Антитело против cd20 и его применение

012464 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые включают новый вариант области Fc. Конкретно, новый вариант области Fc настоящего изобретения включает как минимум одну аминокислотную замену, описанную здесь, которая обеспечивает измененную эффекторную функцию или измененный период полужизни в сыворотке иммуноглобулина, включающего вариант области Fc, по сравнению с исходным иммуноглобулином, не содержащим аминокислотной замены. Кроме того, в изобретении предлагается способ изменения эффекторной функции моноклонального антитела или увеличения периода полужизни в сыворотке полипептида, с которым функционально связан вариант области Fc по изобретению. Раскрыто терапевтическое применение полипептидов, белков, особенно моноклональных антител, которые включают вариант области Fc по изобретению. Предшествующий уровень техники В настоящее время имеется как минимум семнадцать моноклональных антител, зарегистрированных в Соединенных Штатах для использования в качестве терапевтических средств для человека. Кроме того, несколько сотен моноклональных антител проходят клинические испытания и тысячи - доклинические испытания на предмет лечения различных заболеваний или нарушений, включая, например, отторжение трансплантата, рак, воспалительные заболевания, сепсис, нефрит, болезнь Альцгеймера, аллергию,диабет, аутоиммунные заболевания, артрит, рассеянный склероз и инфекционные заболевания. Область терапевтических моноклональных антител позиционируется как быстро развивающаяся в ближайшие годы. После вакцин антитела (или иммуноглобулины, "Ig") составляют второй наиболее распространенный вид биофармацевтических агентов, тестируемых в клинических испытаниях (Stockwin, L.H. et al.Biochemical Society Transactions, 31:433-436, 2003). Генная инженерия значительно способствовала развитию области терапевтических моноклональных антител. Эффективность потенциального терапевтического моноклонального антитела часто варьирует при умеренных изменениях белковой последовательности антитела. Изменение одной аминокислоты в вариабельной области моноклонального антитела способно изменить сродство, с которым антитело связывает антигенный эпитоп, а также такие свойства антитела, как величина Kon или величина Koff. Такие аминокислотные изменения могут определять успешность или неуспешность применения моноклонального антитела в качестве терапевтического агента. Сходным образом, небольшие изменения в последовательности аминокислот области Fc моноклонального антитела могут давать выраженные изменения свойств эффекторной функции антитела или периода полужизни белка, с которым область Fc функционально связана. Область Fc антитела (т.е. карбоксиконцевые концы тяжелых цепей антитела, охватывающие домены СН 2, СН 3 и часть шарнирной области (см. фиг. 1 ограничена в изменчивости и вовлечена в осуществление физиологических функций, которые выполняет антитело. Эффекторные функции, которые могут быть приписаны области Fc антитела, варьируют в зависимости от класса и подкласса антитела и включают (i) связывание антитела через область Fc со специфическим рецептором Fc ("FcR") на клетке,который запускает различные биологические реакции, включая, например, фагоцитоз и уничтожение покрытых антителами частиц, клиренс иммунных комплексов, высвобождение медиаторов воспаления,плацентарный перенос и контроль выработки иммуноглобулина, (ii) зависимую от комплемента цитотоксичность ("CDC"), где область Fc связывает компонент C1q комплемента и таким образом инициирует классический путь активации комплемента, который приводит к лизису мишени, (iii) зависимую от антитела клеточно-опосредованную цитотоксичность ("ADCC"), при которой определенные клетки иммунной системы человека, например, фагоциты и NK клетки, через рецептор Fc связываются с областьюFc антитела через специфические связывающие антитело рецепторы на иммунных клетках с последующим сигнальным уничтожением образования, с которым связано антитело, и (iv) связывание с тучными клетками, базофилами и эозинофилами. Аффинность, с которой область Fc может связываться со специфическим FcR (например, FcRn),или уровень, на котором область Fc может опосредовать CDC или ADCC активность, представляют собой важные факторы для определения эффективности и периода полужизни терапевтических белков,особенно моноклональных антител. Специализированная модификация аминокислот в области Fc человеческого IgG представляет собой область активных исследований, которые дают информацию о взаимоотношениях структурафункция, важную для разработки терапевтических белков, особенно моноклональных антител (см., например, патент США 6165745 и публикацию РСТWO2004/035752 относительно изменения периода полужизни в сыворотке полипептида, функционально связанного с областью Fc, и патент США 6737056 и публикацию РСТWO2004/029207 относительно изменения эффекторной функции моноклонального антитела, которое включает модифицированную область Fc). Для разработки новых терапевтических белков, особенно моноклональных антител, была бы полезна способность рационально сконструировать область Fc со специфическими модификациями аминокислот, которые обеспечивают желательное полезное свойство для целевого антитела. Не следует ожидать,что все моноклональные антитела будут усовершенствованы в качестве терапевтических средств за счет одной и той же конкретной аминокислотной модификации в области Fc. Терапевтическое моноклональ-1 012464 ное антитело, которое связывает один целевой антиген, может выиграть от увеличения специфической эффекторной функции, тогда как другое терапевтическое моноклональное антитело, которое связывает другой целевой антиген, может выиграть от увеличения или даже уменьшения другой эффекторной функции. Одно терапевтическое моноклональное антитело может выиграть от способности связывать специфический рецептор Fc с большим сродством, тогда как другое антитело может быть усовершенствовано в качестве терапевтического средства связыванием этого рецептора Fc с более низким сродством и, таким образом, выведением из организма с более высокой скоростью. Кроме того, конкретная модификация или замена аминокислоты области Fc и полученный эффект, который принес бы пользу терапевтическому антителу, может зависеть от антигенной мишени, с которой связывается антитело и/или заболевания или расстройства, которое должно быть улучшено с помощью антитела. Способы и композиции, которые изменяют конкретные эффекторные функции, связанные с областью Fc антитела, необходимы, чтобы улучшить свойства существующих терапевтических антител, а также для создания новых терапевтических антител с желательными свойствами. Моноклональные антитела с вариантом области Fc могут использоваться для лечения различных заболеваний или расстройств, включая, например, воспалительные расстройства, рак, аутоиммунные расстройства, расстройства проведения сигнала в клетках и инфекционные заболевания. Кроме того,способы и композиции, которые изменяют период полужизни в сыворотке терапевтического белка, либо увеличивая период полужизни и, таким образом, обеспечивая примение меньших доз, либо уменьшая период полужизни и, таким образом, обеспечивая более быстрый клиренс из организма, могли бы принести пользу для создания терапевтических антител, а также других терапевтических белков. Что необходимо для улучшения эффективности терапевтического белка, особенно моноклонального антитела, так это варианты области Fc с улучшенными свойствами. Краткое изложение сущности изобретения В настоящем изобретении предлагаются варианты области Fc, т.е. области Fc, которые включают описанную здесь аминокислотную замену (например, см. табл. 1), которые придают полезные свойства полипептидам, включающим указанные варианты области Fc. Положения Fc исходной области Fc, в которых может быть осуществлена любая замена аминокислоты для создания варианта области Fc по изобретению, включают положения 279, 341, 343 и 373 области Fc, где нумерация остатков, т.е. номер их положения в области Fc представляет собой номер индекса ЕС в соответствии с Kabat (см. фиг. 2 в данном описании). В настоящем изобретении предлагаются варианты области Fc, которые включают замену аминокислоты в положении 279, 341, 343 или 373 исходной области Fc или любое из их сочетаний. Исходная область Fc может необязательно содержать остатки аминокислот, которые не встречаются в природе, в положениях, отличных от 279, 341, 343 и 373. Остатками природных аминокислот в этих положениях человеческого IgG являются валин (279), глицин (341),пролин (343) и тирозин (373). В предпочтительных вариантах осуществления по настоящему изобретению остаток аминокислоты,которым заменен остаток, присутствующий в исходной области Fc, представляет собой остаток природной аминокислоты. Если не указано иное, исходная область Fc может представлять собой природную или неприродную область Fc, предпочтительно человеческого происхождения или в значительной мере человеческого происхождения. Последовательность аминокислот исходной области Fc предпочтительно является такой, как показано в SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4. Предпочтительно исходная область Fc содержит природный остаток аминокислоты в положении, где должна быть произведена замена для создания варианта области Fc по изобретению. Кроме того, со всех точек зрения понятно, что вариант области Fc представляет собой исходную область Fc, измененную таким образом, чтобы включать как минимум одну замену аминокислоты, как описано в данном описании. Кроме того, понятно, что исходная область Fc может представлять собой полноразмерную область Fc или ее часть, которая включает остаток аминокислоты, подлежащий замене для создания варианта области Fc. В настоящем изобретении дополнительно предлагаются полипептиды, предпочтительно моноклональные антитела, которые включают вариант области Fc (или его функциональный фрагмент), который включает как минимум одну замену аминокислоты в положении 279, 341, 343 или 373 в сравнении с исходной областью Fc. Вариант области Fc, который включает как минимум одну замену аминокислоты в положении Fc 279, 341, 343 или 373, может дополнительно включать как минимум одну дополнительную замену аминокислоты в области Fc по сравнению с остатком аминокислоты, присутствующим в природной области Fc такого же типа, как вариант области Fc. В одном осуществлении вариант области Fc (т.е. вариант исходной области Fc) включает как минимум 1, 2, 3 или больше замен аминокислот, выбранных из следующих: В предпочтительном осуществлении вариант области Fc включает, как минимум, 1, 2, 3 или больше замен аминокислот, выбранных из следующих: Варианты области Fc по настоящему изобретению предпочтительно характеризуют с помощью одного или более описанных здесь экспериментальных способов. Такие варианты области Fc обеспечивают измененную эффекторную функцию или измененный период полужизни в сыворотке для моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, или измененный период полужизни в сыворотке для полипептида, с которым вариант области Fc функционально связан. Предпочтительно исходная область Fc варианта области Fc по изобретению представляет собой природную или кодированную зародышевой линией область Fc человеческого происхождения, выбранную из группы, которая состоит из IgG, IgA, IgE, IgM и IgD или их полиморфного варианта или их функционального фрагмента. Предпочтительно исходная область Fc представляет собой область Fc IgG и более предпочтительно - область Fc IgG1, IgG3 или IgG4. Исходная область Fc может необязательно включать одну или более аминокислотную замену(замены) по сравнению с природной областью Fc, отличные от описанных здесь (т.