Гуманизированное антитело против рецептора лимфотоксина -β (варианты), композиция, способ лечения или снижения риска развития, тяжести или последствий неоплазии у человека, выделенная нуклеиноваякислота (варианты), клетка клеточной линии (варианты)

006945 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение в основном касается гуманизированных антител, специфических в отношении рецептора лимфотоксина- (LTR). Уровень техники Рецептор лимфотоксина- (в данном контексте обозначаемый LTR) является представителем семейства фактора некроза опухолей, которое играет хорошо охарактеризованную роль как в развитии иммунной системы, так и в функциональной поддержке ряда клеток иммунной системы, включая фолликулярные дендритные клетки и некоторые типы стромальных клеток (см. статью Matsumoto и соавт., Immunol. Rev., 156:137, (1997. Известные лиганды LTR включают в себя LТ 1/2 и второй лиганд, называемый LIGHT (см. статью Mauri и соавт., Immunity, 8:21, (1998. Было показано, что активация LTR индуцирует апоптотическую гибель некоторых линий раковых клеток in vivo (PCT/US96/01386). Воздействие агентов, активирующих агонист LTR, таких как специфические гуманизированные антитела против LTR, было бы, таким образом, эффективным для лечения или уменьшения риска развития,тяжести или последствий новообразования у субъектов (например, человека). Сущность изобретения В данном изобретении представлены гуманизированные антитела против рецептора лимфотоксина(LTR) и способы применения данных антител для лечения или уменьшения риска развития, тяжести или последствий неоплазии у субъектов (например, человека). В частности, изобретение охватывает гуманизированное антитело, которое специфически связываетLTR (например, человеческий LTR). Данное антитело содержит гипервариабельные участки (т.е. участки, определяющие комплементарность) легкой цепи, определенные остатками аминокислот 24-34,50-56 и 89-97 последовательности SEQ ID NO:1 и/или гипервариабельные участки тяжелой цепи, определенные остатками аминокислот 31-35, 50-66 и 99-109 последовательности SEQ ID NO:2 и, кроме того,в своей легкой цепи содержит по меньшей мере один (например, 1, 2, 3, 4 или 5) из следующих остатков: К 3, W41, I46, Q69 и Y71, или в своей тяжелой цепи содержит по меньшей мере один (например, 1, 2, 3, 4 или 5) из следующих остатков: F37, Т 40, А 49, М 89 и V93 (соглашение о нумерации Kabat). Гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, может содержать последовательность вариабельного домена легкой цепи, определенного остатками аминокислот 1-107 последовательности SEQ ID NO:8 и/или последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, определенного остатками аминокислот 1-120 последовательности SEQ ID NO:16. Гуманизированное антитело может также содержать такие же полипептидные последовательности тяжелой и/или легкой цепей, как у антитела, продуцируемого клеточной линией Е 46.4 (наименование патентного депозита ATCC РТА-3357) или клеточной линией Е 77.4 (наименование патентного депозита ATCC РТА-3765). В другом варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, практически сохраняет связывающие свойства исходного антитела. В одном из вариантов осуществления гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, связываетLTR с функциональной аффинностью, например от приблизительно 1 до приблизительно 10 пМ, альтернативно, от приблизительно 10 до приблизительно 20 пМ, альтернативно, от приблизительно 20 до приблизительно 30 пМ, альтернативно, от приблизительно 30 до приблизительно 40 пМ, альтернативно,от приблизительно 40 до приблизительно 50 пМ, альтернативно, от приблизительно 50 до приблизительно 60 пМ, альтернативно, от приблизительно 60 до приблизительно 70 пМ, альтернативно, от приблизительно 70 до приблизительно 80 пМ и, альтернативно, от приблизительно 80 до приблизительно 90 пМ,где функциональную аффинность измеряют с помощью FACS (флуоресцентный способ разделения клеток лимфоцитов) в соответствии с примером 8. В другом варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, связывают с иммунотоксином (например, цепью рицина А и токсином Pseudomonas). Гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, может быть также связано с химиотерапевтическим лекарственным веществом (например, адриамицином, 5FU (5-фторурацилом), винбластином, актиномицином D, этопозидом, цисплатином, метотрексатом и доксорубицином) или с радиоактивным изотопом. Данное изобретение охватываеттакже комбинированную терапию, например терапию, при которой гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, связанное с иммунотоксином, используют в комбинации с гуманизированным антителом, соответствующим данному изобретению, которое связано с химиотерапевтическим агентом. Кроме того, данное изобретение охватывает композицию, пригодную для введения млекопитающему (т.е. человеку), имеющему опухоль, которая характеризуется сверхэкспрессией LTR. Композиция содержит а) гуманизированное антитело против LTR либо в виде монокомпонента, либо связанное с иммунотоксином или химиотерапевтическим лекарством, и б) цитотоксический фактор, при этом каждый из компонентов присутствует в количествах, эффективных для уменьшения объема опухоли при введении млекопитающему. Цитотоксический фактор может включать в себя, например, TNF-, TNF-, ИЛ-1, INF-, ИЛ-2. Альтернативно цитотоксический фактор может быть представлен химиотерапевтическим лекарственным веществом. Химиотерапевтическое лекарственное вещество может включать в себя, например, адриамицин, 5FU, винбла-1 006945 стин, актиномицин D, этопозид, цисплатин, метотрексат и доксорубицин. Антитело, соответствующее данному изобретению, может быть представлено, например, целым антителом (т.е. имеющим две легкие цепи полной длины и две тяжелые цепи полной длины) любого изотипа и подтипов (например, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA1 и IgA2); альтернативно оно может являться антиген-связывающим фрагментом (например, Fab, (F(ab')2 и Fv) целого антитела. Данным изобретением охвачена также композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель; выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую SEQ ID NO:8, выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую SEQ ID NO:16, выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, продуцируемого клеточной линией Е 46.4 (наименование патентного депозита ATCC РТА-3357), или клеточной линией Е 77.4(наименование патентного депозита ATCC РТА-3765); выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, продуцируемого клеточной линией Е 46.4(наименование патентного депозита ATCC РТА-3357), или клеточной линией Е 77.4 (наименование патентного депозита ATCC РТА-3765); выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность,кодирующую остатки 1-107 последовательности SEQ ID NO:8 и выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую остатки 1-120 последовательности SEQ ID NO:16. Данное изобретение охватывает также клетки из клеточных линий, которые продуцируют гуманизированное антитело против LTR, включая, например, клеточную линию Е 46.4 (наименование патентного депозита ATCC РТА-3357) и клеточную линию Е 77.4 (наименование патентного депозита ATCC РТА-3765). В одном варианте осуществления изобретения клеточная линия продуцирует от приблизительно 250 до приблизительно 300 мг/л данного антитела, альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 300 до приблизительно 350 мг/л данного антитела, альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 350 до приблизительно 400 мг/л данного антитела, альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 400 до приблизительно 450 мг/л данного антитела, альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 450 до приблизительно 500 мг/л данного антитела, альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 500 до приблизительно 550 мг/л данного антитела и альтернативно клеточная линия продуцирует