Способ лечения или предотвращения нейтропении или лейкопении или снижения частоты возникновения инфекции, проявляющейся фебрильной нейтропенией

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ НЕЙТРОПЕНИИ ИЛИ ЛЕЙКОПЕНИИ ИЛИ СНИЖЕНИЯ ЧАСТОТЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ИНФЕКЦИИ, ПРОЯВЛЯЮЩЕЙСЯ ФЕБРИЛЬНОЙ НЕЙТРОПЕНИЕЙ Предложен способ лечения или предотвращения нейтропении или лейкопении или снижения частоты возникновения инфекции, проявляющейся фебрильной нейтропенией. Способ,описанный в настоящем изобретении, включает введение субъекту, представляющему собой человека, от примерно 30 до примерно 60 мг рекомбинантного альбумина человекагранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ТЕВА ФАРМАСЬЮТИКАЛ ИНДАСТРИЗ ЛТД. (IL) Лейкопения представляет собой снижение содержания циркулирующих лейкоцитов (белых клеток крови), и часто определяется как количество лейкоцитов 4000/мл. Основными клетками, которые затрагивает лейкопения, являются нейтрофилы. Однако пониженное содержание лимфоцитов, моноцитов,эозинофилов или базофилов также может способствовать пониженному общему содержанию лейкоцитов(Merck Manual, 17-e издание). Нейтропения характеризуется снижением количества нейтрофилов в крови, которое часто приводит к повышенной чувствительности к бактериальным и грибковым инфекциям. Нейтропения классифицируется по количеству нейтрофилов и относительному риску развития инфекции следующим образом: легкая (от 1000 до 1500/мл), умеренная (3 степень, от 500 до 1000/мл) или тяжелая (4 степень,500/мл). Острая и тяжелая нейтропения представляет собой угрожающее жизни состояние, т.к. при ней пациент подвержен быстро развивающимся инфекциям с летальным исходом (Merck Manual, 17-e издание). Нейтропения может быть вызвана нарушенной продукцией нейтрофилов в костном мозге или ускоренным разрушением нейтрофилов. Острая нейтропения может возникать в течение нескольких дней,когда потеря нейтрофилов происходит быстро, а их продукция сильно нарушена. Хроническая нейтропения может длиться многие месяцы и часто вызвана сниженной продукцией или секвестрацией нейтрофилов в селезенке. Нейтропению можно классифицировать в зависимости от того, является ли ее возникновение вторичным по отношению к факторам, не относящимся к миелоидным клеткам костного мозга, или внутренний дефект в миелоидных предшественниках (Merck Manual, 17-e издание). Нейтропения и ее инфекционные осложнения принадлежат числу наиболее распространенных и серьезных побочных эффектов цитотоксической химиотерапии и других видов терапии рака, таких как лучевая терапия, биотерапия, направленная терапия и трансплантация костного мозга. Цитотоксическая химиотерапия, которая действует путем разрушения быстрорастущих клеток, индуцирует нейтропению из-за высокой скорости пролиферации предшественников нейтрофилов и быстрого обновления нейтрофилов в крови (Merck Manual, 17-e издание). Наиболее распространенные симптомы нейтропении у пациентов, подвергающихся химиотерапии, включают лихорадку, язвы в ротовой полости и ушные инфекции. Пациенты с тяжелой нейтропенией часто страдают от гнойных инфекций, таких как септицемия,кожный целлюлит, абсцессы печени, фурункулез, пневмония, стоматит, гингивит, периректальное воспаление, колит, синусит и отит среднего уха. Может возникать необходимость отложить химиотерапию до того момента, когда организм сможет вырабатывать больше нейтрофилов, а также иногда приходится вводить меньшие дозы, что приводит к снижению эффективности лечения. Краткое описание изобретения Согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или предотвращения патологического состояния, характеризующегося пониженным содержанием лейкоцитов в крови по сравнению с нормой. Такие патологические состояния включают лейкопению и нейтропению, но не ограничиваются ими. Согласно первому варианту реализации изобретения предложен способ лечения или предотвращения нейтропении у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение субъекту, представляющему собой человека, страдающему нейтропенией или имеющего риск развития нейтропении, рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в количестве, эффективном для лечения указанного субъекта. Согласно типичному варианту реализации изобретения субъект, представляющий собой человека, может иметь немиелоидные злокачественные новообразования и получать по меньшей мере одно миелосупрессивное противораковое лекарственное средство, ассоциируемое с клинически значимой частотой возникновения фебрильной нейтропении. Согласно второму варианту реализации изобретения предложен способ лечения или предотвращения лейкопении у субъекта, представляющего собой человека, включающий введение субъекту, представляющему собой человека, страдающему лейкопенией или имеющему риск развития лейкопении, рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в количестве, эффективном для лечения указанного субъекта. Согласно третьему варианту реализации изобретения предложен способ снижения частоты возникновения инфекции, такой как инфекция, проявляющаяся фебрильной нейтропенией, у субъекта, представляющего собой человека, имеющего немиелоидные злокачественные новообразования и получающего по меньшей мере одно миелосупрессивное противораковое лекарственное средство, ассоциируемое с клинически значимой частотой возникновения фебрильной нейтропении, включающий введение субъекту рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в количестве, эффективном для лечения указанного субъекта. В некоторых способах соединения, описанные в настоящей заявке, могут применяться для снижения частоты возникновения инфекции, такой как инфекция, проявляющаяся фебрильной нейтропенией. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения композиции и способы включают гибридный полипептид, образованный из белка сывороточного альбумина человека ("HSA") и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека ("G-CSF"). Длина гибридного полипептида составляет 759 аминокислот; 1-585 аминокислоты гибридного полипептида соответствуют аминокислотам зрелой формы HSA, и 586-759 аминокислоты гибридного полипептида соответствуют аминокислотам зрелой формыG-CSF человека. Последовательности аминокислот гибридного белка представлены на фиг. 1. Гибридный полипептид, имеющий название Нейгранин ("NEUG"), вводят пациентам, страдающим лейкопенией или нейтропенией или имеющим повышенный развития лейкопении или нейтропении. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения способы включают лечение лейкопении или нейтропении у субъекта, представляющего собой человека, путем введения рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека в количестве, эффективном для лечения указанного субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения нейтропения представляет собой первичную нейтропению, острую нейтропению, тяжелую хроническую нейтропению (ТХН), тяжелую врожденную нейтропению (синдром Костманна), тяжелый генетически детерминированный агранулоцитоз новорожденных, доброкачественную нейтропению, циклическую нейтропению, хроническую идиопатическую нейтропению, вторичную нейтропению, ассоциированную с синдромом нейтропению или иммуноопосредованную нейтропению. Согласно другим вариантам реализации изобретения нейтропения является вызванной или связанной с облучением, алкоголизмом, лекарственными средствами, аллергическими заболеваниями, гипопластической анемией, аутоиммунным заболеванием, Т- лимфопролиферативным заболеванием (Т- ЛПЗ),миелодисплазией, миелофиброзом, дисгаммаглобулинемией, ночной пароксизмальной гемоглобинурией,раком, дефицитом витамина В 12, дефицитом фолатов, вирусной инфекцией, бактериальной инфекцией,повреждением селезенки, гемодиализом, трансплантацией, лейкемией, миеломой, лимфомой, метастатическими солидными опухолями, которые инфильтрируют и замещают костный мозг, токсинами, недостаточностью костного мозга, синдромом Швахмана-Даймонда, хряще-волосяной гипоплазией, врожденным дискератозом, болезнью накопления гликогена IB типа, спленомегалией любой этиологии и внутренними дефектами миелоидных клеток или их предшественников. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения нейтропения вызвана или связана с цитотоксической химиотерапией. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения субъект, представляющий собой человека,страдает от немиелоидных злокачественных новообразований, например рака молочной железы, и получает цитотоксическую химиотерапию. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения пациент получает по меньшей мере одно миелосупрессивное противораковое лекарственное средство, ассоциируемое с клинически значимой частотой возникновения фебрильной нейтропении. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения миелосупрессивные противораковые лекарственные средства представляют собой доксорубицин и доцетаксел. Согласно другим вариантам реализации изобретения примерно 50 мг/м 2 доксорубицина и примерно 75 мг/м 2 доцетаксела вводят последовательно путем внутривенной инфузии в один и тот же день в течение по меньшей мере одного цикла лечения. Согласно другим вариантам реализации изобретения примерно 60 мг/м 2 доксорубицина и примерно 75 мг/м 2 доцетаксела вводятся последовательно путем внутривенной инфузии в один и тот же день в течение по меньшей мере одного цикла лечения. Согласно другим вариантам реализации способы включают способ снижения частоты возникновения инфекции, такой как инфекция, проявляющаяся фебрильной нейтропенией, у субъектов, представляющих собой людей. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения субъект, представляющий собой человека, имеет немиелодные злокачественные новообразования и получает по меньшей мере одно миелосупрессивное противораковое лекарственное средство, ассоциируемое с клинически значимой частотой возникновения фебрильной нейтропении. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения рекомбинантный альбумин человека-гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека вводят субъекту в количестве, эффективном для лечения нейтропении у указанного субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения у субъекта устраняют нейтропению или уменьшают продолжительность или выраженность нейтропении. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения устраняют нейтропению 3 или 4 степени у субъекта. В других варианта реализации изобретения уменьшают продолжительность нейтропении 3 или 4 степени. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения продолжительность нейтропении 4 степени у субъекта составляет менее 5 дней; согласно некоторым вариантам реализации изобретения продолжительность нейтропении 4 степени у субъекта составляет менее 4 дней, менее 3 дней или менее 2 дней. Согласно другим вариантам реализации изобретения у субъекта устраняют нейтропению 3 степени, и/или продолжительность нейтропении 3 степени у субъекта снижается по сравнению с субъектами, не получающими лечение альбумином человека-гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения введение рекомбинантного альбумина человекагранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека приводит к повышению содержания лейкоцитов ("WBC") или снижению потери WBC y субъекта. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения увеличивают количество нейтрофилов у субъекта; подавляют снижение содержания нейтрофилов у субъекта, повышают минимальное значение абсолютного числа нейтрофилов ("ANC") y субъекта, улучшают ACN в период восстановления у субъекта и/или снижают время восстановления Согласно некоторым вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 40 до примерно 500 мкг/кг; согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека,вводимого субъекту, составляет от примерно 50 до примерно 450 мкг/кг. Согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 50 мкг/кг, примерно 100 мкг/кг, примерно 150 мкг/кг, примерно 200 мкг/кг или примерно 250 мкг/кг. Согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 300 мкг/кг, примерно 350 мкг/кг или примерно 400 мкг/кг. Согласно альтернативным вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 450 мкг/кг. Согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 20 до примерно 100 мг. Согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человекагранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 30 до примерно 60 мг. Согласно другим вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, составляет от примерно 30 мг, примерно 40 мг, примерно 50 мг или примерно 60 мг. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения рекомбинантный альбумин человекагранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека вводят после проведения химиотерапии (например, после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства). Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения рекомбинантный альбумин человекагранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека вводят во время химиотерапии или вводится в течение 2, 4, 6, 12, 18, 24 или в течение 48 ч от времени введения химиотерапевтического лекарственного средства. Согласно другому варианту реализации изобретения рекомбинантный альбумин человекагранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека возможно вводят после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства. Например, рекомбинантный альбумин человекагранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека возможно вводят в момент времени, выбранный из группы, включающей: (а) по меньшей мере через 2 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (b) по меньшей мере через 4 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (с) по меньшей мере через 6 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (d) по меньшей мере через 12 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (е) по меньшей мере через 18 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (f) по меньшей мере через 24 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; (g) по меньшей мере через 48 ч после введения миелосупрессивного противоракового лекарственного средства; или (h) во время введения, или, по существу, одновременно с введением миелосупрессивного противоракового лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения введение рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека во время или после проведения химиотерапевтического лечения вызывает повышение числа лейкоцитов и/или вызывает повышениеANC. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения ANC и уровень лейкоцитов возвращаются к норме к 10 дню после проведения химиотерапии. Согласно другим вариантам реализации ANC и уровень лейкоцитов возвращаются к норме к 11 дню после проведения химиотерапии, 12 дню после проведения химиотерапии, 13 дню после проведения химиотерапии, 14 дню после проведения химиотерапии или 15 дню после проведения химиотерапии. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения на 14 день после введения химиотерапевтического лекарственного средства повышениеANC y пациентов, получающих лечение рекомбинантным альбумином человека-гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека, меньше, чем повышение ANC y пациентов, получающих лечение эквивалентной дозой пэгфилграстима. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения введение рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека вызывает повышение уровня лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов или базофилов. Например, согласно некоторым вариантам реализации изобретения повышается количество лимфоцитов, моноцитов,эозинофилов или базофилов у субъекта. Согласно другим вариантам реализации изобретения подавляется снижение числа лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов или базофилов у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, в частности, относящимся к способам лечения или предотвращения нейтропении, достигаемый результат может быть выбран из группы, включающей: (а) устранение нейтропении 4 степени у субъекта; (b) снижение выраженности нейтропении 4 степени у субъекта; (с) снижение продолжительности острой нейтропении у субъекта; (d) устранение нейтропении 3 степени у субъекта; (е) снижение продолжительности нейтропении 3 степени у субъекта или (f) любую комбинацию указанных результатов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, в частности, относящимся к способам лечения или предотвращения нейтропении, введение рекомбинантного альбумина человекагранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека вызывает повышение содержания лейкоцитов крови. Согласно другим вариантам реализации изобретения, в частности, относящимся к способам лечения или предотвращения нейтропении, достигаемый результат выбирают из группы, включающей(а) повышение количества нейтрофилов у субъекта; (b) подавление снижения содержания нейтрофилов у субъекта; (с) повышение минимального значения абсолютного числа нейтрофилов (ANC) y субъекта; (d) улучшение восстановления ANC y субъекта; (е) снижение времени восстановления ANC y субъекта; или(f) любую комбинацию указанных результатов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения количество рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, вводимого субъекту, выбрано из группы, включающей: (а) от примерно 50 до примерно 450 мкг/кг; (b) примерно 50 мкг/кг; (с) примерно 150 мкг/кг; (d) примерно 300 мкг/кг; (е) примерно 450 мкг/кг; (f) от примерно 30 до примерно 60 мг; (g) примерно 30 мг; (h) примерно 40 мг; (i) примерно 50 мг; (j) примерно 60 мг или (k) любую комбинацию указанных количеств. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения нейтропения, подверженная лечению или предотвращению, выбрана из группы, включающей первичную нейтропению, острую нейтропению, тяжелую хроническую нейтропению (ТХН), тяжелую врожденную нейтропению (синдром Костманна),тяжелый генетически детерминированный агранулоцитоз новорожденных, доброкачественную нейтропению, циклическую нейтропению, хроническую идиопатическую нейтропению, вторичную нейтропению, ассоциированную с синдромом нейтропению и имммуно-опосредованную нейтропению. Кроме того нейтропения может быть вызванной или связанной, например, с облучением, алкоголизмом, лекарственными средствами, аллергическими заболеваниями, гипопластической анемией, аутоиммунным заболеванием, Т- лимфопролиферативным заболеванием (Т- ЛПЗ), миелодисплазией, миелофиброзом,дисгаммаглобулинемией, ночной пароксизмальной гемоглобинурией, раком, дефицитом витамина В 12,дефицитом фолатов, вирусной инфекцией, бактериальной инфекцией, пораением селезенки, гемодиализом или трансплантацией, лейкемией, миеломой, лимфомой, метастатическими солидными опухолями,которые инфильтрируют и замещают костный мозг, токсинами, недостаточностью костного мозга, синдромом Швахмана-Даймонда, хряще-волосяной гипоплазией, врожденным дискератозом, болезнью накопления гликогена III типа, спленомегалией любой этиологии, внутренними дефектами миелоидных клеток или их предшественников. Согласно вариантам реализации изобретения у субъекта, представляющего собой человека, имеющего немиелоидные злокачественные новообразования, немиелоидное злокачественное новообразование может представлять собой рак молочной железы. Согласно вариантам реализации изобретения вводимые миелосупрессивные противораковые лекарственные средства могут представлять собой доксорубицин и доцетаксел. Например, примерно 50 мг/м 2 доксорубицина и примерно 75 мг/м 2 доцетаксела могут вводиться последовательно путем внутривенной инфузии в один и тот же день в течение по меньшей мере одного цикла лечения. Альтернативно, примерно 60 мг/м 2 доксорубицина и примерно 75 мг/м 2 доцетаксела могут вводиться последовательно путем внутривенной инфузии в один и тот же день в течение по меньшей мере одного цикла лечения. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения после проведения лечения ANC и уровень лейкоцитов возвращаются к норме за период времени, выбранный из группы, включающей следующие периоды: (а) через 10 дней после проведения химиотерапии; (b) через 11 дней после проведения химиотерапии; (с) через 12 дней после проведения химиотерапии; (d) через 13 дней после проведения химиотерапии: (е) через 14 дней после проведения химиотерапии или (f) через 15 дней после проведения химиотерапии. Согласно другому варианту реализации изобретения на 14 день после введения химиотерапевтического средства повышение ANC y пациентов, получающих лечение рекомбинантным альбумином человека-гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека, меньше, чем повышение ANCy пациентов, получающих лечение эквивалентной дозой пэгфилграстима. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения введение рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека вызывает повышение уровня лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов, или любой комбинации указанных. Согласно другим вариантам реализации изобретения у субъекта повышается уровень лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов,базофилов или любой комбинации указанных. Согласно другим вариантам реализации изобретения снижение уровня лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, или базофилов подавляется у субъекта. Приведенное выше общее описание изобретения и последующее краткое описание фигур, а также подробное описание изобретения приведены в качестве примера и пояснения и предназначены для более детального разъяснения предложенного изобретения. Другие объекты, преимущества и новые признаки будут очевидны специалистам в данной области техники из следующего подробного описания настоящего изобретения. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 А-1 С: на фиг. 1 А показаны последовательность нуклеиновых кислот и последовательность аминокислот гибридного белка рекомбинантного альбумина человека-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора ("rHA-G-CSF"), имеющего название "Нейгранин" ("NEUG"); на фиг. 1 В показана последовательность аминокислот G-CSF человека; на фиг. 1 С показана последовательность аминокислот сывороточного альбумина человека. На фиг. 2 представлен график, описывающий абсолютное число нейтрофилов ("ANC") у субъектов в I фазе. Субъекты получали 300 мкг/кг NEUG (n=19), 450 мкг/кг NEUG (n=20) или 6 мг пэгфилграстима(Neulasta) (n=9) в 1 цикле после проведения химиотерапии согласно исследованию. На фиг. 3 представлен график, представляющий фармакокинентические свойства NEUG в I фазе исследования у субъектов, представляющих собой людей. Концентрацию в сыворотке NEUG, вводимого подкожно в указанных дозах (450, 300 или 150 мкг/кг), измеряли у субъектов, страдающих раком молочной железы, в отсутствие химиотерапии. Квадраты: 450 мкг/кг, 0 цикл; треугольники: 300 мкг/кг, 0 цикл; кружки: 150 мкг/кг, 0 цикл. На фиг. 4 представлен график, представляющий фармакокинетические/фармакодинамические свойства ("PK/PD") NEUG в 1 цикле химиотерапии (исследование I фазы). Пациенты получали 450 мкг/кгNEUG через один день после введения доксорубицина/доцетаксела в 1 Цикле. ANC обозначено незакрашенными ромбами; концентрация NEUG обозначена закрашенными квадратами. Пороговые значения для разделения нейтропении 3 и 4 степени показаны штриховыми линиями. Нижний предел количественного определения ("LLOQ") для NEUG показан точечной линией (доза 6 нг/мл). На фиг. 5 представлен график, показывающий кривую ANC для пациентов, которые получали либо 30 мг NEUG, либо 6 мг пэгфилграстима (Нейласты) через один день после начала 1 цикла химиотерапии (исследование II фазы). Пороговые значения для разделения нейтропении 3 и 4 степени показаны штриховыми линиями. На фиг. 6 показаны циклы химиотерапии для исследований I фазы. На фиг. 7 А и 7 В представлены графики, показывающие ANC и уровень лейкоцитов крови ("WBC") для субъектов в исследовании I фазы. На фиг. 8 представлен график, демонстрирующий пролиферацию клеток NSF-60 в присутствииNEUG (альбугранина) или Нейпогена. На фиг. 9 представлен график, демонстрирующий пролиферацию клеток NSF-60 в присутствииNEUG или нейласты. На фиг. 10 представлен график, демонстрирующий число нейтрофилов (Gr,1+) в периферической крови у мышей BDF-1 после однократного SC введения NEUG (альбугранина) и нейпогена (в зависимости от времени). Общее число Gr,1+ клеток выражается как среднее группы +/- стандартная ошибка среднего (SEM). На фиг. 11 представлен график, демонстрирующий содержание гематопоэтических клетокпредшественников (c-kit+) в периферической крови после однократного подкожного (SC) введенияNEUG (альбугранина) и нейпогена (в зависимости от времени). Общее число c-kit+ клеток выражается как среднее группы +/- SEM (стандартная ошибка среднего). На фиг. 12 А и 12 В представлены графики, демонстрирующие содержание гранулоцитов (Gr,1+) периферической крови после однократного подкожного ("SC") введения NEUG (альбугранина) или нейласты (Neulasta) мышам BDF-1. На фиг. 12 А показана зависимость ответа от времени после введения однократной дозы нейласты или NEUG и на фиг. 12 В показана относительная активность NEUG или нейласты. Фиг. 13 представляет собой таблицу, в которой приведена композиция лекарственного продуктаNEUG, используемого в I фазе. Фиг. 14 представляет собой таблицу, в которой приведена композиция лекарственного продуктаNEUG, используемого во II фазе. На фиг. 15 представлен график, демонстрирующий содержание тгематопоэтических клетокпредшественников (c-kit+) в периферической крови после однократного подкожного введения NEUG(альбугранина) или Нейласты (в зависимости от времени). Общее число c-kit+ клеток выражено как среднее и стандартная ошибка среднего, рассчитанная для каждой группы. Различия между лечебными группами анализировали с помощью t-критерия Стьюдента с зависимой дисперсией. На фиг. 16 представлен график, демонстрирующий число нейтрофилов периферической крови(Gr,1+) после однократного подкожного введения NEUG (альбугранина) или нейласты через 1 день после внутрибрюшинного (IP) введения 5-фторурацила (5-FU) в дозе 150 мкг/кг. Общее число GR,1+ клеток,подсчитываемых ежедневно, выражается как среднее и стандартная ошибка среднего, рассчитанная для каждой группы. Различия среди лечебных групп оценивали с помощью двухвыборочного t-критерия Стьюдента с неодинаковой дисперсией. Лечение любым агентом при всех дозах приводило к статистически значимому повышению содержания нейтрофилов по сравнению с контролем плацебо. На фиг. 17 представлен график, демонстрирующий эффект NEUG (альбугранина) на относительное число нейтрофилов в периферической крови. Относительное число нейтрофилов на каждый день исследования представлено как среднее группы +/- SEM. Данные на 8 и 9 день для дозы NEUG 100 мкг/кг, Q7,представлены как данные для 9 и 10 дня, соответственно, для возможности сравнения с другими группами. Контролем являлся физиологический раствор (плацебо), вводимый SC каждые 4 дня 4, или Нейпоген, вводимый SC ежедневно 14. Период проведения лечения рассматривается как период с 1 по 14 день и период восстановления - с 15 по 28 день. На фиг. 18 представлен график, показывающий сравнение многократных доз NEUG (альбугранина) при подкожном (SC) введении, NEUG при внутривенном (IV) введении или Нейласты при подкожном(SC) введении на мобилизацию нейтрофилов у обезьян. Количество нейтрофилов (тысяч клеток/мкл) на каждый день исследования до 22 дня представлено как среднее группы +/- SEM. Стрелки обозначают введение дозы. NEUG вводили подкожно, SC, (n=6) или внутривенно, IV, (n=6) в концентрации 1,0 мг/кг/доза, и нейласту вводили подкожно, SC, (n=6) в концентрации 0,22 мг/кг/доза (доза, эквимолярная 1,0 мг/кг NEUG). Контроль плацебо для NEUG вводили подкожно, SC, (n=2). Фиг. 19 А и 19 В представляют собой таблицы, показывающие суммарные данные исследований фармакокинетических свойств in vivo. Фиг. 20 представляет собой таблицу, показывающую суммарные данные доклинических исследований in vivo, которые обеспечивают данные по безопасности. Фиг. 21 представляет собой схему типичного процесса ферментации и очищения NEUG. Фиг. 22 представляет собой график, показывающий медианное абсолютное число нейтрофилов(ANC) для субъектов в I фазе, части А (0 цикл, или до проведения химиотерапии) от начала лечения до 14 дня. На 4 день кривые (сверху вниз) соответствуют дозам: 300, 450, 150 и 50 мкг /кг. Фиг. 23 А и 23 В показывают площадь под кривой (AUC) ANC, построенной на основе значений ANC для каждого субъекта, получающего лечение в I фазе, части В, полученных на 0-15 день. Фиг. 23 А представляет собой график; данные, представленные на фиг. 23 А, суммированы в табл. 23 В. На фиг. 24 представлен график, показывающий площадь под кривой (AUC) ANC, построенной на основе значений ANC для субъектов, получающих лечение во II фазе, полученных на 0-15 день 1 цикла(группы, получающие фиксированные дозы). Для всех субъектов во II фазе рассчитывали AUC ANC (0-15 день). Диапазон доз для пациентов, получающих лечение нейгранином, составлял от 0,3 до 1 мг/кг (рассчитано на основе дозы, деленной на исходную массу). Рассчитанный с учетом массы тела диапазон доз делили на квартили и наносили на график относительно AUCANC (левая панель). Для всех субъектов, получающих лечение пэгфилграстимом (N=112), 30 мг (N=10), 40 мг (N=105) или 50 мг (N=105) нейгранина, также рассчитывали и сравнивали AUCANC. Данные показаны как среднее +SEM. Подробное описание изобретения Согласно настоящему изобретению предложен способ лечения, предупреждения и облегчения состояний и заболеваний, характеризующихся пониженным содержанием лейкоцитов. Способ, предложенный в настоящем описании, включают гибридный полипептид, образованный белком сывороточного альбумина человека ("HSA") и гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека ("G-CSF"). Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения длина указанного гибридного полипептида составляет примерно 759 аминокислот; 1-585 аминокислоты указанного гибридного белка соответствуют аминокислотам зрелой формы HSA и 586-759 аминокислоты указанного гибридного белка соответствуют аминокислотам зрелой формы G-CSF человека. Аминокислотная последовательность гибридного белка представлена на фиг. 1. Настоящее изобретение также включает гибридные белки, содержащие варианты или фрагменты GCSF, и гибридные белки, содержащие альбумин или его фрагменты или варианты. Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие терапевтические гибридные белки альбумина согласно настоящему изобретению, терапевтические гибридные белки альбумина, композиции, фармацевтические композиции, составы и наборы. Клетки-хозяева, трансформированные полинуклеотидами, кодирующими терапевтические гибридные белки альбумина, также включены в настоящее изобретение, как и способы получения гибридных белков альбумина согласно настоящему изобретению с использованием указанных полинуклеотидов и/или клеток-хозяев. Согласно одному варианту реализации изобретения гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению имеет длительный срок хранения. Согласно второму варианту реализации изобретения гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению более стабилен, чем соответствующая негибридная молекула G-CSF. Настоящее изобретение также включает трансгенные организмы, модифицированные таким образом, что они содержат молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, предпочтительно модифицированные таким образом, что они экспрессируют гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению. В целом, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим гибридные белки альбумина; гибридным белкам альбумина и способам лечения, предупреждения или облегчения заболеваний или расстройств с применением гибридных белков альбумина или полинуклеотидов, кодирующих гибридные белки альбумина. В настоящем описании термин гибридный белок аль-6 023344 бумина относится к белку, образованному путем слияния по меньшей мере одной молекулы альбумина(или ее фрагмента или варианта) с по меньшей мере одной молекулой G-CSF (или ее фрагментом или вариантом). Гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере фрагмент или вариант G-CSF и по меньшей мере фрагмент или вариант сывороточного альбумина человека, которые соединены друг с другом путем генетического слияния (т.е. гибридный белок альбумина получают путем трансляции нуклеиновой кислоты, в которой полинуклеотид, кодирующий весь или часть G-CSF, соединяют в рамке с полинуклеотидом, кодирующим весь или часть альбумина). G-CSF и белок альбумин как часть гибридного белока альбумина могут называться "частью", "областью" или"фрагментом" гибридного белка альбумина (например, "G-CSF-часть белка" или "альбуминовая"). В наиболее предпочтительном варианте реализации гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну молекулу G-CSF или ее фрагмент, или вариант (включая,но не ограничиваясь ей, зрелую форму белка G-CSF) и по меньшей мере одну молекулу альбумина или ее фрагмент, или вариант (включая зрелую форму альбумина, но не ограничиваясь ей). Согласно другому предпочтительному варианту реализации изобретения гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению процессируется клеткой-хозяином и секретируется в окружающую культурную среду. Процессинг образующегося гибридного белка альбумина, происходящий в секреторных путях хозяина, используемого для экспрессии, может включать, но не ограничивается ими,распад сигнального пептида, образование дисульфидных связей, соответствующий фолдинг, добавление и процессинг углеводов (например, N- и О-связанное гликозилирование), конкретное протеолитическое расщепление, и сборку с образованием мультимерных белков. Гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению предпочтительно находится в процессированной форме. В наиболее предпочтительном варианте реализации термин "процессированная форма гибридного белка альбумина" относится к гибридному белковому продукту альбумина, который подвергся отщеплению N-концевого сигнального пептида, в настоящем описании называемому также "зрелым гибридным белком альбумина". В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид,кодирующий гибридный белок альбумина, содержащий или, в качестве альтернативы, состоящий из GCSF и белка сывороточного альбумина. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или, в качестве альтернативы, состоящий из белка G-CSF и белка сывороточного альбумина. В других вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или, в качестве альтернативы состоящий из биологически активного и/или терапевтически активного фрагмента белка G-CSF и белка сывороточного альбумина. В других вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или, в качестве альтернативы, состоящий из биологически активного и/или терапевтически активного варианта белка G-CSF и белка сывороточного альбумина. В предпочтительных вариантах реализации компонент, представляющий собой белок сывороточного альбумина, гибридного белка альбумина представляет собой зрелую часть сывороточного альбумина. Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие данные гибридные белки альбумина. В других вариантах реализации настоящего изобретения предложен гибридный белок альбумина,содержащий или в качестве альтернативы состоящий из белка G-CSF и биологически активного и/или терапевтически активного фрагмента сывороточного альбумина. В других вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или, в качестве альтернативы, состоящий из белка G-CSF и биологически активного и/или терапевтически активного варианта сывороточного альбумина. В предпочтительных вариантах реализации часть белка G-CSF гибридного белка альбумина представляет собой зрелую часть белка G-CSF. В другом предпочтительном варианте реализации часть белка G-CSF гибридного белка альбумина представляет собой растворимый внеклеточный домен белка G-CSF. В альтернативном варианте реализации часть белка G-CSF гибридного белка альбумина представляет собой активную форму белка G-CSF. Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие данные гибридные белки альбумина. В других вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или в качестве альтернативы состоящий из биологически активного и/или терапевтически активного фрагмента или варианта белка G-CSF и биологически активного и/или терапевтически активного фрагмента или варианта сывороточного альбумина. В предпочтительных вариантах реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный белок альбумина, содержащий или в качестве альтернативы состоящий из зрелой части белка G-CSF и зрелой части сывороточного альбумина. Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие данные гибридные белки альбумина.I. Определения В настоящем описании термин "полинуклеотид" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, содержащий или в качестве альтернативы состоящий из по меньшей мере одной молекулы альбумина (или ее фрагмента или варианта), соединенной в рамке по меньшей мере с одной молекулой гранулоцитарного колониестимулирую-7 023344 щего фактора (G-CSF) (или ее фрагментом или вариантом). В настоящем описании термин "гибридная конструкция альбумина" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей или, в качестве альтернативы, состоящей из полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере одну молекулу альбумина (или ее фрагмент или вариант), соединенного в рамке по меньшей мере с одним полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну молекулу G-CSF (или ее фрагмент или вариант); и дополнительно содержащей, например, один или более следующих элементов:(1) функциональный самореплицирующийся вектор (включая, но не ограничиваясь ими, челночный вектор, вектор экспрессии, интеграционный вектор и/или систему репликации), (2) область инициации транскрипции (например, промоторная область, такая как, например, регулируемый или индуцируемый промотор, конститутивный промотор), (3) область терминации транскрипции, (4) лидерную последовательность и (5) селектируемый маркер. Полинуклеотид, кодирующий G-CSF и белок альбумин как часть гибридной конструкции альбумина, каждый может называться "частью", "областью" или "фрагментом" гибридной конструкции альбумина. Полипептид G-CSF, проявляющий "терапевтическую активность", или белок G-CSF, который является "терапевтически активным", означает полипептид G-CSF, обладающий одним или более видами известной биологической и/или терапевтической активности, связанной с белком G-CSF. В качестве не ограничивающего примера "терапевтический белок G-CSF" представляет собой белок G-CSF, подходящий для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, состояния или расстройства. В качестве не ограничивающего примера "терапевтический белок G-CSF" может представлять собой белок, который специфично связывается с конкретным типом клеток (нормальным (например, лимфоциты) или аномальным (например, раковые клетки, и, следовательно, может быть использован для направленного специфичного воздействия соединением (лекарственное средство или цитотоксический агент) на данный тип клеток.II. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) представляет собой гематопоэтический фактор роста, стимулирующий выработку нейтрофилов. Введение G-CSF приводит к быстрой индукции нейтрофильного лейкоцитоза, если имеются доступные для стимуляции клетки-предшественники. Другой важной активностью G-CSF in vivo является стимуляция мобилизации гематопоэтических клетокпредшественников в периферической крови (Duhrsen et al., 1988; Molineux et al., 1999; Roberts et al.,1994). Данный эффект затрагивает не только линию дифференцировки нейтрофилов, но распространяется и на другие предшественники одной линии дифференцировки и нескольких линий дифференцировки,и плюрипотентные гематопоэтические стволовые клетки (Molineux et al., 1999). G-CSF также усиливает клеточные явления, которые являются частью механизма защиты от инфекций, путем праймирования нейтрофилов, тем самым повышая как их фагоцитарную, так и антибактериальную активность в отношении опсонизированного золотистого стафилококка. G-CSF также индуцирует хемотаксис нейтрофилов и моноцитов, и адгезию нейтрофилов (Yuo et al., 1989; Wang et al., 1988). В настоящее время рекомбинантные продукты G-CSF одобрены для ряда клинических показаний для стимуляции пролиферации и дифференцировки нейтрофилов. В клинических исследованиях филграстим (рекомбинантный метионил G-CSF человека; Нейпоген, Амген (Amgen), Thousand Oaks, CA) увеличивал число периферических нейтрофилов и тем самым снижал продолжительность нейтропении после миелосупрессивной химиотерапии. Рекомбинантный G-CSF (филграстим) вводят ежедневно путем подкожной (SC) инъекции. Другая рекомбинантная форма G-CSF представляет собой пэгфилграстим, конъюгированный с полиэтиленгликолем, rG-CSF (Нейласту), который, как установлено, является безопасным и эффективным при применении в качестве альтернативы ежедневной терапии rG-CSF при введении раз в цикл для уменьшения частоты возникновения фебрильной нейтропении у пациентов, получающих миелосупрессивные противораковые препараты (Holmes, O'Shaughnessy et al., 2002; Green et al., 2003; NeulastaSmPC 2007). Первичная профилактика G-CSF рекомендуется для предотвращения фебрильной нейтропении у пациентов, которые относятся к группе повышенного риска развития фебрильной нейтропении на основании возраста, истории болезни, характеристик заболевания и миелотоксичности схемы химиотерапевтического лечения. Американское общество клинической онкологии и Европейская организация по исследованию и лечению рака рекомендуют применение G-CSF в случаях, когда риск развития фебрильной нейтропении составляет приблизительно 20%. Национальная сеть многопрофильных онкологических учреждений США рекомендует факультативное назначение профилактики G-CSF в случаях, когда риск развития фебрильной нейтропении составляет от 10 до 20%, и обязательное назначение профилактики GCSF в случаях, когда риск развития фебрильной нейтропении составляет по меньшей мере 20% (Smith etal., 2006, Vogel et al., 2005, Timmer-Bonte et al., 2006, NCCN Guidelines). Профилактика колониестимулирующими факторами рекомендуется для облегчения токсичности определенных схем химиотерапевтического лечения. Однако высокая стоимость данных способов лечения является существенной проблемой в США и, в особенности, в некоторых частях Европы, которая может приводить к недостаточному использованию профилактического лечения G-CSF и может также ограничивать возможность отбора пациента для проведения схемы химиотерапевтического лечения интенсивными дозами (Timmer-Bonte et al., 2006; Adams et al., 2006, NCCN Guidelines). Белок G-CSF может кодироваться полинуклеотидной последовательностью дикого типа (например,либо полноразмерной, либо зрелой), или, в некоторых примерах, последовательность может представлять собой вариант полинуклеотидной последовательности дикого типа (например, полинуклеотид, который кодирует белок G-CSF дикого типа, причем последовательность ДНК полинуклеотида оптимизирована, например, для экспрессии в определенных видах; или полинуклеотид, который кодирует вариант белка G-CSF дикого типа (т.е., сайтнаправленный мутант; аллельный вариант.III. Сывороточный альбумин человека Сывороточный альбумин человека (HSA или НА) представляет собой наиболее часто встречающийся в природе белок крови в системе кровообращения человека, уровень которого оценивается как приблизительно 40 г альбумина/л и сохраняющийся в кровообращении в течение более 20 дней. Альбумин представляет собой белок-носитель с минимальной активностью при физиологических концентрациях. Даже несмотря на то, что у HSA отсутствует ферментативная или иммунологическая функция, он широко распространен in vivo, и известно, что он является носителем для различных веществ в крови(например, горманов, жирных кислот, несвязанного билирубина и т.д. (Yeh et al., 1992. Как HSA, так и рекомбинантный НА (rHA) обладают одинаково долгим циркулирующим временем полужизни у людей. Исследование показало, что терапевтические белки, генетически гибридизованные с альбумином человека, могут приобретать свойство времени полужизни альбумина в циркулирующей крови (Syed etal., 1997). Например, у кроликов время полужизни CD4, гибридизованного с альбумином, в 140 раз больше, чем негибридного CD4 (Yeh et al., 1992). Сывороточный альбумин человека, белок, состоящий из 585 аминокислот, в зрелой форме (как показано на фиг. 1 патента США 7592010) ответственен за значительную часть осмотического давления сыворотки и также выполняет функцию носителя эндогенных и экзогенных лигандов. В настоящее время НА для клинического применения получают путем экстракции из крови человека. Получение рекомбинантного НА (rHA) в микроорганизмах описано в ЕР 330451 и ЕР 361991.IV. Фрагменты и варианты полипептидов и полинуклеотидов А. Фрагменты Настоящее изобретение также относится к фрагментам белка G-CSF, белков альбумина и/или гибридных белков альбумина согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим фрагменты белка G-CSF, белков альбумина и/или гибридных белков альбумина согласно настоящему изобретению. Даже если делеция одной или более аминокислот из Nконца белка приводит к модификации или потере одной или более биологических функций белка G-CSF,белка альбумина и/или гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, другие виды терапевтической активности и/или функциональной активности (например, биологическая активность,способность мультимеризоваться, способность связывать лиганд) могут быть сохранены. Например, способность полипептидов с N-концевыми делециями индуцировать и/или связываться с антителами, которые распознают полные или зрелые формы полипептидов, в целом обычно сохраняется при удалении менее большинства остатков полного полипептида с N-конца. Сохраняет ли конкретный полипептид, в котором отсутствуют N-концевые остатки полного полипептида, указанные виды иммунологической активности, можно легко определить рутинными способами, указанными в настоящем описании и иными способами, известными в данной области техники. Возможно, мутантный белок с делетированием большого количества N-концевых аминокислотных остатков может сохранять некоторую биологическую или иммуногенную активность. В действительности, пептиды, состоящие из лишь шести аминокислотных остатков, часто могут вызывать иммунный ответ. Соответственно, фрагменты белка G-CSF, соответствующие части белка G-CSF гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, включают полноразмерный белок, а также полипептиды,содержащие делецию одного или более остатков с аминоконца аминокислотной последовательности эталонного полипептида (т.е. белка G-CSF или части белка G-CSF гибридного белка альбумина, кодируемого полинуклеотидом или гибридной конструкцией альбумина). В частности, N-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от m до q, где q представляет собой целое число, показывающее общее количество аминокислотных остатков в эталонном полипептиде (например, белке G-CSF или части белкаG-CSF гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению), и m определяется как любое целое число в диапазоне от 2 до q минус 6. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Кроме того, фрагменты полипептидов сывороточного альбумина, соответствующие части белка альбумина гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, включают полноразмерный белок, а также полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков из аминоконца аминокислотной последовательности эталонного полипептида (т.е. сывороточного альбумина или части сывороточного альбумина гибридного белка альбумина). В предпочтительных вариантах реализации Nконцевые делеции могут быть описаны общей формулой от m до 585, где 585 представляет собой целое число, показывающее общее количество аминокислотных остатков в зрелом сывороточном альбумине человека, и m определяется как любое целое число в диапазоне от 2 до 579. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. В дополнительных вариантах реализации N-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от m до 609, где 609 представляет собой целое число, показывающее общее количество аминокислотных остатков в полноразмерном сывороточном альбумине человека, и m определяется как любое целое число в диапазоне от 2 до 603. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Более того, фрагменты гибридных белков альбумина согласно настоящему изобретению включают полноразмерный гибридный белок альбумина, а также полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков из аминоконца гибридного белка альбумина, В частности, N-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от m до q, где q представляет собой целое число, показывающее общее количество аминокислотных остатков в гибридном белке альбумина, и m определяется как любое целое число в диапазоне от 2 до q минус 6. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Также, как указано выше, даже если делеция одной или более аминокислот из N-конца или С-конца эталонного полипептида (например, белка G-CSF; белка сывороточного альбумина; или гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению) приводит к модификации или потере одной или более биологических функций белка, другие виды функциональной активности (например, биологическая активность, способность мультимеризоваться, способность связывать лиганд) и/или терапевтической активности по-прежнему могут сохранятся. Например, способность полипептидов с С-концевыми делециями индуцировать и/или связываться с антителами, которые распознают полные или зрелые формы полипептида, обычно сохраняется при удалении менее большинства остатков полного или зрелого полипептида из С-конца. Сохраняет ли конкретный полипептид, в котором отсутствуют N-концевые и/или Сконцевые остатки эталонного полипептида, терапевтическую активность, можно легко определить рутинными способами, указанными в настоящем описании и/или иными способами, известными в данной области техники. Согласно настоящему изобретению также предложены полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков из карбоксиконца аминокислотной последовательности белка G-CSF, соответствующего части белка G-CSF гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению. В частности,С-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от 1 до n, где n представляет собой любое целое число в диапазоне от 6 до q минус 1, и где q представляет собой целое число, показывающее общее количество аминокислотных остатков в эталонном полипептиде (например, в белке G-CSF или части белка G-CSF гибридного белка альбумина, кодируемого полинуклеотидом или гибридной конструкцией альбумина). Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков из карбоксиконца аминокислотной последовательности белка альбумина, соответствующего части белка альбумина гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению. В частности, С-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от 1 до n, где n представляет собой любое целое число в диапазоне от 6 до 584, где 584 представляет собой целое число, показывающее общее количество остатков аминокислот в зрелом сывороточном альбумине человека минус 1. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. В частности, С-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от 1 до n, где n представляет собой любое целое число в диапазоне от 6 до 608, где 608 представляет собой целое число, показывающее общее количество остатков аминокислот в сывороточном альбумине минус 1. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Более того, согласно настоящему изобретению предложены полипептиды, содержащие делецию одного или более остатков из карбоксиконца гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению. В частности, С-концевые делеции могут быть описаны общей формулой от 1 до n, где n представляет собой любое целое число в диапазоне от 6 до q минус 1, и где q представляет собой целое число, показывающее общее количество остатков аминокислот в гибридном белке альбумина согласно настоящему изобретению. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Кроме того, любые из вышеописанных N- или С-концевых делеции могут быть скомбинированы с получением N- и С-концевого делетированного эталонного полипептида. Согласно настоящему изобретению также предложены полипептиды, содержащие делецию одной или более аминокислот как из амино-, так и из карбоксиконца, которые в целом могут быть описаны как содержащие остатки от m до n эталонного полипептида (например, белка G-CSF или части белка G-CSF гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, или сывороточного альбумина, или части белка альбумина гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, или гибридного белка альбумина, или гибридного белка альбумина, кодируемого полинуклеотидом или гибридной конструкцией альбумина согласно настоящему изобретению), где n и m представляют собой целые числа, как описано выше. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Настоящая заявка также относится к белкам, содержащим полипептиды по меньшей мере на примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% идентичные эталонному полипептиду G-CSF или эталонному полипептиду альбумина, указанному в настоящем описании, или их фрагментам. В предпочтительных вариантах реализации настоящая заявка относится к белкам, содержащим полипептиды по меньшей мере на примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% идентичные эталонным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, соответствующую N- и С-концевым делециям, описанным выше. Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Предпочтительные полипептидные фрагменты согласно настоящему изобретению представляют собой фрагменты содержащие или, в качестве альтернативы, состоящие из аминокислотной последовательности, проявляющей терапевтическую активность и/или функциональную активность (например, биологическую активность) полипептидной последовательности белка G-CSF или белка сывороточного альбумина, фрагментом которого является данная аминокислотная последовательность. Другие предпочтительные полипептидные фрагменты представляют собой биологически активные фрагменты. Биологически активные фрагменты представляют собой фрагменты, проявляющие активность, схожую, но не обязательно идентичную активности полипептида согласно настоящему изобретению. Биологическая активность фрагментов может включать улучшенную желаемую активность или сниженную нежелательную активность. В. Варианты Термин "вариант" относится к полинуклеотиду или нуклеиновой кислоте, отличающимся от эталонной нуклеиновой кислоты или полипептида, но сохраняющим их основные свойства. Как правило,варианты в целом очень схожи и во многих областях идентичны эталонной нуклеиновой кислоте или полипептиду. В настоящем описании термин "вариант" относится к части белка G-CSF гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, части альбумина гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению или гибридному белку согласно настоящему изобретению, отличающимся по последовательности от белка G-CSF, белка альбумина и/или гибридного белка альбумина соответственно, но сохраняющим по меньшей мере одно их функциональное и/или терапевтическое свойство, как описано в других разделах настоящего описания или иным образом известно в данной области техники. Как правило, варианты в целом очень схожи и во многих областях идентичны аминокислотной последовательности белка G-CSF, соответствующего части белка G-CSF гибридного белка альбумина, белка альбумина, соответствующего части белка альбумина гибридного белка альбумина, и/или гибридного белка альбумина. Нуклеиновые кислоты, кодирующие данные варианты, также включены в настоящее изобретение. Настоящее изобретение также относится к белкам, содержащим или, в качестве альтернативы, состоящим из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или примерно 100% идентична, например,аминокислотной последовательности белка G-CSF, соответствующего части белка G-CSF гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, белков альбумина, соответствующих части белка альбумина гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению, и/или гибридных белов альбумина. Также предложены фрагменты данных полипептидов. Дополнительные полипептиды, включенные в настоящее изобретение, представляют собой полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, которые гибридизуются с комплементом молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению, в жестких условиях гибридизации (например, гибридизация с фильтр-связанной ДНК в 6 смеси хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при примерно 45 С с последующей одной или более промывками в 0,2SSC, 0,1% додецилсульфата натрия при примерно 5065 С), в очень жестких условиях (например, гибридизация с фильтр-связанной ДНК в 6 смеси хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при примерно 45 С с последующей одной или более промывками в 0,1SSC, 0,2% додецилсульфата натрия при примерно 68 С) или в других жестких условиях гибридизации,которые известны специалисту в данной области техники (см., например, Ausubel, F. M. et al., eds., 1989Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associates, Inc., и John WileySons Inc., New York,страницы 6.3.1-6,3,6 и 2.10.3). Полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Под полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, по меньшей мере, например, 95% - "идентичную" запрашиваемой аминокислотной последовательности, подразумевают, что указанная аминокислотная последовательность рассматриваемого полипептида идентична запрашиваемой последовательности за исключением того, что рассматриваемая полипептидная последовательность может содержать до пяти изменений аминокислот на каждые 100 аминокислот запрашиваемой аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную запрашиваемой аминокислотной после- 11023344 довательности, до 5% остатков аминокислот в рассматриваемой последовательности могут быть встроены, удалены или заменены на другую аминокислоту. Данные изменения эталонной последовательности могут происходить в амино- и карбоксиконцевых положениях эталонной аминокислотной последовательности или где-либо между данными концевыми положениями вперемежку либо по отдельности среди остатков в эталонной последовательности, либо в одной или более смежных групп в пределах эталонной последовательности. С практической точки зрения, является ли какой-либо конкретный полипептид по меньшей мере на примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% идентичным, например, аминокислотной последовательности гибридного белка альбумина согласно настоящему изобретению или его фрагмента (например, части белка G-CSF гибридного белка альбумина или части альбумина гибридного белка альбумина), может быть определено традиционным методом с использованием известных компьютерных программ. Предпочтительный способ определения наибольшего полного соответствия между запрашиваемой последовательностью (последовательностью согласно настоящему изобретению) и рассматриваемой последовательностью, также известный как глобальное сопоставление последовательностей, может быть определен с использованием компьютерной программы FASTDB на основе алгоритма Brutlag et al. (Сотр. Арр. Biosci. 6:237-245 (1990. При сопоставлении последовательностей запрашиваемая и рассматриваемая последовательности либо обе представляют собой нуклеотидные последовательности, либо обе представляют собой аминокислотные последовательности. Результат глобального сопоставления последовательностей выражают в процентах идентичности. Предпочтительные параметры, используемые при выравнивании аминокислот FASTDB, представляют собой: Матрица = РАМ 0, ktuple=2, Штраф на несовпадение (Mismatch Penalty) = 1, Штраф на соединение (Joining Penalty) = 20, Длина группы рандомизации (Randomization Group Length) = 0, Граница отсечения (Cutoff Score) = 1, Размер окна(Window Size) = длина последовательности, Штраф на пробел (Gap Penalty )= 5, Штраф на размер пробела(Gap Size Penalty) = 0,05, Размер окна (Window Size) = 500 или длина рассматриваемой аминокислотной последовательности, в зависимости от того, которая короче. Если рассматриваемая последовательность короче запрашиваемой последовательности вследствиеN- или С-концевых делеций, а не внутренних делеций, должна быть проведена ручная коррекция результатов. Причина заключается в том, что программа FASTDB не учитывает N- и С-концевые усечения рассматриваемой последовательности при расчете процента глобальной идентичности. Для рассматриваемых последовательностей, усеченных на N- и С-концах, относительно запрашиваемой последовательности, процент идентичности корректируют путем подсчета числа остатков запрашиваемой последовательности, которые являются N- и С-концевыми рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/не сопоставлены с соответствующим рассматриваемым остатком, в виде процента от общих оснований запрашиваемой последовательности. Совпадает/сопоставлен ли остаток определяют по результатам сопоставления последовательностей FASTDB. Затем данный процент вычитают из процента идентичности, рассчитанного посредством программы FASTDB выше, с использованием указанных параметров, с получением конечной величины процента идентичности. Именно данную конечную величину процента идентичности используют для целей настоящего изобретения. Только остатки на N- и С-концах рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/сопоставлены с запрашиваемой последовательностью, рассматривают для целей ручной корректировки величины процента идентичности. То есть только запрашиваемые положения остатков за пределами самых дальних N- и С-концевых остатков рассматриваемой последовательности. Например, состоящую из 90 остатков аминокислот рассматриваемую последовательность сопоставляют с состоящей из 100 остатков запрашиваемой последовательностью с определением процента идентичности. Делеция происходит на N-конце рассматриваемой последовательности и, следовательно, сопоставление FASTDB не показывает совпадение/сопоставление первых 10 остатков на N-конце. 10 непарных остатков составляют 10% последовательности (число не совпадающих остатков на N- и Сконцах/общее число остатков в запрашиваемой последовательности), поэтому 10% вычитают из величины процента идентичности, рассчитанной программой FASTDB. Если бы оставшиеся 90 остатков идеально совпадали, конечный процент идентичности составил бы 90%. В другом примере состоящую из 90 остатков рассматриваемую последовательность сравнивают с состоящей из 100 остатков запрашиваемой последовательностью. В этом примере делеции представляют собой внутренние делеции, поэтому нет остатков на N- или С-концах рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/выровнены с запрашиваемой. В данном случае процент идентичности, рассчитанный посредством FASTDB, не корректируют вручную. Снова вручную корректируют только положения остатков за пределами N- и Сконцевых областей рассматриваемой последовательности, как показано при выравнивании FASTDB, которые не совпадают/сопоставлены с запрашиваемой последовательностью. Никаких других ручных корректировок для целей настоящего изобретения выполнять не нужно. Как правило, вариант будет обладать по меньшей мере примерно 75% (в других вариантах реализации по меньшей мере примерно 80%,примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99%) идентичности последовательно- 12023344 стей с длиной нормального белка НА или G-CSF, который имеет ту же длину, что и указанный вариант. Гомологию или идентичность на уровне нуклеотидной или аминокислотной последовательности определяют путем анализа BLAST (средство поиска основного локального сопоставления) с применением алгоритма, используемого программами blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87: 2264-2268 (1990) и Altschul, J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993), полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки), специально разработанными для поиска сходства последовательностей. Подход, используемый программой BLAST, заключается в том, чтобы сначала рассмотреть схожие сегменты запрашиваемой последовательности и последовательности из базы данных, затем оценить статистическую значимость всех идентифицированных совпадений и, наконец, суммировать только те совпадения, которые удовлетворяют предварительно выбранному порогу значимости. Для рассмотрения основных вопросов по поиску сходства баз данных последовательностей см. Altschul et al., (Nature Genetics 6: 119-129 (1994, полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки. Поисковые параметры для гистограммы, описаний, выравниваний, ожидания (т.е. порог статистической значимости для сообщения о совпадениях относительно последовательностей из базы данных),отсечения, матрицы и фильтра являются параметрами по умолчанию. Стандартная матрица замен, используемая blastp, blastx, tblastn и tblastx представляет собой матрицу BLOSUM62 (Henikoff et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992), полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки). Для blastn матрицу замен устанавливают соотношениями от M (т.е. премия для пары совпадающих остатков) до N (т.е. штраф на несовпадающие остатки), при этом значения по умолчанию для M и N представляют собой 5 и -4 соответственно. Четыре параметра blastn могут быть скорректированы следующим образом: Q-10 (штраф на создание делеции (gap creation penalty; R = 10 (штраф на продолжение делеции (gap extension penalty; wink = 1 (генерирует попадания в слова в каждом положенииwink.sup.th на протяжении запроса); и gapw = 16 (устанавливает ширину окна, в котором получают содержащие делеции сопоставления). Эквивалентные установки параметров Blastp представляли собой Q = 9; R = 2; wink = 1; и gapw = 32. В сравнении Bestfit последовательностей, доступном в версии пакетаGCG 10,0, используют параметры ДНК GAP = 50 (штраф на создание делеции (gap creation penalty иLEN = 3 (штраф на продолжение делеции (gap extension penalty и эквивалентные установки при сравнениях белка представляют собой GAP = 8 и LEN = 2. Варианты полинуклеотидов согласно настоящему изобретению могут содержать изменения в кодирующих областях, некодирующих областях или обеих областях. Наиболее предпочтительными являются варианты полинуклеотидов, содержащие изменения, которые образуют молчащие замены, добавления или делеции, но не изменяют свойства или виды активности кодируемого полипептида. Предпочтительны варианты нуклеотидов, образованные молчащими заменами из-за вырожденности генетического кода. Более того, предпочтительными также являются варианты полипептидов, в которых менее 50, менее 40, менее 30, менее 20, менее 10 или 5-50, 5-25, 5-10, 1-5 или 1-2 аминокислоты заменены, удалены или добавлены в любой комбинации. Варианты полинуклеотидов могут быть получены по разным причинам,например, для оптимизации экспрессии кодоном для конкретного хозяина (изменение кодонов в мРНК человека на кодоны, предпочтительные для бактериального хозяина, такого как дрожжи или Е. coli). В предпочтительном варианте реализации полинуклеотид согласно настоящему изобретению, кодирующий часть альбумина гибридного белка альбумина, оптимизируют для экспрессии в клетках дрожжей или млекопитающих. В другом предпочтительном варианте реализации полинуклеотид согласно настоящему изобретению, кодирующий часть белка G-CSF гибридного белка альбумина, оптимизируют для экспрессии в клетках дрожжей или млекопитающих. В еще одном предпочтительном варианте реализации полинуклеотид, кодирующий гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению, оптимизируют для экспрессии в клетках дрожжей или млекопитающих. В альтернативном варианте реализации полинуклеотид с оптимизированными кодонами, кодирующий часть белка G-CSF гибридного белка альбумина, не гибридизуется с полинуклеотидом дикого типа, кодирующим белок G-CSF, в жестких условиях гибридизации, как описано в настоящем описании. В другом варианте реализации полинуклеотид с оптимизированными кодонами, кодирующий часть альбумина гибридного белка альбумина, не гибридизуется с полинуклеотидом дикого типа, кодирующим белок альбумина, в жестких условиях гибридизации,как описано в настоящем описании. В другом варианте реализации полинуклеотид с оптимизированными кодонами, кодирующий гибридный белок альбумина, не гибридизуется с полинуклеотидом дикого типа, кодирующим часть белка G-CSF или часть белка альбумина, в жестких условиях гибридизации, как описано в настоящем описании. В дополнительном варианте реализации полинуклеотид, кодирующий часть белка G-CSF гибридного белка альбумина, не содержит или, в качестве альтернативы, не состоит из встречающейся в природе последовательности данного белка G-CSF. В другом варианте реализации полинуклеотид, кодирующий часть белка альбумина гибридного белка альбумина, не содержит или, в качестве альтернативы, не состоит из встречающейся в природе последовательности белка альбумина. В альтернативном варианте реализации полинуклеотид, кодирующий гибридный белок альбумина, не содержит или, в качестве альтернативы, не состоит из встречающейся в природе последовательности части белка G-CSF или части белка альбумина. С использованием известных способов белковой инженерии и технологии рекомбинантных ДНК могут быть получены варианты для улучшения или изменения характеристик полипептидов согласно настоящему изобретению. Например, одна или более аминокислот могут быть удалены с N-конца или Сконца полипептида согласно настоящему изобретению, по существу, без потери биологической функции. В предпочтительных вариантах реализации варианты согласно настоящему изобретению содержат консервативные замены. Под термином "консервативные замены" подразумевают замены внутри групп, такие как замена алифатических или гидрофобных аминокислот Ala, Val, Leu и Не; замена гидроксильных остатков Ser и Таг; замена кислых остатков Asp и Glu; замена амидных остатков Asn и Gln, замена основных остатков Lys, Arg и His; замена ароматических остатков Phe, Tyr и Trp и замена аминокислот малого размера Ala, Ser, Thr, Met и Gly. Руководство по получению фенотипически молчащие замены аминокислот приведено, например, вBowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990), в котором авторы отмечают, что существует две основные стратегии для исследования "толерантности" аминокислотной