е. замен, перечисленных в табл. 1), в особенности одну или более замен, известных в данной области техники или описанных в патентах США 6165745 или 6737056; или публикациях РСТWO2004/035752 или WO2004/029207 (все из которых включены здесь во всей своей полноте); такая(такие) аминокислотная(ые) замена(замены) при наличии в исходной области Fc должна также присутствовать в области Fc варианта изобретения и в полипептиде, включающем область Fc варианта изобретения, если она не находилась в положении, впоследствии замененном для создания варианта областиFc. В изобретении предлагается полипептид, предпочтительно моноклональное антитело, включающий вариант области Fc изобретения или его функциональный фрагмент. В предпочтительном осуществлении моноклональное антитело, включающее вариант области Fc изобретения, представляет собой гибридное антитело. В более предпочтительном осуществлении моноклональное антитело, включающее вариант области Fc изобретения, представляет собой приближенное к человеческому антитело или антитело человека, в котором каркасная последовательность и последовательность константной области, находящиеся в антителе, в значительной мере имеют человеческое происхождение. Гибридное, приближенное к человеческому или человеческое антитело является предпочтительно полноразмерным антителом или одноцепочечным антителом. Когда моноклональное антитело, включающее вариант области Fc-4 012464 изобретения, предназначено для применения в качестве терапевтического агента у человека, область Fc предпочтительно имеет в значительной мере человеческое происхождение. Предпочтительно полипептид, включающий вариант области Fc изобретения или функционально связанный с ним (т.е. вариант полипептида), содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в варианте области Fc в сравнении с исходной областью Fc и демонстрирует измененную эффекторную функцию или измененный период полужизни в сыворотке по сравнению с полипептидом, включающим исходную область Fc указанного варианта области Fc, где как минимум одна замена аминокислоты в варианте области Fc представляет собой (i) любую замену аминокислоты в положении 279, 341, 343 или 373 области Fc или (ii) как минимум одну из следующих замен аминокислот в области(iii) как минимум, две замены аминокислот, перечисленных в (i) или (ii) выше, или (iv) как минимум, 1, 2 или 3 замены аминокислот, перечисленных в (i) или (ii) выше, в дополнение как минимум к одной замене аминокислоты в области Fc, не перечисленной в (i) или (ii) выше. Предпочтительно изменение эффекторной функции представляет собой повышение ADCC, снижение ADCC, повышение CDC,-5 012464 снижение CDC, повышение сродства связывания C1q, снижение сродства связывания C1q, повышение сродства связывания FcR (предпочтительно FcRn) или снижение сродства связывания FcR (предпочтительно FcRn) по сравнению с указанным полипептидом без замены аминокислоты в области Fc (т.е. с исходной областью Fc). В изобретении предлагается моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc,включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области где моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc, демонстрирует повышениеADCC по сравнению с моноклональным антителом, которое включает исходную область Fc. В изобретении предлагается моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc,включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области Fc:-6 012464 где моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc, демонстрирует снижениеADCC активности по сравнению с моноклональным антителом, включающим исходную область Fc. В изобретении предлагается моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc,включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области Fc: 238L, 244L где моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc, демонстрирует повышенное сродство связывания FcRn по сравнению с моноклональным антителом, включающим исходную областьFc. В изобретении предлагается моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc,включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области где моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc, демонстрирует сниженное сродство связывания FcRn по сравнению с моноклональным антителом, включающим исходную областьFc. В изобретении предлагается моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc,включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области где моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc, демонстрирует повышеннуюCDC активность по сравнению с моноклональным антителом, включающим исходную область Fc. В изобретении предлагается моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc,включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области где моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc, демонстрирует пониженную активность CDC по сравнению с моноклональным антителом, включающим исходную область Fc. Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело, которое включает вариант облас-9 012464 ти Fc по изобретению, где указанное антитело специфически связывается с целевым антигеном человека. Предпочтительно целевой антиген выбирается из группы, которая состоит из CD3, CD20, CD25, TNF,Her2/neu, CD33, CD52, EGFR, ЕрСАМ, MUC1, GD3, СЕА, СА 125, HLA-DR, TGF, VEGF, GDF8, GDF11,грелина или любого их предшественника или функционального фрагмента. В изобретении предлагается вариант полипептида, который включает вариант области Fc, включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот в области где вариант полипептида демонстрирует увеличенный период полужизни в сыворотке в сравнении с исходным полипептидом (т.е. полипептидом, идентичным варианту полипептида, но без аминокислотной замены, перечисленной здесь выше). В изобретении предлагается вариант полипептида, который включает вариант области Fc, включающий как минимум одну из следующих замен аминокислоты в области где вариант полипептида демонстрирует уменьшенный период полужизни в сыворотке в сравнении с исходным полипептидом (т.е. полипептидом, идентичным варианту полипептида, но без аминокислотной замены, перечисленной здесь выше). В одном осуществлении изобретения предлагается способ увеличения активности ADCC моноклонального антитела, предпочтительно терапевтического моноклонального антитела (или его функционального фрагмента), который включает создание нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант области Fc, который включает как минимум одну из следующих замен аминокислот: Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc (например,из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Fc или природную область Fc), с включением как минимум одной замены аминокислоты, как перечислено выше, причем или молекула- 11012464 нуклеиновой кислоты функционально присоединяется к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи Ig), или способ может дополнительно включать последующее функциональное связывание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Fc (т.е. после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше) с дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислотой. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc. Способ может дополнительно включать измерение активности ADCC моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, и моноклонального антитела, включающего исходную область Fc, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, с более высокой активностью ADCC, чем у моноклонального антитела, включающего исходную область Fc (т.е. увеличенной, предпочтительно как минимум на 5, 10,12, 14, 16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, включающие вариант области Fc, полученный согласно данному способу. В одном осуществлении изобретения предлагается способ уменьшения активности ADCC моноклонального антитела, предпочтительно терапевтического моноклонального антитела (или его функционального фрагмента), который включает создание нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант области Fc, который включает как минимум одну из следующих замен аминокислот: Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc (например,из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Fc или природную область Fc), с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом либо молекула нуклеиновой кислоты функционально присоединяется к дополнительной кодирующей антитело нук- 12012464 леиновой кислоте (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи Ig), либо способ может дополнительно включать последующее функциональное присоединение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Fc (т.е. после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше), к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc. Способ может дополнительно включать измерение активности ADCC моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, и моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, с активностью ADCC ниже, чем у моноклонального антитела, включающего исходную область Fc (т.е. уменьшенной, предпочтительно как минимум на 5,10, 12, 14, 16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, которые включают вариант области Fc, полученный согласно данному способу. В одном осуществлении изобретения предлагается способ увеличения сродства связывания FcRn моноклонального антитела, предпочтительно терапевтического моноклонального антитела (или его функционального фрагмента), который включает создание нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант области Fc, который включает как минимум одну из следующих замен аминокислот: Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc (например,из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Fc или природную область Fc), с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше; при этом либо эта молекула нуклеиновой кислоты функционально присоединяется к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи Ig), либо способ может дополнительно включать последующее функциональное присоединение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Fc (т.е. после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше), к дополнительной кодирующей антитело нуклеи- 13012464 новой кислоте. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc. Способ может дополнительно включать измерение сродства связывания FcRn моноклонального антитела, которое включает вариант областиFc, и моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, со сродством связывания FcRn, большим, чем сродство связывания FcRn моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc (т.е. увеличенной, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело или его функциональный фрагмент, которые включают вариант области Fc, полученный согласно данному способу. В одном осуществлении изобретения предлагается способ увеличения in vivo периода полужизни полипептида в сыворотке, предпочтительно терапевтического полипептида, который включает создание нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант области Fc, который включает как минимум одну из следующих замен аминокислот: Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc, может быть функционально связана с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический белок. Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc (например, из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Fc или природную область Fc) с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом молекула нуклеиновой кислоты функционально связывается с дополнительной кодирующей полипептид нуклеиновой кислотой (например, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей отличную от Fc область слитого белка), или способ может дополнительно включать последующее функциональное присоединение нуклеиновой кислоты,кодирующей вариант области Fc, после введения, как минимум, одной замены аминокислоты из перечисленных выше, к нуклеиновой кислоте, кодирующей отличный от Fc партнера слияния. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку полипептида, включающего вариант области Fc. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку полипептида, включающего исходную область Fc. Способ может дополнительно включать измерение периода полужизни в сыворотке in vivo полипептида,- 14012464 включающего вариант области Fc, и полипептида, включающего исходную область Fc, любым способом,известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор полипептида, который включает вариант области Fc, где период полужизни полипептида в сыворотке in vivo увеличен по сравнению с полипептидом, включающим исходную область Fc (т.е. увеличен,предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает полипептид (т.е. полипептид слияния), который включает вариант области Fc, полученный согласно данному способу. В одном осуществлении изобретения предлагается способ уменьшения сродства связывания FcRn моноклонального антитела, предпочтительно терапевтического моноклонального антитела (или его функционального фрагмента), который включает создание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Fc, включающего, как минимум, одну из следующих замен аминокислот: Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc (например,из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Fc или природную область Fc), с включением, как минимум, одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом нуклеиновая кислота, кодирующая вариант области Fc, функционально присоединяется к нуклеиновой кислоте, кодирующей дополнительную последовательность антитела (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи Ig), или способ может дополнительно включать последующее функциональное присоединение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Fc после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку мсноклонального антитела, которое включает исходную область Fc. Способ может дополнительно включать измерение сродства связывания FcRn моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, и моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, со сродством связывания FcRn ниже, чем у моноклонального антитела, включающего исходную область Fc(т.е. уменьшенным, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или больше). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело (которое включает вариант области Fc), полученное согласно данному способу. В другом существлении изобретения предлагается способ уменьшения периода полужизни в сыворотке in vivo полипептида, предпочтительно терапевтического полипептида, который включает создание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Fc, включающий как минимум одну из следующих замен аминокислот: Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант области Fc, может быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей терапевтический белок. Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc (например, из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Fc или природную область Fc), с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом молекула нуклеиновой кислоты функционально присоединяется к дополнительной кодирующей полипептид нуклеиновой кислоте (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей отличную от Fc область слитого белка), или способ может дополнительно включать последующее функциональное связывание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Fc после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, с нуклеиновой кислотой, кодирующей отличный от Fc партнер слияния. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку полипептида, включающего вариант области Fc. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку полипептида, включающего исходную область Fc. Способ может дополнительно включать измерение периода полужизни в сыворотке in vivo полипептида, включающего вариант области Fc, и полипептида, включающего исходную область Fc, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор полипептида,который включает вариант области Fc, где период полужизни полипептида в сыворотке in vivo уменьшен по сравнению с полипептидом, включающим исходную область Fc (т.е. уменьшение, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20% или больше). Изобретение дополнительно включает полипептид (т.е. слитый полипептид), который включает вариант области Fc, полученный согласно данному способу. В другом осуществлении изобретения предлагается способ увеличения активности CDC монокло- 16012464 нального антитела, предпочтительно моноклонального терапевтического антитела, который включает конструирование области Fc антитела с включением как минимум одной из следующих замен аминокислот: Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc (например,из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Fc или природную область Fc), с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом молекула- 17012464 нуклеиновой кислоты функционально связывается с дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислотой (например, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи Ig), или способ может дополнительно включать последующее функциональное присоединение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Fc после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc. Способ может дополнительно включать измерение активности CDC моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, и моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, с большей активностью CDC, чем у моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc (т.е. увеличенной, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14,16, 18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc, полученный согласно данному способу. В другом осуществлении изобретения предлагается способ уменьшения реакции CDC моноклонального антитела, предпочтительно моноклонального терапевтического антитела, который включает конструирование области Fc антитела с включением как минимум одной из следующих замен аминокислот: Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc (например,из молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную область Fc или природную область Fc), с включением как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, при этом молекула нуклеиновой кислоты функционально присоединяется к дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислоте (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей остальную часть тяжелой цепи Ig), или способ может дополнительно включать последующее функциональное связывание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Fc после введения как минимум одной замены аминокислоты из перечисленных выше, с дополнительной кодирующей антитело нуклеиновой кислотой. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc. Способ может дополнительно включать экспрессию и очистку моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc. Способ может дополнительно включать измерение активности CDC моноклонального антитела, которое включает вариант области Fc, и моноклонального антитела, включающего исходную область Fc, любым способом, известным в данной области техники или описанным здесь. Способ может дополнительно включать отбор моноклонального антитела,которое включает вариант области Fc, с активностью CDC ниже, чем у моноклонального антитела, которое включает исходную область Fc (т.е. уменьшенной, предпочтительно как минимум на 5, 10, 12, 14, 16,18, 20% или более). Изобретение дополнительно включает моноклональное антитело, которое включает вариант области Fc, полученный согласно данному способу. В другом осуществлении изобретения предлагается изолированная молекула нуклеиновой кислоты,которая включает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант области Fc по изобретению или- 18012464 его функциональный фрагмент. Более предпочтительно изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, включающий вариант области Fc по изобретению. Предпочтительно вариант области Fc полипептида, кодируемый указанной нуклеиновой кислотой, включает замену аминокислоты, как показано в табл. 1, по сравнению с исходной областью Fc варианта. Предпочтительно полипептид представляет собой моноклональное антитело и даже более предпочтительно, моноклональное антитело представляет собой полноразмерное антитело или одноцепочечное антитело. Моноклональное антитело может быть гибридным, гуманизированным или человеческим моноклональным антителом. В другом осуществлении изобретения предлагается вектор, предпочтительно (но не ограничиваясь этим) плазмида, рекомбинантный вектор экспрессии, вектор экспрессии дрожжей или ретровирусный вектор экспрессии, который включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, включающий вариант области Fc полипептида по изобретению. В другом осуществлении изобретения предлагается клетка-хозяин, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Предпочтительно клетка-хозяин по изобретению включает один или более векторов или конструктов, включающих молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Клетка-хозяин по изобретению представляет собой клетку, в которую был введен вектор по изобретению (например, путем трансформации, преобразования, заражения, трансфекции, электропорации и т.п.), причем указанный вектор включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, который включает вариант области Fc полипептида по изобретению. Вектор необязательно может быть стабильно включен в хромосому клетки-хозяина. Типы клеток-хозяев включают клетки млекопитающих,бактерий, дрожжей и растений. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку СНО, клеткуCOS, клетку SP2/0, клетку NS0, клетку дрожжей или производное или потомка любого предпочтительного вида клеток. В другом осуществлении изобретения предлагается фармацевтическая композиция, которая включает полипептид, включающий вариант области Fc по изобретению или его функциональный фрагмент. Предпочтительно полипептид представляет собой моноклональное антитело, даже более предпочтительно терапевтическое моноклональное антитело. Моноклональное антитело может быть гибридным, гуманизированным или человеческим моноклональным антителом. Альтернативно, полипептид может быть полипептидом, отличным от антитела, обладающим преимуществом измененного периода полужизни в сыворотке, что обеспечивается путем функционального связывания и совместной экспрессии с вариантом области Fc по изобретению. Фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. В указанной фармацевтической композиции полипептид, который включает вариант области Fc, представляет собой активный ингредиент. Предпочтительно фармацевтическая композиция включает однородную или в значительной степени однородную популяцию моноклональных антител, которые включают вариант области Fc по изобретению. Фармацевтическая композиция для терапевтического применения предпочтительно является стерильной и может быть лиофилизированной. В изобретении предлагается способ ингибирования активности белка у нуждающегося в этом млекопитающего, предпочтительно человека, который включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества или профилактически эффективного количества полипептида(предпочтительно моноклонального антитела), включающего вариант области Fc по изобретению. Предпочтительно, полипептид, который включает вариант области Fc, представляет собой связывающий партнер белка, который подлежит ингибированию. В изобретении дополнительно предлагается способ лечения или профилактики заболевания или расстройства, которые могут быть облегчены путем ингибирования проведения сигнала в результате связывания моноклонального антитела, включающего вариант области Fc по изобретению, с его антигенным эпитопом, который