Новое антитело против ngf человека

НОВОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ NGF ЧЕЛОВЕКА Проблема. Получить антитело против NGF человека, которое обладает уменьшенными влиянием на плоды и риском побочных действий, включающим тромбоз, при сохранении высокой нейтрализующей активности, и которое имеет превосходную безопасность, или его антигенсвязывающий фрагмент; а также средство профилактики или лечения различных заболеваний,развитие болезненных состояний которых связано с NGF человека, который использует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Решение. Фрагмент Fab' антитела противNGF человека, который включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, и вариабельный участок легкой цепи,содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. Область техники Настоящее изобретение относится к новому антителу против NGF человека. Более конкретно, настоящее изобретение относится к Fab' фрагменту антитела против NGF человека. Уровень техники Фактор роста нервной ткани (NGF) является одним из гуморальных факторов, в целом называемых"нейротрофными факторами", и играет важную роль в формировании и дифференцировке нейронов, а также в поддержании функций нейронов в организме. В качестве рецепторов NGF известны высокоаффинный рецептор trkA (рецепторная тирозинкиназа) и низкоаффинный рецептор p75NTR. Имеется информация, сообщающая, кроме прочего, о том, что p75NTR связывается со всеми нейротрофными факторами и вовлечен в апоптоз в процессе формирования нейронов. Однако до сих пор роль p75NTR достаточным образом не объяснена. Между тем известно, что мыши с нокаутом по NGF и рецептору trkA имеют одинаковый фенотип (непатентный документ 1), и полагают, что физиологическое действие NGF выражается, главным образом, через рецептор trkA. В 1993 г. появилось сообщение, что введение NGF крысам вызывает боль (непатентный документ 2), а позже появилось сообщение, что внутривенное введение NGF человеку вызывает системную миалгию, а местное применение NGF вызывает системный эффект и приводит к гиперпатии и аллодинии в месте инъекции (непатентный документ 3). Кроме того, сообщалось, что мыши с нокаутом по рецепторуtrkA проявляют анальгезию (непатентный документ 4), из чего полагают, что NGF является молекулой,глубоко вовлеченной в проявление боли. Что касается связи между NGF и патологическим состоянием боли у человека, было показано, что экспрессия NGF/trkA усилена в суставных хрящах при остеоартрите(ОА) (непатентный документ 6) и что уровень NGF повышен у пациентов, страдающих ревматоидным артритом (непатентный документ 7) или интерстициальным циститом (непатентный документ 8). Исходя из приведенных выше фактов, ожидалось, что в случае создания моноклонального антитела,которое будет специфически связываться с NGF и имеет ингибиторную активность в отношении действия NGF, его можно использовать для лечения, профилактики и диагностики различных заболеваний,включая боль, связанную с NGF. Сообщается об антителах против NGF человека, которые известны на настоящий момент и клинически испытаны: танезумаб (патентный документ 1) и PG110 (патентный документ 2), как о гуманизированных антителах против NGF человека, и REGN475 (патентный документ 3), фулранумаб (патентный документ 4) и MEDI-578 (патентный документ 5), как полностью человеческие антитела против NGF человека. Среди них наибольшие усилия уделяются разработке танезумаба, и имеется информация о том,что по результатам клинического анализа это антитело вызывает мощный и обширный обезболивающий эффект при боли, такой как артралгия, сопровождающаяся остеоартритом, хронической боли в спине и цисталгии, сопровождающейся интерстициальным циститом (непатентные документы 9-11). В целом, в качестве главных факторов, определяющих эффективную дозу лекарственного средства,содержащего антитело, рассматривается нейтрализующая активность антитела против антигена и количество антигенов, присутствующих в организме. Усиление нейтрализующей активности приводит к снижению дозы и, следовательно, может быть полезным усовершенствованием, ведущим к уменьшению финансовых расходов на пациентов и стоимости препарата. Если уменьшение дозы может быть достигнуто, то также возможно проводить подкожное введение. Подкожное введение имеет важное преимущество, заключающееся в том, что пациент, при удовлетворении определенных условий, может выполнять инъекцию самостоятельно в домашних условиях. Кроме того, если лекарственный препарат, содержащий антитело, обычно вводят капельно в течение определенного времени во многих случаях путем внутривенного введения, при подкожном введении лекарство может быть введено в виде болюса, что обеспечивает еще одно преимущество. И врач, и пациент могут выбрать препарат для внутривенного введения и препарат для подкожного введения, что желательно. Однако при подкожном введении доза, которую можно ввести при одном введении, составляет, в целом, всего около 1 мл, поэтому доза должна содержать существенное количество антител, чтобы реализовать лекарственную эффективность. Далее, в отличие от внутривенного введения при подкожном введении требуется оценить его биодоступность. То есть, для того чтобы реализовать препарат для подкожного введения, требуется получить антитело, которое проявляет высокую растворимость и проявляет существенную лекарственную эффективность даже в малых дозах. Соответственно, если антитело, которое имеет более высокую нейтрализующую активность против NGF, сравнить с антителами, известными в данной области, то они более эффективны для лечения заболеваний, связанных с NGF, и для повышения удобства лечения. При том что NGF, как описано выше, является важным фактором роста нейронов, существенная проверка критериев безопасности необходима при разработке медицинских препаратов, которые ингибируют функцию NGF. В частности, одним из аспектов, для которого требуется проверка по критериям безопасности, являются эффекты на плод. К настоящему времени в отношении функционального ингибирования NGF имеются сообщения, информирующие, что мутации NGF являются причиной врожденной анальгезии (непатентный документ 5) и что в эксперименте на животных, если у беременных морских свинок вызывали образование аутоантител против NGF, ингибируя, таким образом, NGF в организме, у новорожденных морских свинок наблюдали симптом анальгезии (непатентный документ 12). Да-1 024292NGF ингибирует рост нейронов сенсорных нервов и симпатических нервов у эмбриона (непатентные документы 4 и 13). На основании этих результатов ясно, что NGF является необходимым фактором нейрогенеза на ранних стадиях развития. Заболевания, связанные NGF, также включают заболевания, которыми часто страдают женщины в детородном возрасте, такие как интерстициальный цистит (половина или более пациентов были в возрасте 44 года и моложе, 90% пациентов были женщинами (непатентный документ 14, хронические боли в спине (средний возраст 40-50, более 50% пациентов были женщинами(непатентные документы 15-17 и мигрень (возраст максимума проявлений в диапазоне от 15 до 40 лет,80% пациентов были женщинами (непатентный документ 18. В этой ситуации при разработке антител против NGF в качестве медицинского лекарственного препарата очень важно устранить риск побочных эффектов на плод беременных женщин. Еще одним фактором риска при разработке антитела против NGF в качестве медицинского препарата рассматривается образование иммунного комплекса (IC). Иммунный комплекс, который представляет собой комбинацию антигена и антитела, в целом, подвергается воздействию в ретикулоэндотелиальной системе, такой как селезенка или печень. Однако сообщалось, что при патологическом состоянии,таком как иммунное нарушение, или если размер образовавшегося IC велик, IC теряет растворимость,что связано с риском образования тромбов и возникновением нефрита, вызванного накоплением IC в клубочках. При том что IgG является бивалентным антителом, когда антиген является поливалентным,IC может иметь различные размеры вследствие формирования решетчатой структуры. Размер IC зависит от количества антител и антигенов и соотношения между ними, аффинности антитела и т.п. Например,антитело против VEGF - бевацизумаб (наименование продукта: Авастин) представляет собой антителоIgG1, и имеется информация о том, что это антитело образует IC путем связывания с димером VEGF и вызывает образование тромба. Конкретно, если авастин и VEGF вводили мыши Tg с рецепторами человека FcRII, то наблюдалось образование тромба легочной артерии (непатентный документ 19). Кроме того, имеется информация о том, что артериальный тромб чаще формируется у пациентов с метастазирующим раком, которые получают химиотерапию с авастином, по сравнению с плацебо-группой, получавшей только химиотерапию (непатентный документ 20). Так как NGF также образует димер в организме для проявления физиологической активности, то желательно дальнейшее улучшение безопасности путем устранения риска образования IC при разработке медицинского препарата антитела против NGF. По причинам, приведенным выше, для лечения или профилактики различных заболеваний, связанных с NGF, очень важно получить антитело против NGF, которое превосходно с точки зрения безопасности, путем уменьшения риска побочных эффектов, таких как эффекты на плод и образование тромбов,при этом сохраняя высокую нейтрализующую активность. Предшествующий уровень техники Патентные документы. Патентный документ 1. WO 2004/058184. Патентный документ 2. WO 2005/061540. Патентный документ 3. WO 2009/023540. Патентный документ 4. WO 2005/019266. Патентный документ 5. WO 2006/077441. Непатентные документы. Непатентный документ 1. Conover J.C., et al., Rev. Neurosci. 1997, 8:13-27. Непатентный документ 2. Lewin G.R., et al., J. Neurosci. 1993, 13:2136-48. Непатентный документ 3. Petty B.G., et al., Ann. Neurol. 1994, 36:244-6. Непатентный документ 4. Smeyne R.J., et al., Nature. 1994, 368:246-9. Непатентный документ 5. Indo Y., et al., Nat. Genet. 1996, 13:485-8. Непатентный документ 6. Iannone F., et al., Rheumatology. 2002, 41:1413-8. Непатентный документ 7. Aloe L., et al., Clin. Exp. Rheumatol. 1997, 15:433-8. Непатентный документ 8. Lowe E.M., et al., Br. J. Urol. 1997, 79:572-7. Непатентный документ 9. Lane N.E., et al., N. Engl. J. Med. 2010, 363:1521-31. Непатентный документ 10. Evans R.J., et al., J. Urol. 2011, 185:1716-21. Непатентный документ 11. Katz N., et al., Pain. 2011, in press. Непатентный документ 12. Johnson E.M. Jr., et al., Science. 1980, 210:916-8. Непатентный документ 13. Crowley С., et al., Cell. 1994, 76:1001-11. Непатентный документ 14. Payne C.K., et al., J. Urol. 2007, 177:2042-9. Непатентный документ 15. Manchikanti L., et al., Pain Physician. 2010, 13:E279-92. Непатентный документ 16. Wilkens P., et al., JAMA. 2010, 304:45-52. Непатентный документ 17. Buynak R., et al., Expert Opin Pharmacother. 2010, 11:1787-804. Непатентный документ 18. Sakai F., et al., Cephalalgia. 