Моноклональные антитела человека, полученные из в-клеток человека и обладающие нейтрализующей активностью против вирусов гриппа а

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ В-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ОБЛАДАЮЩИЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ВИРУСОВ ГРИППА А Изобретение относится к моноклональным антителам человека, полученным из В-клеток человека,присутствующих в крови пациентов, выздоровевших после инфицирования вирусами гриппа А,при этом указанные антитела обладают нейтрализующей активностью против вирусов гриппа А. Указанные моноклональные антитела против вируса гриппа А согласно настоящему изобретению обладают связывающей и нейтрализующей активностью против по крайней мере одного вируса гриппа А, выбранного из группы, состоящей из подтипов H1, Н 2 и Н 5 вируса гриппа А, и, таким образом, являются полезными для профилактики и лечения заболевания, вызванного указанным вирусом гриппа А, а также для диагностики инфекции вируса гриппа А. Шин Джае Чанг, Джонг Мук Ким,Кые Сук Йи, Хыун Джу Ли (KR) Харченко Е.А. (RU) Область техники Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам человека, полученным из В-клеток человека и присутствующим в крови пациентов, выздоровевших после инфекции, вызванной вирусами гриппа А, при этом указанные моноклональные антитела обладают нейтрализующей активностью против вирусов гриппа А. Предшествующий уровень техники Грипп, являющийся заболеванием, обусловленным респираторной инфекцией с вирусами гриппа,часто случается зимой. Известно, что он обладает очень высокой инфективностью и поражает все возрастные группы, особенно людей старшего возраста (Treanor J., 2004, N. Engl. J. Med. 350(3):218-20). Вирус гриппа является вирусом с антисмысловой РНК (рибонуклеиновой кислотой), заключнной в оболочку, принадлежащим к семейству Orthomyxoviridae. Он содержит восемь сегментов одноцепочечной РНК и классифицируется по типам А, В и С. Вирусы гриппа типа А далее подразделяются на подтипы на основании их главных поверхностных белков гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). К настоящему времени идентифицированы 16 белков HA и 9 белков NA (Cheung T.K. and Poon L.L., 2007, AnnNY, Acad. Sci. 1102:1-25). Вирусы гриппа имеют широкое распространение, включая птиц, свиней и человека, в зависимости от их типов и содержат геном, состоящий из сегментированных молекул РНК. По этой причине вирусы гриппа могут постоянно мутировать и рекомбинировать с образованием новых генетических вариаций (Treanor J., 2004. N. Engl. J. Med. 350(3):218-20). По этой причине трудно получить постоянный иммунитет против вирусов гриппа. Наиболее эффективным профилактическим способом,использующимся в настоящее время, является вакцинация против каждого из конкретных вирусов гриппа, которые, как ожидается, будут распространены. Вакцины против гриппа получают главным образом с использованием яиц, но этот способ является неэффективным, поскольку требуется значительный период времени. Соответственно, недостатком этого способа является то, что трудно получать значительные количества вирусов каждый год в течение ограниченного временного промежутка. Для устранения этого недостатка в нескольких фармацевтических компаниях (GSK, Baxter et al.) активно проводились исследования по разработке способов получения вакцин в культурах клеток. К тому же очень сложно быстро разработать вакцины против вируса пандемического гриппа, когда случается такая пандемическая инфекция. Также противовирусные препараты не являются полностью наджными из-за проблем, связанных с появлением мутантных вирусов, обладающих устойчивостью. Для устранения этого недостатка в последнее время активно разрабатывались антитела против вирусов гриппа для терапевтических целей (Throsby et al., 2008, PloS One 3 (e3942); Suiet al., 2009, Nature structuralmolecular biology. 16 (265-273); Simmons et al., 2007, PloS Medicine, 4(el 78. Продукты крови, полученные от выздоровевших пациентов, использовали для лечения пациентов инфицированных различными вирусами, а также для лечения пандемических инфекций гриппа. Например, когда у пациентов, инфицированных вирусом испанского гриппа, были симптомы пневмонии, продукты кровы, полученные от пациентов, выздоровевших после инфицирования гриппом, использовали для лечения указанного гриппа (Luke et al., 2006. Annals of internal medicine. 145:599). По существу,гипериммунный глобулин (IgIv) выделяли из плазмы человека и использовали для лечения пациентов,инфицированных различными вирусами, но указанный продукт, полученный как описано выше, может быть небезопасным из-за потенциальных инфекционных агентов в крови и неприемлем для массового производства. В-клетки человека используют для скрининга специфических моноклональных антител человека. Однако иммортализация В-клеток человека вирусом Эпштейна-Барра (EBV) является неэффективной для иммортилизации В-клеток и требует значительных затрат времени. Для устранения указанного недостатка были разработаны и применяются новые методики. Одной из таких методик является применение метода ОТ-ПЦР для получения генетической информации об антителе непосредственно из В-клеток. Например, существует метод, включающий окрашивание В-клеток, которые экспрессируют антитело к специфическому антигену, выделение указанных В-клеток с использованием сортировщикаFACS (сортировщик флуоресцентно-активированных клеток), получение генетической информации об антителе из единичных В-клеток с помощью метода ОТ-ПЦР, введение указанной генетической информации в вектор экспрессии, трансфекцию этого вектора экспрессии в клетки животного и затем получение большого количества указанного антитела. Для осуществления такой продукции лгким и быстрым способом используют следующую методику. Указанная методика "матричный стоп-иммуноанализ на чипе" (immune-spot array assay on chip, ISAAC) позволяет получить ген антитела скринингом единичных В-клеток, секретирующих специфическое моноклональное антитело, в течение нескольких недель (Jin etal., 2009, Nat. Med. 15, 1088-1092). Полученное таким образом антитело является природным антителом человека, которое может быть более эффективным с точки зрения иммуногенетики. Непатентные документы. 1. Reed L.J. and Muench H. (1938). A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Описание изобретения Техническая задача Целью настоящего изобретения является предоставление моноклонального антитела, полученного из В-клеток человека и обладающего нейтрализующей активностью против вируса гриппа А. Другой целью настоящего изобретения является предоставление выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное моноклональное антитело. Ещ одной целью настоящего изобретения является предоставление вектора экспрессии, содержащего указанную молекулу нуклеиновой кислоты, введнную в него. Ещ одной целью настоящего изобретения является предоставление линии клеток - продуцентов антитела, трансфицированных указанным вектором экспрессии. Ещ одной целью настоящего изобретения является предоставление способа скрининга моноклонального антитела человека. Ещ одной целью настоящего изобретения является предоставление композиции, содержащей указанное моноклональное антитело человека. Ещ одной целью настоящего изобретения является предоставление способа лечения заболевания,вызванного вирусом гриппа А с использованием указанного моноклонального антитела человека. Ещ одной целью настоящего изобретения является предоставление способа предупреждения заболевания, вызванного вирусом гриппа А с использованием указанного моноклонального антитела человека. Ещ одной целью настоящего изобретения является предоставление способа диагностики инфекционного заболевания, вызванного вирусом гриппа А, с использованием указанного моноклонального антитела человека. Ещ одной целью настоящего изобретения является предоставление набора для диагностики вируса гриппа А, который содержит указанное моноклональное антитело человека. Решение задачи Для достижения указанных выше целей настоящее изобретение предоставляет моноклональное антитело против вируса гриппа А, обладающее нейтрализующей активностью против по крайней мере одного из вирусов гриппа, выбранного из группы, состоящей из вирусов гриппа А подтипов H1, Н 2 и Н 5. Настоящее изобретение также предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанное моноклональное антитело. Настоящее изобретение также предоставляет вектор экспрессии, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, введнную в него. Настоящее изобретение также предоставляет линию клеток - продуцентов антитела, трансфицированных указанным вектором экспрессии. Настоящее изобретение также предоставляет способ скрининга моноклонального антитела человека. Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую указанное моноклональное антитело. Настоящее изобретение также предоставляет композицию для предупреждения и лечения заболевания, вызванного вирусом гриппа А, при этом указанная композиция содержит указанное моноклональное антитело. Настоящее изобретение также предоставляет композицию для диагностики инфекционного заболевания, вызванного вирусом гриппа А, при этом указанная композиция содержит указанное моноклональное антитело. Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения заболевания, вызванного вирусом гриппа А, с использованием указанного моноклонального антитела человека. Настоящее изобретение также предоставляет способ предупреждения заболевания, вызванного вирусом гриппа А, с использованием указанного моноклонального антитела человека. Настоящее изобретение также предоставляет способ диагностики инфекционного заболевания, вызванного вирусом гриппа А, с использованием указанного моноклонального антитела человека. Настоящее изобретение также предоставляет набор для диагностики вируса гриппа А, который содержит указанное моноклональное антитело человека. Преимущества настоящего изобретения Моноклональное антитело против вируса гриппа А согласно настоящему изобретению обладает связывающей и нейтрализующей активностями против по крайней мере одного вируса гриппа А, выбранного из группы, состоящей из вирусов гриппа А подтипов H1, Н 2 и Н 5, и поэтому пригодно для предупреждения и лечения заболевания, вызванного вирусом гриппа А, и также пригодно для диагностики инфекционного заболевания, вызванного вирусом гриппа А. Краткое описание чертежей На фиг. 1 приведн набор графиков, показывающих сродство связывания антител СТ 109, СТ 111-1 и СТ 14-2 с мономером Гемагглютинина (здесь и далее обозначаемым как "HA") и тримером HA. На фиг. 2 приведн набор графиков, показывающих сродство связывания антител СТ 104, СТ 120 и СТ 123 с мономером HA и тримером HA. На фиг. 3 приведн набор графиков, показывающих сродство связывания антител СТ 137, СТ 151 и СТ 165 с мономером HA и тримером HA. На фиг. 4 показаны карты векторов рСТ 145(А) и рСТ 147(В): А: вектор рСТ 145; В: вектор рСТ 147; рас: ген, кодирующий пуромицин N-ацетилтрансферазу (РАС); иDS: диадная симметрия (EBNA1 связывается с элементами диадной симметрии (DS) в oriP вирусаEBV). На фиг. 5 показана карта вектора экспрессии, экспрессирующего моноклональное антитело против вируса гриппа А согласно настоящему изобретению. На фиг. 6 показаны результаты экспериментов по выживаемости животных (мышей), проведнных с использованием моноклональных антител против вируса гриппа А согласно настоящему изобретению: А: группа, инъецированная указанными антителами за 24 чперед заражением вирусом подтипаH5N1 (А/Вьетнам/1203/04); В: группа, инъецированная указанными антителами за 48 ч перед заражением вирусом подтипаH5N1 (А/Вьетнам/1203/04); С: группа, инъецированная указанными антителами за 24 ч перед заражением пандемическим вирусом подтипа H1N1 (А/Калифорния/07/2009); иD: группа, инъецированная указанными антителами за 24 ч перед заражением сезонным вирусом подтипа H1N1 (А/Пуэрто-Рико/8/1934). На фиг. 7 показаны результаты экспериментов по изменению титра вируса в назальных смывах животных (хорьков), проведнных с использованием СТ 120 согласно настоящему изобретению через 24 ч после заражения подтипом H1N1 (А/калифорния/04/09). На фиг. 8 показаны результаты экспериментов по изменению титра вируса в тканях лгкого животных (хорьков), проведнных с использованием СТ 120 согласно настоящему изобретению через 24 ч после заражения подтипом H1N1 (А/калифорния/04/09). Наилучший способ осуществления изобретения Здесь и далее будут определены следующие термины, используемые в настоящем описании. Термин "вирусы гриппа А" означает вирусы, содержащие антисмысловую цепь РНК (рибонуклеиновую кислоту), заключнную в оболочку, принадлежащие к семейству Orthomyxoviridae. Они включают в себя одноцепочечную РНК, содержащую восемь сегментов, и классифицируются по типам А, В и С. Далее они подразделяются на подтипы на основании их главных поверхностных белков гемагглютинина(HA) и нейраминидазы (NA). К настоящему моменту известны 16 HA и 9 NA. Термин "подтип Н 1", используемый здесь, подразумевает вирусы гриппа A H1N1, H1N2, H1N3,H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 и H1N9. Термин "подтип Н 2", используемый здесь, подразумевает вирусы гриппа A H2N1, H2N2, H2N3,H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 и H2N9. Термин "подтип Н 5", используемый здесь, подразумевает вирусы гриппа A H5N1, H5N2, H5N3,H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 и H5N9. Термин "гемагглютинин" (здесь и далее обозначаемый как "HA") обозначает гликопротеин оболочки вирусы гриппа. Посредством HA осуществляется адсорбция и проникновение вируса гриппа в клеткухозяин. Существует 16 известных подтипов HA. Термин "выздоровевшие или полностью выздоровевшие пациенты", используемый здесь, относится к пациентам, у которых вирус гриппа А обнаруживался в ходе заболевания вирусной инфекцией, но не обнаруживался в крови после определнного периода времени, указывая на то, что эти пациенты излечились от вируса гриппа А. Далее настоящее изобретение будет описано более детально. Авторы настоящего изобретения выделили одноядерные клетки периферической крови (peripheralblood mononuclear cells, PBMC) из крови, полученной от пациентов, выздоровевших после инфицирования вирусов гриппа А. Выделенные клетки РВМС подвергали скринингу на В-клетки - продуценты моноклональных антител. Генетическую информацию для получения моноклональных антител в В-клетках получали с помощью метода ОТ-ПЦР и вводили в вектор pcDNA. Указанным вектором трансфицировали клетки CHO для предварительного подтверждения продукции антител и их активности по связыванию сHA. В общей сложности было отобрано 82 антитела. Для более аккуратного измерения способности к связыванию с HA всеми указанными антителами, генетическая информация которых была введена в вектор pcDNA, трансфицировали клетки F2N человека и проводили сравнительный анализ антител, полученных из трансфицированных клеток, методом HA-ELISA с использованием мономера HA и тримераHA в большей степени, чем с мономерным HA. Гены указанных 35 отобранных антител из векторовpcDNA переносили в векторы экспрессии MarEx и затем ими трансфицировали клетки F2N для получения большего количества антител. Эти антитела использовали в эксперименте по микронейтрализации(здесь и далее обозначаемом как "тест MN") и в эксперименте по ингибированию гемагглютинации(здесь и далее обозначаемом как "тест HI") для определения нейтрализующих активностей против различных вирусов гриппа. Некоторое количество указанных антител показывали высокую или низкую нейтрализующую активность против различных вирусов гриппа, но все указанные антитела показали отрицательный результат в тесте HI. В ходе теста MN были окончательно отобраны три моноклональных антитела (антитела СТ 104, СТ 120 и СТ 123), показавших нейтрализующую активность против различных вирусов. Было установлено, что среди этих трх моноклональных антител антитело СТ 104 обладало нейтрализующей активностью против подтипов H1 и Н 5, антитело СТ 120 обладало нейтрализующей активностью против подтипов H1, Н 2 и Н 5, и антитело СТ 123 обладало нейтрализующей активностью против подтипа H1 (см. табл. 1). Также в экспериментах по выживаемости животных (мышей), проводившихся с использованием подтипов H1 and H5, антитела СТ 104 и С 120 показали превосходное профилактическое и терапевтическое действие против инфицирования H5N1, а все три антитела показали превосходное профилактическое действие против инфицирования пандемическим и сезонным H1N1 (см. фиг. 6). В других экспериментах с животными (хорьки), проводившихся с использованием подтипов H1, антитело СТ 120 показало терапевтический эффект против инфицирования H1N1 (А/Калифорния/04/09) (см. фиг. 7 и 8). На основании приведнных выше результатов авторы настоящего изобретения создали настоящее изобретение по нейтрализующим антителам, которые защищают против инфицирования вирусом гриппа А. Соответственно, настоящее изобретение предоставляет моноклональное тело, обладающее нейтрализующей активностью против подтипов H1, Н 2 и Н 5 вируса гриппа А. Согласно настоящему изобретению указанное моноклональное антитело предпочтительно связывается с HA на поверхности вируса гриппа А. Также указанное моноклональное антитело предпочтительно получено из В-клеток, присутствующих в крови пациентов, выздоровевших после инфицирования подтипом H1N1 вируса гриппа А. Согласно настоящему изобретению указанный вирус гриппа А предпочтительно является подтипомH1N1, где указанный подтип H1N1 вирус А является вирусом, выбранным из группы, состоящей изA/Texac/05/2009-RG15, А/Нью-Йорк/18/2009-RG15, А/Соломоновы острова/2006 и А/Огайо/83. Также указанный вирус гриппа А предпочтительно является подтипом H2N2, где указанным подтипом H2N2 вируса гриппа А является А/Энн Арбор/6/60 са. В дополнение указанный вирус гриппа А предпочтительно является подтипом H5N1, где подтипом H5N1 вируса гриппа А является вирусом, выбранным из А/Вьетнам/1203/04 и А/Аньхуэй/1/05. Согласно настоящему изобретению указанное моноклональное антитело не обладает нейтрализующей активностью против подтипа H3N2 вируса гриппа А. Настоящее изобретение также предоставляет моноклональное антитело против вируса гриппа А,содержащее следующие последовательности полипептидов лгкой и тяжлой цепей: лгкую цепь, содержащую участок CDR1, содержащий последовательность SEQ ID NO: 7, участокCDR2, содержащий последовательность SEQ ID NO: 10, и участок CDR3, содержащий последовательность SEQ ID NO: 11. В настоящем изобретении моноклональное антитело предпочтительно содержит лгкую цепь, содержащую последовательность полипептида SEQ ID NO: 40, и тяжлую цепь, содержащую последовательность полипептида SEQ ID NO: 41. Указанное моноклональное антитело предпочтительно обладает нейтрализующей активностью подтипов H1, Н 2 и Н 5 вируса гриппа А и не обладает нейтрализующей активностью против подтипа H3 вируса гриппа А. Подтип H1 включает H1N1, H1N2, H1N3, H1N4,H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 и H1N9, а подтип Н 2 включает H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6,H2N7, H2N8 и H2N9. Также подтип Н 5 включает H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 иH5N9. Фрагментом моноклонального антитела против вируса гриппа А согласно настоящему изобретению является не целое антитело, а его часть. Он обладает способностью к связыванию с HA вируса гриппа А и включает все фрагменты, которые конкурентно связываются с HA в присутствии моноклонального антитела против вируса гриппа А согласно настоящему изобретению. В дополнение, настоящее изобретение включает функциональные варианты моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. Если варианты указанного моноклонального антитела способны конкурировать с моноклональным антителом согласно настоящему изобретению за специфическое связывание с подтипами H1, H2 и Н 5 вируса гриппа А и его фрагментами, они считаются функциональными вариантами моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. В частности, если функцио-4 021977 нальные варианты могут связываться с подтипами H1, Н 2 и Н 5 вируса гриппа А или их фрагментами и обладают нейтрализующей активностью против этих подтипов или их фрагментов, они считаются функциональными вариантами моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. Функциональные варианты включают производные, которые, по существу, сходны по первичной последовательности,но которые содержат, например, модификации in vitro или in vivo, химические и/или биохимические,которые отсутствуют в родительском моноклональном антителе согласно настоящему изобретению, но не ограничиваются ими. Такие модификации включают, например, ацетилирование, ацилирование, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, поперечное связывание, образование дисульфидных связей, гликозилирование, гидроксилирование, метилирование, окисление, пэгилирование, протеолитическую обработку, фосфорилирование и подобные им. В качестве альтернативы функциональными вариантами могут быть моноклональные антитела, содержащие последовательность аминокислот с заменами, вставками, делециями или их комбинациями одной или нескольких аминокислот по сравнению с последовательностью аминокислот родительских моноклональных антител. Кроме того, функциональные варианты могут включать укороченные последовательности аминокислот на любом или на обоих N- или С-концах. Функциональные варианты согласно настоящему изобретению могут обладать такими же или другими, либо более высокой, либо более низкой, связывающими способностями по сравнению с родительским моноклональным антителом, но вс же способными к связыванию подтипов H1, Н 2 и Н 5 вируса гриппа А или их фрагментами. Например, функциональные варианты согласно настоящему изобретению могут обладать повышенной или пониженной способностью к связыванию подтипов H1, Н 2 и Н 5 вируса гриппа А или их фрагментами в сравнении с родительскими связывающими молекулами. Предпочтительны модификации в последовательностях аминокислот вариабельных участков, включая каркасные участки, гипервариабельные участки, в частности участки CDR3, но такие модификации не ограничиваются ими. Как правило, лгкая или тяжлая цепь содержит три гипервариабельных участка, содержащих три CDR, и более консервативные участки, также называемые каркасные участки (FR). Указанные гипервариабельные участки содержат остатки аминокислот из CDR и остатки аминокислот из гипервариабельных петель. Функциональные варианты входят в рамки настоящего изобретения, если обладают по крайней мере 50-99%, предпочтительно по крайней мере около 60-99%, более предпочтительно по крайней мере около 80-99%, даже более предпочтительно по крайней мере около 90-99%, в частности по крайней мере около 95-99%, в частности по крайней мере 97-99% гомологией последовательности аминокислот с родительским моноклональным антителом, определнном в настоящем описании. Компьютерные алгоритмы, такие как Gap или Bestfit, известные специалисту в данной области техники, могут быть использованы для оптимального выравнивания сравниваемых последовательностей аминокислот и для определения сходных или идентичных остатков аминокислот. Функциональные варианты могут быть получены как путм изменения родительских моноклональных антител, так и их частей с помощью стандартных методов молекулярной биологии, известных специалисту в данной области техники, включая ПЦР, направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов и сайт-специфический мутагенез, или методов органического синтеза. Настоящее изобретение также предоставляет моноклональное антитело против вируса гриппа А,содержащее лгкую цепь, содержащую участок CDR1, содержащий полипептид, кодированный последовательностью SEQ ID NO: 23, участок CDR2, содержащий полипептид, кодированный последовательностью SEQ ID NO: 18, и участок CDR3, содержащий полипептид, кодированный последовательностьюSEQ ID NO: 24, и тяжлую цепь, содержащую участок CDR1, содержащий полипептид, кодированный последовательностью SEQ ID NO: 25, участок CDR2, содержащий полипептид, кодированный последовательностью SEQ ID NO: 26, и участок CDR3, содержащий полипептид, кодированный последовательность SEQ ID NO: 27. В настоящем изобретении моноклональное антитело предпочтительно содержит лгкую цепь, содержащую последовательность полипептида SEQ ID NO: 38, и тяжлую цепь, содержащую последовательность полипептида SEQ ID NO: 39. Указанное моноклональное антитело предпочтительно обладает нейтрализующей активностью подтипов H1, Н 2 и Н 5 вируса гриппа А и не обладает нейтрализующей активностью против подтипа H3N2 вируса гриппа А. Подтип H1 включает H1N1, H1N2, H1N3, H1N4,H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 и H1N9, а подтип Н 2 включает H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6,H2N7, H2N8 и H2N9. Также подтип Н 5 включает H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 иH5N9. Настоящее изобретение также предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанное моноклональное антитело против вируса гриппа А. Указанная нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению включает все молекулы нуклеиновой кислоты, полученные трансляцией последовательностей аминокислот указанных антител согласно настоящему изобретению в последовательности полинуклеотидов в соответствии с методами, известными специалисту в данной области техники. Соответственно, множество молекул полинуклеотидов с открытыми рамками считывания(ОРС) могут быть получены, и они также не выходят за рамки молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению.-5 021977 Настоящее изобретение также предоставляет вектор экспрессии, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, введнную в него. Указанный вектор экспрессии предпочтительно может быть получен из одного из выбранных из группы, состоящей из вектора экспрессии MarEx, полученного компанией Celltrion Inc. (Корея), коммерческих широкодоступных векторов pCDNA, F, R1, RP1, Col,pBR322, ToL, Ti; космид; фагов, таких как лямбда, лямбдоид, М 13, Mu, Р 1, Р 22, Q, T-even, Т 2, Т 4, Т 7, и др.; вирусов растений, но не ограничивается ими. Любой из множества векторов экспрессии, известных специалисту в данной области техники, может быть использован в настоящем изобретении, и выбор указанного вектора экспрессии зависит от природы выбранной клетки-хозяина. Введение указанного вектора в клетки-хозяева может быть осуществлено посредством трансфекции с использованием фосфата кальция, инфицирования вирусом, трансфекции, осуществляемой с использованием DEAE-декстрана,трансфекции с использованием липофектамина или электропорацией, но не ограничивается указанными методами, и любой специалист в данной области техники может выбрать и использовать метод введения,подходящий для указанного вектора экспрессии и используемой клетки-хозяина. Предпочтительно, чтобы указанный вектор содержал один или несколько маркеров селекции, но не ограничивался ими, при этом также может использоваться вектор, не содержащий маркер селекции. Выбор указанных маркеров селекции может зависеть от выбранной клетки-хозяина, хотя это не является критичным для настоящего изобретения, как это хорошо известно специалистам в данной области техники. Для осуществления очистки молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в указанный вектор экспрессии может быть введена последовательность маркера (tag). Примеры указанных маркеров включают гексагистидиновый маркер, маркер гемагглютинина, маркер myc или FLAG, но не ограничиваются ими. В рамках настоящего изобретения может быть использована любая очистка с использованием маркера, известная специалисту в данной области техники. Настоящее изобретение также предоставляет линию клеток, трансформированных указанным вектором экспрессии, - продуцентов моноклонального антитела против вируса гриппа А. В настоящем изобретении указанные клетки включают клетки млекопитающих, клетки растений,клетки насекомых, клетки грибов или клетки бактериального происхождения, но не ограничиваются ими. Среди клеток млекопитающих в качестве клеток-хозяев предпочтительно могут быть использованы клетки, выбранные из группы, состоящей из клеток CHO, клеток F2N, клеток CSO, клеток BHK, клеток меланомы Боуэса, клеток HeLa, клеток 911, клеток AT1080, клеток А 549, клеток HEK 293 и клеток HEK 293 Т, но не ограничиваются ими. Любая из клеток, используемых специалистом в данной области техники в качестве клеток млекопитающего, может быть использована в настоящем изобретении. Настоящее изобретение также предоставляет способ скрининга антитела, обладающего нейтрализующей активностью против вируса гриппа А, в пациентах, выздоровевших после инфицирования вирусом гриппа А, при этом указанный способ включает в себя следующие стадии: 1) проверка, полностью ли выздоровел пациент инфицированный вирусом гриппа А, и отбор пациентов, у которых в крови не обнаруживается вирус гриппа А, среди указанных проверенных пациентов; 2) сбор крови у полностью выздоровевших пациентов, отобранных на стадии 1); 3) выделение В-клеток из крови пациентов, собранной на стадии 2); 4) отбор В-клеток, которые производят антитела, связывающие HA, среди В-клеток, полученных на стадии 3); 5) выделение РНК из В-клеток, отобранных на стадии 4); 6) амплификация генов антител из РНК, выделенной на стадии 5); 7) клонирование генов, амплифицированных на стадии 6) в векторы экспрессии; 8) трансфекция клеток-хозяев векторами, полученными на стадии 7); 9) проверка, производят ли клетки-хозяева, трансфицированные на стадии 8), антитела, связывающие HA; 10) выращивание трансфицированных клеток, отобранных на стадии 9); 11) очистка антител, связывающихся с HA вируса гриппа А, из культуры трансфицированных клеток стадии 10); 12) перепроверка, обладают ли антитела, очищенные на стадии 11), нейтрализующей активностью против вируса гриппа А; и 13) повторный отбор антитела, обладающего нейтрализующей активностью против вируса гриппа А, подтвержднной на стадии 12). Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую указанное моноклональное антитело против вируса гриппа А. Указанная композиция согласно настоящему изобретению может содержать, в дополнение к указанному моноклональному антителу против вируса гриппа А, фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемые наполнители хорошо известны специалисту в данной области техники. Настоящее изобретение также предоставляет композицию для профилактики и лечения заболевания, вызванного вирусом гриппа А, содержащую указанное моноклональное антитело против вируса гриппа А.-6 021977 Указанная композиция согласно настоящему изобретению может содержать, в дополнение к указанному моноклональному антителу против вируса гриппа А, фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемые наполнители хорошо известны специалисту в данной области техники. Также указанная композиция для профилактики и лечения согласно настоящему изобретению может содержать по крайней мере пять других терапевтических агентов против гриппа А. Указанная композиция для профилактики и лечения согласно настоящему изобретению может содержать различные моноклональные антитела, связывающиеся с подтипами H1, Н 2 и Н 5 вируса гриппа А или их фрагментами, при этом указанные моноклональные антитела могут проявлять синергетический эффект в отношении нейтрализующей активности. Также указанная композиция для профилактики и лечения согласно настоящему изобретению дополнительно может содержать один или несколько других терапевтических агентов или диагностических агентов. Указанные терапевтические агенты включают противовирусные лекарства, но не ограничиваются ими. Такие лекарства могут включать антибиотики, малые молекулы, органические и неорганические соединения, ферменты, последовательности полинуклеотидов, противовирусные пептиды и т.д. Указанная композиция для профилактики и лечения согласно настоящему изобретению должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения. Также она может быть в форме порошка для восстановления в подходящем фармацевтически приемлемом наполнителе перед введением или во время него. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекции предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофильная сушка с получением порошка активного ингредиента с добавлением любого дополнительного желаемого ингредиента из его предварительно стерильного отфильтрованного раствора. С другой стороны, указанная композиция согласно настоящему изобретению может быть в виде раствора и указанный фармацевтически приемлемый наполнитель может быть добавлен и/или смешан перед введением или во время него с получением формы единичной дозы для инъекции. Предпочтительно, чтобы указанный фармацевтически приемлемый наполнитель подходил для высокой концентрации лекарства, мог поддерживать нужную текучесть и, если необходимо, мог препятствовать абсорбции. Выбор оптимального пути введения указанной композиции для профилактики и лечения будет зависеть от нескольких факторов, включающих физико-химические свойства указанных активных молекул в указанной композиции, срочности клинической ситуации и взаимосвязи между концентрацией указанных активных молекул в плазме и желаемым терапевтическим эффектом. Например, указанные моноклональные антитела согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены с носителем, который будет предотвращать их быстрое высвобождение, таким как составы с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. В настоящем изобретении могут быть использованы биодеградируемый, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимер молочной кислоты. Более того, указанное моноклональное антитело может быть покрыто материалом или соединением, предотвращающим инактивацию антитела, или назначаться вместе с ним. Например,указанное моноклональное антитело может вводиться вместе с подходящим носителем, например липосомами, или разбавителем. Пути введения указанной композиции для профилактики и лечения согласно настоящему изобретению могут подразделяться на оральное или парентеральное введение. Предпочтительным путм введения является внутривенный, но не ограничивается только им. Формы дозирования для орального применения могут быть в виде таблеток, пастилок, леденцов,водных или масляных суспензий, дисперсных порошков или гранул, эмульсий, тврдых капсул, мягких желатиновых капсул, сиропов или эликсиров, пилюль, драже, жидкостей, гелей или глинистых суспензий. Эти составы могут содержать фармацевтически приемлемые наполнители, включая гранулирующие и дезинтегрирующие агенты, связующие агенты, лубриканты, предохраняющие вещества, красители,вкусовые агенты или подсластители, растительные или минеральные масла, увлажняющие агенты и загустители. Составы для парентерального введения могут быть в форме водных или неводных изотонических стерильных нетоксичных растворов или суспензий для инъекций или инфузий. Указанные растворы или суспензии могут содержать агенты, которые не являются токсичными для реципиента в применяемых дозировках и концентрациях, такие как 1,3-бутандиол,раствор Рингера, раствор Хэнка, изотонический раствор хлорида натрия, масла, жирные кислоты, местные анестезирующие агенты, предохраняющие вещества, буферы, агенты, увеличивающие вязкость или растворимость, водорастворимые антиоксиданты, антиоксиданты, растворимые в масле, и металл-хелатирующие агенты. Настоящее изобретение предоставляет композицию для диагностики вируса гриппа А, которая включает конъюгат, содержащий маркер, конъюгированный с указанным моноклональным антителом против вируса гриппа А. Указанная композиция для диагностики согласно настоящему изобретению содержит по крайней мере один детектируемый маркер, такой как детектируемая частица/агент. Указанный маркер может быть конъюгирован нековалентным образом с моноклональным антителом согласно настоящему изобре-7 021977 тению. Указанный маркер также может быть конъюгирован непосредственно с моноклональным антителом посредством ковалентного связывания. С другой стороны, указанный маркер может быть конъюгирован с моноклональным антителом посредством одного или нескольких связывающих агентов. Методики конъюгирования маркера с моноклональным антителом хорошо известны специалисту в данной области техники. Детектируемая частица/агент, используемая в качестве маркера, предпочтительно является выбранной из группы, состоящей из ферментов, простетических групп, флуоресцентных веществ, люминесцентных веществ, биолюминесцентных веществ, радиоактивных веществ, металлов, эмитирующих позитроны и ионов нерадиоактивных парамагнитных металлов, но не ограничиваются ими. Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения заболевания, вызванного вирусом гриппа А, при этом указанный способ включает стадию введения моноклонального антитела против вируса гриппа А согласно настоящему изобретению субъекту с заболеванием, вызванным вирусом гриппа А. В указанном способе лечения согласно настоящему изобретению вирусом гриппа А предпочтительно является вирус, выбранный из группы, состоящей из подтипов H1, H2 и Н 5. Подтип H1 включаетH1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 и H1N9, а подтип Н 2 включает H2N1, H2N2,H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 и H2N9. Также подтип Н 5 включает H5N1, H5N2, H5N3, H5N4,H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 и H5N9. В указанном способе лечения согласно настоящему изобретению вместе с моноклональным антителом согласно настоящему изобретению может вводиться любой терапевтический агент против заболевания, вызванного вирусом гриппа А, известный специалисту в данной области техники. В указанном способе лечения согласно настоящему изобретению заболеванием, вызванным вирусом гриппа А, может быть заболевание, выбранное из группы, состоящей из заболеваний, вызванных новым штаммом вируса, пандемического гриппа и сезонного гриппа, но не ограничивается ими. В указанном способе лечения согласно настоящему изобретению доза моноклонального антитела против вируса гриппа А может подгоняться для достижения оптимального ответа. Указанной дозой является, например, 0,01-200 мг/кг, предпочтительно 0,1-150 мг/кг и более предпочтительно 1-100 мг/кг, но не ограничивается ими. Несколько раздельных доз могут вводиться ежедневно или указанная доза может быть пропорционально снижена в соответствии потребностями ситуации у пациента. Указанная композиция согласно настоящему изобретению может вводиться в виде единичной порции или множественных порций, распределнных в течение суток. Метод введения не ограничен каким-либо образом в настоящем изобретении и может определяться лечащим врачом. В указанном способе лечения согласно настоящему изобретению метод введения моноклонального антитела против вируса гриппа А может разделяться на оральное введение и парентеральное введение. Предпочтительным методом введения является внутривенное введение, но метод не ограничивается только им. Настоящее изобретение также предоставляет способ профилактики заболевания, вызванного вирусом гриппа А, при этом указанный способ включает стадию введения субъекту моноклонального антитела против вируса гриппа А согласно настоящему изобретению. В указанном способе профилактики согласно настоящему изобретению указанное моноклональное антитело против вируса гриппа А может вводиться вместе с любым агентом, известным специалисту в данной области техники, для профилактики против заболевания, вызванного вирусом гриппа А. В указанном способе профилактики согласно настоящему изобретению доза моноклонального антитела против вируса гриппа А может подгоняться для достижения оптимального ответа. Указанной дозой является, например, 0,01-200 мг/кг, предпочтительно 0,1-150 мг/кг и более предпочтительно 1-100 мг/кг, но не ограничивается ими. Несколько раздельных доз могут вводиться ежедневно или указанная доза может быть пропорционально снижена в соответствии потребностями ситуации у пациента. Указанная композиция согласно настоящему изобретению может вводиться в виде единичной порции или множественных порций, распределнных в течение суток. Метод введения не ограничен каким-либо образом в настоящем изобретении и может определяться лечащим врачом. Настоящее изобретение также предоставляет способ диагностики у пациента инфекции, вызванной вирусом гриппа А, при этом указанный способ включает следующие стадии: 1) контактирование образца с моноклональным антителом против вируса гриппа А согласно настоящему изобретению и 2) детекция реакции между указанным моноклональным антителом и образцом. В качестве альтернативы указанный способ диагностики может включать следующие стадии: 1) контактирование образца с композицией для детекции согласно настоящему изобретению и 2) детекция реакции между указанной композицией для детекции и образцом. В способе диагностики согласно настоящему изобретению вирус гриппа А относится к одному или нескольким подтипам, выбранным из группы, состоящей из H1, Н 2 и Н 5. Подтип H1 включает H1N1,H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 и H1N9, а подтип Н 2 включает H2N1, H2N2, H2N3,H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 и H2N9. Также подтип Н 5 включает H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5,H5N6, H5N7, H5N8 и H5N9.