Антитела против респираторного синцитиального вируса (pcb) и способы их применения
Номер патента: 23179
Опубликовано: 31.05.2016
Авторы: Паскуал Габриель, Киогх Элисса, Вадиа Джехангир, Виллиамсон Роберт Энтони
Формула / Реферат
1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие
CDR1 VH, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 2, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности SEQ ID NO: 2;
CDR2 VH, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 3, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и более идентичную указанной последовательности;
CDR3 VH, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 4, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и более идентичную указанной последовательности;
CDR1 VL, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 6, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и более идентичную указанной последовательности;
CDR2 VL, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 7, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и более идентичную указанной последовательности; и
CDR3 VL, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 8, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и более идентичную указанной последовательности,
где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связывают белок слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и/или нейтрализуют РСВ.
2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, включающие тяжелую цепь, приведенную в SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, приведенную в SEQ ID NO: 5.
3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, включающие домен VH, где аминокислотная последовательность домена VH представлена аминокислотами 1-125 в SEQ ID NO: 1.
4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, включающие тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи приведена в SEQ ID NO: 1.
5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, включающие домен VL, где аминокислотная последовательность домена VL представлена аминокислотами 1-107 b SEQ ID NO: 5.
6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, включающие легкую цепь с SEQ ID NO: 5.
7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, которые связаны напрямую или через линкер с доменом мультимеризации или связаны с полипептидным линкером.
8. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, дополнительно включающие домен трансмембранного переноса белка, содержащий любую из последовательностей из SEQ ID NO: 1529-1600.
9. Поливалентное антитело, включающее
первую антигенсвязывающую часть, включающую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с доменом мультимеризации; и
вторую антигенсвязывающую часть, включающую антигенсвязывающий фрагмент противовирусного антитела, конъюгированный со вторым доменом мультимеризации, где
первый домен мультимеризации и второй домен мультимеризации комплементарны друг другу или одинаковы, в результате чего первая антигенсвязывающая часть и вторая антигенсвязывающая часть формируют поливалентное антитело, а также
первая и вторая антигенсвязывающие части являются одинаковыми или разными.
10. Поливалентное антитело по п.9, где вторая антигенсвязывающая часть включает анти-РСВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
11. Поливалентное антитело по п.9, где вторая антигенсвязывающий часть иммуноспецифически связывает антиген вируса парагриппа (PIV) или человеческого метапневмовируса (hMPV).
12. Поливалентное антитело по любому из пп.9-11, где домен мультимеризации выбран из константной области иммуноглобулина (Fc), лейциновой молнии, комплементарных гидрофобных районов, комплементарных гидрофильных областей и совместимых доменов, обеспечивающих белок-белковые взаимодействия.
13. Комбинация, включающая
выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8 или поливалентное антитело по любому из пп.9-12, и
один или более противовирусных агентов и еще одно дополнительное противовирусное антитело, которое отличается от первого антитела.
14. Комбинация по п.13, где одно или более дополнительных противовирусных антител выбраны из антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые иммуноспецифически связывают антиген вируса парагриппа (PIV) или человеческого метапневмовируса (hMPV).
15. Способ обнаружения инфекции РСВ, включающий:
(a) оценку уровня антигена РСВ в образце жидкости, клеток или ткани с помощью антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8;
(b) сравнение измеренного уровня антигена РСВ с контрольным уровнем, где превышение измеренным уровнем антигена РСВ контрольного уровня антигена РСВ указывает на инфекцию РСВ.
16. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8.
17. Выделенная клетка, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по п.16.
18. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8, включающий культивирование клетки по п.17 в условиях, когда происходит экспрессия закодированного антитела или антигенсвязывающего фрагмента.
19. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 для лечения или профилактики вирусной инфекции.
20. Применение поливалентного антитела по любому из пп.9-12 для лечения или профилактики вирусной инфекции.
Текст
АНТИТЕЛА ПРОТИВ РЕСПИРАТОРНОГО СИНЦИТИАЛЬНОГО ВИРУСА (PCB) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В настоящем документе предусмотрены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают белок слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (РСВ). Также предусмотрены способы профилактики, лечения и диагностики вирусной инфекции и/или лечения симптомов РСВ-опосредованного заболевания. Также предусмотрены способы получения антител, которые иммуноспецифически связывают белок F РСВ. 023179 Близкие заявки Преимущество приоритета принадлежит предварительной заявке США 61/274395, озаглавленной"Антитела против респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и способы их применения", поданной 13 августа 2009 г. Указанная заявка родственна соответствующей заявке США 12/806498, озаглавленной "Антитела против респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и способы их применения", которая также претендует на приоритет предварительной заявки США 61/274395. Описание каждой из указанных выше заявок включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Область техники Предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с F-белком респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и/или РСВ и/или нейтрализуют РСВ. Кроме того, предусмотрены способы диагностики и терапии, в которых применяются анти-РСВ антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. Терапия включает введение предусмотренных антител против РСВ или их антигенсвязывающих фрагментов для профилактики или лечения инфекции РСВ и/или улучшения одного или нескольких симптомов инфекции РСВ, например инфекции у детей и инфекции, связанной с трансплантацией органов. Комбинации нескольких различных анти-РСВ антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему документу с другими анти-РСВ антителами и их антигенсвязывающими фрагментами могут быть использованы для комбинированной терапии. Также предусмотрены композиции, содержащие смесь анти-РСВ антител и их антигенсвязывающих фрагментов. Уровень техники Респираторный синцитиальный вирус (РСВ) представляет собой основную причину тяжелых респираторных заболеваний у новорожденных и детей раннего возраста, а также основную причину детского бронхиолита (Welliver (2003) J Pediatr 143:S112). По оценкам 64 млн случаев респираторных заболеваний и 160000 смертельных исходов в мире связаны с вызванными РСВ заболеваниями. Только в США десятки тысяч случаев госпитализации детей обусловлены инфекцией парамиксовирусом, таким как РСВ и вирус парагриппа (PIV) (Shay et al. (1999) JAMA 282:1440-1446). Тяжелая инфекция РСВ чаще всего встречается у детей и новорожденных, особенно у недоношенных детей. Такие состояния, как хронические заболевания легких или врожденный порок сердца, могут значительно увеличить тяжесть заболеваний. РСВ инфекция также может вызвать тяжелое заболевание у пожилых людей, лиц с хроническими легочными заболеваниями и взрослых с ослабленным иммунитетом, например, в результате пересадки костного мозга. Были исследованы различные подходы к профилактике и лечению инфекции РСВ, включая вакцины, противовирусные соединения (рибавирин), препараты антисмысловых РНК, РНК-интерференция,антитела, например иммуноглобулины или внутривенно вводимые моноклональные антитела. Внутривенный иммуноглобулин (PCB-IGIV; RespiGam), выделенный из доноров, и моноклональное антитело паливизумаб (SYNAGIS) были одобрены для профилактики РСВ у детей с высоким риском инфекции. Однако пока не существует доступной вакцины или коммерчески доступного препарата для лечения РСВ. Только рибавирин одобрен для лечения инфекции РСВ. Из-за низкой специфичности для эффективного лечения инфекции РСВ требуются высокие дозы, частое введение и/или большие объемы антител, таких как PCB-IG и паливизумаб. Кроме того, использование таких продуктов, как внутривенный иммуноглобулин, зависит от наличия донора. Соответственно, существует потребность в дополнительных агентах для профилактики и лечения инфекции РСВ. Краткое описание изобретения В настоящем документе предусмотрены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты для профилактики и лечения вызванной респираторным синцитиальным вирусом(РСВ) инфекции и РСВ-опосредованных заболеваний или состояний. Кроме того, предусмотрены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты для диагностики и/или мониторинга инфекции РСВ. В настоящем документе предусмотрены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают и нейтрализуют РСВ. В некоторых примерах полипептиды по настоящему документу иммуноспецифически связывают и нейтрализуют РСВ, если указанные предусмотренные в настоящем документе полипептиды являются частью антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Кроме того, предусмотрены антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие предусмотренный в настоящем документе полипептид, где антитело или антигенсвязывающие фрагменты иммуноспецифически связывают и нейтрализуют РСВ. Полипептиды, антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу могут специфически связывать F-белок, а также нейтрализовать РСВ. В настоящем документе предусмотрены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые могут нейтрализовать РСВ подтипов А и В. В настоящем документе предусмотрены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают F-белок РСВ. В некоторых приме-1 023179 рах предусмотрены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, включающие последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1-16 и 1627-1628, где выделенные полипептиды иммуноспецифически связывают белок слияния (F) РСВ. В некоторых примерах выделенные полипептиды включают полипептид, обладающий 60, 65, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с последовательностью аминокислот, приведенной в любой из SEQ ID NO: 1-16, где выделенные полипептиды иммуноспецифически связывают белок слияния (F) РСВ. В настоящем документе предусмотрены выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают белок слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и/или нейтрализуют РСВ и содержат VH CDR1 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2 или 1627, VH CDR2 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 3; VH CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 4, VL CDR1 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 6, VL CDR2 с последовательностью аминокислот,приведенной в SEQ ID NO: 7, и VL CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ IDNO: 8. В других примерах выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат VHCDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 с 60, 65, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,98, 99% или большей идентичностью последовательности с последовательностями аминокислот, приведенными в любой из SEQ ID NO: 2-4, 6-8 и 1627. В настоящем документе предусмотрены выделенные антитела против РСВ или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают тот же эпитоп белка F РСВ или вируса РСВ, где антитело или антигенсвязывающие фрагменты содержатNO: 6, VL CDR2 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 7, и VL CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 8, или выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты включают VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 с 60,65, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с последовательностями аминокислот, приведенными в SEQ ID NO: 2-4, 6-8 и 1627. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу включают тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат домен VH с последовательностью аминокислот, приведенной как аминокислоты 1-125 вSEQ ID NO: 1. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат легкую цепь с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ IDNO: 5. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VL домен с последовательностью аминокислот, приведенной как аминокислоты 1-10 в SEQ ID NO: 5. Например, выделенное антитело или антигенсвязывающие фрагменты представляет собой 58 с 5. В настоящем документе предусмотрены выделенные антитела против РСВ или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие тяжелые вариабельные (VH) цепи и легкие вариабельные (VL) цепи, где антитело или его антигенсвязывающие фрагменты иммуноспецифически связывают тот же эпитоп белка слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (РСВ), который связывает антитело или антигенсвязывающие фрагменты, который содержит тяжелую цепь, приведенную в SEQ ID NO: 1, и легкую цепь,приведенную в SEQ ID NO: 5. В некоторых примерах выделенное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат определяющий комплементарность район 1 VH (CDR1) с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2 или 1627. В некоторых примерах выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VH CDR2 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 3. В некоторых примерах выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VH CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 4. В некоторых примерах выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VH CDR1 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2 или 1627, VH CDR2 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 3, и VH CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 4. В некоторых примерах выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VL CDR1 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 6. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VL CDR2, где аминокислотная последовательность VL CDR2 приведена в SEQ ID NO: 7. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VL CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 8. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VL CDR1 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 6, VL CDR2 с последо-2 023179 вательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 7, и VL CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 8. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат тяжелую цепь с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 9. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат домен VH с последовательностью аминокислот, приведенной как аминокислоты 1-125 вSEQ ID NO: 9. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат легкую цепь с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ IDNO: 13. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VL домен с последовательностью аминокислот, приведенной как аминокислоты 1-107 в SEQ ID NO: 13. В частности, например, выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 58c5. В настоящем документе предусмотрены выделенные антитела против РСВ или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие тяжелые вариабельные (VH) цепи и легкие вариабельные (VL) цепи, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связывает тот же эпитоп белка слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (РСВ), который связывает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелые цепи, приведенные в SEQ ID NO: 9, и легкие цепи, приведенные вSEQ ID NO: 13. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VH. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты содержат VH CDR1 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 10 или 1628. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VH CDR2 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 11. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VH CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 12. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержатVH CDR1 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 10 или 1628; VH CDR2 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 11, и VH CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 12. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VL CDR1 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 14. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VL CDR2, где аминокислотная последовательность VL CDR2 приведена в SEQ ID NO: 15. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VL CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 16. В некоторых примерах выделенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат VL CDR1 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 14, VL CDR2 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO 15, и VL CDR3 с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 16. В настоящем документе предусмотрены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают часть белка F РСВ, аминокислотная последовательность которой приведена в SEQ ID NO: 25. Кроме того, предусмотрены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают белок F РСВ, аминокислотная последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 1629. В настоящем документе предусмотрены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие антигенсвязывающий домен, который представляет собой человеческое или гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых примерах выделенный полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предусмотренные в настоящем документе, представляют собой химерные антитела. В некоторых примерах выделенный полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют собой одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), Fab, Fab',F(ab')2, Fv, dsFv, диатело, Fd или фрагмент Fd. В некоторых примерах выделенный полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу содержат пептидный линкер. В некоторых примерах пептидный линкер содержит приблизительно от 1 до 50 аминокислот. В некоторых примерах выделенный полипептид, антитело или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу конъюгированы с полиэтиленгликолем (ПЭГ). В некоторых примерах выделенный полипептид, антитело или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу содержат терапевтические или диагностические агенты. Примеры диагностических агентов включают, но не ограничиваются, ферментами, флуоресцентными соединениями, переносящими электроны соединениями и радиоактивными метками. В настоящем документе предусмотрены выделенные полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащих домен трансмембранного переноса белка. В некоторых примерах домен трансмембранного переноса белка выбран из пептидов с аминокислотной последовательностью, приве-3 023179 денной в SEQ ID NO: 1529-1600. В некоторых примерах домен трансмембранного переноса белка представляет собой домен трансмембранного переноса ТАТ-белка ВИЧ. В настоящем документе предусмотрены поливалентные антитела, содержащие антигенсвязывающую часть, включающую полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, конъюгированные с доменом мультимеризации; и вторую антигенсвязывающую часть, включающую антигенсвязывающий фрагмент противовирусного антитела, конъюгированный со вторым доменом мультимеризации. В некоторых примерах первый домен мультимеризации и второй домен мультимеризации комплементарны или одинаковы, в результате чего первая антигенсвязывающая часть и вторая антигенсвязывающая часть формируют поливалентное антитело. В некоторых примерах предусмотрены поливалентные антитела, содержащие 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных антигенсвязывающих фрагментов. Примеры поливалентных антител включают двухвалентные, трехвалентные, четырехвалентные, пятивалентные, шестивалентные или семивалентные антитела. Поливалентные антитела, предусмотренные в настоящем документе, включают гетеробивалентные или гомобивалентные антитела. Поливалентные антитела, предусмотренные в настоящем документе, включают мультиспецифичные антитела. В некоторых примерах мультиспецифичные