1997, 17:15-22. Непатентный документ 19. Meyer T., et al., J. Thromb Haemost. 2009, 7:171-81. Непатентный документ 20. Scappaticci F.A., et al., J. Natl Cancer Inst. 2007, 99:1232-9. Сущность изобретения Техническая проблема. Задача настоящего изобретения заключается в получении антитела против NGF человека или его антигенсвязывающего фрагмента, которое имеет наилучшие с точки зрения безопасности свойства за счет уменьшения риска побочных эффектов, таких как эффекты на плод и формирование тромба при этом сохраняя 1 высокую нейтрализующую активность. Решение проблемы. Настоящее изобретение относится к нижеследующим изобретениям, которые представляют собой вещества и способы, применяемые в медицине или промышленности. 1. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательностиSEQ ID NO:6; и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательностиSEQ ID NO:4. 2. Фрагмент Fab' по п.1, в котором константная область тяжелой цепи фрагмента Fab' представляет собой константную область Ig1 человека. 3. Фрагмент Fab' по п.1, в котором константная область легкой цепи фрагмента Fab' представляет собой константную область Ig человека. 4. Фрагмент Fab' по п.1, в котором константный участок тяжелой цепи фрагмента Fab' представляет собой константный участок Ig1 человека, а константный участок легкой цепи фрагмента Fab' представляет собой константный участок Ig человека. 5. Фрагмент Fab' по п.1, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:16; и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12. 6. Фрагмент Fab' по любому из пп.1-5, в котором фрагмент Fab' конъюгирован с полиэтиленгликолем. 7. Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента Fab' по любому из пп.1-6. 8. Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует легкую цепь фрагмента Fab' по любому из пп.1-6. 9. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.7 и/или 8. 10. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.9. 11. Клетка-хозяин по п.10, которая выбрана из группы, состоящей из:(а) клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента Fab' по любому из пп.1-6, и полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует легкую цепь фрагмента(b) клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента Fab' по любому из пп.1-6, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует легкую цепь фрагмента Fab'. 12. Способ получения фрагмента Fab' антитела против NGF человека по любому из пп.1-6,drk.xf.obq экспрессирование фрагмента Fab' антитела против NGF человека путем культивирования клеток-хозяев по пп.10, 11. 13. Средство для лечения боли, которое содержит фрагмент Fab' по любому из пп.1-6. 14. Средство для лечения боли по п.13, где боль представляет собой боль при остеоартрите. 15. Способ профилактики или лечения боли, включающий введение фрагмента Fab' по любому из пп.1-6. 16. Способ по п.15, где боль представляет собой боль при остеоартрите. 17. Фрагмент Fab' по любому из пп. 1-6 для использования в профилактики или лечения боли. 18. Фрагмент Fab' по п.17, где боль представляет собой боль при остеоартрите. Благоприятные эффекты изобретения. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению может использоваться для профилактики или лечения различных заболеваний, формирование патологических состояний которых связано с NGF человека. Благодаря своей высокой нейтрализующей активности, фрагмент Fab' антитела против NGF человека по изобретению обеспечивает высокие преимущества для клинических применений, таких как уменьшение дозы, расширение интервалов введения и улучшение способа введения(например, подкожной инъекции). Более того, по уменьшению риска побочных эффектов, таких как эффекты на плод и формирование тромбов, фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению имеет значительное превосходство по отношению безопасности и вносит значительный вклад в профилактику или лечение различных заболеваний, формирование патологических состояний которых связано с NGF человека. Краткое описание фигур На фигуре показано временное изменение количества антител, находящихся в подошве стопы модельных мышей с артритом, индуцированным коллагеном. Описание вариантов воплощения Ниже настоящее изобретение будет описано более подробно. Авторы настоящего изобретения повторили творческое исследование для получения антитела против NGF человека или его антигенсвязывающего фрагмента. Им удалось получить фрагмент Fab' антитела против NGF человека, который обладает превосходными качествами в отношении безопасности благодаря уменьшению риска побочных эффектов, таких как эффекты на плод и формирование тромбов при поддержании высокой нейтрализующей активности. Основная структура молекулы антитела является общей среди соответствующих классов антител и образована тяжелой цепью, имеющей молекулярный вес 50000-70000, и легкой цепью, имеющей молекулярный вес 20000-30000. Тяжелая цепь, в целом, состоит из полипептидной цепи, включающей около 440 аминокислот, а каждый класс имеет свою характерную структуру. Тяжелые цепи называются , , , и -цепями, соответственно IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Кроме того, IgG имеет подклассы, такие как IgG1,IgG2, IgG3 и IgG4, и эти цепи называются 1, 2, 3 и 4 соответственно. Легкая цепь, в целом, состоит из полипептидной цепи, включающей около 220 аминокислот, известны два типа легких цепей, включающих легкие цепи L-типа и K-типа, которые называются - и -цепями соответственно. Что касается пептидного строения базовой структуры молекулы антитела, то две гомологичные тяжелые цепи и две гомологичные легкие цепи связаны дисульфидными мостиками (S-S связи) и нековалентными связями, а их молекулярный вес составляет 150000-190000. Два типа легких цепей могут быть соединены в пару какой-либо тяжелой цепью. Каждая молекула антитела всегда состоит из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей. В тяжелой цепи присутствуют четыре S-S мостика (пять мостиков в - и -цепях) и два - в легкой цепи. Одна из петель образована из 100-110 аминокислотных остатков, и эта стерическая структура сходна среди соответствующих петель и называется структурной единицей или доменом. И для тяжелых цепей, и для легких цепей аминокислотная последовательность домена, расположенного на его N-конце,не является постоянной, даже по сравнению со стандартным образцом того же класса (подкласса) того же вида животных, и этот домен называется вариабельным участком. Каждый из доменов называется вариабельным участком тяжелой цепи (VH) и вариабельным участком легкой цепи (VL) соответственно. Так как аминокислотная последовательность на С-концевой части домена почти постоянна в каждом классе или подклассе, то этот участок называется константным участком, и каждый из доменов обозначается как CH1, CH2, CH3 и CL соответственно. Сайт антигенной детерминанты антитела образован VH и VL, и специфичность связывания зависит от аминокислотной последовательности этого сайта. С другой стороны, биологическая активность, такая как связывание с комплементами или различными клетками, отражает различия в структуре константного участка среди различных классов Ig. Известно, что вариабельность вариабельных участков тяжелой цепи и легкой цепи главным образом ограничена тремя небольшими гипервариабельными участками,присутствующими в обеих цепях, и эти участки называются антигенсвязывающими участками (CDR;CDR1, CDR2 и CDR3, начиная с N-концевой стороны). Остающаяся часть вариабельного участка называется каркасным участком (FR) и является относительно константной. Участок между доменом CH1 и доменом CH2 константного участка тяжелой цепи антитела называется шарнирной областью. Этот участок включает множество остатков пролина и имеет много межцепочечных S-S мостиков, соединяющих две тяжелые цепи. Например, каждая шарнирная область IgG1,IgG2, IgG3 и IgG4 человека включает 2, 4, 11 и 2 остатка цистеина соответственно, которые образуют S-S мостики между тяжелыми цепями. Шарнирная область является участком, высокочувствительным к протеолитическим ферментам, таким как папаин или пепсин. Когда антитело переваривается папаином, то его тяжелая цепь расщепляется в положении ближе к N-концевой стороне, чем к S-S мостику между тяжелыми цепями в шарнирной области, в результате чего антитело разделяется на два фрагмента Fab и один фрагмент Fc. Фрагмент Fab образован легкой цепью и фрагментом тяжелой цепи, включая вариабельный участок тяжелой цепи (VH), домен CH1 и часть шарнирной области. Когда антитело переваривается пепсином, то его тяжелая цепь расщепляется в положении, более близком к С-концевой стороне,чем к S-S мостику, между тяжелыми цепями шарнирной области, в результате образуются фрагментыF(ab')2. Фрагмент F(ab')2 представляет собой фрагмент, имеющий димерную структуру, в которой два фрагмента Fab связываются между собой S-S мостиками между тяжелыми цепями в шарнирной области. Фрагмент Fab' образован легкой цепью и фрагментом тяжелой цепи, включая вариабельный участок тяжелой цепи (VH), домен CH1 и часть шарнирной области. Остатки цистеина, образующие S-S мостики между тяжелыми цепями, включены в участок шарнирной области. И фрагмент Fab, и фрагмент F(ab')2, и фрагмент Fab' включают вариабельный участок и имеют антигенсвязывающую активность. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, который авторы настоящего изобретения успешно получили, представляет собой фрагмент Fab', имеющий нижеследующие характеристики. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека содержит вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и вариабельного участка легкой цепи,состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4. Конкретно, авторами настоящего изобретения было сконструировано антитело с помощью методики создания моноклональных антител человека, "VelocImmune" mouse [VelocImmune antibody technology;Regeneron Inc. (патент США 6596541)], и проверили антитела с использованием анализов на различные виды биологической активности и физические свойства, добившись, таким образом, идентификации фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению. Согласно технологииVelocImmune трансгенные мыши, у которых вариабельные участки тяжелой и легкой цепей эндогенного иммуноглобулина замещены соответствующими вариабельными участками человека подвергаются воздействию антигена, представляющего интерес (например, NGF человека), а затем от мышей получали лимфатические клетки, которые экспрессировали антитела. Лимфатические клетки сливали с клетками миеломы мыши, чтобы получить гибридомы. Клетки гибридомы проверяли, чтобы идентифицировать клетки гибридомы, которые продуцируют такие антитела, которые специфически связываются с антигеном, представляющим интерес. Антитела, которые продуцируются таким образом, представляют собой антитела, имеющие вариабельные участки антител человека и константные участки антител мыши (также обозначаемые как химерные антитела). Затем, если антитело, которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном и имеет желаемую нейтрализующую активность, идентифицировано, ДНК, которые кодируют вариабельные участки тяжелой цепи и легкую цепь антитела, выделяли из клеток гибридомы и связывали с ДНК, кодирующими константные участки тяжелой цепи и легкую цепь желаемого класса антител человека. Полученный ген, кодирующий тяжелую цепь и легкую цепь антитела, экспрессировали в клетках (например, клетках СНО), чтобы продуцировать молекулу антитела. Тяжелая цепь и легкая цепь антитела, продуцированные вышеописанным способом, представляют собой тяжелую цепь и легкую цепь "полностью человеческого" антитела, происходящего от гена иммуноглобулина человека. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению может быть без труда получен специалистами в данной области на основе информации о последовательности его вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи, описанного в настоящем документе, с помощью способа, общеизвестного в данной области. Предпочтительно фрагмент Fab' антитела противNGF человека по настоящему изобретению может быть получен как полностью человеческий фрагментFab' антитела путем соединения его вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельных участков легкой цепи с частью константного участка тяжелой цепи (который включает домен CH1 и частью шарнирной области, включающей цистеин в шарнирной области) и константным участком легкой цепи антитела человека, соответственно. Конкретно, получают фрагмент гена вариабельного участка тяжелой цепи,имеющий последовательность оснований, которая кодирует аминокислоты вариабельного участка тяжелой цепи фрагмента Fab' по настоящему изобретению (SEQ ID NO:6), и ген фрагмента вариабельного участка легкой цепи, имеющего последовательность оснований, который кодирует аминокислоты вариабельного участка легкой цепи фрагмента Fab' по настоящему изобретению (SEQ ID NO:4). Затем гены вариабельного участка тяжелой цепи и легкой цепи связываются с каждым геном части константного участка тяжелой цепи и константного участка легкой цепи в соответствующий класс антител человека для получения полностью человеческого гена фрагмента Fab' антитела. Затем этот ген соединяют с соответствующим вектором экспрессии и вводят в культивируемые клетки. Наконец, эти культивируемые клетки культивировали и, таким образом, получали моноклональный фрагмент Fab' из супернатанта культуры. Фрагменты гена, которые кодируют аминокислоты вариабельного участка тяжелой цепи и легкой цепи фрагмента Fab' по настоящему изобретению, могут быть синтезированы с помощью способа синтеза генов, известного в данной области, на основе, например, последовательностей оснований, созданных на основе аминокислотных последовательностей вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи. Примеры такого способа синтеза генов включают различные способы, известные специалистам в данной области, такие как способ синтеза генов антител, описанный в WO 90/07861. Затем вышеописанные фрагменты генов вариабельного участка соединяются с геном константного участка антитела человека для получения полностью человеческого гена фрагмента Fab'. Хотя какойлибо подкласс константного участка (например, константный участок тяжелой цепи, такой как 1-, 2-,3- или 4-цепи, или константный участок легкой цепи, такой какили -цепи) может быть выбран как константный участок антитела человека, Ig1 человека как константный участок тяжелой цепи и Ig человека как константный участок легкой цепи, могут быть использованы предпочтительно. После получения такого полностью человеческого гена фрагмента Fab' антитела введение гена в вектор экспрессии, введение вектора экспрессии в культивируемые клетки, культивирование культиви-5 024292 руемых клеток, очистка фрагмента Fab' и т.п. могут быть выполнены с помощью различных способов,известных в данной области. Примеры векторов экспрессии, которые присоединены к полученным таким образом генам, включают GS вектор PEEE6.4 или pEE12.4 (Lonza Biologics), но не ограничиваются конкретно этим, если они в состоянии экспрессировать такой ген антитела. Также может быть использован вектор экспрессии, уже имеющий константный участок гена Ig человека, такой как AG-1 или AG- (например, см. WO 94/20632). Вышеописанный вектор экспрессии вводят в культивируемые клетки путем, например, кальцийфосфатного способа или способа электропробоя мембраны и т.п. Примеры культивируемых клеток, в которые введен вектор экспрессии, включают культивируемые клетки, такие как клетки CHO-K1SV, клетки CHO-DG44 и клетки 293, и эти клетки могут культивироваться общепринятым способом. Фрагмент Fab', накопленный в супернатанте культуры после культивирования, описанного выше,может быть очищен с помощью различных типов колоночной хроматографии. Например, возможно проведение колоночной хроматографии с использованием KappaSelect или т.п. Фрагмент Fab' по настоящему изобретению может быть получен с помощью способа рекомбинантной экспрессии, как описано выше. Однако фрагмент Fab' может быть получен выполнением сначала пепсинового переваривания после получения полноразмерного антитела и обработки полученного фрагмента F(ab')2 восстановителем, таким как 2-меркаптоэтанол. Предпочтительно фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению может быть легко получен синтезом ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:6, и ДНК, содержащую последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO:4, и соединения ДНК с подходящим классом константных участков генов антитела человека, предпочтительно, константным участком гена тяжелой цепи Ig1 человека и константным участком гена легкой цепи Ig человека, чтобы сконструировать ген фрагмента Fab' полностью человеческого антитела с использованием способа, известного в данной области, и введения гена в вектор экспрессии, введения вектора экспрессии в культивируемые клетки, культивирования культивируемых клеток и очистки фрагмента Fab', собранного из культивируемых клеток с помощью различных способов, известных в данной области. Предпочтительно ДНК, содержащая последовательность оснований,кодирующую аминокислотные последовательности вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:6,содержит последовательности оснований SEQ ID NO:5. Предпочтительно ДНК, содержащая последовательность оснований, кодирующую аминокислотные последовательности вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO:4, содержит последовательности оснований SEQ ID NO:3. В данном изложении "фрагмент Fab'" обозначает фрагмент моновалентного антитела, образованный легкой цепью и фрагментом тяжелой цепи, включающий вариабельный участок тяжелой цепи (VH), домен CH1 и часть шарнирной области. В часть шарнирной области включен по меньшей мере один остаток цистеина (также называемый в данном изложении "цистеином шарнирной области"), иной, чем остатки цистеина, образующие S-S мостик между тяжелой цепью и легкой цепью. Цистеин шарнирной области может быть использован как сайт модификации полиэтиленгликолем, описанный ниже. Количество цистеина в шарнирной области во фрагменте Fab' изменяется в диапазоне от 1 до нескольких остатков цистеина в зависимости от класса используемых антител, и легко может быть установлено специалистом в данной области. Например, когда получают фрагмент Fab', относящийся к классу IgG1 человека (в целом, имеющий два цистеина в шарнирной области), стоп-кодон встраивают между кодирующим сайтом первого цистеина в шарнирной области и кодирующим сайтом второго цистеина в шарнирной области тяжелой цепи, в результате чего может быть получен фрагмент Fab', имеющий один цистеин в шарнирной области. В дополнение, если стоп-кодон встроен после кодирующего сайта второго цистеина в шарнирной области, может быть получен фрагмент Fab', имеющий два цистеина в шарнирной области. Предпочтительный фрагмент тяжелой цепи фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и части константного участка Ig1 человека, представляет собой фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:16. Предпочтительно ДНК, содержащая последовательность оснований,которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента Fab' антитела против NGF человека, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:16, содержит последовательность оснований SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:15. Предпочтительная легкая цепь фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, содержащая вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, и константного участка Ig человека, представляет собой легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12. Предпочтительно ДНК, содержащая последовательность оснований, которая кодирует легкую цепь фрагмента Fab' антитела против NGF человека, состоящую из аминокислотной последовательностиSEQ ID NO:12, содержит последовательность оснований SEQ ID NO:11. В качестве предпочтительного фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, который содержит фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12,приводится полностью человеческий фрагмент Fab' антитела 1-15 (N52D), описанный ниже в разделе"Примеры". В качестве предпочтительного фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, который содержит фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ IDNO:12, приводится фрагмент Fab' полностью человеческого антитела 1-15 (N52D-A), описанного в разделе "Примеры". В качестве предпочтительного фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, который содержит фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательностиSEQ ID NO:12, приводится фрагмент Fab' полностью человеческого антитела 1-15 (N52D-P), описанного в разделе "Примеры". Настоящее изобретение также содержит фрагмент Fab' антитела против NGF человека, который содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 31 до 35 из SEQ ID NO:6, CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 50 до 65 из SEQ ID NO:6, и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 98 до 110 из SEQ ID NO:6, и вариабельный участок легкой цепи,содержащий CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 24 до 39 изSEQ ID NO:4, CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 55 до 61 изSEQ ID NO:4, и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 94 до 102 изSEQ ID NO:4. Фрагмент Fab' также может быть получен специалистами в данной области в соответствии с процедурами, такими, как описаны выше. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению может быть модифицирован путем конъюгирования с полиэтиленгликолем (PEG) через цистеин в шарнирной области. PEG может быть конъюгирован с фрагментом Fab' с помощью способов, известных в данной области (например, EP 0948544). В настоящем изобретении подходит линейный или разветвленный PEG, имеющий произвольный средний молекулярный вес, или его производные, которые легко могут быть выбраны специалистами в данной области в соответствии с предполагаемым использованием. Например, в ткани опухоли или во время воспалительной реакции проницаемость сосудов значительно повышена по сравнению с нормальной тканью, так что вещества, достигающие ткани, склонны к утечке из кровеносных сосудов и накапливанию в опухоли или воспаленной ткани (эффект EPR). Также известно, что низкомолекулярное вещество легко реабсорбируется в кровеносные сосуды, а высокомолекулярные вещества легко не реабсорбируются. Следовательно, чтобы улучшить удерживаемость фрагмента Fab' в пораженной ткани, с этим фрагментом может быть конъюгирован PEG, имеющий высокий молекулярный вес(например, около 40000 Да). Когда фрагмент Fab' желательно быстро экскретировать из организма, с этим фрагментом может быть конъюгирован PEG, имеющий малый средний молекулярный вес (например, около 10000 Да). Далее, чтобы облегчить связывание PEG с цистеином шарнирной области, может быть использовано производное PEG. Например, как описано в разделе "Примеры", возможно использовать производное PEG, с которым связана тиореактивная группа, такая как малеимид, и связать тиоловую группу цистеина в шарнирной области с малеимидной группой через ковалентную связь. В целом,средний молекулярный вес PEG составляет от около 500 до около 50000 Да, предпочтительно от около 5000 до около 40000 Да и более предпочтительно от около 10000 до около 40000 Да. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению связывается с NGF человека. В качестве способа измерения активности связывания полученного фрагмента Fab' антитела против NGF человека с NGF человека существует способ, такой как ELISA или FACS. Например, при использовании ELISA, NGF человека иммобилизован на планшете ELISA, фрагмент Fab' добавляют к нему, чтобы вызвать реакцию, а затем второму антителу, такому как анти- антитело, помеченному ферментом, таким как пероксидаза хрена (HRP) позволяли прореагировать с реакционной смесью. После отмывки планшета активность измеряли с помощью детектирования активности реагента (например,хромогенного реагента ТМВ в случае мечения HRP), идентифицируя, таким образом, связывание вторых антител. В дополнение, фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению также включает фрагмент Fab', который связывает NGF, происходящий от другого животного (например, NGF мыши), так же как NGF человека, так что может быть измерена связывающая активность в отношении такого белка. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению имеет нейтрализующую активность по отношению к NGF человека. При использовании в данном изложении термин "нейтрализующая активность" фрагмента Fab' антитела против NGF человека обозначает активность, которая ин-7 024292 гибирует какую-либо биологическую активность, вызванную NGF, путем связывания с NGF, а нейтрализующая активность может быть оценена с помощью одного или множества биологической активностиNGF как показателя. Примеры такой нейтрализующей активности включают ингибиторную активность против связывания NGF с trkA, который представляет собой рецептор NGF, ингибиторную активность против потока кальция внутрь клетки, опосредованного NGF-trkA-сигналом, и ингибиторную активность против NGF-зависимой сигнализации, связанной с выживанием клетки. Нейтрализующая активность может быть оценена с помощью способов, описанных в разделе "Примеры". Чтобы более конкретно оценить эффект фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, был выполнен анализ in vivo. Например, как описано в разделе "Примеры", эффективность лекарственного средства фрагмента Fab' может быть оценена по обезболивающему эффекту или тому подобному с использованием модели артрита на мышах. Также возможно оценить эффект удерживания в поврежденной ткани с использованием анализа на проникновение в поврежденную ткань. Далее, фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению может быть также оценен с точки зрения риска побочных действий. Например, как описано в разделе "Примеры", с использованием анализа переноса через плаценту, выполненного после введения фрагмента Fab' беременным животным, можно оценить возможность того, что фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению может вызвать эффекты на плод. В дополнение, как описано в разделе "Примеры", размер иммунного комплекса (IC), образованного фрагментом Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению и NGF, измеряли с помощью анализа на формирование IC с NGF, на основании чего может быть оценена возможность формирования тромба. В дополнение, в качестве способа оценки различных типов стабильности (например, термостабильности, стабильности при длительном хранении и стабильности в высоких концентрациях) фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, приводятся способ с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии и способ измерения формирования агрегатов при хранении. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, если требуется, очищают и затем получают в виде формы обычными способами и может быть использован для лечения боли,такой как боль при остеоартрите (боль ОА), ревматическая боль, боли, связанной с раковым заболеванием, невропатические боли, хронические боли в спине, послеоперационные боли, посттерапевтическая невралгия, болезненная диабетическая невропатия, боли при переломах и при синдроме раздраженного мочевого пузыря и заболеваниях, формирование патологических состояний которых связано с NGF, таких как интерстициальный цистит, острый панкреатит, хронический панкреатит и эндометриоз. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению может быть использован предпочтительно как средство для лечения боли и, более предпочтительно, как средство для лечения боли при остеоартрите. Примеры форм лечебного средства и тому подобного включают парентеральные формы, такие как инъецируемые средства и средства для вливаний, которые, предпочтительно, вводятся путем внутривенного введения, подкожного введения и т.п. В процессе составления формы могут быть использованы носители и добавки, которые соответствуют данной форме в фармакологически приемлемом диапазоне. Количество фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, добавленное в вышеописанную форму, варьирует в зависимости от жестокости симптомов у пациента или возраста, используемой формы дозировки лекарственной формы или титра связывания антитела и тому подобного; например, может быть использовано от около 0,001 до 100 мг/кг антитела. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность, кодирующую фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению и вектор экспрессии, содержащий то же самое. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи фрагмента Fab' антитела противNGF человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, и вектор экспрессии, содержащий это поодиночке или вместе. Вектор экспрессии по настоящему изобретению не ограничен конкретно, так что он может экспрессировать ген, который кодирует фрагмент Fab' по настоящему изобретению или вариабельный участок его тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи в различных клетках-хозяевах прокариотических клеток и/или эукариотических клеток и продуцируют эти полипептиды. Их примеры включают плазмидные векторы, вирусные векторы (например, аденовирус, ретровирус) и т.п. Предпочтительно вектор экспрессии по настоящему изобретению содержит полинуклеотид, содержащий или последовательность, кодирующую тяжелую цепь фрагмента или легкую цепь фрагмент вышеописанного фрагмента Fab' по настоящему изобретению, или оба полинуклеотида, содержащие последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи фрагмента Fab' по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь фрагмента Fab' по настоящему изобретению. Вектор экспрессии по настоящему изобретению может содержать ген, который кодирует фрагментFab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, или ген, который кодирует вариабельный участок тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи фрагмента Fab' антитела противNGF человека по настоящему изобретению, и промотор, функционально связанный с геном. Примеры промотора для экспрессии гена, кодирующего фрагмент Fab' по настоящему изобретению или вариабельный участок его тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи бактерии, включает промотор Trp, промотор lac, промотор recA, промотор PL, промотор lpp, промотор tac и т.п., если хозяевами являются бактерии рода Escherichia. Примеры промотора для экспрессии в дрожжах включают промотор РН 05, промотор PGK, промотор GAP и промотор ADH, а некоторые примеры промотора для экспрессии в роде Bacillus включают промотор SL01, промотор SP02, промотор penP и т.п. Если хозяева представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, примеры промотора включают промотор, происходящий из SV40, ретровирусный промотор, промотор теплового шока и т.п. Если в качестве клетки-хозяина используется бактерия, в частности Escherichia coli, вектор экспрессии по настоящему изобретению может также содержать стартовый кодон, стоп-кодон, терминаторный участок и реплицируемый участок. Если в качестве хозяев используют дрожжи, клетки животных или клетки насекомых, вектор экспрессии по настоящему изобретению может содержать стартовый кодон и стоп-кодон. В этом случае он может содержать энхансерную последовательность, некодирующий участок на 5' стороне и 3' стороне гена, который кодирует фрагмент Fab' по настоящему изобретению или его вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок легкой цепи, сигнальную последовательность секреции, сайт сплайсинга, участок полиаденилирования, реплицируемый участок и т.п. Также он может содержать маркер отбора, который применяется обычно (например, ген тетрациклинрезистентности, ген ампициллин-резистентности, ген канамицин-резистентности, ген неомицинрезистености, ген редуктазы дигидрофолиевой кислоты) в соответствии с предполагаемым применением. Настоящее изобретение также относится к трансформанту, введенному с геном, кодирующим фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, или с геном, кодирующим вариабельный участок тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению. Такой трансформант может быть получен путем, например, трансформации клетки-хозяина вектором экспрессии по настоящему изобретению. Клеткихозяева, которые используются для получения трансформанта, конкретно не ограничены, постольку, поскольку это пригодно для вышеупомянутого вектора экспрессии и для трансформации; их примеры включают различные клетки, такие как природные клетки или искусственно сформированные линии клеток, обычно используемые в области по настоящему изобретению (например, бактерии (бактерии родаEscherichia, бактерии рода Bacillus), дрожжи (род Saccharomyces, род Pichia и т.п.), клетки животных или клетки насекомых (например, Sf9) и т.