от приблизительно 550 до приблизительно 600 мг/л данного антитела. Концентрацию антитела, продуцируемого клеточными линиями, измеряют как титр при сборе из 10-суточной культуры с подпиткой. В данном изобретении представляют также способ лечения или уменьшения риска развития, тяжести или последствий неоплазии у субъекта (например, человека), предусматривающий введение субъекту эффективного количества антитела, соответствующего изобретению. Эффективное количество композиции может быть введено в одной или более дозах. В другом варианте осуществления данное изобретение представляет способ лечения или уменьшения риска развития, тяжести или последствий неоплазии у субъекта (например, человека), предусматривающий введение субъекту эффективного количества антитела, соответствующего изобретению, и цитотоксического фактора. Цитотоксический фактор может включать в себя, например, TNF-, TNF-, ИЛ-1, INF-, ИЛ-2. Альтернативно цитотоксический фактор может быть представлен химиотерапевтическим лекарственным веществом. Химиотерапевтическое лекарственное вещество может включать в себя, например, адриамицин, 5FU, винбластин, актиномицин D,этопозид, цисплатин, метотрексат и доксорубицин. Перечень фигур чертежей и иных материалов На фиг. 1 (связанные антитела) и 2 (растворимые антитела) представлены графики цитотоксичности в отношении клеток WiDr. На графиках показаны mСВЕ 11 (мышиное антитело) (ромбы), huCBE112(гуманизированное антитело против LTR, содержащее вариант 2 легкой цепи (VL2) и вариант 2 тяжелой цепи (VH2 (кружки), huCBE114 (гуманизированное антитело против LTR, содержащее вариант 3 легкой цепи (VL3) и вариант 4 тяжелой цепи (VH4 (звездочки). На фиг. 3 (связанные антитела) и 4 (растворимые антитела) представлены графики, показывающие агонистический эффект ИЛ-8 в отношении клеток А 375. На графиках показаны антитела mСВЕ 11 (ромбы), huCBE11 2 (гуманизированное антитело против LTR, содержащее вариант 2 легкой цепи (VL2) и вариант 2 тяжелой цепи (VH2 (кружки), huCBE114 (гуманизированное антитело против LTR,содержащее вариант 3 легкой цепи (VL3) и вариант 4 тяжелой цепи (VH4 (звездочки). На фиг. 5 представлен график зависимости объема опухоли от дней введения. На графике показаны(квадраты). На фиг. 6 представлен график зависимости выживаемости животных (в процентах) от дней после прививания опухоли. На графике показаны mСВЕ 11 (треугольники), huCBE114 (гуманизированное антитело против LTR, содержащее вариант 3 легкой цепи и вариант 4 тяжелой цепи) (кружки), а также группа, не получающая лечение (квадраты). На фиг. 7 представлен график зависимости объема опухоли от дней после прививания опухоли. На графике показаны huCBE114 (гуманизированное антитело против LTR, содержащее вариант 3 легкой(квадраты). На фиг. 8 представлен график зависимости объема ранее выросшей опухоли от дней, прошедших после лечения. На графике показаны контрольная группа (квадраты), введение huCBE11 4 (гуманизированное антитело против LTR, содержащее вариант 3 легкой цепи (VL3) и вариант 4 тяжелой цепи(VH4 в различных дозах: 500 мкг (кружки), 100 мкг (треугольники) и 20 мкг (ромбы) и mСВЕ 11 (крестики). На фиг. 9 представлен график зависимости выживаемости животных с ранее выросшими опухолями(в процентах) от дней, прошедших после лечения. На графике показаны контрольная группа (квадраты),введение huCBE11 4 (гуманизированное антитело против LTR, содержащее вариант 3 легкой цепи(VL3) и вариант 4 тяжелой цепи (VH4 в различных дозах: 500 мкг (кружки), 100 мкг (треугольники) и 20 мкг (ромбы) и mСВЕ 11 (крестики). На фиг. 10 представлен график зависимости средней интенсивности флуоресценции от концентрации huCBE11 4 в логарифмическом масштабе. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Идентификационные номера последовательностей. Последовательности нуклеотидов и аминокислот, упоминаемые в описании, получили следующие идентификационные номера последовательностей:SEQ ID NO:1 - последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи mСВЕ 11.SEQ ID NO:2 - последовательность аминокислот вариабельного домена легкой цепи mСВЕ 11.SEQ ID NO:3 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела СВЕ 11 (вариант 1-VL1).SEQ ID NO:4 - последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 1-VL1).SEQ ID NO:5 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 2-VL2).SEQ ID NO:6 - последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 2-VL2).SEQ ID NO:7 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 3-VL3).SEQ ID NO:8 - последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 3-VL3).SEQ ID NO:9 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 1-VH1).SEQ ID NO:10 - последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 1-VH1).SEQ ID NO:11 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 2-VH2).SEQ ID NO:12 - последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 2-VH2).SEQ ID NO:13 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 3-VH3).SEQ ID NO:14 - последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 3-VH3).SEQ ID NO:15 - последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 4-VH4).SEQ ID NO:16 - последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного СВЕ 11 (вариант 4-VH4).SEQ ID NO:17 - праймер FR1 для интродукции сайта Bsu36l.SEQ ID NO:18 - праймер FR2 для интродукции сайтов Ncil и Hpall.SEQ ID NO:19 - праймер FR3 для интродукции сайтов Bsu36l и Pstl.SEQ ID NO:20 - праймер FR2 для интродукции сайта Smal.SEQ ID NO:21 - праймер FR3 для интродукции сайта Pvul.SEQ ID NO:22 - праймер FR2 для интродукции сайтов Smal и Hhal.SEQ ID NO:23 - праймер FR3 для интродукции сайтов Pvull и Fspl.SEQ ID NO:24 - праймер FR1 для интродукции сайтов Hinfl и Nsil.SEQ ID NO:25 - праймер FR2 для интродукции сайтов Haell и Hhal.SEQ ID NO:26 - праймер FR3 для интродукции сайтов Bsu36l, Ddel и Pstl.SEQ ID NO:27 - праймер FR1 для интродукции сайта EcoRV.SEQ ID NO:28 - праймер FR3 для интродукции сайта Rsal.SEQ ID NO:29 - праймер FR1 для интродукции сайта EcoRV.SEQ ID NO:30 - праймер FR2 для интродукции сайта Hindlll.SEQ ID NO:31 - праймер FR3 для интродукции сайта Rsal.SEQ ID NO:32 - полная легкая цепь huCBE11 (вариант 3), включающая константный домен.SEQ ID NO:33 - полная тяжелая цепь huCBE11 (вариант 4), включающая константный домен. Определения. Термин "гуманизированное антитело", как используют в данном контексте, относится в данном случае к антителу, полученному из нечеловеческого, как правило, мышиного антитела, которое сохраняет или практически сохраняет антиген-связывающие свойства исходного антитела, но которое менее иммуногенно для человека. Термин "гипервариабельный участок" ("участок, определяющий комплементарность") (CDR), как используют в данном контексте, относится к последовательностям аминокислот, которые, взятые вместе,определяют аффинность и специфичность связывания природного Fv-фрагмента связывающего центра нативного иммуноглобулина, как это описано в работе Kabat и соавт., (1991). Термин "каркасная (скелетная) область", как используют в данном контексте, относится к последовательностям аминокислот, расположенным между участками CDR. Данные фрагменты антитела служат для поддержания CDR в соответствующей ориентации (дают возможность CDR связывать антиген). Термин "константная область", как используют в данном контексте, относится к части молекулы антитела, которая определяет эффекторные функции. В данном изобретении мышиные константные области замещены человеческими константными областями. Константные области данных химерных или гуманизированных антител получены из человеческих иммуноглобулинов. Константная область тяжелой цепи может быть выбрана из любого из пяти изотипов: , , ,или . Кроме того, тяжелые цепи различных подклассов (таких как подклассы тяжелых цепей IgG) являются ответственными за различные эффекторные функции и, таким образом, можно получить антитела с желательной эффекторной функцией