антитела представляют собой биспецифичные, триспецифичные или тетраспецифичные антитела. В некоторых примерах предусмотрены поливалентные антитела, содержащие антигенсвязывающие фрагменты, которые представляют собой одноцепочечныеFv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, диатела, Fd или фрагменты Fd'. Первая антигенсвязывающая часть и/или вторая антигенсвязывающая часть поливалентного антитела по настоящему документу может быть ковалентно или нековалентно конъюгирована с доменом мультимеризации. В некоторых примерах антигенсвязывающая часть конъюгирована с доменом мультимеризации через линкер, такой как химически синтезированный линкер или полипептидный линкер. В некоторых примерах домен мультимеризации поливалентного антитела, предусмотренного в настоящем документе, выбран из константного домена иммуноглобулина (Fc), лейциновой молнии, комплементарных гидрофобных районов, комплементарных гидрофильных районов или совместимых доменов, отвечающих за белок-белковые взаимодействия. В некоторых примерах Fc домен представляет собой Fc домен IgG, IgM и IgE. В некоторых примерах предусмотрены поливалентные антитела, содержащие два или более антиРСВ антител или их антигенсвязывающих фрагментов. В частности, например, предусмотрены поливалентные антитела, содержащие два или более анти-РСВ антитела или их антигенсвязывающих фрагментов. В настоящем документе предусмотрены поливалентные антитела, содержащие антигенсвязывающий фрагмент, включающий анти-РСВ антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, конъюгированный с доменом мультимеризации; и содержащие второй антигенсвязывающий фрагмент, включающий анти-РСВ антитело или антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из паливизумаба, мотавизумаба, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, А 13 с 4, А 17d4, А 4 В 4, А 8 с 7, 1X-493L1, FRH3-3F4, М 3 Н 9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15 В 10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R,A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 или их антигенсвязывающих фрагментов, конъюгированный со вторым доменом мультимеризации. В настоящем документе предусмотрены поливалентные антитела, содержащие антигенсвязывающий фрагмент, включающий анти-РСВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, конъюгированный с доменом мультимеризации; и второй антигенсвязывающий фрагмент,включающий противовирусное антитело, которое иммуноспецифически связывает антиген вируса парагриппа (PIV) или человеческого метапневмовируса (hMPV), конъюгированный со вторым доменом мультимеризации. В настоящем документе предусмотрены комбинации, которые содержат выделенный полипептид,антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу или поливалентное антитело по настоящему документу и противовирусный агент. В некоторых примерах противовирусный агент представляет собой рибавирин. В настоящем документе предусмотрены комбинации, которые содержат выделенный полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу и противовирусный агент, включенные в единую композицию или в виде отдельных композиций. В настоящем документе предусмотрены комбинации, которые содержат выделенный полипептид,антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, или поливалентное антитело по настоящему документу, а также один или несколько дополнительных противовирусных антител. В некоторых примерах комбинация включает два или более различных анти-РСВ антител или их антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых примерах комбинация включает два или более различных анти-РСВ антител или антигенсвязывающих фрагментов, выбранных из антител или антигенсвязывающих фрагментов, предусмотренных в настоящем документе. В некоторых примерах комбинация содержит антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу и антитела, выбранные из паливизумаба, мотавизумаба, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, А 17d4, А 4 В 4, А 8 с 7, 1X-493L1, FRH3-3F4, М 3 Н 9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15 В 10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R,A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 или их антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых примерах комбинация содержит антитела или антигенсвязывающие фрагменты по-4 023179 настоящему документу и антитела, выбранные из антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые иммуноспецифически связывают антиген вируса парагриппа (PIV) или человеческого метапневмовируса (hMPV). В некоторых примерах антиген PIV представляет собой антиген человеческого PIV типа 1, человеческого PIV типа 2, человеческого PIV типа 3 и/или человеческого PIV типа 4. В некоторых примерах антиген PIV выбран из фосфопротеина нуклеокапсида PIV, белка слияния (F) PIV, фосфопротеина PIV, большого белка (L) PIV, белка матрикса (М) PIV, гликопротеина гемагглютинин-нейраминидазы (HN) PIV, РНК-зависимой РНК-полимеразы PIV, белка Y1 PIV, белка D PIV, белка С PIV и их аллельных вариантов. В некоторых примерах антиген hMPV представляет собой антиген hMPV типа А или антиген hMPV типа В. В некоторых примерах антиген hMPV представляет собой антиген hMPV подтипа А 1, hMPV подтипа А 2, hMPV подтипа В 1 или hMPV подтипа В 2. В некоторых примерах антиген hMPV выбран из нуклеопротеида hMPV, фосфопротеина hMPV, белка матрикса hMPV, малого гидрофобного белка hMPV, РНК-зависимой РНК-полимеразы hMPV, белка F hMPV, белка G hMPV и их аллельных вариантов. В настоящем документе предусмотрены комбинации, которые содержат выделенный полипептид,антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу или поливалентные антитела по настоящему документу, а также одно или несколько дополнительных противовирусных антител, где одно или несколько дополнительных противовирусных антител представляют собой одноцепочечный Fv(scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, диатело, Fd или фрагмент Fd. В настоящем документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие любой выделенный полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, любое поливалентное антитело по настоящему документу или любую комбинацию по настоящему документу, а также фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых примерах фармацевтические композиции по настоящему документу изготовлены в виде геля, мази, жидкости, суспензии, аэрозоли, таблеток, пилюль, порошка или назального спрея. В некоторых примерах фармацевтические композиции по настоящему документу изготовлены для легочного, интраназального или парентерального введения. В некоторых примерах фармацевтические композиции по настоящему документу изготовлены для однократного введения. В некоторых примерах фармацевтические композиции по настоящему документу изготовлены для пролонгированного высвобождения. В настоящем документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие выделенный полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу или поливалентное антитело по настоящему