Гибридный полипептид &beta 1 &alpha-интерферона человека, его мутантные формы и производные и содержащая их фармацевтическая композиция

1 Предпосылки изобретения Применение полипептидов и белков для системного лечения конкретных заболеваний в настоящее время широко используется в медицинской практике. Роль, которую эти вещества играют в терапии, так важна, что многочисленные усилия исследователей направлены на их синтез в больших количествах с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Многие из этих полипептидов являются эндогенными молекулами, биологическое действие которых осуществляется очень эффективно и специфично. Основной фактор, ограничивающий применимость этих белковых веществ для намеченного применения, состоит в том, что при парентеральном введении они выводятся из организма в течение короткого времени. Это может происходить в результате протеазного метаболизма или при клиренсе с вовлечением обычных механизмов удаления белков, таких как фильтрация в почках. Проблемы, связанные с этими способами введения белков, хорошо известны в фармацевтической промышленности, и при попытках решить их используются различные стратегии. Интерфероны представляют собой семейство пептидов, на котором были сфокусированы многочисленные клинические исследования и усилия, предпринятые для усовершенствования способов их введения и биологического усвоения. Наличие интерферонов было определено при различных клинических болезненных состояниях. Применимость -интерферона человека, одного из членов этого семейства, лучше всего установлена для лечения рассеянного склероза. Для лечения этого заболевания в Европе и США недавно были лицензированы две формы рекомбинантного -интерферона. Одна форма представляет собой -1-интерферонBiogen, Inc., Cambridge, MA), далее в данном документе упоминается как "-1-интерферон",или "IFN1", или "IFN1", или "-1 интерферон", используемые взаимозаменяемо. Другая форма представляет собой -1 интерферон (торговые марка и название BETASERON, Berlex., Richmond CA), далее в данном документе упоминается как "-1 интерферон". -1-Интерферон продуцируется в клетках млекопитающих с использованием нативной последовательности гена человека и гликозилируется, тогда как -1-интерферон продуцируется бактериями Е. coli с использованием модифицированной последовательности гена человека, которая содержит генетически введенную замену цистеина на серии в аминокислотном положении 17, и не гликозилируется. Ранее некоторые из авторов данного изобретения непосредственно сравнили относительную активность in vitro -1-интерферона и 2 ваниях и показали, что удельная активность 1-интерферон приблизительно в 10 раз выше,чем удельная активность -1-интерферон(Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649). В результате исследований, призванных идентифицировать структурную основу этих различий в активности, авторы идентифицировали гликозилирование как единственное из известных структурных отличий между продуктами, которое влияет на удельную активность. Эффект углевода в значительной степени выражается через его стабилизирующее влияние на структуру. Стабилизирующий эффект углевода наблюдали в экспериментах по термической денатурации и SEC анализе. Отсутствие гликозилирования также коррелирует с усилением агрегации и повышенной чувствительностью к термической денатурации. Ферментативное удаление углевода из -1-интерферона с помощью PNGазы F вызывает интенсивное осаждение дегликозилированного продукта. Эти исследования показывают, что, несмотря на сохранение одинаковой последовательности -1-интерферона и -1-интерферона, они различны биохимически, и, таким образом, многое из того, что известно о -1 интерфероне, не может быть применено к -1 интерферону и наоборот. Сущность изобретения Авторы данного изобретения использовали преимущества гликозилированного -интерферона по сравнению с его негликозилированными формами. В частности, авторы разработали композицию -1-интерферона с повышенной активностью по сравнению с -1-интерфероном, и которая также имеет полезные свойства гибридных белков, как правило, без существенной утраты активности по сравнению с формами -1-интерферона, которые не являются гибридными белками. Так, если модификации проводят таким образом, чтобы продукты (гибридные белки -1-интерферона) сохраняли всю или большую часть биологической активности, в результате могут быть получены следующие свойства: изменение фармакокинетики и фармакодинамики, что приводит к увеличению периода полужизни и изменению распределения в тканях (например, способность оставаться в сосудистом русле в течение более длительного периода времени). Такая готовая препаративная форма является существенным достижением в фармацевтической и медицинской областях и может внести значительный вклад в лечение различных заболеваний, в которых применяется интерферон, таких как рассеянный склероз, фиброз и другие воспалительные или аутоиммунные заболевания, злокачественные опухоли, гепатит и другие вирусные заболевания, а также заболевания, характеризующиеся неоваскуляризацией. В частности, способность сохраняться в течение длительного времени в 3 сосудистом русле позволяет использовать -1 интерферон для подавления ангиогенеза и возможно для проникновения через гематоэнцефалический барьер. В частности, данное изобретение относится к выделенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность X-Y-Z,где X представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности -интерферона, или ее фрагмент; Y представляет собой необязательный линкерный фрагмент; и Z представляет собой полипептид,включающий, по меньшей мере, фрагмент полипептида, отличного от -интерферона. Необязательный фрагмент Y и необходимый фрагментZ могут быть связаны либо с N-концом, либо с С-концом -интерферона (X). ПредпочтительноX представляет собой человеческий -1 интерферон. В предпочтительных воплощенияхZ представляет собой, по меньшей мере, фрагмент константной области иммуноглобулина, и может быть получен из иммуноглобулина, принадлежащего к классу, выбранному из IgM, IgG,IgD, IgA и IgE. Если таким классом являетсяIgG, то его выбирают из IgG1, IgG2, IgG3 иIgG4. Константная область человеческих IgM иIgE содержит 4 константных участка (СН 1,(шарнир), СН 2, СН 3 и СН 4), тогда как константная область человеческих IgG, IgA и IgD содержит 3 константных участка (СН 1, (шарнир), СН 2 и СН 3). В наиболее предпочтительных гибридных белках данного изобретения константная область содержит, по меньшей мере, шарнирный домен и домены СН 2 и СН 3. В других воплощениях фрагмент Z представляет собой, по меньшей мере, фрагмент полипептида, который содержит иммуноглобулинподобные домены. Примеры таких других полипептидов включают CD1, CD2, CD4 и члены I и II классов антигенов главного комплекса гистосовместимости. В другом воплощении данного изобретения предоставляется гибридный белок, имеющий аминоконцевую область, состоящую из аминокислотной последовательности -интерферона или ее фрагмента, и имеющий карбоксиконцевую область, включающую, по меньшей мере, фрагмент белка, отличного от бетаинтерферона. Карбоксиконцевая область предпочтительно представляет собой, по меньшей мере, фрагмент константной области иммуноглобулина, полученный из иммуноглобулина,принадлежащего к классу, выбранному из IgM,IgG, IgD, IgA и IgE. В наиболее предпочтительных гибридных белках константная область содержит, по меньшей мере, шарнирный домен и домены СН 2 и СН 3. В другом воплощении данного изобретения предоставляется гибридный белок, в котором фрагмент -интерферона (например, X в 4 приведенной выше формуле) подвергается мутации с получением мутеинов, обладающих селективно повышенной антивирусной и/или антипролиферативной активностью или другими свойствами, улучшенными по сравнению с немутированными формами -1-интерферона. В дальнейшем аспекте данного изобретения предоставляется гибридный белок на основе-1-интерферона, включающий -1-интерферон и добавочный полипептид, с которым в природе он не связан, в существенно очищенном виде, причем гибридный белок обладает антивирусной активностью, приблизительно равной антивирусной активности-1 интерферон, не содержащего добавочный полипептид. В следующем аспекте данного изобретения предоставляется фармацевтическая композиция,включающая терапевтически эффективное количество гибридного белка на основе -1 интерферона. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - последовательность кДНК и расшифрованная аминокислотная последовательность гибрида гистидиновый маркер - -интерферон (упоминаемого также "his IFN-" или"His6-маркер"). Приведены последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность hisVCAM-1 сигнальной последовательности остается 3 аминоконцевых остатка (SerGlyGly) выше гистидинового маркера (His6, положения 4-9). Последовательность энтерокиназного линкера(AspAspAspAspLys) отделена от гистидинового маркера спейсером(положения 10-12,SerSerGly). Белковая последовательность природного IFM1 занимает положения (Met18Asn183). Фиг. 2 - кДНК и расшифрованная аминокислотная последовательность гибридного белка -1-интерферон/Fс. Приведены последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность человеческого IFN1/мышиный Fc. Белковые последовательности человеческого IFN1 перекрывают аминокислотные последовательности 1-166 (ДНК последовательности 1-498). Энтерокиназная линкерная последовательность перекрывает аминокислотные остатки 167-171(ДНК последовательности 499-513). Белковая последовательность тяжелой цепи мышиногоIgG2a перекрывает остатки 172-399 (ДНК последовательности 514-537). Фиг. 3 - связывание аланинзамещенных мутантных форм -интерферона с димерным гибридным белком, включающим внеклеточный домен цепи рецептора интерферона типа I,IFNAR2/Fc. Связывающее сродство аланинзамещенных мутантных форм IFN (А 1-Е) к рецепторной 5 цепи IFNAR2 определяют как описано в примере 1 (подраздел D). Гистограмма представляет их связывающее сродство в этом анализе по сравнению с диким типом his-IFN- (% от д.т.). Значения % от д.т. рассчитывали как отношение(сродство дикого типа his-IFN-)/(сродство мутантного IFN-)100. Показаны % от д.т. (х) для серийных анализов (n = 3) и средний % от д.т.IFNAR2/Fc при концентрациях, превышающих в 500 раз количество his-IFN-, соответствующее ЕС 50 . Фиг. 4 - связывание аланинзамещенных мутантных форм -интерферона с рецепторными комплексами клеточной поверхности для интерферона типа I ("комплекс IFNAR1/2"),экспрессированными на клетках лимфомы Дауди-Беркитта. Рецептор-связывающие свойства аланинзамещенных мутантных форм (А 1-Е) определяли с помощью анализа связывания рецептора клеточной поверхности с использованием FACS(клеточный сортер с возбуждением флуоресценции), как описано в примере 1 (подраздел D). Гистограмма представляет их рецепторсвязывающее сродство в этом анализе по сравнению с диким типом his-IFN- (% от д.т.). Значения % от д.т. для каждой мутантной формы рассчитывали как отношение (сродство д.т. hisIFN-)/(сродство мутантного IFN-)100. Показаны значения % от д.т. (о) для серийных анализов под гистограммой и средние значения % от д.т. (х) для конкретного эксперимента. Фиг. 5 - антивирусная активность аланинзамещенных мутантных форм -интерферона. Антивирусную активность аланинзамещенных мутантных форм (А 1-Е) определяли на человеческих клетках А 549, зараженных вирусом ЕМС, как описано в примере 1 (подраздел Е). Гистограмма представляет их активность в этом анализе по сравнению с диким типом his-IFN- (% от д.т.). Значения % от д.т. рассчитывали как отношение обратной концентрации мутантногоcре)/ концентрации д.т. his-IFN- (50% cре)100. Показаны значения % от д.т. (о) для множественных анализов и средние значения для экспериментального набора данных (х). Фиг. 6 - антипролиферативная активность аланинзамещенных мутантных форм интерферона. Антипролиферативную активность аланинзамещенных мутантных форм (А 1-Е) определяли на клетках лимфомы Дауди-Беркитта,как описано в примере 1 (подраздел Е). Гистограмма представляет их активность в этом анализе по сравнению с диким типом his-IFN- (% от д.т.). Значения % от д.т. рассчитывали как отношение концентрации д.т. his-IFN- (50% ингибирования роста)/концентрации мутантногоIFN- (50% ингибирования роста)100. Показаны значения % от д.т. (о) для множественных анализов и средние значения для экспериментального набора данных (х). Фиг. 7 - относительная антивирусная и антипролиферативная активность аланинзамещенных мутантных форм -интерферона. Сравнивали относительную активность аланинзамещенных мутантных форм (А 1-Е) в антивирусном (ось X) и антипролиферативном(ось Y) анализах. Для проведения этого сравнения использовали средние значения процента от активности дикого типа his-IFN- (% от д.т. (х,приведенные на фиг. 5 и 6. Мутантные формы с пропорциональным отношением падение/рост активности попадают на вертикальную линию,или в близлежащую к этой линии область. Мутантные формы с непропорциональным отношением падение/рост антивирусной или антипролиферативной активности попадают в существенно отдаленную от диагональной линии область (DE1, D, C1). Значение определяли из анализа стандартных отклонений, присущих используемым средним значениям % от д.т. Фиг. 8 - антивирусная активность гибридного белка -1-интерферон/Ig. Активность -1 а-интерферон (использующегося в виде AVONEX) или гибридного белка -1-интерферон/мышиный Ig2a в концентрациях, указанных на оси X, оценивали в антивирусных анализах с использованием клеток карциномы легких человека (А 549), зараженных вирусом ЭМК (энцефаломиокардита). После двух дней инкубации с вирусом жизнеспособные клетки окрашивали МТТ, плашки считывали при 450 нм и поглощение, которое отражало жизнеспособность клеток, указывали на оси Y. Стандартные отклонения показаны как величины ошибки. Концентрация -1-интерферона(использующегося в виде AVONEX bulk intermediate), которая предлагается (50% от максимального OD450) и, следовательно, 50% вирусной гибели ("50% цитопатический эффект"),составляла приблизительно 0,4 пМ, а 50% цитопатический эффект для гибридного -1 аинтерферона соответствовал приблизительно 0,15 пМ. Фиг. 9 - измерения антивирусной активности -интерферона в плазме мышей, обработанным гибридным белком -1-интерферон/Fс или -1-интерфероном. Мышам внутривенно вводили или 50000 ед. -1-интерферона (использующегося в видеAVONEX bulk intermediate), или 50000 ед. гибридного белка -1-интерферон/Fс. Кровь от этих мышей получали из ретро-орбитального синуса через различные промежутки времени после введения интерферона, как указано на осиX. Для каждой временной точки кровь брали по меньшей мере у 3 мышей, плазму получали и замораживали до того времени, когда актив 7 ность -интерферона оценивали в антивирусных анализах с использованием клеток карциномы легкого человека (А 549), зараженных вирусом энцефаломиокардита. Жизнеспособные клетки окрашивали раствором МТТ, плашки считывали при 450 нм для определения поглощения, которое свидетельствует о жизнеспособности клеток и активности -интерферон. Стандартные кривые получали для каждой плашки с использованием -1-интерферона в виде AVONEX и использовали для количественного определения активности -интерферона в каждом образце. Приведены данные для индивидуальных животных. Фиг. 10 - последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность открытых рамок считывания непосредственного гибрида человеческого IFN- и человеческогоIgGlFc (ZL5107). Фиг. 11 - последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность открытой рамки считывания гибридного белка,состоящего из человеческого IFN-/линкераG4S/человеческого IgG1Fc (ZL6206). Подробное описание изобретения Все ссылки, цитируемые в подробном описании, включены в данный документ в качестве ссылок, если не оговорено иначе. В данном документе используются следующие термины.I. Определения. Интерферон - "интерферон" (также упоминается как "IFN") представляет собой небольшой, видо-специфичный одноцепочечный полипептид, продуцирующийся клетками млекопитающих в ответ на воздействие ряда индукторов, таких как вирусы, полипептиды, митогены и т.