посредством выбора желательной константной области тяжелой цепи. Предпочтительными константными областями являются 1 (IgG1), 3 (IgG3) и 4 (IgG4). Более предпочтительным является Fcфрагмент изотипа -1 (IgG1). Константная область легкой цепи может быть представлена k- или -типом,предпочтительно -типом. Термин "химерное антитело", как используют в данном контексте, относится кантителу, содержащему последовательности, выделенные из двух различных антител, которые, как правило, принадлежат организмам разных видов. Чаще всего химерные антитела содержат фрагменты человеческого и мышиного антитела, обыкновенно, человеческую константную и мышиную вариабельную область. Термин "иммуногенность", как используют в данном контексте, относится к степени способности направленного белка или терапевтической молекулы вызывать иммунный ответ (гуморальный или клеточный) при введении реципиенту. Данное изобретение касается иммуногенности определенных гуманизированных антител. Термин "гуманизированные антитела с пониженной иммуногенностью" относится к гуманизированным антителам, проявляющим пониженную иммуногенность относительно исходного антитела, например мышиного антитела. Термин "гуманизированное антитело, практически сохраняющее связывающие свойства исходного антитела", относится к гуманизированному антителу, которое сохраняет способность специфически связывать антиген, распознаваемый исходным антителом, используемым для получения данного гуманизированного антитела. Предпочтительно, если гуманизированное антитело будет проявлять такую же или практически такую же антигенсвязывающую аффинность и авидность, как у исходного антитела. В идеальном случае аффинность антитела не будет ниже, чем 10% аффинности исходного антитела, более предпочтительно не ниже, чем приблизительно 30%, и наиболее предпочтительно аффинность не будет ниже, чем приблизительно 50% от уровня аффинности исходного антитела. Способы анализа антигенсвязывающей аффинности хорошо известны в области техники и включают анализы полумаксимального связывания, конкурентные анализы и анализ по Scatchard. Подходящие анализы связывания антигена описаны в данной заявке. Данное изобретение направлено на гуманизированные моноклональные антитела, которые связывают человеческий LTR, и их применение в качестве терапевтических агентов. Кроме того, данное изобретение направлено на последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют указанные гуманизированные антитела, и их экспрессию в рекомбинантных клетках-хозяевах. Более конкретно, данное изобретение направлено на гуманизированные антитела, полученные из мышиного СВЕ 11, которое специфически связывает человеческий LTR. Мышиное СВЕ 11 (mСВЕ 11) представляет собой мышиное IgG1 антитело, выделенное у мыши,иммунизированной человеческим слитым белком LTR-Ig (см. статью Browning и соавт., J. Immunol.,154:33, (1995. mCBE11 функционально активирует LTR как in vivo, так и in vitro (PCT/US96/01386),и были описаны его выделение и противоопухолевые свойства (см. статью Browning и соавт., J. Exp.Med., 183:867, (1996. Гибридомная клеточная линия, которая продуцирует mСВЕ 11, была предварительно депонирована заявителями данного изобретения в Американской коллекции клеточных культур(ATCC) в соответствии с условиями Будапештского договора и получила регистрационный номер ATCCHB 11793. (PCT/US96/01386). Заявители показали также, что перекрестное связывание рецептора LT- с различными агонистическими антителами против LTR активирует рецептор LT- (т.е. может имитировать эффекты природных лигандов). (PCT/US96/01386). Было показано, что активация рецептора, в свою очередь, подавляет рост опухоли в ряде моделей опухолей in vivo, в которых происходит экспрессия рецептора LT-. Рецептор LT-, как было показано, экспрессируется на ряде раковых клеток, включая, например, клетки немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), клетки колоректального рака (CRC),клетки рака молочной железы, а также на клетках рака простаты, желудка, кожи, пищевода и мочевого пузыря. Неограничивающие примеры опухолей, которые ингибируют агонистические антитела противLTR, включают в себя следующие солидные опухоли: аденокарциному толстой кишки НТ 29, карциному шейки матки НТ 3, меланому А 375, карциному молочной железы MDA-231 и первичные опухоли толстой кишки. Вследствие этого, агонистические антитела против LTR обладают свойствами, обусловливающими их эффективность при лечении заболеваний, при которых желательна активация LTR и/или модуляция взаимодействия LTR/лиганда LTR, включая, например, лечение или уменьшение риска развития, тяжести или последствий неоплазии у субъектов (например, человека). В данном контексте описана гуманизация моноклонального антитела mСВЕ 11, включая анализ на модели и обратные мутации, необходимые для сохранения в значительной мере свойств связывания моноклонального антитела mСВЕ 11. Анализ на модели мышиных вариабельных областей. Наиболее вероятно, что CDR содержат остатки, которые связывают антиген, и они должны быть сохранены в реконструированном антителе. CDR определяются последовательностью согласно работеKabat и соавт., Последовательность белков, представляющих иммунологический интерес (Последовательность of Proteins of Immunological Interest) (5 изд., The United States Department of Health and Human(см. статью Chothia и соавт., Nature, 342: 877-883, (1989, в которых ключевые остатки в значительной степени определяют структурную конформацию петли CDR. Данные остатки почти всегда остаются в реконструированном антителе. Ниже представлена полипептидная последовательность вариабельного домена легкой цепи mСВЕ 11, где CDR выделены подчеркиванием и номера положений остатков указаны в соответствии с системой нумерации по Kabat 1 DIKMTQSPSS MYASLGERVT ITCKAGQDIK SYLSWYQQKP 41 WKSPKILIYY ATRLADGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLES 81 DDTATYYCLQ HGESPWTFGG GTKLEIK(SEQ ID NO:1). Ниже представлена полипептидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепиmСВЕ 11, где CDR выделены подчеркиванием и номера положений остатков указаны в соответствии с системой нумерации по Kabat 1 EVQLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS DYYMYWFRQT 41 PEKRLEWVAT ISDGGSYTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNNLY 81 LQMSSLKSED TAMYYCVREE NGNFYYFDYW GQGTTVTVSS(SEQ ID NO:2). Вариабельные легкие и тяжелые цепи mСВЕ 11 сравнивали с консенсусными последовательностями мышиной и человеческой подгрупп (см. работу Johnson G., Wu Т., T. Kabat, База данных и ее применение перспективные направления исследований нуклеиновых кислот (Database and its applications: future directions Nucleic Acid Research), 29, 205-206, (2001); статью Wu и Kabat, J. Exp. Med., 132:211-250, (1970 при использовании программы FASTA. Вариабельная легкая цепь mСВЕ 11 является членом мышиной подгруппы V с идентичностью 74% на участке перекрывания из 110 аминокислот и вариабельная тяжелая цепь mСВЕ 11 является членом мышиной подгруппы IIId с идентичностью 79% на участке перекрывания из 132 аминокислот. Вариабельная легкая цепь соответствует человеческой подгруппе I с идентичностью 66% на участке перекрывания из 113 аминокислот. Вариабельная тяжелая цепь соответствует человеческой подгруппе III с идентичностью 71% на участке перекрывания из 131 аминокислоты.CDR, соответствующие данному изобретению, были разделены на установленные классы. Петля L1 относится к установленному классу 2 (петля из 11 остатков), L2 - к классу 1 (7 остатков) и L3 - к классу 1(9 остатков). Петля Н 1 относится к классу 1 (5 остатков) и петля Н 2 - к классу 3 (17 остатков). Петля Н 3 не принадлежит к установленному классу. Были определены остатки на границе вариабельных легкой и тяжелой цепей (см. статью Chothia и соавт., J. MoI. Biol., 186:651-663, (1985. Они, как правило, сохраняются в реконструированном антителе. В mСВЕ 11 некоторые из данных остатков являются необычными для