документу, а также одно или несколько дополнительных противовирусных антител. В некоторых примерах фармацевтические композиции содержат два или более различных антиРСВ антител или их антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых примерах фармацевтические композиции содержат два или более различных анти-РСВ антитела или антигенсвязывающих фрагментов, где антитела или антигенсвязывающие фрагменты предусмотрены в настоящем документе. В некоторых примерах фармацевтические композиции содержат антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу и антитела, выбранные из падивизумаба, мотавизумааб, AFFF, P12f2, P12f4,P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, А 8 с 7, 1X-493L1, FR H3-3F4, М 3 Н 9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8,L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, А 4 В 4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21,rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 или их антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых примерах фармацевтические композиции содержат антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу и антитела, выбранные из антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые иммуноспецифически связывают антиген вируса парагриппа (PIV) или человеческого метапневмовируса (hMPV). В некоторые примерах антиген PIV представляет собой антиген человеческого PIV типа 1, человеческого PIV типа 2,человеческого PIV типа 3 и/или человеческого PIV типа 4. В некоторых примерах антиген PIV выбран из фосфопротеина нуклеокапсида PIV, белка слияния (F) PIV, фосфопротеина PIV, большого белка (L) PIV,белка матрикса (М) PIV, гликопротеина гемагглютинин-нейраминидазы (HN) PIV, РНК-зависимой РНКполимеразы PIV, белка Y1 PIV, белка D PIV, белка С PIV и их аллельных вариантов. В некоторых примерах антиген hMPV представляет собой антиген hMPV типа А или hMPV типа В. В некоторых примерах антиген hMPV представляет собой антиген hMPV подтипа A1, hMPV подтипа А 2, hMPV подтипа В 1 или hMPV подтипа В 2. В некоторых примерах антиген hMPV выбран из нуклеопротеида hMPV, фосфопротеина hMPV, белка матрикса hMPV, малого гидрофобного белка hMPV, РНК-зависимой РНКполимеразы hMPV, белка F hMPV, белка G hMPV и их аллельных вариантов. В настоящем документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие выделенный полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу или поливалентные антитела по настоящему документу, а также одно или несколько дополнительных противовирусных антител, где одно или несколько дополнительных противовирусных антител представляют собой одноцепочечный Fv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, диатело, Fd или фрагмент Fd. В настоящем документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие выделенный полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу или поливалентное антитело по настоящему документу, а также противовирусный агент. В некоторых примерах противовирусный препарат представляет собой рибавирин.-5 023179 В настоящем документе предусмотрен способ лечения вирусных инфекций у субъекта, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции,предусмотренной в настоящем документе. В настоящем документе предусмотрен способ лечения или подавления одного или нескольких симптомов вирусной инфекции у субъекта, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, предусмотренной в настоящем документе. Кроме того, предусмотрен способ профилактики вирусных инфекций у субъекта, который предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по настоящему документу. В частности, например, вирусная инфекция представляет собой инфекцию РСВ. В частности, например, инфекция РСВ представляет собой инфекцию верхних дыхательных путей. Введение может осуществляться любым подходящим путем, включая, но не ограничиваясь, местным, парентеральным, локальным или системным введением, например интраназальным, внутримышечным, интрадермальным, внутрибрюшинным, внутривенным, подкожным, пероральным или легочным введением. В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предусмотренную в настоящем документе, вводят с помощью распылителя или ингалятора. Фармацевтические композиции по настоящему документу могут быть введены любому подходящему субъекту, например млекопитающему, в частности человеку. В некоторых примерах фармацевтическую композицию, предусмотренную в настоящем документе,вводят младенцу, недоношенному младенцу или младенцу с риском госпитализации в результате инфекции РСВ, пожилому человеку, субъекту с муковисцидозом, бронхолегочной дисплазией, врожденным пороком сердца, врожденным иммунодефицитом, приобретенным иммунодефицитом, лейкемией или неходжкинской лимфомой или субъекту, перенесшему пересадку органов или тканей, например пересадку костного мозга или пересадку печени. В некоторых примерах фармацевтическую композицию по настоящему документу вводят один раз,два раза, три раза, четыре раза или пять раз в течение сезона распространения инфекции РСВ (например,с октября по май). В некоторых примерах фармацевтическую композицию по настоящему документу вводят один раз, два раза, три раза, четыре раза или пять раз в течение одного месяца, двух месяцев или трех месяца до сезона РСВ. В некоторых примерах фармацевтическая композиция по настоящему документу может быть введена с одним или более противовирусными агентами. В некоторых примерах противовирусный препарат представляет собой рибавирин. В некоторых примерах фармацевтическая композиция и противовирусный агент включены одну композицию или предусмотрены в виде отдельных композиций. В способах по настоящему документу фармацевтическая композиция и противовирусный агент могут быть введены последовательно, одновременно или с перерывом. В некоторых примерах фармацевтическая композиция по настоящему документу может быть введена совместно с гормональной терапией, иммунотерапией или противовоспалительным агентом. В некоторых примерах фармацевтическая композиция по настоящему документу может быть введена совместно с одним или несколькими дополнительными противовирусными антителами и их антигенсвязывающими фрагментами. Фармацевтическая композиция и один или несколько дополнительных противовирусных антител могут быть включены в одну композицию или предусмотрены в виде отдельных композиций. Фармацевтическая композиция и один или несколько дополнительных анти-РСВ антител могут быть введены последовательно, одновременно или с перерывом. В некоторых примерах антигенсвязывающие фрагменты представляют собой одноцепочечные Fv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, диатело,Fd или фрагмент Fd. В некоторых примерах фармацевтическая композиция по настоящему документу может быть введена с одним или несколькими дополнительными противовирусными антителами, выбранными из антител против РСВ или их антигенсвязывающих фрагментов, таких как, например, паливизумаб, мотавизумаб, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, А 8 с 7, 