включает введение нуждающемуся в таком лечении или профилактике больному (например, человеку), терапевтически или профилактически эффективного количества моноклонального антитела по изобретению. Изобретение включает предмет производства, который включает упаковочный материал и полипептид, включающий вариант области Fc полипептида по изобретению, находящийся в указанном упаковочном материале. Изобретение дополнительно включает композиции, которые включают моноклональные антитела и гетерологичные полипептиды, включающие описанный здесь вариант области Fc и физиологически или фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается полипептид, который включает:i) немодифицированную каркасную область ("FR") человека (например, никаких изменений не было осуществлено в отношении природного каркаса человека) иii) вариант области Fc. В некоторых вариантах осуществления немодифицированная каркасная область человека представляет собой каркас зародышевой линии человека. В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются композиции, которые включают полипептид, где полипептид включает: i) как минимум одну рандомизированную последовательность CDR и ii) вариант области Fc по изобретению. В до- 19012464 полнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются композиции, которые включают полипептид, где полипептид включает: i) немодифицированную каркасную область человека(например, каркас зародышевой линии человека), ii) как минимум одну рандомизированную последовательность CDR и iii) вариант области Fc по изобретению. Настоящее изобретение охватывает терапевтическое и диагностическое применение для моноклональных антител гетерологичных полипептидов, которые включают вариант области Fc по изобретению,раскрытый в данном описании. Описание фигур На фиг. 1 показано схематическое представление молекулы IgG с разметкой различных областей и сегментов. На фиг. 2 показано выравнивание различных исходных последовательностей аминокислот Fc,включая человеческий IgG1 SEQ ID NO:1) показаны аллотипы а и отличные от а), человеческий IgG2(SEQ ID NO:8). На фиг. 3 показаны различные последовательности аминокислот, включая область СН 2 (SEQ IDa, z (SEQ ID NO:12) последовательности человеческого IgG1, которые включают CHl, шарнир, области СН 2 и СН 3. На фиг. 4 показаны различные последовательности аминокислот, которые содержатся в пределах:(а) вариабельной области легкой цепи (LCVR) антитела против CD20 (I) (SEQ ID NO:13); (b) вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) антитела против CD20 (I) (SEQ ID NO:14); (с) LCVR антитела противCD20 (II) (SEQ ID NO:15); и HCVR антитела против CD20 (II) (SEQ ID NO:16). На фиг. 4 е показаны последовательности аминокислот, содержащиеся в пределах вариабельной области антитела против CD20(см. Временную заявку США 60/471958, зарегистрированную 20 мая, 2003 г., и патент США 5843439,оба включены в данное описание). На фиг. 5 а показана полная последовательность аминокислот легкой цепи для антитела AME 133 против CD20. На фиг. 5b показана полная последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи дляAME 133. На фиг. 6 показаны последовательности аминокислот и нуклеиновой кислоты для полной тяжелой цепи трех предпочтительных вариантов антитела АМЕ 133 против CD20. Конкретно, на фиг. 6 а показана последовательность аминокислот полной тяжелой цепи варианта 247I/339Q. На фиг. 6b показана последовательность нуклеиновой кислоты полной тяжелой цепи варианта 247I/339Q. На фиг. 6 с показана последовательность аминокислот полной тяжелой цепи варианта 247I/339D. На фиг. 6d показана последовательность нуклеиновой кислоты полной тяжелой цепи варианта 247I/339D. На фиг. 6 е показана последовательность аминокислот полной тяжелой цепи варианта 378D. На фиг. 6f показана последовательность нуклеиновой кислоты полной тяжелой цепи варианта 378D. Подробное описание изобретения В данных подробном описании и формуле изобретения нумерация остатков аминокислот в тяжелой цепи иммуноглобулина (область Fc) представляет собой нумерацию в соответствии с индексом EC, поof Health, Bethesda, MD (1991). "Индекс ЕС согласно Kabat" относится к нумерации остатков человеческого IgG антитела и отображается в данном описании на фиг. 2. Например, в положении 438 человеческий IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и мышиный IgG3 содержат аминокислоту Q, хотя мышиный IgG1 содержит аминокислоту I, мышиный IgG2a содержит аминокислоту Т, а мышиный IgG2B содержит аминокислоту К. Кроме того, замены в данном описании обозначаются номером положения аминокислоты, в котором производится замена, с последующим обозначением аминокислоты, заменяющей присутствующую в исходной области Fc в том же положении (например, 249G означает замену остатком глицина остатка,который находится в положении 249 исходной области Fc). Номер относится к положению в человеческом IgG1 независимо от того, является ли исходная область Fc человеческим IgG1; если исходная область Fc не является человеческим IgG1, номер относится к гомологичному положению в исходной области Fc, если бы он был выровнен с человеческим IgG1 в этом положении. В данном описании термины "субъект" и "больной" обозначают любое животное, у которого может терапевтически применяться полипептид, который включает вариант области Fc по изобретению, включая человека, а также других млекопитающих (таких как, например, домашние животные (например, собаки, кошки), спортивные животные (например, лошади) и сельскохозяйственные животные (например,коровы, свиньи и овцы, которые могут получить пользу от такой терапии. В данном описании "лечение или профилактика" относится к заболеванию или расстройству, связанному с аномальными уровнями белка, или такому, при котором пациент может получить пользу от изменения активности или уровня белка. Термин изолированный, если он используется в связи с нуклеиновой кислотой, обозначает нуклеиновую кислоту, которая идентифицирована и отделена как минимум от одной загрязняющей нуклеи- 20012464 новой кислоты, с которой она обычно связана в их природном источнике. Изолированная нуклеиновая кислота находится в форме или состоянии, отличном от того, в котором она найдена в природе. Изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, таким образом, отличаются от молекул нуклеиновых кислот,которые существуют в природных клетках. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые рутинно экспрессируют кодируемый ей полипептид, где, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в плазмиде или имеет хромосомную локализацию, отличную от локализации в природных клетках. Изолированная нуклеиновая кислота может находиться в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Если изолированная молекула нуклеиновой кислоты должна использоваться для экспрессии белка, олигонуклеотид или полииуклеотид должен содержать как минимум смысловую или кодирующую цепь, но может содержать и смысловую, и антисмысловую цепи (т.е. может быть двухцепочечным). Молекула нуклеиновой кислоты является "функционально связанной" или "функционально присоединенной", если она расположена в функциональной связи с другой молекулой нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если он воздействует на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если он расположен таким образом, чтобы облегчить трансляцию. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc, является функционально связанной с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный белок (т.е. белок или его функциональный фрагмент, который как таковой в естественных условиях не включает область Fc), если она расположена таким образом, что экспрессируемый слитый белок включает гетерологичный белок или его функциональный фрагмент, присоединенный спереди или сзади к варианту области Fc полипептида; гетерологичный белок может непосредственно соседствовать с вариантом области Fc полипептида или, может быть отделен от него последовательностью линкера любой длины и состава. Сходным образом, молекула полипептида (который используется в данном описании синонимично с "белком") является "функционально связанной" или "функционально присоединенной", если она находится в функциональной связи с другим полипептидом. В данном описании термин "функциональный фрагмент" в отношении полипептида или белка (например, вариант области Fc или моноклональное антитело) относится к фрагментам такого белка, которые сохраняют как минимум одну функцию полноразмерного полипептида. Фрагменты могут варьировать по размеру от шести аминокислот до всей последовательности аминокислот полноразмерного полипептида минус одна аминокислота. Функциональный фрагмент варианта области Fc полипептида по данному изобретению сохраняет как минимум одну "замену аминокислоты", как определено в данном описании. Функциональный фрагмент варианта области Fc полипептида сохраняет как минимум одну функцию, известную в данной области техники, которая связана с областью Fc (например, ADCC, CDC, связывание с рецептором Fc, связывание C1q, негативная регуляция рецепторов на поверхности клетки или может, например, увеличивать in vivo или in vitro период полужизни полипептида, с которым он функционально связан). Термин "очищенный" или "очистка" относится к значительному удалению как минимум одного загрязняющего компонента из образца. Например, антиген-специфичное антитело может быть очищено полным или значительным удалением (как минимум, 90, 91, 92, 93, 94, 95% или более предпочтительно,как минимум, 96, 97, 98 или 99%) как минимум одного загрязняющего неиммуноглобулинового белка; оно может также быть очищено удалением иммуноглобулинового белка, который не связывается с тем же антигеном. Удаление не-иммуноглобулиновых белков и/или удаление иммуноглобулинов, которые не связываются с конкретным антигеном, приводит к увеличению процентного содержания антигенспецифичных иммуноглобулинов в образце. В другом примере полипептид (например, иммуноглобулин), экспрессированный в бактериальных клетках-хозяевах, очищают полным или значительным удалением белков клеток-хозяев; таким образом процент полипептида в образце повышается. Термин природный, если он относится к полипептиду (например, области Fc) в данном описании используется для указания на то, что полипептид имеет последовательность аминокислот, состоящую из последовательности аминокислот полипептида, которая обычно встречается в природе или ее природного полиморфизма. Природный полипептид (например, природная область Fc) может быть произведен рекомбинантными средствами или может быть выделен из природного источника. Термин "вектор экспрессии" в данном описании относится к рекомбинантной молекуле ДНК, содержащей желательную кодирующую последовательность и соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме хозяина. В данном описании термин "клетка-хозяин" относится к любой эукариотной или прокариотной клетке (например, бактериальным клеткам, таким как Е. coli, клеткам СНО, дрожжевым клеткам, клеткам млекопитающих, клеткам птиц, клеткам амфибий, клеткам растений, клеткам рыб и клеткам насекомых),находящейся в условиях in vitro или in situ, или in vivo. Например, клетки-хозяева могут находиться в трансгенном животном. В данном описании "исходный полипептид" представляет собой полипептид, включающий после- 21012464 довательность аминокислот, которая может быть заменена или изменена (например, заменой аминокислоты) для создания варианта (т.е. варианта полипептида). В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает как минимум часть природной или неприродной области Fc, т.е. областиFc природного происхождения или области Fc с как минимум одной модификацией последовательности аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения отдельно охватываются варианты,короче или длиннее, чем исходный полипептид. В особенно предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид отличается по функции (например, повышенная или сниженная эффекторная функция, связывание рецептора, период полужизни in vivo или in vitro и т.