п. Наиболее предпочтительным интерфероном, использующимся в данном изобретении,является гликозилированный человеческий интерферон, который гликозилирован по 80 остатку (Asn 8) и который предпочтительно получают посредством технологий рекомбинантных ДНК. Этот предпочтительный гликозилированный -интерферон называют "-1-интерферон"(или "IFN1", или "IFN1", или "-1 интерферон", или "-1-интерферон", или "1-интерферон-", используемые взаимозаменяемо). Подразумевается, что термин "-1 интерферон" также охватывает все мутантные формы (см. пример 1), при условии, что мутантные формы также являются гликозилированными по остатку Asn 80. Способы получения белков, включая интерфероны, с использованием рекомбинантных ДНК, являются известными. См., например, патенты США 4399216, 5149636, 5179017 (Axel etal.) и 4470461 (Kaufman). Предпочтительные полинуклеотиды, которые могут использоваться в способах настоящего изобретения, получают из генных последовательностей -интерферона дикого типа различ 005005 8 ных позвоночных животных, предпочтительно млекопитающих, с помощью методов, хорошо известных рядовым специалистам в данной области, таких как методы, описанные в следующих патентах США: патент США 5641656 (выданный 24 июня 1997 г.: DNA encoding aviansub-sequences of different, naturally occurring leukocyte interferons). В соответствии с данным изобретением могут быть использованы мутантные формы 1-интерферона. Мутации проводят с помощью традиционных методов направленного мутагенеза, известных рядовым специалистам в данной области. Кроме того, данное изобретение предоставляет функционально эквивалентные полинуклеотиды -1-интерферона, которые кодируют функционально эквивалентные полипептидные последовательности -1-интерферона. Первый полинуклеотид, кодирующий 1-интерферон, является "функционально эквивалентным" по отношению ко второму полинуклеотиду, кодирующему -1-интерферон,если он удовлетворяет по меньшей мере одному из следующих условий:(a) "функциональным эквивалентом" является первый полинуклеотид, который гибридизуется со вторым полинуклеотидом в стандартных условиях гибридизации, и/или является вырожденным по отношению к первой полинуклеотидной последовательности. Наиболее предпочтительно он кодирует мутантную форму интерферона, обладающую терапевтической активностью -1-интерферона;(b) "функциональным эквивалентом" является первый полинуклеотид, который программирует экспрессию аминокислотной последовательности, которую кодирует второй нуклеотид. Таким образом, термин "интерферон" включает, не ограничиваясь ими, перечисленные выше агенты, а также их функциональные эквиваленты. В данном документе термин"функциональный эквивалент", следовательно,относится к белку -1-интерферон, или к полинуклеотиду, кодирующему белок -1-интерферон, который обладает таким же или улуч 9 шенным полезным действием на млекопитающего-реципиента, как и интерферон, функциональным эквивалентом которого он считается. Как известно рядовому специалисту в данной области, функционально эквивалентный белок может продуцироваться посредством рекомбинантных методов, например, посредством экспрессии "функционально эквивалентной ДНК". Соответственно настоящее изобретение охватывает белки -1-интерферон, которые кодируются встречающимися в природе ДНК, а также синтетическими ДНК, которые кодируют тот же белок, что и встречающиеся в природе ДНК. Вследствие вырожденности кодирующих нуклеотидных последовательностей для кодирования -1-интерферона могут использоваться другие полинуклеотиды. Они включают фрагменты вышеупомянутых последовательностей,или вышеупомянутые последовательности целиком, которые изменены в результате замещения различных кодонов, кодирующих одни и те же аминокислотные остатки в пределах последовательности, что приводит, таким образом, к образованию молчащей замены. Измененные таким образом последовательности рассматриваются в качестве эквивалентов этих последовательностей. Например, Phe (F) кодируют два кодона, ТТС или ТТТ, Туr (Y) кодируют ТАС или ТАТ и His (H) кодируют САС или CAT. С другой стороны, Trp (W) кодирует единственный кодон, TGG. Соответственно, понятно, что для данной последовательности ДНК, кодирующей конкретный интерферон, существует много вырожденных последовательностей ДНК,которые кодируют его. Вырожденные последовательности ДНК рассматриваются в объеме данного изобретения."Гибрид" - относится к колинеарным, ковалентно связанным через индивидуальные пептидные каркасы, двум или более белкам или их фрагментам, наиболее предпочтительно продуцируемым посредством генной экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки. Предпочтительно, если белки или их фрагменты происходят из разных источников. Таким образом, предпочтительные гибридные белки включают белок -1-интерферон, или его фрагмент, ковалентно связанный со вторым компонентом, который не является интерфероном. Конкретно, "гибрид интерферон-/Ig" представляет собой белок, включающий молекулу -интерферона данного изобретения (например, -1-интерферона) или ее фрагмент, Nконец или С-конец, которой связан с N-концом иммуноглобулиновой цепи, где часть Nконцевой области иммуноглобулина заменена на -интерферон. Разновидностью гибридного белка -интерферон/Ig является "гибрид интерферон/Fc", который представляет собой белок, включающий молекулу -интерферона данного изобретения 10 интерферона), связанную по меньшей мере с частью константного домена иммуноглобулина. Предпочтительный Fc-гибрид включает молекулу -интерферона данного изобретения, связанную с фрагментом антитела, содержащим Сконцевой домен тяжелой цепи иммуноглобулина. Кроме того, термин "гибридный белок" обозначает белок интерферон-, химически связанный через моно- или гетерофункциональную молекулу со вторым компонентом, который не является белком -интерферон и который получают de novo из очищенного белка, как описано ниже. В данном документе термин "рекомбинантный" означает, что белок получают из рекомбинантной экспрессирующей системы млекопитающего. Белок, экспрессирующийся в большинстве бактериальных культур, например,в Е. coli, не содержит гликана, поэтому эти экспрессирующие системы не являются предпочтительными. Белок, экспрессирующийся в дрожжах, может содержать олиго-сахаридные структуры, которые отличаются от олигосахаридных структур белка, экспрессированного в клетках млекопитающего. Термин "биологически активный", использующийся в данном описании в качестве характеристики -1-интерферона, означает, что конкретная молекула обладает достаточной степенью гомологии аминокислотной последовательности по сравнению с молекулами воплощений настоящего изобретения, раскрытых в данном документе, для того, чтобы быть способной к антивирусной активности, которую измеряют в антивирусном анализе in vitro такого типа, как показано в примере 1, как описано ниже. Термин "терапевтическая композиция",использующийся в данном документе, определяется как включающий белки данного изобретения и другие физиологически совместимые ингредиенты. Терапевтическая композиция может включать такие наполнители, как вода, минеральные вещества и носители, такие как белок."Аминокислота" - мономерная единица пептида, полипептида или белка. Существует двадцать аминокислот, обнаруженных в природных пептидах, полипептидах и белках, все они являются L-изомерами. Этот термин также включает аналоги этих аминокислот и Dизомеры аминокислот белков и их аналогов."Модифицированная" аминокислота представляет собой природную или синтетическую аминокислоту, в которой присутствующую в норме боковую цепь или концевую группу (или фрагмент сахара в случае -1-интерферона) модифицируют с помощью химической реакции. Такие модификации включают, например,-карбоксилирование,-карбоксилирование,конъюгирование с ПЭГ, сульфирование, суль 11 фонирование,фосфорилирование,амидирование, этерифицирование, N-ацетилирование,карбобензилирование, тозилирование, а также другие модификации, известные в данной области. "Модифицированный полипептид" представляет собой полипептид, содержащий одну или несколько модифицированных аминокислот и/или один или несколько модифицированных сахаров, если пептид является гликозилированным."Белок" - это любой полимер, состоящий,по существу, из любых из 20 аминокислот. Хотя термин "полипептид" часто используется для обозначения относительно больших полипептидов, а термин "пептид" часто используется для обозначения маленьких полипептидов, области применения этих терминов в данной области перекрываются и варьируют. Термин "белок",как используется в данном документе, относится к пептидам, белкам и полипептидам, если не оговорено иначе."Функциональным эквивалентом" аминокислотного остатка является аминокислота, обладающая физико-химическими свойствами,сходными с физико-химическими свойствами аминокислотного остатка, который заменяют на функциональный эквивалент."Мутантная форма" - любое изменение в генетическом материале организма, в частности,любое изменение (например, делеция, замещение, добавление или изменение) в полинуклеотидной последовательности дикого типа, или любое изменение в белке дикого типа. Термин"Дикий тип" - встречающаяся в природе полинуклеотидная последовательность экзона белка, или ее фрагмент, или белковая последовательность, или ее фрагмент, соответственно,как она обычно существует in vivo."Стандартные условия гибридизации" - солевые и температурные условия, по существу,эквивалентные от 0,5 х SSC (раствор хлорида и цитрата натрия) до 5 х SSC и 65 С как для гибридизации, так и для промывания. Следовательно, в данном документе термин "стандартные условия гибридизации" является рабочим определением и охватывает разные условия гибридизации. Более строгие условия могут, например, включать гибридизацию с использованием буфера для скрининга бляшек (0,2% поливинилпирролидон, 0,2% фиколл 400; 0,2% бычий сывороточный альбумин, 50 мМ Tris-HCl (рН 7,5); 1 М NaCl; 0,1% пирофосфат натрия; 1%SDS); 10% декстрансульфата и 100 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком,ДНК спермы лосося при 65 С в течение 12-20 ч,и промывание смесью 75 мМ NaCl/7,5 мМ цитрат натрия (0,5 х SSC)/1% SDS при 65 С. Менее строгие условия могут, например, включать гибридизацию с использованием буфера для скрининга бляшек 10% декстрансульфата и 110 12 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком, ДНК спермы лосося при 55 С в течение 12-20 ч, и промывание смесью 300 мМNaCl/30 мМ цитрат натрия (2,0 х SSC)/1% SDS при 55 С. См. также Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, Inc. New"Последовательность,контролирующая экспрессию" - это последовательность полинуклеотидов, которая контролирует и регулирует экспрессию генов, будучи оперативно связана с этими генами."Оперативно связанный" - полинуклеотидная последовательность (ДНК, РНК), оперативно связана с последовательностью, управляющей экспрессией, если управляющая экспрессией последовательность контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию этой полинуклеотидной последовательности. Термин"оперативно связанный" включает наличие соответствующего стартового сигнала (например,ATG) в начале полинуклеотидной последовательности, которая должна экспрессироваться, и сохранение правильной рамки считывания для обеспечения экспрессии полинуклеотидной последовательности под контролем последовательности, контролирующей экспрессию, и продукции целевого полипептида, кодируемого этой полинуклеотидной последовательностью."Экспрессирующий вектор" - полинуклеотид, такой как плазмидная или фаговая ДНК(среди других обычных примеров), который позволяет экспрессироваться по меньшей мере одному гену, если экспрессирующий вектор введен в клетку-хозяина. Вектор может быть способным или неспособным к репликации в клетке."Выделенный" (этот термин является взаимозаменяемым с термином "существенно чистый") - при применении к нуклеиновой кислоте, например, полинуклеотидным последовательностям, которые кодируют полипептиды,обозначает полинуклеотидную последовательность РНК или ДНК, фрагмент геномного полинуклеотида, кДНК, или синтетический полинуклеотид, который в результате особенностей его происхождения или манипуляций, проведенных с ним, (i) не связан с целым полинуклеотидом, с которым он связан в природе (например, присутствует в клетке-хозяине в виде экспрессионного вектора или его фрагмента); или (ii) связан с нуклеиновой кислотой или другим химическим фрагментом, отличающимся от того, с которым он связан в природе; или (iii) не встречается в природе. Термин "выделенный" также обозначает полинуклеотидную последовательность, которую (i) получают в результате амплификации in vitro посредством, например,полимеразной цепной реакции (PCR); (ii) синтезируют химически; (iii) получают рекомбинантным методом путем клонирования; или (iv) 13 очищают, например, путем расщепления и разделения в геле. Таким образом, "существенно чистой нуклеиновой кислотой" является нуклеиновая кислота, которая не соседствует непосредственно с одной или обеими кодирующими последовательностями, с которыми она обычно соседствует в природном геноме организма, из которого получают нуклеиновую кислоту. Существенно чистая ДНК также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительные последовательности."Выделенный" (этот термин используется взаимозаменяемо с термином "существенно чистый") - при применении к полипептидам обозначает полипептид или его фрагмент, который, в результате особенностей его происхождения или манипуляций, проведенных с ним (i) присутствует в клетке-хозяине как продукт экспрессии фрагмента экспрессионного вектора; или (ii) связан с белком или другим химическим фрагментом, отличным от того, с которым он связан в природе; или (iii) не встречается в природе. Термин "выделенный" также обозначает белок, который (i) синтезируют химически; или(ii) экспрессию которого осуществляют в клетке-хозяине и очищают его от связанных с ним белков. Этот термин обычно обозначает полипептид, который был отделен от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он встречается в природе. Предпочтительно этот полипептид также отделен от таких веществ, как антитела или гелеобразные матрицы (полиакриламид), которые используются для его очистки."Гетерологичный промотер" - в данном документе обозначает промотер, который в природных условиях не связан с геном или очищенной нуклеиновой кислотой."Гомологичный" - в данном документе является синонимом термину "идентичный" и относится к подобию последовательностей двух полипептидов, молекул, или двух нуклеиновых кислот. Если положение в обоих из двух сравниваемых последовательностей занято одной и той же основной или аминокислотной мономерной субъединицей (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином,или положение в каждом из двух полипептидов занято лизином), то соответствующие молекулы являются гомологичными по этому положению. Процент гомологии двух последовательностей определяют как число парных или гомологичных положений, общих для двух последовательностей, деленное на число сравниваемых положений, x100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях являются равносильными или гомологичными, то две последовательности являются гомологичными на 60%. Например, последовательности ДНК(3 из 6 общих положений являются равносиль 005005 14 ными). Обычно сравнение проводят при выравнивании двух последовательностей, с получением максимальной гомологии. Такое совмещение может быть проведено с помощью, например,метода Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453(1970) с соответствующим обеспечением такими компьютерными программами, как Alignprogram (DNAstar, Inc.). Гомологичные последовательности имеют идентичные или подобные аминокислотные остатки, где подобные остатки представляют собой консервативные замещения на соответствующие аминокислотные остатки в выровненной последовательности отнесения, или "разрешенные точковые мутации" этих аминокислотных остатков. В этом отношении "консервативными заменами" остатков в последовательности отнесения являются замещения на такие остатки, которые физически или функционально подобны соответствующим остаткам отнесения, например, которые имеют сходный размер, форму, электрический заряд,химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи,или т.п. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются замещения,удовлетворяющие критерию, определенному для "допустимой точковой мутации" в DayhoffFoundation, Washington, D. C. (1978). Термины "полинуклеотидная последовательность" и "нуклеотидная последовательность" в данном документе также использующиеся взаимозаменяемо. Термины "неоваскуляризация" и "ангиогенез" в их самом широком смысле обозначают образование новых кровеносных сосудов. В частности, термин "ангиогенез" также относится к образованию новых кровеносных сосудов в области опухоли."IFNAR2", "IFNAR1", "IFNAR1/2" относится к белкам, которые, как известно, составляют клеточный поверхностный рецептор интерферона типа I. Внеклеточный фрагмент (эктодомен) цепи IFNAR2 может один связывать интерферонили . При осуществлении настоящего изобретения применяются, если не оговорено иначе, традиционные методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии,микробиологии, рекомбинантных ДНК, белковой химии и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации специалистов данного уровня техники. Такие методы описаны в литературе. См., например, Molecular Cloning: AII. Получение и экспрессия гибридных белков. Настоящее изобретение относится к системе получения гибридных белков на основе 1-интерферона. В частности настоящее изобретение относится к этим белкам, а также к рекомбинантным молекулам ДНК, использующимся для их получения. Получение полипептидов данного изобретения может осуществляться с помощью ряда методов, известных в данной области. Например, полноразмерный -1-интерферон или укороченные формы -1-интерферона могут быть получены с помощью известных методов с использованием рекомбинантной кДНК (см. ниже). Ген, который кодирует целевой полипептид -1-интерферон, может быть сконструирован на основе аминокислотной последовательности целевого полипептида. Затем для синтеза этого гена могут быть применены стандартные методы. Например, аминокислотная последовательность может использоваться для конструирования обратно-транслируемого гена. Олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, способную кодировать -1 интерферон, может быть получен в одну стадию. Альтернативно, можно синтезировать несколько олигонуклеотидов меньшего размера,кодирующих фрагменты целевого -1 интерферона, и затем сшить их вместе. Предпочтительно последовательность ДНК, кодирующую фрагмент -1-интерферона, получают в виде нескольких отдельных олигонуклеотидов, которые затем сшивают вместе (см. пример 2). Индивидуальные олигонуклеотиды обычно содержат 5'- или 3'-липкие концы для обеспечения комплементарной сборки. После сборки предпочтительные гены характеризуются последовательностями, которые распознаются рестрикционными эндонуклеазами (включая уникальные сайты рестрикции для непосредственной вставки в клонирующий или экспрессирующий вектор), предпочтительными кодонами, взятыми в соответст 005005(предпочтительно клеткой млекопитающего), и последовательностью, которая при транскрипции дает стабильную, эффективно транслирующуюся РНК. Правильность сборки может быть подтверждена путем секвенирования нуклеиновой кислоты, рестрикционного картирования и экспрессии биологически активного полипептида в подходящем хозяине. кДНК -интерферона млекопитающих может быть выделена с использованием последовательности ДНК человеческого -интерферона в качестве зонда для скрининга конкретной библиотеки кДНК млекопитающих путем перекрестно-видовой гибридизации. -интерферон млекопитающих включает, например, интерферон приматов, человеческий, мышиный,собачий, кошачий, бычий, лошадиный и свиной-интерферон. -интерферон млекопитающих может быть получен путем перекрестновидовой гибридизации с использованием одноцепочечной кДНК, полученной из последовательности ДНК человеческого -интерферона в качестве гибридизационного зонда для выделения кДНК -интерферона из библиотек кДНК млекопитающих. К методам, которые могут использоваться для выделения и клонирования генных последовательностей интерферона, относятся методы, выявленные в патентах США,приведенных выше. Особое значение имеют,однако, положения патента США 4738931 (19 апреля 1988 г.), описывающего ДНК, содержащую ген человеческого -интерферона. