Вакцина против вируса африканской чумы лошадей

ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ ЛОШАДЕЙ Настоящее изобретение обеспечивает иммуногенную вакцинную композицию, способную вызвать у лошадей иммунный ответ против вируса африканской чумы лошадей (АЧЛ), которая содержит вектор на основе вируса оспы птиц, содержащий один или несколько полинуклеотидов, выбранных из последовательности, идентичной по меньшей мере на 70% последовательности SEQ ID NO: 4, последовательности, идентичной по меньшей мере на 70% последовательности SEQ ID NO: 5,комбинации последовательности, идентичной по меньшей мере на 70% последовательности SEQID NO: 4, и последовательности, идентичной по меньшей мере на 70% последовательности SEQ IDNO: 5, или последовательности, идентичной по меньшей мере на 95% последовательности SEQ IDNO: 17, где указанные полинуклеотиды кодируют полипептиды VP2 и/или VP5 вируса АЧЛ и где указанные полинуклеотиды способны к экспрессии in vivo в организме лошади. Изобретение также обеспечивает способ индукции у лошадей иммунного ответа против вируса АЧЛ, включающий стадию введения предложенной иммуногенной вакцинной композиции. Минке Жюль Мартен, Одонне ЖанКристоф (FR), Гютри Алан Джон (ZA),Маклохлан Найджел Джеймс (US), Яо Джианшенг (CA) Фелицына С.Б. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: МЕРИАЛ ЛИМИТЕД; ТЕ РИДЖЕНТС ОФ ТЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ КАЛИФОРНИЯ (US); ЮНИВЕРСИТИ ОФ ПРЕТОРИЯ Включение ссылкой Это заявка заявляет интересы предварительной заявки США с серийным номером 61/108075, от 24 октября 2008 г. и предварительной заявки США с серийным номером 61/163517 от 26 марта 2009 г. Вышеупомянутые заявки и все документы, процитированные в них или в ходе их рассмотрения("документы, процитированные в заявке"), и все документы или ссылки в документах, процитированных в заявке, и все документы, процитированные или упоминаемые в данном документе ("документы, процитированные в данном документе"), и все документы, процитированные или упомянутые в документах,процитированных в данном документе, вместе с какими-либо инструкциями производителя, описаниями,техническими описаниями изделия, технологическими картами для любых продуктов, упомянутых в данном документе, или в любом документе, включенном ссылкой в данный документ, настоящим включены в данный документ ссылкой и могут быть использованы при практическом осуществлении изобретения. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к вакцинации объекта против вируса африканской чумы лошадей(African Horse Sickness Virus (AHSV. В частности, изобретение относится к конструированию и применению рекомбинантных векторов, содержащих и экспрессирующих в хозяине, один или несколько иммуногенных белков вируса африканской чумы лошадей. Изобретение также относится к иммунологическим композициям или вакцинам, которые индуцируют иммунный ответ, направленный против вируса африканской чумы лошадей. Изобретение также относится к таким композициям или вакцинам, которые придают защитный иммунитет против инфекции вирусом африканской чумы лошадей. В данную заявку включены несколько публикаций. Полное цитирование этих документов находится в конце описания, предшествующего формуле изобретения и/или в месте, где цитируется документ. Эти документы относятся к области данного изобретения; и каждый из этих процитированных или упомянутых в данной заявке документов ("документы, процитированные в данной заявке"), и каждый из документов, процитированных или упомянутых в документах, процитированных в данном документе,настоящим включены в данный документ ссылкой. Предшествующий уровень техники Африканская чума лошадей (АЧЛ) (African Horse Sickness (AHS является серьезным, часто фатальным, переносимым членистоногими вирусным заболеванием лошадей и мулов (африканская чума лошадей, ветеринарное руководство "Merck Veterinary Manual"). При некоторых формах этого заболевания смертность может достигать 95%. Бессимптомные или слабовыраженные инфекции могут протекать у лошадей, а также у зебр и ослов, особенно у лошадей, которые ранее были инфицированы различными серотипами вируса. Инфицированные животные или переносчики могут переносить вирус в области без африканской чумы лошадей. Некоторые авторы полагают, что климатические изменения могут повысить риск распространения переносимых членистоногими заболеваний, таких как африканская чума лошадей,как это недавно произошло с родственным вирусом катаральной лихорадки овец (bluetongue virus) (Wilson A. et al., Parasitol. Res. 2008; 103:69-77). Culicoides imicola, основной переносчик данного заболевания, просочился в Северную Африку и Южную Европу. Потенциальные переносчики-членистоногие также существуют практически во всех областях мира, включая значительную часть Соединенных Штатов и остальную часть американского континента. Африканская чума лошадей является результатом инфекции вирусом африканской чумы лошадей,членом рода Orbivirus семейства Reoviridae. На сегодняшний день известно 9 серотипов вируса африканской чумы лошадей. Серотип 9 вируса африканской чумы лошадей широко распространен в эндемических областях, в то время как серотипы 1-8 главным образом обнаружены в ограниченных географических районах. Серотип 9 ответственен за большую часть вспышек африканской чумы лошадей за пределами Африки. Серотип 4 стал причиной вспышки в Испании и Португалии в период между 1987 и 1990 гг. (Lubroth J., Equine Pract. 1988; 10:26-33). Первоначальное исследование вируса африканской чумы лошадей привело к разработке в 1930 гг. вакцины к вирусу африканской чумы лошадей на основе выращенного в мышином мозге ослабленного модифицированного живого вируса. Эти вакцины были улучшены, что привело к разработке в 1960 гг. вакцины на основе выращенного в тканевой культуре ослабленного модифицированного живого вируса(modified live virus (MLV. Несмотря на эффективность этой вакцины, она имеет неустранимые ограничения, включая реакции на вакцину (включая смерть) у индивидуальных животных, различные иммунные ответы у индивидуальных животных, трудности при иммунизации молодых животных с пассивным материнским иммунитетом, возможность реверсии вакцинного вируса к вирулентности и рекомбинация вакцинных штаммов после вакцинации с возможной реверсией вирулентности (du Plessis M. et al., 1998, Onderstepoort Journalof Veterinary Research 65: 321-329). Существуют также социо-экономические последствия применения вакцины на основе MLV. Южная Африка имеет протокол, по которому позволяется экспортировать лошадей в Европейский союз и множество других стран. Этот протокол также позволяет ввозить лошадей из других стран в Южную Африку для участия в различных соревнованиях или позволяет временно оставаться для случки. Протокол основан на обеспечении того, что лошади адекватно вакцинируются про-1 024111 тив вируса африканской чумы лошадей. Ветеринарные учреждения осведомлены об возможных опасностях применения вакцины на основе MLV. Большая часть этих проблем будет в значительной степени устранена разработкой альтернативных вакцин против вируса африканской чумы лошадей. Геном вируса африканской чумы лошадей состоит из десяти двухцепочечных РНК-сегментов (Oellermann, R.A. et al., 1970; Bremer, С.W. et al., 1976), которые кодируют по меньшей мере десять вирусных белков. Геномные сегменты нумеруются от 1 до 10 в порядке миграции в ПААГ. Семь вирусных белков являются структурными и образуют вирусную частицу в двойной оболочке. Внешний капсид состоит из двух основных вирусных белков, VP2 и VP5, которые определяют антигенную вариабельность вирусов африканской чумы лошадей, в то время как внутренний капсид состоит из двух основных (VP3 и VP7) и трех второстепенных (VPL, VP4 и VP6) вирусных белков (Lewis S.A.and Grubman M.J., 1991); Martinez-Torrecuadrada J.L. et al., 1994); Bremer, C.W., et al., 1990; Grubman, M.J.Lewis, S.A., 1992). VP3 и VP7 являются высококонсервативными среди девяти серотипов (Oellermannet al., 1970; Bremer et al., 1990). Было обнаружено по меньшей мере три неструктурных белка, NS1, NS2 иNS3 (Huismans, Н.Els, H.J., 1979); van Staden, V.Huismans, H., 1991); Mizukoshi, N. et al., 1992). На основе рекомбинантных вирусов оспы канареек, полученных из ослабленных вирусов, были разработаны вектора для экспрессии гетерологичных вирусных генов. После этого для применения в качестве вакцин на лошадях (Minke J.M., et al., 2004a and b; Minke J.M., et al., 2007; Siger L., et al., 2006) и других видах (Poulet H., et al., 2003) во множестве стран, включая Южную Африку, Европейский союз и Соединенные Штаты Америки, были лицензировано множество таких конструктов на основе вируса оспы канареек. Тот факт, что эти вакцины содержат только представляющие интерес гены организма, делает их изначально более безопасными (Minke J.M., et al., 2004b). Более того, проявление детектируемого нейтрализующего антитела происходит быстро даже после одиночной дозы вакцины (Minke J.M. et al., 2004b). Присущая безопасность таких вакцин и природа развития нейтрализующего антитела делает такие вакцины особенно привлекательными для применения при эпизоотии (Minke J.M. et al., 2004a). Предыдущие исследования показали, что у лошадей развиваются нейтрализующие антитела к АЧЛ,если им инокулируют экзогенно экспрессированный VP2 и соответствующий адъювант (Scanlen M., etal., 2002). Исследования на овцах показали, что ответ нейтрализующих антител к вирусу катаральной лихорадки овец усиливается инокуляцией овце вирусподобных частиц, в которых одновременно экспрессированы VP2 и VP5 (Pearson L.D., Roy P., 1993). Недавно было показано, что вакцина на основе рекомбинантного вируса оспы канареек, одновременно экспрессирующего гены, кодирующие белки VP2 и VP5 внешнего капсида вируса катаральной лихорадки овец, индуцирует высокие уровни защиты у овец(Boone J.D., et al., 2007). Не было показано, что в лошадях развиваются нейтрализующие антитела, связывающие вирус африканской чумы лошадей, при инокуляции вектором, содержащим и одновременно экспрессирующим белки VP2 и VP5 вируса АЧЛ. Таким образом, можно отметить, что настоящее изобретение удовлетворяет потребность в данной области путем предоставления рекомбинантного вируса оспы, включая композиции и продукты из него, особенно рекомбинанты на основе ALVAC и композиции и продукты из него, особенно такие рекомбинанты, которые экспрессируют белки VP2 и VP5 или любую их комбинацию и композиции и продукты из них. Цитата или указание любого документа в данной заявке не является признанием того, что такой документ доступен в качестве предшествующего уровня техники по отношению к настоящему изобретению. Сущность изобретения Задача настоящего изобретения может быть обеспечена любым или всеми рекомбинантными векторами или вирусами, а также способами для изготовления таких рекомбинантных векторов или вирусов,и может быть обеспечена композициями и/или вакцинами, а также способами для лечения и профилактики инфекции вирусом африканской чумы лошадей. Изобретение дополнительно обеспечивает иммунологические (или иммуногенные) или вакцинные композиции, содержащие такой вирус или продукт(ы) экспрессии такого вируса. Изобретение дополнительно обеспечивает способы для индукции иммунологического (или иммуногенного) или защитного ответа против вируса африканской чумы лошадей, а также способы профилактики или лечения вируса африканской чумы лошадей или болезненного состояния(ий) вызванного вирусом африканской чумы лошадей, содержащий введение вируса или продукта экспрессии вируса или композиции, содержащей вирус, или композиции, содержащей продукт экспрессии вируса. Эти и другие воплощения описаны в или являются очевидными из и охвачены следующим подробным описанием. Краткое описание фигур Следующее подробное описание, данное в качестве примера, но не предназначенное для ограничения изобретения исключительно конкретными описанными воплощениями, может быть лучше понято в сочетании со следующими чертежами, в которых На фиг. 1 показана схема конструирования pLHD3460.4, С 3-донорной плазмиды для полученияALVAC-рекомбинанта, экспрессирующего белки синтетический AHSV-4-VP2 (SEQ ID NO: 1) и синтетический AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO: 2). На фиг. 2 показана карта и соответствующие SEQ ID NO для pLHD3460.4 (рС 3 Н 6 р синтетический(pLHD3460.4) - SEQ ID NO: 4; AHSV-4 VP5 ДНК (pLHD3460.4) - SEQ ID NO: 5; прогнозированная аминокислотная последовательность для AHSV-4 VP2 PRT (pLHD3460.4) - SEQ ID NO: 1; прогнозированная аминокислотная последовательность для AHSV-4-VP5 PRT (pLHD3460.4) - SEQ ID NO: 2. На фиг. 3 представлена схема рекомбинации in vitro для vCP2377 (ALVAC C3 Н 6 р синтетическийAHSV-4-VP2/42Kp-синтетический AHSV-4-VP5). На фиг. 4 представлен теоретический гель после ферментативной рестрикции геномной ДНК, созданный с помощью программы "Vector NTI". На фиг. 5 представлены результаты 0,8% агарозного гель-электрофореза геномной ДНК, экстрагированной из стока Р 3 из vCP2377.6.1.1, после расщепления BamHI, HindIII или PstI. На фиг. 6 представлен результат блот-гибридизации по Саузерну vCP2377.6.1.1 при использовании зонда AHSV-4-VP2. На фиг. 7 представлены результаты вестерн-блоттинга анализа рекомбинантного vCP2377, которые говорят о экспрессии белка AHSV-4-VP5. На фиг. 8 представлены результаты иммуноанализа на бляшках, говорящие о 100% гомогенности популяции vCP2377.6.1.1 с помощью мышиного антитела "10 АЕ 12" пассаж 9, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ при разведении 1:100. На фиг. 9 представлена карта праймеров, примененных для амплификации фрагмента С 3R-(вставка из AHSV)-C3L и ссылки на SEQ ID для рекомбинатных последовательностей vCP2377.6.1.1 (SEQ ID NO: 17-21). На фиг. 10 показана схема конструирования pCXL2415.1 (SEQ ID NO: 22), С 3-донорной плазмиды для получения ALVAC-рекомбинанта, экспрессирующего белки AHSV9-VP2 (SEQ ID NO: 20) и AHSV9VP5 (SEQ ID NO: 21). На фиг. 11 представлена карта и соответствующие SEQ ID NO (18-21) для pCXL2415.1 (pALVAC С 3 AHSV-9 H6 VP2 42K VP5). На фиг. 12 представлена схема рекомбинации in vitro для vCP2383 (ALVAC С 3 Н 6 - синтетическийAHSV9 VP2/42K-синтетический AHSV9 VP5). На фиг. 13 представлен теоретический гель ферментативной рестрикции геномной ДНК, созданный с помощью программы "Vector NTI". На фиг. 14 представлены результаты 0,8% агарозного гель-электрофореза экстрактов ДНК изvCP2383.3.1.1.1 и vCP2383.9.1.1.1, после расщепления BamHI, HindIII или XbaI. На фиг. 15 представлен результат блот-гибридизации по Саузерну vCP2383 при использовании зонда AHSV-4-VP5. На фиг. 16 представлены результаты вестерн-блоттинг анализа рекомбинантного vCP2383, которые говорят о экспрессии белка VP5 из AHSV9. На фиг. 17 представлены результаты иммуноанализа на бляшках, говорящие о 100% гомогенности популяции vCP2383.3.1.1.1 с помощью мышиного антитела "10 АЕ 12" пассаж 9, связывающего белокVP5 вируса АЧЛ при разведении 1:100. На фиг. 18 представлена карта праймеров, примененных для амплификации всего фрагмента C3LH6 AHSV9 VP2-42K AHSV9 VP5-C3R и SEQ ID NO (27-31) соответствующих последовательностей для рекомбинантных последовательностей VCP2383. На фиг. 19 представлены результаты иммунофлюоресценции на инфицированных клетках CEF с антителами, связывающими VP2 и VP5 IFI. На фиг. 20 А и В представлены результаты вестерн-блоттинга на инфицированных и трансфецированных CEF, полученные с помощью антител, связывающих VP2 (А) и VP5 (В). На фиг. 21 представлены результаты теста нейтрализации вируса АЧЛ 4 серотипа (AHSV-4) сывороткой из 6 лошадей, которые были вакцинированы с помощью cpAHSV-4 (vCP2377). Результаты показаны для дней 0, 28 и 42. На фиг. 22 показана схема конструирования pJSY2247.2, С 3-донорной плазмиды для полученияALVAC-рекомбинта, экспрессирующего белки VP2 и VP5 из вируса АЧЛ 5 серотипа (AHSV5). На фиг. 23 представлена карта и соответствующие SEQ ID NO (18-21) для pJSY2247.2 (pALVAC С 3AHSV5 Н 6 VP2 42K VP5). На фиг. 24 представлена схема рекомбинации in vitro для vCP2398 (ALVAC С 3 Н 6 - синтетическийAHSV5 VP2/42K- синтетический AHSV5 VP5). На фиг. 25 представлен теоретический гель ферментативной рестрикции геномной ДНК vCP2398,созданный с помощью программы "Vector NTI". На фиг. 26 представлен результат 0,8% агарозного гель-электрофореза геномной ДНК, экстрагированной из vCP2398.2.1.1 и 3.1.1, после расщепления BamHI, HindIII или PstI. На фиг. 27 представлен результат блот-гибридизации по Саузерну vCP2398 при использовании зон-3 024111 да AHSV5 VP2. На фиг. 28 представлены результаты вестерн-блоттинг анализа рекомбинантного vCP2398, которые говорят о экспрессии белка AHS V5 VP5. На фиг. 29 представлены результаты иммуноанализа бляшек, говорящие о 100% гомогенности популяции vCP2383.2.1.1 с помощью мышиного антитела "10 АЕ 12" пассаж 9, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ при разведении 1:100. На фиг. 30 представлена карта праймеров, примененных для амплификации всего фрагмента C3LH6 AHSV5 VP2-42K AHSV5 VP5-C3R для рекомбинантного vCP2398. На фиг. 31 представлены 3 панели, с результатами тестового заражения вирусом АЧЛ из 8 лошадей,иммунизированных vCP2377 (частично представленного в SEQ ID NO: 17), и контрольной лошади, иммунизированной EIV-CP. Панель А: порог циклов количественного ОТ-ПЦР для генов, которые кодируют белки вируса АЧЛNS2 и VP7 (показан средний профиль для NS2 и VP7). Присутствие вируса АЧЛ в крови лошади было определено анализами количественного ОТ-ПЦР, которые детектируют индивидуальные гены, кодирующие белки VP7 и NS2 вируса АЧЛ с образцами, классифицированными как положительные, если флюоресценция превысила порог 0,1 в течение максимум 40 циклов. Панель В: температура тела, там же. Панель С: количество тромбоцитов в 8 вакцинированных vCP2377 лошадей и у невакцинированной контрольной лошади после тестового заражения вирулентным полевым штаммом вируса АЧЛ, серотип 4, там же. На фиг. 32 представлена таблица, в которой объединены SEQ ID NO, присутствующие в списке последовательностей. На фиг. 33 представлено сравнение "ClustalW" белков VP2 из серотипов 4/5/9 вируса АЧЛ (SEQ IDNO: 2, 45, 31). На фиг. 35 представлено сравнение "ClustalW" синтетического белка AHSV-4-VP2 (SEQ ID NO:1) с белком из полевого изолята, штамма Jane вируса африканской чумы лошадей 4 серотипа (SEQ ID NO: 49). Также указан процент идентичности. На фиг. 36 представлено сравнение "ClustalW" синтетического белка AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO: 2) с белком из полевого изолята, штамма Jane вируса африканской чумы лошадей 4 серотипа (SEQ ID NO: 51). Также указан процент идентичности. На фиг. 37 представлено сравнение "ClustalW" синтетического белка AHSV-4-VP2 (SEQ ID NO: 1) с множеством депонированных белков AHSV-4-VP2 (SEQ ID NO: 59-63). Представлена таблица процента идентичности. На фиг. 38 представлено сравнение "ClustalW" синтетического белка AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO: 2) с множеством депонированных белков AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO: 52-58). Представлена таблица процента идентичности. На фиг. 39 представлено сравнение "ClustalW" оптимизированного по кодонам AHSV-4-VP2 (SEQID NO: 04) с белком AHSV4-VP2 из полевого изолята (SEQ ID NO: 48). Представлен процент идентичности. На фиг. 40 представлено сравнение "ClustalW" оптимизированного по кодонам AHSV4-VP5 (SEQID NO: 05) с белком AHSV4-VP5 из полевого изолята (SEQ ID NO: 50). Представлен процент идентичности. Подробное описание Следует отметить, что в данном раскрытии и особенно в формуле изобретения и/или абзацах, термины, такие как "содержит", "содержащий" и т.