п. Трансформация может быть выполнена каким-либо известным способом самим по себе. Предпочтительно трансформант по настоящему изобретению представляет собой или клеткухозяин, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи фрагмента Fab' по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи фрагмента Fab', или клетку-хозяин, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи фрагмента Fab' по настоящему изобретению, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи фрагмента Fab'. Более предпочтительно трансформант по настоящему изобретению представляет собой либо клетку-хозяин, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи вышеупомянутого фрагмента Fab' по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь фрагмента Fab', или клеткухозяин, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи вышеупомянутого Fab' по настоящему изобретению,и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь фрагмента Fab'. Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, включающему экспрессирование в клетке-хозяине гена,кодирующего фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, или гена, кодирующего вариабельный участок тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи фрагментаFab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению, все это - при использовании такого трансформанта. Предпочтительно клетка-хозяин, которая используется в вышеизложенном способе,представляет собой клетку-хозяин, трансформированную вышеописанным вектором экспрессии по настоящему изобретению, и она может по отдельности или одновременно содержать полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи фрагмента Fab' по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи фрагмента Fab'. При продуцировании фрагмента Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению трансформант может быть культивирован в питательной среде. Питательная среда содержит источник углерода и источник неорганического азота или источник органического азота, которые требуются для роста трансформанта. Примеры источника углерода включают глюкозу, декстран, растворимый крахмал,сахарозу и т.п.; примеры источника неорганического азота или источника органического азота включают соли аммония, нитраты, аминокислоты, кукурузный экстракт, пептон, казеин, мясной экстракт, соевый жмых, экстракт картофеля и т.п. Если желательно, могут содержаться другие питательные вещества (например, неорганические соли (например, хлористый кальций, однозамещенный фосфат натрия, хлористый магний), витамины, антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин, канамицин и т.п.) и т.п.). Культивирование трансформанта проводится способом, который известен сам по себе. Условия культивирования, например, температура, pH среды и время культивирования выбираются подходящим образом. Например, если хозяин представляет собой клетку животного, в качестве среды может быть использована среда MEM, содержащая от около 5 до 20% фетальной бычьей сыворотки (Science,Vol. 122, p. 501, 1952), среда DMEM (Virology, Vol.8, p. 396, 1959), среда RPMI 1640 (J. Am. Med. Assoc,Vol. 199, p. 519, 1967), среда 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 73, p. 1, 1950) и т.п. pH среды предпочтительно составляет около 6 до 8, культивирование обычно проводится при около 30 до 40 С в течение около 15 до 72 ч, а аэрация или перемешивание могут проводиться, если требуется. Когда хозяин представляет собой клетку насекомого, например, может быть упомянута среда Грейса, содержащая фетальную бычью сыворотку (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 8404, 1985) и т.п., а ее pH составляет предпочтительно от около 5 до 8. Культивирование обычно проводится при около 20-40 С в течение 15-100 ч,а если требуется, могут быть выполнены аэрация или перемешивание. Если хозяин представляет собой бактерию, актиномицет, дрожжи или нитчатый гриб, пригодна, например, жидкая среда, содержащая вышеупомянутые источники питательных веществ. Среда, имеющаяpH 5-8, является предпочтительной. Когда хозяин представляет собой Е.coli, предпочтительные примеры среды включают среду LB, среду М 9 (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring HarborLaboratory, p. 431, 1972) и т.п. В этом случае культивирование обычно проводят при 14-43C в течение около 3-24 ч, тогда как аэрация или перемешивание выполняется, если необходимо. Когда хозяин представляет собой бактерию рода Bacillus, культивирование обычно проводили при 30-40C в течение около 16-96 ч, тогда как аэрация или перемешивание выполняется, если необходимо. Когда хозяин представляет собой дрожжи, примеры среды включают минимальную среду Буркхолдера (Bostian, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, Vol. 77, p. 4505, 1980), а pH среды желателен 5-8. Культивирование обычно проводят при около 20-35C в течение около 14-144 ч, тогда как аэрация или перемешивание выполняется, если необходимо. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению может быть получен,предпочтительно, выделен и очищен, из культуры трансформанта, как описано выше. Примеры способа выделения и очистки включают способы, основанные на различиях растворимости, таких как высаливание и осаждение растворителя; способы, основанные на различиях молекулярного веса, такие как диализ,ультрафильтрация, гель-фильтрация и электрофорез в додецилсульфат-полиакридамидном геле; способы, основанные на различиях электрического заряда, такие как ионообменная хроматография и хроматография на гидроксил апатите; способы, основанные на специфической аффинности, такие как аффинная хроматография; способы, основанные на различиях гидрофобности, такие как обращенно-фазная хроматография высокого разрешения; способы, основанные на различиях изоэлектрической точки, такие как изоэлектрическое фокусирование и т.п. Хотя настоящее изобретение, в целом описано выше, конкретные примеры представлены в данном документе только для лучшего понимания настоящего изобретения. Эти примеры направлены только на иллюстративные цели и не ограничивают сферу настоящего изобретения. Примеры На стадиях, использующих коммерчески доступные наборы или реагенты, эксперименты выполняли в соответствии с прилагаемыми протоколами, если не обозначено иное. Пример 1. Иммунизация мышей VelocImmune. Антитело против NGF человека было получено иммунизацией мышей VelocImmune. Чтобы увеличить разнообразие получаемых антител, авторы настоящего изобретения проверили множество способов иммунизации, путей введения, адъювантов, периодов иммунизации и т.п. Используя NGF человека(RD Systems, Inc.) в качестве иммуногена, авторы настоящего изобретения проверили способ иммунизации, в котором NGF человека был использован для иммунизации путем смешивания с адъювантом после растворения, и способ иммунизации, в котором NGF человека использовали путем смешивания его с адъювантом после термической денатурации (обработка при 80C в течение 10 мин в 0,5% растворе лаурилсульфата натрия (SDS. В качестве пути введения проверяли введение в подушечку стопы и интраперитонеальное введение. В качестве адъюванта проверяли TiterMax Gold (CytRx Corporation), полный адъювант Фройнда (Sigma), неполный адъювант Фройнда (Sigma), и адъювант RIBI (Corixa Corporation). В качестве добавляемого иммуноактиватора проверяли олигонуклеотид CpG и гель фосфата алюминия (BRENNTAG). В качестве периода иммунизации проверяли 3-14 недель. После того, как животное было иммунизировано несколько раз, кровь собирали из хвостовой вены мыши, а титр контролировали. Таким образом, отбирали мышей VelocImmune, продуцирующих антитело, связывающее NGF человека. Титр измеряли с использованием стандартного способа ELISA. NGF человека добавляли в планшет Maxisorp 384 (Nunc) 10 нг/лунку и иммобилизовали путем инкубирования в течение ночи при 4C. На следующий день планшет отмывали один раз отмывочным раствором (TBST: трис-буфер (TBS), содержащий 0,05% Tween-20), затем туда добавляли блокирующее средство (TBST, содержащий 20%Blocking One (Nacalai Tesque, Inc., и планшет оставляли при комнатной температуре на 1 ч. После однократной отмывки планшета отмывочным раствором TBST собранную кровь серийно разбавляли и добавляли в планшет. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре планшет отмывали три раза отмывочным раствором TBST и туда добавляли HRP-козьи антитела против Ig мыши (Zymed), которые были разбавлены в 2000 раз отмывочным раствором TBST, содержащим 5% Blocking One. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре планшет отмывали три раза отмывочным раствором TBST. В планшет добавляли хромогенный реагент ТМВ (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD) и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 10 мин, затем туда добавляли стоп-раствор (2 моль/л серной кислоты), чтобы остановить реакцию, и измеряли поглощение при 450 нм. Пример 2. Получение гибридомы, продуцирующей антитело против NGF человека. Мыши, отобранные путем подтверждения повышения титра антител, были заключительно иммунизированы (внутривенное или интраперитонеальное введение антигена). Селезенку, лимфатический узел или т.п. иммунизированных мышей выделяли обычным способом, чтобы собрать лимфоциты, и лимфоциты сливали с клетками миеломы мыши SP2/0, получая, таким образом, гибридому. Гибридома подвергалась серийному разведению и моноклонированию, а антитело очищали из супернатанта с помощью колонок с белком А или белком G (GE Healthcare Japan). Пример 3. Оценка ингибирования связывания NGF-trkA.EZ-LINK 5-(биотинамидо)пентиламином (Pierce) при комнатной температуре в течение 30 мин в темном месте,чтобы провести мечение биотином, а избыток биотина удаляли с помощью обессоливающих колонок,получая, таким образом, NGF человека, меченный биотином. В примерах 6 и 7, подтверждено, что полученный NGF человека, меченный биотином, имеет такую же биологическую активность, как оригинальный NGF человека. Ингибиторную активность измеряли нижеследующим способом. trkA человека (RD Systems, Inc.) добавляли в белый планшет Maxisorp 384 (Nunc) no 60 нг/лунку и иммобилизовали путем инкубирования в течение ночи при 4C. На следующий день планшет отмывали один раз отмывочным раствором TBST,а затем добавляли в него блокирующее средство (TBST, содержащий 20% Blocking One (Nacalai Tesque,Inc., и планшет оставляли стоять при комнатной температуре в течение часа. Затем смесь, полученную смешиванием меченного биотином NGF человека (0,2 мкг/мл), полученного, как описано выше, с антителом, полученным в примере 2, добавляли в планшет с иммобилизованным trkA, прошедшим блокирование. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре планшет три раза отмывали отмывочным раствором TBST и туда добавляли стрептавидин, меченный щелочной фосфатазой (Pierce). Через 1 ч инкубации при комнатной температуре планшет отмывали три раза отмывочным раствором TBST, а затем добавляли APU4 (BioFx), который представляет собой реагент для детектирования хемилюминесценции,и измеряли количество хемилюминесценции счетчиком Envision (PerkinElmer Co., Ltd.). Пример 4. Оценка межвидовой перекрестной реактивности. Если антитело имеет перекрестную реактивность с NGF мыши, можно выполнить оценку эффективности лекарственного препарата на модели патологии мыши с использованием антитела. В результате, меченный биотином NGF мыши готовили способом по примеру 3 с использованием NGF мыши(RD Systems, Inc.), посредством которого оценивали перекрестную реактивность антитела противNGF мыши. Пример 5. Оценка специфичности связывания. Специфичность связывания антитела против NGF оценивали с помощью способа ELISA, описанного в примере 1. Конкретно, использовали NT-3 как семейство молекул, демонстрирующих наивысшую гомологию с NGF. NT-3 человека (PeproTech) добавляли в планшет способом по примеру 1 20 нг/лунку и иммобилизовали на планшете, таким образом позволяя выполнить оценку. Пример 6. Оценка ингибирования сигнализации NGF-trkA. Оценивали ингибиторную активность антитела против NGF-trkA сигнализации. NGF повышает внутриклеточную концентрацию кальция (Са 2+) через trkA как рецептор NGF. В целом, изменение концентрации Са 2+ может быть оценено в присутствии кальциевого индикатора с помощью системы измерения концентрации внутриклеточного кальция (Са 2+) (FLIPR; Molecular Devices, LLC). Ингибиторную активность измеряли нижеследующим способом. Клетки HEK293 (WO2009/054468),в которых вызвана стабильная экспрессия trkA человека, разносили в покрытые поли-D-лизином лунки 96-луночного планшета (Becton, Dickinson and Company, Japan) 2104 клеток/лунку за день до эксперимента и культивировали в течение ночи. На следующий день культуральную среду заменяли на культуральную среду DMEM (содержащую 3,6 мМ гидрата окиси натрия (NaOH) и 2,5 мМ пробенецида(Sigma, содержащую кальциевый индикатор (Fluo4-AM; Dojindo), и оставляли стоять при 37C в тече- 11024292 ние 30 мин. Затем клетки дважды отмывали отмывочным раствором (сбалансированным солевым раствором Хенкса) (HBSS) (20 мМ 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этан сульфоновая кислота(HEPES), 3,6 мМ гидрата окиси натрия, 2,5 мМ пробенецида (Sigma) и 0,1% бычьего сывороточного альбумина), и культуральную среду заменяли этим отмывочным раствором по 150 мкл/лунку. Планшет с клетками помещали в FLIPR. Управляя FLIPR, смешанный раствор антитела, полученный по примеру 2,и NGF добавляли в планшет по 50 мкл/лунку (конечная концентрация NGF - 100 нг/мл) и измеряли изменение внутриклеточной концентрации Са 2+. Разницу между максимальным и минимальным значениями изменения внутриклеточной концентрации Са 2+ рассчитывали и сохраняли в качестве данных измерения. Пример 7. Оценка ингибирования NGF-зависимой сигнализации выживания клеток. Когда клетки PC 12, естественно экспрессирующие trkA и р 75 рецепторы, культивируются в бессывороточных условиях, NGF дает возможность клеткам выживать в течение нескольких дней. Нижеследующим способом оценивали ингибиторную активность антитела против NGF-зависимой сигнализации выживания клеток. Клетки PC 12 высевали в 96-луночный покрытый коллагеном планшет (ASAHI TECHNO CO.,LTD.) по 1104 клеток/лунку и инкубировали в течение ночи в культуральной среде F12K (Invitrogen),содержащей 2,5% фетальной бычьей сыворотки и 15% инактивированной лошадиной сыворотки(Invitrogen) при 37C под 5% CO2. На следующий день культуральную среду заменяли на только F12K в бессывороточных условиях. Через 1 ч туда добавляли антитело и NGF человека (конечная концентрация 50 нг/мл), после чего культивировали в течение 72 ч. Затем культуральный раствор удаляли с помощью аспиратора и измеряли жизнеспособность клеток с помощью реагента (CellTiter Glo; aromegaCorporation), количественно определяющего эндогенную АТФ клеток. Пример 8. Получение фрагмента Fab. Гель, с которым связан переваривающий фермент папаин, добавляли к 1 мг/мл антитела с использованием набора препарата Fab (Pierce), после чего обрабатывался при 37C в течение 3 ч. Раствор, прошедший реакцию, наносили на колонку с белком G (GE Healthcare Japan), расщепленный Fc и непрореагировавший IgG удаляли абсорбцией на колонке, а элюированную фракцию собирали, получая, таким образом, фрагменты Fab. Полученные фрагменты Fab оценивали с помощью экспериментов, описанных в примерах 3, 6 и 7. В результате оценки примеров 3-8, было подтверждено, что антитело, именуемое 1-15 (химерное антитело) имеет высокую нейтрализующую активность, межвидовую перекрестную реактивность и специфичность связывания и сохраняет высокую нейтрализующую активность, даже когда это антитело присутствует в форме фрагмента моновалентного антитела. Пример 9. Определение последовательности гена антитела. Для идентифицированного антитела 1-15 авторы настоящего изобретения клонировали гены, кодирующие тяжелые цепи и легкие цепи антитела из гибридом. Конкретно, клон гибридомы получали в количестве 1105 или более и суспендировали в буфере RLT, который включен в набор RNeasy Mini Kit(QIAGEN), а затем клетки были дезинтегрированы с помощью QIAshredder (QIAGEN). Затем в соответствии с протоколом экстрагировали РНК и, используя экстрагированную РНК в качестве матрицы, синтезировали кДНК с помощью набора для амплификации ДНК (SMARTer RACE cDNA Amplification Kit;Clontech). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) выполняли с помощью полученной кДНК, удлиняя и амплифицируя таким образом вариабельный участок тяжелых цепей и легких цепей. Анализ последовательности выполняли непосредственно на продуктах ПЦР с помощью сиквенатора (ABI PRISM 3100;Applied Biosystems). В дополнение продукты ПЦР рекомбинировали с вектором субклонирования продукта ПЦР, таким как pCR3.1-ТОРО (Invitrogen), после чего анализировали последовательность гена, в результате определяя последовательность. Определенная последовательность оснований вариабельного участка тяжелой цепи антитела 1-15 показана в SEQ ID NO:1, а ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:2. Далее, последовательность оснований вариабельного участка легкой цепи антитела показана в SEQ ID NO:3, а ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:4. CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи антитела 1-15 представляют собой участки в положениях от 31 до 35, 50-65 и 95-102 вариабельного участка тяжелой цепи, основываясь на нумерации Кэбота соответственно, которые состоят из аминокислотных последовательностей в положении от 31 до 35, 50-65 и 98-110 вSEQ ID NO:2 соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного участка легкой цепи антитела 1-15 представляют собой участок в положении от 24 до 34, 50-56 и 89-97 вариабельного участка легкой цепи,основываясь на нумерации Кэбота соответственно, которые состоят их аминокислотных последовательностей в положении от 24 до 39, 55-61 и 94-102 в SEQ ID NO:4 соответственно. Пример 10. Получение мутанта сайта гликозилирования вариабельного участка. Аминокислоты (SEQ ID NO:2) вариабельного участка тяжелой цепи антитела 1-15, описанного выше, включают последовательность мотива гликозилирования N-типа, N-X-(T/S). Конкретно, в вариабельном участке тяжелой цепи, показанном в SEQ ID NO:2, Asn (N52) в положении 52, основываясь на нумерации Кэбота, соответствует сайту гликозилирования. Известно, что гликозилирование антитела происходит в ходе культивирования клетки, если антитело имеет сайт гликозилирования, в зависимости от условий культивирования или хозяина, экспрессирующего антитело. Другими словами, даже среди одинаково полученных клеток, продуцирующих антитело, степень гликозилирования, вероятно, варьирует в зависимости от условий культивирования (таких как культуральная среда и плотность клеток), что приводит к возможности того, что возможны трудности с получением из антитела лекарственного средства одинакового качества. Поэтому авторы настоящего изобретения получили 1-15 (N52D), который был получен путем введения мутации в N52 вариабельного участка тяжелой цепи антитела 1-15. Последовательность оснований вариабельного участка тяжелой цепи полученного 1-15 (N52D) показана в SEQ ID NO:5, а ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:6. CDR1, CDR2 иCDR3 вариабельного участка тяжелой цепи антитела 1-15 (N52D) представляет собой участки в положении от 31 до 35, 50-65 и 95-102 вариабельного участка тяжелой цепи, основываясь на нумерации Кэбота соответственно, который содержит аминокислотные последовательности в положении от 31 до 35, 50-65 и 98-110 в SEQ ID NO:6 соответственно. Пример 11. Получение полностью человеческого фрагмента Fab' антитела. Используя вариабельный участок тяжелой цепи 1-15 и 1-15 (N52D), описанные выше, и вариабельный участок легкой цепи 1-15, получали соответствующие полностью человеческие фрагменты Fab' антитела. Сигнальная последовательность была соединена с 5'-стороной соответствующего вариабельного участка тяжелой цепи генов 1-15 и 1-15 (N52D), а константный участок гена Ig1 человека (Man Sung Co.et al., (1992), J. Immunol. Vol. 148 (4): 1149-1154) был соединен с его 3'-стороной соответственно. Этот ген фрагмента тяжелой цепи был встроен в GS вектор PEEE6.4 (Lonza Biologics). В то же время, чтобы экспрессировать гены как фрагмент Fab', стоп-кодон был встроен после кодона Cys в положении 226 (соответствующем Cys в положении 230 аминокислотной последовательностей SEQ ID NO:8 иSEQ ID NO:10, описанных ниже), основываясь на индексе EU, в гене константного участка тяжелой цепи. В дополнение, сигнальная последовательность была соединена с 5'-стороной вариабельного участка легкой цепи гена 1-15, а константный участок гена -цепи человека (Man Sung Co. et al., описано выше) был соединен с его 3'-стороной соответственно. Этот ген легкой цепи был встроен в GS вектор рЕЕ 12.4(Lonza Biologics). Фрагмент Fab' экспрессировали двумя путями, включая кратковременную экспрессию и постоянную экспрессию. При кратковременной экспрессии, клетки Freestyle 293 (Invitrogen), культивировавшиеся в среде экспрессии Freestyle 293 (Invitrogen) при около 1000000 клеток/мл, были трансфицированы вышеописанными векторами GS фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи с помощью 293 fectin(Invitrogen), после чего культивировались в течение семи дней. При постоянной экспрессии оба вектораGS, описанные выше, расщеплялись ферментами рестрикции NotI и PvuI, после чего следовало лигирование с помощью набора для лигирования ДНК (TAKARA BIO INC), в результате чего конструировался вектор GS, в который встроены гены и фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи. Этот вектор экспрессии кодирует фрагмент тяжелой цепи, легкую цепь и глютамин синтетазу и экспрессируется после трансфекции в клетки CHO-K1-SV. После того как векторы экспрессировались соответствующими путями, супернатант культуры очищали с помощью KappaSelect (GE Healthcare Japan) с получением соответствующих фрагментов Fab'. Последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи полностью человеческого фрагмента Fab' антитела 1-15 (также обозначаемого как 1-15-Fab') показана в SEQ ID NO:7, а его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:8 соответственно. Последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи полученного полностью человеческого фрагмента Fab' антитела 1-15 (N52D) (также обозначаемого как 1-15 (N52D)-Fab'), показана вSEQ ID NO:9, а его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:10 соответственно. Легкая цепь соответствующих фрагментов Fab' одинакова, а их последовательность оснований показана в SEQ ID NO:11, а их аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:12 соответственно. Пример 12. Оценка нейтрализующей активности и уровня экспрессии полностью человеческого фрагмента Fab' антитела. 