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным молекулам ДНК, включающим вышеупомянутые последовательности ДНК. Рекомбинантные молекулы ДНК данного изобретения способны управлять экспрессией полипептидов данного изобретения в организмах-хозяинах, трансформированных с помощью этих молекул. Для осуществления такой экспрессии последовательность ДНК, кодирующая гибридный полипептид данного изобретения, должна быть оперативно связана с последовательностью, управляющей экспрессией. Для обеспечения адекватной транскрипции рекомбинантных конструкций данного изобретения предпочтительно в рекомбинантный вектор можно включить последовательность промотора/энхансера, при условии, что промоторная/управляющая экспрессией последовательность способна управлять транскрипцией нуклеотидной последовательности, кодирующей гликозилированный -интерферон. Промоторы,которые могут быть использованы для управления экспрессией гибридного белка на основе иммуноглобулина включают, не ограничиваясь ими, участок раннего промотора SV40 (Benoistand Chambon, 1981, Nature 290:304-310), промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto, et al., 17 1980, Cell 22:787-797), промотор тимидинкиназы вируса герпеса (Wagner et al., 1981, Proc Natl.Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), регуляторные последовательности гена металлотионина (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); векторы для осуществления экспрессии в растениях, включающие промоторный участок нопалинсинтетазы (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213) или РНК промотор вируса мозаики цветной капусты 35S (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), и промотор фотосинтетического фермента рибулозобифосфаткарбоксилазы (HerreraEstrella et al., 1984, Nature 310:115-120); промоторные элементы из дрожжей или других грибков, такие как промотор Gal 4, промотор ADC(алкогольдегидрогеназы), промотор PGK (фосфоглицеринкиназы), промотор щелочной фосфатазы и следующие контролирующие транскрипцию области животного происхождения,которые проявляют тканевую специфичность и применяются у трансгенных животных: участок,контролирующий ген эластазы I, который активен в клетках поджелудочной железы (Swift etMacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); энхансеры или промоторы гена инсулина, которые активны в -клетках поджелудочной железы(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); энхансеры или промоторы гена иммуноглобулина, которые активны в лимфоидных клетках (Grosschedl etCell. Biol. 7:1436-1444); участки раннего промотора и энхансера цитомегаловируса (Boshart etal., 1985, Cell 41:521-530); контролирующая область вируса опухоли мышиной молочной железы, который является активным в семенниках,молочной железе, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); участок,управляющий геном альбумина, который является активным в печени (Pinkert et al., 1987,Genes and Devel. 1:268-276); участок, управляющий геном -фетопротеина, который является активным в печени (Krumlauf et al., 1985,Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987,Science 235:53-58); участок, управляющий геном -1-антитрипсина, который является активным в печени (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); участок, управляющий геном глобина, который является активным в миелоидных клетках (Morgam et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cel 46:89-94); участок, управляющий геном основного белка миелина, который является активным в олигодендроцитарных клетках мозга (Readhead et al.,1987, Cell 48:703-712); участок, управляющий геном легкой цепи-2 миозина, который является активным в скелетных мышцах (Sani, 1985, Nature 314:283-286); участок, управляющий геном релизинг-фактора гонадотропин, который явля 005005 18 ется активным в гипоталамусе (Mason et al.,1986, Science 234:1372-1378). Прокариотические экспрессионные системы, такие как LAC, или промотор бета-лактамазы (Villa-Kamaroff, et al.,1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731),не являются в настоящее время предпочтительными, поскольку экспрессируемый -интерферон не является гликозилированным. Тем не менее, прокариотические экспрессионные системы, которые позволяют протекать гликозилированию -интерферона либо в прокариотических, либо в эукариотических организмаххозяевах, входят в объем данного изобретения. Экспрессионные векторы, которые могут быть использованы, включают, не ограничиваясь ими, следующие векторы или их производные: вирусы человека или животных, такие как вирус оспы коров, векторы на основе аденовируса или ретровируса; вирусы насекомых, такие как бакуловирус; дрожжевые векторы; бактериофаговые векторы (например, лямбда) и векторы из плазмидной и космидной ДНК, здесь перечислены только некоторые. Конкретно,пригодные экспрессионные векторы для предпочтительных эукариотических хозяев включают векторы, содержащие последовательности,управляющие экспрессией, из SV40, бычьего папилломавируса, цитомегаловируса. Кроме того, в каждом конкретном экспрессионном векторе для вставки этих последовательностей ДНК могут быть выбраны различные сайты. Эти сайты обычно обозначают по названию рестрикционной эндонуклеазы, которая разрезает их. Они хорошо известны специалистам в данной области. Понятно, что для данного экспрессионного вектора, использующегося в данном изобретении, присутствие сайта рестрикционной эндонуклеазы для вставки выбранного фрагмента ДНК не является обязательным. Вместо этого, вектор может быть соединен с фрагментом с помощью альтернативных средств. Экспрессирующий вектор, и сайт, выбранный для вставки выбранного фрагмента ДНК, и оперативная связь с последовательностью,управляющей экспрессией, определяется с помощью ряда факторов, таких как число сайтов,чувствительных к конкретному рестрикционному ферменту, размер полипептида, насколько легко происходит протеолитическое расщепление полипептида и т.п. Выбор вектора и сайта вставки для данной ДНК определяют по балансу этих факторов. Рекомбинантные конструкции данного изобретения могут быть введены в клеткихозяева, которые способны экспрессировать гибридный белок, с помощью любого метода,известного в данной области, включая трансформацию (например, с помощью методик с использованием DEAE-декстрана или фосфата кальция), трансфекцию, микроинъекцию, ин 19 фекцию, "бомбардировка" клетки (cell gun) и электропорацию. Можно использовать любой тип клеток-хозяев при условии, что последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, могут адекватно транскрибироваться в мРНК в данном типе клеток, и в данном типе клеток может происходить гликозилирование белка. Кроме того,рекомбинантные конструкции нуклеиновых кислот данного изобретения могут использоваться для создания трансгенных животных,отличных от человека, способных продуцировать гибридный белок на основе иммуноглобулина. В предпочтительных воплощениях данного изобретения клеткой-хозяином является клетка млекопитающего, такая как клетка COS или СНО. Успешное введение таких полинуклеотидных конструкций в данный экспрессирующий вектор может быть установлено с помощью трех общих подходов (а) ДНК-ДНК гибридизации,(b) присутствие или отсутствие "маркерных" генных функций и (с) экспрессия вставленных последовательностей. В первом подходе присутствие гена -1-интерферона, введенного в экспрессирующий вектор, может быть установлено с помощью ДНК-ДНК гибридизации, с использованием зондов, включающих последовательности, которые являются гомологичными по отношению к введенному гену гибридного белка. Во втором подходе система рекомбинантный вектор/хозяин может быть идентифицирована и выбрана на основе присутствия или отсутствия некоторых функций "маркерных" генов (например, тимидинкиназной активности,устойчивости к антибиотикам, таким как G418,изменения фенотипа, блокировка образования телец бакуловирусов и др.), что вызвано введением чужеродных генов в вектор. Например,если полинуклеотид вставлен так, что он прерывает последовательность маркерного гена данного вектора, рекомбинанты, содержащие данную вставку, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. В третьем подходе рекомбинантные экспрессионные векторы могут быть идентифицированы путем анализа продукта чужеродного гена, который экспрессируется посредством рекомбинантного вектора. Такие анализы могут основываться,например, на физических или химических свойствах генного продукта в биоаналитических системах. Понятно, что не все комбинации хозяин/экспрессирующий вектор будут функционировать с равной эффективностью в экспрессирующих последовательностях ДНК, которые кодируют полипептиды данного изобретения. Однако специалисты в данной области после тщательного анализа основных положений, изложенных в данном документе, могут сделать конкретный выбор комбинации хозяин 005005 20 экспрессирующий вектор, не выходя за рамки данного изобретения. В предпочтительном воплощении данного изобретения рассматриваются гибридные белки и последовательности ДНК, кодирующие их. Данные гибридные белки имеют аминоконцевой участок, характеризующийся аминокислотной последовательностью -1-интерферона, и карбоксиконцевой участок, включающий домен белка, отличного от -1-интерферона. Предпочтительной общей формулой для такого белка является белок, имеющий первичную аминокислотную последовательность X-YZ, где X представляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности человеческого -интерферона, или ее фрагмент;Y представляет необязательный линкерный фрагмент; и Z представляет полипептид, включающий, по меньшей мере, фрагмент полипептида, отличного от человеческого -интерферона. В одном воплощении фрагмент Z может быть частью полипептида, который содержит иммуноглобулин-подобные домены. Примеры таких полипептидов включают CD1, CD2, CD4 и члены I и II классов антигенов главного комплекса гистосовместимости. Примеры таких полипептидов приведены в патенте США 5565335 (Capon et al.). Фрагмент Z может включать, например,множество гистидиновых остатков или предпочтительно Fc область иммуноглобулина, "Fc" определяется в данном документе как фрагмент антитела, содержащий С-концевой домен тяжелых цепей иммуноглобулина. В большинстве предпочтительных гибридных белков полипептид -1-интерферон соединен через его С-конец по меньшей мере с частью Fc области иммуноглобулина. -1 интерферон образует аминоконцевой фрагмент,a Fc область образует карбоксиконцевой фрагмент. В этих гибридных белках Fc область предпочтительно ограничена константным доменом шарнирного участка и доменами СН 2 и СН 3. Fc область в этих гибридных белках также может быть ограничена фрагментом шарнирного участка, причем данный фрагмент способен образовывать межмолекулярные дисульфидные мостики, и доменами СН 2 и СН 3, или их функциональными эквивалентами. Эти константные области могут быть получены из любого млекопитающего, использующегося в качестве источника (предпочтительно человека), и из любого соответствующего класса и/или изотипа, включая IgA, IgD, IgM, IgE и IgG1, IgG2, IgG3 иIgG4. Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют гибриды на основеIg, могут быть получены с помощью любого метода, известного в данной области (Maniatis etHarbor, N.Y.), или получены из доступных библиотек клонов. Методы получения генов, которые кодируют тяжелую или легкую цепь константных областей иммуноглобулинов, приведены, например, в Robinson, R. et al., заявка РСТ, публикацияWО 87-02671. Последовательность кДНК, кодирующая молекулу или фрагмент интерферона, может быть непосредственно соединена с кДНК, кодирующей тяжелую цепь константных областей Ig, или может быть соединена с ней через линкерную последовательность. В следующих воплощениях данного изобретения может быть создана рекомбинантная векторная система, содержащая последовательности, кодирующие -интерферон, в корректной рамке считывания с последовательностью, кодирующей синтетический шарнирный участок. Кроме того, может быть желательным включение в качестве части рекомбинантной векторной системы нуклеиновых кислот, соответствующих 3'-фланкирующей области гена иммуноглобулина, включая сайты расщепления РНК/полиаденилирования и последовательности, находящиеся ниже по ходу транскрипции. Кроме того, может быть желательно конструирование сигнальной последовательности выше последовательностей, кодирующих гибридный белок на основе иммуноглобулина, для облегчения секреции гибридной молекулы из клетки,трансформированной рекомбинантным вектором. Настоящее изобретение предоставляет димерные гибридные молекулы, а также мономерные или мультимерные молекулы, включающие гибридные белки. Такие мультимеры могут быть образованы путем использования таких Fc областей, или их фрагментов, или молекул Ig,которые обычно являются мультивалентными,таких как пентамеры IgM, или димеры IgA. Понятно, что J цепь полипептида может быть нужна для образования и стабилизации пентамеровIgM и димеров IgA. Альтернативно мультимеры гибридных белков на основе -1-интерферона могут быть образованы с использованием белка,обладающего сродством к Fc области молекулIg, таких как белок А. Например, множество гибридных белков -1-интерферон/иммуноглобулин может быть связано с белком А, сшитым с агарозными гранулами. Данные поливалентные формы являются пригодными, так как они обладают множеством участков, связывающих рецептор -интерферона. Например, бивалентный растворимый 1-интерферон может состоять из двух последовательно соединенных повторов аминокислот от 1 до 166 в последовательности SEQ ID NO: 2(или кодируемых нуклеиновыми кислотами под номерами от 1 до 498 в последовательностиY), повторы связаны, по меньшей мере, с фрагментом константного домена иммуноглобулина(фрагмент Z). Также могут быть сконструированы альтернативные поливалентные формы, например, путем химического связывания гибридов -1-интерферон/Ig с любой химически приемлемой молекулой носителя, полимером,выбранным из группы, состоящей из фиколла,полиэтиленгликоля или декстрана, с помощью традиционных методов сочетания. Альтернативно, -1-интерферон может быть химически связан с биотином, затем конъюгат биотининтерферонFc связывается с авидином, что приводит к образованию тетравалентных молекул авидин/биотин/-интерферон. Гибриды 1-интерферон/Ig могут также ковалентно связываться с динитрофенолом (ДНФ (DNP или тринитрофенолом (ТНФ (TNP, полученный конъюгат осаждают анти-ДНФ- или анти-ТНФIgM, с образованием декамерных конъюгатов с валентностью, равной 10 для участков, связывающих рецептор -интерферона. Белки, фрагменты и гибридные белки на основе -1-интерферона данного изобретения могут быть выделены и очищены в соответствии с традиционными условиями, такими как экстракция, осаждение, хроматография, аффинная хроматография, электрофорез или т.п. Например, белки и фрагменты на основе интерферона могут быть очищены путем пропускания их раствора через колонку с иммобилизованным рецептором интерферона (см. патент США 4725669). Связанную интерфероновую молекулу можно затем элюировать путем обработки хаотропной солью или путем элюирования водным раствором уксусной кислоты. Иммуноглобулиновые гибридные белки могут быть очищены путем пропускания раствора, содержащего гибридный белок через колонку с иммобилизованным белком А или белком G, которые селективно связывают Fc фрагмент гибридного белка. См., например, Reis, К.J., et al., J. Immunol. 