д.) по сравнению с вариантом. В данном описании термин "вариант исходного полипептида" относится к полипептиду, который включает последовательность аминокислот, отличающуюся от последовательности исходного полипептида как минимум одной заменой аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления вариант включает как минимум 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% или наиболее предпочтительно как минимум 95, 97 или 99% области Fc (т.е. "часть" области Fc). В предпочтительных вариантах осуществления вариант области Fc исходного полипептида включает как минимум одну замену аминокислоты в исходном полипептиде, причем замена произведена в области Fc. Исходный полипептид может быть природным полипептидом или не быть им. В данном описании термин "область Fc" относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, как показано на фиг. 1). "Область Fc" может быть природной последовательностью области Fc или вариантом области Fc. Хотя общепринятые границы области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, область Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определяется как область,которая простирается от остатка аминокислоты в положении Cys226 или от Pro230, до его карбоксильного конца. В некоторых вариантах осуществления варианты включают только части области Fc и могут включать или не включать карбоксильный конец. Область Fc иммуноглобулина обычно включает два константных домена, СН 2 и СН 3, как показано, например, на фиг. 1. В некоторых вариантах осуществления рассматриваются варианты, содержащие один или более константных доменов. В других вариантах осуществления рассматриваются варианты без таких константных доменов (или только с частями таких константных доменов)."Домен СН 2" области Fc IgG человека (также обозначается как "С 2"домен) обычно простирается от приблизительно аминокислоты 231 до приблизительно аминокислоты 340 (см. фиг. 2). Домен СН 2 является уникальным в том, что не является тесно спаренным с другим доменом. Две N-связанные разветвленные углеводные цепи вставлены между двумя доменами CH2 интактной природной молекулы"Домен СН 3" области Fc IgG человека (также обозначается как "С 3"домен) обычно представляет собой фрагмент, состоящий из остатков, расположенных ближе к С-концу по отношению к СН 2 домену в области Fc, который простирается от приблизительно остатка аминокислоты 341 до приблизительно остатка аминокислоты 447 (см. фиг. 2)."Функциональная область Fc" обладает "эффекторной функцией" области Fc с природной последовательностью. Как минимум, одна эффекторная функция полипептида, который включает вариант области Fc по данному изобретению, может быть усилена или ослаблена по отношению к полипептиду, который включает природную область Fc или исходную область Fc варианта. Примеры эффекторных функций включают, не ограничиваясь ими: связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание с рецептором Fc; зависимую от антитела опосредуемую клетками цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; негативную регуляцию рецепторов на поверхности клетки (например, рецептора В-клеток;BCR) и т.д. Для таких эффекторных функций может быть необходимым, чтобы область Fc была функционально связана с доменом связывания (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оцененить с применением различных тестов (например, анализа связывания Fc, теста ADCC, теста CDC,истощения клеток-мишеней из образцов цельной или фракционированной крови и т.д.)."Природная последовательность области Fc" или "область Fc дикого типа" относится к последовательности аминокислот, идентичной последовательности аминокислот области Fc, которая обычно встречается в природе. Иллюстративные природные последовательности области Fc человека показаны на фиг. 2 и включают природную последовательность области Fc человеческого IgG1 (аллотипы f и a, z,т.е. аллотипы, отличные от А, и А); природную последовательность области Fc человеческого IgG2; природную последовательность области Fc человеческого IgG3; и природную последовательность областиFc человеческого IgG4, a также их природные варианты. Природные последовательности областей Fc мыши также показаны на фиг. 2."Вариант области Fc" включает последовательность аминокислот, которая отличается от природной последовательности области Fc с (или ее фрагмента) посредством как минимум одной "замены аминокислоты", как определено в данном описании. В предпочтительных вариантах осуществления вариант области Fc содержит как минимум одну замену аминокислоты по сравнению с областью Fc с природной последовательностью или областью Fc исходного полипептида, предпочтительно 1, 2, 3, 4 или 5 замен аминокислот в области Fc с природной последовательностью или в области Fc исходного полипептида. В- 22012464 альтернативном осуществлении вариант области Fc может быть создан в соответствии со способами,раскрытыми в данном описании, и этот вариант области Fc может быть слит с выбранным гетерологичным полипептидом, таким как вариабельный домен антитела или полипептид, отличный от антитела,например, доменом связывания рецептора или лиганда. В данном описании термин "производное" в контексте полипептидов относится к полипептиду, который включает последовательность аминокислот, которая была изменена путем введения замены остатка аминокислоты. Термин "производное" в данном описании также относится к полипептиду, который был модифицирован ковалентным присоединением любого вида молекулы к полипептиду. Например, не ограничиваясь перечисленным, антитело может быть модифицировано, например, гликозилированием,ацетилированием, пэгилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитическим расщеплением, присоединением к клеточному лиганду или другому белку и т.д. Производное полипептида может быть получено путем химических модификаций с использованием способов, известных специалистам в данной области техники,включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, присоединение формиата, метаболический синтез туникамицина и т.д. Кроме того, производное полипептида обладает функцией, подобной или идентичной полипептиду, из которого оно было получено. Понятно, что полипептид, который включает вариант области Fc по данному изобретению, может быть производным,как определено в данном описании, предпочтительно дериватизация производится в пределах областиFc. Выражение "в значительной мере человеческого происхождения" в данном описании в отношении полипептида (например, области Fc или моноклонального антитела) указывает на то, что полипептид имеет последовательность аминокислот, которая как минимум на 80%, как минимум, на 85%, более предпочтительно, как минимум, на 90, 91, 92, 93, 94% или даже более предпочтительно, как минимум, на 90, 95, 97, 98 или 99% гомологична последовательности природного человеческого полипептида. Термины рецептор Fc или FcR используются для описания рецептора, который связывается с областью Fc (например, областью Fc антитела). Предпочтительный FcR представляет собой природную последовательность FcR. Более того, предпочтительным FcR является такой, который связывается с IgG антителом (гамма рецептор) и включает рецепторы подклассов FcRI, FcRII, FcRIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы FcRII включаютFcRIIA (активирующий рецептор) и FcRIIB (ингибирующий рецептор), которые имеют сходные последовательности аминокислот, отличающиеся в основном в цитоплазматических доменах рецептора.FcRs рассмотрены в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel, et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другой предпочтительный FcR включает рецептор новорожденных, FcRn, который ответственен за перенос иммуноглобулинов IgG матери плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994. Другие FcRs, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, охватываются термином "FcR" в данном описании. Выражения "зависимая от антител клеточно-опосредованная цитотоксичность" и "ADCC" относятся к клеточно-опосредованной реакции, в ходе которой неспецифические цитотоксические клетки (например, неспецифические), которые экспрессируют FcRs (например, природные клетки-киллеры ("NK"),нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и далее вызывают лизис клеток-мишеней. Основные клетки, опосредующие ADCC, клетки NK, экспрессируют только FcRIII,тогда как моноциты экспрессируют FcRI, FcRII и FcRIII. В данном описании выражение "эффекторные клетки" относится к лейкоцитам (предпочтительно,человеческим), которые экспрессируют один или более FcRs и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют как минимум FcRIII и выполняют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов, которые опосредуют ADCC, включают РВМС, клетки NK, моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника(например, из крови или РВМС). Вариант полипептида с "измененным" сродством связывания FcRn представляет собой вариант либо с усиленным (т.е. увеличенным, более высоким или повышенным), либо ослабленным (т.е. уменьшенным, сниженным или более низким) сродством связывания FcRn по сравнению с исходным вариантом полипептида или с полипептидом, который включает природную область Fc, измеренным при рН 6,0. Вариант полипептида, который демонстрирует повышенное связывание или повышенное сродство связывания с FcRn, связывает FcRn с более высоким сродством, чем исходный полипептид. Вариант полипептида, который демонстрирует сниженное связывание или сниженное сродство связывания с FcRn,связывает FcRn с более низким сродством, чем исходный полипептид. Варианты полипептида, которые демонстрируют сниженное сродство связывания с FcRn, могут обладать низким или незначительным связыванием с FcRn, например, 0-20% связывания с FcRn в сравнении с исходным полипептидом. Вариант полипептида, который связывает FcRn с "повышенным сродством" по сравнению с исходным полипептидом, представляет собой такой полипептид, который связывает FcRn с более высоким сродством связывания, чем исходный полипептид, когда количества варианта полипептида и исходного полипепти- 23012464 да при тестировании связывания по существу являются одинаковыми, и все другие условия являются идентичными. Например, вариант полипептида с повышенным сродством связывания FcRn может проявлять от приблизительно 1,10-кратного до приблизительно 100-кратного (более типично, от приблизительно 1,2-кратного до приблизительно 50-кратного) повышения сродства связывания FcRn в сравнении с исходным полипептидом, где сродство связывания FcRn определяют, например, в тесте ELISA или другим способом, доступным специалисту в данной области техники. В данном описании "замена аминокислоты" относится к замене как минимум одного существующего остатка аминокислоты в данной последовательности аминокислот другим заменяющим остатком аминокислоты. Заменяющий остаток или остатки, могут быть "природными остатками аминокислот"(т.е. такими, которые кодируются генетическим кодом), выбранными из аланина (Ala); аргинина (Arg); аспарагина (Asn); аспарагиновой кислоты (Asp); цистеина (Cys); глутамина (GIn); глутаминовой кислоты(Glu); глицина (Gly); гистидина (His); изолейцина (Ile); лейцина (Leu); лизина (Lys); метионина (Met); фенилаланина (Phe); пролина (Pro); серина (Ser); треонина (Thr); триптофана (Trp); тирозина (Tyr); и валина (Val). Замещение одним или более остатками неприродных аминокислот также охватывается определением замены аминокислоты в данном описании. "Не встречающийся в природе остаток аминокислоты" относится к остатку, который отличается от встречающихся в природе остатков аминокислот, перечисленных выше, который способен ковалентно связываться со смежным остатком(ами) аминокислот в полипептидной цепи. Примеры остатков не встречающихся в природе аминокислот включают норлейцин, омитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги остатков аминокислот, такие как описаные Ellman etal. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991). Термин "сигнал теста" относится к результирующему показателю любого способа обнаружения белок-белкового взаимодействия, включая, но не ограничиваясь ими, измерения поглощения при колориметрических тестах, интенсивности флуоресценции или распадов в минуту. Форматы анализа могут включать ELISA, FACS или другие методы. Изменение "сигнала теста" может отражать изменение жизнеспособности клеток и/или изменение в кинетике обратной реакции, прямой реакции обоих показателей. "Более высокий сигнал теста" относится к измеренному числовому значению результирующего показателя, большему чем другое числовое значение (например, вариант может иметь более высокое(большее) измеренное значение в тесте ELISA в сравнении с исходным полипептидом). "Пониженный" сигнал теста относится к измеренному числовому значению результирующего показателя, более низкому, чем другое числовое значение (например, вариант может иметь более низкое (меньшее) измеренное значение в тесте ELISA в сравнении с исходным полипептидом). Термин "сродство связывания" относится к равновесной константе диссоциации (выраженной в единицах концентрации), ассоциированной с каждым взаимодействием при связывании Fc рецептор-Fc. Сродство связывания непосредственно относится к соотношению кинетической скорости обратной реакции (обычно регистрируемой в единицах, обратных времени, например, секунды-1), деленной на кинетическую скорость прямой реакции (обычно регистрируемую в единицах концентрации на единицу времени, например, молярность/секунду). Обычно нельзя однозначно утверждать, являются ли изменения равновесных констант диссоциации следствием отличий в скорости прямой реакции, скорости обратной реакции или обоих показателей, за исключением случая, когда каждый из этих параметров определяется экспериментально (например, измерениями с помощью BIACORE или SAPIDYNE). В данном описании "шарнирная область" относится к участку аминокислот в человеческом IgG1,который простирается от Glu216 до Pro230 человеческого IgG1. Шарнирные области других изотиповIgG могут быть выравнены с последовательностью IgG1 размещением первого и последнего остатков цистеина, образующих S-S связи между тяжелыми цепями в одних и тех же положениях."C1q" представляет собой полипептид, который включает сайт связывания для области Fc иммуноглобулина. C1q вместе с двумя сериновыми протеазами, C1r и C1s, образует комплекс C1, первый компонент пути CDC. В данном описании термин "антитело", который используется взаимозаменяемым образом с термином "иммуноглобулин" или "Ig", используется в самом широком смысле и особенно охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела,мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, до тех пока они проявляют желательную биологическую активность или функциональную активность. Одноцепочечные антитела, гибридные, человеческие и гуманизированные или приматизированные (CDRпривитые) антитела, а также гибридные или CDR-привитые одноцепочечные антитела и т.п., включая части, полученные от различных видов, также охватываются настоящим изобретением и термином "антитело". Различные части таких антител могут быть соединены вместе химически с помощью традиционных способов, синтетическим путем или могут быть получены как смежный белок с использованием генно-инженерных способов. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие гибридную или гуманизированную цепь, могут быть экспрессированы для получения смежного белка, см., например, патент США 4816567; Европейский патент 0125023 В 1; патент США 4816397; Европейский патент 0120694 B1; WO 86/01533; Европейский патент 0194276 В 1; патент США 5225539; Европейский патент 0239400 В 1 и патенты США 5585089 и 5698762. См. также, Newman, R. et al. BioTechnol- 24012464ogy, 10:1455-1460, 1993, относительно приближенных к приматным антител, и Ladner et al., патент США 4946778, а также Bird, R.E. et al., Science, 242:423-426, 1988, относительно одноцепочечных антител. Понятно, что все формы антител, которые включают область Fc (или ее часть) охватываются в данном описании в пределах термина "антитело". Кроме того, антитело может быть помечено обнаружимой меткой, закреплено на твердой фазе и/или конъюгировано с гетерологичным соединением (например, ферментом или токсином) в соответствии со способами, известными в данной области техники. В данном описании термин "фрагменты антител" относится к части интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, не ограничиваясь ими, линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; пептиды Fc или Fc', Fab и фрагменты Fab, a также мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагменты антител предпочтительно сохраняют как минимум часть шарнирной области и необязательно область СН 1 тяжелой цепи IgG. В других предпочтительных вариантах осуществления фрагменты антитела включают как минимум часть области СН 2 или полностью область СН 2. В данном описании термин "функциональный фрагмент", если он используется в отношении моноклонального антитела, предназначен для обозначения части моноклонального антитела, которая все еще сохраняет функциональную активность. Функциональная активность может представлять собой, например, антиген-связывающую активность или специфичность, рецептор-связывающую активность или специфичность, активность эффекторной функции и т.п. Функциональные фрагменты моноклонального антитела включают, например, отдельные тяжелые или легкие цепи и их фрагменты, такие как VL, VH иal., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) и in Day,E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). Термин функциональный фрагмент предназначен для включения, например, фрагментов, образованных путем расщепления протеазой или восстановления моноклонального антитела, а также с помощью способов рекомбинации ДНК, известных специалистам в данной области техники. В данном описании термин "фрагмент" относится к полипептиду, который включает последовательность аминокислот как минимум из 5, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 90, 100 или более остатков аминокислот смежной последовательности аминокислот другого полипептида. В предпочтительном осуществлении фрагмент пептида сохраняет как минимум одну функцию полноразмерного полипептида. В данном описании термин "гибридное антитело" включает одновалентные, двухвалентные или многовалентные иммуноглобулины. Одновалентное гибридное антитело представляет собой димер, образованный гибридной тяжелой цепью, связанной с помощью дисульфидных мостиков с гибридной легкой цепью. Двухвалентное гибридное антитело представляет собой тетрамер, образованный из двух димеров тяжелая цепь-легкая цепь, связанных с помощью как минимум одного дисульфидного мостика. Гибридная тяжелая цепь антитела для использования у человека включает связывающую антиген область, происходящую из тяжелой цепи отличного от человеческого антитела, которая связана как минимум с частью константной области человеческой тяжелой цепи, такой как CH1 или СН 2. Гибридная легкая цепь антитела для использования у человека включает связывающую антиген область, происходящую из легкой цепи отличного от человеческого антитела, связанную как минимум с частью константной области человеческой легкой цепи (CL). Антитела, фрагменты или производные, содержащие гибридные тяжелые цепи и легкие цепи с такой же или другой специфичностью связывания вариабельной области, могут также быть получены соответствующим объединением полипептидных отдельных цепей,в соответствии со стадиями известного способа. При таком подходе, хозяев, экспрессирующих гибридные тяжелые цепи, культивируют отдельно от хозяев, экспрессирующих гибридные легкие цепи, и цепи иммуноглобулина отдельно извлекают, а затем объединяют. Альтернативно, хозяева могут культивироваться совместно, и цепям дают объединяться самопроизвольно в среде культивирования, с последующим извлечением собранного иммуноглобулина или фрагмента, или обе цепи - легкую и тяжелую - можно экспрессировать в одной и той же клетке-хозяине. Способы получения гибридных антител известны в данной области техники (см., например, патенты США 6284471; 5807715; 4816567 и 4816397). В данном описании "гуманизированные" формы отличных от человеческих (например, мышиных) антител (т.е. гуманизированные антитела) представляют собой антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из отличного от человеческого иммуноглобулина, или такая последовательность отсутствует. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело реципиента), где остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области видов, отличных от человека (антитело донора),таких как мышь, кролик или негуманоидный примат, имеющими желательные специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками, отличными от человеческих. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаружены в антителе реципиента или антителе донора. В общем, такие модификации осуществляют для дальнейшего улучшения функциональности антитела.- 25012464 Обычно, гуманизированное антитело включает в значительной мере все из как минимум одного, обычно из двух вариабельных доменов, где все или в значительной мере все гипервариабельные петли (CDR) соответствуют таковым отличного от человеческого иммуноглобулина и все или в значительной мере все остатки FR являются остатками последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может включать, как минимум, часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. Пример способа, который используется для создания гуманизированных антител, описан в патенте США 5225539. В данном описании термин "иммуноадгезин" обозначает антитело-подобные молекулы, которые сочетают домен связывания гетерологичного белка "адгезина" (например, рецептора, лиганда или фермента) с константным доменом иммуноглобулина. Структурно, иммуноадгезины включают слияние аминокислотной последовательности адгезина с желательной специфичностью связывания, которая отличается от сайта распознавания и связывания антигена (сайт объединения антигена) антитела (т.е. является "гетерологичной"), с последовательностью константного домена иммуноглобулина. В данном описании термин "домен связывания лиганда относится к любому природному рецептору или любой его области или производному, которые сохраняют, как минимум, качественно лигандсвязывающую способность соответствующего природного рецептора. В некоторых вариантах осуществления рецептор представляет собой полипептид клеточной поверхности, который содержит внеклеточный домен, являющийся гомологичным члену надсемейства иммуноглобулинов. Другие рецепторы, которые не являются членами надсемейства иммуноглобулинов, но тем не менее конкретно охватываются данным определением, представляют собой рецепторы для цитокинов, и в особенности, рецепторы с тирозинкиназной активностью (рецепторные тирозинкиназы), члены надсемейств рецепторов гематопоэтина и фактора роста нервов и молекулы клеточной адгезии (например, Е-, L- и Р-селектины). В данном описании термин "домен связывания рецептора" относится к любому природному лиганду для рецептора, включая, например, молекулы клеточной адгезии, или любому участку или производному такого природного лиганда, сохраняющему, как минимум, качественную способность связывания рецептором соответствующего природного лиганда. В данном описании термин гибрид антитело-иммуноадгезин включает молекулу, которая объединяет как минимум один домен связывания антитела с как минимум одним иммуноадгезином. Примеры включают, не ограничиваясь ими, биспецифичные гибриды CD4-IgG, описанные в Berg et al., PNAS(USA) 88:4723-4727 (1991) и Charnow et al., J. Immunol., 153:4268 (1994). В данном описании "изолированный" полипептид представляет собой такой полипептид, который идентифицирован и отделен и/или извлечен из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые мешали бы диагностическому или терапевтическому использованию полипептида и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления изолированный полипептид очищается (1) более чем на 95 мас.