п., могут иметь значение, которое придается термину в патентном законе США; они могут означать "включает", "включен", "включенный" и т.п.; и что термины такие как "состоящий в основном" и "состоит в основном" имеет значение, приписанное ему в патентном законе США, например, они позволяют элементам упоминаться не явным образом, но позволяют исключать элементы, которые обнаружены в предшествующем уровне техники или которые влияют на основную или новую характеристику изобретения. Если не указано иное, то технические термины используются в соответствии с обычным применением. Определения общих терминов молекулярной биологии можно найти в Benjamin Lewin, Genes V.Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9) и Robert A. Meyers (ed.),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc.,1995 (ISBN 1-56081-569-8). Термины в единственном числе включают множественные обозначаемые, если контекстом ясно не указано иное. Аналогичным образом, слово "или" предназначено для включения "и", если контекст с очевидностью не указывает на иное. Слово "или" означает один из членов конкретного списка, а также включает в себя любое сочетание членов этого списка. Виды-мишени или объекты (хозяева) включают животное и человека. При использовании в данном документе животные могут быть отобраны из группы, состоящей из представителей лошадиных (например, лошадь), представителей собачьих (например, собак, волков, лис, койотов, шакалов), представителей кошачьих (например, львов, тигров, домашних кошек, диких кошек, других больших кошек и других кошачьих, включая гепардов и рысей), баранов (например, овец), представителей бычьих (например, коров), свиней (например, домашнюю свинью), птиц (например, кур, уток, гусей, индеек, фазанов, попугаев, зябликов, ястребов, ворон, страусов обыкновенных, страусов эму и казуаров), приматов (например,полуобезьян, долгопятов, обезьян, гибонов, человекообразных обезьян) и рыб. Термин "животное" также включает индивидуальное животное во всех стадиях развития, включая стадии эмбриона и плода. Термин "полипептид" и "белок" применяются взаимозаменяемо в данном документе для обозначения полимера последовательных аминокислотных остатков. Термин "нуклеиновая кислота", "нуклеотид" и "полинуклеотид" относятся к РНК или ДНК и к их производным, таким как те, что содержат модифицированные каркасы. Следует отметить, что изобретение обеспечивает полинуклеотиды, содержащие последовательности, комплементарные тем, что описаны в данном документе. Полинуклеотиды по изобретению могут быть приготовлены различными способами (например, химическим синтезом, клонированием генов и т.п.) и могут быть взяты в различных формах (например, линейной или расщепленной, одно- или двухцепочечной или в виде гибрида, праймеров, зондов и т.п.). Термин "ген" широко используется для обозначения какого-либо сегмента полинуклеотида, ассоциированного с биологической функцией. Таким образом, гены или полинуклеотиды включают интроны и экзоны, как, например, в геномной последовательности, или только кодирующие последовательности как в кДНК, такие как открытая рамка считывания (ORF), начиная от стартового кодона (метионинового кодона), и заканчивая сигналом терминации (стоп-кодоном). Гены и полинуклеотиды также могут включать области, которые регулируют их экспрессию, такие как области инициации транскрипции, трансляции и терминации транскрипции. Таким образом, также включены промоторы и участки связывания с рибосомами (как правило, эти регуляторные элементы находятся примерно между 60 и 250 нуклеотидами выше стартового кодона кодирующей последовательности или гена; Doree S.M. et al.; Pandher K. et al.;Chung J.Y. et al.), терминаторы транскрипции (как правило, терминатор расположен в пределах примерно 50 нуклеотидов ниже стоп-кодона кодирующей последовательности или гена; Ward С.K. et al.). Ген или полинуклеотид также относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует мРНК или функциональную РНК, или кодирует конкретный белок, и которая включает регуляторные последовательности. При использовании в данном документе термин "иммуногенный полипептид" или "иммуногенный фрагмент" относится к полипептиду или фрагменту полипептида, который содержит аллельспецифичный мотив, эпитоп или другую последовательность, так что полипептид или фрагмент связывает молекулу ГКГС (МНС) и индуцирует ответ цитотоксических Т-лимфоцитов ("CTL"), и/или Вклеточный ответ (например, продуцирование антител), и/или ответ лимфоцитов Т-хелперов, и/или ответ гиперчувствительности замедленного типа (DTH) в отношении антигена, из которого получен иммуногенный полипептид или иммуногенный фрагмент. Ответ гиперчувствительности замедленного типа является иммунной реакцией, в которой зависимые от Т-клеток активация макрофагов и воспаление вызывают повреждение ткани. Реакция гиперчувствительности замедленного типа на подкожную инъекцию антигена часто используют в качестве анализа опосредованного клетками иммунитета. По определению, эпитоп является антигенной детерминантой, которая является иммунологически активной в том смысле, что, будучи однажды введенным хозяину, является способной вызывать иммунный ответ гуморального (В-клетки) и/или клеточного типа (Т-клетки). На молекуле, которая является антигенной, присутствуют определенные химические группы или пептидные последовательности. Антитело специфически связывает определенный антигенный эпитоп на полипептиде. Конкретные, неограничивающие примеры эпитопа включают тетра- и пентапептидную последовательность в полипептиде,трипентагликозидную последовательность в полисахариде. В животном большинство антигенов будут представлять несколько или даже множество антигенных детерминант одновременно. Такой полипетид также может быть определен, как иммуногенный полипептид, а эпитоп может быть идентифицирован,как описано далее. При использовании в данном документе термин "очищенный" не требует абсолютной чистоты; скорее он подразумевается как относительный термин. Таким образом, например, препарат очищенного полипептида является препаратом, в котором полипептид находится в более обогащенном состоянии, чем полипептид в его естественной среде. Полипептидный препарат является фактически очищенным, если полипептид, представляющий несколько воплощений, составляет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% от общего полипептидного содержания в препарате. То же самое относится к полинуклеотидам. Полипептиды, раскрытые в данном документе, могут быть очищены любым средством известным в данной области. Рекомбинантный полинуклеотид является полинуклеотидом, который имеет последовательность,-5 024111 которая не встречается в природе или имеет последовательность, которая сделана путем искусственного комбинирования двух обычно разделенных сегментов последовательности. Искусственное комбинирование часто осуществляется химическим синтезом, или, более часто, искусственной манипуляцией с выделенными сегментами нуклеиновых кислот, например, методами генетической инженерии. В одном воплощении, рекомбинантный полинуклеотид кодирует химерный белок. В одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полипептиды из вируса африканской чумы лошадей. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает полипептид, имеющий последовательность, изложенную в SEQ IDNO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 63, и его вариант или фрагмент. При использовании в данном документе термин "белок вируса африканской чумы лошадей или полипептид вируса африканской чумы лошадей (AHSV VP)" может включать белки VP1, VP2, VP3, VP4,NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3 из вируса АЧЛ и их гомологи, фрагменты и варианты. Гомологи вирусных белков из вируса африканской чумы лошадей предполагаются как находящиеся в рамках настоящего изобретения. При использовании в данном документе термин "гомолог" включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин "аналог" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам,которые имеют одну и ту же или похожую функцию, но развивались отдельно в неродственных организмах. Термин "ортологи" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам из различных видов, которые развились из общего гена-предшественника в ходе видообразования. Как правило, ортологи кодируют полипептиды, имеющие одни и те же, или похожие функции. Термин "паралог" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые являются родственными по причине дубликации в геноме. Паралоги, как правило, обладают различными функциями, но эти функции могут быть родственными. Аналоги, ортологи и паралоги полипептида вируса африканской чумы лошадей дикого типа могут отличаться от полипептида вируса африканской чумы лошадей дикого типа посттрансляционными модификациями, различиями в аминокислотной последовательности или и по тому, и другому. В частности, гомологи изобретения будут, в общем, демонстрировать, по меньшей мере, идентичность последовательности 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95, 96, 97, 98, 99% со всем или частью полипептида вируса африканской чумы лошадей дикого типа или полинуклеотидными последовательностями и будут демонстрировать похожие функции. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает вирусный белок вируса африканской чумы лошадей идентичный по меньшей мере на 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% полипептиду, имеющему последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62 или 63. В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает фрагменты и варианты идентифицированных выше вирусных белков вируса африканской чумы лошадей (SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35,36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, или 63), которые легко могут быть получены специалистом в данной области с помощью хорошо известных методов молекулярной биологии. Варианты являются гомологичными вирусными белками вируса африканской чумы лошадей, имеющими аминокислотную последовательности, по меньшей мере, с идентичностью 75%, 80%, 85%, 90%,95%, 96%, 97%, 98%, или 99% по отношению к аминокислотной последовательности изложенной в SEQID NO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 63. Варианты включают аллельные варианты. Термин "аллельный вариант" относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему полиморфизмы, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях белка и которые существуют в естественной популяции (например, вирусные виды или разновидности). Такие естественные аллельные варианты могут, как правило, приводить к 1-5% дисперсии в полинуклеотиде или полипептиде. Аллельные варианты могут быть идентифицированы секвенированием представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты во множестве различных видов, что может быть легко проведено при использовании гибридизационных зондов для идентификации одного и того же генного локуса в этих видах. Любая и все такие нуклеотидные вариации и обусловленные ими аминокислотные полифорфизмы или вариации, которые являются результатом природных аллельных вариаций и которые не изменяют функциональную активность представляющего интерес гена, подпадают под объем данного изобретения. Вариант является любым полипептидом из вируса африканской чумы лошадей, способным индуцировать в животных, таких как лошади, вакцинированных этим полипептидом, специфический клеточноопосредованный иммунный ответ, характеризующийся секрецией интерферона-гамма (IFN-) при стимуляции вирусом африканской чумы лошадей. Такая секреция IFN- может быть продемонстрирована с помощью методологии in vitro (например, иммуноанализом "QUANTIKINE" от RD Systems Inc. (каталожный номерCAIF00); Djoba Siawaya J.F. et al.). При использовании в данном документе термин "производное" или "вариант" относится к полипептиду или нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, который имеет одну или несколько консервативных аминокислотных вариаций или других минорных модификаций, так что (1) соответствующий полипептид имеет фактически эквивалентную функцию при сравнении с полипептидом дикого типа или(2) антитело, индуцированное полипептидом, является иммунореактивным по отношению к полипептиду дикого типа. Эти варианты или производные включают полипептиды, имеющие минорные модификации аминокислотных последовательностей полипептида вируса африканской чумы лошадей, которые могут дать в результате пептиды, которые имеют практически эквивалентную активность при сравнении с немодифицированным противоположным вариантом полипептида. Такие модификации могут быть преднамеренными, как те что внесены сайт-направленным мутагенезом, или могут быть спонтанными. Термин "вариант" дополнительно предусматривает делеции, добавления и замены в последовательности при условии, что полипептид вызывает иммунологический ответ, как определено в настоящем документе. Иммуногенный фрагмент полипептида вируса африканской чумы лошадей включает по меньшей мере 8, 10, 15 или 20 последовательных аминокислот, по меньшей мере 21 аминокислоту, по меньшей мере 23 аминокислоты, по меньшей мере 25 аминокислот, по меньшей мере 30 аминокислот полипептида вируса африканской чумы лошадей, обладающий последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1, 2,20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 или в их вариантах. В другом воплощении фрагмент вируса африканской чумы лошадей включает специфический антигенный эпитоп, обнаруженный в полноразмерном полипептиде вируса африканской чумы лошадей. Процедуры определения фрагментов полипептида и эпитопа, такие как получение перекрывающихся пептидных библиотек (Hemmer В. et al), "Pepscan" (Geysen H.M. et al., 1984; Geysen H.M. et al., 1985;Van der Zee R. et al.; Geysen H.M.) и алгоритмы (De Groot A. et al.; Hoop T. et al.; Parker K. et al.), могут быть применены при практическом осуществлении изобретения без проведения излишних экспериментов. Как правило, антитела специфически связывают определенный антигенный эпитоп. Конкретные,неограничивающие примеры эпитопа включают тетра-пентапептидную последовательность в полипептиде, трипентагликозидную последовательность в полисахариде. В животных большинство антигенов будут представлены несколькими или даже множеством антигенных детерминант одновременно. Предпочтительно, если эпитоп являясь белковым фрагментом большей молекулы будет обладать практически такой же иммунологической активностью что и целый белок. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, кодирующий белок VP из вируса АЧЛ, такой как полинуклеотид, кодирующий белок VP из вируса АЧЛ, имеющий последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,61, 62, 63. В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, кодирующий полипептид, идентичный по меньшей мере на 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% полипептиду, имеющему последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21, 30, 31, 35, 36, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, или консервативный вариант, аллельный вариант, гомолог или иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь или по меньшей мере десять конститутивных аминокислот одного из этих полипептидов или комбинацию этих полипептидов. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 22, 27, 28, 29, 32, 33, 34, 41, 42, 43,48, 50, или его вариант. В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, идентичный по меньшей мере на 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%,по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% полинуклеотиду,имеющему последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 22, 27, 28, 29, 32, 33, 34,41, 42, 43, 48, 50 или в их вариантах. Эти полинуклеотиды могут включать последовательности ДНК, кДНК и РНК, которые кодируют вирусный белок VP вируса африканской чумы лошадей. Понятно, что все полинуклеотиды, кодирующие полипептид вируса африканской чумы лошадей, также включены в данный документ при условии, что полипептид обладает распознаваемой активностью, такой как связывание с антителом, которое распознает полипептид, индукцией иммунного ответа к полипептиду или влиянием на выживание при африканской чуме лошадей, при введении объекту, подвергнутому воздействию вируса африканской чумы лошадей, или кто испытывает снижение признака или симптома африканской чумы лошадей. Полинуклеотиды раскрытия включают последовательности, которые являются вырожденными изза генетического кода, например оптимизированная частота применения кодонов для конкретного хозяина. При использовании в данном документе "оптимизированный" относится к полинуклеотиду, который изготовлен генно-инженерно для повышения его экспрессии в данных видах. Для обеспечения оптимизированных полинуклеотидов, кодирующих полипептиды африканской чумы лошадей, последовательность ДНК гена белка вируса африканской чумы лошадей может быть модифицирована так, чтобы она 1) содержала кодоны, которые являются предпочтительными в сильно экспрессированных генах в конкретных видах; 2) содержала состав А+Т или G+C в композиции нуклеотидных оснований как тот, что фактически обнаружен в указанных видах; 3) образовывала исходную последовательность указанных видов; или 4) удаляла последовательности, которые приводят к дестабилизации, неприемлемому полиаденилированию, деградации и терминации РНК или которые образуют шпильки вторичной структуры или сайты сплайсирования РНК. Повышенная экспрессия белка вируса африканской чумы лошадей в указанных видах может быть достигнута применением частот распределения использования кодонов в эукариотах и прокариотах или в определенных видах. Термин "частота предпочтительного использования кодонов" относится к предпочтению, демонстрируемому конкретной клеткой-хозяином в применении нуклеотидных кодонов для определения данной аминокислоты. Существуют 20 аминокислот, большая часть которых определена более чем одним кодоном. Следовательно, все вырожденные нуклеотидные последовательности включены в раскрытие при условии, что кодируемая нуклеотидной последовательностью аминокислотная последовательность полипептида вируса африканской чумы лошадей является функционально неизмененной. Идентичность последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями может быть установлена с помощью алгоритма "pairwise blast" и блоковой матрицы замен с 62% идентичности(BLOSUM62) на сервере NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) с применением стандартных параметров (см. например, алгоритм "BLAST" или "BLASTX" доступный на сервере Национального центра биотехнологической информации (NCBI, Бетесда, Мэриленд, США) а также в работе Altschul et al.; и таким образом, под термином "blast" в этом документе понимается использование или алгоритма "BLAST" или алгоритма "BLASTX" и матрицы "BLOSUM62"). Идентичность последовательностей между двумя нуклеотидными последовательностями также может быть определена с помощью программы "Align" Myers и Miller ("Optimal Alignments in LinearSpace", CABIOS 4, 11-17, 1988) доступной в NCBI, а также с помощью такой же или других программ,доступных через интернет на сайтах, таких как сайт NCBI. В ином случае или дополнительно термин "идентичность" например, в отношении к нуклеотидной или аминокислотной последовательности может указывать на количественную меру гомологии между двумя последовательностями. Процент гомологии последовательностей может быть рассчитан следующим образом: (Nref - Ndif)100/Nref, где Ndif является общим числом неидентичных остатков в двух последовательностях при выравнивании и где Nref является числом остатков в одной из последовательностей. Следовательно, последовательность ДНК AGTCAGTC будет идентичной на 75% последовательности ААТСААТС (Nref = 8; Ndif = 2). В ином случае или дополнительно "идентичность" в отношении последовательностей может относиться к числу позиций с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, разделенное на число нуклеотидов или аминокислот в более короткой из двух последовательностей, где выравнивание двух последовательностей может быть определено в соответствии с алгоритмом Вилбура и Липмана (Wilbur andLipman), например, с помощью размера окна 20 нуклеотидов и длиной "слова" 4 нуклеотида, штрафом за внесение разрыва 4, а компьютерный анализ и интерпретация данных о последовательностях, включая выравнивание, могут быть удобно осуществлены с помощью доступного на коммерческой основе программного обеспечения (например, Intelligenetics Suite, Intelligenetics Inc. Калифорния). Если последовательности РНК называют похожими или обладающими степенью идентичности последовательности или гомологией с последовательностью ДНК, то тимидин (Т) в последовательности ДНК рассматривается как равный урацилу (U) в последовательности РНК. Таким образом, последовательности РНК находятся в пределах объема изобретения и могут быть получены из последовательностей ДНК, если тимидин (Т) в последовательностях ДНК рассматривать как равный урацилу (U) в последовательностях РНК. Идентичность последовательностей или сходство последовательностей для двух аминокислотных последовательностей или идентичность последовательности для двух нуклеотидных последовательностей может быть определена с помощью пакета программного обеспечения "Vector NTI" (Invitrogen, 1600Faraday Ave., Карлсбад, Калифорния). Следующие документы содержат алгоритмы для сравнения относительной идентичности или гомологии последовательностей и дополнительно или альтернативно в отношении вышеизложенного указания в этих источниках могут быть применены для определения процента гомологии или идентичности:Devereux J., Haeberlie P. and Smithies О. И без неоправданных экспериментов специалист может принять во внимание множество других программ или источников для определения процента гомологии. Полинуклеотиды вируса африканской чумы лошадей могут включать рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или в вирус, или в геномную ДНК прокаритота или эукариота, или которая существует как отдельная молекула (например, кДНК), независимая от других последовательностей. Раскрытые в данном документе рекомбинантные векторы могут включать полинуклеотид, кодирующий полипептид, его вариант или его фрагмент. Рекомбинантные векторы могут включать плазмиды и вирусные векторы и могут быть применены для экспрессии in vitro или in vivo. Рекомбинантные векторы могут включать дополнительно сигнальный пептид. Сигнальные пептиды являются короткой пептидной цепью (длиной 3-60 аминокислот), которая направляет пострансляционный транспорт белка (который синтезируется в цитозоле) к некоторых органеллам, таким как ядро, митохондриальный матрикс,эндоплазматический ретикулюм, хлоропласт, апопласт и пероксисома. Сигнальная последовательность может быть естественной последовательностью из белка вируса африканской чумы лошадей, или пеп-8 024111 тидным сигналом из секретируемого белка, например сигнальной последовательностью из белкаактиватора тканевого плазминогена (tPA), в частности из человеческого tPA (S. Friezner Degen et al.; R.Rickles et al.; D. Berg, et al.), или из сигнального пекптида инсулинподобного фактора роста 1 (IGF1), в частности из лошадиного IGF1 (K. Otte et al.), собачьего IGF1 (P. Delafontaine et al.), кошаьего IGF1 (WO 03/022886), бычьего IGF1 (S. Lien et al.), свиного IGF1 (M. Muller et al.), куриного IGF1 (Y. Kajimoto etal.), индюшачьего IGF1 (GenBank учетный номер AF074980). Сигнальный пептид из IGF1 может быть естественным или оптимизированным, что может быть достигнуто удалением криптических сайтов сплайсинга и/или адаптацией по частоте использования кодонов. После трансляции непроцессированный полипептид может быть расщеплен по сайту расщепления, что приводит к образованию зрелого полипептида. Сайт расщепления может быть предсказан с помощью метода Von Heijne (1986). Плазмида может включать единицу транскрипции ДНК, например последовательность нуклеиновой кислоты, которая позволяет ей реплицироваться в клетке-хозяине, такую как точку начала репликации (прокариотическую или эукариотическую). Плазмида также может включать один или несколько селективных маркерных генов и других генетических элементов, известных в данной области. Кольцевые и линейные формы плазмид охвачены в настоящем раскрытии. В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к вакцинной композиции или фармацевтической композиции для индукции иммунологического или защитного ответа в животном-хозяине,инокулированном композицией. Композиция включает носитель или разбавитель или наполнитель и/или адъювант и рекомбинантный вектор, такой как рекомбинантный вирус. Рекомбинантный вирус может быть модифицированным рекомбинантным вирусом; например рекомбинант вируса, в котором инактивированы (например, разрушены или удалены), кодируемые вирусом генетические функции. Модифицированный рекомбинантный вирус может иметь инактивированные в нем, кодируемые вирусом несущественные генетические функции; например, для того, чтобы рекомбинантный вирус имел ослабленную вирулентность и повышенную безопасность. Вирус, примененный в композиции в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно является вирусом оспы, таким как вирус осповакцины или вирус оспы енотов или предпочтительно вирус оспы птиц, например вирус оспы кур или более предпочтительно вирус оспы канареек, и еще более предпочтительно вирус ALVAC. Предпочтительно, чтобы рекомбинантный вектор или рекомбинантный вирус экспрессировался без репликации в млекопитающих. В другом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам, содержащим по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или несколько антигенов вируса африканской чумы лошадей (вирус АЧЛ). Кроме того, изобретение относится к вакцинам или иммуногенетическим композициям, содержащим, для того чтобы вызвать в объекте защитный иммунный ответ, эффективное количество рекомбинантного вектора на основе вируса оспы птиц, содержащего по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или несколько антигенов вируса африканской чумы лошадей (вируса АЧЛ). Кроме того, изобретение относится к соответствующим способам вакцинации объекта против вируса африканской чумы лошадей. Фармацевтически приемлемые носители или наполнители для применения являются обычными. ВRemington's Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975) описываются композиции и составы подходящие для фармацевтической доставки полипептидов, плазмид, вирусных векторов, которые раскрыты в данном документе. В общем, природа носителя или наполнителя будет зависеть от конкретного пути введения, который будет использован. Например, парентеральные составы, как правило, содержат инъецируемые жидкости, которые в качестве носителя включают фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водный раствор декстрозы, глицерин или тому подобное. Для твердых композиций (например, лиофилизированной пастилки, порошка, пилюли, таблетки или капсулы), обычные нетоксичные твердые носители или наполнители могут включать, например, маннит, лактозу, крахмал или стеарат магния фармацевтической категории. В дополнение к биологически нейтральным носителям или наполнителям, вводимые иммуногенные композиции могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, консерванты, буферные агенты и т.п., например ацетат натрия или монолаурат сорбитана. Композиции или вакцины по данному изобретению могут включать векторы, содержащие один или несколько полинуклеотидов, кодирующих один или несколько вирусных белков VP вируса АЧЛ в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше. В одном и том же векторе могут быть сделаны множественные вставки с помощью различных сайтов вставки или с помощью одного и того же участка вставки. Если используется один и тот же участок вставки, то каждая полинуклеотидная вставка, которая может быть любым нуклеотидом, упомянутым в настоящем изобретении, может быть вставлена под контролем одного и того же или различных промоторов. Вставка может быть осуществлена хвост-к-хвосту, голова-к-голове, хвост-к-голове или голова-кхвосту. IRES-элементы (Internal Ribosome Entry Site - участок внутренней посадки рибосомы, см. ЕР 0803573) также может быть использован для разделения и экспрессии множественных вставок, функционально связанных с одним и тем же и/или различными промоторами. В одном воплощении настоящее изобретение относится к экспрессии вектора, содержащего один или несколько вышеупомянутых полинуклеотидов. Экспрессирующий вектор может быть in vivo экспрессирующим вектором или in vitro экспрессирующим вектором. В одном воплощении рекомбинантный вектор или вирус может включать одну или несколько гетерологичных молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют один или несколько антигенов вируса африканской чумы лошадей (вирус АЧЛ), иммуногены, включая эпитопы или их фрагменты. Рекомбинантный вектор или модифицированный рекомбинантный вирус может включать, например, в пределах вирусного генома, а именно в пределах несущественной области вирусного генома, гетерологичную последовательность ДНК, которая кодирует иммуногенный белок, например, полученный из вирусного белка(ов) вируса африканской чумы лошадей, например белки вируса АЧЛ VP1, VP2, VP3, VP4, NS1,VP5, VP6, VP7, NS2, NS3 или любая их комбинация, предпочтительно белки вируса АЧЛ VP 2 и 5 (где иммуногенный белок может быть представляющим интерес эпитопом, например представляющим интерес эпитопом из белка, экспрессируемого любым или несколькими из белков вируса АЧЛ VP1, VP2,VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3, например интересующий эпитоп из белков вируса АЧЛ VP 2 и/или 5). Вектор или вирус предпочтительно является вирусом оспы, таким как вирус осповакцины или вирус оспы енотов или предпочтительно вирус оспы птиц, например вирус оспы кур или более предпочтительно вирус оспы канареек и еще более предпочтительно вирус ALVAC. В другом воплощении гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или несколько антигенов, иммуногенов вируса африканской чумы лошадей (вируса АЧЛ), включая эпитопы или их фрагменты, например, полученные из вирусного белка(ов) вируса африканской чумы лошадей,например белки вируса АЧЛ VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3 или из любой их комбинации, предпочтительно белки вируса АЧЛ VP 2 и 5 (где иммуногенный белок может быть представляющим интерес эпитопом, например представляющим интерес эпитопом из белка, экспрессируемого любым или несколькими из белков VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2 или NS3 вируса АЧЛ,например, представляющим интерес эпитоп из VP2 и/или 5 вируса АЧЛ) функционально связана с промоторной последовательностью и необязательно с энхансером. В предпочтительном воплощении промоторную последовательность выбирают из группы, состоящей из промотора Н 6 вируса осповакцины,промотора I3L вируса осповакцины, промотора 42K вируса оспы, промотора 7,5K вируса осповакцины и промотора Pi вируса осповакцины. Более предпочтительно, если промоторная последовательность является промотором Н 6 вируса осповакцины или промотором 42K вируса оспы. Более предпочтительно,если VP2 функционально связан с промотором Р 6 вируса осповакцины, a VP5 функционально связан с промотором 42K вируса оспы. В другом воплощении гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или несколько антигенов, иммуногенов вируса африканской чумы лошадей, включая эпитопы или их фрагменты, например, полученные из вирусного белка(ов) вируса африканской чумы лошадей, например из белков VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3 вируса АЧЛ или любой их комбинации,предпочтительно из белков VP2 и 5 вируса АЧЛ (где иммуногенный белок может быть представляющим интерес эпитопом, например представляющим интерес эпитопом из белка, экспрессированного любым или несколькими из VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2 или NS3 вируса АЧЛ, например представляющим интерес эпитопом из VP2 и/или 5 вируса АЧЛ) вставляют в вектор, содержащий локусы для вставки, где указанные локусы содержат С 5 и/или С 6 и/или С 3 и где фланкирующие последовательности С 6, С 5 и/или С 3 локусов для вставки промотируют гомологичную рекомбинацию антигенов вируса африканской чумы лошадей с похожим локусом для вставки. В другом воплощении гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или несколько антигенов, иммуногенов вируса африканской чумы лошадей, включая эпитопы или их фрагменты, например, полученные из вирусного белка(ов) вируса африканской чумы лошадей, например из белков VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2, NS3 вируса АЧЛ или любой их комбинации,предпочтительно из белков VP2 и 5 вируса АЧЛ (где иммуногенный белок может быть представляющим интерес эпитопом, например представляющим интерес эпитопом из белка, экспрессированного любым или несколькими из VP1, VP2, VP3, VP4, NS1, VP5, VP6, VP7, NS2 или NS3 вируса АЧЛ, например интересующим эпитопом из VP2 и/или 5 вируса АЧЛ) вставляют в вектор, содержащий локусы для вставки, где указанный локусы содержат С 5 и/или С 6 и/или С 3 и где фланкирующие последовательности С 6,С 5 и/или С 3 локусов для вставки промотируют гомологичную рекомбинацию антигенов вируса африканской чумы лошадей с похожим локусом для вставки, в котором фланкирующие последовательности дополнительно содержат открытые рамки считывания C3L и C3R вируса оспы птиц. В другом воплощении вектором на основе вируса оспы птиц является vCP2377 или vCP2383 илиvCP2398. На практике в настоящем изобретении будут применяться, если не указано иное, обычные методы молекулярной биологии, микробиологии, бактериологии, технологии рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в пределах опыта в данной области. Такие методы в полной мере описаны в литературе. См., например, Sambrook, et al. (1989); 1985); (M.J. Gait ed. 1984); (B.D. HamesS.J. Higgins В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный вектор, например вирус,такой как рекомбинантный вирус оспы, содержащий последовательность ДНК из вируса африканской чумы лошадей, например, в вирусном (например, вируса оспы) геноме, предпочтительно в несущественной области вируса, например генома вируса оспы. Вирусом оспы может быть вирус осповакцины, такой как NYVAC или вирус на основе NYVAC; и вирусом оспы предпочтительно является вирус оспы птиц,такой как вирус оспы кур, особенно ослабленный вирус оспы кур, например TROVAC, или вирус оспы канареек, предпочтительно ослабленный вирус оспы канареек, такой как ALVAC. Однако вектором изобретения может быть любой подходящий рекомбинантный вирус или вирусный вектор, такой как вирус оспы (например, вирус осповакцины, вирус оспы птиц, вирус оспы канареек, вирус оспы кур, вирус оспы енотов, вирус оспы свиней и т.д.), аденовирус (например, аденовирус собачьих), вирус герпеса, бакуловирус, ретровирус и т.