границы цепей, а именно S34,I46, L89, Н 91 в VL и Y35, F37, V93, Е 95 в VH. Необычные каркасные остатки определены путем анализа всех последовательностей мышиных и человеческих вариабельных цепей в версии базы данных Kabat от сентября 1999 г. [NCBI, NIH]. Считают, что специфические отличия mСВЕ 11, возможно, указывают на соматические мутации, которые по-5 006945 вышают связывающую активность, если данные отличия находятся близко к центру связывания. Необычные для мышиной молекулы остатки, более удаленные от центра связывания, и необычные для человеческой молекулы остатки удаляли в случаях, когда они могли бы образовать иммуногенные эпитопы в реконструированном антителе. Необычные каркасные остатки, обнаруженные в mСВЕ 11, представлены К 3, М 11, Y12, W41, Q69, S72, D81, Т 83 в легкой цепи и F37, Т 40, Е 42, А 49, N77 в тяжелой цепи. Хотя большинство из данных остатков не сохраняются в гуманизированных антителах СВЕ 11, некоторые из данных необычных каркасных остатков сохраняются, включая, например, F37 и А 49 в тяжелых цепях. Моделирование структуры вариабельных областей. Легкую и тяжелую цепи, соответствующие данному изобретению, сопоставляют с сокращенной базой данных, с целью установления структурных основ для применения при конструировании трехмерных моделей легких и тяжелых цепей mСВЕ 11. При использовании программы BLAST было обнаружено, что легкая цепь имеет последовательность, идентичную на 93% моноклональному мышиному антителу 5g9(1AHW), и было обнаружено, что тяжелая цепь имеет последовательность, идентичную на 81% фрагменту Fab мышиного антитела IGGA2 (Fab 17/9) (1 IFH). С помощью пакета по молекулярному моделированию Sybyl (Tripos Inc.) были созданы трехмерные структуры легкой и тяжелой цепей при использовании легкой цепи 5g9 и тяжелой цепи фрагмента Fab IGGA2, соответственно. Структурную целостность модели оценивали с помощью компьютерной программы и сочли приемлемой. Разработка реконструированных вариабельных областей. Гомологический анализ используют для выбора человеческих акцепторных каркасов, с целью "присоединения" участков CDR mСВЕ 11. Поиск как в базе данных Kabat, так и в сокращенной базе данных изNCBI, ENTRZ (Национальные институты здоровья (The National Institutes of Health проводили с использованием программного обеспечения BLAST. Выбор человеческих акцепторных каркасов делают на основе идентичности последовательностей каркасов mСВЕ 11 и каркасов человеческих антител (за исключением каркасов ранее гуманизированных антител). Человеческие каркасные (скелетные) области могут быть выбраны из антитела TNF-AI'CL (kabat No 004770) против человеческого -фактора некроза опухолей (см. статью Griffiths и соавт., EMBO J.,12:725-734, (1993 для вариабельной легкой (VL) цепи (-подгруппа I человека) и антитела FLA-IgG'CL(Kabat No 040003) неизвестной специфичности (см. статью Malisan и соавт., Blood, 87:717-724, (1996 для вариабельной тяжелой (VH) цепи (подгруппа III человека). Человеческие каркасные VL и VH отличаются по 15 и 11 остаткам по сравнению с мышиными последовательностями. Обратные мутации человеческих каркасов. Самой непредсказуемой процедурой гуманизации моноклональных антител является идентификация важных каркасных остатков исходного антитела (т.е. в данном случае родительского антитела мышиной природы), которые необходимо оставить, чтобы сохранить в значительной степени связывающие свойства исходного антитела и в то же самое время снизить до минимума потенциальную иммуногенность полученного антитела. Особенно важным является сохранение обязательных остатков, остатков упаковки границы цепей и необычных остатков мышиных молекул, которые находятся близко к центру связывания. Кроме того, принимают во внимание остатки в "Зоне Vernier" (образующие платформу, на которой находятся CDR) (см. статью Foote и Winter, J. Mol. Biol., 224:487-499, (1992 и остатки, расположенные близко от Н 3 CDR. Мутации, возвращающие обратно к исходному антителу (т.е. обратный мутационный процесс от остатков человеческого каркаса к мышиному), обозначаются в данном контексте, как обратные мутации. Было получено три варианта вариабельной легкой реконструированной цепи (hu-CBE11 VL) и четыре варианта вариабельной тяжелой реконструированной цепи (hu-CBE11 VH). Как правило, первый вариант содержит наибольшее количество обратных мутаций, а третий вариант - наименьшее (т.е. является наиболее гуманизированным), за исключением четвертого варианта hu-CBE11 VH. Данное изобретение предусматривает гуманизированные антитела, выделенные из mСВЕ 11, которые имеют вариабельную легкую цепь, выбранную из вариабельных легких цепей, описанных ниже (т.е. VL1, VL2 илиVL3) и вариабельную тяжелую цепь, выбранную из вариабельных тяжелых цепей, описанных ниже (т.е.(А) Легкая цепь: 3 Q (глутамин)-K (лизин). Данная замена сохраняется в первом варианте, поскольку предшествующие эксперименты по реконструированию показали (см., например, статью Kolbinger и соавт., Prot.Eng., 6:971-980, (1993, что она могла бы быть важной в плане связывания антигена или конформацииCDR. 41 G (глицин)-W (триптофан). Данная замена сохраняется в первом и втором вариантах. 46 L (лейцин)-I (изолейцин). Данная замена сохраняется в первом и втором вариантах, поскольку этот остаток является одновременно пограничным остатком и находится в Зоне Vernier. Кроме того, он является необычным остатком, встречающимся 9 раз в мышиных последовательностях и один раз в человеческой. Вероятно, он влияет на упаковку вариабельных цепей и может контактировать с CDR. 69 T (треонин)-Q (глутамин). Данный остаток находится в Зоне Vernier и может влиять на кон-6 006945 формацию CDR. Замена короткого остатка T на более длинный остаток Q может также означать, что он контактирует с антигеном. Q является необычным остатком, встречающимся 58 раз в мышиной и два раза в человеческой последовательности. Он сохраняется в первом варианте. 71 F (фенилаланин)-Y (тирозин). Данный остаток находится в обязательном положении и сохраняется во всех вариантах. Он также является относительно необычным для человеческих последовательностей, где встречается только 25 раз.(В) Тяжелая цепь: 37 V (валин)-F (фенилаланин). Данная замена сохраняется в первом, втором и четвертом вариантах. F в данном положении является необычным остатком и встречается только 15 раз в мышиной и 18 раз в человеческой последовательности. Он также является пограничным остатком. 40 А (аланин)-Т (треонин). Данная замена сохраняется в первом варианте. Мутация в данном положении была апробирована в 5 предшествующих экспериментах по гуманизации, хотя никогда не была представлена заменой А на T. Один из примеров представлен заменой А на S в работе с ВrЕ-3 (см. статью Couto и соавт., Hybridoma, 13:215-219, (1994, где была повышена аффинность связывания, хотя причина никогда не была установлена. В данном случае тяжелая цепь также принадлежала к подгруппеIII человека. 49 S (серин)-А (аланин). Данный остаток находится под CDR и в Зоне Vernier и сохранен во всех вариантах. 89 V (валин)-М (метионин). Данная замена сохраняется в первом варианте. В данном положении в нескольких экспериментах по гуманизации произошла обратная мутация. 