132:3098-3102 (1984); заявку РСТ, публикацияWО 87/00329. Затем химерное антитело можно элюировать путем обработки хаотропной солью или путем элюирования водным раствором уксусной кислоты. Альтернативно белки на основе интерферона и гибридные молекулы с иммуноглобулином могут быть очищены на колонках с антителами против интерферона или на колонках с антителами против иммуноглобулина, с получением существенно чистого белка. Под термином"существенно чистый" подразумевается, что белок является свободным от примесей, которые в природе связаны с ним. Степень чистоты может быть подтверждена наличием одной полосой в электрофорезе. Примером подходящего гибридного белка-1-интерферон/Ig данного изобретения является SEQ ID NO: 2, которая секретируется в 23 клеточную культуральную среду эукариотическими клетками, содержащими экспрессионную плазмиду pCMG2 61 (см. пример 2). Данный белок состоит из зрелого человеческого -1 интерферона, связанного с фрагментом шарнирного участка и константными доменами СН 2 и СН 3 мышиного Ig. Данный белок содержит достаточный фрагмент мышиного иммуноглобулина, чтобы распознаваться белком, связывающим Fc, белком А. Другие гибридные белки данного изобретения, включающие человеческий -1-интерферон, показаны (а) в SEQ ID NO: 3 и 4 для последовательности кДНК и расшифрованной аминокислотной последовательности, в соответствии с his-меченным гибридным белком на основе -1-интерферона (также показано на фиг. 1); и (b) в SEQ ID NO: 1 для кДНК, кодирующей гибридный белок -1-интерферон/Ig с последовательностью SEQ ID NO: 2 (также показано на фиг. 2). Предпочтительные белки на основе -1 интерферона данного изобретения включают новый "участок сочленения" с последовательностью ДНК SEQ ID NO: 5 и аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 5 представляет 11 триплетных кодонов на каждой стороне участка сочленения между ДНК человеческого -интерферона и ДНК, кодирующей константную область человеческого иммуноглобулина (см. пример 5: SEQ ID NO: 41 и 42). Конкретно, в SEQ ID NO: 5, ДНК, кодирующая человеческий -1 а-интерферон заканчивается на нуклеотидном триплете 568-570 (ААС), а ДНК,кодирующая константную область человеческого IgG1, начинается с триплета (GAC), начинающегося с нуклеотида номер 574 последовательности SEQ ID NO: 41. Соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность "участка сочленения" представлена вSEQ ID NO: 6 и основана на SEQ ID NO: 42. Другая уникальная последовательность "участка сочленения" построена так, чтобы она включала линкерную последовательность в конечной конструкции ДНК (см. пример 5: SEQ ID NO: 43 и 44). Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность данного "участка сочленения" представлены в SEQ ID NO: 7 и 8 соответственно, которые демонстрируют 11 триплетных кодонов на каждой стороне участка сочленения непосредственно между концом последовательности -1-интерферона (нуклеотид номер 570 в SEQ ID NO: 43) и линкерной последовательностью (нуклеотиды 571-585 вSEQ ID NO: 43; GGGGS в SEQ ID NO: 8). Последовательности ДНК "участка сочленения" могут использоваться в виде зондов ДНК и могут представлять собой минимальную ДНК,требующуюся для гибридизации в стандартных условиях с любой последовательностью ДНК,кодирующей какой-либо гибридный белок -1 005005 24 интерферона/Ig. Тем не менее, при условии, что целый зонд гибридизуется с обоими сторонами участка сочленения и обе стороны участка сочленения -интерферона/константной области участвуют в гибридизации, могут существовать последовательности меньшего размера. Более того, рядовым специалистам в данной области понятно, что последовательности ДНК большего размера, чем SEQ ID NO: 5 или 7, тоже являются подходящими для гибридизации. Рядовой специалист в данной области может определить,способен ли конкретный зонд, такой как SEQ IDNO: 5 или 7, к гибридизации на обоих сторонах участка сочленения, путем мечения 5'-конца либо одноцепочечного смыслового олигонуклеотида, либо одноцепочечного антисмыслового олигонуклеотида, с использованием подходящим образом меченного фосфора АТФ с помощью полинуклеотидкиназы. Последовательность данного изобретения должна гибридизоваться с обоими олигонуклеотидными зондами,и таким образом происходит ее мечение этими зондами. Кроме того, понятно, что охватывает полностью вырожденные последовательности,кодирующие участок сочленения SEQ ID NO: 5 или 7.III. Другие варианты гибридных белков на основе интерферона. Производные белков данного изобретения также включают различные структурные формы первичного белка, которые сохраняют биологическую активность. Благодаря присутствию способных к ионизации аминогрупп и карбоксильных групп, например, гибридный белок на основе -интерферона может находиться в виде кислой или основной соли, или в нейтральном виде. Индивидуальные аминокислотные остатки могут быть модифицированы посредством окисления или восстановления. Кроме того,первичную аминокислотную структуру (включая N- и/или С-концевые участки), или гликан-1-интерферона, можно модифицировать путем образования ковалентных или агрегационных конъюгатов с другими химическими компонентами, такими как гликозильные группы,полиалкиленгликолевые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ (PEG): см. рассматриваемые одновременно с настоящей заявкой и регистрируемые в обычном порядке заявки с серийными номерами 60/104491 и 60/720237),липиды, фосфатные, ацетильные группы и т.п.,или путем создания мутантных форм аминокислотной последовательности. Другие производные гибрида -интерферон/Ig включают ковалентные или агрегационные конъюгаты -интерферона или его фрагментов с другими белками или полипептидами,такие как полученные путем синтеза в рекомбинантной культуре как дополнительные N-концы или С-концы. Например, конъюгированным пептидом может быть сигнальная (или лидер 25 ная) полипептидная последовательность в Nконцевой области белка, которая одновременно с трансляцией или после трансляции направляет перенос белка из области его синтеза к области его функционирования снаружи или внутри по отношению к клеточной мембране или стенке(например, лидерная последовательность дрожжевого -фактора). Белки-рецепторы -интерферона могут включать пептиды, добавленные для облегчения очистки или идентификации интерферона (например, гибриды гистидин/1-интерферон). Аминокислотная последовательность -интерферона может быть также связана с пептидом Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-AspAsp-Lysal.,Bio/Technology 6:1204, 1988). Последняя последовательность является высоко антигенной и предоставляет эпитоп, обратимо связывающийся со специфическим моноклональным антителом, создавая возможность для быстрого анализа и легкой очистки экспрессируемого рекомбинантного белка. Данная последовательность также специфично расщепляется под действием энтерокиназы бычьей слизистой оболочки по остатку, следующему сразу за парой Asp-Lys. Другие аналоги включают гибридный белок интерферонFc, или его биологически активные фрагменты, где последовательности интерферона отличаются от последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, по одному или нескольким консервативным аминокислотным замещениям, или по удалениям или вставкам, которые не приводят к утрате биологической активности выделенного белка. Консервативные замещения обычно включают замещение одной аминокислоты на другую,имеющую сходные характеристики, такие как замещения внутри следующих групп: валин,аланин и глицин; лейцин и изолейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серин и треонин; лизин и аргинин; и фенилаланин и тирозин. Неполярные гидрофобные аминокислоты включают аланин,лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Другие консервативные замещения могут быть хорошо известны рядовым специалистам. Например, для аминокислоты аланина консервативное замещение может быть проведено с использованием любой аминокислоты, выбранной из D-аланина, глицина, -аланина, L-цистеина и D-цистеина. Для лизина замещение может быть проведено с использованием любой аминокислоты, выбранной из D-лизина, аргинина, D-аргинина, гомо 005005 26 аргинина, метионина, D-метионина, орнитина или D-орнитина. В основном замещениями, которые предположительно вызывают изменения функциональных свойств выделенных полипептидов, являются такие, в которых (i) полярный остаток, например, серина или треонина, замещают на гидрофобный остаток, например, лейцина, изолейцина, фенилаланина или аланина;(ii) остаток цистеина замещают на любой другой остаток; (iii) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, аргинина или гистидина, замещают на остаток, имеющий электроотрицательную боковую цепь, например, глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты; или (iv) остаток, имеющий объемную боковую цепь, например, фенилаланина,замещают на остаток, не имеющий такой боковой цепи, например, глицина. В данное изобретение включены выделенные молекулы, которые представляют собой аллельные варианты,природные мутанты, индуцированные мутанты,белки, кодируемые ДНК, которая гибридизуется в очень или не очень строгих условиях с нуклеиновой кислотой, которая кодирует такой полипептид, как SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8. Заявители разработали мутантные формы-1-интерферона, которые являются дополнительными вариантами фрагмента-1 интерферона данного изобретения. Эти фрагменты -1-интерферона могут быть особенно полезными поскольку они проявляют новые свойства, не обнаруженные у -1-интерферона дикого типа (см. пример 1). Короче говоря, заявители предприняли мутационный анализ человеческого -1-интерферона с целью картирования остатков, необходимых для осуществления активности и рецепторного связывания. Наличие 3-D кристаллической структуры человеческого -1-интерферона (см. Karpusas et al.,1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:11813-11818) позволило заявителям идентифицировать для аланиновых (или сериновых) замещений, остатки,находящиеся в контакте с растворителем, доступные для взаимодействия с рецептором интерферона, и сохранить аминокислоты, включенные в образование межмолекулярных связей. Панель из пятнадцати аланиновых последовательных мутаций была создана, чтобы заменить от двух до восьми остатков вдоль различных областей каждой из спиралей (А, В, С, D, Е) и петель (АВ 1, АВ 2, АВ 3, CD1, CD2, DE1, DE2)-1-интерферона. См. пример 1. Для аффинной очистки мутантных форм,экспрессирующихся в клетках млекопитающих(SEQ ID NO: 2: фиг. 1), был включен аминоконцевой гистидиновый маркер ("his" маркер). Функциональные результаты образования данных мутантных форм оценивали в антивирусном и антипролиферативном анализах. Для анализа данных мутантных форм на связывание с клеточным поверхностным рецептором -интер 27 ферона (рецептор клеточной поверхностиIFNAR1/2) был разработан нерадиоактивный анализ связывания. Кроме того, анализ на основе ELISA с применением гибридного белка эктодомен IFNAR/Fc для связывания интерферона, использовали для картирования поверхностных взаимодействий между -1-интерфероном и IFNAR2 (см. пример 1). Эти мутационные анализы показали, что N- и С-концевые положения фрагмента молекулы -интерферона не являются важными для осуществления рецепторного связывания или биологической функции. Заявители идентифицировали три типа эффектов, получаемых в результате направленного мутагенеза. В некоторых условиях эти эффекты могут быть полезными для разработки лекарственного препарата на основе интерферона. К данным трем типам эффектов относятся следующие: (а) мутантные формы с более высокой антивирусной активностью, чем у hisдикого типа -1-интерферона (например, мутантная форма C1); (b) мутантные формы, которые проявляют активность как в антивирусном,так и в антипролиферативном анализе, но для которых антипролиферативная активность является непропорционально низкой по отношению к антивирусной активности, по сравнению с hisдиким типом -1-интерферона (например, мутантные формы C1, D и DE1); и (с) функциональные антагонисты (например, A1, В 2, CD2 иDE1), которые демонстрируют антивирусную и антипролиферативную активность, которые являются непропорционально низкими по отношению к связыванию рецептора, по сравнению с his-диким типом -1-интерферона. Кроме того, связывание фрагмента -1 интерферона (X) со вторым, отличным от -1 интерферона, фрагментом Z (например, Fc области иммуноглобулина) может осуществляться с помощью химической реакции, в результате которой две молекулы связываются друг с другом, при условии, что иммуноглобулин и -1 интерферон сохраняют их соответствующие активности. Данная химическая связь может включать многочисленные химические механизмы, такие как ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляция, координационное связывание и комплексообразование. Типичные связывающие агенты (например, линкеры "Y" в общей формуле), использующиеся для образования ковалентной связи между фрагментами -1-интерферона и иммуноглобулина,могут включать органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидные сложные эфиры, диизоцианаты, такие как толуол-2,6-диизоцианат, глютеральдегиды, диазобензолы и гексаметилендиамины, такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин,бифункциональные производные сложных эфиров имидов, такие как диметиладипимидат, и бис 005005 28 активные соединения фтора, такие как 1,5 дифтор-2,4-динитробензол. Данный список не является исчерпывающим для различных классов химических связывающих агентов, известных в данной области. Многие из этих соединений являются коммерчески доступными, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат (SPDP), гидрохлорид 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимида (EDC); 4 сукцинимидилоксикарбонилметил(2 пиридилдитио)толуол (SMPT: Pierce Chem. Co.,Cat.21558G).IV. Область применения данного изобретения. Гибридные белки данного изобретения могут применяться в терапевтических композициях, когда требуется терапия с использованием интерферона. Данные молекулы имеют обычные преимущества, связанные с гибридными белками, особенно, Ig гибридными белками; а именно, измененные фармакокинетические и фармакодинамические характеристики, приводящие к увеличению периода полужизни и времени пребывания в сосудистом русле. Более того, особенно предпочтительные гликозилированные белки -1-интерферон, хотя по структуре подобны -1-интерферону, являются во много раз биологически более активными, чем не гликозилированный -1-интерферон. См.Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15:641-649. Было обнаружено, что продукты настоящего изобретения являются полезными для поддержания периода полужизни терапевтического -1-интерферона, и, например, могут быть получены для терапевтического введения путем растворения в воде или приемлемой жидкой среде. Введение осуществляют парентеральным, аэрозольным или пероральным способом. Тонкие коллоидные суспензии могут быть получены для парентерального введения с целью достижения эффекта депо, или для перорального введения, тогда как аэрозольные композиции могут быть по характеру жидкими или в виде сухого порошка. В сухом, лиофилизированном состоянии, или в составе раствора, гибридные белки настоящего изобретения на основе -1-интерферона должны иметь хорошую стабильность при хранении. Белки настоящего изобретения, предназначенные для терапевтического применения, могут применяться для профилактики или лечения любого болезненного состояния или заболевания, при котором -1-интерферон, как составная часть, является эффективным. Кроме того,гибридные белки настоящего изобретения могут применяться для диагноза компонентов, болезненных состояний или заболеваний в биологических системах или образцах, а также для диагностических целей в нефизиологических системах. 29 В области терапевтического применения настоящее изобретение рассматривает способ лечения животного, страдающего от такого болезненного состояния (состояний) или заболевания (заболеваний), или в скрытой форме склонного к таким состояниям или заболеваниям, и нуждающегося в таком лечении, включающий введение такому животному эффективного количества гибридного белка настоящего изобретения, который является терапевтически эффективным для упомянутого болезненного состояния или заболевания. Индивидуумы, подлежащие лечению с помощью гибридных белков настоящего изобретения, включают представителей млекопитающих и наиболее предпочтительно человека. В зависимости от конкретного состояния или заболевания, подлежащего лечению, животным могут быть введены гибридные белки данного изобретения на основе -1-интерферона в любой подходящей терапевтически эффективной и безопасной дозировке, которая может быть легко определена в пределах уровня техники без лишних экспериментов. Из-за существования видовых барьеров для интерферонов типа I, может быть необходимо получать гибридные белки на основе интерферона, как описано в данном документе, с использованием интерферона из соответствующих видов. Антипролиферативная активность -1 интерферона хорошо известна. В частности,некоторые из гибридных белков на основе -1 интерферона, описанные в данном документе,являются применимыми для лечения опухолей,в т.ч. злокачественных, таких как остеогенная саркома, лимфома, острый лимфоцитарный лейкоз, карцинома молочной железы, меланома и карцинома носоглотки, а также аутоиммунные состояния, такие как фиброз, волчанка и рассеянный склероз. Кроме того, предполагается, что антивирусная активность, проявляемая гибридными белками, в особенности некоторыми из мутеинов -1-интерферона, описанных в данном документе, может использоваться для лечения вирусных заболеваний, таких как инфекция ЕСМ, грипп и другие инфекции дыхательного тракта, бешенство и гепатит. Также ожидается,что иммуномодуляторная активность -1 интерферона, проявляемая белками, описанными в данном документе, может использоваться для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как фиброз, рассеянный склероз. Способность интерферонов ингибировать образование новых кровеносных сосудов(ангиогенез или неоваскуляризация) позволяет использовать белки данного изобретения для лечения ангиогенных заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных, дегенерация желтого пятна, отторжение трансплантата роговицы неоваскулярная глаукома, ретролентальная фиброплазия, по 005005(Osler-Webber). Более того, с некоторого времени известна антиэндотелиальная активность интерферона, и возможным механизмом действия интерферона может быть подавление активности эндотелиальных клеток путем ингибирования продукции или эффективности ангиогенных факторов, продуцируемых опухолевыми клетками. Некоторые васкулярные опухоли,такие как гемангиомы, являются особенно чувствительными к лечению интерфероном. Лечение -интерфероном является единственным описанным в документах способом лечением этого заболевания. Предполагается, что лечение гибридными белками данного изобретения на основе -1-интерферона приводит к существенным фармацевтическим улучшениям в отношении фармакокинетики и фармакодинамики, так как полагают, что конъюгат остается в сосудистой сети в течение более длинного периода времени, чем неконъюгированные интерфероны, что таким образом приводит к более результативной и эффективной терапии в случае применения в качестве антиангиогенного агента. См. пример 9. Гибриды данного изобретения полимер-1-интерферон могут быть введены сами по себе, а также в виде фармацевтически приемлемых сложных эфиров, солей и других физиологически функциональных производных данных гибридов. В таких фармацевтических и лекарственных композициях -1-интерферон предпочтительно используется вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно с любыми другими терапевтическими ингредиентами. Носитель должен быть фармацевтически приемлемым, то есть быть совместимым с другими ингредиентами композиции и не быть чрезмерно опасным для получающего его. -1-интерферон предоставляется в количестве, эффективном для достижения желательного фармакологического эффекта, как описано выше, и в количестве, необходимом для достижения желательной ежедневной дозы. Композиции включают подходящие для парентерального, а также для непарентерального введения, а конкретные способы введения включают пероральное, ректальное, щечное,наружное, назальное, глазное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, чрескожное, интратекальное, внутрисуставное, внутриартериальное, субарахноидальное, бронхиальное, лимфатическое, вагинальное и внутриматочное введение. Предпочтительными являются композиции,подходящие для перорального, назального и парентерального введения. Если -1-интерферон применяется в составе композиции, включающей жидкий раствор, то композиция может быть введена преимущественно перорально или парентерально. 31 Если -1-интерферон применяется в составе композиции, представляющей собой жидкую суспензию, или в виде порошка в композиции с биосовместимым носителем, то данная композиция может быть введена преимущественно перорально, ректально или бронхиально. Если -1-интерферон применяется непосредственно в виде порошкообразного твердого вещества, то -1-интерферон может быть введен преимущественно перорально. Альтернативно, он может быть введен назально или бронхиально, посредством распыления порошка в газообразном носителе, с образованием газовой дисперсии порошка, которая вдыхается пациентом из дыхательного устройства, включающего подходящее распыляющее устройство. Удобно, когда композиции, включающие белки настоящего изобретения, находятся в виде дозированных лекарственных форм и могут быть получены с помощью любого из методов,хорошо известных в области фармацевтики. Такие методы обычно включают стадию внесения активного ингредиента (ингредиентов) в сочетании с носителем, который составляет один или несколько вспомогательных ингредиентов. Обычно композиции приготавливают путем внесения одинакового (одинаковых) и хорошо знакомого (знакомых) активного ингредиента (ингредиентов) в сочетании с жидким носителем, тонко измельченным твердым носителем, или с обоими, и затем, при необходимости, формование продукта в дозированные формы желаемой композиции. Композиции настоящего изобретения,подходящие для перорального введения, могут находиться в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки, таблетки или лепешки,каждая из которых содержит ранее определенное количество активного ингредиента в виде порошка или гранул; или в виде суспензии в водном растворе, или в неводной жидкости, такой как сироп, эликсир, эмульсия, или в виде дозы жидкого лекарства. Таблетка может быть изготовлена путем прессования или формования, необязательно с одним или несколькими добавочными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены путем прессования в подходящем устройстве, с активным ингредиентом, находящимся в сыпучем виде, таком как порошок или гранулы, который необязательно смешивают со связующим агентом, дезинтегрирующим агентом, смазочным агентом, инертным разбавителем, поверхностно-активным веществом или разряжающим агентом. Формованные таблетки,включающие смесь порошкообразных полимерных конъюгатов с подходящим носителем, могут быть изготовлены путем формования в подходящем устройстве. Сироп может быть получен путем добавления активного ингредиента к концентриро 005005 32 ванному водному раствору сахара, например,сахарозы, к которому также может быть добавлен любой добавочный ингредиент. Такие добавочные ингредиенты могут включать ароматизаторы, подходящие консерванты, агенты, замедляющие кристаллизацию сахара, и агенты,увеличивающие растворимость любого другого ингредиента, такого как многоатомный спирт,например, глицерин или сорбит. Композиции, подходящие для парентерального введения, соответственно включают стерильный водный препарат активного конъюгата, который предпочтительно является изотоническим с кровью реципиента (например, физиологический солевой раствор). Такие композиции могут включать суспендирующие агенты и загустители, или другие системы микровключений, которые создают для направления соединений к компонентам крови, или одного или нескольких органов. Композиции могут находиться в единичной дозированной или множественной дозированной форме. Назальные композиции в виде спреев включают очищенные водные растворы активного конъюгата с консервантами и изотоническими агентами. Такие композиции преимущественно доводят до рН и изотонического состояния, совместимых с назальными слизистыми оболочками. Композиции для ректального введения могут присутствовать в виде свечей с подходящим носителем, таким как масло какао, гидрированные жиры или гидрированная жирная карбоновая кислота. Глазные композиции, такие как глазные капли, получают с помощью методов, подобных методам получения назального спрея, за исключением того, что рН и изотонические факторы предпочтительно доводят до соответствующих для глаз. Наружные композиции включают конъюгаты данного изобретения, растворенные или суспендированные в одной или нескольких средах, таких как минеральное масло, смесь жидких углеводородов (нефть), многоатомные спирты, или другие основы, использующиеся для наружных фармацевтических композиций. В добавление к вышеупомянутым ингредиентам, композиции данного изобретения могут дополнительно включать один или несколько добавочных ингредиентов, выбранных из разбавителей, буферов, ароматизирующих агентов, дезинтегрирующих агентов, поверхностноактивных веществ, загустителей, смазывающих агентов, консервантов (включая антиоксиданты) и т.п. Соответственно настоящее изобретение рассматривает предоставление подходящих гибридных белков для in vitro стабилизации 1-интерферона в растворе в качестве предпочтительного иллюстративного примера не тера 33 певтического применения. Гибридные белки могут использоваться, например, для повышения устойчивости к ферментативному разрушению -1-интерферона, и с их помощью обеспечивается увеличение срока годности, стабильность при комнатной температуре и устойчивость к исследовательским реагентам и наборам. Следующие примеры предоставлены для иллюстрации настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие его. В частности, понятно, что эксперименты на животных in vivo, описанные в данном документе, могут варьировать, так что возможны другие модификации и вариации основной методологии. Например, в примере 7, рядовой специалист в данной области может использовать другой анализ с использованием неоптерина или может изменить число и вид используемых приматов. Данные модификации и вариации примеров следует рассматривать как соответствующие духу и области действия данного изобретения. Пример 1. Исследования структура/ активность человеческого -1-интерферона с использованием мутаций в виде аланин/сериновых замещений. Анализ сайтов рецепторного связывания и функциональных доменов. А. Обзор. Пространственный мутационный анализ человеческого -1 а-интерферона (IFN1) был предпринят с целью картирования остатков,требующихся для осуществления активности и рецепторного связывания. Наличие 3-D кристаллической структуры человеческого -1 интерферона (см. Karpusas et al., 1997, Proc.Natl. Acad. Sci. 94:11813-11818) позволило заявителям идентифицировать для аланиновых(или сериновых) замещений, остатки, находящиеся в контакт с растворителем, доступные для взаимодействия с рецептором -интерферона, и сохранить аминокислоты, включенные в образование межмолекулярных связей. Панель из пятнадцати аланиновых последовательных мутаций была создана, чтобы заменить от 2 до 8 остатков вдоль различных областей каждой из спиралей (А, В, С, D, Е) и петель (АВ 1, АВ 2,АВ 3, CD1, CD2, DE1, DE2) -1 а-интерферона. Для аффинной очистки включили аминоконцевой маркер, состоящий из 6 гистидиновых остатков, а также участок энтерокиназной линкерной последовательности для удаления аминоконцевого удлинения. Полученные интерфероны равнозначно обозначают как "hisмеченный интерферон (IFN)-" или "His6-интерферон" и т.п. Экспрессионные плазмиды с различными мутантными формами меченного IFN- конструировали с использованием генной конструкции IFN- дикого типа в качестве матрицы для 34 мутагенеза. Стратегия мутагенеза включает вначале введение уникальных сайтов расщепления рестрикционными ферментами на всем протяжении гена his-меченного IFN- дикого типа,затем замену различных последовательностей ДНК между выбранными сайтами рестрикции на синтетические олигонуклеотидные дуплексы,которые кодируют мутации с аланиновыми (или сериновыми) замещениями. Наконец, мутантные гены IFN субклонировали в плазмиде, которая направляет экспрессию в клетках млекопитающих, в клеточной линии 293 почек человека. Функциональные результаты этих мутаций оценивали в антивирусном и антипролиферативном тестах. Нерадиоактивный анализ связывания IFN разработали для анализа данных мутантных форм на связывание с поверхностным рецептором ("комплекс IFNAR1/2") клеток человеческой лимфомы Дауди-Беркитта. Кроме того, разработали анализ для картирования поверхностей взаимодействия между мутантными формами his-IFN- и IFNAR2, в котором использовали гибридный белок IFNAR2/Fc, включающий внеклеточный домен IFNAR2, рецепторного белка IFN, соединенный с шарнирным участком, СН 2 и СН 3 доменами человеческогоIgG1. 1. Создание гена -интерферона как матрицы для мутагенеза. Стратегия заявителей, направленная на получение аланин- (или серин)замещенных мутантных форм IFN- состояла в создании вначале модифицированного гена IFN-, который кодировал белок дикого типа, но который нес уникальные сайты расщепления рестрикционными ферментами, рассеянные на всем протяжении гена. Уникальные сайты использовали для замены последовательностей дикого типа на синтетические олигонуклеотидные дуплексы,которые кодируют мутантные кодоны. Для получения экспрессионной кассеты IFN1 подходящей для создания мутантных генов, кДНКIFN- (GenBank каталожный номер Е 00029) амплифицировали с помощью ПЦР (PCR). Начальное клонирование гена IFN- в плазмидеpMJB 107, полученной из pACYC184, (см. Rose,et. al., 1988, Nucleic Acids Res. 16(1) 355) было необходимо для проведения сайтнаправленного мутагенеза данного гена в плазмиде, утратившей специфические сайты рестрикции, которые образуются в процессе мутагенеза. ПЦР праймеры, использующиеся для субклонирования кодирующей последовательности гена человеческого IFN-, также позволили заявителям ввести линкерную последовательность энтерокиназы выше по ходу транскрипции и в рамке считывания с геном IFN- 5' ПЦР праймер 5'-TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAA 35"BET-022") и фланкирующими сайтами ферментативной рестрикции (BspEI и Хhо I), использующимися для клонирования в сайтах плазмиды pMJB107. Полученную ДНК обозначают ПЦР фрагмент А. Эффективную сигнальную последовательность из сигнальной последовательности адгезионной молекулы-1 клеток кровеносных сосудов человека (VCAM-1) и 6 гистидиновых остатков в качестве маркера ввели в конечную конструкцию из второго фрагмента ДНК, созданную из pDSW247 (фрагмент В). ПлазмидуpDSW247 получали из рСЕР 4 (Invitrogen,Carlsbad, CA), из которой удален ген EBNA-1, и которая несет сигнальную последовательностьVCAM-1 (VCAMss), находящуюся в рамке считывания с 6 гистидиновыми остатками в качестве маркера и присоединенную выше их по ходу транскрипции. ПЦР праймеры, которые использовали для создания кассетного фрагментаGCCCCCGGA-3': SEQ ID NO: 12), включающие фланкирующие сайты расщепления рестрикционными ферментами (NotI and BspEI), которые позволяют вырезать фрагмент В ДНК. Для создания плазмидного вектора, несущего сигнальную последовательность VCAM-1,his-маркер и ген -интерферона, заявители провели 3-фрагментное лигирование, используя очищенные в геле фрагменты ДНК из плазмидного вектора pMJB107 (полученные в результате расщепления NotI и XhoI), ПЦР фрагмент АXhoI) и фрагмент В (полученный в результате расщепления NotI и BspEI). Лигированную плазмиду использовали для трансформации клеток Е. coli, или JA221, или XL1-Blue, и устойчивые к ампициллину колонии собирали и тестировали на наличие вставок путем анализа рестрикционной карты. Проводили препаративное получение ДНК и последовательность вставки подтверждали путем секвенирования ДНК. Полученную конструкцию назвали pCMG260. 2. Создание аланинзамещенных мутантных форм человеческого -интерферона в pCMG260. Плазмиду pCMG260 использовали в качестве матрицы для множественных раундов мутагенеза (U.S.E. набор для направленного мутагенеза (Boehringer-Mannheim, в результате которого были введены уникальные сайты рестрикционного расщепления в положения вдоль последовательности, кодирующей белок IFN-,но полученная в результате последовательность белка не была изменена. Мутантные плазмиды 36 использовали для трансформации штаммов Е.coli JA221 или XL1-Blue, и рекомбинантные колонии отбирали по устойчивости к хлорамфениколу. Хлорамфениколустойчивые колонии затем тестировали на присутствие требуемого уникального сайта ферментативной рестрикции с помощью анализа рестрикционного картирования ДНК. Были подтверждены структуры полученной плазмиды IFN-, pCMG275.8, содержащей полный набор уникальных сайтов рестрикционного ферментативного расщепления, и последовательности ДНК данного гена. Последовательность полноразмерной ДНК модифицированного, his-меченного гена -интерферона, вместе с последовательностью, кодирующей белок дикого типа, приведены на фиг. 1. Полный набор аланинзамещенных мутаций приведен в табл. 1. Названия мутантов определяют структурные области (спирали и петли), в которые введены данные мутации. Полная панель аланиновых (сериновых) замещений дает в результате 65 мутаций на 165 аминокислот человеческого IFN-. Панель мутантных форм создана изpCMG275.8 путем замещения сегментов ДНК,находящихся между уникальными свитами рестрикции, на синтетические олигонуклеотидные дуплексы, которые несут информацию генетического кодирования, как изображено в табл. 2(см. ниже). Для создания различных аланинзамещенных мутантных форм плазмид, векторpCMG275.8 (полученный в результате расщепления соответствующим рестрикционным ферментом, как определено в списке, приведенном ниже для каждой структурной области IFN-),очищенный в геле, и олигонуклеотидные дуплексы (кодирующие последовательности цепей,как показано в табл. 2) сшивали вместе. Лигированные смеси использовали для трансформации штамма Е. coli JA221 и рекомбинантные колонии выбирали по устойчивости к ампициллину. Устойчивые к ампициллину колонии тестировали на присутствие вставок мутаций путем скрининга соответствующих сайтов ферментативной рестрикции. Для двух мутантных форм(А 2 и CD2), стратегия клонирования заключается в использовании двух дуплексов синтетических нуклеотидов (как показано в табл. 2), которые несут комплементарные липкие концы, что позволяет лигировать один с другим и с каркасом вектора IFN- при трехстадийном лигировании. Следующий список иллюстрирует сайты,которые использовали для клонирования мутантных олигонуклеотидов из табл. 2. Схема клонирования (подраздел В) показывает позиции данных уникальных сайтов гена интерферона. Спираль А от BspEI до MunI или от BgIII до PstI Петля АВ от MunI до PstI или от MunI до Таблица 1 Положения аланинзамещенных мутаций челIFN Линия, обозначающая IFN-, показывает последовательность человеческого IFN- дикого типа. Аланиновые или сериновые замены остатков IFN- показаны для каждой мутантной формы, и черточки, расположенные ниже соответствующих областей, обозначают последовательности дикого типа. Структуры спиралей и петель обозначены сплошными линиями ниже мутантных форм. Петля DE охватывает промежуток между спиралями D и Е. Две дополнительные аланинзамещенные мутантные фомы(Н 93 А, Н 97 А и Н 121 А) получали и анализировали в антивирусных анализах для того, чтобы оценить влияние мутации соответствующих гистидинов, которые образуют хелатные комплексы с цинком в корковом структурном димере. Обе вышеуказанные мутантные формы полностью сохраняют активность дикого типа в антивирусных анализах, что позволяет предположить, что цинк-опосредованное образование димера не является существенным для проявления активности IFN-. В. Конструирование экспрессионных плазмид EBNA 293. Гены мутантных форм и дикого типа IFN, соединенные с сигнальной последовательностью VCAM-1, his-маркером и энтерокиназной линкерной последовательностью, очищали в геле в виде фрагментов величиной в 761 пару оснований, полученных в результате действия рестрикционных ферментов NotI и BamHI. Очищенные гены субклонировали в расщепленном под действием NotI и BamHI плазмидном векторе pDSW247, который получали из рСЕР 4(Invitrogen, Carlsbad, CA). Плазмида pDSW247 представляет собой экспрессирующий вектор для временной экспрессии белка в клетках почек человека EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad,CA). Она содержит ранний промотор гена цитомегаловируса и регуляторные элементы EBV,которые необходимы для обеспечения высокого уровня экспрессии в данной системе, а также отборочные маркеры для Е. coli (устойчивость к ампициллину) и клеток EBNA 293 (устойчивость к гидромицину). Цитированные плазмиды использовали для трансформирования JA221 или XL1-Blue клеток Е. coli, и ампициллинустойчивые колонии собирали и тестировали на наличие вставок с помощью рестрикционного картирования. Получали препаративное количество ДНК и последовательность вставок подтверждали путем секвенирования ДНК. Положительные клоны, обнаруживающие наличие желательных мутировавших последовательностей, использовали для трансфекции клеток почек человека EBNA 2 93. Полное клонирование и стратегия экспрессии представлены на фиг. 12. С. Экспрессия и количественное определение аланинзамещенных форм IFN1. Человеческие клетки EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Chittenden, Т. (1989) J. Virol. 