1X-493L1, FR H3-3F4, М 3 Н 9,Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, А 4 В 4-F52S,rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 или их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых примерах фармацевтическая композиция по настоящему документу может быть введена с одним или несколькими дополнительными противовирусными антителами, выбранными из антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые иммуноспецифически связывают антиген вируса парагриппа (PIV) или человеческого метапневмовируса (hMPV). В некоторых примерах антиген PIV представляет собой антиген человеческого PIV типа 1, человеческого PIV типа 2, человеческого PIV типа 3 и/или человеческого PIV типа 4. В некоторых примерах антиген PIV выбран из фосфопротеина нуклеокапсида PIV, белка слияния (F) PIV, фосфопротеина PIV, большого белка (L) PIV, белка матрикса (М)hMPV представляет собой антиген hMPV типа А или hMPV типа В. В некоторых примерах антигенhMPV представляет собой антиген hMPV подтипа A1, hMPV подтипа А 2, hMPV подтипа В 1 или hMPV подтипа В 2. В некоторых примерах антиген hMPV выбран из нуклеопротеида hMPV, фосфопротеинаhMPV, белка матрикса hMPV, малого гидрофобного белка hMPV, РНК-зависимой РНК-полимеразыhMPV, белка F hMPV, белка G hMPV и их аллельных вариантов. В настоящем документе предусмотрен способ обнаружения инфекции РСВ, который включает:(а) анализ уровня антигена РСВ в образцах жидкости, клеток или ткани с помощью антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему документу,(б) сравнение измеренного уровня антигена РСВ с контрольным уровнем, где превышение измеренного уровня антигена РСВ по сравнению с контрольным уровнем антигена РСВ указывает на инфекцию РСВ. В некоторых примерах образец клеток или ткани получают у человеческого субъекта. В некоторых примерах образец клеток или ткани представляет собой образец крови, мочи, слюны, мокроты легких,лаважа или лимфы. В настоящем документе предусмотрены выделенные нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептид, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу. В настоящем документе предусмотрены векторы, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид,антитело или его антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу. В настоящем документе предусмотрены клетки, содержащие антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу, нуклеиновые кислоты по настоящему документу или вектор по настоящему документу. Клетки по настоящему документу могут представлять собой, например, прокариотические или эукариотические клетки. Кроме того, предусмотрены трансгенные животные, которые содержат нуклеиновые кислоты по настоящему документу или вектор по настоящему документу. Также предусмотрены способы экспрессии выделенных антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые включают культивирование клеток по настоящему документу в условиях, которые приводят к экспрессии закодированных антител, или выделение антител или антигенсвязывающих фрагментов из трансгенных животных по настоящему документу. В некоторых примерах антитела или антигенсвязывающие фрагменты выделяют из сыворотки или молока трансгенных животных. В настоящем документе предусмотрены наборы, включающие полипептид, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу, поливалентные антитела по настоящему документу или комбинации по настоящему документу, помещенные в один или несколько контейнеров, а также инструкции по применению. Кроме того, предусмотрено применение антител или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему документу для профилактики и/или лечения вирусной инфекции у субъекта. Кроме того, предусмотрено применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему документу для лечения или подавления одного или нескольких симптомов вирусной инфекции у субъекта. Также в настоящем документе предусмотрено применение антител или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему документу для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения вирусной инфекции у субъекта. Кроме того, предусмотрено применение антител или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему документу для изготовления лекарственного средства для лечения или подавления одного или нескольких симптомов вирусной инфекции у субъекта. Подробное описание изобретения СодержаниеB. Обзор 1. Респираторно-синцитиальный вирус С. Антитела против РСВ 1. Общая структура антител и функциональные домены а. Структурные и функциональные домены антителD. Дополнительные модификации анти-РСВ антител 1. Снижающие иммуногенность модификации 2. Модификации Fc 3. Пегилирование 4. Конъюгация с обнаруживаемой меткой 5. Конъюгация с терапевтическим агентом 6. Модификации, улучшающие специфичность связыванияF. Способы получения анти-РСВ антител, их модифицированных форм или различных вариантов, а также нуклеиновых кислот, кодирующих антитела-7 023179 1. Нуклеиновые кислоты 2. Векторы 3. Клеточные системы экспрессии а. Прокариотические системы экспрессииG. Оценка свойств и активности анти-РСВ антител 1. Анализы на связывание 3. In vitro анализы на нейтрализацию вирусов антителами 4. In vivo животные модели для оценки эффективности анти-РСВ антител 5. In vitro и in vivo анализы для измерения эффективности антител Н. Применение в диагностических целях 1. In vitro обнаружение патогенной инфекции 2. In vivo обнаружение патогенной инфекции 3. Контроль инфекцииI. Применение для профилактики и терапии 1. Субъекты для терапии 2. Дозировка 3. Пути введения 4. Комбинированная терапия а. Противовирусные антитела для комбинированной терапииII. Антитела против других респираторных вирусов 5. Генная терапияK. Примеры А. Определения Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют тот же смысл, как это обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Если не указано иное, все патенты, заявки, опубликованные заявки и публикации, последовательностиGenbank, базы данных, вебсайты и другие опубликованные материалы, упомянутые в настоящем документе, приведены в качестве ссылки в полном объеме. Если для упоминаемого в настоящем документе термина существует множество определений, предпочтительно приведенное в этом разделе определение. В случае приведения ссылки на URL или другого подобного идентификатора или адреса понимается, что идентификатор может изменяться и информация в сети Интернет может появляться и исчезать, но аналогичную информацию можно найти в сети Интернет. Подобная ссылка свидетельствует о наличии информации и открытом доступе. В настоящем документе термин "антитело" относится к иммуноглобулинам и фрагментам иммуноглобулинов, природным или частично или полностью синтетическим, таким как рекомбинантные,включая любые их фрагменты, содержащие по меньшей мере часть вариабельного домена молекулы иммуноглобулина, которые сохраняют специфичность связывания полноразмерного иммуноглобулина. Таким образом, антитела включают любые белки, имеющие связывающий домен, гомологичный