93 А (аланин)-V (валин). Данное положение одновременно является пограничным остатком и находится в Зоне Vernier. Данная замена сохраняется в первом и втором вариантах. Получены следующие последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот каждого из различных вариантов вариабельных легкой и тяжелой цепей: Реконструированные вариабельные легкие цепи Реконструированная вариабельная легкая цепь СВЕ 11 - вариант 1 легкой цепи (VL1) (ПлазмидаSEQ ID NO:3 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной VL1.SEQ ID NO:4 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной VL1. Реконструированная вариабельная легкая цепь СВЕ 11 - вариант 2 легкой цепи (VL2) (ПлазмидаSEQ ID NO:5 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной VL2.SEQ ID NO:6 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной VL2. Реконструированная вариабельная легкая цепь СВЕ 11 - вариант 3 легкой цепи (VL3) (ПлазмидаSEQ ID NO:7 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной VL3.SEQ ID NO:8 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной VL3. Реконструированные вариабельные тяжелые цепи. Реконструированная вариабельная тяжелая цепь СВЕ 11 - вариант 1 тяжелой цепи (VH1) (Плазмида pAND067)SEQ ID NO:9 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной VH1.SEQ ID NO:10 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной VH1. Реконструированная вариабельная тяжелая цепь СВЕ 11 - вариант 2 тяжелой цепи (VH2) (Плазмида pAND071)SEQ ID NO:11 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной VH2.SEQ ID NO:12 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной VH2. Реконструированная вариабельная тяжелая цепь СВЕ 11 - вариант 3 тяжелой цепи (VH3) (Плазмида pAND075)SEQ ID NO:13 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной VH3.SEQ ID NO:14 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной VH3. Реконструированная вариабельная тяжелая цепь СВЕ 11 - вариант 4 тяжелой цепи (VH4) (Плазмида pAND090)SEQ ID NO:15 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты вышеописанной реконструированной VH4.SEQ ID NO:16 представляет собой последовательность аминокислот вышеописанной реконструированной VH4. Были получены и использованы в последующих исследованиях антитела, состоящие из различных вариантов легких и тяжелых цепей. Например, получено антитело, состоящее из реконструированного варианта 3 легкой вариабельной цепи (VL3) huCBE11 и реконструированного варианта 4 тяжелой вариабельной цепи (VH4) huCBE11, называемое huCBE114 или hCBE11. Клеточные линии Е 46.4 и Е 77.4, продуцирующие данное антитело, депонированы в коллекции ATCC (наименование патентных депозитов ATCC РТА-3357 и 3765, соответственно). Далее изобретение касается эквивалентов и вариантов реконструированных последовательностейVH и VL, т.е. последовательностей, содержащих одну или более замен консервативной аминокислоты,которая существенным образом не влияет на связывание LTR. Гуманизированные антитела противLTR, содержащие данные гуманизированные вариабельные последовательности тяжелых и легких цепей, могут быть получены рекомбинантными способами, как описано в примерах. Применение Гуманизированные антитела против LTR, соответствующие данному изобретению, применяют для лечения болезненных состояний, при которых активация LTR является терапевтически эффективной. Данные состояния включают в себя лечение, предупреждение или снижение риска развития, тяжести или последствий неоплазии. В одном из вариантов осуществления изобретения представлен способ лечения у млекопитающего(т.е. человека) состояния, ассоциированного с нежелательной пролиферацией клеток, посредством введения млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей гуманизированные антитела против LTR, соответствующие настоящему изобретению. В другом варианте осуществления изобретения представлен способ лечения млекопитающего (т.е. человека) с солидной опухолью (т.е. карциномой), которая характеризуется сверхэкспрессией LTR,предусматривающий введениеданному млекопитающему гуманизированного антитела против LTR,которое связывает LTR, в количестве, эффективном для уменьшения объема опухоли. Примеры форм рака, пролиферация клеток которого модулируется посредством LTR, могут быть обнаружены путем измерения in vitro уровня транскрипта LTR и/или лиганда LTR (т.е. LТ 12 или LIGHT), экспрессирующегося в библиотеках опухолевых тканей. Подходящими были бы библиотеки опухолевых тканей,в которых транскрипт LTR и/или лиганда LTR (т.е. LT12 или LIGHT) экспрессируется на высоком уровне. Типы опухолей, рассматриваемые в данном изобретении, содержат солидные опухоли,включающие в себя без ограничения перечисленным клетки немелкоклеточного рака легкого (NSCLC),клетки колоректального рака (CRC), клетки рака молочной железы, а также рака простаты, желудка, кожи, пищевода и мочевого пузыря. Гуманизированные антитела, соответствующие данному изобретению, которые используют для лечения состояний, ассоциированных с нежелательной пролиферацией клеток, в частности терапии опухолей, эффективно подавляют рост опухолевых клеток, что измерено, например, по снижению объема опухоли, больше, чем на приблизительно 10, 20, 30 или 40% и, что наиболее эффективно, больше, чем на 50%. Гуманизированные антитела получают путем скрининга (см., например, обсуждение в примере 3). Например, гуманизированные антитела для использования в данном изобретении можно выбрать на основе уменьшенного объема опухоли по сравнению с нелечеными раковыми клетками (например, более чем на приблизительно 10, 20, 30, 40 или 50%). В данном изобретении представлены также фармацевтические композиции, содержащие гуманизированное антитело, соответствующее данному изобретению, и фармацевтически приемлемый наполнитель. Например, подходящие носители и их составы описаны в Справочнике по фармацевтическим нау-9 006945 кам Ремингтона (Remington' Pharmaceutical Sciences), 16 изд., 1980, Mack Publishing Co., под ред. Oslo и соавт. Как правило, чтобы сделать состав изотоническим, в составе используют соответствующее количество фармацевтически приемлемой соли. Примеры носителя включают в себя буферы, такие как физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. рН раствора предпочтительно составляет от приблизительно 5 до приблизительно 8 и более предпочтительно от приблизительно 7,4 до приблизительно 7,8. Кроме того, носители включают в себя препараты с задержанным выходом, такие как полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров. При этом данные матрицы представлены в виде частиц определенной формы, например липосом, пленок или микрочастиц. Для компетентных специалистов будет очевидным, что некоторые носители могут быть более предпочтительными, например, в зависимости от способа введения и концентрации вводимой фармацевтической композиции. Введение может быть осуществлено путем инъекции (например, внутривенной, внутрибрюшинной,подкожной, внутримышечной) или другими способами, такими как инфузия, которая в эффективной форме обеспечивает доставку в кровоток. Гуманизированные антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть введены в эффективной дозе, с целью лечения определенного клинического состояния, на которое оно направлено. Определение предпочтительного фармацевтического препарата и терапевтически эффективной схемы дозирования для данного варианта применения находится в компетенции квалифицированного специалиста, принимающего во внимание, например, массу тела и состояние больного, длительность желательного лечения и переносимость лечения больным. Например, эффективная доза будет лежать в интервале от приблизительно 0,05 до приблизительно 100 миллиграмм/килограмм массы тела/сутки. В частности,приблизительно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела/сутки. Альтернативно приблизительно от 0,05 до приблизительно 100 мг, в частности приблизительно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела/неделю. Альтернативно, приблизительно от 0,05 до приблизительно 100 мг, в частности приблизительно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела/две недели. Альтернативно приблизительно от 0,05 до приблизительно 100 миллиграмм, в частности приблизительно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела/три недели. Альтернативно приблизительно от 0,05 до приблизительно 100 мг, в частности приблизительно 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела/четыре недели. При реализации данного изобретения будут использованы, если не указано иначе, традиционные методики клеточной биологии, клеточных культур, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, химии белка и иммунологии, которые входят в компетенцию