п. (как в документах, включенных в данный документ ссылкой); или вектор может быть плазмидой. Рекомбинантный вирус может быть модифицированным рекомбинантным вирусом; например, рекомбинант вируса, в котором инактивированы (например, разрушены или удалены) кодируемые вирусом генетические функции. Модифицированный рекомбинантный вирус может иметь инактивированные в нем кодируемые вирусом несущественные генетические функции; например, для того, чтобы рекомбинантный вирус имел ослабленную вирулентность и повышенную безопасность. Вирус, примененный в композиции в соответствием с настоящим изобретением, предпочтительно является вирусом оспы, таким как вирус осповакцины или вирус оспы птиц, например вирус оспы кур или более предпочтительно вирус оспы канареек, а еще более предпочтительно вирус ALVAC. Предпочтительно, если рекомбинантный вектор или рекомбинантный вирус экспрессируется без репликации в млекопитающих. В одном конкретном воплощении вирусный вектор является вирусом оспы, например вирусом осповакцины или ослабленным вирусом осповакцины (например, MVA, модифицированный штамм Анкара, полученный после более чем 570 пассажей вакцинного штамма Анкара в куриных эмбриональных фибробластах; см. SticklHochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter et al., Proc.NYVAC, а также варианты NYVAC с дополнительным ORF, удаленным из генома штамма Копенганен вируса осповакцины, а также вставку гетерологичных кодирующих молекул нуклеиновой кислоты в участках этого рекомбинанта, и также применение подходящих промоторов; см. также WO 96/40241), вирус оспы птиц или ослабленный вирус оспы птиц (например, вирус оспы канареек, вирус оспы кур, вирус оспы горлиц, вирус оспы голубей, вирус оспы перепелов, ALVAC или TROVAC; см., например, патент США 5505941, 5494807), вирус оспы свиней, вирус оспы енотов, вирус оспы верблюдов или вирус миксоматоза. Рекомбинантные вирусы оспы могут быть сконструированы в две стадии известными в данной области и аналогично способам для создания синтетических рекомбинантов вирусов оспы, таких как вирус осповакцины и вирус оспы птиц, описанный в пат. США 4769330; 4722848; 4603112; 5110587; 5174993; 5494807; 5942235 и 5505941, раскрытие которых включено в данный документ ссылкой. В ином случае, способы для изготовления и/или введения вектора или рекомбинантов или плазмиды для экспрессии генных продуктов генов изобретения либо in vivo, либо in vitro могут быть любым описанным способом, например способом, который является или аналогичным способу, раскрытому в или раскрытому в документах, процитированных в пат. США 6130066, 5494807, 5514375, 5744140, 5744141,5756103, 5762938, 5766599, 5990091, 6004777, 6130066, 6497883, 6464984, 6451770, 6391314, 6387376,6376473, 6368603, 6348196, 6306400, 6228846, 6221362, 6217883, 6207166, 6207165, 6159477, 6153199,6090393, 6074649, 6045803, 6033670, 6485729, 6103526, 6224882, 6312682, 6312683, 6348450, 4603112; 4769330; 5174993; 5505941; 5338683; 5494807; 4394448; 4722848; 4745051; 4769331; 5591639; 5589466; 4945050; 5677178; 5591439; 5552143; 5580859; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 91/11525; WO 98/33510;(McClements, Armstrong et al. 1996);(Ju, Edelstein et al. 1998); и (Robinson and Torres 1997). Элементы для экспрессии полинуклеотида или полинуклеотидов преимущественно присутствуют в векторе изобретения. По минимуму он содержит, состоит преимущественно из или состоит из инициирующего кодона (ATG), стоп-кодона и промотора и, необязательно, также из последовательности полиаденилирования для некоторых векторов, таких как плазмида и некоторые вирусные векторы, например вирусные векторы, отличные от вирусов оспы. Если полинуклеотид кодирует белковый фрагмент, например, преимущественно, в векторе, ATG расположен на 5' рамки считывания, а стоп-кодон расположен на 3'. Могут присутствовать другие элементы для контроля экспрессии, такие как энхансерные последовательности, стабилизирующие последовательности и сигнальные последовательности, обеспечивающие секрецию белка. В патентных заявках WO 90/11092, WO 93/19183, WO 94/21797 и WO 95/20660 воспользовались разработанным недавно методом полинуклеотидных вакцин. Известно, что в этих вакцинах применяют плазмиды способные экспрессировать в клетка-хозяевах антигены, вставленные в плазмиды. Были предложены все пути введения (внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, чрескожный, внутрикожный, через слизистую и т.п.). Также могут быть применены различные средства вакцинации, такие как ДНК, депонированная на поверхности золотых частиц и спроектированные таким образом, чтобы проникнуть в кожу животного (Tang et al., 1992) и безыгольный инъектор, который делает возможным трансфекцию кожи, мышцы жировых тканей а также тканей молочной железы (Furth et al., 1992). (См. также пат. США 5846946, 5620896, 5643578, 5580589, 5589466, 5693622 и 5703055; Ulmer, J.B., et al.,1993; Robinson et al., 1997; Luke et al., 1997; Norman et al., 1997; Bourne et al., 1996; и заметим, что в целом плазмида для вакцины или иммунологической композиции может содержать ДНК, кодирующую антиген, функционально связанный с регуляторными последовательностями, которые контролируют экспрессию или экспрессию и секрецию антигена из клетки-хозяина, например клетки млекопитающего; например, сначала до конца, ДНК для промотора, ДНК для эукариотического лидерного пептида для секреции, ДНК для антигена и ДНК, кодирующую терминатор). В соответствии с другим воплощением изобретения, вектор на основе вируса оспы является вирусом оспы канареек или вирусом оспы кур, преимущественно ослабленным вирусом оспы канареек или кур. В этой связи ссылка сделана на вирус оспы канареек, который можно получить в АТСС по учетному номеру VR-111. Ослабленные вирусы оспы канареек описаны в патенте США 5756103 (ALVAC) и вWO 01/05934. Также доступно множество вакцинных штаммов вируса оспы кур, например штамм"DIFTOSEC СТ", продаваемый "MERIAL" и вакцина "NOBILIS VARIOLE", продаваемая "INTERVET"; также дается ссылка на патент США 5766599, который относится к штамму ослабленного вируса оспы кур "TROVAC". Если экспрессирующим вектором является вирус осповакцины, то участок или участки вставки для экспрессируемого полинуклеотида или полинуклеотидов может быть в гене тимидинкиназы или в участке для вставки, в гене гемагглютинина или в участке вставки, в области, кодирующей тельце включения типа А; см. также документы, процитированные в данном документе, особенно те, которые касаются вируса осповакцины. В случае вируса оспы канареек участком или участками для вставки могут быть открытые рамки считывания С 3, С 5 и/или С 6; см. также документы, процитированные в данном документе, особенно те, которые касаются вируса оспы канареек. В случае вируса оспы кур, участком или участками для вставки могут быть открытые рамки считывания F7 и/или F8; см. также документы, процитированные в данном документе, особенно те которые касаются вируса оспы кур. Участок или участки для вставки области вируса MVA может быть таким, как и в различных публикациях, включая Carrollal., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040; и, в связи с этим также отмечается, что полный геном MVA описан в работе Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396, что позволяет специалисту применять участки для вставки или другие промоторы. В другом воплощении настоящего изобретения экспрессируемый полинуклеотид вставляют под контролем специфического промотора вируса оспы, например промотора вируса осповакцины 7,5 кДа(Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35), промотора вируса осповакцины I3L (Riviere et al., J. Virology,1992, 66, 3424-3434), промотора вируса осповакцины НА (Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), промотора коровьей оспы ATI (Funahashi et al., J. Gen. Virol, 1988, 69, 35-47), промотор вируса осповакцины Н 6(Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al., J. Virol, 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol, 1989, 63, 3829-3836), inter alia. В другом воплощении вирусный вектор является аденовирусом, таким как человеческий аденовирус (HAV) или собачий аденовирус (CAV). Вакцина на основе рекомбинантного вирусного вектора может быть объединена с fMLP (N-формилметионил-лейцил-фенилаланин; США 6017537) и/или адъювантом "CARBOMER" (Pharmeuropa Vol.). В другом воплощении вирусный вектор может быть, но не ограничен перечисленным, аденовирусом человека, свиней, opines, коров и птиц. Для аденовируса человека, особенно аденовируса 5 серотипа,приведенного в некомпетентное состояние путем делеции области Е 1 вирусного генома, в частности примерно от нуклеотида 459 до примерно нуклеотида 3510 со ссылкой на последовательность hAd5, раскрытую в GenBank по учетным номером М 73260 и в указанной публикации J. Chroboczek et al. Virol. 1992, 186, 280-285. Делетированный аденовирус размножают в экспрессирующих Е 1 клетках 293 (F.Graham et al. J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72) или в клетках PER, в частности в PER.C6 (F. Falloux et al. Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917). В человеческом аденовирусе может быть удалена область Е 3, в частности примерно с нуклеотида 28592 примерно по нуклеотид 30470. Делеция в области Е 1 может быть осуществлена в сочетании с делецией в области Е 3 (см., например, J. Shriver et al. Nature, 2002, 415,331-335, F. Graham et al. Methods in Molecular Biology Vol .7: Gene Transfer and Expression Protocols Edited 1996, 70, 4805-4810). Сайтами для вставки могут быть локусы Е 1 и/или Е 3 (области). В результате после частичного или полного удаления областей Е 1 и/или Е 3 участками для вставки могут быть локусы Е 1 и/или Е 3 (области). Если экспрессирующий контроль является аденовирусом, экспрессируемый полинуклеотид может быть вставлен под контролем промотора, функционирующего в эукариотических клетках, таких как сильный промотор, такой как промотор средне-ранних генов цитомегаловируса, в частности область промотора/энхансера с примерно нуклеотида -734 по примерно нуклеотид +7 в М. Boshart etCMV-IE является промотором преимущественно мышиного или человеческого происхождения. Также может быть применен промотор фактора элонгации 1 а. Также может быть применен мышцеспецифичный промотор (X. Li et al. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245). В данном документе также обсуждются сильные промоторы в отношении плазмидных векторов. В одном воплощении последовательность для сплайсинга может быть расположена ниже области энхансера/промотора. Например, интрон 1, выделенный из гена CMV-IE (R. Stenberg et al. J. Virol. 1984, 49, 190), интрон, выделенный из гена -глобина кролика или человека, в частности интрон 2 гена -глобина, интрон, выделенный из иммуноглобулинового гена, последовательность для сплайсинга из раннего гена SV40 или последовательность химерного интрона, выделенная из вектора pCI, Promega Corp., содержащий донорную последовательность из гена глобина человека, слитую с акцепторной последовательностью мышиного иммуноглобулина (от около нуклеотида 890 до около нуклеотида 1022 в последовательности из Genbank с учетным номеромCVU47120). Ниже экспрессируемого полинуклеотида могут быть вставлены поли(А)последовательность и последовательность терминатора, например, из гена бычьего фактора, высвобождающего гормон роста, в частности, с около нуклеотида 2339 по около нуклеотид 2550 последовательности учетным номером в Genbank BOVGHRH (AF242855), и из кроличьего -глобинового гена или из сигнала полиаденилирования позднего гена SV40. В другом воплощении вирусным вектором является собачий аденовирус, в частности CAV-2 (см.,например, L. Fischer et al. Vaccine, 2002, 20, 3485-3497; патент США 5529780; патент США 5688920; заявка РСТWO 95/14102). Для CAV сайты для вставки могут быть в области Е 3 и/или в области, расположенной между областью Е 4 и правой областью ITR (см. патент США 6090393; патент США 6156567). В одном воплощении вставка находится под контролем промотора, такого как цитомегаловирусный промотор средне-ранних генов (промотор CMV-IE) или промотор, уже описанный для промотора аденовируса человека. Поли(А)-последовательность и терминаторная последовательность могут быть вставлены ниже экспрессируемого полинуклеотида, например, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста или кроличьего -глобинового гена. В другом конкретном воплощении вирусный вектор является вирусом герпеса, таким как лошадиный вирус герпеса (EHV 1-5), свиной вирус герпеса (PRV), собачий вирус герпеса (CHV) или кошачий вирус герпеса (FHV). Участки для вставок могут быть в тимидинкиназном гене, в ORF3, или в ORF UL43(для CHV см. патент США 6159477). В одном воплощении экспрессируемый полинуклеотид вставлен под контролем промотора, функционирующего в эукариотических клетках, преимущественно под контролем промотора CMV-IE (мышиного или человеческого). Поли(А)-последовательность и терминаторная последовательность могут быть вставлены ниже экспрессируемого полинуклеотида, например могут быть вставлены сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста или кроличьего -глобинового гена. В более общем плане настоящее изобретение охватывает in vivo экспрессирующие векторы, включая любую плазмиду (ЕР-А 2-1001025; Chaudhuri P.), содержащую и экспрессирующую in vivo в хозяине полинуклеотид или ген полипептида вируса африканской чумы лошадей, его вариант или его фрагмент и элементы, необходимые для его экспрессии in vivo. В соответствии с еще одним воплощением изобретения экспрессирующий вектор является плазмидным вектором или плазмидным вектором из ДНК, в частности, in vivo экспрессирующим вектором. В конкретном, не ограничивающем примере, плазмида pVR1020 или 1012 (VICAL Inc.; Luke С. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217, см.,например, пат. США 5846946 и 6451769) может быть использована в качестве вектора для вставки полинуклеотидной последовательности. Плазмиду pVR1020 получают из pVR1012, и она содержит сигнальную последовательность человеческого tPA. В одном воплощении сигнал человеческого tPA содержит аминокислоты с М(1) по аминокислоту S(23) последовательности из Genbank с учетной записьюHUMTPA14. В другом конкретном, не ограничивающем примере плазмида, используемая в качестве вектора для вставки полинуклеотидной последовательности, может содержать последовательность сигнального пептида лошадиного IGF1 с аминокислоты М(24) по аминокислоту А(48) в Genbank с учетным номером U28070. Дополнительная информация по ДНК-плазмидам, которая может быть принята во внимание или может быть использована при осуществлении на практике, встречается, например, в пат. США 6852705; 6818628; 6586412; 6576243; 6558674; 6464984; 6451770; 6376473 и 6221362. При использовании в данном документе термин "плазмида" может включать любую единицу транскрипции ДНК, содержащую полинуклеотид в соответствии с изобретением и элементы, необходимые для его in vivo экспрессии в клетке или клетках требуемого хозяина или мишени; и в связи с этим отме- 13024111 чается, что суперскрученная или несуперскрученная кольцевая плазмида, а также линейная форма предназначены для включения в объем изобретения. Плазмиды также могут содержать другие регулирующие транскрипцию элементы, такие как, например, стабилизирующие последовательности интронного типа. В некоторых воплощениях плазмида может включать первый интрон CMV-IE (WO 89/01036), интрон II гена кроличьего бета-глобина (van Ooyen et al.), сигнальную последовательность белка, кодируемого активатором тканевого плазминогена (tPA; Montgomery et al.), и/или сигнал полиаденилирования (поли(А, в частности поли(А) гена бычьего гормона роста (bGH) (US 5122458) или поли(А) гена крольичего -глобина или вируса SV40. Каждая плазмида заключает или содержит или в основном состоит из, в дополнение к полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп или иммуноген вируса АЧЛ, необязательно слитый с гетерологичной пептидной последовательностью, вариантом, аналогом или фрагментом, функционально связанный с промотором или под контролем промотора или зависимый от промотора. В общем, в эукариотических клетках предпочтительно использовать сильный промоторный функционал. Предпочтительным сильным промотором является средне-ранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE) из человека или мыши, или необязательно обладающий другим происхождением, например из крысы или морской свинки. ПромоторCMV-IE может содержать действительную промоторную часть, которая может быть или может не быть связана с энхансерной частью. Можно сослаться на ЕР-А-260148, ЕР-А-323597, пат. США 5168062,5385839 и 4968615, а также на заявку РСТWO 87/03905. Промотор CMV-IE преимущественно является человеческим CMV-IE (Boshart M. et al., Cell, 1985, 41, 521-530) или мышиным CMV-IE. Сильный клеточный промотор, который может быть с пользой применен при практическом осуществлении изобретения, является промотором гена цитоскелета, например промотором десмина (Kwissa M. et al.), или промотором актина (Miyazaki J. et al.). Функциональные субфрагменты этих промоторов, т.е. части этих промоторов, которые поддерживают адекватную промоторную активность, включены в настоящее изобретение, например, укороченные промоторы CMV-IE в соответствии с WO 98/00166 или US 6156567 и могут быть применены при практическом осуществлении изобретения. Следовательно, полезный при практическом осуществлении изобретения промотор может включать производные и/или подфрагменты полноразмерного промотора, которые поддерживают адекватную промоторную активность и следовательно функционируют как промотор, и которые могут преимущественно обладать промоторной активностью, которая фактически подобна той, что есть у реального или полноразмерного промотора, из которого получены производное или субфрагмент, например, сродни активности укороченных промоторовCMV-IE из US 6156567 в сравнении с активностью полноразмерных промоторов CMV-IE. Таким образом, промотор CMV-IE при осуществлении на практике изобретения может содержать или фактически состоять из или состоять из части промотора полноразмерного промотора и/или энхансерной части полноразмерного промотора, а также производных и/или их субфрагментов. В более общем плане промотор является либо вирусного, либо клеточного происхождения. Сильным вирусным промотором, отличным от CMV-IE, который может быть эффективно применен при практическом осуществлении изобретения, является ранний/поздний промотор вируса SV40 или LTRпромотор вируса саркомы Рауса. Сильным клеточным промотором, который может быть эффективно применен при практическом осуществлении изобретения, является промотор гена цитоскелета, например промотор десмина (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344), или промотор актина (Miyazaki J. et al.,Gene, 1989, 79, 269-277). В настоящее изобретение включены функциональные субфрагменты этих промоторов, т.