или существенно гомологичный антигенсвязывающему домену иммуноглобулинов (связывающий район антитела). Антитела включают фрагменты антител, такие как фрагменты анти-РСВ антител. Используемый в настоящем документе термин "антитело", таким образом, включает в себя синтетические антитела, рекомбинантные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), человеческие антитела и не человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, внутриклеточные антитела и фрагменты антител, включая, но не ограничиваясь, Fab фрагментами, Fab' фрагментами, F(ab')2-фрагментами, Fv фрагментами, связанными дисульфидными мостами Fv фрагментами (dsFv),Fd фрагментами, Fd' фрагментами, одноцепочечными Fv фрагментами (scFv), одноцепочечными Fab(scFab), диателами, антиидиотипическими (анти-Id) антителами или антигенсвязывающими фрагментами любой из вышеперечисленных молекул. Термин "антитело" по настоящему документу распространяется на представителей любого типа иммуноглобулинов (например, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY) любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса (например, IgG2a и IgG2b). В настоящем документе "фрагмент антитела" или "антигенсвязывающий фрагмент" антитела относится к любой части полноразмерного антитела, которая меньше полноразмерной молекулы, но содер-8 023179 жит по меньшей мере часть вариабельного домена антитела, который связывает антиген (например, один или несколько CDR и/или один или более связывающих районов антитела), и тем самым сохраняет специфичность связывания полноразмерного антитела, по меньшей мере, частично. Фрагменты антител включают производные антител, полученные ферментативной обработкой полноразмерных антител, а также полученные синтетически, например, рекомбинантные производные. Фрагмент антитела включен в понятие антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются Fab, Fab', F(ab')2,одноцепочечными Fv (scFv), Fv, dsFv, диателами, Fd и фрагментами Fd, a также другими фрагментами,включая модифицированные фрагменты (см., например, Methods in Molecular Biology, т. 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003), глава 1, с. 3-25, Kipriyanov). Фрагмент может содержать несколько цепей, связанных друг с другом, например, через дисульфидные мосты и/или пептидные линкеры. Фрагмент антитела обычно содержит, по меньшей мере, приблизительно 50 аминокислот, как правило, по меньшей мере приблизительно 200 аминокислот. В настоящем документе антигенсвязывающий фрагмент относится к фрагменту антитела, который содержит антигенсвязывающий участок, связывающий тот же антиген, который связывает антитело, из которого получен фрагмент. Антигенсвязывающий фрагмент по настоящему документу включает любой фрагмент антитела, который при вставке в рамку считывания антитела (например, путем замены соответствующего домена) приводит к антителу, которое иммуноспецифически связывает (то есть демонстрирует Ka по меньшей мере приблизительно 107-108 М-1) с антигеном. Антигенсвязывающие фрагменты включают фрагменты антител, такие как фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab')2, фрагментыFv, связанные дисульфидными мостами Fv (dsFv), фрагменты Fd, фрагменты Fd', одноцепочечные Fv(scFv), одноцепочечные Fab (scFab), а также включают в себя другие фрагменты, такие как CDRсодержащие фрагменты, и полипептиды, которые иммуноспецифически связывают антиген, или при вставке в рамку считывания антитела приводят к антителу, которое иммуноспецифически связывается антигеном. В настоящем документе "терапевтическое антитело" относится к любому антителу или антигенсвязывающему фрагменту, который вводят для лечения животных, включая человека. Такие антитела могут быть получены с помощью любого известного способа получения полипептидов и, следовательно, включают, но не ограничиваются рекомбинантными антителами, синтетическими антителами и терапевтическими антителами, выделенными из клеток, тканей и других источников. При выделении из любых источников или при другом способе получения терапевтические антитела могут быть гетерогенны по длине и различаться по посттрансляционным модификациям, таким как гликозилирование (т.е. содержание углеводов). Гетерогенность терапевтических антител также может зависеть от источника терапевтических антител. Таким образом, упоминание терапевтического антитела относится к гетерогенной популяции антител, как выделенных, так и полученных другим способом. Если упоминается гомогенный препарат, то об этом указано отдельно. Упоминание терапевтических антител в настоящем документе включает их мономерные, димерные или другие олигомерные формы, если это необходимо. В настоящем документе "нейтрализующие антитела" относятся к любому антителу или антигенсвязывающему фрагменту, который связывает возбудителя и препятствует возбудителю инфицировать клетки и/или вызывать заболевание у субъекта. Примером нейтрализующих антител являются нейтрализующие антитела, которые связывают вирусы, бактерии и грибковые патогены. Как правило, нейтрализующие антитела по настоящему документу связывают поверхность патогена. В примерах, где возбудитель представляет собой вирус, нейтрализующие антитела, связывающие вирус, обычно связываются с белком на поверхности вируса. В зависимости от класса вирусов поверхностный белок может представлять собой белок капсида (например, белок капсида безоболочечного вируса) или белок оболочки вируса(например, белок оболочки оболочечного вируса). В некоторых примерах белок представляет собой гликопротеин. Способность антитела подавлять инфекционность вируса может быть измерена, например, с помощью анализа нейтрализации in vitro, например, анализа подавления бляшкообразования с применением клеток Vero. В настоящем документе "оболочечный вирус" представляет собой вирус животных, который имеет наружную мембрану или оболочку, которая представляет собой липидный бислой, содержащий вирусные белки, окружающую капсид вируса. Белки оболочки вируса участвуют в сборке инфекционных частиц, а также участвуют в процессе проникновения вируса, связываясь с рецепторами поверхности клетки-хозяина и вызывая слияние вирусной оболочки и мембраны клетки-хозяина. Оболочечные вирусы могут быть сферическими или нитевидными (палочковидными). Примеры вирусов с оболочкой включают, но не ограничиваются членами семейств герпесвирусов, поксвирусов, гепаднавирусов, тогавирусов,аренавирусов, флавивирусов, ортомиксовирусов, паровксовирусов, буньявирусов, рабдовирусов, филовирусов, коронавирусов и борнавирусов. Респираторный синцитиальный вирус (РСВ) представляет собой оболочечный вирус семейства парамиксовирусов, подсемейства пневмовирусов, содержащий антисмысловую одноцепочечную РНК. В настоящем документе "безоболочечный вирус" или "голый вирус" представляет собой вирус, который не имеет оболочки. Для заражения клетки-хозяина безоболочечный вирус для прикрепления к клетке-мишени использует белки вирусного капсида. Примеры безоболочечных вирусов включают, но-9 023179 не