1-15-Fab' и 1-15 (N52D)-Fab', полученные в примере 11, были оценены с помощью экспериментов,описанных в примерах 3 и 6. В эксперименте по примеру 3 IC50 1-15-Fab' и 1-15 (N52D)-Fab' составила 0,17 и 0,18 мкг/мл соответственно. В эксперименте по примеру 6 IC50 1-15-Fab' и 1-15 (N52D)-Fab' составила 0,021 и 0,018 мкг/мл соответственно. На основании этих результатов было подтверждено, что нейтрализующая активность 1-15 (N52D)-Fab' поддерживалась на почти таком же уровне, что у немодифицированного 1-15-Fab' и что нейтрализующая активность не меняется, даже если введена мутация. В дополнение, соответствующие фрагменты Fab' экспрессировались путем постоянной экспрессии,и измеряли количество антитела, продуцированного в супернатанте культуры клеточного пула стабильной экспрессии. В результате, концентрации соответствующих супернатантов культуры 1-15-Fab' и 1-15 (N52D)-Fab' составили 86 и 106 мг/л соответственно, что показывает, что 1-15 (N52D)-Fab' является антителом, которое продуцируется в большем количестве, чем немодифицированный 1-15-Fab'. Пример 13. Получение пэгилированного фрагмента Fab' и оценка нейтрализующей активности. Далее, авторы настоящего изобретения ввели PEG в 1-15 (N52D)-Fab'. После очистки с помощьюKappaSelect фрагмент Fab' подвергался реакции восстановления с помощью гидрохлорида TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфин HCl), в результате чего фрагмент Fab' превращался в пэгилированную структуру. Конкретно, ТСЕР добавляли к раствору фрагмента Fab', чью концентрацию устанавливали на уровне 1,2 мг/мл с помощью 20 мМ натрий-фосфатного буфера (pH 6,8), так что ТСЕР составляла 1 мМ, после чего проходила реакция при 37C в течение 2 ч, а получившееся разбавляли 20 мМ натрийацетатным буфером (pH 5,0), чтобы установить pH. Этот раствор адсорбировался на катионообменной смоле (SP-5PW; TOSOH CORPORATION) и подвергался элюции в градиенте HCl, и основной пик собирали. Полученный фрагмент Fab' разбавляли 20 мМ натрий-фосфатного буфера (pH 6,8), так что выход составил 1 мг/мл, pH устанавливали на 6,8, а затем раствор оставляли стоять при 4C на ночь или более,так что он окислялся естественным образом. 40 кДа PEG (SUNBRIGHT GL2-400MA; NOFCORPORATION) добавляли к раствору, чтобы получить конечную концентрацию 0,1 мМ, и раствор оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем при 4C в течение ночи. Этот PEG,имеющий малеимидную группу на конце, быстро реагирует с Cys (C226, основываясь на индексе EU;Cys в положении 230 в SEQ ID NO:10) карбоксильного конца фрагмента тяжелой цепи. Раствор разбавляли 20 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,5), чтобы установить pH, а затем адсорбировали снова на катионообменной смоле (SP-5PW; TOSOH CORPORATION), полученное подвергали элюции градиентомHCl, и главный пик собирали. Полученный пэгилированный фрагмент Fab' очищали. Этот пэгилированный 1-15 (N52D)-Fab' также называется 1-15 (N52D)-Fab'-PEG. Нейтрализующая активность не-пэгилированного и пэгилированного 1-15 (N52D)-Fab' оценивали способом, показанным в примере 3. В результате, тогда как IC50 1-15 (N52D)-Fab' составляет 0,15 мкг/мл,IC50 1-15 (N52D)-Fab'-PEG составляет 0,12 мкг/мл (по концентрации фрагмента Fab'), в результате подтвердилось, что нейтрализующая активность 1-15 (N52D)-Fab' не меняется, даже если добавлен PEG. В дополнение, с помощью способа по примеру 6 1-15 (N52D)-Fab'-PEG сравнили с антителом против NGF человека предшествующего уровня техники - танезумабом, по нейтрализующей активности по отношению к NGF человека и мыши. В результате, тогда как IC50 1-15 (N52D)-Fab'-PEG составила 0,051 мкг/мл для NGF человека и 0,069 мкг/мл для NGF мыши, IC50 танезумаба составила 0,17 мкг/мл дляNGF человека и 0,23 мкг/мл для NGF мыши. Следовательно, подтверждено, что нейтрализующая активность 1-15 (N52D)-Fab'-PEG в около 3,3 раза выше, чем танезумаба, по отношению к NGF человека и мыши. Пример 14. Анализ на обезболивающий эффект на модели артрита, вызванного адъювантом, у мыши. Авторы настоящего изобретения оценивали обезболивающий эффект вышеупомянутого 1-15 (N52D)-Fab'-PEG на модели артрита, вызванного адъювантом, у мыши. 1-15 (N52D)-Fab'-PEG вводили мышам внутривенно (0,03, 0,1 и 0,3 мг/кг; доза составила 10 мл/кг),и 1 мг/мл полного адъюванта Фройнда (Sigma) вводили в количестве 25 мкл в подушечку передней лапы,чтобы вызвать боль. Через 24 ч после того, как была индуцирована боль, в течение 20 мин измеряли поведенческую реакцию в виде вертикальной стойки (на задних лапах). Конкретно, с помощью системы мониторинга спонтанной активности SUPERMEX (Muromachi Kikai Co., Ltd.) количество времени спонтанного положения мыши в вертикальной стойке в течение 20 мин измеряли с помощью сенсора инфракрасного излучения (Matson et al., JPET 320:194-201, 2007). В качестве сравнительного контроля использовали антитело танезумаб, относящееся к предшествующему уровню техники. В результате, тогда как внутривенное введение танезумаба вызывало обезболивающий эффект с ED50=0,27 мг/кг, 1-15 (N52D)Fab'-PEG вызывал обезболивающий эффект с ED50 = 0,11 мг/кг, что показывает эффективность, большую в около 3 раз. Пример 15.: Анализ на перенос через плаценту крысы. 1-15 (N52D)-Fab'-PEG или танезумаб вводили внутривенно (100 мг/кг, доза составляла 10 мл/кг) самкам крыс на 17-й день беременности. Через три дня измеряли концентрацию антитела в крови матери и плода. Концентрацию антитела измеряли нижеследующим образом. NGF человека (RD Systems, Inc.) добавляли в 96-луночный планшет MULTI-ARRAY plate (Standard) (Meso Scale Discovery) по 25 нг/лунку и иммобилизовали, оставляя стоять при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшет отмывали три раза отмывочным раствором TBST и туда добавляли блокирующее средство (1% казеин TBS; ThermoFisher) и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем образец крови, полученный путем разбавления собранной тем временем крови, добавляли в планшет с иммобилизованным NGF человека, подвергшимся блокированию. После того как смесь реагировала при комнатной температуре в течение 60 мин при встряхивании, планшет отмывали три раза отмывочным раствором TBST, а затем туда добавляли меченное биотином к антитело человека (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.). После того, как смесь прореагировала в течение 60 мин при комнатной температуре при встряхивании, планшет три раза отмывали отмывочным раствором TBST и туда добавляли SULFO-TAG-меченный стрептавидин(Meso Scale Discovery). После того как смесь прореагировала в течение 60 мин при комнатной температуре при встряхивании, планшет три раза отмывали отмывочным раствором TBST, туда добавляли ReadBuffer T (Meso Scale Discovery) и измеряли величину электрохимической люминесценции с помощьюSECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Этот эксперимент выполняли на трех крысах-матерях. Через три дня концентрация антител 1-15(N52D)-Fab'-PEG и танезумаба в крови крыс-матерей составила в среднем 12,1 и 7,1 мкг/мл соответственно. Между тем, что касается концентрации антител в крови 3 плодов, полученных от каждой из крысматерей (всего 9 плодов), тогда как концентрация 1-15 (N52D)-Fab'-PEG в крови составила 0,01 мкг/мл (предел количественного определения) или менее во всех плодах, концентрация танезумаба в крови составила в среднем 5,39 мкг/мл. То есть, тогда как танезумаб переносился в плод на уровне 75,9%, 1-15 (N52D)-Fab'-PEG переносился в плод на уровне 0,08% (предел определения) или менее. Эти результаты предполагают, что 1-15 (N52D)-Fab'-PEG представляет собой медицинское средство, обладающее превосходным качеством по безопасности за счет устранения риска побочных действий, вызванных в плоде вследствие ингибирования NGF. Пример 16. Формирование иммунного комплекса (IC). Оценивали, образует ли IC 1-15 (N52D)-Fab'-PEG или насколько велик размер сформированного IC. Конкретно, 1 мг/мл 1-15 (N52D)-Fab'-PEG смешивали с NGF человека (RD Systems, Inc.) в молярном соотношении 1:1, после чего следовала инкубация при комнатной температуре в течение 3 ч, с образованием в результате IC. Размер частиц и распределение IC в этом реакционном растворе измеряли с помощью Zetasizer Nano (Malvern) в качестве инструмента, измеряющего динамическое рассеяние света. Для анализа использовали Zetasizer v6.01 (Malvern), а размер частиц индицировался по значению (d. нм), анализировавшихся в значениях интенсивности (%). Измеренные размеры частиц показаны в табл. 1. В этом эксперименте размер частиц только NGF составил в среднем 6,2 нм. В случае только танезумаба пиковый размер наблюдался на 11,7 нм. Когда измеряли IC, образовавшийся при инкубации танезумаба и NGF, пиковый размер смещался к 91,3 нм. С другой стороны, когда антитело, не связанное с NGF, использовалось как контрольное антитело, пиковый размер составлял те же 11,7 нм. Рассматривая изменения величины, предполагалось, что каждый танезумаб и NGF превращается в макромолекулу в результате комбинирования множества молекул, в результате чего образуется IC крупного размера. По контрасту с этим, когда измеряли формирование IC 1-15 (N52D)-Fab'-PEG и NGF, пиковый размер смещался с 18,1 к 24,4 нм. При рассмотрении изменения величины этот результат отражает только связывание одна к одной и предполагает, что формирования пространственной структуры с 1-15 (N52D)-Fab'-PEG не происходит. Таблица 1 Пример 17. Распределение свойств в поврежденной ткани. Эмульсию, включающую коллаген (бычий коллаген из сустава тип 2, 10 мг/мл; Collagen techniqueworkshop) и полный адъювант Фройнда (0,5 мг/мл; DIFCO) в соотношении 1:1 вводили подкожно в голеностопный сустав мыши DBA/1, в результате получая модель артрита, индуцированного коллагеном. Через четыре недели после индукции артрита эмульсию вводили снова, чтобы вызвать артрит. Степень развития артрита (оценка и величина опухоли) в передних конечностях наблюдали в группе мышей. Флуоресцентное мечение выполняли на 1 мг/мл PBS растворах 1-15 (N52D)-Fab'-PEG и танезумаба с использованием набора SAIVI Rapid Antibody Labeling Kit, Alexa Fluor (зарегистрированная торговая марка) 680 (Life Technologies Corporation). 2 мг/кг (N=4) каждого раствора вводили хвостовую вену. Накопление флуоресценции, накапливающейся в опухшей подушечке стопы, анализировали с помощьюIVIS Spectrum (Caliper/Xenogen), и интенсивность флуоресценции указывалась как численные значения. Фигура показывает изменение во времени количества антитела, удерживающегося в подошве. 