последовательности к изменению. В первой стратегии используется "толерантность" к заменам аминокислот со стороны естественного отбора в процессе эволюции. Путем сравнения аминокислотных последовательностей у разных видов могут быть идентифицированы консервативные аминокислоты. Данные консервативные аминокислоты,вероятно, имеют важное значение для функции белка. В отличие от этого положения аминокислот, где замены были допущены естественным отбором, вероятно, не имеют критического значения для функции белка. Таким образом, положения, в которых допускается замена аминокислот, могут быть модифицированы, при этом биологическая активность белка сохраняется. Во второй стратегии для введения изменений аминокислот в конкретных положениях клонированного гена для идентификации областей, имеющих критическое значение для функции белка используется генная инженерия. Например, может быть использован сайт-направленный мутагенез или сканирующий аланином мутагенез (введение единичных мутаций аланина в каждом остатке в молекуле). См. Cunningham и Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Полученные мутантные молекулы затем могут быть протестированы на биологическую активность. Как утверждают авторы, данные две стратегии показали, что белки удивительно "толерантны" к заменам аминокислот. Авторы также показывают, какие изменения аминокислот, вероятно, будут разрешены в определенных положениях аминокислот в белке. Например, для большинства скрытых (в пределах третичной структуры белка) остатков аминокислот необходимы неполярные боковые цепи, тогда как некоторые особенности поверхностных боковых цепей, как правило, сохраняются. Более того, допустимые консервативные замены аминокислот включают замену алифатических или гидрофобных аминокислот Ala, Val, Leu и Ile; замену гидроксильных остатков Ser и Thr; замену кислых остатков Asp и Glu; замену амидных остатков Asn и Gln, замену основных остатков Lys, Arg и His; замену ароматических остатков Phe, Tyr и Trp, и замену аминокислот малого размера Ala, Ser, Thr, Met и Gly. Помимо консервативной замены аминокислот, варианты согласно настоящему изобретению включают (i) полипептиды,содержащие замены одного или более неконсервативных остатков аминокислот, при этом замененные аминокислотные остатки могут быть или могут не кодироваться генетическим кодом, или (ii) полипептиды, содержащие замены одного или более остатков аминокислот, содержащих заменяющую группу,или (iii) полипептиды, которые были слиты или химически сопряжены с другим соединением, таким как соединение для увеличения стабильности и/или растворимости полипептида (например, полиэтиленгликоль), (iv) полипептид, содержащий дополнительные аминокислоты, такой как, например, пептид с гибридной областью Fc IgG. Предполагается, что указанные вариантные полипептиды находятся в рамках компетенции специалиста в данной области техники исходя из идей настоящего описания. Например, варианты полипептидов, содержащие замены заряженных аминокислот на другие заряженные или нейтральные аминокислоты, могут приводить к образованию белков с улучшенными характеристиками, такими как пониженная агрегация. Агрегация фармацевтических составов одновременно снижает активность и повышает клиренс вследствие иммуногенной активности агрегата. См. Pinckard etTherapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993). В конкретных вариантах реализации полипептиды согласно настоящему изобретению содержат или, в качестве альтернативы, состоят из фрагментов или вариантов аминокислотной последовательности гибридного белка альбумина, аминокислотной последовательности белка G-CSF и/или сывороточного альбумина человека, при этом указанные фрагменты или варианты содержат 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 1050 и 50-150 присоединений, замен и/или делеций остатков аминокислот по сравнению с эталонной аминокислотной последовательностью. В предпочтительных вариантах реализации замены аминокислот являются консервативными. Нуклеиновые кислоты, кодирующие данные полипептиды, также включены в настоящее изобретение. Полипептид согласно настоящему изобретению может состоять из аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями,т.е. пептидные изостеры, и могут содержать аминокислоты, отличные от 20 генетически кодируемых аминокислот. Полипептиды могут быть модифицированы либо естественными путями, такими как по- 14023344 сттрансляционный процессинг, или в соответствии с технологиями химической модификации, которые хорошо известны в данной области техники. Указанные модификации хорошо описаны в базовых учебниках и в более подробных монографиях, а также в обширной исследовательской литературе. Модификации могут происходить в любом месте полипептида, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот и амино- или карбоксиконцы. Очевидно, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одинаковой или различной степени в нескольких участках в данном полипептиде. Кроме того,конкретный полипептид может содержать много типов модификаций. Полипептиды могут быть разветвленными, например, в результате убиквитинилирования и они могут быть циклическими с разветвлением или без него. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут являться проуктом посттрансляционных естественных процессов или могут быть получены синтетическими способами. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование,ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение фрагмента гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, сшивание, Циклизацию, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию,селеноилирование, сульфатацию, опосредуемое транспортной РНК добавление аминокислот к белкам,такое как аргинилирование и убиквитинилирование. (См., например, PROTEINS-STRUCTURE и MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman и Company, New York (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, В. С Johnson, Ed., Academic Press, NewYork, nrs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:4862 (1992. С. Функциональная активность Термин "полипептид, обладающий функциональной активностью" относится к полипептиду, способному проявлять один или более видов известной функциональной активности, ассоциируемой с полноразмерным белком, про-белком и/или зрелой формой белка G-CSF. Указанные виды функциональной активности включают, но не ограничиваются перечисленными: биологическую активность, антигенность[способность связываться (или конкурировать с полипептидом за связывание) с антителом к полипептиду], иммуногенность (способность вызывать образование антитела, которое связывается с конкретным полипептидом согласно настоящему изобретению), способность образовывать мультимеры с полипептидами согласно настоящему изобретению и способность связываться с рецептором или лигандом полипептида. Термин "полипептид, обладающий биологической активностью" относится к полипептиду, проявляющему активность, близкую к, но не обязательно идентичную активности белка G-CSF согласно настоящему изобретению, включая зрелые формы, измеряемую в конкретном биологическом анализе с зависимостью от доз или без нее. В предпочтительных вариантах реализации гибридный белок альбумина согласно настоящему изобретению обладает по меньшей мере одним видом биологической и/или терапевтической активности, связанной с частью белка G-CSF (или его фрагментом или вариантом), не гибридизованного с альбумином. Гибридные белки альбумина согласно настоящему изобретению могут быть исследованы на функциональную активность (например, биологическую активность) с использованием тестов, известных в данной области техники, или их рутинных модификаций, а также тестов, указанных в настоящем описании. Кроме того, специалист в данной области техники может рутинным способом исследовать фрагменты белка G-CSF, соответствующие части белка G-CSF гибридного белка альбумина. Кроме того, специалист в данной области техники может рутинным способом исследовать фрагменты белка альбумина, соответствующие части белка альбумина гибридного белка альбумина, на активность с использованием тестов, известных в данной области техники, и/или как описано в разделе Примеры ниже. Например, в одном из вариантов реализации, в котором анализируют способность гибридного белка альбумина связывать или конкурировать с белком G-CSF за связывание с антителом к полипептиду GCSF и/или антителом к альбумину, могут быть использованы различные иммуноанализы, известные в данной области техники, включая, но не ограничиваясь перечисленными: системы конкурентного и бесконкурентного анализа с использованием таких технологий, как радиоиммуноанализы, ИФА (твердофазный иммуноферментный анализ), иммуноанализы типа "сэндвич", иммунорадиометрические анализы,гель-диффузионные реакции осаждения, иммунодиффузионные анализы, иммуноанализы in situ (с использованием коллоидного золота, фермента или радиоизотопных меток, например), вестерн-блоттинг,реакции осаждения, реакции агглютинации (например, реакции агглютинации в геле, реакции гемагглютинации), реакции связывания комплемента, иммунофлуоресцентные анализы, тесты с белком белка А и исследования методом иммуноэлектрофореза и т.д. В одном из вариантов реализации связывание антитела обнаруживают путем детектирования метки на первичном антителе. В другом варианте реализации первичное антитело обнаруживают путем детектирования связывания вторичного антитела или реагента с первичным антителом. В другом варианте реализации вторичное антитело метят. В данной области техники известно много способов детектирования связывания в иммуноанализе и они входят в объем настоящего изобретения. В предпочтительном варианте реализации, в котором идентифицируют партнера по связыванию(например, рецептор или лиганд) белка G-CSF, можно анализировать связывание с данным партнером по связыванию посредством гибридного белка альбумина, который содержит данный белок G-CSF в качестве части белка G-CSF указанного гибрида, например, способами, хорошо известными в данной области техники, такими как, например, восстанавливающая и невосстанавливающая гель-хроматография, аффинная хроматография белков и аффинный блоттинг. См., в целом, Phizicky et al., Microbiol. Rev. 59:94123 (1995). В другом варианте реализации способность физиологических коррелятов гибридного белка альбумина связываться с рецептором (рецепторами) полипептида G-CSF, соответствующего части белкаG-CSF указанного гибрида, можно рутинным способом анализировать с использованием технологий,известных в данной области техники. В альтернативном варианте реализации, в котором оценивают способность гибридного белка альбумина мультимеризоваться, можно анализировать связывание с другими компонентами мультимера,например, методами, хорошо известными в данной области техники, такими как, например, восстанавливающая и невосстанавливающая гель-хроматография, аффинная хроматография белков и аффинный блоттинг. См., в целом, Phizicky et al., выше. Иммуноанализы, которые могут быть использованы для анализа белкового связывания, перекрестной реактивности, или идентичности, включают, но не ограничиваются перечисленными: системы конкурентного и бесконкурентного анализа с использованием технологий, таких как вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализы, ИФА (твердофазный иммуноферментный анализ), иммуноанализы "сэндвич"-типа,реакции иммуноосаждения, реакции осаждения, гель-диффузионные реакции осаждения, иммунодиффузионные анализы, реакции агглютинации, реакции связывания комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы и анализы белка А, и другие. Указанные анализы являются рутинными и хорошо известны в данной области техники (см., например, Ausubel et al., eds, 1994, CurrentProtocols in Molecular Biology, vol. 1, John WileySons, Inc., New York, полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки). Антитела, которые связывают белок G-CSF, соответствующий части белка G-CSF гибридного белка альбумина, также могут быть описаны или охарактеризованы в терминах их аффинности к связыванию в отношении данного белка или антигена, предпочтительно антигена, который они специфично связывают. Предпочтительные значения аффинности связывания включают значения с константой диссоциации илиKd менее 510-2 М, 10-2 М, 5103 М, 103 М, 510-4 M, 10-4 М. Более предпочтительные значения аффинности связывания включают значения с константой диссоциации или Kd менее 510-5 М, 10-5 М, 510-6 М, 10-6 М, 510-7 М, 10-7 М, 510-8 M или 10-8 М. Еще более предпочтительные значения аффинности к связыванию включают значения с константой диссоциации или Kd менее 510-9 М, 10-9 М, 51010 М, 10-10 М, 510-11 М, 10-11 М, 510-12 М, 10-12 М, 510-13 М, 10-13 М, 510-14 М, 10-14 М, 510-15 M или 10-15 М. Кроме того, тесты, указанные в настоящем описании или другие, известные в данной области техники, можно рутинно использовать для измерения способности гибридных белков альбумина и их фрагментов, вариантов и производных, вызывать биологическую активность и/или активность G-CSF(либо in vitro, либо in vivo), связанную или с частью белка G-CSF и/или частью альбумина гибридного белка альбумина. Другие способы известны специалисту в данной области техники и входят в объем настоящего изобретения.(rHA-G-CSF) представляет собой аналог G-CSF. Примеры rHA-G-CSF описаны в патенте США 5665863 и в патенте США No. 7041478, оба из которых включены в настоящую заявку посредством ссылки. Другой пример rHA-G-CSF представляет собой Нейгранин ("NEUG"), разработанный компаниейTeva Biopharmaceuticals USA LTD. NEUG представляет собой гибридный полипептид с молекулярной массой приблизительно 85 кДа. NEUG представляет собой одноцепочечный полипептид из 759 аминокислот, где остатки 1-585 соответствуют зрелой форме HSA, и остатки 586-759 соответствуют зрелой форме G-CSF человека. Последовательность аминокислот гибридного белка NEUG показана на фиг. 1.VI. Получение гибридного белка Примеры способов синтетических процессов производства rHA-G-CSF описаны в заявке на патент США 11/929828, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации NEUG получают с использованием хозяйской системы на основе дрожжей (например, Saccharomyces cerevisiae), созданной методами генной инженерии для экспрессии гибридного белка NEUG. NEUG собирают из сбраживаемой среды дрожжевой культуры и очищают с использованием методов, хорошо известных в данной области техники (например, путем серии этапов хроматографии и фильтрации, таких как аффинная хроматография и ионообменная хроматография). В одном из неограничивающих примеров гибридную конструкцию NEUG получали следующим образом. Полноразмерную кДНК альбумина выделяли из библиотеки кДНК человека в лаборатории д-ра.F.E. Baralle в Оксфордском университете, Великобритания. Данный клон отправляли в Delta Biotechnology Limited, Ноттингем, Великобритания, в виде плазмиды pAT153ALB. Кроме того, модифицировали состоящий из 6 аминокислот пропептид HSA (RGVFRR) для обеспечения более эффективного процессинга в дрожжах (RSLDKR). Плазмида для получения NEUG, модифицированный вектор экспрессии, основанный на pSAC35,основана на 2-мкм плазмиде, обнаруженной в Saccharomyces cerevisiae дикого типа. Вектор экспрессии на основе PSAC35 (см., например, патенты ЕР 286424 В, патент США 5637504) содержит ген LEU2 изSaccharomyces cerevisiae в качестве селектируемого маркера, который дополняет дефицит лейцина хозяина S. cerevisiae для получения. Данная плазмида для получения также содержит сильный дрожжевой промотор, PRB1, и последовательности плазмиды pUC9, обеспечивающие клонирование и воспроизводство в Е. coli. Кроме того, указанная плазмида устраняет последовательности из pUC9, необходимые для воспроизводства в Е. Coli, сразу после трансформации в дрожжи. Это достигается путем фланкирования распознающих FLP мишеней (FRT) и экспрессии рекомбиназы FLP дрожжей с плазмиды после попадания в дрожжи. Таким образом, в организме, используемом для получения NEUG, не присутствует бактериальная ДНК. Это подтверждено путем выделения и секвенирования 2 мкм плазмиды из дрожжей после получения главного банка клеток. Как описано выше, плазмиду для получения NEUG, называемуюCID1643 (pSAC35:HSA.GCSF(T31-P204, получали из вектора экспрессии на основе pSAC35. Область,соответствующую Т 31-Р 204 G-CSF человека, амплифицировали путем ПЦР при добавлении подходящих 5' и 3' сайтов рестрикции с обеспечением гладкого слияния с 3'-концом открытой рамки считыванияHSA. Флаконы с затравкой NEUG использовали для получения главного банка клеток cGMP в HumanGenome Sciences, Inc., в Роквилле, Мэриленд. Тестирование и исследование основного банка клетокNEUG выполняли в Charles River Laboratories (Малверн, Пенсильвания, США) и Lark Technologies (Хьюстон, Техас, США) согласно руководству ICH Q5D (Выделение и характеристика клеточных субстратов,используемых для производства биотехнологических/биологических продуктов). Затем получали рабочий банк клеток cGMP, полученный из основного банка клеток, и тестировали его в Charles River Laboratories (Малверн, Пенсильвания, США). Все компоненты сред, применяемые в производстве банков линий клеток NEUG, были синтетическими, биосинтетическими или растительного происхождения. В ходе получения линии клеток или банка клеток не использовали компоненты животного или человеческого происхождения. Банки клеток хранят при температуре -135 С в средах для криоконсервирования в предварительно стерилизованных 1,8 мл полипропиленовых пробирках Nunc с винтовыми с внутренней стороны крышками. Неограничивающий типичный способ выделения, очищения и приготовления гибридного белкаrHSA-G-CSF для