-8 021977 В способе диагностики согласно настоящему изобретению моноклональное антитело согласно настоящему изобретению может быть, если необходимо, коньюгировано с маркером для диагностики и детекции в соответствии с любым из методов, известных специалисту в данной области техники. В способе диагностики согласно настоящему изобретению образцом предпочтительно является образец, выбранный из группы, состоящей из слизи, мокроты, крови, клеток лгкого, слизь тканей лгкого,ткани дыхательных путей и слюны, но не ограничиваются ими. Указанный образец может быть приготовлен в соответствии с любым из методов, традиционно используемых специалистами в данной области техники. В способе диагностики согласно настоящему изобретению указанным способом детекции реакции может быть способ, выбранный из группы, состоящей из иммунологического анализа по гомогенному или гетерогенному связыванию, такому как радиоиммунологический анализ (RIA), ELISA, иммунофлуоресценции, иммуногистохимии, FACS, BIACORE и вестерн-блот анализ. Любой метод детекции, известный специалисту в данной области техники, может быть использован в настоящем изобретении. Настоящее изобретение также предоставляет набор для диагностики вируса гриппа А, содержащий 1) моноклональное антитело против вируса гриппа А согласно настоящему изобретению и 2) контейнер. В дополнение, настоящее изобретение предоставляет набор для диагностики инфекции, вызванной вирусом гриппа А, содержащий 1) композицию для диагностики вируса гриппа А согласно настоящему изобретению и 2) контейнер. В указанном наборе для диагностики согласно настоящему изобретению вирусом гриппа А предпочтительно является один или несколько подтипов вируса, выбранных из группы, состоящей из H1, Н 2 и Н 5. Подтип H1 включает H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 и H1N9, а подтип Н 2 включает H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 и H2N9. Также подтип Н 5 включаетH5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 и H5N9. В указанном наборе для диагностики согласно настоящему изобретению поддерживающая опора включена в указанный контейнер 2). Указанное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению может быть прикреплено к поддерживающей опоре, и указанная поддерживающая опора может быть пористой или непористой, плоской или неплоской. Примеры Пример 1. Выделение РВМС из крови пациентов, выздоровевших от гриппа. Группа выздоровевших состояла из пациентов-добровольцев по истечении 2-4 недель после подтверждения инфекций новых типов гриппа. У указанных добровольцев подтверждали отсутствие вируса гриппа (H1N1) в их крови и наличие антител против новых типов вируса гриппа. Это исследование осуществляли по разрешению Комитета по ведомственной экспертизе (the Institutional Review Board, IRB). Эта группа пациентов характеризовалась следующим образом:(1) указанные пациенты не были вакцинированы против сезонного гриппа;(2) у пациентов не обнаруживались вирусы других инфекций, а именно HBsAg, и не обнаруживались антитела против HCV и HIV;(3) у пациентов в плазме методом ОТ-ПЦР не обнаруживался подтип вируса гриппа H1N1;HA(H1N1) подтипа H1N1 вируса гриппа А. Около 100 мл цельной крови отбирали у добровольцев и одноядерные клетки периферической крови (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) выделяли из собранной крови с использованием Lymphoprep (Axis-Shield, Норвегия, 1114545). Выделенные РВМС промывали три раза физиологическим раствором с фосфатным буфером, консервировали в концентрации 2107 клеток/мл в среде для замораживания KM banker (Cosmobio, Япония, KOJ-16092010) и хранили в мкости с жидким азотом. Пример 2. Первичный скрининг моноклональных антител. В-клетки, секретирующие антигенспецифические антитела, скринировали с использованием метода, описанного Jin et al. (Jin A. et al., 2009. Nat Med. 15, 1088-1092). Вкратце, РВМС добавляли в каждую лунку подготовленного чипа для микроанализа с плотностью 1 клетка/лунку. Наличие антител, секретируемых единичными клетками, подтверждали с помощью предварительно нанеснных антител противIgG человека. Секретируют ли отобранные клетки, антитела, связывающие HA, проверяли с помощью меченых антител против HA с использованием спот-иммуноанализа с применением ферментов (ELISPOT; Sedgwick J.D., 2005, Methods Mol. Biol. Vol. 302, p. 314). Полные последовательности генов, кодирующих тяжлые и лгкие цепи указанных антител из индивидуальных клеток, секретирующих антитела,получали методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Полученные ДНК,кодирующие тяжлые и лгкие цепи, вводили в векторы экспрессии pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, США,V790-20) с получением векторов экспрессии, продуцирующих каждую из тяжлых и лгких цепей указанных антител. Полученными векторами экспрессии совместно трансфицировали клетки CHO. После этого среди антител, полученных из трансфицированных клеток CHO, предварительно отобрали 82 антитела, связывающихся с HA, с использованием метода HA-ELISA, описанного в примере 3. При этом все антитела, реагирующие с HA, были предварительно проскринированы без последовательных разбавлений образцов указанных антител.-9 021977 Пример 3. Вторая стадия скрининга моноклональных антител и их продукция. Для повторного скринирования моноклональных антител, обладающих высокой связывающей аффинностью к рекомбинантному HA, среди 82 первично отобранных антител проводили HA-ELISA с использованием мономеров HA и тримеров HA. Рекомбинантный мономер HA (11055-V08H) вируса гриппа А (А/Калифорния/04/2009) приобрели у компании Sino Biological Inc. (Китай). Указанный коммерческий мономерный HA состоял из внеклеточного домена HA (metl - gln529), содержащего 10 полигистидиновых остатков на С-конце, и был получен из трансфицированных клеток человека. Рекомбинантный тример HA (FR-180) был предоставлен компанией IRR (Influenza Reagent Resource, США). Тример HA из H1N1 (А/Калифорния/04/2009) содержал сайт расщепления тромбина на С-конце, домен тримеризации (foldon) и шесть остатков гистидина и был получен с использованием бакуловирусной системы. Реакционную способность антитела в связывании сHA антигеном измеряли методом ELISA с использованием указанных HA и антитела. В частности, сначала в каждую лунку 96-луночного планшета для микротитрования (Nunc, Denmark, 449824) вносили 50 мкл каждого из мономера HA или тримера HA (250 нг/мл). Планшет блокировали физиологическим раствором с фосфатным буфером (Teknova, США, D5120), содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), а затем в каждую лунку планшета добавляли серийные 3-кратные разбавления образцов антитела (начальная концентрация: 1 мкг/мл). Затем указанный планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем обрабатывали меченными пероксидазой антителами козы против гамма-глобулинов человека (Zymed, USA, 62.8420). После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре указанный планшет инкубировали с тетраметилбензидином (ТМВ; Sigma-Aldrich, США, Т 0440) и останавливали указанное инкубированные добавлением 1 н. HCl. Измеряли оптическую плотность при 450/570 нм с использованием планшетного сканера (Spectramax plus 384, Molecular Device) и реакционную способность антиген-антитело отображали в виде графика с использованием программы Graphpadprism (GraphPad Software Inc. USA). Как показано на фиг. 1, антитела СТ 109, СТ 111-1 и СТ 154-2 показали очень высокие связывающие активности с тримерным HA и также показали высокую активность связывания с мономерным HA, которая была ниже, чем связывающие активности против тримера HA. Также антитела СТ 104, СТ 120 и СТ 123 показали высокие связывающие активности с тримернымHA, но при этом показали низкую или нулевую активность против мономерного HA (фиг. 2). Другие антитела (СТ 137, СТ 151 и СТ 165) показали низкую активность против этих двух антигенов или не показали такую активность против двух антител (фиг. 3). На основании результатов, показанных на фиг. 1-3, среди 82 первично отобранных антител вторично были отобраны 35 антител, обладающих высокой активностью против тримера HA. Для того чтобы количественно оценить связывающие активности моноклональных антител и, таким образом, снизить количество моноклональных антител в тесте MN, было необходимо повысить уровни экспрессии вторично отобранных антител. Поэтому гены, кодирующие указанные антитела, переклонировали с кДНК векторов в векторы экспрессии MarEx, сконструированные и запатентованные компанией Celltrion, Inc.,следующим образом. После переклонирования векторы экспрессии MarEx, содержащие гены указанных антител, использовали для получения антител, требующихся для проведения теста MN и теста HI. Исходные векторы pcDNA, содержащие каждый из генов тяжлой и лгкой цепей 35 вторично отобранных антител, обрабатывали ферментами рестрикции NheI и PmeI для того, чтобы разделить гены тяжлой цепи и гены лгкой цепи. Полученные гены тяжлой цепи и гены лгкой цепи вводили соответственно в векторы рСТ 145 и векторы рСТ 147, которые обрабатывали теми же самыми ферментами рестрикции. Векторы