63: 3016-3025) хранили в виде субконфлюентных культур в модифицированной по способу Дальбекко среде Игла с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 250 нг/мл генетицина (Life Technologies,Gaithersburg, MD). Экспрессионные плазмидыpDSW247 для обеспечения временной экспрессии трансфицировали в клетки EBNA 293, с помощью метода с использованием липофектамина (Gibco/BRL, Life Technologies). Кондиционированную среду собирали через 3-4 дня после трансфекции, обломки клеток удаляют путем центрифугирования и концентрацию his-IFNопределяют с помощью ELISA. Анализ ELISA проводили с использованием поликлональных кроличьих антител (IgG,очищенные на белке А, образование антител вызывали против очищенного человеческогоIFN1) для покрытия 96-луночных планшетов ELISA, и биотинилированную форму таких же поликлональных кроличьих IgG использовали в качестве второго реагента для обеспечения возможности определения интерферона с помощью стрептавидин-связанной пероксидазы хрена (HRP: Jackson ImmunoResearch, W. Grove,PA). Серии разведении -1-интерферона (в виде AVONEX, получали от Biogen, Inc.) использовали для получения стандартных концентрационных кривых. Кондиционированную среду от трансфицированных клеток EBNA, содержащую his-IFN-, разбавляли до получения образцов с концентрациями, варьирующими от 10 до 0,3 нг/мл в тесте ELISA. Для подтверждения концентраций IFN- в среде, определенных с помощью ELISA, проводили вестерн-блоттинг. Востановленные супернатанты культуры и стандарты IFN1 подвергали анализу методом SDS-PAGE на гелях с градиентом полиакриламида 10-20% (Novex, San Diego, CA) и помещали на мембраны PDVF. Иммуноактивные полосы определяли с помощью кроличьей поликлональной антисыворотки против IFN1(447, Biogen, Inc., вторая антисыворотка, которая была получена против IFN1), с последующей обработкой HRP-связанными антикроличьими IgG осла (Jackson ImmunoResearch, W.D. Анализ мутантных форм -интерферона на связывание с рецептором. Рецепторсвязывающие свойства мутантных форм -интерферона, описанных в разделе С, оценивали с помощью двух различных анализов связывания. В одном анализе измеряли связывание мутантных форм -интерферона с гибридным белком, IFNAR2/Fc, включающим внеклеточный домен цепи человеческого рецептора IFNAR2, соединенного с частью константной области человеческого IgG. IFNAR2-Fс экспрессировали в клетках яичников китайского хомяка (СНО) и очищали с помощью аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным белком А в соответствии с инструкциями производителя (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, по каталогу 20334). Связывание мутантных форм бета-интерферона с IFNAR2-Fс измеряли с помощью анализа формата ELISA. Планшеты для ELISA получали путем покрытия плоскодонных 96-луночных планшетов 50 мкл/лунку мышиных моноклональных антител против человеческого IgG1 (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) в течение ночи при 4 С, при концентрации 10 мкг/мл в буфере для покрытия (50 мМ NaHCO3,0,2 мМ МgСl2, 0,2 мМ СаСl2, рН 9,6). Планшеты дважды промывали PBS, содержащим 0,05%Tween-20, и блокировали 0,5% обезжиренным сухим молоком в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. После двух дополнительных промывок к каждой лунке добавляли 50 мкл 1 мкг/мл IFNAR2-Fс в 0,5% молоке в PBS, содержащем 0,05% Tween-20, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего планшеты промывали еще два раза. Связывание мутантных форм -интерферона с IFNAR2-Fс измеряли путем добавления 50 мкл/лунку мутантных форм -интерферона в кондиционированной среде, серийно разведенных в модифицированной по Дальбекко среде Игла (DMEM),дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, и инкубировали 2 ч при 4 С. Разведения мутантных форм-интерферона обычно варьировали приблизительно от 1 мкМ до 10 пМ. После промывания концентрацию -интерферона, связанного с планшетом,определяли путем добавления 50 мкл/лунку 41 смеси, состоящей из разбавленных 1:1000 кроличьих поликлональных антител против интерферона (447, Biogen, Inc.) и меченных пероксидазой хрена (HRP) антикроличьих IgG осла(Jackson ImmunoResearch), и инкубации в течение 15 мин при 4 С. После двух промывок добавляли субстрат HRP и планшет инкубировали при 4 С, после чего считывали поглощение при 450 нм на аппарате для прочтения планшетELISA. Строили график зависимости поглощения от концентрации мутантной формы интерферона, и сродство связывания мутантной формы -интерферона с IFNAR2-Fc определяли путем приведения данных к простому гиперболическому уравнению связывания. Результаты этих анализов приведены на фиг. 3, в которой связывающее сродство для каждого мутанта,определенное в экспериментах с тройными повторами, выражали в виде процента от величины, измеренной для Нis61-интерферона дикого типа. Во втором анализе использовали измерение сродства, с которым мутантные формы интерферона связываются с клетками Дауди,экспрессирующими обе рецепторные цепи, IFNAR1 и IFNAR2, которые вместе составляют рецептор -интерферона. В этом анализе, который проводят с использованием FACS, использовали блокирование моноклональных антител,направленных против внеклеточного доменаIFNAR1, ЕА 12 (Biogen, Inc.), для того, чтобы различить незанятый (свободный) рецептор от рецептора, с которым связан -интерферон. Клетки Дауди (20 мкл с концентрацией 2,5 х 107 клеток/мл) помещали в 96-луночные планшетыELISA с V-образным дном и инкубировали в течение 1 ч при 4 С с различными концентрациями мутантных форм -интерферона (20 мкл в FACS-буфере; 5% FBS, 0,1% NaN3 в PBS). Желательные серийные разведения мутантных форм -интерферона варьировали от 0,5 мкМ до 0,5 пМ. К каждой лунке добавляли 100 нг биотинилированных мышиных моноклональных антител ЕА 12 (10 мкл) против IFNAR1, и планшеты инкубировали еще 2 мин при комнатной температуре, после чего их дважды промывалиFACS-буфером (4 С). Затем клетки инкубировали 30 мин при 4 С с 50 мкл/лунку разбавленного 1:200 R-фикоэритрин-конъюгированного стрептавидина (Jackson ImmunoResearch, West(Falcon 2052). Затем образцы анализировали с помощью проточной цитометрии на FACScan(Becton Dickinson). Строили график зависимости среднего значения интенсивности канальной флюоресценции (MFCI) от концентрации мутантной формы -интерферона: связывающее сродство определяли как концентрацию му 005005 42 тантной формы -интерферона, соответствующую 50% ингибированию окрашивания антител. Каждую мутантную форму тестировали много раз. На фиг. 4 показано связывающее сродство к рецептору для каждой мутантной формы -интерферона, определенное с помощью этого метода, выраженное как процент от сродства, измеренного для His61-интерферона дикого типа в каждом эксперименте. Е. Анализ функции мутантных форм интерферона. Мутантные формы -интерферона также тестировали на функциональную активность,используя in vitro анализы на антивирусную активность и способность -интерферона ингибировать пролиферацию клеток. Минимум три антивирусных анализа, каждый с тройными повторами точек данных, проводили для каждой мутантной формы. Нis61-интерферон дикого типа был включен в каждый эксперимент в качестве образца отнесения. Антивирусный анализ проводили путем обработки клеток карциномы легкого человека А 549 (АТСС CCl 185) в течение ночи 2-кратными серийными разведениями мутантной формы -интерферона в концентрациях, охватывающих интервал от полной защиты против вируса до отсутствия защиты от гибели клеток в результате действия вируса. На следующий день клетки заражали в течение двух дней вирусом энцефаломиокардита (ВЭМК(ECMV при разбавлении, которое приводит к полной гибели клеток в отсутствие интерферона. Содержимое планшетов затем окрашивали метаболическим красителем МТТ (2,3-бис[2 метокси-4-нитро-5-сульфофенил]-2 Н-тетразолин-5-карбоксианалид) (М-5655, Sigma, St.Louis, МО). Получали базовый раствор МТТ с концентрацией 5 мг/мл в PBS, подвергали стерильной фильтрации и 50 мкл этого раствора разбавляли в клеточных культуральных средах(100 мкл на лунку). После инкубации при комнатной температуре в течение 30-60 мин, раствор МТТ/среда отбрасывали, клетки промывали 100 мкл PBS, и наконец метаболизированный краситель солюбилизировали в 100 мкл 1,2 н. растворе соляной кислоты в 90% изопропаноле. Количество живых клеток (как видно по присутствию красителя) определяли по поглощению при 450 нм. Данные анализировали путем нанесения на график величины поглощения против концентрации мутантной формы интерферона, и активность каждой мутантной формы определяли как концентрацию, при которой наступала гибель 50% клеток. На фиг. 5 показана активность каждой мутантной формы,выраженная в виде процента от активности, измеренной в каждом эксперименте для hisмеченного -1-интерферона дикого типа. Мутантные формы -интерферона также оценивали на активность в антипролиферативном анализе. Клетки человеческой лимфомы 43 Дауди-Беркитта (АТССCCL 213) высевали в концентрации 2 х 105 клеток/мл в RPMI 1620,дополненной 10% определенной фетальной телячьей сывороткой (Hyclone, Logan Utah) и 2 мМ L-глутамином. Каждая лунка также содержит заданную концентрацию мутантной формы-интерферона в конечном общем объеме 100 мкл среды на лунку; использующиеся концентрации -интерферона были выбраны так, чтобы охватывать интервал от максимального ингибирования пролиферации клеток Дауди до отсутствия ингибирования (т.е. полная пролиферация). Повторы экспериментальных точек использовали для каждой концентрации тестируемой мутантной формы -интерферона, и во всех экспериментах был включен параллельный набор необработанных клеток. Клетки инкубировали в течение двух дней при 37 С в инкубаторах с 5% СО 2, после чего к каждой лунке добавляли 1 мкКи на лунку меченного тритием тимидина метил-3 Н) тимидин, Amersham TRK758) в 50 мкл среды, и инкубировали в течение еще 4 ч. Клетки собирали, используя харвестер планшет LKB, и включение меченного тритием тимидина измеряли, используя планшет-ридерLKB . Получали средние значения повторов экспериментальных данных и определяли стандартные отклонения. Данные наносили на график как среднее количество импульсов в минуту против концентрации мутантной формы бетаинтерферона, и активность каждого мутанта определяли как концентрацию, требующуюся для получения 50% ингибирования максимального наблюдающегося роста. Для каждой мутантной формы проводили многочисленные анализы. На фиг. 6 показаны результаты, выраженные в виде процента от активности, обнаруженной для his-меченного -1-интерферона дикого типа в каждом эксперименте.F. Свойства мутантных форм -интерферона. Было обнаружено, что активность гистидин-меченного -1-интерферона дикого типа в антивирусном и антипролиферативном анализах была в каждом приблизительно в 3 раза ниже,чем соответствующая активность, обнаруженная для немеченого -1-интерферона дикого типа. Из-за того что все мутантные формы интерферона А 1-Е содержат идентичную hisмеченную последовательность в их N-концевых областях, влияние мутаций на свойства молекулы определяли путем сравнения активностей данных мутантных форм в антивирусном, антипролиферативном анализах и анализе связывания с активностью, наблюдаемой для hisмеченного -1-интерферона дикого типа. Исходя из этого, заявители допускали, что вариации активностей мутантных форм А 1-Е, сравниваемые с his-меченным -1-интерфероном дикого типа, качественно и количественно при 005005 44 близительно соответствуют эффектам, которые те же мутации будут оказывать в отсутствие Nконцевого his-маркера. Эквивалентное допущение для меченных или гибридных конструкций других растворимых цитокинов обычно считается верным практикующими специалистами,использующими мутагенез с последовательными аланиновыми замещениями, особенно еслиin vitro функциональная активность меченной или гибридной конструкции близка к активности цитокина дикого типа, как в случае, описанном в данном документе. См., например, Pearce(1997) и Jones J.T., et al., J. Biol. Chem. 213:11667-11674 (1998). Данные, приведенные на фиг. 3-6, позволяют предположить наличие трех типов эффектов, которые вызваны направленным мутагенезом. Эти эффекты в некоторых условиях могут быть благоприятными для разработки лекарственного препарата на основе интерферона. К данным трем типам эффектов относятся следующие: (а) мутантные формы с более высокой антивирусной активностью, чем активность 1-интерферона дикого типа (например, мутантная форма C1); (b) мутантные формы, которые проявляют активность как в антивирусном,так и в антипролиферативном анализе, но для которых антипролиферативная активность является непропорционально низкой по отношению к антивирусной активности, по сравнению с диким типом -1-интерферона (например, мутантные формы C1, D и DE1); и (с) функциональные антагонисты (например, A1, B2, CD2 иDE1), которые демонстрируют антивирусную и антипролиферативную активность, которые являются непропорционально низкими по отношению к связыванию рецептора, по сравнению с диким типом -1-интерферона. Можно видеть, что некоторые мутантные формы относятся более чем к одному классу. Обзор этих классов приведен ниже. Хотя заявители характеризуют данные классы мутантных форм относительно перечисленных примеров, должно быть понятно, что другие мутации в данных областях могут приводить к подобным или даже увеличенным влияниям на активность:(a) Мутантная форма С 1 обладает антивирусной активностью, которая приблизительно в 6 раз выше, чем активность his-меченного -1 интерферона дикого типа. Ожидается, что эта и другие мутантные формы данного типа будут полезными для уменьшения количества интерферона, которое должно быть введено для достижения заданного уровня антивирусного эффекта. Полагают, что уменьшение количества вводимого белка приведет к уменьшению иммуногенности данного белка и может также уменьшить побочные эффекты, касающиеся токсичности, не основанной на механизме действия белка. Ожидается, что мутации в данном классе являются благоприятными в ситуациях,когда терапевтическое улучшение, наступившее в результате введения -интерферона, является следствием его антивирусного действия, и когда антипролиферативная активность сопровождается токсичностью или нежелательными побочными эффектами.(b) Относительные активности (% от дикого типа) аланинзамещенных мутантных форм в антивирусном и антипролиферативном анализах сравнивают на фиг. 7. Согласованно измененные активности (т.