е. части этих промоторов, которые поддерживают адекватную промотирующую активность, например, укороченные промоторы CMV-IE в соответствии с заявкой РСТWO 98/00166 или патентом США 6156567 могут быть применены при практическом осуществлении настоящего изобретения. Промотор при практическом осуществлении изобретения, следовательно, может включать производные и/или субфрагменты полноразмерного промотора, которые поддерживают адекватную промоторную активность и,следовательно, функционируют как промотор, а предпочтительная промотирующая активность фактически подобна той, что есть у реального или полноразмерного промотора, из которого получены производное или субфрагмент, например, сродни активности укороченных промоторов CMV-IE из патента США 6156567 в сравнении с активностью полноразмерных промоторов CMV-IE. Таким образом, промоторCMV-IE при осуществлении на практике изобретения может содержать или фактически состоять из или состоять из части промотора полноразмерного промотора и/или энхансерной части полноразмерного промотора, а также производных и/или субфрагментов. Предпочтительно, если плазмиды содержат или фактически состоят из других экспрессирующих контрольных элементов. Особенно предпочтительно включить стабилизирующую последовательность(и), например, интронную последовательность(и),предпочтительно первый интрон hCMV-IE (заявка РСТWO 89/01036), II интрон кроличьего глобинового гена (van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344). Что касается сигнала полиаденилирования (поли(А для плазмид и вирусных векторов, отличных от вирусов оспы, то применение может быть осуществлено сигналом поли(А) гена бычьего гормона роста (bGH) (см. патент США 5122458), или сигналом поли(А) кроличьего гена -глобина, или сигналом поли(А) вируса SV40. В соответствии с другим воплощением изобретения экспрессирующие векторы являются экспрессирующими векторами, применяемыми для экспрессии in vitro белков в соответствующей клеточной системе. Экспрессированные белки могут быть собраны в или из культуральной надосадочной жидкости,после или не после секреции (если секреция отсутствует, то, как правило, осуществляется лизис клеток),необязательно сконцентрированы способами концентрации, такими как ультрафильтрация и/или очищены средствами очистки, такими как методы аффинной, ионообменной хроматографии или гельфильтрации. Выделение и очистка рекомбинантно экспрессируемого полипептида могут быть проведены обычными средствами, включая препаративную хроматографию (например, гель-фильтрацию, ионообменную, аффинную хроматографии), селективную преципитацию и ультрафильтрацию. Примеры методов данной области, которые могут быть применены, без ограничения перечисленным, можно найти в "Protein Purification Applications", Second Edition, edited by Simon Roe, Oxford University Press. Такой рекомбинантно экспрессируемый полипептид является частью настоящего изобретения. Также охватываются способы для производства какого-либо полипептида в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше, в частности применение вектора для рекомбинантной экспрессии, содержащего полинуклеотид в соответствии с раскрытием, и применение клетки-хозяина. Вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные вектора в соответствии с изобретением, могут быть лиофилизированными преимущественно со стабилизатором. Лиофилизирование может быть выполнено в соответствии с хорошо известными стандартными процедурами лиофилизации. Фармацевтически или ветеринарно приемлемыми стабилизаторами могут быть углеводы (например, сорбит, маннит,лактоза, сахароза, глюкоза, декстран, трегалоза), глутамат натрия (Tsvetkov T. et al.; Israeli E. et al.), белки, такие как пептон, альбумин, лактальбумин или казеин, белоксодержащие агенты, такие как обезжиренное молоко (Mills С.K. et al.; Wolff E. et al.), и буферы (например, фосфатный буфер, фосфатный буфер с щелочным металлом). Адъювант может быть применен для изготовления растворимых лиофилизированных препаратов. Любая композиция или вакцина в соответствии с изобретением может также преимущественно содержать один или несколько адъювантов. Рецептуры вакцин на основе плазмид могут быть составлены с катионными липидами, преимущественно с DMRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)пропанаммоний; WO 96/34109), или совместно с нейтральным липидом, например, DOPE (диолеоил-фосфатидил-этаноламин;Behr J.P.) для образования DMRIE-DOPE. В одном воплощении смесь делается импровизировано, и перед ее введением желательно подождать от около 10 до около 60 мин, например около 30 мин, для соответсвующего комплексообразования смеси. Когда DOPE применяется, молярное соотношениеDMRIE/DOPE может быть от 95/5 до 5/95, а преимущественно 1/1. Массовое соотношение плазмида/DMRIE или DMRIE-DOPE адъювант составляет, например, от 50/1 до 1/10, от 10/1 до 1/5 или от 1/1 до 1/2. Необязательно к композиции может быть добавлен цитокин, особенно GM-CSF или цитокины, индуцирующие Thl (например, IL12). Эти цитокины могут быть добавлены к композиции в виде плазмиды,кодирующей белок цитокина. В одном воплощении цитокины являются цитокинами собачьего происхождения, например, собачий GM-CSF, чья последовательность была депонирована в базе данных Genbank(учетный номер S49738). Эта последовательность может быть применена для создания указанной плазмиды аналогичной той, что была сделана в WO 00/77210."Клетка-хозяин" означает прокариотическую или эукариотическую клетку, которая была генетически изменена или является способной к генетическому изменению путем введения экзогенного полинуклеотида, такого как рекомбинантная плазмида или вектор. Когда речь идет о генетически измененных клетках, термин относится к первоначально измененной клетке и к ее потомкам. Преимущественные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются перечисленным, клетки почек детенышей хомяка(ВНК), клетки рака толстой кишки (Сасо-2), клетки COS7, клетки MCF-7, клетки MCF-10A, клетки почек собаки Мадин-Дарби (MDCK), клетки легких норки (MvILu), клетки MRC-5, клетки U937 и клеткиVERO. Полинуклеотиды, содержащие требуемую последовательность, могут быть вставлены в любой подходящий вектор для клонирования и экспрессии, а вектор, в свою очередь, может быть введен в подходящую клетку-хозяин для репликации и амплификации. Полинуклеотиды могут быть введены в клетки-хозяева любым средством известным в данной области. Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяин любым из множества соответствующих средств, включая прямое поглощение, эндоцитоз, трансфекцию, f-спаривание, электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других субстанций; бомбардировку микрочастицами, липофекцию; и инфекцию (когда вектор является инфекционным, например, ретровирусным вектором). Выбор векторов для введения или полинуклеотидов часто будет зависеть от особенностей клетки-хозяина. В полинуклеотидных вакцинах могут применяться как оголенная ДНК, так и ДНК в составе, например, липосом или катионных липидов или с CpG. Нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислоты вируса африканской чумы лошадей из-за вырожденности генетического кода, также находятся в объеме изобретения. Например,много аминокислот кодируются более чем одним триплетом. Кодоны, которые определяют одну и ту же аминокислоту, или синонимы (например, CAU и САС являются синонимами гистидина) в результате могут привести к "молчащей" мутации, которая не влияет на аминокислотную последовательность белка. Вариации последовательности ДНК, которые приводят к изменениям в аминокислотной последовательности целевых белков вируса африканской чумы лошадей, кодируемые рекомбинантными векторами настоящего изобретения, также охвачены настоящим изобретением. Любая и все такие нуклеотидные вариации и полученные в результате аминокислотные вариации находятся в пределах объема изобретения. Также возможно модифицировать структуру целевых полипептидов вируса африканской чумы лошадей, кодируемых рекомбинантными векторами настоящего изобретения для таких целей, как усиление терапевтической или профилактической эффективности (например, повышение иммуногенности полипептида). Такие модифицированные полипептиды, когда их разрабатывают для сохранения по меньшей мере одной активности естественно-встречающейся формы белка, рассматриваются как функциональные эквиваленты полипептидов вируса африканской чумы лошадей, описанных более детально в данном документе. Такие модифицированные полипептиды могут быть получены, например, аминокислотной заменой, делецией или добавлением. Например, разумно ожидать, что выделенная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или подобная замена аминокислоты на структурно похожую аминокислоту(например, при консервативных мутациях) не будет оказывать существенное влияние на биологическую активность полученной в результате молекулы. Консервативными заменами являются те, которые имеют место в пределах семейства аминокислот, которые являются родственными по их боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты могут быть разделены на четыре семейства: (1) кислые=аспартат,глутамат; (2) основные=лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные=аланин, валин, лейцин, изолейцин,пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные=глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют совместно как ароматические аминокислоты. Подобным образом, аминокислотный репертуар может быть сгруппирован в виде (1) кислых=аспартат, глутамат; (2)основных =лизин, аргинин, гистидин; (3) алифатических=глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин, с серином и треонином необязательно сгруппированными отдельно в качестве алифатических-гидроксильных; (4) ароматических=фенилаланин, тирозин, триптофан; (5) амидных=аспарагин, глутамин; и (6) серосодержащих=цистеин и метионин, (см., например, Biochemistry, 2nd ed., Ed. by L. Stryer, W.H. Freeman and Co.,1981). Будет ли изменение в аминокислотной последовательности приводить к функциональному гомологу может быть легко определено оценкой способности вариантного полипептида продуцировать ответ в клетках в той же манере, что и в белке дикого типа. Что касается представляющих интерес эпитопов, то дается ссылка на Kendrew, THE ENCYCLOPEDIA OF MOLECULAR BIOLOGY (Blackwell Science Ltd., 1995) и Sambrook, et al. 1982. Представляющий интерес эпитоп является иммонологически релевантной областью иммуногена или его иммунологически активного фрагмента, например, из патогена или токсина, представляющий интерес в ветиренарии или для человека, например из вируса африканской чумы лошадей. Специалист в данной области может определить эпитоп или иммунодоминантную область пептида или полипептида и, следовательно, кодирующую ДНК из информации об аминокислотной или соответствующей ДНК-последовательности пептида или полипептида, а также исходя из природы определенных аминокислот (например, размер, заряд,и т.п.) и кодонового словаря, без проведения излишних экспериментов. ДНК-последовательность предпочтительно кодирует, по меньшей мере, области пептида, которые образуют антительный ответ или Т-клеточный ответ. Один способ определения Т- и В-клеточных эпитопов включает картирование эпитопов. Представляющий интерес белок синтезируют в виде коротких перекрывающихся пептидов (PEPSCAN). Индивидуальные пептиды затем тестируют на их способность связывать антитело, которое получено против естественного белка или индуцировать активацию Т- или В-клеток, Janis Kuby, (1992). Другой способ определения представляющего интерес эпитопа заключается в выборе областей белка, которые являются гидрофильными. Гидрофильные остатки часто находятся на поверхности белка и,следовательно, часто находятся в областях белка, который доступен антителу, Janis Kuby, (1992). Еще один способ выбора представляющего интерес эпитопа, который может вызывать Т-клеточный ответ заключается в идентификации в белковой последовательности потенциальных связывающих мотивов,ответственных за заякоривание HLA, которые являются пептидными последовательностями, которые известны способностью связывать молекулу МНС. Пептид, который является предполагаемым интересующим эпитопом для вызова Т-клеточного ответа, должен быть презентирован в МНС-комплексе. Пептид предпочтительно содержит подходящие заякоривающие мотивы для связывания с молекулами МНС и для образования иммунного ответа должен связываться с достаточно высокой аффинностью. Некоторые принципы при определении того, является ли белок представляющим интерес эпитопом,- 16024111 который будет стимулировать Т-клеточный ответ, включают длину пептида - пептид должен быть по меньшей мере 8 или 9 аминокислот в длину для того, чтобы соответствовать комплексу МНС класса I, и по меньшей мере 13-25 аминокислот в длину для того, чтобы соответствовать комплексу МНС класса II. Длина является минимумом для связывания пептида с комплексом МНС. Для пептидов предпочтительно быть длиннее, чем эти длины, потому что клетки могут расщеплять экспрессированные пептиды. Пептид должен содержать соответствующий заякоривающий мотив, который будет способен с различными молекулами класса I или II с достаточно высокой специфичностью для образования иммунного ответа (см.Bocchia, M. et al.; Englehard, VH, (1994. Это может быть осуществлено без проведения излишних экспериментов, сравнением последовательности интересующего белка с опубликованными структурами пептидов, ассоциированных с молекулами МНС. Кроме того, специалист может определить представляющий интерес эпитоп сравнением последовательности белка с последовательностями, перечисленными в белковой базе данных. Далее другой способ заключается просто в образовании или экспрессии частей представляющего интерес белка, образовании моноклональных антител к этим частям представляющего интерес белка, и затем в определении того, ингибируют ли эти антитела in vitro рост патогенна, в котором образован полученный белок. Специалист может использовать другие правила, изложенные в данном раскрытии и в данной области для образования или экспрессии частей представляющего интерес белка для анализа того, ингибируют ли антитела к нему рост in vitro. В дополнительных воплощениях изобретение обеспечивает рекомбинантный вектор, содержащий одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько белков вируса африканской чумы лошадей, например VP2 и/или VP5, которые были модифицированы из их естественной формы для преодоления иммунодоминантного ненейтрализующего эпитопа. Иммунодоминантные ненейтрализующие эпитопы действуют как ловушки против нейтрализующих эпитопов, например, направляя иммунный ответ, минуя нейтрализующий эпитоп. Иммунодоминантные ненейтрализующие эпитопы могут быть обнаружены в иммуногенных белках патогенов, таких вирус африканской чумы лошадей. Настоящее изобретение охватывает рекомбинантные векторы и модифицированные рекомбинантные вирусы,содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие один или несколько белков вируса африканской чумы лошадей, которые были модифицированы из их естественной формы, например, делецией(ями) и/или вставкой(ами) и/или заменами аминокислотного остатка(ов) в естественной последовательности. Что касается "иммуногенной композиции", "иммунологической композиции" и "вакцины", то иммунологическая композиция, содержащая вектор (или продукт его экспрессии), вызывает иммунологический ответ - локальный или системный. Ответ не обязательно может быть защитным. Иммуногенная композиция, содержащая рекомбинант или вектор по изобретению (или продукт его экспрессии), точно так же вызывает локальный или системный иммунологический ответ, который необязательно может быть защитным. Вакцинная композиция вызывает локальный или системный защитный ответ. Соответственно, термины "иммунологическая композиция" и "иммуногенная композиция" включают "вакцинную композицию" (поскольку два исходных термина могут быть защитными композициями). Изобретение охватывает иммунологические, иммуногенные или вакцинные композиции. В соответствии с настоящим изобретением рекомбинантный вектор, например вирус, такой как вирус оспы, экспрессирует генные продукты инородного гена(ов) вируса африканской чумы лошадей или молекулу(ы) нуклеиновой кислоты. Специфические вирусные белки вируса африканской чумы лошадей или специфические молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие эпитоп(ы) вирусных белков вируса африканской чумы лошадей, вставлены в рекомбинантный вектор, например вирус, такой как вектор на основе вируса оспы, и полученный в результате вектор, например рекомбинантный вирус, такой как вирус оспы, применяют для инфекции животного или для экспрессии in vitro продукта(ов) для введения животному. Экспрессия в животном генных продуктов вируса африканской чумы лошадей приводит к образованию иммунного ответа в животном к вирусу африканской чумы лошадей. Таким образом, рекомбинантный вектор, например вирус, такой как рекомбинантный вирус оспы настоящего изобретения,может быть использован в иммунологической композиции или вакцине для обеспечения средств индукции иммунного ответа. Процедура введения рекомбинантного вектора, например рекомбинантного вируса, такого как рекомбинантный вирус оспы-вирус АЧЛ или его продукта экспрессии, а также композиций изобретения,таких как иммунологические и вакцинные композиции или терапевтические композиции (например,композиции, содержащие рекомбинантный вектор или рекомбинантный вирус, такой как вирус оспы,или продукт его экспрессии), может быть осуществлена парентеральным путем (внутрикожным, внутримышечным или подкожным). Такое введение позволяет вызвать системный иммунный ответ или гуморальный или опосредованный клетками ответы. Вектор или рекомбинантный вирус-вирус АЧЛ, например вирус оспы-вирус АЧЛ или продукт его экспрессии, или композиция, содержащая такой продукт экспрессии и/или вектор или вирус, могут быть введены лошадям любого возраста или пола; например вызвать иммунологический ответ против вируса африканской чумы лошадей, например, с целью профилактики вируса африканской чумы лошадей и/или других патологических осложнений, ассоциированных с вирусом африканской чумы лошадей. Предпоч- 17024111 тительно, если вектор или рекомбинантный вирус-вирус АЧЛ, например вирус оспы-вирус АЧЛ, или продукт его экспрессии, или композиция, содержащая такой продукт экспрессии и/или вектор или вирус,вводят лошадям, включая новорожденных и/или беременных кобыл для придания активного иммунитета в течение беременности и/или пассивного иммунитета новорожденному через материнские антитела. В предпочтительном воплощении изобретение предусмотрено для инокуляции лошади (например, кобылы) композицией, содержащей иммуноген из вируса африканской чумы лошадей или представляющий интерес эпитоп из такого иммуногена, например иммуногена VP2 и/или VP5 вируса АЧЛ, и/или представляющий интерес эпитоп, экспрессированный любым или несколькими вирусными белками VP или композицией VP, и/или вектором, экспрессирующим такой иммуноген или представляющий интерес эпитоп. Инокуляция может быть осуществлена до скрещивания; и/или до спаривания; и/или в течение беременности, и/или до перинатального периода; и/или многократно в течение жизни. Предпочтительно, если по меньшей мере одну инокуляцию осуществляют до спаривания. Также предпочтительно, если последующую инокуляцию осуществляют в течение беременности, например примерно в середине беременности(около 5-6 месяцев беременности) и/или в конце беременности (или около 10-11 месяцев