рСТ 145 и рСТ 147 были сконструированы компанией Celltrion, Inc. для получения векторов экспрессии тяжлой цепи и лгкой цепи соответственно (фиг. 4). Затем для конструирования векторов экспрессии, содержащих транскрипционную единицу тяжлой цепи (промотор - ген тяжлой цепи- поли А) вместе с транскрипционной единицей лгкой цепи (промотор - ген лгкой цепи - поли А), векторы рСТ 145, содержащие гены тяжлой цепи, обрабатывали ферментами рестрикции PacI и AscI для выделения транскрипционных единиц тяжлой цепи, а затем векторы рСТ 147, содержащие гены лгкой цепи, обрабатывали теми же ферментами рестрикции и внедряли в выделенные транскрипционные единицы тяжлой цепи. Затем векторы, содержащие транскрипционную единицу тяжлой цепи вместе с транскрипционной единицей лгкой цепи, отбирали с использованием ферментов рестрикции (фиг. 5). Проверяемые векторы выделяли с использованием набора Endofree plasmid maxi kit (QIAGEN, Германия,12362) и нуклеотидные последовательности анализировали с использованием части выделенных образцов ДНК, определяя, таким образом, последовательность нуклеотидов генов антител. Затем указанными ДНК выделенных антител трансфицировали суспензию линии клеток F2N (сконструированных компанией Celltrion, Inc., Корея) для получения моноклональных антител кратковременным способом продукции. Так, указанную трансфекцию проводили следующим способом. Трансфекцию указанных клеток плазмидной ДНК осуществляли с использованием катионного полимера FreeStyleTM Max (Invitrogen, США,16447-100) в соответствии с инструкцией производителя. За день перед трансфекцией клетки F2N, культивированные в среде EX-CELL 293 без сыворотки (SAFC, LIK, 14571C; здесь и далее обозначаемая как среда "EX-CELL 293"), центрифугировали и суспендировали в концентрации 1106 клеток/мл в модифицированной среде EX-CELL 293 (SAFC, LIK, 65237; изготовлена по заказу) и 80 мл суспензии клеток- 10021977 засевали колбы Эрленмейера объмом 250 мл или 200 мл суспензии клеток засевали колбы Эрленмейера объмом 1 л в количестве 200 мл. В день трансфекции в случае, когда засевали 80 мл суспензии клеток,каждую из ДНК, кодирующую моноклональное антитело, и 100 мкл реагента FreeStyleTM Max разбавляли в объме 1,6 мл с использованием среды OptiPRO SFM II (Invitrogen, США, 12309) и аккуратно перемешивали. В случае, когда засевали 200 мл суспензии клеток, каждые 250 мкг ДНК и 250 мкг реагентаFreeStyleTM Max разбавляли в объме 4 мл с использованием среды OptiPRO SFM II и аккуратно перемешивали. Сразу после процесса перемешивания раствор, содержащий реагент FreeStyleTM Max, разбавленный в нм, смешивали с раствором, содержащим ДНК, разбавленную в нм, и смешанный раствор инкубировали при температуре окружающей среды в течение 19 мин. В процессе инкубирования при температуре окружающей среды в течение 19 мин засеянные клетки F2N разбавляли до концентрации клеток 0,8106 с использованием свежей модифицированной среды EX-CELL 293. После инкубирования в течение 19 мин указанный смешанный раствор ДНК и реагента FreeStyleTM Max добавляли к культуре клеток F2N, подготовленной для трансфекции. Через день после трансфекции такое же количество средыEX-CELL 293 добавляли к трансфицированным клеткам, которые затем культивировали в течение 7-8 суток, получая, таким образом, моноклональные антитела. Пример 4. Проверка in vitro нейтрализующей активности против вирусов. Среди отобранных 35 моноклональных антител выбрали 11 антител, которые продемонстрировали высокие аффинности по связыванию с тримером HA в HA-ELISA, и подвергли их тесту MN для проверки их нейтрализующих активностей против различных вирусов гриппа. Пример 4-1. Культура линии клеток MDCK и определение концентрации вирусов. В качестве линии клеток Мадин-Дарби почек собак (MDCK) использовали лондонскую линию(MDCK-L). Указанную линию клеток MDCK культивировали во влажном инкубаторе с 5% CO2 при 37C с использованием среды DMEM (Gibco, США, 11965), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Atlas Biologicals, США, F0500A), 1X пенициллин/стрептомицин (Gibco, США, 15140), 25 мМHEPES (Gibco, США, 15630) и 2 мМ L-глутамин (Gibco, США, 25030). Концентрацию вирусов количественно оценивали с помощью метода ELISA для определения средней эффективной дозы в культуре ткани (TCID50). Определение концентрации вирусов осуществляли следующим образом. Сначала исходный раствор вируса последовательно разводили в 10 раз разбавителем для вирусов [DMEM (Gibco, США), 3% БСА (Gibco,USA, 15260), 1X пенициллин/стрептомицин(Gibco, США) и 25 мМ HEPES (Gibco, США)] и 100 мкл разбавленного вируса добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. В качестве негативного контроля использовали разбавитель для вирусов, не содержащий вирус. Затем указанную линию культивированных клеток MDCK обрабатывали трипсином,удаляли из инкубатора для культивирования и затем обрабатывали культуральной средой MDCK для нейтрализации трипсина. Затем осадки этих клеток дважды промывали солевым раствором с фосфатным буфером и разбавляли до концентрации клеток 5105 клеток/мл разбавителем для вирусов. 3-4 мкг/млTPCK-трипсина (Sigma, USA) добавляли в 96-луночный планшет, содержащий вирусы, затем сразу 100 мкл добавляли в линию клеток MDCK в каждую лунку планшета и инкубировали во влажном инкубаторе с 5% CO2 при 37C в течение 20 ч. После инкубирования планшет один раз промывали солевым раствором с фосфатным буфером, а затем 200 мкл смешанного раствора холодного ацетона: солевого раствора с фосфатным буфером (PBS) (80:20) добавляли в каждую лунку планшета. Затем указанные клетки фиксировали в течение 8 мин, после чего планшет высушивали при температуре окружающей среды в течение 20 мин. 200 мкл солевого раствора с фосфатным буфером добавляли в каждую лунку планшета дважды для промывки. 100 мкл биотинилированных моноклональных антител против ядерного белка (NP) (Milipore, США, МАВ 8257 В), разбавленных в 2,000 раз солевым раствором с фосфатным буфером, содержащим 1% БСА, добавляли в каждую лунку планшета и инкубировали при температуре окружающей среды в течение 1 ч. Планшет промывали три раза 200 мкл/лунку солевым раствором с фосфатным буфером и антитела, конъюгированные со стрептавидином-HRP, разбавляли в 20,000 раз солевым раствором с фосфатным буфером, содержащим 1% БСА. Затем 100 мкл разведнного антитела добавляли в каждую лунку планшета и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывки планшета четыре раза солевым раствором с фосфатным буфером в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора OPD (Sigma, США, Р 8287) и планшет проявляли при комнатной температуре в течение 10 мин. Планшет обрабатывали 50 мкл/лунку 3 М HCl для остановки цветного проявления и затем измеряли оптическую плотность OD490 в каждой лунке. На основании OD490 рассчитывали TCID50 с использованием метода ReedMuench (The American 1938). Пример 4-2. Тест MN. Каждое антитело разбавляли до концентрации 10 мкг/мл разбавителем для вирусов. Начиная с этой концентрации, указанное разведение антитела последовательно разбавляли в 2 раза разбавителем для вирусов и 50 мкл каждого разведения добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. Также 50 мкл вирусов добавляли в каждую лунку планшета в концентрации, соответствующей 100 TCID50, и инкубировали во влажном инкубаторе с 5% CO2 при 37C в течение 1 ч. Затем в каждую лунку добавляли 3-4 мкг/мл ТРСК-трипсина (Sigma, США, Т 1426) и 100 мкл обработанных клетокMDCK и инкубировали во влажном инкубаторе с 5% CO2 при 37C в течение 20 ч. Затем проводили тестMN в соответствии с таким же методом, как при количественной оценке вирусов, описанной в примере 4-1, определяя, таким образом, значение OD490 для каждой лунки. Лунки со значением OD490 большим,чем такое значение для лунок, содержащих только клетки, как считалось, содержали клетки, инфицированные вирусами. Среди значений OD490 для каждого антитела, при которых не обнаруживался антиген вируса, наименьшие концентрации (мкг/мл) антител приведены в табл. 1, и указанная более низкая концентрация антитела означает более высокую нейтрализующую активность против вируса. Таблица 1 Результаты теста микронейтрализации (тест MN), проведнного с использованием отобранных антител и вирусов различных типов Как видно из результатов теста MN для 11 кандидатов антител против вирусов гриппа подтипов H1,Н 2, H3 и Н 5, антитело СТ 104 обладало нейтрализующей