квалифицированного специалиста в данной области. Данные методики описаны в литературе. См., например, монографии Лабораторное руководство по молекулярному клонированию (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), 2 изд.,под ред. Sambrook, Fritsch и Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Клонирование ДНК(DNA Cloning), тт. I и II (под ред. D.N. Glover), 1985; Синтез олигонуклеотидов (Oligonucleotide Synthesis), (под ред. M.J. Gait), 1984; патент США No. 4683195, выданный Mullis и соавт.; монографии Гибридизация нуклеиновых кислот (Nucleic Acid Hybridization) под ред. В.D. Hames и S.J. Higgins, 1984; Транскрипция и трансляция (Transcription and Translation) под ред. В.D. Hames и S.J. Higgins, 1984; Культура клеток животных (Culture of Animal Cells) под ред. R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987; Иммобилизованные клетки и ферменты (Immobilized Cells and Enzymes), IRL Press, 1986; B. Perbal, Практическое руководство по молекулярному клонированию (A Practical Guide to Molecular Cloning), 1984; Методы энзимологии (Methods in Enzymology), тт. 154 и 155, под ред. Wu и соавт., Academic Press, New York; Векторы для переноса генов для клеток млекопитающих (Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells), под ред. J.H. Miller и M.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Иммунохимические методы в клеточной и молекулярной биологии (Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology), под ред. Mayer иWalker, Academic Press, London, 1987; Справочник по экспериментальной иммунологии (Handbook ofExperiment Immunology) тт. I-IV, под ред. D.M. Weir и CC. Blackwell, 1986; сборник Манипуляции с мышиными эмбрионами (Manipulating the Mouse Embryo), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Следующие примеры представлены с целью иллюстрации данного изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его. ПРИМЕРЫ Пример 1. Конструирование и экспрессия chCBE11. кДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мышиного СВЕ 11, используют для конструирования векторов для экспрессии мышино-человеческих химер (chCBE11), в которых вариабельные области muСВЕ 11 связаны с человеческим IgG1 и -константными областями. Для конструирования химерной тяжелой цепи фрагмент Pstl-BstEII размером 0,36 т.п.н. из субклона pEAG970 тяжелой цепи СВЕ 11 субклонируют в полученный при обработке фосфатазой векторный фрагмент PstlBstEII размером 2,82 т.п.н. из плазмиды pLCB7, кодирующей тяжелую цепь 5 а 8 (5 а 8 представляет собой молекулярным способом клонированное СD4-специфическое mAb (моноклональное антитело), ранее охарактеризованное Biogen), с целью добавления сигнальной последовательности мышиной тяжелой- 10006945 цепи и сплайс-донорного участка в вариабельную область тяжелой цепи muСВЕ 11. В данной плазмиде,названной pEAG979, зрелый N-конец тяжелой цепи отличается по двум остаткам от N-концевой последовательности очищенной аутентичной тяжелой цепи СВЕ 11, выделенной из продуктов деградации поEdman, поскольку она определяется праймером во время ПЦР. Для коррекции N-конца тяжелой цепиpEAG979 подвергают мутагенезу с элиминацией уникального сайта (USE) при использовании набора дляUSE-мутагенеза фирмы Amersham Pharmacia Biotech, следуя протоколу, рекомендованному изготовителем. Мутантные плазмиды идентифицируют путем скрининга интродуцированных изменений Avall, Pstl и Rsal. Последовательность тяжелой цепи в полученной плазмиде pEAG981 подтверждают секвенированием ДНК. Фрагмент вариабельного домена тяжелой цепи Notl-HindIII размером 0,44 т.п.н. из pEAG981 и фрагмент HindIII-Notl размером 1,21 т.п.н. из плазмиды pEAG964, содержащий константную область человеческого IgG1, субклонируют в сайт Notl плазмиды рСН 269, полученной на основе экспрессионного вектора EBV рСЕР 4 (Invitrogen), с образованием плазмиды pEAG983. Для конструирования химерной легкой цепи фрагмент Notl-EcoRV размером 0,11 т.п.н. из плазмиды pMDR985 и фрагмент EcoRV-BamHI размером 0,37 т.п.н. из плазмиды pEAG967 вариабельного домена легкой цепи СВЕ 11 субклонируют в полученный при обработке фосфатазой векторный фрагментNotl-BamHI размером 2,94 т.п.н. из pBluescriptllSK фирмы Stratagene + вектор для клонирования, с целью добавления сигнальной последовательности мышиной легкой цепи и сайта 5'-Notl в конечную плазмидуpEAG978. Данную плазмиду подвергают USE-мутагенезу при использовании набора для USE-мутагенезаAmersham Pharmacia Biotech, следуя протоколу, рекомендованному изготовителем, с использованием мутагенных праймеров, кодирующих замену V3K, для получения соответствия N-концу легкой цепи аутентичного СВЕ 11. При этом интродуцируют сайт BgIII в 3'-конец вариабельного домена легкой цепи. Мутантные плазмиды идентифицируют путем скрининга изменений интродуцированных сайтов BgIII,EcoRV и Msel. Последовательность легкой цепи в конечной плазмиде pEAG980 подтверждают секвенированим ДНК. Фрагмент вариабельного домена легкой цепи Notl-BgIII размером 0,41 т.п.н. из pEAG980 и фрагмент Bcll-Notl размером 0,68 т.п.н. из плазмиды pEAG963, содержащий константный домен легкой цепи человека, субклонируют в сайт Notl плазмиды рСН 269, полученной на основе экспрессионного вектора EBV рСЕР 4 (Invitrogen) с образованием плазмиды pEAG982. Экспрессионными векторами (вектор тяжелой цепи chCBE11 плазмиды pEAG983 и вектор легкой цепи chCBE11 pEAG982) котрансфицируют клетки 293-EBNA и тестируют трансфицированные клетки на секрецию и специфичность антитела (в качестве контроля служат клетки, трансфицированные сh5 с 8(молекулярным способом клонированное СD154-специфическое mAb, ранее охарактеризованное Biogen) и ненагруженным вектором). Анализ способом вестерн-блоттинга (проведенный с использованием антител против человеческой тяжелой и легкой цепей) образования иммунопреципитатов белка А из лизатов целых клеток и кондиционированной среды показывает, что клетки, трансфицированные chCBE11, синтезируют и эффективно секретируют тяжелые и легкие цепи на уровне, близком к уровню клеток, трансфицированных ch5c8. Анализ с помощью FACS (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) экспрессирующих LTR клеток НТ-29, окрашенных кондиционированной средой, полученной из трансфицированных клеток, показывает, что антитело chCBE11 связывает и образует образцы окрашивания, близкие к образцам, полученным для muCBE11, тогда как кондиционированная среда, полученная из псевдо- и сh5 с 8-трансфицированных клеток, не окрашивает LTR на клетках НТ-29. Химерное СВЕ 11, полученное в результате временной трансфекции, очищают и демонстрируют его способность индуцировать секрецию ИЛ-8 (интерлейкина-8) клетками меланомы А 375, экспрессирующими LTR, и ингибировать рост клеток аденокарциномы WiDRr у голых мышей. Пример 2. Конструирование и экспрессия huCBE11. Создание реконструированных вариабельных доменов, с целью получения гуманизированного СВЕ 11 (huCBE11), проводят, как описано supra. Выбор человеческих акцепторных каркасов основан на анализе гомологии mAb TNF-A1 из человеческой -подгруппы I для легкой цепи (см. работу Griffiths и соавт., 1993) и mAb FLA-IgG из человеческой подгруппы III для тяжелой цепи (см. работу Malisan и соавт., 1996). Разрабатывают три варианта каждой из вариабельных легких и четыре варианта вариабельных тяжелых реконструированных цепей. Как правило, первый вариант содержит больше всего обратных мутаций к последовательностям мышиного донора, тогда как последний вариант содержит наименьшее количество обратных мутаций (т.е. является наиболее "гуманизированным"). Вариабельные области huCBE11 получают путем мутагенеза с элиминацией уникального сайта(USE) при использовании набора для USE-мутагенеза Amersham Pharmacia Biotech, следуя протоколу,рекомендованному изготовителем, и используя плазмиды вариабельного домена chCBE11 в качестве исходных матриц. Ниже описаны мутагенные праймеры для изменений каркаса (FR). Используют последовательность кДНК человеческих акцепторных каркасов (база данных Kabat 004770 для легкой цепи иKabat 040003 для тяжелой цепи) с молчащими мутациями, интродуцированными для получения изменений сайтов рестрикции, с целью облегчения идентификации мутантных плазмид. Полученные мутантные плазмиды идентифицируют путем скрининга интродуцированных изменений сайтов рестрикции. Последовательности кДНК вариабельных цепей подтверждают секвенированием ДНК.