беременности). Таким образом, преимущественным режимом является инокуляция перед спариванием и вторичная инокуляция в ходе беременности. После чего может быть осуществлена повторная инокуляция перед каждым спариванием и/или в течение каждой беременности примерно в середине беременности (около 5-6 месяцев беременности) и/или в конце беременности (или около 10-11 месяцев беременности). Предпочтительно, если повторная инокуляция может быть осуществлена только в течение беременности. В другом предпочтительном воплощении жеребята, такие как жеребята от вакцинированных самок (например,инокулированных, как обсуждалось в данном документе), инокулированы в течение первых месяцев жизни, например инокулированы на третий и/или четвертый, четвертый и/или пятый, пятый и/или шестой и шестой месяцы жизни. Еще более предпочтительно, если позднее такие жеребята затем повторно инъецируются через 2-8 недель (после первой инокуляции). Таким образом, и потомку, и лошади (например, кобыле) могут быть введены композиции изобретения, и/или они могут быть объектами осуществления способов изобретения. Инокуляции могут быть введены в дозах, описанных в данном документе. В отношении введения композиции на основе вируса оспы или вирусной композиции и материнского имммунитета дается ссылка на патент США 5338683. В отношении дозировок, путей введения, составов, адъювантов и применений для рекомбинантных вирусов и продуктов их экспрессии композиции изобретения могут быть использованы для парентерального введения или введения через слизистую предпочтительно внутрикожным, подкожным и внутримышечным путями. Если применяют введение через слизистую, то можно использовать пероральный, глазной и назальный пути. Изобретение в еще одном аспекте относится к продукту экспрессии рекомбинанта или вектора изобретения, например, вируса, например рекомбинантного вируса оспы, и, следовательно, к применениям, таким как образование иммунологических или вакцинных композиций для лечения, профилактики, диагностики или тестирования; и относится к ДНК из рекомбинанта или вируса по изобретению, например из вируса оспы, который полезен при конструировании ДНК-зондов и ПЦР-праймеров. Рекомбинантный вектор по изобретению или вирус-вирус АЧЛ (например, рекомбинанты вируса оспы-вируса АЧЛ) иммунологические или вакцинные композиции или терапевтические композиции могут быть получены в соответствии со стандартными методами хорошо известными специалистам в фармацевтической и ветеринарной областях. Такие композиции могут быть введены в дозах и методами,хорошо известными специалистам в области ветеринарии, принимая во внимание такие факторы, как возраст, пол, массу и путь введения. Композиции могут быть введены отдельно либо могут быть введены совместно или введены последовательно с композициями, например, с "другой" иммунологической композицией, или ослабленной, инактивированной рекомбинантной вакциной или терапевтическими композициями, тем самым обеспечивая мультивалент или "коктейль" или комбинацию композиций изобретения и способы их применения. Композиция может содержать комбинации компонентов вируса африканской чумы лошадей (например, рекомбинантный вектор, такой как плазмида или вирус или вирус оспы,экспрессирующий иммуноген вируса африканской чумы лошадей или представляющий интерес эпитоп и/или иммуноген вируса африканской чумы лошадей или представляющий интерес эпитоп) и одну или несколько вакцин против лошадиных патогенов (например, представляющий интерес эпитоп(ы), иммуноген(ы) и /или рекомбинантный вектор или вирус, такой как рекомбинантный вирус, например рекомбинантный вирус, экспрессирующий такой эпитоп(ы) или иммуноген(ы, такие как один или несколько иммуногенов и представляющих интерес эпитопов из одного или нескольких бактериальных и/или вирусных патогенов, например, представляющий интерес эпитоп или иммуноген из одного или нескольких перечисленных: лошадиный вирус герпеса (EHV), вирус гриппа лошадиных (EIV), вирус западного нила(WNV) и венесуэльский энцефаломиелит лошадиных (VEE), столбняк, бешенство и потомакская лихорадка лошадей + ЕРМ. Опять-таки, ингредиенты и способ введения (последовательный или совместное введение), а также дозировки могут быть определены с учетом таких факторов, как возраст, пол, масса и путь введения. В этом отношении дана ссылка на патент США 5843456, включенный в данный документ ссылкой и нацеленный на композиции против бешенства и комбинацию композиций и их применения. Примеры композиций изобретения включают жидкие препараты для введения через слизистую, например пероральное, назальное, глазное и т.п. введение, например, суспензий и препаратов для парентерального, подкожного, внутрикожного, внутримышечного (например, инъецируемое введение), например, стерильных суспензий или эмульсий. В таких композициях рекомбинантный вирус оспы или иммуногены могут быть в смеси с подходящим носителем, разбавителем или наполнителем, таким как стерильная вода, физиологический раствор и т.п. Композиции также могут быть лиофилизированы или заморожены. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие и увлажняющие агенты, буферные вещества, адъюванты, консерванты и т.п. в зависимости от пути введения и требуемого препарата. Композиции могут содержать по меньшей мере одно адъювантное соединение, выбранное из гидроксида алюминия, метаболизируемого масла, содержащего терпеновые углеводороды и полиоксиэтилен-полиоксипропилен блок-сополимер, полимеры акриловой и метакриловой кислоты, сополимеры малеинового ангидрида и алкенильное производное и иммуностимулирующую комплексную матрицу (ISCOM), содержащую гликозиды QUIL А, холестерин, антиген и/или фосфолипиды. Предпочтительные адъювантные соединения являются перекрестно-связанными полимерами акриловой и метакриловой кислоты, особенно полиалкениловыми эфирами сахаров или полиспиртов. Эти соединения известны под термином КАРБОМЕР (CARBOMER) (Pharmeuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). Специалист в данной области может также сослаться на патент США 2909462 (включенный в данный документ ссылкой), в котором описаны такие акриловые полимеры перекрестно-связанные с полигидроксилированными соединениями имеющими по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не больше чем 8, атомы водорода по меньшей мере трех гидроксилов, замененных ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются те, что содержат от 2 до 4 атомов углерода, например винилы, аллилы и другие этиленоненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы могут сами по себе содержать другие заместители,такие как метил. Особенно подходят продукты, продаваемые по названием "CARBOPOL" (BFGoodrich, Огайо, США). Они перекрестно сшиты с аллильной сахарозой или с аллильным пентаэритритом. Среди них можно упомянуть "CARBOPOL" 974P, 934 Р и 971P. Среди кополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного, предпочтительными являются кополимеры "EMA" (Monsanto), которые являются кополимерами малеинового ангидрида и этилена, линейные или перекрестно-связанные, например перекрестно-связанные дивиниловым эфиром. Можно сослаться на работу J. Fields et al., 1960, включенную в данный документ ссылкой. С точки зрения их структуры, полимеры акриловой и метакриловой кислоты и кополимеры"ЕМА" предпочтительно образованы основными единицами следующей формулы:R1 и R2, которые являются одинаковыми или различными, представляют Н или СН 3; х=0 или 1, предпочтительно х=1; у=1 или 2, с х+у=2. Для кополимеров "ЕМА", х = 0 и у = 2. Для карбомеров х=у=1. Растворение этих полимеров в воде приводит к образованию кислого раствора, который будет нейтрализован предпочтительно до физиологического значения рН для того, чтобы получить раствор адъюванта, в который включена вакцина. Карбоксильные группы полимеров частично находятся в форме СОО-. Предпочтительно, если раствор адъюванта по изобретению, особенно карбомер, готовят в дистиллированной воде предпочтительно в присутствии хлорида натрия, при этом полученный раствор имеет кислое значение рН. Стоковый раствор разводят добавлением требуемого количества (для получения конечной концентрации) или его существенной части, воды с NaCl, предпочтительно физиологический раствор (NaCl, 9 г/л) одновременно в несколько порций с сопровождающей или последующей нейтрализацией (рН с 7,3 по 7,4), предпочтительно с NaOH. Этот раствор при физиологическом рН будет применяться для смешивания с вакциной, которая может специально храниться в лиофилизированной, жидкой или замороженной форме. Концентрация полимера в конечной вакцинной композиции будет от 0,01 до 2% мас./об., более предпочтительно от 0,06 до 1% мас./об., предпочтительно от 0,1 до 0,6% мас./об. Композиции изобретения также могут быть составлены в виде эмульсии "масло в воде" или в виде"вода в масле в воде", например, как в работе V. Ganne et al. (1994). Стандартные тексты, такие как "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985,включенные в данный документ ссылкой, могут быть использованы для справки и приготовления подхо- 19024111 дящих препаратов, без проведения излишних экспериментов. Изобретением предусмотрены композиции в формах для различных путей введения. И опять же,эффективная дозировка и путь введения определяются известными факторами, такими как возраст, пол,масса и другие процедуры контроля, которые известны и не требуют проведения излишних экспериментов. Дозировки каждого активного агента могут быть такими же, как и в документах, процитированных в данном документе (или документах, на которые даны ссылки или которые процитированы в документах,процитированных в данном документе). Рекомбинантные векторы могут быть введены в подходящем количестве для получения in vivo экспрессии, соответствующей дозировкам, описанным в данном документе и/или в документах, процитированных в данном документе. Например, подходящие диапазоны для вирусных суспензий могут быть определены эмпирически. Вирусный вектор или рекомбинант в изобретении может быть введен в лошадь или инфицирован или трансфецирован в клетки в количестве около по меньшей мере 103 БОЕ; более предпочтительно от 104 до 1010 БОЕ, например около от 105 до 109 БОЕ, например около 106 до 108 БОЕ на дозу, например на 2 мл дозу. И, если более чем один генный продукт экспрессируется более чем одним рекомбинантном, каждый рекомбинант может быть введен в данных количествах; или каждый рекомбинант может быть введен так, чтобы в комбинации сумма рекомбинантов содержала эти количества. В композициях рекомбинантного вектора, примененных в изобретении, дозировки могут быть такими же, как описанные в документах, процитированных в данном документе, или как описанные в данном документе или как в документах, на которые даны ссылки или которые процитированы в документах,процитированных в данном документе. Например, подходящие количества каждой ДНК в композициях рекомбинантного вектора может быть от 1 мкг до 2 мг, предпочтительно от 50 мкг до 1 мг. Документы,процитированные в данном документе (или в документах, на которые даны ссылки или которые процитированы в документах, процитированных в данном документе) в отношении ДНК-векторов, могут быть использованы в качестве справки специалистом для определения других подходящих дозировок для композиций с рекомбинантным ДНК-вектором изобретения, без проведения избыточных экспериментов. Однако дозировки композиции(ий), концентрация компонентов в ней и хронометраж введения композиции(ий), которая вызывает соответствующий иммунологический ответ, могут быть определены способами, такими как титрование антитела в сыворотке, например ИФА и/или анализ нейтрализации сывороткой и/или оценка тестового вакцинирования лошадей. Такие определения не требуют проведения излишних экспериментов исходя из осведомленности специалиста, данного раскрытия и документов, процитированных в данном документе. А время для последовательных введений может быть также установлено с помощью способов, определенными данным раскрытием, и информации в данной области, без проведения излишних экспериментов. Иммуноген или представляющий интерес эпитоп вируса африканской чумы лошадей может быть получен из любого из девяти серотипов вируса африканской чумы лошадей или может быть получен invitro рекомбинантной экспрессией гена(ов) африканской чумы лошадей или их частей. Способы изготовления и/или применения векторов (или рекомбинантов) для экспрессии и применения продуктов экспрессии и продуктов, полученных с их помощью (таких как антитела), могут быть или могут быть аналогичными способам, раскрытым в документах, процитированных в данном документе и документах, на которые даны ссылки или которые процитированы в документах, процитированных в данном документе. Подходящие дозировки также могут быть основаны на примерах приведенных ниже. Изобретение в конкретном аспекте направлено на рекомбинантные вирусы оспы, содержащие последовательности ДНК из вируса африканской чумы лошадей, преимущественно в несущественной области генома вируса оспы. Рекомбинантные вирусы оспы экспрессируют генные продукты инородного гена вируса африканской чумы лошадей. В частности, гены VP2 и VP5, кодирующие белки вируса африканской чумы лошадей, были выделены, охарактеризованы и вставлены в ALVAC-рекомбинанты (вектор на основе вируса оспы канареек). Одно воплощение изобретения относится к новому штамму вируса АЧЛ, штамму Jane серотипа 4 вируса африканской чумы лошадей. Имея, таким образом, подробно описанные предпочтительные воплощения настоящего изобретения следует понимать, что изобретение, описанное в абзацах выше, не ограничено определенными деталями,изложенными в описании выше, поскольку множество их очевидных вариаций возможны без отхода от духа и объема настоящего изобретения. Далее изобретение будет описано с помощью представленных ниже неограничивающих примеров. Примеры Без дополнительного уточнения считается, что специалист в данной области может с помощью предыдущих описаний осуществить на практике настоящее изобретение в наиболее полной мере. Следующие подробные примеры должны быть истолкованы как всего лишь иллюстративные и не ограничивающие предшествующее раскрытие в какой бы то ни было форме. Специалисты в данной области быстро распознают соответствующие вариации процедур как для реагентов, так и для условий реакции и методов. Конструирование ДНК-вставок, плазмид и рекомбинантных вирусных векторов проводили с помо- 20024111A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Все фрагменты рестрикции, использованные для настоящего изобретения, были выделены с помощью набора"Geneclean" (BIO 101 Inc., Ла-Хойя, Калифорния). Пример 1. Конструирование рекомбинантных вирусных векторов на основе вируса оспы канареек. Синтетические гены, кодирующие белки VP2 и VP5 вируса африканской чумы лошадей, использовали для конструирования рекомбинантного вектора на основе вируса оспы канареек. Вкратце, генные сегменты L2 и М 5, которые соответственно кодируют белки VP2 и VP5 вируса африканской чумы лошадей серотипов 4, 5 и 9, амплифицировали полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипциейBonneau K.R., et al. (1999). Последовательности генов L2/VP2 (SEQ ID NO: 48) и M5/VP5 (SEQ ID NO: 50) вирулентного полевого изолята серотипа 4 вируса африканской чумы лошадей (AHSV-4) (далее именуемого как "штаммJane вируса африканской чумы лошадей 4 серотипа (AHSV4-Jane)") сравнивали с опубликованными последовательностями этих генов из других штаммов серотипа 4 вируса АЧЛ которые доступны в Genbank,а затем с помощью програмного обеспечения "GeneOptimizer" (Geneart GmbH) были получены оптимизированные синтетические последовательности для химического синтеза эррея олигонуклеотидов, который охватывает каждый индивидуальный ген. Олигонуклеотиды были собраны с помощью основанной на ПЦР стратегии для получения полных, полноразмерных синтетических кодирующих последовательностей VP2 и VP5. Синтетические гены, кодирующие VP2 и VP5, затем субклонировали в вектор из вируса оспы канареек для получения рекомбинанта вируса оспы канареек и вируса АЧЛ (AHSV-СР), в основном, так же, как ранее было описано для вакцины на основе рекомбинантного вируса оспы канареек,несущего вирус Западного Нила (WNV-CP) (Minke J.M., et al. 2004a). Вкратце, синтетический ген, кодирующий VP2 из серотипа 4 вируса АЧЛ (SEQ ID NO: 4) субклонировали в С 3-вставку вектора на основе вируса оспы канареек (плазмиду, содержащую промотор Н 6 вируса осповакцины и фланкирующие плечи локуса С 3 вируса оспы канареек) для образования экспрессирующей кассеты, содержащей ген VP2 (SEQ ID NO: 4) под контролем промотора Н 6. Затем экспрессирующую кассету, содержащую синтетический ген VP5 (SEQ ID NO: 5) под контролем промотора 42K вируса оспы из насекомого Amsacta moorei, конструировали и клонировали в донорную плазмиду Н 6VP2. Полученная в результате плазмида со вставками содержала две экспрессирующие кассеты, с геномVP2 (SEQ ID NO: 4) под контролем промотора Н 6 и геном VP5 (SEQ ID NO: 5) под контролем промотора 42K в ориентации голова к хвосту. Для получения вирусного рекомбинанта AHSV-CP плазмиду со вставками трансфецировали в первичные клетки куриных эмбриональных фибробластов (CEF), которые затем инфицировали вирусом оспы канареек. Через 24 ч трансфецированные-инфицированные клетки собирали, обрабатывали ультразвуком и использовали для скрининга рекомбинантных вирусов (Piccini A., et al. (1987. Рекомбинантные плашки скринировали методом in situ гибридизации с перенесенными бляшками (Sambrook et al.,1982) с помощью зонда, специфичного к вирусу АЧЛ. Через 4 последовательных цикла очистки бляшек,рекомбинанты, подтвержденные гибридизацией как 100% положительные по вставке вируса африканской чумы лошадей, амплифицировали и применяли для приготовления вакцинных стоков, которые хранили при -80 С. Пример 2. Конструирование донорной плазмиды pLHD3460.4, экспрессирующей синтетическийAHSV-4-VP2, под контролем промотора Н 6, и синтетический AHSV-4-VP5, под контролем промотора 42K. На фиг. 1 показана схема конструирования pLHD3460.4 (SEQ ID NO: 6), С 3-донорной плазмиды для получения ALVAC-рекомбинанта, экспрессирующего вирусные белки AHSV-4-VP2 и AHSV-4-VP5. Гены, кодирующие AHSV-4-VP2 (SEQ ID NO: 4) и AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO: 5), являются синтетическими с кодоновой оптимизацией для экспрессии в клетках млекопитающих. Синтетический ген AHSV4-VP2 (SEQ ID NO: 4) помещали под контроль промотора рС 3 Н 6 р вируса осповакцины, а синтетический ген AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO: 5) помещали под контроль промотора 42K