фармацевтического применения показан на фиг. 21. Состав лекарственного вещества асептически фильтруют с использованием 0,2 мкм фильтра в автоклавированные тефлоновые бутылки. Наполненное жидкостью лекарственное средство хранят в замороженном виде при температуре примерно -80 С (номинальное значение, приемлемый диапазон температур хранения составляет до -65 С). Для улучшения устойчивости состава для перевозки и хранения в клинических базах, а также для обеспечения стабильности продукта с ожидаемым долгим сроком хранения, NEUG может также быть лиофилизирован способами, хорошо известными в данной области техники.VII. Примеры причинылейкопении и нейтропении Как описано выше, лейкопения представляет собой снижение количества циркулирующих лейкоцитов (белых клеток крови, WBC), а нейтропения характеризуется пониженным содержанием нейтрофилов крови, которое часто приводит к повышенной чувствительности к бактериальным или грибковым инфекциям. Далее следует неполный список факторов, на основании которых субъекта идентифицируют как имеющего риск развития лейкопении или нейтропении: прием лекарственных средств (например,фенитоина, хлорамфеникола, сульфамидных лекарственных средств и химиотерапевтических лекарственных средств); дефицит витамина В 12 или дефицит фолатов; чрезмерное потребление алкоголя; рак или другие заболевания, которые поражают костный мозг (например, гипопластическая анемия, дисгаммаглобулинемия, ночная пароксизмальная гемоглобинурия, миелодисплазия, миелодиспластические синдромы, миелофиброз, лейкемия, миелома, лимфома или метастатические солидные опухоли, которые инфильтрируют и замещают костный мозг); вирусные инфекции (например, грипп, ВИЧ, ранние стадии инфекционного мононуклеоза, детские вирусные заболевания); бактериальные инфекции (например, туберкулез); облучение; токсины (например, бензол и инсектициды); недостаточность костного мозга (например, Синдром Швахмана-Даймонда, хряще-волосяная гипоплазия, врожденный дискератоз, болезнь накопления гликогена IB типа); повреждение селезенки, спленомегалия любой этиологии; врожденные дефекты миелоидных клеток или их предшественников; аллергические заболевания; аутоиммунные заболевания; Т- лимфопролиферативное заболевание (Т- ЛПЗ); гемодиализ или трансплантация; токсины. Многочисленные лекарственные средства, которые используют в различных химиотерапевтических схемах лечения (например, схемах цитотоксической химиотерапии), связаны с высоким риском развития фебрильной нейтропении (например,чем 20% риском). При использовании некоторых схем химиотерапии частота возникновения фебрильной нейтропении в отсутствие лечения G-CSF составляет примерно 40% (например, схема химиотерапии, включающая внутривенное введение доксорубицина и доцетаксела). Неограничивающие примеры различных раковых заболеваний и схем лечения, связанных с риском развития фебрильной нейтропении, приведены ниже в табл. 1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения гибридный белок HSA-G-CSF, показанный на фиг. 1, вводится пациенту для предотвращения, лечения или облегчения нейтропении, связанной с введением указанных лекарственных препаратов. Схемы цитотоксического лечения мелкоклеточного рака легких, например, цисплатин + этопозид,также как и САЕ, тоже связаны с развитием фебрильной нейтропении. Известны различные виды нейтропении, и согласно некоторым вариантам реализации изобретения гибридный белок HSA-G-CSF, показанный на фиг. 1, применяется для предотвращения, лечения или облегчения одного или более видов нейтропении, включая (но не ограничиваясь указанными) вызванную химиотерапией нейтропению, первичную нейтропению, острую нейтропению, тяжелую хроническую нейтропению (ТХН), тяжелую врожденную нейтропению (синдром Костманна), тяжелый генетически детерминированный агранулоцитоз новорожденных, доброкачественную нейтропению, Циклическую нейтропению, хроническую идиопатическую нейтропению, вторичную нейтропению, ассоциированную с синдромом нейтропению или имммуно-опосредованную нейтропению.VIII. Экспериментальные примеры Следующие примеры приведены целью иллюстрации настоящего изобретения. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными условиями или деталями, описанными в приведенных примерах. Содержание всех общедоступных документов, ссылки на которые приведены в настоящем описании, включая (но не ограничиваясь указанными) патенты США, включено в настоящее описание посредством ссылки. В следующих неограничивающих примерах Нейгранин ("NEUG") тестировали на клеточных линиях, на мышах и обезьянах и также использовался для предотвращения, лечения и облегчения нейтропении и/или лейкопении, вызванной лекарственной терапией (например, химиотерапией), у субъектов,представляющих собой людей, для лечения рака молочной железы.NEUG представляет собой аналог G-CSF, у которого скорость плазматического клиренса снижена благодаря слиянию активного соединения G-CSF с сывороточным альбумином человека. Полученный в результате полноразмерный рекомбинантный белок сохраняет фармакологическую активность G-CSF invivo, т.е. стимулирует мобилизацию нейтрофилов и гематопоэтических стволовых клеток из костного мозга в периферический кровоток. Оценивали активность указанного белка у мышей и обезьян (см. Экспериментальные примеры, ниже). Наблюдаемое повышение уровня нейтрофилов и гематопоэтических клеток-предшественников происходило быстро и сохранялось в течение нескольких дней после однократного введения. Эффекты являлись дозозависимыми, при этом более высоким дозам соответствовал более интенсивный и продолжительный ответ на введение NEUG по сравнению с ответом на более низкие дозы. Клиренс NEUG был медленнее, чем клиренс Нейпогена (филграстима). Кинетика нейтрофилии крови после однократного и многократного введения NEUG была почти такой же, как у животных,получающих лечение Нейластой (пэгфилграстимом). Так как NEUG в 4,5 раз больше Нейласты (пэгфилграстима) (по массе), для достижения подобного эффекта in vivo может применяться большая (по массе), но эквимолярная доза NEUG. У обезьян эквимолярная доза NEUG оказывала эквивалентный пэгфилграстиму эффект, а у мышей было показано, что доза NEUG, превышающая в 1,5 раза дозу пэгфилграстима, приводила к достижению эквивалентной AUCANC. В указанных исследованиях 1 мг Нейласты(пэгфилграстима) был эквивалентным по эффекту 4,5-7,7 мг NEUG. При этом максимальная доза, не приводящая к развитию наблюдаемых нежелательных явлений ("NOAEL"), для NEUG y обезьян составляла более 1 мг/кг/неделю. Доза 1 мг/кг оказывала в 12 раз большее воздействие (Cmax и AUC) у обезьян, чем у людей, получающих 0,45 мг/кг NEUG. Таким образом, NOAEL, показанная для обезьян, превышает диапазон доз, используемый для клинической оценки NEUG (см. ниже). В совокупности данные исследований показывают, что эквимолярные дозы NEUG обеспечивают фармакологический эффект, близкий к эффекту Нейласты (пэгфилграстиму) и оказывают такие же эффекты на популяцию гранулоцитов у человека.A. In vitro и in vivo исследования NEUG Далее следует обзор результатов исследований NEUG in vitro и in vivo, которые подробно описаны в Экспериментальных примерах, ниже. In vitro фармакологические исследования показали следующее: 1) NEUG вызывает пролиферацию клеток линии NFS-60 дозозависимым образом. 2) NEUG является в 3 раза менее активным, чем Нейпоген (филграстим) in vitro. 3) NEUG эквивалентен Нейласте (пэгфилграстиму) при оценке на основе молярных количеств (1 мг Нейласты (пэгфилграстима) эквивалентен по эффекту 4,5 мг NEUG). На основании in vivo фармакологических исследований были определены следующие свойстваNEUG: 1) NEUG хорошо переносится мышами и яванскими макаками. 2) У мышей однократное введение NEUG вызывает дозозависимое быстрое и продолжительное увеличение содержания нейтрофилов и гематопоэтических клеток-предшественников в периферической крови. При сравнении с имеющимися на рынке продуктами G-CSF было показано, что повышение содержания нейтрофилов и клеток-предшественников при использовании NEUG было более продолжительным, чем при использовании эквимолярной дозы Нейпогена (филграстима), и идентичным использованию эквимолярной дозы Нейласты (пэгфилграстима) по продолжительности и интенсивности. 3) У мышей эквивалентные эффект и AUCANC достигались при дозе NEUG, в 7,7 раз превышающей дозу Нейласты (пэгфилграстима). 4) У мышей с индуцированной 5-FU нейтропенией однократные инъекции эквимолярных дозNEUG и Нейласты (пэгфилграстима) приводили к эффективному ускорению восстановления нейтрофилов с идентичной кинетикой и выраженностью эффекта. 5) Однократные и многократные (один раз в неделю) дозы NEUG и Нейласты (пэгфилграстима) вызывают одинаковое увеличение содержания периферических нейтрофилов у обезьян. При эквимолярных дозах как интенсивность, так и продолжительность повышения содержания нейтрофилов у обезьян были одинаковыми для животных, получающих лечение Нейластой (пэгфилграстимом), и животных,получающих лечение NEUG. 6) Как у мышей, так и обезьян NEUG имеет более медленный клиренс, более длинный конечный период полувыведения и большее среднее время удержания, чем Нейпоген (филграстим) при IV илиSC введении. 7) У яванских макак конечный период полувыведения NEUG (12,6 ч) приблизительно на 33% длиннее, чем у Нейласты (пэгфилграстима) (9,49 ч) после SC инъекции, и клиренс по отношению к биодоступности ("CL/F") для NEUG составляет примерно половину значения CL/F для Нейласты (пэгфилграстима). 8) Клиренс NEUG и Нейласты (пэгфилграстима) медленнее у мышей с 5-FU-индуцированной цитопенией, чем у нормальных мышей, что указывает на то, что в выведение обоих белков вносит вклад рецептор-опосредованный клиренс. 9) Почечное выведение (показано на крысах) вносит значительный вклад в клиренс Нейпогена(филграстима), вносит незначительный вклад в клиренс Нейласты (пэгфилграстима) и не вносит значительного вклада в клиренс NEUG. 10) NEUG, белок человека, образованный из сывороточного альбумина человека и колониестимулирующего фактора человека, является иммуногенным у мышей и яванских макак. Нейласта (пэгфилграстим) вызывала такую же заболеваемость и титр антител у обезьян. Антитела некоторых обезьян, получающих лечение NEUG и Нейластой (пэгфилграстимом), были нейтрализующими in vitro, при этом как в случае NEUG, так и в случае Нейласты (пэгфилграстима), ответ нейтрофилов снижался при повторном воздействии, при этом у животных, положительных на присутствие антител, исходный уровень нейтрофилов был таким же, как уровень нейтрофилов у животных, отрицательных по присутствию антител, в течение периода восстановления. Взятые вместе данные по фармакологическим свойствам NEUG in vitro и in vivo дают основания полагать, что NEUG действует аналогичным Нейпогену (филграстиму) и Нейласте (пэгфилграстиму) образом в обеспечении мобилизации нейтрофилов и гематопоэтических клеток в кровоток. Неограничивающие экспериментальные примеры in vitro и in vivo описаны ниже. Пример 1. Пролиферация клеток NFS-60NSF-60 представляет собой клеточную линию, обычно используемую в биологических тестах для измерения активности G-CSF. Скорость пролиферации указанной клеточной линии повышается в ответ на введение G-CSF. Сравнивали относительную активность рекомбинантого C-CSF (Нейпогена, филграстима) и NEUG. Для измерения эффективности NEUG и Нейпогена (филграстима) в отношении стимуляции пролиферации клеток NFS-60 измеряли включение Н-тимидина через 24 ч после воздействия ряда концентраций указанных аналогов. Получали значения ЕС 50, которые выражали в единицах массы (нг/мл). Вкратце, 110 клеток NFS-60 на лунку высевали на 96-луночные планшеты в конечном объеме 200 мкл полной среды, включающей указанное количество NEUG (также называемого альбугранином) или Нейпогена (филграстима). Все образцы тестировали трижды. Клетки инкубировали при температуре 30 С в течение 24 ч и вводили в течение последних 4 ч 0,5 мкКи 3 Н-тимидина на лунку. Включение тимидина использовали для измерения пролиферации (фиг. 8).NEUG и Нейпоген (филграстим) стимулировали пролиферацию дозозависимым образом. В настоящем анализе Нейпоген (филграстим) являлся в 15 раз более активным, чем NEUG при сравнении на основе массы. NEUG в 4,5 раза больше (по массе) Нейпогена (филграстима), таким образом, при расчете на основе молярных количеств в настоящем анализе NEUG являлся в 3 раза менее активным,чем Нейпоген (филграстим) in vitro. Нейласту (пэгфилграстим) аликвотировали на основе массы рекомбинантного G-CSF, массу модифицированного полиэтиленгликоля не включали в расчет дозировки. NEUG в 4,5 раза больше рекомбинантного G-CSF из-за вклада массы HSA, и, таким образом, для сравнения способности NEUG и Нейласты (пэгфилграстима) стимулировать пролиферацию клеток NFS-60 использовали титры эквимолярных доз NEUG и Нейласты (пэгфилграстима) и значения EC50 выражали как молярные концентрации. Вкратце, 110 NFS-60 клеток/лунку высевали на 96-луночные планшеты в конечном объеме 200 мкл полной среды, содержащей указанное количество NEUG (альбугранина) или Нейласты (пэгфилграстима). Все образцы тестировали трижды. Клетки инкубировали при температуре 37 С в течение 20 ч и вво- 20023344 дили в течение последних 4 ч 0,5 мкКи 3 Н -тимидина на лунку. Включение тимидина использовали для измерения пролиферации. Результаты показаны на фиг. 9. Пример 2. Сравнение NEUG и Нейпогена (филграстима) у мышей BDF-1 Целью настоящего исследования была оценка эффекта однократных доз NEUG при его подкожном введении на нейтрофилы и гематопоэтические стволовые клетки периферической крови у мышей BDF-1. Мышей BDF-1 инъецировали подкожно ("SC") однократной дозой NEUG при 3 уровнях дозы (0,25, 1,25 или 5,0 мг/кг) или Нейпогеном (филграстимом) при 2 уровнях дозы (0,25 и 1,25 мг/кг). Гранулоциты(Gr,1+) и гематопоэтические клетки-предшественники (c-kit+) периферической крови оценивали количественно с помощью проточной цитометрии ежедневно с 1 дня до 5 дня и сравнивали с данными для животных, получающих плацебо (среду без тестируемого соединения). Как NEUG, так и Нейпоген (филграстим) вызывали повышение содержания нейтрофилов в периферической крови по сравнению с животными, получающими плацебо, но кинетика и интенсивность ответа различались (фиг. 10). В группах, получающих Нейпоген (пэгфилграстим), максимальное 3 кратное увеличение содержания нейтрофилов происходило на 1 день, и число нейтрофилов возвращалось к нормальному уровню ко 2 дню. Хотя однократное введение NEUG приводило к такому же повышению содержания нейтрофилов, что и введение сопоставимых доз Нейпогена (филграстима), число нейтрофилов, напротив, продолжало увеличиваться в группах, получающих NEUG, причем выход на максимум кинетики и величины был дозозависимым. Дозы NEUG 0,25, 1,25 и 5,0 мг/кг приводили к максимальному содержанию нейтрофилов в 5,4, 10 и 24 раз выше, чем у животных, получающих лечение средой. Более низкие две дозы вызывали максимальное повышение содержания нейтрофилов на 2 день,тогда как самая высокая тестируемая доза приводила к максимальному содержанию на 4 день. Число нейтрофилов возвращалось к нормальному уровню на 3, 4 и 5 день для при введении доз NEUG 0,25,1,25 и 5,0 мг/кг, соответственно (фиг. 10). Как показано на фиг. 10, увеличение содержания нейтрофилов в периферической крови, вызванное введением NEUG, было более выраженным и более длительным,чем вызванное введением Нейпогена (филграстима). Влияние лечения NEUG и Нейпогеном (филграстимом) на содержание периферических гематопоэтических (c-kit+) стволовых клеток в настоящем исследовании были аналогичны результатам, полученным для нейтрофилов периферической крови (фиг. 11). Эффект NEUG был дозозависимым и близким к эффекту сопоставимых доз Нейпогена (филграстима) на 1 день, но продолжал усиливаться на 2-4 день во всех лечебных группах, возвращаясь к задаваемой контролем, получавшим среду, базовой линии к 5 дню. Как показано на фиг. 11, вызванное NEUG увеличение содержания клеток c-kit+ было более выраженным и продолжительным, чем вызванное введением Нейпогена (филграстима). Пример 3. Сравнение NEUG и Нейласты (пэгфилграстима) у мышей BDF-1 Целью настоящего исследования являлось сравнение эффекта однократных подкожных (SC) инъекций NEUG и Нейласты (пэгфилграстима) на нейтрофилы и гематопоэтические клеткипредшественники в периферической крови у мышей BDF-1. Оценку проводили путем инъецирования мышам BDF-1 (n=5) однократных доз NEUG 5 или 10 мг/кг. Эффект NEUG сравнивали с эффектом эквимолярных доз пэгфилграстима (Нейласты) (1,12 и 2,24 мг/кг) при однократном введении. Две указанные дозы Нейласты (пэгфилграстима) и NEUG являются приблизительно эквимолярными. Результаты показаны на фиг. 12. Однократное введение NEUG (5 и 10 мг/кг) или Нейласты (1,12 и 2,24 мг/кг) приводило к эффективному увеличению количества гранулоцитов и гематопоэтических клетокпредшественников в периферической крови у мышей BDF-1. В указанном эксперименте максимальная мобилизация периферических гранулоцитов происходила на 3 день (в случае использования NEUG в дозе 5 мг/кг) и на 4 день (в случае использования NEUG в дозе 10 мг/кг). Содержание гранулоцитов возвращалось к нормальному уровню на 6 день после проведения лечения NEUG. У мышей, которым вводили однократную дозу Нейласты (пэгфилграстима), максимальная мобилизация гранулоцитов происходила на 4 день. У мышей, получающих Нейласту (пэгфилграстим) в дозе 2,25 мг/кг, на 6 день после введения лекарственного средства значение ANC было все еще значительно (р=0,036) выше, чем исходное, а абсолютное число нейтрофилов (ANC) y мышей, получающих дозу 1,12 мг/кг, возвращалось к норме на 6 день (фиг. 12 А). Для оценки