е. антивирусная и антипролиферативная активности, которые отличаются на один и тот же коэффициент от активностей(которые лежат на диагональной линии). Однако некоторые мутантные формы более сильные изменения в активности в одном анализе относительно другого, по сравнению с his-меченным-1-интерфероном дикого типа, как видно по смещению от диагонали. Три такие мутантные формы показаны в таблице, приведенной ниже. Мутантная форма С 1 обнаруживает антивирусную активность, которая в 6 раз выше, чем активность his-меченного -1-интерферона дикого типа, но ее активность в антипролиферативном анализе является подобной активности дикого типа. Таким образом мутантная форма С 1 обладает антивирусной активностью, превышающей в 5,2 раза ее антипролиферативную активность, по сравнению с his-меченным -1 интерфероном дикого типа. Подобным образом,мутантная форма D проявляет 65% активности дикого типа в антивирусном анализе, но только 20% активности дикого типа в антипролиферативном анализе, и таким образом обладает антивирусной активностью, которая в 3,4 превышает ее антипролиферативную активность по сравнению с диким типом. Мутантная формаDE1 проявляет 26% активности дикого типа в антивирусном анализе, но только 8,5% в антипролиферативном анализе, и таким образом обладает антивирусной активностью, которая в 3,0 раза превышает ее антипролиферативную активность по сравнению с his-меченным -1 интерфероном дикого типа. При введении в концентрации, достаточной для достижения желаемого уровня антивирусной активности,эти мутантные белки будут обнаруживать сущеМутантная форма 46 ственно более низкие уровни антипролиферативной активности, чем белок дикого типа. Ожидается, что мутации в этом классе, так же как и в классе (а), являются благоприятными в ситуациях, когда терапевтическое улучшение,наступившее в результате введения интерферона, является следствием его антивирусного действия и когда антипролиферативная активность сопровождается токсичностью или нежелательными побочными эффектами. Антивирусная АнтипролифераМутантная активность (АВ) тивная активность форма(с) Мутантные формы с антивирусной и антипролиферативной активностями, которые являются низкими относительно рецепторного связывания, по сравнению с his-меченным -1 интерфероном дикого типа (см. таблицу, приведенную ниже). Мутантная форма А 1 проявляет антивирусную и антипролиферативную активности, которые являются в 2,0 раза и в 1,8 раза выше, чем активности, наблюдающиеся для hisмеченного -1-интерферона дикого типа, но связывает родственный рецептор на клетках Дауди со сродством, которое в 29 раз превышает сродство дикого типа. Связывание данной мутантной формы с рецептором IFN-, таким образом, увеличено приблизительно в 15 раз по сравнению с антивирусной и антипролиферативной активностями данного белка. Подобным образом, мутантные формы В 2, CD2 и DE1 показывают увеличение связывания по отношению к антивирусной активности в 4,6, 4,6 и 18 раз соответственно, и по отношению к антипролиферативной активности в 3,5, 15 и 54 раза. Ожидается, что эти белки будут полезными в качестве функциональных антагонистов активности эндогенного IFN- и возможно других эндогенных интерферонов типа I, так как они обладают способностью связывать и занимать рецептору и, кроме того, генерируют только небольшую часть функционального ответа в клетках-мишенях, который можно наблюдать в случае IFN- дикого типа. Антипролифера- Клеточная святивная активзывающая акность (АП) тивностьG. Зависимость мутеина от трехмерной структуры интерферона. В то время как опубликованные кристаллические структуры негликозилированной формы мышиного -интерферона (Т. Senda, S. Saitoh and Y. Mitsui. Refined Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon- at 2.15Resolution. J. Mol. Biol. 253: 187-207 (1995 и человеческого альфа-2b-интерферона (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hruza, P. Reichert, P.P Trotta,T.L. Nagabhushan and M.R. Walter. Zinc MediatedCrystallography. Structure. 4: 1453-1463 (1996 предоставили модели полипептидного каркаса человеческого -интерферона, заявители недавно установили структуру гликозилированной формы -1 а-интерферона (М. Karpusas, M.USA 94:11813-11818 (1997. Результаты наших мутационных анализов могут быть суммированы относительно 3Dструктуры -1-интерферона (не представлено в данном документе). Некоторые мутации остатков приводят к уменьшению активности (от 2 до 5-кратное уменьшение). Мутировавшие участки соответствуют замещениям, приведенным в табл. 1 и 2. Мутации, которые являются наиболее значительными по влиянию на функционирование,приводят к значительному уменьшению как активности, так и связывания рецептора клеточной поверхности. Мутации в данной областиIFNAR2, так как ни одна из этих мутантных форм не связывала IFNAR/Fc в анализе, проводимом заявителями. Хотя мутации, которые являются важными для связывания IFNAR2, также влияют на клеточное связывание. На связывающие свойства клеточной поверхности также влияют остатки в других участках молекулы (спираль В 1, спираль С 2). Как можно видеть на 3-D моделях (не показано), изображающих эффекты аланинзамещенных мутантных форм, что N-концевые, Сконцевые участки и участки гликозилированной спирали С молекулы IFN1 не принадлежат участку, связывающему рецептор. Мутации в этих участках не уменьшают биологической активности или уменьшают связывание рецептора клеточной поверхности. Пример 2. Конструирование плазмид для экспрессии гибридного белка на основе -1 интерферона (IFN-/Fc). Для создания экспрессионной плазмиды,кодирующей последовательность ДНК человеческого IFN-, соединенного с молекулой тяжелой цепи Fc фрагмента мышиного IgG2a, применяли метод ПЦР. Плазмидный векторpDSW247 (см. пример 1) получали из рСЕР 4(Invitrogen, Carlsbad, CA), из которого был удален ген EBNA-I. Данную плазмиду использовали для конструирования экспрессионного вектора, пригодного для временной экспрессии белка в клетках почек человека EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA., Shen. E. S., et. al. 1995,Gene 156, 235-239). Он был сконструирован так,чтобы включать сигнальную последовательность адгезионной молекулы-1 клеток кровеносных сосудов человека (VCAM-1), находящуюся в рамке считывания и выше по ходу транскрипции последовательности -интерферона, и энтерокиназную линкерную последовательность в области сочленения -интерферона и Ig последовательностей. Экспрессионную кассету гибридного белка собирали из нескольких фрагментов ДНК. Для получения фрагмента ДНК, кодирующего ген человеческого IFN-, субклон кДНК человеческого IFN- (GenBank каталожный номер Е 00029) использовали в качестве матрицы для ПЦР, которую проводили с использованием праймеров 5'-GGTGGTCTCACATGAGCTACAACCTGTAAG (SEQ ID NO: 32: "ВЕТ-026"), которая также включала сайт расщепления рестрикционным ферментом (BsaI) выше первого кодона IFN-. 3' праймер (SEQ ID NO: 32: ВЕТ 026) для ПЦР гена IFN- исключал терминирующий кодон IFN- и включал как рамку считывания энтерокиназной линкерной последовательности (DDDDK), так и концевой сайт ферментативной рестрикции (XhoI), использующийся для субклонирования в экспрессионном векторе. Сайт BsaI, введенный выше последовательности, кодирующей IFN-, позволил заявителям лигировать сигнальную последовательность VCAM-1 в рамку считывания гена, кодирующего последовательность IFN-, и выше его по ходу транскрипции. Сигнальную последовательность VCAM-1 также получали с помощью ПЦР, используя пары праймеров 5'-CAAAGAAGCTGC-3' (SEQ ID NO: 34: "BET-024"),которые содержали 5' сайт расщепления рестрикционным ферментом (NotI, для лигирования в pDSW247 NotI-клонирующий сайт) и 3' сайт расщепления рестрикционным ферментом (BsaI,для лигирования в IFN1a 5' ПЦР фрагмент). В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК(GenBank каталожный номер Х 53051) адгезионной молекулы-1 клеток кровеносных сосудов человека (VCAM-1). Для создания гибридного гена IFN1/Fc проводили следующие процедуры. Фрагмент мышиного IgG2a удаляли из pEAG293 путем очистки в геле фрагмента ДНК, который пред 49 ставляет собой продукт расщепления SalI +Bluescript IISK+ (Stratagene, LaJolla CA, номер по каталогу 212205) субклон шарнирного участка, доменов СН 2 и СН 3 мышиного IgG2a(GenBank каталожный номер V00798). Пары праймеров для ПЦР 5'-AGGTSMARCTGCAGGCTCTT-3' (SEQ ID NO: 36) создают фланкирующие сайты SalI и NotI в 5' и 3' концах кассеты, соответственно. Кассета Fc домена мышиного IgG2a отличалась от последовательностиGenBank на одно основание (кодон V369), создающее молчащую мутацию. Следовательно, с помощью кассеты IgG2a Fc экспрессировали Fc белок дикого типа. Фрагмент ДНК, содержащий сигнальную последовательность VCAM-1, соединенную с геном человеческого IFN- с С-концевой энтерокиназной линкерной последовательностью,вырезали из pCMG258 путем расщепления поpDSW247 и помещался непосредственно ниже и в рамке считывания гена, кодирующего последовательность IFN-. Плазмидный векторpDSW247 получали в виде очищенного в геле фрагмента NotI + BamHI (см. пример 1). Для сборки конечного экспрессионного вектора,кодирующего гибрид IFN1/IgG2a, проводили 3-стадийное лигирование, используя вышеупомянутые фрагменты. Данную экспрессионную плазмиду обозначили pCMG261, она содержит сигнальную последовательность VCAM1 в соединении с геном зрелого человеческогоIFN-, энтерокиназную линкерную последовательность и Fc домен мышиного IgG2a. Последовательность полноразмерной ДНК (SEQ IDNO: 2) гибридного белка приведены на фиг. 2. Пример 3. Получение гибридного белка на основе -1-интерферона в клетках млекопитающих. Экспрессирующий вектор pCMG261 рекомбинантного IFN-/Fc для временной экспрессии трансфицировали в клетки почек человека EBNA 293 для осуществления экспрессии гибридного белка данного изобретения на основе IFN1. Данную рекомбинантную экспрессионную плазмиду трансфицировали с использованием липофектамина (номер по каталогу 18324-020, Life Techonologies) в клетки почек человека EBNA 283 в соответствии с инструкцией производителяFocus 15.73) с использованием 1-3 мкг плазмидной ДНК для культуральной плашки диаметром 100 мм с клетками EBNA 293. На следующий 50 день после липофектаминовой трансфекции клеток среду заменяют на среду для культивирования (модифицированная по Дальбекко среда Игла, 10% фетальная бычья сыворотка, 4 мМ глутамин, 250 мкг гентецина/мл (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Кондиционированную среду собирали через 3-4 дня и концентрациюIFNl-Fc определяли как описано ниже. Получение гибридного белка IFN-/Fc в других экспрессионных системах, клетках млекопитающих или прокариотических клетках,может быть проведено путем переноса участка,кодирующего гибридный белок, в экспрессионные векторы, соответствующие этим экспрессионным системам. Альтернативные экспрессионные системы включают клетки млекопитающих,такие как клетки яичника китайского хомякаPur. 7, 335-342) и клетки почек зеленой мартышки COS7 (Ettinger, R. et. al. 1996, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 93:23, 13102-13107). Другими эукариотическими экспрессионными системами, которые могут применяться, могут быть дрожжи Pichia pastoris (Eldin, P. E. et al. 1997, J.Sci. USA, 85, 8678-8682). Количественное определение уровней экспрессии белка IFN1-Fc в культуральных супернатантах из трансфицированных клетокEBNA 293 проводили с помощью ELISA, с использованием очищенной на белке A IgG фракции кроличьих поликлональных антител противIFN1 (антигеном был очищенный IFN1,Biogen, Inc.) для покрытия 96-луночных планшетов. С помощью антител определяли содержание IFN1 в стандартных растворах и культуральных супернатантах в интервале концентраций интерферона от 10 до 0,3 нг/мл. Биотинилированные кроличьи поликлональные антитела против IFN1 (такие же антитела, как описанные выше) и связанную со стрептовидином пероксидазу хрена использовали для детекции связанных интерферонов. Для подтверждения данных, полученных с помощью ELISA,проводили вестерн-блоттинг, в котором восстановленные культуральные супернатанты и стандартные растворы IFN1 прогоняли на гелях с 5-20% Tris-глицина (Novex, San Diego, CA),переносили на мембраны PVDF (Amersham LifeScience, Inc., Cleveland. OH) и проводили определение с использованием другой кроличьей поликлональной сыворотки (полученной противIFN1), с последующим применением связанных с пероксидазой хрена антител осла против кроличьих IgG (Jackson ImmunoResearch,West Grove, PA). Пример 4. Антивирусная активность гибридного белка IFN1/мышиный IgG2a. 51 Клетки карциномы легкого человека(61, 41, 27, 18, 12, 8,2, 5,5, 3,7, 2,5, 1,6 пг/мл) перед внесением вируса энцефаломиокардита(ВЭМК). После двух дней инкубации с вирусом живые клетки окрашивали раствором ХТТ:PMS(2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2 Нтетразолий-5-карбоксанилида внутренняя соль: метасульфат феназина, при 333 мкг/мл и 2 нг/мл соответственно, в физиологическом растворе с фосфатным буфером) и определяли путем спектроскопии при 450 нм. Анализ проводили, используя данные с тройными повторами для каждой концентрации IFN. На фиг. 8 стандартные отклонения показаны как величины ошибки. 50% цитопатический эффект для IFN1 приблизительно составлял 0,4 пМ. Обнаружено, что 50% цитопатический эффект IFNмышиного IgG2a составлял 0,15 пМ. Пример 5. Конструирование и получение гибридного белка человеческий -1-интерферон/человеческий IgG1 Fc. А. Конструирование гибридного белка человеческийIgG1 Fc. Для создания экспрессионной плазмиды,кодирующей последовательность ДНК человеческого IFN-, соединенного с молекулой тяжелой цепи Fc фрагмента (шарнирный участок,домены СН 2 и СН 3) человеческого IgG1, применяли метод ПЦР. Конструкция EBNA. Плазмидный вектор рСН 269 получали из рСЕР 4 (Invitrogen,Carlsbad, CA), из которого был удален генEBNA-1. Плазмиду использовали для конструирования экспрессионного вектора, использующегося для временной экспрессии белка в клетках почек человека EBNA 293 (Invitrogen,Carlsbad, CA; Shen E.S., et al. 1995, Gene 156,235-239). Экспрессионную кассету гибридного белка собирали из трех фрагментов ДНК: NotI/SalI фрагмента, кодирующего сигнальную последовательность VCAM-1 в рамке считывания и соединенный с последовательностью, кодирующей человеческий IFN-, SalI/NotI фрагмента,кодирующего шарнирный участок, СН 2 и СН 3 домены человеческого IgGI, и NotI фрагментаEBNA экспрессионного вектора рСН 269. Два разных фрагмента NotI/SalI, кодирующих зрелую сигнальную последовательность VCAM-1 в рамке считывания и соединенных с геном человеческого IFN- получали с помощью метода ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pCMG258 (см. пример 2, приведенный выше), которая кодирует зрелую сигнальную последовательность 52 в рамке считывания и соединен с энтерокиназной линкерной последовательностью. Использовали два набора праймеров для ПЦР. Один набор праймеров (5'-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3' (SEQ ID NO: 37),и 5-ATACGCGTCGACGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3': (SEQ ID NO: 38 вводит аминокислотную замену G на С в положении 162. Данный фрагмент называется человеческийIFNC162. Второй набор праймеров (5'-AGCTTGGTAAGTCTG-3' (SEQ ID NO: 40 также вводит аминокислотную замену G162 на С 162 и изменяет энтерокиназную линкерную последовательность (DDDDK) на линкерную последовательность GGGGS в рамке считывания и соединяет 3' с геном человеческого IFN-. Этот фрагмент назвали человеческий IFNC162/G4S. Оба набора праймеров содержат 5' NotI сайт для обеспечения возможности лигирования в рСН 269 и 3' SalI сайт расщепления для обеспечения возможности лигирования с фрагментомSall/NotI человеческого IgGl. Фрагмент человеческого IgGl, который кодирует шарнирный участок, СН 2 и СН 3 домены человеческого IgG1, получали путем расщепления под действием рестрикционных ферментов(SalI/NotI) плазмиды pEAG409, полученной из плазмиды SAB144 (описанной в патенте США 5547853). Фрагмент вырезали и очищали в геле. Плазмиду рСН 269 экспрессионного вектора EBNA расщепляли с помощью NotI и очищали в геле. Две гибридные конструкции человеческийIFNчеловеческий IgG1 Fc получали путем трехстадийного лигирования. Одна конструкция, названная ZL6206, содержит линкер G4S; другая конструкция, названная ZL5107, представляет собой прямое соединение. Последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность открытых рамок считывания(см. фиг. 10) гибридного белка с прямым соединением приведены в SEQ ID NO: 41 и SEQ IDNO: 42 соответственно. Последовательность полноразмерной ДНК и белковая последовательность открытых рамок считывания (см. фиг. 11) гибридного белка с линкерной последовательностью приведены в SEQ ID NO: 43 и SEQID NO: 44 соответственно. Конструкция СНО. Получали стабильную экспрессионную конструкцию СНО гибридного белка человеческий IFNчеловеческий IgGlFc, которая включала ген человеческого IFN-,непосредственно связанный с геном человеческого IgG1 Fc. Фрагмент человеческий IFN-человеческий IgGl Fc вырезали из плазмиды 53 лигировали в NotI сайт pEAG347 (экспрессирующий вектор, содержащий тандем раннего промотора SV40 и основного позднего промотора аденовируса [полученный из плазмиды рАD2], уникальный сайт клонирования NotI,сопровождаемый сайтом поздней терминации транскрипции SV40 и сигналами полиА [полученными из плазмиды рСМV]. pEAG347 содержит плазмидную основу, полученную изpUC19 и pSV2dhfr-полученный dhfr для селекции МТХ и амплификации в трансфицированных клетках СНО). В. Получение гибридного белка человеческий -1-интерферон/человеческий IgG1 Fc в клетках млекопитающих. Трансфекция гибридных конструкций IFN в клетки EBNA293 для обеспечения временной экспрессии. Экспрессионные векторы рекомбинантного белка IFN-/человеческий IgG1 Fc, описанные выше, временно трансфицируют в клетки почек человека EBNA293 для осуществления экспрессии гибридного белка данного изобретения на основе IFN1. Эти рекомбинантные экспрессионные плазмиды трансфицируют с использованием липофектамина (номер по каталогу 18324-020, Life Technologies) в клетки почек человека EBNA 293 в соответствии с инструкцией, описанной выше в примере 3. Стабильная трансфекция гибридной конструкции человеческий IFN1/человеческийIgG1 Fc (не содержащей линкера) в клетки dhfrCHO. Описанный выше экспрессирующий вектор рекомбинантного IFN-/человеческий IgG1Fc (не содержащего линкера), содержащий dhfr стабильно трансфицировали в клетки dhfr- CHO для осуществления экспрессии гибридного белка данного изобретения на основе IFN1. Данную рекомбинантную экспрессионную плазмиду трансфицировали методом электропорации и отбор положительных клонов проводили в соответствии со следующим описанием. Плазмидную ДНК (20 мкг), расщепленную с помощью BgIII, осаждали, ресуспендировали в 800 мкл буфера HEPES и добавляли к 10107CHO клеток/мл. После электропорации клетки культивировали в полной среде DMEM в течение 2 дней. Клетки разделяли на 20-40 чашек диаметром 10 см с полной средой DMEM/ диализованной 10% FBS и культивируют в течение 5 дней перед помещением в селекционную среду с увеличивающимися концентрациями (50-200 нг/мл) МТХ в DMEM в течение двух недель. К концу двух недель единичные колонии отбирали и размножали. Супернатанты,полученные от 22 клонов СНО, тестировали в антивирусном анализе. Активность. Антивирусную активность гибридных белков определяли в СРЕ анализах, как описано в 54 примере 4. Как определено с использованием в данном анализе стандарта -1-интерферона со специфической активность 60 MU/мг, активность полученного в результате временной экспрессии (EBNA) гибридного белка человеческий -1-интерферон/человеческий IgG1 Fc,содержащего линкер, составляла 900 ед./мл и активность гибридного белка, не содержащего линкер, составляла 440 ед./мл. Активность экспрессированного в СНО гибридного белка человеческий -1-интерферон/человеческий IgG1Fc составляла 50 ед./мл. Пример 6. Измерение антивирусной активности -1-интерферона в плазме мыши, обработанной -1-интерфероном и гибридным белком -1a-интерферон /мышиный IgG2a. Мышам (С 57/В 16) вводили в.