1-15 (N52D)-Fab'-PEG демонстрировало эффект удерживания в поврежденной ткани более ясно по сравнению с танезумабом, и этот эффект сохранялся в течение 48 ч. Исходя из этого результата, 1-15 (N52D)Fab'-PEG расценивается как эффективно вызывающее обезболивающий эффект, и ожидается, что это антитело в малой дозе способно вызывать обезболивающий эффект, равный или больший, чем эффект лекарственного средства. Также ожидается, что 1-15 (N52D)-Fab'-PEG может быть превосходным в отношении безопасности медицинского средства, поскольку это антитело селективно накапливается в месте повреждения. Пример 18. Получение аминокислотного аддукта фрагмента Fab'. Чтобы улучшить эффективность введения PEG в 1-15 (N52D)-Fab', авторы настоящего изобретения получили фрагменты Fab', которые были получены путем добавления двух аланинов (A) или пролинов(P) после остатка Cys в карбоксильном конце фрагмента тяжелой цепи и выполнили экспрессию и очистку. Такой же способ, как в примере 11, был использован для получения этих фрагментов Fab'. По этому способу кодон двух аланина или пролина встраивается после кодона остатка Cys на карбоксильном конце фрагмента тяжелой цепи 1-15 (N52D)-Fab', а стоп-кодон встраивается после этого кодона. Последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи 1-15 (N52D)-Fab' с добавленным аланином(полностью человеческий 1-15 (N52D-A) фрагмент Fab'антитела; также обозначаемый как 1-15 (N52DA)-Fab'), показана в SEQ ID NO:13, а ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:14 соответственно. Последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи с добавлением пролина 1-15 (N52D)-Fab' (полностью человеческий 1-15 (N52D-P) фрагмента Fab'антитела; также обозначаемая как 1-15 (N52D-P)-Fab'), показана в SEQ ID NO:15, а ее аминокислотная последовательность показана вSEQ ID NO:16 соответственно. Легкая цепь соответствующих фрагментов Fab' такова же, как легкая цепь 1-15 (N52D)-Fab', а последовательность оснований и ее аминокислотная последовательность показаны вSEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 соответственно. Пример 19. Получение пэгилированного 1-15 (N52D-A)-Fab' и оценка нейтрализующей активности и фармакологическая оценка) 40 кДа PEG конъюгировали с 1-15 (N52D-A)-Fab' таким же образом, как в примере 13, в результате получая пэгилированный 1-15 (N52D-A)-Fab' (здесь и далее также обозначаемый как 1-15 (N52D-A)-Fab'-PEG). Нейтрализующую активность 1-15 (N52D-A)-Fab'-PEG оценивали по способу, описанному в примере 3. В результате, тогда как IC50 1-15 (N52D)-Fab'-PEG составила 0,0810,034 мкг/мл, IC50 1-15 (N52DA)-Fab'-PEG составила 0,0740,021 мкг/мл. В дополнение, IC50 танезумаба в то же время составила 0,4100,099 мкг/мл. Далее, нейтрализующую активность сравнивали с помощью способа, описанного в примере 6. В результате, тогда как IC50 1-15 (N52D)-Fab'-PEG составила 0,0610,011 мкг/мл для NGF человека, IC50 1-15 (N52D-A)-Fab'-PEG составила 0,0640,028 мкг/мл. Далее, обезболивающий эффект на модели артрита, вызванного адъювантом, оценивали с помощью способа, описанного в примере 14. В результате, 1-15 (N52D-A)-Fab'-PEG продемонстрировал обезболивающий эффект на модели артрита. Приведенные выше результаты подтверждают, что даже при добавлении двух аланинов после остатка Cys на карбоксильном конце, нейтрализующая активность и фармакологическая активность не изменены. Пример 20. Оценка аффинности связывания 1-15 (N52D-A)-Fab'-PEG. Термодинамику связывания 1-15 (N52D-A)-Fab'-PEG и танезумаба с антигеном NGF исследовали с помощью изотермической титрационной калориметрии (ITC) (Scappaticci FA, J. Natl Cancer Inst. 2007,99:1232-9. Velazquez-Compoy, A., et al., Curr Protoc Cell Biol. 2004, Chapter 17, Unit 17-18). Все измерение целиком выполняли с помощью Auto-iTC 200, произведенного GE healthcare. В ходе эксперимента выполняли анализ при нижеследующих концентрациях, так чтобы оценить связывание моновалентного фрагмента Fab' с одной молекулой антигена, а весь анализ проводили в растворе PBS. Конкретно,44 мкМ NGF человека (RD Systems, Inc.), содержащиеся в титровальном шприце, титровали в калориметрическую ячейку, заполненную образцом антитела (3 мкМ 1-15 (N52D-A) -Fab'-PEG или 1,5 мкМ танезумаба) по 1,4 мкл 30 раз, и детектировалось количество тепла, продуцированное в результате. Полученные данные анализировали с помощью модели моносайтового связывания с помощью программного обеспечения, прилагающегося к прибору, таким образом рассчитывая аффинность связывания (Kd),соотношение связывания (n), свободную энергию связывания (G), энтальпию связыванияи энтропию связывания (-TS), связанные со связыванием антиген-антитело. Эти результаты показаны в табл. 2. В результате, значение Kd танезумаба составило 20,41 нМ, значение Kd 1-15 (N52D-A)-Fab'-PEG составило 1,49 нМ, что показывает, что аффинность связывания 1-15 (N52D-A)-Fab'-PEG было более сильным в 10 раз или более, чем таковое танезумаба (табл. 2). Пример 21. Получение пэгилированного 1-15 (N52D-A)-Fab', имеющего PEG различного размера, и оценка нейтрализующей активности. 1-15 (N52D-A)-Fab', полученный по примеру 18, конъюгировали с 5 кДа PEG или 10 кДа PEG с помощью процедуры, сходной с таковой по примеру 13. Конкретно, раствор фрагмента Fab', полученный с помощью 20 мМ Tris-HCl буфера (pH 7,4), подвергали восстанавливающей обработке с помощью ТСЕР. Затем фрагмент Fab' собирали с помощью высаливающей колонки. PEG (SUNBRIGHT GL2-50MA илиSUNBRIGHT GL2-100MA; NOF CORPORATION) добавляли к полученному фрагменту Fab' и раствор оставляли стоять при 4C в течение ночи. 1-15 (N52D-A)-фрагменты Fab', конъюгированные с 5 кДа PEG или с 10 кДа PEG, которые были получены таким образом, именовались 1-15 (N52D-A)-Fab'-5kPEG и 1-15 (N52D-A)-Fab'-10kPEG соответственно. Затем с помощью способа, показанного в примере 6, соответствующие пэгилированные фрагментыFab' сравнивали между собой по нейтрализующей активности. В качестве сравнительного контроля использовали 1-15 (N52D-A)-Fab'-PEG (конъюгированный с 40 кДа PEG; здесь и далее также обозначаемый как 1-15 (N52D-A)-Fab'-40kPEG), полученный по примеру 19. В то же время выполняли анализ при конечной концентрации NGF 50 нг/мл. В результате, IC50 1-15 (N52D-A)-Fab'-5kPEG, 1-15 (N52D-A)-Fab'10kPEG и 1-15 (N52D-A)-Fab'-40kPEG составили 0,030, 0,028 и 0,023 мкг/мл соответственно. Исходя из этих результатов, понятно, что PEG, размеры которого находятся в диапазоне от 5 до 40 кДа, не влияет на нейтрализующую активность фрагментов Fab'. Пример 22. Оценка РК мыши для пэгилированного 1-15 (N52D-A)-Fab', имеющего PEG различных размеров. Оценка РК мыши была выполнена для различных типов пэгилированных 1-15 (N52D-A)-Fab'. Конкретно, 0,3 мг/кг различных типов пэгилированных 1-15 (N52D-A)-Fab' вводили внутривенно, кровь собирали на 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 и 168 ч после введения. Количество тестируемого антитела в полученной крови измеряли с помощью сэндвич-ELISA. Конкретно, тестируемое антитело добавляли в планшетMSD (Meso Scale Discovery), в котором иммобилизован NGF. Антитело, связанное с планшетом, распознавали с помощью к-антитела человека, меченного биотином, которое затем детектировалось с помощью стрептавидина, меченного SULFO-TAG. Концентрацию антитела в крови рассчитывали с помощью создания калибровочной кривой с использованием соответствующих стандартов. Из рассчитанной концентрации антитела в крови, рассчитывали время полужизни антитела в крови (Т 1/2: час). В результате,Т 1/2 1-15 (N52D-A)-Fab'-5kPEG, 1-15 (N52D-A)-Fab'-10kPEG и 1-15 (N52D-A)-Fab'-40kPEG составили 13,82,2 ч, 17,70,4 ч и 39,23,7 ч соответственно. Пример 23. Анализ на обезболивающий эффект с использованием модели надреза подошвы крысы. Используя модель боли после надреза подошвы крысы (Brennan et al., Current Protocols in Pharmacology 2004; 5.34.1-5.34.8), которая рассматривается как отражающая послеоперационную боль в клинической практике, оценивали обезболивающий эффект 1-15 (N52D-A)-Fab'-5kPEG и 1-15 (N52D-A)-Fab'10kPEG на послеоперационную боль. Конкретно, в каждой группе было по 8 крыс, и 1-15 (N52D-A)-Fab'-5kPEG или -10kPEG вводили крысам внутривенно (0,1, 0,3 и 1 мг/кг, доза составила 1 мл/кг). Затем в подошве правой передней лапы делался прямой надрез, который имел величину 10 мм в направлении пальцев в положении, удаленном на 5 мм от конца пятки, а затем немедленно накладывался матрасный шов нейлоновой нитью в двух местах, вызывая таким образом боль. Болевые пороги в области операции измеряли через 5 ч и на первый,второй, третий, четвертый и пятый дни после индукции боли. Для измерения был использован динамический подошвенный анестезиометр производства фирмы Ugo Basile, чтобы измерить давление, при котором крысы демонстрируют реакцию избегания, когда давление прикладывается к подошве. В качестве сравнительного контроля использовали антитело танезумаб из предшествующего уровня техники. В результате внутривенное введение танезумаба приводило к обезболивающему эффектуED50=0,26 мг/кг в 1-й послеоперационный день, и 1-15 (N52D-A)-Fab'-5kPEG, и -10kPEG вызывали обезболивающий эффект ED50=0,15 мг/кг, что примерно около в два раза более эффективно. В дополнение,существенный обезболивающий эффект 1-15 (N52D-A)-Fab'-5kPEG и -10kPEG продолжал наблюдаться и в 3- и 4-й послеоперационные дни соответственно. Пример 24. Оценка стабильности агрегации. 1-15 (N52D-A)-Fab'-40kPEG растворяли до 1 и 10 мг/мл в условиях pH 5, 6, 7,4 и 9. Каждый из этих растворов содержали при 50C, чтобы оценить стабильность агрегации через 2 недели. Чтобы оценить свойства агрегации, выполняли эксклюзионную хроматографию с помощью Agilent 1100 производства фирмы Agilent. В качестве условий измерения использовали 0,1 М фосфат натрия, содержащий 0,2 М аргинина (pH 6,8) в качестве буфера подвижной фазы, a TSK gel Super Sw3000 (TOSOH, 2,0 мм ID 300 мм) использовали в качестве колонки. Длина волны детектирования составила 280 нм. В анализе при 1 мг/мл, танезумаб использовали как антитело сравнения, а результаты показаны в табл. 3. В анализе при 10 мг/мл, танезумаб и REGN 475 использовали как антитела сравнения, а результаты показаны в табл. 4. В результате для танезумаба и REGN 475 заметное увеличение количества образовавшихся агрегатов наблюдалось через две недели. По контрасту с этим для 1-15 (N52D-A)-Fab'-40kPEG агрегаты почти не детектируются. Этот результат предполагает, что пэгилированный 1-15 (N52D-A)-Fab' с высокой вероятностью может быть лекарством, имеющим превосходную стабильность при хранении. Таблица 3 Промышленная применимость Антитело против NGF человека, более конкретно - фрагмент Fab' антитела против NGF человека по настоящему изобретению подходит для профилактики или лечения различных заболеваний, формирование патологических состояний которых связано с NGF человека.