- 11006945 Для VH1 используют pEAG981 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер FR1 5'GCC TGG AGG GTC CCT GAG GCT CTC CTG TGC AGC CTC 3' (SEQ ID NO:17), который интродуцирует сайт Bsu36l; праймер FR2 5' GTT TCG CCA GAC TCC GGG AAA GGG GCT GGA GTG GGT CGCAAC 3' (SEQ ID NO:18), который интродуцирует сайты Neil и Hpall и праймер FR3 5' CAG AGA CAATGC CAA GAA CAG CCT СТА CCT GCA GAT GAG CAG CCT GAG GGC TGA GGA CAC AGC CAT G 3' (SEQ ID NO:19), который интродуцирует сайты Bsu36l и Pstl и удаляет сайт Rsal. Полученную плазмиду VH 1 называют PAND067. Для VH2 используют pAND067 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер FR2 5'CAT GTA TTG GTT TCG CCA GGC CCC GGG AAA GGG GCT GG 3' (SEQ ID NO:20), который интродуцирует сайт Smal и праймер FR3 5' GGG CTG AGG АСА CAG CTG TGT ATT ACT GTG TAA GAG 3'(SEQ ID NO:21), который интродуцирует сайт Pvull. Полученную VH2 плазмиду называют pAND071. Для VH3 используют плазмиду pAND067 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер FR2 5' GTG ACT ATT АСА TGT ATT GGG TGC GCC AGG CCC CGG GAA AGG GGC TGG AG 3'(SEQ ID NO:22), который интродуцирует сайты Smal и Hhal и праймер FR3 5' GAG GGC TGA GGA CACAGC TGT GTA TTA CTG CGC AAG AGA GGA GAA TGG TAA С 3' (SEQ ID NO:23), который интродуцирует сайты Pvull и Fspl. Полученную плазмиду VH3 называют pAND075. Экспрессионные векторы для тяжелых цепей huCBE11 получают путем субклонирования фрагментов вариабельного домена тяжелой цепи Notl-HindIII размером 0,44 т.п.н. из pAND067, pAND071 илиpAND075, и фрагмента HindIII-Notl размером 1,21 т.п.н. из плазмиды pEAG964, несущей константный домен человеческого IgG1, субклонируют в сайт Notl плазмиды рСН 269, полученной на основе экспрессионного вектора EBV рСЕР 4, с образованием векторов для экспрессии тяжелой цепи pAND069 (VH1),pAND073 (VH2), и pAND077 (VH3). Для VL1 используют плазмиду pEAG980 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер FR1 5' CTT GCAAGT GAT AGT GAC CCT GTC TCC CAC CGA TGC AGA CAA GGA TGA TGGAGA CTG GGT CAT C 3' (SEQ ID NO:24), который удаляет сайты Hinl и Nsil; праймер FR2 5' CAT AATAGATCA GGA TCT TAG GCG CTT TCC ATG GTT TCT GCT G 3' (SEQ ID NO:25), который интродуцирует сайты Haell и Hhal, и праймер FR3 5' GTA GAC AGT AAT AAG TTG CGA AAT CCT CAG GCTGCA GGC TGC TGA TGG TTA GAG TAT AAT CTT GCC CAG АТС 3' (SEQ ID NO:26), который интродуцирует сайты Bsu36l, Ddel и Pstl. Полученную плазмиду VL1 называют pAND066. Для VL2 используют плазмиду pAND066 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер FR1 5' GAT GGA GAC TGG GTC АТС TGG ATA TCA CCT CTG GCA CCT G 3' (SEQ ID NO:27),который интродуцирует EcoRV, и праймер FR3 5' GAT GGT TAG AGT ATA АТС TGT ACC AGA TCCACT GCC ACT G 3' (SEQ ID NO:28), который интродуцирует сайт Rsal. Полученную плазмиду VL2 называют pAND070. Для VL3 используют плазмиду pAND066 в качестве матрицы со следующими праймерами: праймер FRI 5' GAT GGA GAC TGG GTC АТС TGG ATA TCA CCT CTG GCA CCT G 3' (SEQ ID NO:29), который интродуцирует сайт an EcoRV; праймер FR2 5' CAA CCT TGT TGC ATA ATA GAT CAG AAGTCC ACT GCC ACT G 3' (SEQ ID NO:31), который интродуцирует сайт Rsal. Полученную плазмидуVL3 называют PAND074. Экспрессионные векторы для легких цепей huCBE11 получают субклонированием фрагментов вариабельного домена легкой цепи Notl-BgIII размером 0,41 т.п.н. из pAND066, pAND070 или pAND074, и фрагмента Bcll-Notl размером 0,68 т.п.н. из плазмиды pEAG963, содержащей константный домен человеческой -легкой цепи, субклонируют в сайт Notl плазмиды рСН 269, полученной на основе экспрессионного вектора EBV рСЕР 4, с образованием векторов для экспрессии легкой цепи pAND068 (VL1),pAND072 (VL2) и pAND076 (VL3). Экспрессионными векторами котрансфицируют клетки 293-EBNA и трансфицированные клетки тестируют на секрецию и специфичность антитела (клетки, трансфицированные ненагруженным вектором, служат отрицательным контролем). Анализ способом вестерн-блоттинга (проведенный с использованием антител против человеческой тяжелой и легкой цепей) образования иммунопреципитатов белка А из лизатов целых клеток и кондиционированной среды показывает, что клетки, трансфицированныеhuCBE11, синтезируют и эффективно секретируют тяжелые и легкие цепи на уровне, близком к уровню клеток, трансфицированных сhСВЕ 11. Анализ с помощью FACS экспрессирующих LTR клеток НТ 29, окрашенных кондиционированной средой, полученной из трансфицированных клеток, показывает,что mAb huCBE11 3 связывает хуже, чем mAb huCBE111 и huCBE112 по сравнению с chCBE11 (см. табл. 1 ниже), где показаны huCBE111 (VL1 в сочетании с VH1); huCBE2 (VL2 в сочетании сVH2) и huCBE113 (VL3 в сочетании с VH3). Результаты смешанных и соответствующих котрансфекций позволяют предполагать, что снижение могло было быть связано с вариантом VH3, который отличается от VH2 двумя каркасными остатками: FR2 F37V и FR3 V93A. Для исследования отдельных вкладов каждого из данных изменений конструируют векторы для экспрессии новых тяжелых цепей.- 12006945 Плазмиду PAND089, вариант F37V VH 2, получают посредством субклонирования фрагмента Notl-Pstl размером 311 п.н. из pAND075, фрагмента Pstl-HindIII размером 126 п.н. из pAND071 и фрагмента HindIII-Notl размером 1,21 т.п.н. из плазмиды pEAG964 в сайт Notl плазмиды рСН 269, полученной на основе экспрессионного вектора EBV рСЕР 4. Плазмиду pAND090, вариант V93A VH2, получают посредством субклонирования фрагмента Notl-Pstl размером 311 п.н. из pAND071, фрагмента Pstl-HindIII размером 126 п.н. из pAND075 и фрагмента HindIII-Notl размером 1,21 т.п.н. из плазмиды pEAG964 в сайт Notl плазмиды рСН 269, полученной на основе экспрессионного вектора EBV рСЕР 4. Данными химерными тяжелыми цепями Н 2/Н 3 котрансфицируют клетки 293-EBNA, несущие VL2 или VL3. Анализ с помощью FACS показывает, что у варианта Н 2 V93A восстанавливается связывание LTR в паре с VL3(см. таблицу, supra). Вариант с использованием пары pAND076 и pAND090 называют huCBE114 (см. таблицу). Котрансфекции клеток 293-EBNA вариантами chCBE11 и huCBE11 L-4 масштабируют и собирают кондиционированную среду. Антитело очищают на Белок А-Сефарозе. Проводят анализ активности очищенных mАb. Кондиционированную среду, полученную из временно трансфицированных клеток, используют для окрашивания клеток НТ-29 путем инкубирования в течение 30 мин на льду, промывания клеток два раза в буфере для FACS (PBS (физиологический раствор, забуференный фосфатом) с добавлением 5% FBS(сыворотка телячьих эмбрионов) и 0,05% азида натрия), окрашивания с использованием РЕконъюгированного IgG против человека (H + L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) в течение 30 мин на льду в буфере для FACS, промывания клеток два раза буфером для FACS и ресуспендирования в буфере для FACS, с целью проведения анализа. Относительный MFI означает среднее значение MFI,нормализованное относительно значения, полученного для chCBE11. Показанные данные представляют среднее значение по двум независимым экспериментам с трансфекцией. Пример 3. Агонизм ИЛ-8 на клетках А 375. Анализируют активность очищенных mAb. Результаты анализа выхода ИЛ-8 на клетках человеческой меланомы А 375 представлены на фиг. 1 (связанные антитела) и 2 (растворимые антитела), где измеряют количество ИЛ-8, которое выделилось при связывании антитела против LTR с LTR, экспрессирующегося на поверхности человеческих клеток меланомы А 375. Клетки А 375 помещают при густоте 105/мл в 96-луночные планшеты, содержащие либо растворимые антитела, либо антитела, иммобилизованные на лунках, покрытых козьим Fc IgG против человека (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Планшеты для культивирования инкубируют в течение ночи. Кондиционированную среду собирают и анализируют на присутствие ИЛ-8 с помощью ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Пример 4. Цитотоксичность в отношении клеток WiDr.