относительной активности у мышей рассчитывали площади под фармакодинамическими (PD) кривыми (AUCANC) В зависимости от молярной эквивалентной дозы (нмоль/кг) (фиг. 12 В). Линии ответа на дозу были параллельны, что указывает на то, что AUCANC является приемлемым объектом сравнения в указанной модели. AUCANC, по-видимому, являлись дозозависимыми для обоих аналогов G-CSF. В указанном эксперименте относительная активность нейласты по отношению к NEUG на основе массы составляла 7,7. То есть, 1 мг Нейласты (пэгфилграстима) (при дозировании в клинике на основе массыrhG-CSF) эквивалентен по эффекту 7,7 мг NEUG, что в -1,5 раз превышает разницу по молекулярной массе между NEUG и Нейластой (пэгфилграстимом), составляющую 4,5 раз. Однократное введение NEUG или Нейласты (пэгфилграстима) приводило к значительному(р 0,05) увеличению общего число гематопоэтических предшественников в периферической крови (фиг. 15). Максимальная мобилизация гематопоэтических клеток-предшественников происходила на 4 день в группах, получающих лечение как NEUG, так и Нейластой (пэгфилграстимом). NEUG в дозе 10 мг/кг и нейласта в дозе 1,12 и 2,24 мг/кг вызывали одинаковое увеличение содержания c-kit+ клеток (р 0,0001). Доза NEUG 5 мг/кг приводила к статистически значимому (р 0,0001) увеличению содержания c-kit+ клеток по сравнению с контролем HSA, однако это увеличение было примерно на 50% меньше, чем увеличение, наблюдаемое в обеих группах, получающих Нейласту (пэгфилграстим) и оказалось субмаксимальным, так как большая в 2 раза доза приводила к увеличению значения максимального содержания ckit+ клеток (фиг. 15). Пример 4. Сравнение NEUG и Нейласты (пэгфилграстима) у мышей BDF-1 с вызванной 5-FU нейтропенией Продукты G-CSF используются в клинике для ускорения восстановления нейтрофилов после миелосупрессивной химиотерапии. Целью настоящего исследования было сравнение эффекта однократной подкожной (SC) инъекции NEUG и Нейласты (пэгфилграстима) на восстановление нейтрофилов в модели, где нейтропения была вызвана сублетальной дозой 5-FU (150 мг/кг). Мышам BDF1 давали однократную дозу NEUG 5 или 10 мг/кг. Эффект NEUG сравнивали с эффектом однократного введения Нейласты (1,12 мг/кг - доза, эквимолярная дозе 5 мг/кг NEUG). Оба агента вводили через 1 день после введения однократной дозы 5-FU. Количество нейтрофилов периферической крови определяли ежедневно с 6 дня по 19 день. В указанный период времени у мышей, получающих 5-FU, наблюдалось снижение числа нейтрофилов до минимума с последующей фазой медленного восстановления. Эксперимент был предназначен для определения влияния NEUG на время и степень восстановления нейтрофилов. У мышей,инъецированных контролем плацебо или HSA через 1 день после введения 5-FU, нейтропения достигала минимума к 6 дню (фиг. 16). Уровень нейтрофилов начинал восстанавливаться к 10 дню. Напротив, восстановление после нейтропении ускорялось, когда мышам проводили лечение либо NEUG, либо нейластой на 1 день после введения 5-FU. Лечение любым агентом при всех уровнях дозы приводило к статистически значимому увеличению содержания нейтрофилов по сравнению с контролем плацебо. На 9 день эффект NEUG, вводимого в дозе 5 мг/кг, был ниже (р = 0,0048), чем эффект, обеспечиваемый эквимолярной дозой нейласты (1,12 мг/кг). Однако к 10 дню оба агента вызывали одинаковое увеличение общего содержания периферических нейтрофилов. Взятые вместе данные исследований на мышах указывают на то, что однократное введение NEUG нормальным мышам приводило к эффективному, дозозависимому, быстрому и длительному увеличению содержания нейтрофилов (Gr,1+ клеток) и гематопоэтических клеток-предшественников (c-kit+) в периферической крови. Ответ на NEUG был близок ответу, вызванному Нейластой (пэгфилграстимом), однако в указанном исследовании максимальный ответ на NEUG был немного отсрочен по сравнению с Нейластой (пэгфилграстимом). Однократное введение Нейпогена (филграстима) приводило только к временному увеличению содержания нейтрофилов и гематопоэтических клеток-предшественников в периферической крови. С использованием клинически адекватной модели цитопении у мышей, в которой путем инъекции вводили внутрибрюшинно (IP) сублетальную дозу 5-FU, вызывающую миелосупрессию и периферическую нейтропению, однократное введение NEUG или Нейластыа (пэгфилграстима) эффективно усиливало восстановление содержания нейтрофилов. Пример 5. Тестирование NEUG на яванских макаках Для определения эффектов многократного введения NEUG были выбраны яванские макаки. Были проведены два исследования на обезьянах с серийной оценкой гематологических показателей после многократного введения NEUG: 2-недельное фармакологическое исследование для сравнения доз NEUG и Нейпогена (филграстима) при подкожном введении и более долгое (5 месяцев) исследование иммуногенности для сравнения эффекта NEUG при его подкожном и внутривенном введении с эффектом Нейласты (филграстимом) при подкожном введении. Оба исследования показали, что NEUG вызывает длительное повышение содержания нейтрофилов в периферической крови у обезьян с активностью и фармакодинамическим профилем, аналогичным Нейласте (пэгфилграстиму). Пример 6. 2-недельное фармакологическое исследование NEUG y обезьян Для оценки фармакодинамики NEUG y обезьян было проведено 2-недельное исследование повторного введения доз с гематологическими показателями в качестве конечной точки оценки эффективности. Двадцать ранее не подвергавшихся экспериментальным исследованиям самцов и самок яванских макак случайным образом распределяли в 5 лечебных групп по 2 самца и 2 самки в каждой группе. Обезьянам подкожно ("SC") инъецировали среду (плацебо) в область между лопатками, NEUG или Нейпоген(филграстим). В течение 14-дневной фазы экспериментального лечения плацебо вводили каждые 4 дняNEUG хорошо переносился яванскими макаками в дозе 25 мкг/кг или 100 мкг/кг при введении дозы каждые 4 дня и не вызывал нежелательных явлений. Гематологические изменения главным образом заключались в вызванном NEUG повышении содержания нейтрофилов периферической крови с менее значительным повышением содержания моноцитов периферической крови. Повышение содержания ней- 22023344 трофилов было максимальным через 24 ч после SC введения дозы 100 мкг/кг (фиг. 17). Введение NEUG в дозе 25 мкг/кг каждые 4 дня, или 5 мкг/кг Нейпогена (филграстима) ежедневно приводило к умеренному увеличению содержания нейтрофилов, которое было значительным по сравнению с плацебо в течение второй недели введения. Все гематологические изменения, связанные с введением NEUG, полностью восстанавливались в течение 2-недельного восстановительного периода в отсутствие лечения. Другие наблюдения Было установлено, что количество моноцитов в периферической крови увеличивается в ответ на GCSF, но в меньшей степени, чем количество нейтрофилов. В настоящем исследовании только NEUG в дозе 100 мкг/кг, вводимый каждые 4 дня, вызывал увеличение абсолютного числа моноцитов. На абсолютное число лимфоцитов периферической крови не влияло ни лечение NEUG, ни лечение Нейпогеном (филграстимом). Пример 7. Сравнение NEUG при IV и SC введении и Нейласты (пэгфилграстима) при SC введении у обезьян Исследование введения многократных доз NEUG яванским макакам, не соответствующее требованиям надлежащей лабораторной практики, было проведено с основной целью оценки иммуногенности(Covance Study No. 6962-129). В качестве конечной точки исследований брали гематологические параметры. Указанное исследование также обеспечивает полезную фармакологическую информацию по сравнению эквимолярных доз NEUG и Нейласты (пэгфилграстима). Как NEUG, так и Нейласту вводили раз в неделю в течение 3 недель. На фиг. 18 показано ANC после каждого из первых 3 введений дозыNEUG или Нейласты (пэгфилграстима). В данном исследовании Нейгранин, вводимый SC и IV, и Нейласта (пэгфилграстим), вводимая SC в эквимолярной дозе, приводили к значительному (0,0001 по сравнению с плацебо) повышению содержания нейтрофилов в периферической крови. Как величина, так и кинетика нейтрофильного ответа были почти идентичными среди этих трех групп. Пример 8. Фармакокинетика Фармакокинетические свойства NEUG оценивали у нормальных мышей BDF-1 после однократнойIV или SC инъекции у получающих лечение 5-FU мышей BDF-1, страдающих нейтропенией, после SC инъекции, у крыс с нефроктомией после IV инъекции и у яванских макак после однократных и множественных IV и SC инъекций. Кроме того проводили сравнение между фармакокинетическими свойствамиrhG-CSF (Нейпогеном) и пегилированным rhG-CSF (Нейластой). Сводные данные указанных исследований приведены ниже. Во всех исследованиях концентрацию NEUG в плазме измеряли с помощью ИФА в "сэндвич"модификации с иммобилизованным G-CSF и выявлением HSA. Такая схема анализа позволяет проводить количественную оценку интактного NEUG без вмешательства или перекрестной реактивности с эндогенным G-CSF и альбумином. Фармакокинетические исследования объединили в форме таблиц на фиг. 19. В описанных исследованиях NEUG имел более медленный клиренс и более долгий конечный период полувыведения и среднее время удержания (MRT), чем Нейпоген (филграстим) при IV или SC введении мышам BDF-1. Клиренс NEUG приблизительно в 8 раз медленнее, чем клиренс Нейпогена (филграстима), и MRT (11,2-20,7 ч) приблизительно в 4 раза дольше. Клиренс как NEUG, так и Нейласты(пэгфилграстима) был медленнее у мышей, которые страдали вызванной 5-FU цитопенией, чем у нормальных мышей, что наиболее вероятно связано с меньшим количеством нейтрофилов (после лечения 5FU), которые играют роль в клиренсе G-CSF. У яванских макак MRT NEUG составляет 17,9-27,2 часов. Кроме того Cmax после введения последней из 5-недельных SC доз снижается по сравнению с Cmax после первой дозы. Биодоступность при SC ведении NEUG y яванских макак составляет приблизительно 22%. У яванских макак конечный период полувыведения NEUG (12,6 ч) приблизительно на 33% длиннее, чем Нейласты (пэгфилграстима) (9,49 ч) после SC инъекции. Почечный клиренс не играет значительной роли в выведении NEUG (определено на крысах). Пример 9. Обзор доклинических исследований токсичностиNEUG хорошо переносился мышами и обезьянами. У обезьян, которым вводили NEUG подкожно при концентрации 100, 500, или 1000 мкг/кг/доза раз в неделю в течение 4 недель, не наблюдалось неблагоприятных явлений. Наблюдали фармакодинамические ответы на лечение NEUG после введения множественных SC или IV доз яванским макакам, которые соответствовали ранее показанным эффектами GCSF. NEUG стабильно приводил к развитию выраженного и дозозависимого лейкоцитоза и нейтрофилии с менее выраженным увеличением содержания моноцитов, эозинофилов и базофилов, и не всегда приводил к увеличению числа лимфоцитов. Ни в исследованиях в соответствии с GLP, ни в не-GLP исследованиях не была выявлена максимальная доза препарата, не приводящая к развитию наблюдаемых эффектов(NOEL), для NEUG y обезьян , и, соответственно считается, что она ниже дозы 25 мкг/кг/ для подкожного введения. У обезьян, получающих лечение SC NEUG, не наблюдали нежелательных явлений, следовательно максимальная доза, при которой не наблюдаются нежелательные явления (NOAEL), для подкожного введения NEUG y обезьян больше чем 1000 мкг/кг/доза. Дополнительные наблюдения, соответствующие фармакологическим свойствам NEUG, включали: увеличенную массу селезенки, микроскопические данные, свидетельствующие о миелоидной гиперплазии и лейкоцитозе. Данные доклинических исследований безопасности собраны в таблицах на фиг. 20. Пример 10. ИммуногенностьNEUG может (теоретически) вызывать иммунный ответ у пациентов, у которых развивается нейтрализующий ответ на G-CSF. Также возможно образование антител к HSA, при этом их клиническая значимость не является достоверной, учитывая крайне высокую концентрацию HSA в крови (40 мг/мл). Для оценки иммуногенности у людей использовали ряд высоко чувствительных анализов, обеспечивающих детектирование антител ко всем компонентам NEUG. Для определения безопасности и токсикологических свойств NEUG оценивали иммуногенностьNEUG в различных исследованиях. Указанные исследования демонстрируют, что G-CSF человека (Нейласта, пэгфилграстим), альбумин человека и NEUG являются иммуногенными у обезьян. В исследовании иммуногенности, которое включало группу, получающую лечение Нейластой (пэгфилграстимом),большинство животных, которые получали лечение дозами NEUG при его IV или SC введении раз в неделю, продуцировали антитела к Нейласте (пэгфилграстиму). Антитела к NEUG (или Нейласте, пэгфилграстиму) впервые наблюдали на 22 день или после 22 дня (после 3-ей недельной дозы). Во многих случаях эти антитела имели нейтрализующий эффект в анализе in vitro, хотя присутствие нейтрализующих антител не вызывало нейтропению и не препятствовало проявлению фармакологических эффектовNEUG или Нейласты (пэгфилграстима) у обезьян. Более того, после 2-недельного и 2-месячного периода без введения дозы ANC во всех группах были в пределах нормального диапазона, и не наблюдалось значительной разницы в кривых ANC, независимо от состояния антител. Альбумин человека, как и большинство человеческих белков, является иммуногенным для животных. Опыт с другими гибридными белками альбумина продемонстрировал, что иммуногенность у обезьян не позволяет предсказать возникновение (или последствия) иммуногенности у людей. Например, Альбуферон (гибридный белок,образованный из сывороточного альбумина человека и интерферона альфа) был высоко иммуногенным у обезьян (10/12 обезьян были положительны на антитела после однократной инъекции), иммунный ответ являлся нейтрализующим и значительно влиял на воздействие. В противоположность этому, по результатам недавнего исследования Альбуферона во 2 фазе, с участием 458 пациентов, частота возникновения антител была очень низкой и при этом была значительно ниже в группах, получающих лечение Альбуфероном (3%) по сравнению с группой, получающей лечение пэгилированным интерфероном (18%) в течение первых 12 недель лечения. Более того, появление антител не вызывало очевидных осложнений. Антитела к NEUG не выявляли у пациентов, представляющих собой людей, получающих до 3 дозNEUG (см., например, раздел I фаза, 5.с и II фаза, 5.е, ниже). В отношении оценки риска NEUG имеющиеся данные, полученные на людях и животных, дают основания полагать, что образование нейтрализующих антител к G-CSF не позволяет предсказать ответ на фармакологические дозы G-CSF и не предсказывают нормальный ответ на стимуляцию инфекционным агентом. На моделях возникновения нейтрализующих антител к G-CSF с использованием мышей было показано, что нейтрофилия может развиваться в ответ на стимуляцию инфекционным агентом, что указывает на избыточность в гранулопоэтической системе. Кроме того, описаны случаи возникновения аутоантител к G-CSF y людей с синдромом Фелти и системной красной волчанкой. У таких пациентов развивается нейтропения; однако лечение GCSF или GM-CSF остается эффективным у большинства пациентов. Суммарные данные исследований in vitro и in vivo и фармакокинетические характеристики NEUG указывают на возможность применения NEUG в виде однократной дозы для профилактики развития фебрильной нейтропении у пациентов, получающих миелосупрессивную противораковую терапию. Способность NEUG приводить к повышенному содержанию гематопоэтических клеток-предшественников в периферической крови после введения однократной дозы может также иметь благоприятный эффект у пациентов или доноров для аутологической и аллогенной трансплантации гематопоэтических стволовых клеток. В. Исследования NEUG на человеке Следующие примеры разделены на две секции - "I Фаза" и "II Фаза". Каждая фаза включает две части, часть А и часть В. Примеры из I фазы и II фазы приведены в табл. 2, ниже. Каждая фаза разделена на пять частей: 1) цели, 2) характеристики пациентов, 3) исследуемый агент,4) характеристики исследования и 5) результаты частей А и В. Пример 11.1 Фаза 1. Цель Исследование IA/B, ПА/В Фазы проводили для оценки безопасности, переносимости, иммуногенности, фармакокинетики и фармакодинамики вводимого подкожно Нейгранина ("NEUG") (рекомбинантный альбумин человека-гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека) у пациентов, получающих миелосупрессивную химиотерапию (доксорубицин/доцетаксел). Для I Фазы основные цели исследования заключались в оценке характеристик безопасности NEUG,вводимого подкожно в диапазоне потенциальных терапевтических доз, по сравнению с пэгфилграстимом путем измерения частоты, тяжести и длительности возникших после начала лечения нежелательных явлений и соотнесения их со временем и дозой введения NEUG. Вторичные цели исследования заключались в оценке фармакокинетики и иммуногенности NEUG, и сравнении влияния введения NEUG на частоту возникновения, тяжесть и продолжительность нейтропении с пэгфилграстимом у пациентов, получающих доксорубицин/доцетаксел.I Фазу осуществляли в виде двух частей, части А и части В, как указано в табл. 2 выше. 2. Характеристики пациентов Для I Фазы пациентов отбирали на основе следующих характеристик или параметров: Включение: 1. Пациенты с гистологически подтвержденным раком молочной железы, для которых предусмотрено получение доксорубицина и доцетаксела. 2. Возраст: 18 лет или старше. 3. Удовлетворительная гематологическая функция. 4. ANC1500/мм 3 5. Тромбоциты 100,000/мм 6. Удовлетворительная функция печени и почек: 7. Креатинин сыворотки 2,0 верхней границы нормы 8. Общий билирубин в пределах нормы (WNL) для местной лаборатории 9. Трансаминазы сыворотки (SGOT/SGPT)1,5 верхней границы нормы 10. Щелочная фосфатаза 2,5 верхней границы нормы 11. Общее состояние ECOG 0 или 1. 