вируса осповакцины. Плазмида также содержит ген, придающий устойчивость к ампициллину. Плазмиду, содержащую синтетический ген AHSV-4-VP2, расщепляли рестриктазами BamHI и NruI. Полученную в результате 3,2 кб вставку с AHSV-4-VP2 выделяли и клонировали по сайтам BamHI/NruI шатл-вектора, приготовленного из pJY1107.5 (pF8 AIV H7N2 НА) для создания pLHD3410.9 (pF8 H6pAHSV-4-VP2), которая содержит сайт NruI в промоторе Н 6 и полноразмерный AHSV-4-VP2, за которым следует сайт XhoI.pLHD3410.9 снова разрезали NruI и XhoI и 3,2 кб фрагмент ДНК, содержащий 3' NruI промотора Н 6 и полноразмерный ген AHSV-4-VP2 выделяли и клонировали по сайтам NruI/XhoI ALVAC С 3-донорной плазмиды, полученной из pJY1738.2 (рС 3 Н 6 р CPV-VP2) для получения pLHD3426.1, ALVAC С 3 донорной плазмиды, содержащей экспрессирующую кассету H6p-AHSV-4-VP2. Экспрессирующую кассету 42Kp-AHSV-4-VP5, фланкированную сайтом SpeI, амплифицировали ПЦР с помощью плазмиды, содержащей AHSV-4-VP5, которую использовали в качестве матрицы, и па- 21024111 ры праймеров 13599.JY (SEQ ID NO: 7) и 13600.JY (SEQ ID NO: 8). Праймер 13599.JY (SEQ ID NO: 7) содержит сайт SpeI последовательности промотора 42K, за которым следует 5' последовательность VP5. Праймер 13600.JY (SEQ ID NO: 8) состоит из 3' последовательности VP5, следующей после T5NT и сайта SpeI. Амплифицированную экспрессирующую кассету затем клонировали в pCR2.1, TOPO-вектор для получения pCR2.1 42Kp AHSV-4-VP5, в котором подтверждали наличие корректной последовательности. Плазмиду pCR2.1 AHSV-4-VP5 разрезали с помощью SpeI, выделяли экспрессирующую кассету 42Kp-VP5 и клонировали по сайту SpeI плазмиды pLHD3426.1 для получения ALVAC С 3-донорной плазмиды, содержащей двойные экспрессирующие кассеты H6p-AHSV-4-VP2/42Kp-VP5 (pLHD3460.4),которые секвенировали и в которых подтверждали наличие корректных последовательностей, изложенных в SEQ ID NO: 6. Праймеры для амплификации кассеты, экспрессирующей 42Kp-AHSV-4-VP5 были следующими: Предсказанные молекулярные массы были 124,3 кДа для AHSV-4-VP2 (SEQ ID NO: 1) и 57 кДа дляAHSV-4-VP5 (SEQ ID NO: 2). Изоэлектрические точки были 6,75 для AHSV-4-VP2 и 5,8 для AHSV-4VP5. Оба вирусных белка были обнаружены в цитоплазме. Пример 3. Конструирование рекомбинатного вирусного вектора vCP2377 (ALVAC С 3 Н 6 р- синтетический AHSV-4-VP2/42Kp-синтетический AHSV-4-VP5). Для получения рекомбинантного вирусного вектора vCP2377 донорную плазмиду, pLHD3460.4(SEQ ID NO: 6) и родительский вирус, ALVAC (4,41010 БОЕ/мл) рекомбинировали in vitro с помощью клеток первичных куриных эмбриональных фибробластов (первичные CEF или CEF). На фиг. 3 описана эта процедура. Для подтверждения рекомбинантного вирусного вектора была применена гибридизация специфичного зонда AHSV-4-VP5 с бляшками.In vitro-рекомбинацию (IVR) осуществляли трансфекцией первичных клеток CEF, линеаризованной с помощью NotI донорной плазмиды pLHD3460.4 (15 мкг) с помощью реактива "Fugene" Roche, Пало Алто, Калифорния 94304-1353). Трансфецированные клетки затем инфицировали ALVAC (4,41010 БОЕ/мл) в качестве вспомогательного вируса с множественностью инфекции (MOI) 10. Через 24 ч трансфецированные-инфицированные клетки собирали, обрабатывали ультразвуком и использовали для скрининга рекомбинантных вирусов. Скрининг рекомбинантных бляшек осуществляли на основе метода гибридизации с перенесенными бляшками (Sambrook et al., 1982) с помощью специфического зондаAHSV-4-VP5, который метили пероксидазой хрена в соответствии с протоколом производителя (Amersham, Альфаретта, Джорджия 30058, Cat RPN3001). После 3 последовательных раундов очистки бляшек рекомбинант, обозначенный как vCP2377.6.1.1 (частичная последовательность дана в SEQ ID NO: 17),получали и подтверждали гибридизацией как 100% положительный по вставке вируса АЧЛ и 100% отрицательный по пустому С 3-сайту. Одиночные бляшки выбирали на последнем раунде очистки бляшек и размножали для получения стоков Р 1 (Т-25 флакон), Р 2 (Т-75 флакон) и P3 (роллерный флакон) для амплификации vCP2377.6.1.1. Рекомбинант дополнительно подтверждали на уровне Р 2 гибридизацией и обнаружили, что он является 100% положительным по вставке и 100% отрицательным по пустому локусу С 3. Жидкость инфицированной клеточной культуры из роллерных флаконов собирали и концентрировали для получения вирусного стока (3,2 мл vCP2377.6.1.1 с 1,21010 БОЕ/мл). Мышиное антитело, связывающее BTV4-VP2 и мышиное антитело 10 АЕ 12, пассаж 9, связывающее белок VP5 вируса АЧЛ (Martinez-Torrecuadrada, J. etal., Virology 257, 449-459, 1999), применяли для вестерн-блоттинга и иммуноанализа на бляшках (фиг. 7 и 8 соответственно). Клетки, используемые для in vitro рекомбинации, клетки первичных куриных эмбриональных фибробластов (первичные CEF), выращивали в 10% фетальной бычьей сыворотке (FBS) (JRH bioscience, Ленекса, Канзас 66215: -облученные, cat 12107, Lot1L0232), и в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (Invitrogen/BRL/Gibco, Карлсбад, Калифорния, 92008-7321, cat 11960) дополненных 4 мМ глутамином (Invitrogen/BRL/Gibco, Карлсбад, Калифорния, 92008-7321, cat 25030-081) и 1 мМ пируватом натрия (Invitrogen/BRL/Gibco cat 11360-070) в присутствии 1 антибиотика/антимикотика (P/S/A/A,Invitrogen/BRL/Gibco cat 15240-062). "Fugene" (Roche, Lot 181444). Конечные вирусные концентраты ресуспендировали в 1 мМ Tris, рН 9,0. Пример 4. Анализ рекомбинантного вирусного вектора vCP2377 (ALVAC С 3 Н 6 р-синтетическийAHSV-4-VP2/42Kp-синтетический AHSV-4-VP5). Сток Р 3 повторно подтверждали гибридизацией как 100% положительный по вставке AHSV-4-VP2 и 100% отрицательный по пустым локусам С 3. Теоретическая карта рестрикции геномной ДНК (фиг. 4) была создана с помощью программы "Vector NTI" (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Для осуществления реального эксперимента геномную ДНК экстрагировали из концентрата вируса vCP2377.6.1.1, разрезали с помощью BamHI, HindIII или PstI и разделяли 0,8% агарозным гель-электрофорезом. Результаты показали корректную вставку инородной генной последовательности. Блот-гибридизация по Саузерну: геномную ДНК расщепленную BamHI, HindIII, или PstI, переносили на нейлоновую мембрану и осуществляли блот-гибридизацию по Саузерну зондом AHSV-4-VP2. Наблюдали полосы ожидаемого размера, а именно 16047 п.н., 6971 п.н. BamHI, 20660 п.н. HindIII и 13658 п.н., 4061 п.н. PstI. Результаты продемонстрировали корректную вставку AHSV-4-VP2 и AHSV-4-VP5 в локусы С 3 (фиг. 6). Анализ экспрессии: клетки первичные CEF инфицировали стоком Р 3 vCP2377.6.1.1 с множественностью инфекции (MOI) 10 и инкубировали при 37 С в течение 24 ч. Затем собирали клетки и культуральную надосадочную жидкость. Белки образца разделяли на 10% геле SDS-PAGE, переносили на нейлоновую мембрану "IMMOBILON" и исследовали отдельно с помощью мышиного антитела "10 АЕ 12" пассаж 9, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ (Martinez-Torrecuadrada, J. et al., 1999) в разведении 1:100. Конъюгированную с пероксидазой козью сыворотку, связывающую мышиные антитела, применяли в качестве вторичного антитела и полосы визуализировали с помощью реактивов для детекции "Amersham". В клеточных осадках vCP2377.6.1.1 с помощью мышиного антитела, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ, детектировали белковые полосы между 55 и 70 кДа, что указывает на экспрессию белкаAHSV-4-VP5 (фиг. 7). Экспрессия белка AHSV-4-VP5 не была обнаружена в культуральной среде. Экспрессию AHSV-4-VP2 не обнаружили мышиными антителами анти-BTV4-VP2 (проприетарный материал"Merial"). Иммуноанализ бляшек: однородность популяции vCP2377.6.1.1 на 100% доказана иммуноанализом бляшек с помощью мышиного антитела "10 АЕ 12" пассаж 9, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ (Martinez-Torrecuadrada, J. et al., 1999) в разведении 1:100 (фиг. 8). Антитело, связывающее белок VP2 вируса АЧЛ, не было доступно. Анализ последовательности: более детальный анализ геномной ДНК стока Р 3 осуществляли амплификацией ПЦР и анализом последовательности фланкирующих плечей локуса С 3 и вставок AHSV-4VP2 и AHSV-4-VP5. Праймеры 8103. JY (SEQ ID NO: 13)/13616.LH (SEQ ID NO: 15) и 13637.LH (SEQ IDNO: 16)/8104.JY (SEQ ID NO: 14) применяли для амплификации целого фрагмента C3R-вставки VP2/VP5AHSV-4-C3L (фиг. 9). Полученная в результате последовательность, а именно SEQ ID NO: 17, указывает на то, что последовательности вставок AHSV-4-VP2 и AHSV-4-VP5, правого и левого плеча С 3 вокруг вставок вируса АЧЛ в VCP2377.6.1.1, были корректными. Праймеры для амплифиции зонда AHSV-4-VP2: Праймеры для амплификации зонда AHSV-4-VP5: Пример 5. Конструирование донорной плазмиды pCXL2415.1, экспрессирующей синтетическийAHSV-9-VP2 под контролем промотора Н 6 и синтетический AHSV-9-VP5 под контролем промотора 42K. Общая схема конструирования pCXL2415.1 (SEQ ID NO: 22) изображена на фиг. 10. Плазмиду, содержащую синтетический AHSV-9-VP2 (SEQ ID NO: 28), разрезали NruI/BamHI и фрагмент длиной 3188 п.о. выделяли и клонировали в линеаризованную NruI/BamHI плазмиду pJY1107.5 (pF8 H6p-AIV H7N2 НА). Полученная в результате плазмида, pCXL2275.1 (pF8 H6p-AHSV-9-VP2), содержит сайт NruI промотора Н 6 и полноразмерный AHSV-9-VP2, за которым следует сайт XhoI. После подтверждения последовательности pCXL2275.1 разрезали NruI/XhoI и фрагмент AHSV-9-VP2 длиной 3194 п.о. выделяли и клонировали в разрезанную NruI/XhoI плазмиду pJY1738.2 (ALVAC С 3-донорная плазмида). Полученная в результате плазмида, pCXL2328.4 (рС 3 H6p-AHSV-9-VP2), содержит экспрессирующую кассету H6pAHSV-9-VP2. Для получения экспрессирующей кассеты 42Kp-AHSV-9-VP5 ДНК, кодирующую ген синтетический AHSV-9-VP5, амплифицировали ПЦР с помощью праймеров 18020CXL (SEQ ID NO: 23) и 1802ICXL (SEQ ID NO: 24). Продукт ПЦР затем клонировали с помощью вектора ТОРО pCR2.1 для получе- 23024111 ния плазмиды pCXL2313.2 (pCR2.1 42Kp-VP5). Однако было обнаружено, что pCXL2313.2 не содержит последовательности TN5T на конце гена VP5 из-за дизайна праймера 18020CXL. В следствии этого синтезировали новый набор праймеров, 18041CXL (SEQ ID NO: 46) и 18042CXL (SEQ ID NO: 47), и применяли его для введения последовательности T5NT в конце гена VP5 в плазмиду pCXL2313.2. Сайтнаправленный мутагенез проводили с помощью набора Stratagene's "QuickChange", Stratagene, а полученную в результате плазмиду, pCXL2399.3, секвенировали и подтверждали в ней наличие правильной экспрессирующей кассеты, фланкированной сайтами SpeI. Плазмиду pCXL2399.3 затем разрезали SpeI и фрагмент длиной 1556 п.о., содержащий экспрессирующую кассету 42Kp-AHSV-9-VP5 выделяли и клонировали по сайту SpeI плазмиды pCXL2328.4 для создания pCXL2415.1 (SEQ ID NO: 22), которая является ALVAC С 3-донором, содержащим двойные экспрессирующие кассеты H6p-AHSV-9-VP2/42KpAHSV-9-VP5 в ориентации голова к хвосту (фиг. 11). Предсказанные молекулярные массы для AHSV-9VP2 и AHSV-9-VP5 равны 123,5 кДа и 56,8 кДа соответственно. Изоэлектрические точки VP2 и VP5 равны 8,14 и 5,96 соответственно, и белки экспрессируются главным образом в цитоплазму. Пример 6. Конструирование рекомбинантного вирусного вектора vCP2383 (ALVAC С 3 Н 6 рсинтетический AHSV-9-VP2/42Kp-синтетический AHSV-9-VP5). Рекомбинантный вирусный вектор vCP2383 получали по схеме in vitro рекомбинации (IVR), изображенной на фиг. 12. IVR осуществляли трансфекцией клеток первичных куриных эмбриональных фибробластов (CEF) 13,2 мкг линеаризованной SapI донорной плазмидой pCXL2415.1 с помощью реагента для трансфекции "FuGENE HD" (Roche, Cat 04709705001). Трансфецированные клетки затем инфицировали ALVAC (4,41010 БОЕ/мл) в качестве вспомогательного вируса с множественностью инфекции(MOI) 10. Через 24 ч трансфецированные-инфицированные клетки собирали, обрабатывали ультразвуком и использовали для скрининга рекомбинантных вирусов. Скрининг рекомбинантных бляшек осуществляли на основе метода гибридизации с перенесенными бляшками (Sambrook et al., 1982) с помощью специфического зонда AHSV-9-VP5, который метили пероксидазой хрена в соответствии с протоколом производителя (Amersham, Cat RPN3001). Через 4 последовательных раунда очистки бляшек рекомбинанты, обозначенные как vCP2383.3.1.1.1 иvCP2383.9.1.1.1, получали и подтверждали гибридизацией как 100% положительные по вставке вируса АЧЛ и 100% отрицательные по локусам С 3. Одиночные бляшки выбирали на последнем раунде очистки бляшек и размножали для получения стоков Р 1 (Т-25 флакон), Р 2 (Т-75 флакон) и P3 (роллерный флакон) для амплификации vCP2383.3.1.1.1. Жидкость инфицированной клеточной культуры из роллерных флаконов собирали и концентрировали для получения вирусного стока (4,5 мл vCP2383.3.1.1.1 с 2,21010 БОЕ/мл). Пример 7. Анализ рекомбинантного вирусного вектора vCP2383 (ALVAC С 3 Н 6 р-синтетическийAHSV-9-VP2/42Kp-синтетический AHSV-9-VP5). Сток Р 3 повторно подтверждали гибридизацией как 100% положительный по вставке AHSV-9-VP2 и 100% отрицательный по пустым локусам С 3. Геномный анализ: теоретически предсказанный гель результатов рестрикции геномной ДНКvCP2383 получали с помощью "Vector NTI" (фиг. 13). Для осуществления реального эксперимента геномную ДНК экстрагировали из концентрата вируса vCP2383.3.1.1.1 и разрезали с помощью BamHI,HindIII или XbaI и разделяли 0,8% агарозным гель-электрофорезом. Результаты показали корректную вставку инородной генной последовательности. (фиг. 14). Блот-гибридизация по Саузерну: геномную ДНК, расщепленную BamHI, HindIII или XbaI, переносили на нейлоновую мембрану и осуществляли блот-гибридизацию по Саузерну зондом AHSV-9-VP5. Наблюдали полосы ожидаемого размера, а именно 4940 п.о. BamHI, 20633 п.о. HindIII и 9559 п.о. XbaI. Результаты показали корректную вставку AHSV-9-VP2 и AHSV-9-VP5 в локусы С 3 (фиг. 15). Анализ экспрессии: клетки первичные CEF инфицировали стоком Р 3 vCP2383.3.1.1.1 с множественностью инфекции (MOI) 10 и инкубировали при 37 С в течение 26 ч. Клетки и культуральный супернатант собирали, белки образца разделяли на 10% геле SDS-PAGE, переносили на нейлоновую мембрану"IMMOBILON" и исследовали отдельно с помощью мышиного антитела "10 АЕ 12" пассаж 9, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ (Martinez-Torrecuadrada, J. et al., 1999) в разведении 1:100. Конъюгированную с пероксидазой козью сыворотку, связывающую мышиные антитела, применяли в качестве вторичного антитела, а полосы визуализировали с помощью реактивов для детекции "Amersham". В клеточных осадках vCP2383.3.1.1.1 с помощью мышиного антитела, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ, детектировали белковые полосы между 55 и 72 кДа, что указывает на экспрессию белка AHSV-9-VP5. Экспрессия белка AHSV9-VP5 не была обнаружена в культуральной среде. Экспрессию AHSV-9-VP2 не обнаружили мышиными антителами анти-BTV4-VP2 (проприетарный материал "Merial"). Иммуноанализ бляшек: однородность популяции vCP2383.3.1.1.1 на 100% доказана иммуноанализом бляшек с помощью мышиного антитела "10 АЕ 12" пассаж 9, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ(Martinez-Torrecuadrada, J et al., 1999) в разведении 1:100 (фиг. 17). Анализ последовательности: более детальный анализ геномной ДНК стока Р 3 осуществляли амплификацией ПЦР и анализом последовательности фланкирующих плечей локуса С 3 и вставок AHSV-9- 24024111(SEQ ID NO: 14) (фиг. 18) использовали для амплификации целого фрагмента C3L-H6-AHSV-9-VP2-42KAHSV-9-VP5-C3R. Полученная в результате последовательность, а именно SEQ ID NO: 27, указывает на то, что последовательности вставок AHSV-9-VP2 (SEQ ID NO: 28) и AHSV-9-VP5 (SEQ ID NO: 29) и правого и левого плеча С 3 вокруг вставок из вируса АЧЛ в vCP2383.3.1.1.1 были корректными. Праймеры для амплификации зонда AHSV-9-VP5 Праймеры для амплификации зонда AHSV-9-VP2 Пример 8. Конструирование донорной плазмиды pJSY2247.2 (SEQ ID NO:32), экспрессирующей синтетический AHSV-5-VP2 под контролем промотора Н 6 и синтетический AHSV- 5-VP5 под контролем промотора 42K. Общая схема конструирования pJSY2247.2 (SEQ ID NO: 32) изображена на фиг. 22. Плазмиду, содержащую синтетический ген AHSV-5-VP2 (SEQ ID NO:33), расщепляли рестриктазами XhoI и NmI. Полученную в результате вставку AHSV-5-VP2 (SEQ ID NO: 33) выделяли и клонировали по сайтамpJSY2245.1, ALVAC С 3-донорной плазмиды, содержащей экспрессирующую кассету H6p-AHSV-5-VP2. Экспрессирующую кассету 42Kp-AHSV-5-VP5, фланкированную сайтом SpeI, выделяли из плазмиды, содержащей синтетический AHSV-5-VP5 (SEQ ID NO: 34) расщеплением по SpeI и затем клонировали по сайту SpeI в плазмиду pJSY2245.1 для создания ALVAC С 3-донорной плазмиды, содержащей двойные экспрессирующие кассеты pJSY2247.2 (SEQ ID NO:32; H6p-AHSV-5-VP2/42Kp-VP5), которые были секвенированы и в которых было подтверждено наличие правильных последовательностей. Диаграмма плазмиды pJSY2247.2 и соответствующих последовательностей указаны на фиг. 23. Молекулярные массы для синтетического AHSV-5-VP2 (SEQ ID NO: 35) и синтетического AHSV-5-VP5 (SEQ IDNO: 36) были равны около 122,9 кДа и около 57,1 кДа соответственно. Изоэлектрические точки для синтетического AHSV-5-VP2 (SEQ ID NO: 35) и синтетического AHSV-5-VP5 (SEQ ID NO: 36) были равны около 8,4 и 5,77 соответственно. Оба вирусных белка были обнаружены главным образом в цитоплазме. Пример 9. Конструирование рекомбинантного вирусного вектора vCP2398 (SEQ ID NO: 41) (H6 синтетический AHSV-5-VP2-42K-синтетический AHSV-5-VP5). Рекомбинантный вирусный вектор vCP2398 (SEQ ID NO: 41) получали по схеме in vitro рекомбинации (IVR) изображенной на фиг. 24. IVR осуществляли трансфекцией клеток первичных CEF 15 мкг линеаризованной NotI донорной плазмиды pJSY2247.2 (SEQ ID NO: 32) с помощью реактива "FuGENE"(Roche, Cat04709705001). Трансфецированные клетки затем инфицировали ALVAC (1) (21010 БОЕ/мл НМ 1355) в качестве вспомогательного вируса с множественностью инфекции (MOI) 10. Через 24 ч трансфецированные-инфицированные клетки собирали, обрабатывали ультразвуком и использовали для скрининга рекомбинантных вирусов. Скрининг рекомбинантных бляшек осуществляли на основе метода гибридизации с перенесенными бляшками (Sambrook et al., 1982) с помощью специфического зонда AHSV-5-VP2, который метили пероксидазой хрена в соответствии с протоколом производителя (Amersham, Cat RPN3001). Через 3 последовательных раунда очистки бляшек рекомбинант, обозначенный как vCP2398.2.1.1, получали и подтверждали гибридизацией как 100% положительный по вставке вируса АЧЛ и 100% отрицательный по пустому сайту С 3. Одиночные бляшки выбирали на последнем раунде очистки бляшек и размножали для получения стоков Р 1 (Т-25 флакон), Р 2 (Т-75 флакон) и P3 (роллерный флакон) для амплификации vCP2398.2.1.1. Рекомбинант дополнительно подтверждали на уровне Р 2 гибридизацией и обнаружили, что он является 100% положительным по вставке и 100% отрицательным по пустому сайту С 3. Жидкость инфицированной клеточной культуры из роллерных флаконов собирали и концентрировали для получения вирусного стока (2,6 мл VCP2398.2.1.1 с 3,31010 БОЕ/мл). Пример 10. Конструирование рекомбинантного вирусного вектора vCP2398 (SEQ ID NO: 41) (Н 6 синтетический AHSV-5-VP2-42K-синтетический AHSV-5-VP5). Р 3 сток повторно подтверждали гибридизацией как 100% положительный по вставкам AHSV-5-VP2 и AHSV-5-VP5 и 100% отрицательный по пустому сайту С 3. Геномный анализ: теоретический гель результатов ферментной рестрикции для геномной ДНК, был создан в программе "Vector NTI" и представлен на фиг. 25. Геномную ДНК экстрагировали изvCP2398.2.1.1, разрезали BamHI, HindIII или PstI и разделяли 0,8% агарозным гель-электрофорезом. Результаты показали корректную вставку инородной генной последовательности. (фиг. 26). Блот-гибридизация по Саузерну: геномную ДНК, расщепленную BamHI, HindIII, или PstI переносили на нейлоновую мембрану и осуществляли блот-гибридизацию по Саузерну зондом AHSV-5-VP2. Наблюдали полоски ожидаемых размеров 20975 п.