- 13006945 Результаты анализа цитотоксичности при использовании клеток рака толстой кишки WiDr с растворимыми антителами против LTR в лунках, покрытых Fc IgG против человека, демонстрируют, что антитела против LTR повышают цитотоксичность раковых клеток, как показано на фиг. 3 (связанные антитела) и 4 (растворимые антитела). Клетки WiDr помещают при густоте 6 х 104/мл в присутствии 80 единиц/мл hulFN- в 96-луночные планшеты, содержащие либо растворимые антитела, либо антитела,иммобилизованные на лунках, покрытых козьим Fc IgG против человека (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Планшеты для культивирования инкубируют в течение 5 дней. На 4 ч добавляют MTT, полученный преципитат растворяют посредством инкубирования в течение ночи с 10% SDS (додецилсульфат натрия) в 10 мМ HCl и читают О.D. (оптическую плотность) с помощью ридера для микропланшет. Пример 5. Получают антитело, состоящее из реконструированного варианта 3 легкой вариабельной цепи(VL3) и реконструированного варианта 4 тяжелой вариабельной цепи huCBE11, названное huCBE11 4 или hCBE11, и клеточную линию, продуцирующую антитело, депонируют в коллекции культур ATCC(наименование патентного депозита ATCC РТА-3357). Полные полипептидные последовательности каждой из легкой и тяжелой цепей, включая константные домены, являются следующими: Последовательность варианта 3 легкой цепи зрелого huCBE11 (SEQ ID NO:32): 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKAGQDIK SYLSWYQQKP GKAPKLLIYY 51 ATRLADGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCLQ HGESPWTFGG 101 GTKLEIK [RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHК VYACEVTHQG 201 LSSPVTKSFN RGEC]CDR выделены подчеркиванием; обратная мутация F71Y выделена жирным шрифтом; константный домен выделен скобками. Последовательность варианта 4 тяжелой цепи зрелого huCBE11 (SEQ ID NO:33):CDR выделены подчеркиванием; обратная мутация F71Y выделена жирным шрифтом; константный домен выделен скобками. Голым мышам в возрасте 6 недель делают внутрибрюшинную инъекцию 100 мкг антитела противLFA3 (1 Е 6), 100 мкг антитела против LTBR (huCBE11 4) или им не делают инъекцию (контроль). Затем животным делают подкожную инъекцию 1x106 клеток аденокарциномы толстой кишки WIDR. Мышей,леченных huCBE11 4, повторно лечат еженедельным введением 100 мкг антитела, а животных, леченных mСВЕ 11, повторно лечат введением только на день 14. Размер опухоли измеряют еженедельно и вычисляют объем сферической опухоли (см. фиг. 5). Животных умерщвляют, когда объем их опухолей достигает 2,0 см 3 (диаметр 16 мм) и их гибель отмечают на графике выживаемости (см. фиг. 6). Пример 6. Голым мышам в возрасте 6 недель либо делают внутрибрюшинную инъекцию 100 мкг антитела против LTBR (huCBE114), либо им не делают инъекцию (контроль). Затем всем животным делают подкожную инъекцию 1x106 клеток аденокарциномы толстой кишки WIDR. Мышей, леченных huCBE114,повторно лечат еженедельным введением 100 мкг антитела huCBE11 4. Размер опухоли измеряют еженедельно и вычисляют объем сферической опухоли. Представленные объемы опухолей представляют среднее значение по 10 контрольным животным и 8 животным, леченным huCBE114 (см. фиг. 7). Еженедельное введение huCBE114 в значительной степени подавляет рост опухоли WIDR, имплантированной подкожно голым мышам. Животные, леченные антителом, до дня 21 продолжают демонстрировать пониженную скорость роста опухоли в течение двух недель после прекращения лечения. Пример 7.huCBE114 замедляет рост ранее выросших опухолей WIDR и повышает выживаемость у голых мышей, несущих опухоль WIDR. 106 клеток WIDR предварительно выращивают подкожно в течение 10 дней у голых мышей. Мышам делают подкожные инъекции PBS либо huCBE11 4 еженедельно, илиmСВЕ 11 через неделю. Массы опухолей рассчитывают, исходя из измерений ширины и длины, и животных с опухолями массой более 2000 мг умерщвляют, массы их опухолей в момент умерщвления продол- 14006945 жают учитывать в статистическом усреднении. Границы ошибки представляют стандартную ошибку. Массы опухолей вычисляют с помощью формулы: (Ширина х Ширина х Длина)/2 = масса опухоли в мг. Результаты представляют в виде графика на фиг. 8 и показывают, что huCBE11 4 обладает способностью замедлять развитие ранее выросших опухолей in vivo. Кроме того, опухоли культивируют и лечат, как описано выше и измеряют процент выживаемости животных. Результаты в виде графика представляют на фиг. 9 и показывают, что huCBE11 4 обладает способностью индуцировать более длительную выживаемость in vivo у мышей с ранее выросшими опухолями. Пример 8. Измерение аффинности антитела. Клетки НТ-29 культивируют в среде DMEM (модифицированная среда Дульбекко-Игла) с добавлением L-глутамина, не-незаменимых аминокислот, пирувата натрия и 10% сыворотки телячьих эмбрионов. Клетки однократно промывают в PBS и удаляют из планшета путем инкубирования при комнатой температуре с течение 5 мин с PBS с добавлением 20 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты). Клетки центрифугируют при 1000 об/мин. (110 х g) в течение пяти минут и ресуспендируют в PBS до получения густоты 1 х 107 клеток/мл. Антитело huCBE11 4 против-LTR и гуманизированное антитело против CD40L в качестве отрицательного контроля разводят в PBS и делают 12-кратное серийное разведение 1:4 до получения конечной концентрации, лежащей в интервале 2,37 пМ - 10 мкМ. 100 мкл суспензии клеток и 100 мкл разведения антитела вместе вносят в каждую лунку 96-луночного планшета для микротитрования с V-образной формой дна. Антитело и клетки инкубируют при 4C в течение 2 ч. Планшет центрифугируют при 1000 об/мин. (110 х g) в течение 10 мин при 4 С. Супернатант отбрасывают и шесть раз промывают клеточный остаток холодным PBS. Конъюгат козьего IgG против человека и фикоэритрина (Jackson lmmunoresearch) разводят 1:100 вPBS и добавляют по 200 мкл в каждую лунку. Клетки инкубируют с данным вторичным антителом в течение одного часа при 4 С, центрифугируют, как описано выше, и однократно промывают в холодномPBS. Затем клетки переносят в полистирольные тест-пробирки. Интенсивность флуоресценции измеряют на приборе FACS Calibur (Beckton Dickinson). Строят график зависимости средних значений интенсивности флуоресценции окрашивания для контроля неспецифического связывания антитела против CD40L от концентрации антитела с помощью программы Delta Graph. Данные значения соответствуют прямой линии и теоретические значения неспецифического связывания для каждой концентрации антитела вычитают из результата для каждой точки в серии разведенийhuCBE11 4. Затем строят график зависимости данных значений интенсивности специфической флуоресценции от концентраций huCBE114 в логарифмическом масштабе. Полученная в результате кривая имеет форму колокола и является симметричной, она отражает самоингибирование связывания антитела при высоких концентрациях. Левая половина данной кривой соответствует уравнению с четырьмя параметрами,которое позволяет определить функциональную аффинность антитела. Соответствие полученной в результате кривой дает значение EC50 60 пМ для связывания huCBE11 4 с клетками НТ-29. Для компетентных специалистов в данной области очевидна возможность различных модификаций и вариантов в полипептидах, композициях и способах, соответствующих изобретению, не выходя за рамки сущности и объема притязаний изобретения. Вследствие этого предусматривают, что данное изобретение охватывает модификации и варианты, соответствующие данному изобретению, при условии, что они входят в объем прилагаемых пунктов формулы изобретения и эквивалентных им решений.