известными квалифицированным специалистам. Для введения через кожу (например местно) готовят разбавленные стерильные, водные или частично водные растворы (обычно приблизительно 0,1-5%-ной концентрации), во всем остальном подобные вышеупомянутым парентеральным растворам. Способы приготовления различных фармацевтических композиций с некоторым коли