активностью против вируса гриппа двух пандемических подтипов H1N1 (А/Техас/05/2009 и А/Нью-Йорк/18/2009) и двух сезонных подтипов H1N1 вирусов (А/Соломоновы острова/3/2006 и А/Огайо/83) при низких концентрациях (0,313-0,625 мкг/мл) и также нейтрализовало два вируса подтипа H5N1 (А/Вьетнам/1203/04 и А/Эньхуэй/1/05) при концентрациях 1,25 и 0,625 мкг/мл соответственно. Однако указанное антитело СТ 104 не обладало нейтрализующей активностью против вирусов подтипа H2N2 (А/Энн Арбор/6/60 са) и подтипа H3N2 вируса(А/Висконсин/67/2005). Антитело СТ 123 обладало нейтрализующей активностью только против четырх протестированных вирусов подтипов H1N1. В частности, антитело СТ 120 обладало высокой нейтрализующей активностью против вирусов гриппа четырх подтипов H1N1, вируса гриппа одного подтипаH2N2 (А/Энн Арбор/6/60 са) и вирусов гриппа двух подтипов H5N1. Однако описанные выше антитела не обладали нейтрализующей активностью против подтипа H3N2, принадлежащего к монофилетическому таксону H3. Значения IC50 трх выбранных антител, обладающих нейтрализующей активностью против вирусов, были измерены для сравнения, и результаты измерений приведены в табл. 2. Здесь значение IC50 является концентрацией антитела, при которой указанное антитело проявляет 50% от наивысшей ней- 12021977 трализующей активности против вирусов, и меньшее значение IC50 означает большую активность указанного антитела. Таблица 2 Значения IC50 нейтрализующих активностей СТ 104, СТ 120 и СТ 123 против вирусов двух пандемических типов H1N1 Замечание. Концентрацией антитела являются нейтрализующие концентрации антитела, приведнные в табл. 1. Как видно из табл. 2 выше, указанные три антитела обладали очень низкими значениями IC50 и поэтому обладали высокой нейтрализующей активностью против двух вирусов, приведнных в табл. 2. Пример 5. Исследование способности антитела ингибировать реакцию гемагглютинации, вызванной вирусами. Готовили серийные двукратные разведения антитела в 96-луночном планшете с V-образным дном,добавляли вирусы в количестве 4 единиц гемагглютинации и смешивали их с антителом. Затем планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего в каждую лунку планшета добавляли 1% птичьих эритроцитов. Конечную точку ингибирования гемагглютинации определяли как самую низкую концентрацию антитела, при которой реакция гемагглютинации полностью отсутствовала. Результаты показывают, что ни одно из протестированных антител не ингибировало гемагглютинацию для двух пандемических подтипов вируса H1N1 (A/Texac/05/2009-RG15 и А/Нью-Йорк/18/2009RG18) даже в высоких концентрациях (20 мкг/мл) (табл. 3). Таблица 3 Результаты ингибирования гемагглютинации для отобранных антител в отношении двух типов пандемического вируса H1N1 Пример 6. Исследование профилактического и терапевтического влияния антител на вызываемую вирусами гриппа инфекцию в экспериментах на животных. Пример 6-1. Эксперимент по выживанию мышей. Для того чтобы определить, оказывают ли антитела СТ 104, СТ 120 и СТ 123, отобранные, как описано в приведенных выше примерах, профилактическим и терапевтическим действием против подтиповH1N1 и H5N1 вируса у мышей, были проведены следующие эксперименты. Каждую группу, состоящую из пяти мышей, назальным путм инфицировали вирусами в количестве 10LD50. За 24 до и через 48 ч после инфицирования вирусами мышам путм интраабдоминальной инъекции вводили каждое из трех отобранных антител (СТ-104, СТ-120 и СТ 123) и антитело, представ- 13021977 ляющее собой отрицательных контроль (СТ-Р 6), в количестве 10 мг/кг массы тела мыши. Результаты экспериментов показаны на фиг. 6. Как показано на фиг. 6, в случаях, когда мышам инъецировали СТ-104 или СТ-120 за 24 ч до инфицирования подтипа H5N1 вируса(А/Вьетнам/1203/2004) в количестве 10LD50, все мыши выжили, но когда мышам вводили СТ-123, через 12 дней погибло 20% мышей. В случае антитела отрицательного контроля (СТ-Р 6), мыши, которым инъецировали антитело отрицательного контроля, погибли через 7 дней (фиг. 6 А). В случае, когда антитела инъецировали через 2 дня после инфицирования вирусом с целью исследовать терапевтическое действие антител, все мыши, которым вводили СТ-104 и СТ-120, дожили до 14 дня - последнего дня периода наблюдения, а все мыши, которым инъецировали антитело отрицательного контроля (СТ-Р 6) или СТ-123, погибли (фиг. 6 В). В случае, когда антитела вводили за 24 ч до инфицирования пандемическим подтипом вируса H1N1(А/Калифорния/07/2009)с целью исследования профилактического действия антител, все мыши, которым инъецировали СТ-120 и СТ-123, дожили до 14 дня - последнего дня периода наблюдения, также выжило 80% мышей, которым инъецировали СТ-104, тогда как все мыши, которым инъецировали антитела отрицательного контроля (СТ-Р 6), погибли (фиг. 6 С). Кроме того, все мыши, которым вводили СТ-104 или СТ-123 за 24 ч до инфицирования сезонными подтипами вируса H1N1 (А/Пуэрто-Рико/8/1934), выжили в течение периода наблюдения, мыши, которым вводили СТ-120, демонстрировали степень выживаемости 80%, а все мыши, которым вводили антитела отрицательного контроля (антитело СТ-Р 6), погибли (фиг. 6D). Пример 6-2. Эксперимент на хорьках. Для исследования лечебных свойств отобранное антитело СТ 120 исследовали в модели на хорьках,которые демонстрируют чувствительность к вирусу гриппа и симптомы при заражении, близкие к наблюдаемым у человека. Каждая тестируемая группа состояла из 9 хорьков, за исключением группы отрицательного контроля, которая включала дополнительно 4 хорька для измерения исходной концентрации вирусной инфекции. После акклиматизации хорькам интраназально или интратрахеально вводили 1 мл(1106 EID50/мл) вируса гриппа [А/Калифорния/04/09 (H1N1)]. СТ 120 вводили путм внутривенной инъекции через 24 ч после инокуляции вируса: группе тестирования 1 инъецировали 15 мг/кг СТ 120; группе тестирования 2 инъецировали 30 мг/кг СТ 120, группе тестирования 3 инъецировали 30 мг/кг СТ 120 каждые 24 ч в течение 3 дней. В группе отрицательного контроля 30 мг/кг антитела СТ-Р 6 вводили путм внутривенной инъекции однократно через 24 ч после инокуляции вируса. Собирали назальные смывы каждого хорька из каждой группы тестирования в дни 1, 3, 5 и 8 после инокуляции вируса и измеряли концентрации вируса в собранных образцах с использованием оплодотворнных яиц. 3 хорьков из каждой группы тестирования забивали в дни 1, 3, 5 и 8 после инокуляции вируса и измеряли концентрации вируса в извлеченных тканях лгкого с использованием оплодотворнных яиц. Каждый образец ткани лгкого измельчали при помощи гомогенизатора в солевом растворе с фосфатным буфером (PBS), содержащем антибиотики (1 мл на каждый 1 ткани лгкого), после чего центрифугировали и отделяли супернатант. Каждый назальный смыв собирали в 1 мл PBS, содержащего антибиотики, а затем центрифугировали и отделяли супернатант для измерения концентрации вируса. Затем готовили серийные 10-кратные разведения супернатантов гомогенатов ткани лгкого или назальных смывов в PBS, содержащем антибиотики, и после этого инокулировали разведнными супернатантами 10-13-дневные оплодотворнные яйца. Смеси алонтоисной жидкости (50 мкл) из оплодотворнных яиц, которые инкубировали в течение 48 ч, и такого же объема 0,5% эритроцитов (индюшки) инкубировали в течение 30 мин, после чего титровали вирус по агглютинации крови. В то время как в контрольной группе титр вируса в назальных смывах оставался высоким(log 10,4 EID0/мл) до 5 дня после инокуляции, а затем снижался, в группе, которой вводили антитело СТ 120, титр был значительно снижен и в день 8 после инокуляции вирус не обнаруживался (фиг. 7). Таким образом, в группе, получавшей лечение СТ 120, наблюдали более быстрый клиренс вируса, чем в контрольной группе. В частности, наблюдали более значительное подавление вируса в группе исследования 3, в которой антитело вводили ежедневно в течение первых 3 дней. В контрольной группе титр вируса в ткани лгкого оставался высоким (log 4,5 EID50/мл) до дня 5 после инфицирования и затем снижался, а в группе, получавшей СТ 120, титр вируса был значительно снижен. В день 8 после инфицирования вирус не обнаруживался (фиг. 8). В частности, эксперимент на хорьках показал, что подавление вируса было более значительным в группах тестирования 2 и 3. Эти результаты демонстрируют, что 30 мг/кг СТ 120 более эффективно подавляют пролиферацию вируса, чем дозировка 15 мг/кг.