о. и 11899 п.о. BamHI, 4980 п.о. HindIII и 1818 п.о. PstI. Результаты показали корректную вставку AHSV-5-VP2 и AHSV-5-VP5 в локус С 3 (фиг. 27). Анализ экспрессии: клетки первичные CEF инфицировали стоком Р 3 VCP2398.2.1.1 с множественностью инфекции (MOI) 10 и инкубировали при 37 С в течение 24 ч. Затем собирали клетки и культуральную надосадочную жидкость. Белки образца разделяли на 10% геле SDS-PAGE, переносили на нейлоновую мембрану "IMMOBILON" и исследовали отдельно с помощью мышиного антитела "10 АЕ 12" пассаж 9, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ (Martinez-Torrecuadrada, J. et al., 1999) в разведении 1:100. Конъюгированную с пероксидазой козью сыворотку, связывающую мышиные антитела, применяли в качестве вторичного антитела, а полосы визуализировали с помощью реактивов для детекции "Amersham". В клеточных осадках vCP2398.2.1.1 с помощью мышиного антитела, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ, детектировали белковые полосы между 55 и 72 кДа, что указывает на экспрессию белкаAHSV-5-VP5 (фиг. 28). Экспрессия белка AHSV-5-VP5 не была обнаружена в культуральной среде. Иммуноанализ бляшек: однородность популяции vCP2398.2.1.1 на 100% доказана иммуноанализом бляшек с помощью мышиного антитела "10 АЕ 12" пассаж 9, связывающего белок VP5 вируса АЧЛ (Martinez-Torrecuadrada, J. et al., 1999) в разведении 1:100 (фиг. 29). Анализ последовательности: более детальный анализ геномной ДНК стока Р 3 осуществляли амлификацией ПЦР и анализом последовательности фланкирующих плечей локуса С 3 и вставок AHSV-5-VP2 и AHSV-5-VP5. Праймеры 8103 JY/8104.JY использовали для амплификации целого фрагмента C3Rвставки VP2/VP5 из AHSV-5-C3L. Карта праймеров представлена на фиг. 30. Полученная в результате последовательность, а именно SEQ ID NO: 41, указывает на то, что последовательности вставок AHS V4-VP2 и AHSV-4-VP5 и правого и левого плеча С 3 вокруг вставок из вируса АЧЛ в vCP2398.2.1.1 были корректными. Праймеры для амплификации зонда AHSV-5-VP2 Праймеры для амплификации зонда AHSV-5-VP5 Пример 11. Получение экспериментальных вакцин. Три различные вакцины были получены при использовании активного ингредиента, продуцируемого на 5 пассаже из стока исходного вакцинного вируса (MSV+5) из 4-дневной культуры vCP2377 (полученного в соответствии с примером 6) на конфлюэнтных монослоях куриных эмбриональных фибробластов (CEF) после обработки сбора. Пассаж MSV+5 является репрезентативным (по перспективе геномной/генетической стабильности) для коммерческого вакцинного продукта, и, как правило, его применяют для получения коммерческих партий. В трех вакцинах (полученных в условиях GMP) в качестве адъюванта применяли "CARBOMER" (4 мг/мл), и они различались по концентрации в них антигена. Использованным специфическим карбомером был "CARBOMEr"/"CARBOPOL 974P" (фармацевтической категории, произведенный Goodrich Chemicals Europe NV, Бельгия). Использованная концентрация была 4 мг/мл, с 1 дозой = 1 мл. "CARBOMEr 974P" применяли наравне с "CARBOPOL 974P" везде в данной заявке. Инфекционный титр активного ингредиента vCP2377, примененного в составе вакцин, был 8,89Log10 CCID50/мл. Вакцинные составы также содержали следующие ингредиенты: адъювант из 1,5% раствора карбомера в воде для инъекций, содержащей 0,1% NaCl; разбавитель, который был буферизован до физиологических значений, рН 7,1 и 0,1N NaOH для регуляции рН. Активный ингредиент, который хранили при -70 С, размораживали в водяной бане (37 С) не более чем за 72 ч до применения. Сразу после размораживания его хранили при +5 С. В стерильном сосуде с системой перемешивания 80% буферного физиологического раствора рН 7,1 для состава вносили при комнатной температуре. При перемешивании добавляли активный ингредиент. После гомогенизации,1,5% раствор "CARBOMEr 974P" добавляли медленно при регуляции рН (рН 7,1) с помощью 1NNaOH. В ходе приготовления состава значение рН предпочтительно сохранялось между 6,5 до 7,3 и конечная концентрация карбомера составляла 4 мг/мл. После добавления всего "CARBOMEr 974P" оставшееся количество буферного физиологического раствора с рН 7,1 добавляли при перемешивании для доведения до конечного объема. При необходимости, рН может быть скорректирован до 7,10,2 добавлением гидроксида натрия или соляной кислоты (1N). Партию гомогенизировали перемешиванием при температуре не ниже чем +2 С в течение по меньшей мере 2 ч. Полученную основную массу хранили при +5 С (3 С) до фасовки. Композиции вакцин обобщены в табл 1. Таблица 1 Пример 12. Проверка идентичности 3 партий вакцины, содержащей рекомбинантный вирусный вектор vCP2377, экспрессирующий капсидные белки синтетический AHSV-4-VP2 и синтетическийAHSV-4-VP5. 3 вакцины, содержащие vCP2377 с адъювантом "974 Р", были описаны в соответствии со следующим: партия 87859 А 011, титр против мишени 7,5 log10 DICC50/мл, партия 87859 А 021, титр против мишени 7,2 log10 DICC50/мл и партия 87859 А 031, титр против мишени 6.,8 log10 DICC50/мл. vCP2377 до смешивания был VCP2377-1-CEPI 7007/17/07/07 и титр составлял 8,3 log10 DICC50/мл. Вакцину, содержащую два "нерелевантных" рекомбинантных вируса оспы канареек (EIV) с адъювантом "CARBOPOL 974P", применяли в качестве отрицательного контроля (партия - 76435V191, титр 7,34 log10 DICC50/мл). Методы: экспрессию вирусных белков AHSV-4-VP2 и AHSV-4-VP5 проверяли непрямой иммунофлюоресценцией и вестерн-блоттингом и использовали для подтверждения идентичности вакцин. Реактивы включали следующее: антитела "10 АЕ 12", связывающие белок VP5 из вируса АЧЛ (INGENASA,28037 Мадрид), свиные поликлональные сыворотки, связывающие белок VP2 серотипа 4 вируса АЧЛ(GENOVAC), антитела, связывающие сМус, клон 4 А 6 (мышиные моноклональные IgG1, Upstate, cat 05724), меченые IRDye800 антитела, связывающие мышиные антитела, меченые IRDye800 антитела, связывающие антитела морской свинки, меченые Су 3 антитела, связывающие мышиные антитела, и меченые Су 3 антитела, связывающие антитела морской свинки. Плазмиды, кодирующие белки синтетическийpVR1012). Для непрямой иммунофлюоресценции клетки куриных эмбриональных фибробластов (CEF), инфицированные рекомбинантным вирусом/трансфецированные плазмидой, рассевали в 96-луночных планшетах (25000 клеток на лунку). Клетки фиксировали через около 24 ч после трансфекции, что равно около 72 ч после инфекции. Клетки затем метили с помощью первичных антител связывающихся с VP2 иVP5, а затем метили вторичными антителами, которые связаны с Су 3. Меченые клетки наблюдали с помощью флюоресцентной микроскопии. Для вестерн-блоттинга клетки CEF, инфицированнные рекомбинантным вирусным вектором/трансфецированные плазмидой, высевали на 6 см чашки (1,10 Е 6 клеток/чашку). Клетки собирали через около 24 ч после трансфекции, что равно около 72 ч после инфекции. После разрушения клеток собранные образцы помещали в трис-глициновый 4-20% гель. После миграции гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану, метили первичными антителами, связывающими VP2,VP5, и сМус, а затем метили вторичными антителами, связанными с IRDye800. Считывание результатов осуществляли с помощью сканера "Odyssey-LiCor". Результаты: в соответствии с результатами иммуннофлюоресценции, представленными на фиг. 19,белок VP5 экспрессировался в клетках CEF, инфицированных тремя партиями vCP2377 с адъювантом"CARBOPOL" и несмешанным vCP2377 (с vCP EIV, используемого в качестве отрицательного контроля). Белок VP2 был корректно детектирован пулом сывороток от 3 морских свинок в несмешанномvCP2377 и после смешивания в трех партиях vCP. Тем не менее, флюоресцентность была меньшей в пуле поликлональных антител по сравнению с моноклональными антителами, связывающими белок VP5, а в отрицательном контроле с vCP EIV был небольшой шум. Кроме того, реактивы проверяли с помощьюCEF, трансфецированных плазмидой, кодирующей индивидуальные белки, включая контрольную плазмиду без вставки (pVR1012), синтетический AHSV-4-VP2 (SEQ ID NO: 4) в pVR1012 (pCG050), синтетический AHSV-4-VP5 (SEQ ID NO: 5) в pVR1012 (pCG042) и синтетический AHSV-4-VP2 + метка "histag" в pVR1012 (pCG049). Белок VP5 был обнаружен только в CEF, трансфецированных плазмидойpCG042. Белок VP2 корректно был обнаружен только в CEF, трансфецированных плазмидами pCG050 иpCG049. Эти результаты подтверждают правильность выбора метода и реактивов. На фиг. 20 А представлен вестерн-блоттинг, осуществленный на лизатах инфицированных и трансфецированных CEF, и на фигуре указана экспрессия белка VP2 из 4 серотипа вируса АЧЛ. Белок VP2 был обнаружен в каждой из 3 партий vCP2377 с адъювантом "CARBOPOL" (определенных как 9 А 011,9 А 021 и 9 А 031), и в несмешанном vCP2377. CEF, трансфецированные плазмидами pCG050 (VP2 вpVR1012) и pCG049 (VP2 + c-myc в pVR1012) применяли в качестве положительных контролей, также экспрессирующих VP2. Обработку CEF, трансфецированных плазмидой pCG049, антителами, связывающими c-myc, применяли в качестве положительного контроля трансфекции. Как и предполагалось, не было обнаружено никакого сигнала в CEF, инфицированных vCP EIV,или в CEF трансфецированных pVR1012 и pCG042. Более того, поликлональные антитела, связывающиеVP2, были специфичными к белку VP2 4 серотипа вируса АЧЛ. На фиг. 20 В представлен вестерн-блоттинг, осуществленный на лизатах, инфицированных и трансфецированных CEF, и указана экспрессия белка VP5 из 4 серотипа вируса АЧЛ. На фиг. 20 А представлены результаты вестерн-блоттинга с антителом, связывающим VP5 на инфицированных и трансфецированных CEF. Белок VP5 был обнаружен в каждой из 3 партий vCP2377 с адъювантом "CARBOPOL 974P" и в несмешанном vCP2377. CEF, трансфецированные плазмидамиpCG042 (VP5 в pVR1012), также экспрессировали белок VP5. Как и предполагалось, не было обнаружено никакого сигнала ни в CEF инфицированных vCP EIV,ни в CEF трансфецированных pVR1012, pCG050 и pCG049, что говорит о том, что антитело, связывающее VP5, несомненно является специфичным к белку VP5 вируса АЧЛ, как описано в литературе (Martinez-Torrecuadrada et al.; Virology, 257, 449-459; 1999). Заключение. Все результаты, полученные непрямой иммунофлюоресценцией и вестерн-блоттингом, показывают, что три вакцины vCP2377, дополненные адъювантом "CARBOPOL 974P" экспрессируют белкиVP2 и VP5 4 серотипа вируса АЧЛ. Пример 13. Эффект дозы вакцины у лошадей.A. Экспериментальные животные. В иммунологических исследованиях использовали всего 6 ранее невакцинированных лошадей. Животных кормили и содержали в соответствии со стандартными процедурами.B. Иммуногенность у невакцинированных животных. Для оценки иммунного ответа лошадей на кандидатную вакцину 6 ранее невакцинированных жеребят случайно попарно распределяли в 3 группы. Каждую группу из 2 лошадей в 0 день вакцинировали 3 дозами препаратов одной из трех различных партий (партии: 87859 А 011, 87859 А 021 и 87859 А 031) кандидатной вакцины (AHSV-CP). Различные партии различались в связи с их титрами против мишени, как показано на фиг. 21, а именно 7,3, 6,96 и 6,28 Log10CCID50/мл. В каждой группе две дозы вводили внутримышечно (IM) с одной стороны шеи, и одну дозу вводили IM с другой стороны шеи. На 28 день лошадей иммунизировали IM в шею с одной дозой из той же партии вакцины, что и вводимая в 0 день. До получения первичной дозы вакцины образцы крови собирали (0 день) яремной венепункцией в 27 мл пробирки "SST VACUTAINER". Кроме того, образцы крови собирали из всех лошадей яремной венепункцией в 27 мл пробирки "SST VACUTAINER" в 28 и 42 дни. С. Анализ. Образцы сыворотки, собранные до первой вакцинации, в течение первого периода вакцинации, во время второй вакцинации и в течение второго периода вакцинации, подвергали группа-специфичному ИФА-тесту на антитела вируса африканской чумы лошадей (Hamblin С., et al. (1990) Epidemiology andInfection 104(2), 303-312 и тесту нейтрализации вируса сывороткой, специфичной к 4 серотипу вируса АЧЛ. Результаты представлены на фигуре 21. В день 0 все лошади были отрицательными без детектируемых титров сывороточных антител, связывающих вирус АЧЛ 4 серотипа. На 28 день, через четыре недели после первичной иммунизации, во всех лошадях, иммунизированных вакциной из партии с наибольшим титром (Log10CCID50/мл 7,3), развились нейтрализующие титры. На 28 день, в 1 из 2 лошадей,которые были иммунизированы вакциной из партии со средним титром (Log10CCID50/мл 6,96), развились нейтрализующие титры. Наконец, на 28 день, ни в одной из лошадей, которые были иммунизированы вакциной из партии с наиболее низким титром (Log10CCID50/мл 6,28), не развились нейтрализующие титры. На 42 день через две недели после введения повторной дозы, у 5 из 6 лошадей имелись хорошие антительные титры (фиг. 21). Одна лошадь (53761), которая была иммунизирована вакциной из партии с наиболее низким титром (87859 А 031), была отрицательной по антителам, связывающим вирус африканской чумы лошадей. Пример 14. Вакцинирование лошадей рекомбинантными вирусами оспы канареек. Девять годовалых лошадей породы Боерперд (5 самцов, 4 самки) были закуплены в Северной Капской провинции, Южная Африка, области, свободной от АЧЛ в течение, по меньшей мере, предыдущих 12 месяцев. Иммуноферментным анализом (ИФА), который детектирует антитела к белку центральной части VP7, который является общим для вирусов серогруппы вируса АЧЛ, было подтверждено, что у лошадей отсутствуют специфичные к вирусу АЧЛ антитела (Maree, S. and Paweska, JT., 2005). Лошадей разместили в защищенных от переносчиков изоляторах на протяжении всех исследований. Две группы из четырех лошадей каждая (2 самца и 2 самки) инокулировали внутримышечно с 107,1 или 106,4TCID50/доза соответственно, AHSV-CP примерно в 1 мл разбавителя, содержащего адъювант "CARBOPOL". Для подтверждения вирулентности тестового инокулюма по этическим причинам использовали одну контрольную лошадь, потому что ранее было показано, что вирусный штамм вызывает серьезное или летальное заболевание в инокулированных лошадях (Nurton, J.P., et al., 2001). Контрольную лошадь вакцинировали рекомбинантным вирусом оспы канареек, эспрессирующим гемагглютинин вируса гриппа лошадей (EI-CP; "PROTEQFLU", лошадиная вакцина против вируса гриппа, "Merial"), который вводили в соответствии с инструкциями производителя. Всех лошадей через 28 дней повторно вакцинировали соответствующим вакцинным конструктом. Животные содержались вместе в зависимости от типа вакцины. Все лабораторные тесты были проведены независимо от информации о вакцинном статусе. А. Методы. Инфицирование лошадей вирусом АЧЛ и сбор пробю Все 9 лошадей были заражены внутривенной инокуляцией 105,5 TCID50 вируса АЧЛ 4 серотипа на 28 день после второй вакцинации. Ежедневно оценивали у лошадей проявления африканской чумы лошадей в течение 23 дней после инокуляции. Кровь собирали в пробирки "EDTA VACUTAINER" (Becton Dickinson) до тестовой инфекции и на 2, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 19, 21 и 23 дни после инфекции (days postinfection (DPI для полного анализа крови. Образцы крови затем собирали ежедневно в пробирки "EDTAVACUTAINER" (Becton Dickinson) со дня 0 по 23 DPI для количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР) и для выделения вируса в клетках BHK-21. Сыворотку собирали в пробирки "SST serum separator" (Becton Dickinson) из всех лошадей сразу перед вакцинацией и с двухнедельными интервалами после. Клинические лабораторные анализы. Гематологический анализ проводили с помощью электронного счетчика клеток (Coulter ElectronicsInc.). Обнаружение вируса. Присутствие вируса АЧЛ в крови лошади определяли анализами количественного ОТ-ПЦР, которые детектируют индивидуальные гены, кодирующие белки VP7 и NS2 вируса АЧЛ (Quan, M. and A.J.Guthrie, 2009) с образцами, классифицированными как положительные, если флюоресценция превышала порог 0,1 в течение максимум 40 циклов. Выделение вируса из крови проводили на клетках BHK-21, как описано Quan, M. et al., 2008. Серологические анализы. Серотип-специфичные нейтрализующие антитела к вирусу АЧЛ были обнаружены анализом микронейтрализации с помощью вируса АЧЛ 4 серотипа в качестве тестового вируса, как описано в работеHowell, P.G. et al., 2002. Титры антител были записаны как реципрокные наибольшего конечного разведения сыворотки, которое обеспечивает по меньшей мере 50% защиту клеточного монослоя ВНК-21. Титр 10 рассматривали как значимый. Статистический анализ. Титры антитела, нейтрализующего вирус АЧЛ 4 серотипа через 8 недель после первичной вакцинации и 6 недель после инфекции вируса АЧЛ сравнивали между вакцинными группами с помощью Uкритерия Манна-Уитни и при Р 0,05 рассматривались как значимые. В. Анализ. Иммуногенность AHSV-CP. Все лошади до вакцинации были серонегативными как по ИФА, так и по анализу микронейтрализации вируса АЧЛ 4 серотипа (AHSV-4), и у всех кроме двух лошадей в табл. 2, выработались нейтрализующие антитела к вирусу АЧЛ 4 серотипа (AHSV-4) после иммунизации рекомбинантным векторомAHSV-CP, тогда как в лошади, иммунизированной EIV-CP, не выработались нейтрализующие антитела к вирусу АЧЛ 4 серотипа (AHSV-4) (табл. 2). Через 8 недель после вакцинации титры против вируса АЧЛ 4 серотипа (AHSV-4) были значительно выше (Р = 0,021) в лошадях, получивших высокую дозу вакцины, чем в группе с низкой дозой, но это различие было менее очевидно (Р = 0,057) через 6 недель после