в. через хвостовую вену 50000 ед. -интерферона-1 (одной дозой) или 5000 ед. гибридного белка -1 интерферон-мышиный IgG2a. В качестве контроля вводили равный объем фосфатного буфера. Образцы крови брали из ретроорбитального синуса в разные моменты времени(сразу, через 0,25, 1, 4, 24 и 48 ч) после инъекции -интерферона. Для каждой временной точки брали по меньшей мере 3 мыши. Целую кровь собирали в пробирки, содержащие коагулянт, клетки удаляли, полученную плазму замораживали и хранили до анализа. Образцы плазмы разбавляли 1:10 не содержащей сыворотку средой для анализа и пропускали через 0,2 мкм шприцевой фильтр. Разбавленные образцы затем титровали в обозначенных лунках 96-луночного культурального планшета, содержащего клетки А 549. Стандарт -1-интерферона (10, 6,7, 4,4, 2,9,1,3, 0,9 и 0,6 ед./мл, AVONEX) и 4 образца тестировали на каждом планшете. Клетки предварительно обрабатывали образцами в течение 24 ч перед заражением вирусом ЭМК. После двух дней инкубации с вирусом живые клетки окрашивали раствором МТТ (5 мг/мл в фосфатном буфере) в течение 1 ч, промывали фосфатным буфером и солюбилизровали в 1,2 н. растворе НСl в изопропаноле. Лунки прочитывали при 450 нм. Для каждого планшета получали стандартные кривые и использовали их для определения величины активности -1-интерферона в каждом образце. На фиг. 9 приведен график зависимости активности в образцах, полученных от разных мышей, от времени. Более медленное исчезновение гибридного белка на основе -1-интерферона из системы циркуляции, как функция времени, показывает,что период полужизни образца гибридного белка гораздо больше, чем период полужизни немодифицированного контроля-1-интерферона. Вторым обнаружением данного исследования, имеющим большое значение, является то, что очень небольшое количество гибридного 55 белка утрачивается в процессе фазы распределения, что подтверждается сходными высокими уровнями активности, соответствующими временным точкам 15 и 60 мин. Эти данные показывают, что в отличие от контроля -1 интерферона, распределение гибридного белка на основе -1-интерферона в значительной степени ограничено сосудистой сетью. Пример 7. Сравнительные фармакокинетические и фармакодинамические характеристики у приматов. Сравнительные исследования проводили с гибридным белком на основе -1-интерферона и нативным -1-интерфероном (не представленным в виде лекарственной формыAVONEX -1-интерферона в 100 мМ фосфате натрия, 200 мМ NaCl, pH 7,2) для определения их относительной стабильности и активности у приматов. В этих исследованиях фармакокинетические и фармакодинамические характеристики гибридного белка на основе -1 интерферона у приматов сравнивали с характеристиками нативного -1-интерферона, корректные заключения могут быть распространены на людей. Животные и методы План исследования. Для сравнительной оценки фармакокинетических и фармакодинамических характеристик гибридного белка на основе -1 интерферона и негибридного белка -1 интерферона проводили исследования с использованием параллельных групп, повторяющихся доз. Для данного исследования использовали здоровых приматов (предпочтительно макак резусов). Перед получением дозы всех животных дважды проверяли на наличие симптомов заболеваний с помощью Lab Animal Veterinary в течение 14 дней перед введением тестируемого препарата; одна проверка должна проходить в пределах 24 ч перед первым введением тестируемого препарата. Тестируемый препарат давали только здоровым животным. Проверки включают общее физическое обследование и анализ крови перед введением дозы на базовую клиническую патологию и базовый уровень антител к -1-интерферону. В пределах 24 ч перед введением тестируемого препарата всех животных взвешивали и измеряли у них температуру тела. Двенадцать индивидуумов регистрировали и распределяли по группам из трех индивидуумов для получения 1 MU/кг -1-интерферона,либо гибридного, либо негибридного, но иным образом идентичного -1-интерферону. Введение осуществляли либо подкожным (ПК),либо внутривенным (ВВ) способом. Шесть самцов получали тестируемый препарат ВВ способом (3/обработку), а другие 6 самцов получали тестируемый препарат ПК способом(3/обработку). Все животные должны быть наивными по отношению к обработке интерфероном. Каждое животное получало дозу дважды; дозы разделяли на четыре недели. Объем дозы составлял 1,0 мл/кг. Кровь подвергали фармакокинетическому тестированию через 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2,4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 и 96 ч после каждой инъекции. Образцы крови для определений индуцированного интерфероном маркера биологического ответа, сывороточного неоптерина, брали через 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336, 504 ч после введения исследуемого препарата. Проверки в течение периода исследования включают клинические наблюдения, проводимые через 30 мин и 1 ч после введения дозы для обнаружения симптомов токсичности. Проводили ежедневные всесторонние наблюдения и регистрировали общий вид, симптомы токсичности, дискомфорт и изменения в поведении. Вес и температуру тела регистрировали с регулярными интервалами через 21 день после введения дозы. Аналитические методы. Количественное определение уровней интерферона в сыворотке проводили с помощью анализа цитопатического эффекта (СРЕ). В анализе СРЕ измеряли уровни интерферонопосредованной антивирусной активности. Уровень антивирусной активности в образце отражает число молекул активного интерферона, содержащихся в данном образце в момент взятия крови. Этот подход является стандартным методом определения фармакокинетических характеристик -интерферона. Анализ СРЕ, использующийся в настоящем исследовании, определяет способность -интерферона защищать клетки карциномы легкого человека(А 549, CCl-185, АТСС, Rockville, MD) от цитотоксичности, обусловленной вирусом энцефаломиокардита (ЭМК). Преинкубация клеток в течение периода от 15 до 20 ч с образцами сыворотки способствует индукции и синтезу интерферон-индуцируемых белков, которые затем обеспечивают антивирусный эффект. Затем добавляют вирус и инкубируют в течение еще 30 ч, после чего определяют цитотоксичность с использованием кристаллического фиолетового красителя. Внутренний стандарт, -интерферон,а также внутренний стандарт, -Ig-интерферон,тестировали одновременно с образцами на каждом аналитическом планшете. Этот стандарт калибровали против стандарта отнесения, природного интерферона фибробластов человека(WHO Второй международный стандарт интерферона, человеческие фибробласты, Gb-23-90253). Каждый аналитический планшет также включает лунки контроля клеточного роста, не содержащие ни -интерферона какого-либо вида, ни ЭМК, и лунки контроля вируса, содержащие клетки и ЭМК, но не -интерферона. Для 57 определения влияния, если оно имеет место,образцов на клеточный рост также готовили контрольные планшеты, содержащие стандарты и образцы. Эти планшеты окрашивали, не добавляя вирус. Образцы и стандарты тестировали в повторах на каждом из двух параллельных аналитических планшетах, получая для образца четыре значения данных. Приводили среднее геометрическое значение концентраций в четырех повторах. Предел определения в этом анализе составлял 10 единиц (ед.)/мл. Сывороточные концентрации неоптерина определяли в единицах клинической фармакологии с использованием коммерчески доступных анализов. Фармакокинетические и статистические методы. Для приведения данных к фармакокинетическим моделям использовали программное обеспечение RstripTM (MicroMath, Inc., SaltLake City, UT). Для каждой группы строили график зависимости среднего геометрического значения концентраций от времени. Так как результаты анализа выражали в разведениях,средние геометрические значения считали более подходящими, чем средние арифметические. Уровни сывороточного интерферона доводили до базовых значений и к не детектируемым сывороточным концентрациям относили концентрации ниже 5 ед./мл, что представляет собой половину нижнего предела детекции. В случае данных для ВВ инфузии, модель ВВ инфузии из двух отделений приводили к детектируемым сывороточным концентрациям для каждого индивидуума, и ПК данные приводили к инъекционной модели из двух отделений. Рассчитывали следующие фармакокинетические параметры:(i) наблюдаемое максимальное значение концентрации, Сmах (ед./мл);(ii) область под кривой от 0 до 48 ч, ОПК(iii) полупериод выведения; и из данных ВВ инфузии (если ВВ применяется):(L). Для расчета полупериодов выведения после ПК и ВВ введения использовали программное обеспечение WinNonlin (Version 1.0, Scientific Consulting Inc., Apex, NC). Для неоптерина представляли зависимость средних арифметических значений от времени для каждой группы. Рассчитывали Emax, значение, максимально отличающееся от базовой линии. Сmах, ОПК и Еmах подвергали одностадийному анализу отклонений для сравнения дозировочных групп. Сmах и ОПК перед анали 005005 58 зом переводили в логарифмический вид; приводили средние геометрические значения. Пример 8. Антиангиогенные эффекты гибридного белка на основе -1-интерферона. Определение способности гибридного белка на основе -1-интерферона ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток in vitro. Эндотелиальные клетки вены человека(Cell Systems, номер по каталогу 2VO-P75) и эндотелиальные клетки микрососудов кожи человека (Cell Systems, номер по каталогу 2 М 1 С 25) выращивали в культуре с CS-C средовым набором (Cell Systems, Cat.4Z0-500). За 24 до эксперимента клетки трипсинизировали, ресуспендировали в аналитической среде, 90% М 199 и 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), и доводили до желаемой клеточной плотности. Затем клетки помещали на покрытые желатином 24- или 96-луночные планшеты в количестве 12500 клеток/лунку или 2000 клеток/лунку соответственно. После инкубации в течение ночи, аналитическую среду заменяли свежей средой, содержащей 20 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (Becton Dickinson, номер по каталогу 40060), и различные концентрации гибридного или негибридного -1-интерферона или положительного контроля (в качестве положительного контроля можно использовать эндостатин,а также антитело против bFGF). Конечный объем доводят до 0,5 мл в 24-луночном планшете или до 0,2 мл в 96-луночном планшете. Через 72 ч клетки трипсинизируют для счета Coulter, замораживают для CyQuant флюоресцентного считывания, или метят [3 Н]тимидином. В данном анализе in vitro анализировали влияние молекул человеческого -интерферона данного изобретения на пролиферацию эндотелиальных клеток, которое может быть показателем агиогенных эффектов in vivo. См. O'Reilly,M.S., T. Boehm, Y. Shing, N. Fukal, G. Vasios, W.of Angiogensis and Tumor Growth. Cell 88, 277285. Пример 9. In Vivo модель для анализа антиангиогенных и реваскуламатозных эффектов гибридного белка -1/Ig-интерферона. Был разработан ряд моделей для анализа антиангиогенных и неоваскуламатозных эффектов описанных в данном документе молекул. Некоторые из этих моделей были описаны в патентах США 5733876 (31 марта 1998: "Methodfor the inhibition of angiogenesis"). Другие исследования включают анализ с использованием безоболочечной хориоаллантоисной мембраны(1982) и R. Crum, S. Szabo and J. Folkman; Science. 230. 1375 (1985); модель антиангиогенеза метода мышиного дорсального воздушного мешочка Folkman, J. et al.; J. Exp. Med.,133. 275(1971) и анализ с использованием микрокармана комедона крысы Gimbrone, M.A. Jr. et al., J. Natl.Cancer Inst. 52, 413 (1974), в котором васкуляризацию комедона индуцируют у взрослых самцов крыс штамма Sprague-Dawley (Charles River,Japan) путем имплантации 500 нг основногоFGF (бычий, RD Systems, Inc.) импрегнированного в ЭВА (сополимер этилена и винилацетата) шарики в каждой роговице. Другие методы тестирования гибридных белков /Ig-интерферон на антиангиогенные эффекты в животных моделях включают (но не ограничиваются ими) описания скрининга новых потенциальных антираковых агентов, как описано в Cancer Chemotherapy Reports, Part 3,Vol. 3, No.2, September 1972 и the supplement InNo. 84-2635, February 1984. Из-за наличия видовых барьеров для интерферонов типа I, для определения антиангиогенной активности гибридных белков на основе -интерферона на моделях-грызунах, получали гибридные препараты-интерферон грызунов/Ig. Примеры таких методов скрининга приводятся в описании к тесту для антиангиогенных эффектов мышиных гибридных белков /Ig-интерферон на имплантированной подкожно карциноме легких Льюиса. Источник опухолевой линии. Возник спонтанно в 1951 в виде карциномы легких у мыши C57BL/6. Краткое описание аналитических процедур. Опухолевый фрагмент имплантировали подкожно в подмышечную область мышиB6D2F1. Тестируемый агент (т.е. гибридный белок данного изобретения) вводили в различных дозах, подкожно (ПК) или интраперитонеально (ИП) через много дней после имплантации опухоли. Измеряемым параметром являлось среднее время выживания. Результаты выражали в виде процента от контрольного времени выживания. Животные: Воспроизведение: мыши C57BL/6. Тестирование: мыши B6D2F1. Вес: Вес мыши должен варьировать в пределах 3 г от минимального веса, составляющего 18 г для самцов и 17 г для самок. Пол: В одном эксперименте использовали тестируемых и контрольных животных одного пола. Источник: В одном эксперименте всех животных, если возможно, брали из одного источника. Размер эксперимента: Десять животных на тестируемую группу. Пересадка опухоли: Воспроизведение: 60 Фрагмент: Получали фрагмент величиной 2-4 мм от п. к. донора опухоли. Время: 13-15 день. Место: Имплантировали фрагмент п.к. в подмышечную область с пункцией в паховую область. Тестирование: Фрагмент: Получали фрагмент величиной 2-4 мм от п. к. донора опухоли. Время: 13-15 день. Место: Имплантировали фрагмент п.к. в подмышечную область с пункцией в паховую область. Режим тестирования: День 0: Имплантация опухоли. Выращивание бактериальных культур. Тестирование соединения положительного контроля в каждом нечетном эксперименте. Подготовка материалов. Ежедневная запись гибели животных. День 1: Проверка культур. Отбрасывание эксперимента в случае загрязнения. Перемешивание животных. Обработка в соответствии с инструкцией (на 1 день и на следующие дни). День 2: Повторная проверка культур. Отбрасывание эксперимента в случае загрязнения. День 5: Сравнение дня 2 и дня начального определения токсичности тестируемого агента. День 14: Контрольный день ранней гибели. День 48: Контрольный no-take день. День 60: Окончание и оценка эксперимента. Грубое обследование легких на наличие опухоли. Контроль качества. Использовали соединение положительного контроля (NSC 26271 (цитоксан в дозе 100 мг/кг/инъекцию в каждом нечетном эксперименте, режим для которого состоял в интраперитонеальном введении только на 1 день. Более низкий предел тест/контроль для положительного контроля составлял 140%. Допустимое среднее время выживания необработанного контроля составляло 19-35,6 дней. Оценка. Измеряемым параметром являлось среднее время выживания. Вычисляли вес тела животных на 1 день и 5 день, вычисляли отношение тест/контроль для всех тестируемых групп. Вычисляли средний вес тела животных на промежуточный день и день окончательной оценки. Отношение тест/контроль вычисляли для всех тестируемых групп с выживаемостью на 5 день 65%. Величина отношения тест/контроль 86% определяет токсичность. При оценке токсичности можно также использовать разность изменения избыточного веса тела (тест минус контроль). Критерий активности. Начальное отношение тест/контроль большее чем или равное 140%, считается необходимым для демонстрации умеренной активности. Воспроизводимое отношение тест/