% полипептидов, что определяют по методуLowry, и предпочтительно более чем на 99 мас.%, (2) до степени, достаточной, чтобы получить как минимум 15 остатков N-концевой или внутренней последовательности аминокислот путем использования секвенатора с вращающейся чашей, или (3) до однородности с помощью метода SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания кумасси синим или серебром. Изолированный полипептид включает пслипептид in situ в пределах рекомбинантных клеток,поскольку как минимум один компонент естественного окружения полипептида должен отсутствовать. Обычно, однако, изолированный полипептид получают с использованием как минимум одной стадии очистки. В данном описании термин "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам. Субъекты или больные, которые нуждаются в лечении,включают пациентов, у которых уже возникло расстройство, а также тех, у кого расстройство должно быть предупреждено. В данном описании термины "расстройство" и "заболевание", которые используются взаимозаменяемым образом, обозначают любое состояние, при котором пациент может получить пользу от лечения вариантом полипептида (полипептидом, который включает вариант области Fc по изобретению), включая хронические и острые расстройства или заболевания (например, патологические состояния, которые способствуют возникновению у пациента конкретного расстройства). В некоторых вариантах осуществления расстройство представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления термин "аутоиммунное заболевание", который используется взаимозаменяемым образом с термином "аутоиммунное расстройство", применяется для обозначения состояния у субъекта, которое характеризуется повреждением клеток, ткани и/или органа, вызванным иммунологической реакцией субъекта по отношению к его собственным клеткам, тканям и/или органам. Термин "воспалительное заболевание", который используется взаимозаменяемым образом с термином "воспалительное расстройство", применяется для обозначения состояния у субъекта, которое характеризуется воспалением. Аутоиммунные расстройства могут быть связаны с воспалением или не связаны с ним. Более того, воспаление может быть или не быть вызвано аутоиммунным расстройством. Определенные расстройства могут быть охарактеризованы и как аутоим- 26012464 мунные, и как воспалительные расстройства. В данном описании термины "рак" и "раковый" обозначают или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется неупорядоченным ростом клеток. Примеры рака включают, не ограничиваясь ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы,рак ободочной кишки, рак колоректальной области, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы,карциному печени и различные виды рака головы и шеи. В данном описании термин "метка" относится к выявляемым соединению или композиции, которые непосредственно или непрямым способом конъюгируют с полипептидом. Метка может обнаруживаться сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментной метки, может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которое может быть обнаружено. В данном описании термин "рецептор" относится к полипептиду, который способен связываться как минимум с одним лигандом. Предпочтительный рецептор представляет собой рецептор на поверхности клетки или растворимый рецептор, имеющий внеклеточный лигандсвязывающий домен и, необязательно, другие домены (например, трансмембранный домен, внутриклеточный домен и/или мембранный якорь). Рецептор, который оценивают с помощью теста, раскрытого в данном описании, может быть интактным рецептором, его фрагментом или производным (например, слитым белком, который включает домен связывания рецептора, слитый с одним или более гетерологичными полипептидами). Более того,рецептор, который оценивают на предмет его связывающих свойств, может находиться в клетке или быть изолированным, и необязательно им может быть покрыт планшет для анализа или некоторая другая твердая фаза, или он может быть меченным непосредственно и использоваться как зонд. В данном описании термин "заболевание, которое реагирует на антитело" относится к любому заболеванию или медицинскому состоянию, для которого показано лечебное действие, по крайней мере,частичное, терапией антителами. Примеры таких заболеваний и медицинских состояний включают, не ограничиваясь ими, лимфому (показано лечение с помощью RITUXAN), инфекционное заболевание(респираторный синцитиальный дыхательный вирус, показано лечение с помощью SYNAGIS), пересадку почки (показана полезность ZENAPAX), болезнь Крона и ревматоидный артрит (показано лечение с помощью REMICADE), карциному молочной железы (показано лечение с помощью HERCEPTIN) и рак ободочной кишки (показано лечение с помощью EDRECOLOMAB). В данном описании термин заболевание, которое реагирует на иммуноадгезин относится к любому заболеванию или медицинскому состоянию, для которого показано лечение, по крайней мере, частичное, терапией иммуноадгезином. В данном описании вариант полипептида, который "опосредует зависящую от антител клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более эффективно", чем исходное антитело, представляет собой вариант полипептида, который in vitro или in vivo в значительной мере более эффективен в опосредовании ADCC, когда количества варианта полипептида и исходного антитела, которые используются в тесте, в значительной мере являются одинаковыми. Например, такой вариант вызывает лизис большего количества клеток-мишеней в данном анализе ADCC,чем исходный полипептид в идентичном анализе ADCC. Такие варианты могут быть идентифицированы,например, с применением теста ADCC, но другие анализы или способы определения активности ADCC также могут применяться (например, модели на животных). В предпочтительных вариантах осуществления вариант полипептида приблизительно в 1,2, 1,3 или 1,4 раза, 1,5 раза, 50 раз, 100 раз, приблизительно 500 раз или приблизительно в 1000 раз более эффективен в опосредовании ADCC, чем исходный полипептид. Термин симптомы заболевания, которое реагирует на антитело или иммуноадгезин относится к симптомам, обычно связанным с конкретным заболеванием. Например, симптомы, обычно связанные с болезнью Крона, включают боль в животе, диарею, ректальное кровотечение, снижение массы тела, лихорадку, снижение аппетита, дегидратацию, анемию, вздутие, фиброз, воспаление кишечника и недоедание. Фраза "в таких условиях, что симптомы уменьшаются" относится к любой степени качественного или количественного уменьшения выявляемых симптомов любого заболевания, которое реагирует на антитело или иммуноадгезин, включая, но не ограничиваясь ими, выявляемое влияние на скорость выздоровления от заболевания (например, скорость увеличения массы тела) или уменьшение как минимум одного из симптомов, которые обычно сопровождают конкретное заболевание (например, если заболевание, которое реагирует на антитело или иммуноадгезин, было болезнью Крона, уменьшение как минимум одного из следующих симптомов: боли в животе, диареи, ректального кровотечения, снижения массы тела, лихорадки, снижения аппетита, дегидратации, анемии, вздутия, фиброза, воспаления кишечника и недоедания).- 27012464 Моноклональные антитела и рецепторы Полноразмерное антитело ("иммуноглобулин" или "Ig"), найденное в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех пептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей (приблизительно 50-70 кДа при полном размере) и двух легких (L) цепей (приблизительно 50-70 кДа при полном размере), связанных между собой дисульфидными связями. Амино-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область, состоящую приблизительно из 100-110 аминокислот или более, в основном ответственную за распознавание антигена. Карбокси-концевая часть каждой цепи определяет константную область, в основном ответственную за эффекторную функцию. Легкие цепи классифицированы как каппа или лямбда и характеризуются специфической константной областью. Тяжелые цепи классифицированы как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон и определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется специфической константной областью. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (в данном описании "HCVR") и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи включает три домена (CH1,CH2 и СН 3) для IgG, IgD и IgA; и 4 домена (CH1, СН 2, СН 3 и CH4) для IgM и IgE. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в данном описании "LCVR") и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи включает один домен, CL. Области HCVR и LCVR могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, названные областями, определяющими комплементарность (CDR), перемежаемые областями, которые являются более консервативными,и которые названы каркасными областями (FR). Каждый HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырехFR, расположенных от амино-конца в направлении карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1,FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Отнесение аминокислот к каждому домену производится в соответствии с хорошо известными договоренностями [например, Kabat, "Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]. Функциональная способность антитела к связыванию специфического антигена определяется совместно шестью CDR. Однако даже один вариабельный домен, который включает только три CDR, специфичных для антигена, сам по себе может быть способен распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем полный Fab. Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, методов гибридомы, хорошо известных в данной области техники, а также, рекомбинантной технологии,технологии дисплея фага, синтетических технологий или комбинаций таких технологий, хорошо известных в данной области техники. Термин "моноклональное антитело" в данном описании не ограничивается антителами, полученными с помощью технологии гибридомы. "Моноклональное антитело" относится к антителу, которое происходит из одной копии или клона, включая например, любой эукариотный, прокариотный или фаговый клон, а не к способу, которым оно получено. "Моноклональное антитело" может быть интактным (полным или полноразмерным) антителом, в значительной мере интактным антителом,функциональным фрагментом антитела или оно может быть гибридным антителом, человеческим антителом или гуманизированным антителом. Популяция "моноклональных антител" относится к гомогенной или в значительной мере гомогенной (или чистой) популяции антитела, т.