12. Могут получать доксорубицин, если фракция выброса левого желудочка (ФВЛЖ) в пределах нормы. 13. Способны понимать требования исследования, предоставлять информированное согласие в письменной форме (включая согласие на использование и раскрытие относящейся к исследованию информации о состоянии здоровья) и соблюдать процедуры согласно протоколу исследования. Исключение: 1. Более 1 предшествующего курса химиотерапии (включая адъювантную терапию, если получали в течение последних 12 месяцев); любая химиотерапия/иммунотерапия в течение 4 недель до вступления в исследование; кумулятивная доза антрациклина, которая могла бы препятствовать проведению 2 полнодозовых циклов доксорубицина в данном исследовании. 2. Предшествующее использование любой нитрозомочевины (BCNU, CCNU) или митомицина-С в течение 6 недель химиотерапии исследования. 3. Сердечные заболевания, признаки или симптомы в анамнезе, которые, по мнению Исследователя,исключают использование режима химиотерапии на основе антрациклинов. 4. Предшествующее хирургическое лечение или радиотерапия в течение 2 недель химиотерапии исследования. 5. Предшествующее широкопольное облучение таза или более 20% областей костного мозга или поражение костного мозга. 6. Предшествующая высокодозовая химиотерапия с трансплантатом гематопоэтических стволовых клеток. 7. Предшествующее использование миелоидных (G-CSF или GM-CSF) факторов роста в течение 4 недель химиотерапии исследования. 8. Предшествующее использование эритропоэтина в течение 4 недель химиотерапии исследования. 9. Миелоидная злокачественная опухоль или миелодисплазия в анамнезе. 10. Известные метастазы в головном мозге без подходящего лечения (хирургическое лечение или радиотерапия), отсутствие данных о прогрессировании с минимум 3-недельным наблюдением и неврологической стабильности без противосудорожных средств и стероидов. 11. Известная серповидно-клеточная анемия. 12. Диагноз респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ). 13. Текущая инфекция, требующая внутривенного или перорального введения антибиотиков. 14. Установленная аллергия на получаемые из дрожжей продукты в анамнезе. 15. Установленная гиперчувствительность к получаемым из Е coli белкам, пэгфилграстиму, филграстиму или любому другому компоненту пэгфилграстима (только 2 фаза). 16. Беременная женщина или кормящая мать (в течение исследования все женщины должны применять метод контрацепции, обладающий более 90% надежности, или быть бесплодными, или находиться в периоде постменопаузы). 17. Установленная ВИЧ-положительный статус или активный гепатит (пациентов с неизвестным статусом не будут тестировать). 18. Мужчины, которые не согласны применять эффективную контрацепцию на протяжении всего исследования и в течение периода, составляющего 30 дней, после последней дозы исследуемого агента. Субъектов исключали из дальнейшего лечения по следующим причинам: 1. Прогрессирование заболевания 2. Неприемлемые токсические явления несмотря на оптимальное лечение 3. Интеркуррентное заболевание по усмотрению Исследователя. 4. Режим доксорубицина - достижение максимально допустимой для жизни кумулятивной дозы (см. критерии отбора) 5. Отзыв согласия 6. Невыполнение/недоступность для наблюдения по завершении исследования 7. Беременность Если лечение NEUG прекращали, субъекты оставались в исследовании и их наблюдали в течение по меньшей мере 30 дней после последней дозы исследуемого лекарственного для запланированной оценки безопасности и ФК. 3. Исследуемый агентNEUG (рекомбинантный альбумин человека-гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека, rHSA-G-CSF) представляет собой гибридный белок с молекулярной массой приблизительно 85 кДа, соединенный в одну цепь, содержащую остатки 1-585, соответствующие зрелой форме HSA, и остатки 586-759, соответствующие зрелой форме G-CSF человека. Терапевтический фрагмент NEUG представляет собой получаемый из рекомбинантной ДНК человека G-CSF.NEUG поставляли в виде стерильного, лиофилизированного состава в одноразовых флаконах из стекла 1 типа и хранили при 2-8 С. После восстановления 1,1 мл стерильной воды для инъекций каждый флакон содержал 15 мг/мл (доставляемые 15 мг/флакон) NEUG в 10 мМ фосфате натрия, 200 мМ маннита, 60 мМ дегидрата трегалозы, 0,01% (мас./об.) полисорбата 80, рН 7,2. Состав лекарственного продукта NEUG, применяемого в I Фазе, представлен на фиг. 13. Коммерчески доступную Нейласту (пэгфилграстим) поставляли в 0,6 мл предварительно заполненных шприцах для подкожной инъекции. Каждый шприц содержит 6 мг пэгфилграстима (по массе белка) в стерильном, прозрачном, бесцветном, не содержащем консервантов растворе (рН 4,0), содержащем ацетат (0,35 мг), сорбит (30,0 мг), полисорбат 20 (0,02 мг), натрий (0,102 мг) в воде для инъекций.NEUG (50, 150, 300 или 450 мкг) или Нейласту (пэгфилграстим) (6 мг) вводили путем подкожного введения. 4. Характеристики исследования А) Схема и продолжительность исследования Данное исследование представляло собой первое, многоцентровое, открытое неконтролируемое ис- 26023344 следование на людях с последовательным увеличением дозы, проводимое в режиме контролируемого рандомизированного исследования с участием 62 субъектов, страдающих раком молочной железы, для которых предусмотрено получение доксорубицина и доцетаксела. Указанное исследование состояло из 2 частей. Часть А представляла собой последовательное увеличение дозы у 13 субъектов, 4 группы доз (50,150, 300 или 450 мкг/кг) с 3 субъектами в каждой из групп 50, 150 и 450 мкг/кг и 4 субъектами в группе 300 мкг/кг для оценки безопасности перед рандомизированной частью В исследования. В Части А субъекты получали первую дозу NEUG по меньшей мере за 2 недели до начала химиотерапии (0 Цикл) для первоначальной оценки безопасности и влияния на абсолютное число нейтрофилов("ANC") в отсутствие цитотоксической химиотерапии. После как минимум 2 недель наблюдения субъекты получали NEUG в той же дозе после химиотерапии в циклах 1 и 2, если в 0 Цикле не было дозолимитирующих нежелательных явлений, считающихся связанными с NEUG, и субъект продолжал соответствовать всем критериям отбора. В части А дозолимитирующую токсичность (DLT) определяли как клинически значимое нежелательное явление (явления) 2 степени или выше, признанные, возможно, вероятно или определенно, связанными с исследуемым агентом, за исключением боли в костях 2 степени. В рамках каждой группы части А, исходное введение исследуемого лекарственного средства каждому субъекту, входящему в исследование, отделяли как минимум 24 ч для мониторинга острых нежелательных явлений. Решение об увеличении дозы до следующего уровня основывали на анализе данных по безопасности в течение по меньшей мере 7 дней после первого введения дозы NEUG для всех субъектов в данной группе. Если ни один из 3 субъектов не испытывал дозоограничивающую токсичность, дозу продолжали увеличивать с включением 3 субъектов на следующий уровень дозы. Если 1 из 3 субъектов в данной группе проявлял признаки дозоограничивающей токсичности, набирали других 3 субъектов на данных уровень дозы с получением всего 6 субъектов в группе. Увеличение дозы продолжало происходить, если только 1 из 6 субъектов испытывал дозоограничивающую токсичность. Если у 2 из 6 субъектов развивалась дозоограничивающая токсичность, прекращали увеличивать дозу и не вводили дополнительные лечебные средства NEUG. Остальные субъекты завершали предусмотренные оценки безопасности, фармакокинетические и фармакодинамические оценки. После демонстрации безопасности в исходных группах части А проводили часть В. В части В субъектов случайным образом распределяли параллельным образом в 1 из 3 групп лечения: NEUG 300 мкг/кг(n = 20), NEUG 450 мкг/кг (n = 21) или пэгфилграстим (n = 10) в разрешенной дозе, составляющей 6 мг,вводимой приблизительно через 24 ч после химиотерапии исследования. В табл. 3 и 4 ниже суммировано распределение субъектов в I Фазе, части А и В. На фиг. 6 показаны циклы химиотерапии для исследования I Фазы, части А и В.b) Сопутствующее лечение в ходе I Фазы, части А и В Химиотерапия Режим химиотерапии для данного исследования состоял из доксорубицина 50 мг/м 2 и доцетаксела 75 мг/м 2, вводимых последовательно путем внутривенной инфузии в 1 день лечения в течения до двух 21-дневных циклов. Перед получением каждого цикла терапии субъекты должны были демонстрировать абсолютное содержание нейтрофилов (ANC)1,5109/л и тромбоцитов 100109 /л 3. Лечение могло быть отсрочено до двух недель для восстановления гематологических показателей. Установлено, что комбинация доксорубицина и доцетаксела обладает значительной клинической активностью у пациентов, страдающих раком молочной железы. Однако указанная комбинация является крайне миелосупрессивной с более высокой частотой нейтропении 3 и 4 степени, по сравнению с другими стандартными режимами. Даже при добавлении CSF комбинация доксорубицина и доцетаксела индуцировала нейтропению 4 степени у 79% пациентов и частоту фебрильной нейтропении, составляющую 9-18%. Данный режим доксорубицин/доцетаксел был использован в исследованиях новых агентов для предотвращения нейтропении и ее осложнений. Следовательно, комбинация доксорубицина и доцетаксела представляет собой подходящий режим химиотерапии для исследования действия нового агента,такого как NEUG. Доксорубицин Фармакологические данные Доксорубицина гидрохлорид - это антибиотик антрациклинового ряда, получаемый из streptomycespeucetius var caesius, ингибирующий ДНК и ДНК-зависимый синтез РНК, а также синтез белков. Доксорубицин активен во всех фазах клеточного Цикла, но обладает максимальной цитотоксичностью в Sфазе. Выведение указанного лекарственного средства осуществляется преимущественно печенью; почечный клиренс незначителен. Фармацевтические данные Указанное лекарственное средство продается на коммерческой основе в 10, 20 50, 100 или 200 мг флаконах. Лиофилизированные препараты могут быть восстановлены стерильной водой для инъекций,5% раствором декстрозы или 0,9% физиологическим раствором для инъекций. Побочные эффекты и токсичность Миелосупрессия, в первую очередь лейкопения, со снижением числа клеток до минимума в течение 10-14 дней, и кардиотоксичность, включая редкий синдром острого перикардита-миокардита и отсроченную связанную с кумулятивной дозой кардиомиопатию, составляют дозолимитирующую токсичность доксорубицина. Отмечаемая алопеция и умеренная тошнота/рвота представляют собой ожидаемые токсические явления. Сообщали о реакциях экстравазации, приводящих к местному повреждению кожи и тканей в месте случайной экстравазации, стоматите, гиперпигментации кожи (особенно ногтевых лунок) и местной воспалительной реакции в местах предшествующего облучения. Доцетаксел Фармакологические данные Доцетаксел представляет собой полусинтетический таксоид, который связывается со свободным тубулином и способствует сборке стабильных микротрубочек, препятствуя митозу и репликации клеток(клеточный цикл, специфичный по М-фазе). Доцетаксел активно связывается с белком, интенсивно метаболизируется в печени с экскрецией с фекалиями приблизительно 75% дозы в течение 7 дней. Фармацевтические данные Доцетаксел (Таксотер, Sanofi Aventis) представлен в 80 мг/2 мл или 20 мг/0,5 мл флаконах с однократной дозой с прилагающимся флаконом разбавителя (13% этанол в воде для инъекций). Каждый мл Таксотера содержит 40 мг доцетаксела (безводного) и 1080 мг полисорбата 80. Побочные эффекты и токсичность Доцетаксел не следует назначать пациентам, у которых в анамнезе присутствуют тяжелые реакции гиперчувствительности к доцетакселу или другим лекарственным средствам, изготовленным с полисорбатом 80, таким как этопозид и витамин Е. Пациентам, испытывающим тяжелые реакции гиперчувствительности, не следует повторно назначать препарат. Пациентам, получающим доцетаксел, должны быть введены кортикостероиды в качестве премедикации, как указано ниже. Печеночная недостаточность от легкой до умеренной приводит к замедленному метаболизму с 27 и 38% увеличением системного воздействия (AUC). Доцетаксел не следует назначать пациентам с SGOT и/или SGPTв 1,5 раза больше нормы и щелочной фосфатазойв 2,5 раза больше нормы. Задержка жидкости происходила у 17% (умеренная) и 6% (тяжелая задержка) пациентов в исследованиях III Фазы,несмотря на премедикацию кортикостероидами. Наблюдали тяжелые нейросенсорные симптомы (парестезия, дисестезия, боль). Ожидаемые побочные эффекты включают миелосупрессию, в первую очередь лейкопению с самым низким уровнем приблизительно на 9 день и восстановлением к 15-21 дню. Сообщали об алопеции, изменениях ногтей и кожи, стоматите, миалгии/артралгии, тошноте/рвоте и гипотензии. Химиотерапевтическая доза, введение и модификации доз В 1 день каждого цикла лечения вводили химиотерапевтическое средство (доксорубицин, а затем доцетаксел). Доксорубицин вводили в дозе, составляющей 50 мг/м , путем внутривенного болюсного введения через боковое ответвление инфузионной капельницы или через центральный венозный катетер для избежания экстравазального повреждения. Доцетаксел 75 мг/м разводили в 250 мл 0,9% физиологического раствора или 5% раствора декстрозы и вводили внутривенно в течение приблизительно 1 ч с помощью полиэтиленовой системы для инфузии. Основные показатели состояния организма определяли непосредственно перед и после окончания инфузии доцетаксела. Перед получением каждого цикла терапии субъекты должны были обладать абсолютным содержанием нейтрофилов (ANC)1500/мм 3 и тромбоцитов 100,000/мм 3. Лечение могло быть отсрочено до двух недель для восстановления гематологических показателей. 25% снижение химиотерапевтических доз предусматривали для негематологических токсических явлений 3-4 степени, инфекционных эпизодов двух степеней 3-4 или тромбоцитопении 4 степени. Субъектов, испытывающих тяжелые реакции гиперчувствительности или негематологические токсические явления, которые препятствуют дальнейшим циклам химиотерапии, исключали из лечения в программе исследования, но они выполняли наблюдение по окончании исследования. Премедикация для химиотерапии Кортикостероиды для перорального введения (при необходимости внутривенного введения) (например, дексаметазон 8 мг два раза в сутки) вводили в течение трех дней, начиная за 1 день перед введением доцетаксела для снижения частоты возникновения и тяжести задержки жидкости и реакций гиперчувствительности. Применение и выбор противорвотных средств или других средств премедикации (например, антагонисты Н 2) оставляли на усмотрение лечащего врача. Запрещенные лекарственные средства Субъекты не должны были получать ни одно из следующих лекарственных средств и/или процедур в ходе данного исследования и в дополнительное время, указанное ниже: 1. Другие исследуемые агенты в течение 30 дней начала исследования агента и во время проведения исследования. 2. Последующие циклы химиотерапии не следует начинать пока не пройдет 14 дней после введения доз NEUG. 3. Цитокины, другие гематопоэтические факторы роста и профилактические антибиотики во время проведения исследования, если не возникает пролонгированная или фебрильная нейтропения. Если субъектов лечили G-CSF в любое время между периодом отбора и 0 Днем они не должны были получатьNEUG и их исключали из исследования. Разрешенные лекарственные средства Субъектам разрешали продолжать прием базового лекарственного средства (средств). Суточная доза каждого лекарственного средства при возможности поддерживалась постоянной на протяжении всего исследования. Если по какой-либо причине, считающейся исследователем необходимой, субъекту требовалось дополнительное лекарственное средство (средства) или изменение дозы, лекарственное средство(средства), способ введения и показание, по которому его вводили, регистрировали на соответствующих страницах индивидуальной регистрационной карты. Антибиотики Все субъекты получали пероральные антибиотики например, ципрофлоксацин) после каждого курса химиотерапии в качестве профилактики для снижения вероятности инфекции. Если возникала фебрильная нейтропения или стабильная тяжелая нейтропения (ANC0,510 /л в течение 5 дней),субъекта признавали терапевтической неудачей, исключали из исследования, он полностью проходил наблюдение по завершении исследования и получал все стандартную поддерживающую терапию, включая поддерживающий фактора роста по усмотрению Исследователя. Субъектов, испытывающих тяжелые реакции гиперчувствительности или негематологические токсические явления, которые препятствовали дальнейшим циклам химиотерапии, также исключали из лечения в программе исследования, они проходили наблюдение по завершению исследования. с) Оценки безопасности Безопасность NEUG оценивали путем определения типа, частоты и тяжести нежелательных явлений ("НЯ"), изменений в клинических лабораторных тестах (гематология и клиническая биохимия), иммуногенности, путем медицинских осмотров и мониторинга основных показателей состояния организма с течением времени. Все НЯ и лабораторные токсические явления располагали по степеням на основе общих терминологических критериев для оценки нежелательных явлений Национального института рака(NCI-CTCAE Версия 3,0, 12 декабря 2003 г.). Нежелательные явления (включая серьезные нежелательные явления, "СНЯ") фиксировали с начала введения исследуемого лекарственного средства и до 30 дней после конечной дозы какого-либо исследуемого лекарственного средства. Лабораторные оценки получали, как указано в схеме оценок. В случае какой-либо токсичности нейтропении 4 степени, лабораторные показатели получали каждый день до достижения ANC500. Если отсрочивали следующий цикл лече- 29