е. как минимум приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, более предпочтительно как минимум приблизительно 97 или 98% или наиболее предпочтительно как минимум 99% антител в популяции являются идентичными и должны конкурировать в тесте ELISA за один и тот же антиген или эпитоп. Термин "специфически связывается" или "предпочтительно связывается" в данном описании относится к ситуации, где один член пары специфического связывания не связывается в значительной мере с молекулами, отличными от специфического связывающего партнера(ов). Термин применим также к ситуациям, где, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфическим для конкретного эпитопа, который присутствует на ряде антигенов, и в этом случае конкретное антитело,несущее антигенсвязывающий домен, будет способно связываться с различными антигенами, несущими эпитоп. Область Fc относится к части интактного антитела, например, IgG, образованной в результате расщепления ферментом папаином (см. фиг. 1). Область Fc представляет собой гомодимер, где каждая цепь включает часть шарнирной области, а также домены СН 2 и СН 3. Область Fc представляет собой димер,образованный благодаря межцепочечным дисульфидным мостикам между шарнирными областями и множественным нековалентным связям между доменами СН 3. IgG представляет собой самый обширный класс Ig в организме, который составляет приблизительно 75% от общего количества иммуноглобулинов и в равной мере распределен между внутрисосудистым и внесосудистым пулами. Очень мало IgG вырабатывается на ранних стадиях первичной реакции на антиген, но он представляет собой основную форму антитела, вырабатываемого в ходе вторичной реакции. Как описано выше, антитела содержат области, в основном области СН 2 и СН 3, которые принимают участие в функциях, отличных от связывания антигенов. Взятые вместе, эти области и часть последовательности линкера в общем известны как область Fc и выполняют несколько эффекторных функций,опосредуемых связыванием эффекторных молекул.- 28012464 Эффекторные функции, опосредованные областью Fc антитела, могут быть разделены на две категории: (1) эффекторные функции, которые выполняются после связывания антитела с антигеном (такие функции включают, например, участие каскада комплемента или содержащих рецептор Fc (FcR)- клеток); и (2) эффекторные функции, которые выполняются независимо от связывания антигена (эти функции обеспечивают, например, постоянное присутствие в кровотоке и способность переноса через клеточные барьеры путем трансцитоза). Например, связывание компонента C1q комплемента с антителами активирует систему комплемента. После опсонизации активация комплемента играет важную роль в лизисе клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительную реакцию и может также быть вовлечена в аутоиммунные реакции гиперчувствительности. Кроме того, антитела связываются с клетками через область Fc, причем сайт связывания Fc с рецептором расположен в области Fc антитела, которая связывается с FcR на клетке. Существует большое количество FcR, которые являются специфичными для антител различных классов, включая IgG, IgE, IgA и IgM. Хотя данное изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом, связывание антитела с FcR на поверхности клеток запускает множество важных и разнообразных биологических реакций, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клеток-мишеней клетками-киллерами (ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, плацентарный перенос и контроль выработки иммуноглобулина. Несколько эффекторных функций антитела опосредуются FcRs, которые связываются с областьюFc антитела. FcRs определяются их специфичностью для изотипов иммуноглобулина; рецепторы Fc для антител IgG обозначают как FcR, для IgE как FcR, для IgA как FcR и т.д. Идентифицированы три подкласса FcR: FcRI (CD64), FcRII (CD32) и FcRIII (CD16). Поскольку каждый подкласс FcR кодируется двумя или тремя генами, а альтернативный сплайсинг РНК приводит к множественным транскриптам, существует широкое разнообразие изоформ FcR. Три гена, кодирующие подкласс FcRI (FcRIA, FcRIB и FcRIC) сосредоточены в области Iq21.1 длинного плеча хромосомы 1; гены, кодирующие FcRII изоформы (FcRIIA, FcRIIB и FcRIIC), и два гена, кодирующие FcRIII(FcyRIIIA и FcyRIIIB) , сосредоточены в области Iq22. Эти различные подтипы FcR экспрессируются на различных видах клеток (например, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991. Например,у человека FcRIIIB найден только на нейтрофилах, тогда как FcRIIIA найден на макрофагах, моноцитах, клетках NK и субпопуляции Т-клеток. Следует отметить, что FcRIIIA присутствует на клетках NK,одном из видов клеток, принимающих участие в ADCC. Человеческий рецептор FcRIIIA (CD16) обладает распространенным полиморфизмом в положении 158 во внеклеточном домене, который кодирует или фенилаланин, или валин в этом положении. АллельV FcRIHA имеет более высокое сродство к IgG1 человека, чем аллель F. Аллель V158 также опосредуетADCC более эффективно. Данные клинических исследований показали корреляцию между генотипом рецептора FcRIIIA у больных, получавших лечение ритуксаном (Rituxan) и терапевтическим эффектом. Показано, что и клинический, и молекулярный ответы и период до прогрессирования заболевания, были лучшими у больных, гомозиготных по генотипу FcRIIIA-158V (приблизительно 20% населения). И наоборот, больные, гетерозиготные или гомозиготные по генотипу FcRIIIA-158F с более низкой аффинностью (приблизительно 80% населения) отвечают хуже. Эти данные указывают на то, что мутации Fc, которые усиливают активность ADCC носителей 158F, могут усиливать клиническую эффективность лечения рака с помощью антител. Генетический полиморфизм также присутствует в рецепторе FcRIIA(CD32) человека в положении 131 во внеклеточном домене, который кодирует или гистидин (Н), или аргинин (R) в этом положении. Обнаружено, что полиморфизм в положении 131 влияет на способность связываться с человеческим IgG. Недавние данные также показывают корреляцию между полиморфизмом FcRIIA в положении 131 и клиническим ответом на ритуксан. Больные, гомозиготные по аллели Н 131, давали значительно более высокий показатель ответа, чем 2 другие группы.FcRI, FcRII и FcRIII представляют собой рецепторы надсемейства иммуноглобулинов (IgSF);FcRI содержит три домена IgSF во внеклеточном домене, тогда как FcRII и FcRIII содержат только дваIgSF домена в своих внеклеточных доменах. Другой тип рецептора Fc представляет собой рецептор Fc новорожденных (FcRn). FcRn является структурно сходным с основным комплексом гистосовместимости (МНС) и состоит из -цепи, нековалентно связанной с 2-микроглобулином. Варианты области Fc В настоящем изобретении предлагаются варианты полипептида, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты полипептида, а также способы создания вариантов полипептида. Предпочтительно, варианты полипептида по настоящему изобретению отличаются от исходного полипептида как минимум одной аминокислотной модификацией, предпочтительно аминокислотной заменой. "Исходный", "дикого типа", "начальный" или "невариантный" полипептид предпочтительно включает как минимум часть области Fc антитела, и аминокислотная замена в варианте полипептида имеет место в области Fc. Исходный полипептид, включающий область Fc, может быть получен с применением спосо- 29012464 бов, доступных в данной области техники для создания полипептидов, включающих область Fc или его часть. В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид представляет собой антитело. Исходный полипептид может, однако, быть любым другим полипептидом, который включает как минимум часть области Fc (например, иммуноадгезином). Часть области Fc в исходном полипептиде может представлять собой природную или неприродпую последовательность, предпочтительно она представляет собой природную последовательность человеческого происхождения. В некоторых вариантах осуществления вариант области Fc может быть создан (например, в соответствии со способами, раскрытыми в данном описании) и может быть слит с выбранным гетерологичным полипептидом, таким как вариабельный домен антитела или домен связывания рецептора или лиганда или любой терапевтический полипептид. В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает область Fc или ее функциональную часть. Обычно область Fc исходного полипептида должна включать область Fc с природной последовательностью, и предпочтительно природную последовательность области Fc человека. Однако область Fc исходного полипептида может содержать одну или более предварительно существовавших изменений или модификаций (например, замен аминокислот) в сравнении с природной последовательностью области Fc. Например, C1q-связывающая активность области Fc может быть предварительно изменена или FcR связывающая активность области Fc может быть изменена. Могут быть сконструированы желательный вариант области Fc или нуклеиновая кислота, кодирующая целевой вариант области Fc, без функционального присоединения к желательному партнеру слияния варианта области Fc(например, вариабельной области антитела, гетерологичному белку) и затем функционально связан с ним. В дополнительных вариантах осуществления исходная область Fc полипептида является концептуальной (например, воображаемым продуктом размышлений или визуальным представлением на компьютере или на бумаге) и, хотя он физически не существует, конструктор антител может выбрать желательный вариант последовательности аминокислот области Fc и создать полипептид, включающий такую последовательность, или ДНК, кодирующую желательный вариант последовательности аминокислот области Fc. Однако в предпочтительных вариантах осуществления доступна нуклеиновая кислота, кодирующая область Fc исходного полипептида, и данную последовательность нуклеиновой кислоты изменяют для создания варианта последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант области Fc. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант исходного полипептида (или просто вариант областиFc), может быть получена способами, известными в данной области техники, с использованием указаний данной спецификации для конкретных последовательностей. Такие способы включают, не ограничиваясь ими, получение путем сайт-специфичного (или олигонуклеотид-опосредованного) мутагенеза, ПЦР мутагенеза (например, Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989 и кассетного мутагенеза (например,Wells et al., Gene 34:315-323 (1985 ранее полученной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Сайт-специфичный мутагенез представляет собой предпочтительный способ получения вариантов. Данный способ хорошо известен в данной области техники (см., например, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) и Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987. Альтернативно или дополнительно, желательная последовательность аминокислот, кодирующая вариант полипептида, может быть определена, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая такой вариант аминокислотной последовательности полипептида (т.е. полипептида, который включает вариант области Fc, который включает замену аминокислоты, описанную в данном описании), может быть создана синтетическим путем. Она все еще рассматривается как вариант области Fc исходной области Fc, даже если исходная область Fc не была молекулярным предшественником варианта области Fc,но вместо этого последовательность аминокислот области Fc присутствовала в исходном варианте в отсутствие желательной замены аминокислоты. Последовательность аминокислот исходного полипептида может быть модифицирована для того,чтобы создать вариант области Fc с измененной аффинностью связывания Fc рецептором или активностью in vitro и/или in vivo и/или измененной активностью ADCC in vitro и/или in vivo и/или измененной активностью CDC in vitro и/или in vivo. Последовательность аминокислот исходного полипептида также может быть модифицирована для того, чтобы создать вариант области Fc с измененными свойствами связывания комплемента и/или периодом полужизни в кровотоке. Значительные модификации биологических свойств области Fc могут достигаться путем выбора аминокислотных замен, которые значительно различаются по действию на изменение (а) структуры скелета полипептида в области замены, например, в качестве складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте или объема боковой цепи, (d) взаимодействия с углеводом или (е) гибкости движений домена. Остатки природного происхождения делят на классы на базе общих свойств боковой цепи:(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и