ограничиваются семейством аденовирусов, папилломавирусов, парвовирусов, полиомавирусов, цирковирусов, реовирусов, пикорнавирусов, калицивирусов и астровирусов. В настоящем документе "поверхностный белок" патогена представляет собой любой белок, который находится на внешней поверхности патогена. Поверхностный белок может быть полностью или частично экспонирован во внешнюю среду (например, на наружной поверхности). Примерами поверхностных белков являются мембранные белки, например белок, расположенный на поверхности вирусной оболочки или бактериальной наружной мембране (например, гликопротеин мембран). Мембранные белки могут представлять собой трансмембранные белки (то есть белки, которые пересекают липидный бислой) или не трансмембранные белки, ассоциированные с клеточной поверхностью (например, заякоренные или ковалентно прикрепленные к поверхности мембраны, например приклепленные к другим белкам на поверхности патогена). Другие примеры белков включают поверхностные вирусные капсидные белки безоболочечных вирусов и оболочечных вирусов, которые хотя бы частично экспонированы во внешнюю среду. В настоящем документе "моноклональные антитела" относятся к популяции идентичных антител,подразумевая, что каждая отдельная молекула антител в популяции моноклональных антител идентична другим молекулам. Это свойство отличается от популяции поликлональных антител, которая содержит антитела, имеющие множество различных последовательностей. Моноклональные антитела можно получать с помощью целого ряда известных методов (Smith et al. (2004) J. Clin. Pathol. 57, 912-917; и Nelsonet al., J. Clin. Pathol. (2000), 53, 111-117). Например, моноклональные антитела могут быть получены иммортализацией клеток, например, слиянием с клетками миеломы для создания линии гибридомы или заражением В клеток вирусом, таким как EBV. Рекомбинантная технология также может быть использована для получения антител in vitro из клональной популяции клеток-хозяев, где клетки-хозяева трансформированы плазмидой, несущей искусственную последовательность нуклеотидов, кодирующую антитело. В настоящем документе "обычное антитело" относится к антителу, которое состоит из двух тяжелых цепей (которые можно обозначить Н и Н'), двух легких цепей (которые можно обозначить L и L') и двух участков связывания, где каждая тяжелая цепь может представлять собой полноразмерную тяжелую цепь иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент, который сохраняет антигенсвязывающие свойства (например, тяжелая цепь включает, но не ограничивается VH, VH-CH1 и VH-CH1-CH2-CH3), и каждая легкая цепь может представлять собой полноразмерную легкую цепь или любой ее функциональный домен (например, легкие цепи включают, но не ограничиваются, VL цепями и VL-CL цепями). Каждая тяжелая цепь (Н и Н') образует пару с одной легкой цепью (L и L' соответственно). В настоящем документе полноразмерное антитело представляет собой антитело, имеющее две полноразмерные тяжелые цепи (например, VH-CH1-CH2-CH3 или VH-CH1-CH2-CH3-CH4) и две полноразмерные легкие цепи (VL-CL), а также шарнирные фрагменты, например человеческое антитело, вырабатываемое в естественных условиях секретирующими антитела В-клетками, и антитело с теми же доменами, которое получено синтетически. В настоящем документе Fv фрагмент антитела состоит из одного вариабельного тяжелого домена(VH) И ОДНОГО вариабельного легкого домена (VL), связанных нековалентно. В настоящем документе dsFv относится к Fv с искусственной межмолекулярной дисульфидной связью, которая стабилизирует VH-VL пару. В настоящем документе фрагмент Fd представляет собой фрагмент антитела, содержащий вариабельный домен (VH) и один константный домен (CH1) тяжелой цепи антитела. В настоящем документе фрагмент Fab представляет собой фрагмент антитела, полученный расщеплением полноразмерного иммуноглобулина папаином, или фрагмент, имеющий ту же структуру, но полученный синтетически, например, рекомбинантными методами. Fab фрагмент содержит легкую цепь(включающую VL и CL), и вторую цепь, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и один домен константного района тяжелой цепи (CH1). В настоящем документе F(ab')2 фрагмент представляет собой фрагмент антитела, полученный расщеплением иммуноглобулина пепсином при рН 4,0-4,5, или фрагмент, имеющий ту же структуру, но полученный синтетически, например, рекомбинантными методами. F(ab')2 фрагмент, по существу, содержит два Fab фрагмента, где каждая часть тяжелой цепи содержит несколько дополнительных аминокислот, включая остатки цистеина, которые образуют дисульфидные связи, соединяющие два фрагмента. В настоящем документе Fab'-фрагмент представляет собой фрагмент, содержащий половину (одну тяжелую цепь и одну легкую цепь) F(ab')2-фрагмента. В настоящем документе Fd' фрагмент представляет собой фрагмент антитела, содержащий часть тяжелой цепи F(ab')2-фрагмента. В настоящем документе фрагмент Fv представляет собой фрагмент, содержащий только VH и VL домены молекулы антитела. В настоящем документе к hsFv фрагментам относится антитело, в котором константный домен,обычно присутствующий в Fab фрагменте, был заменен гетеродимерным биспиральным (coiled-coil) доменом (см., например, Arndt et al. (2001) J Mol Biol. 7:312:221-228).- 10023179 В настоящем документе фрагмент scFv относится к фрагменту антитела, который содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH), ковалентно связанные полипептидным линкером в любом порядке. Линкер имеет такую длину, что два вариабельных домена соединяются без существенных затруднений. Примеры линкеров представляют собой (Gly-Ser)n последовательности с включенными для увеличения растворимости остатками Glu или Lys. Используемый в настоящем документе термин "производное" относится к полипептиду, который содержит последовательность аминокислот анти-РСВ антитела или его фрагмента, которая была изменена, например, введением замен, удаления или добавления аминокислотных остатков, а также ковалентным присоединением к полипептиду молекул любого типа (например, гликозилированием, ацетилированием, пегилированием, фосфорилированием, амидированием, модификацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением, связыванием с клеточными лигандами или другими белками). Производные антител против РСВ или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть изменены химической модификацией с помощью методов, известных специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь, специфическим химическим расщеплением, ацетилированием,формилированием, метаболическим синтезом туникамицина. Кроме того, производные антител против РСВ или их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать одну или несколько неклассических аминокислот. Как правило, полипептидное производное обладает схожими или идентичными функциями по сравнению с анти-РСВ антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему документу(например, нейтрализация РСВ). Используемая в настоящем документе фраза "полученная из", употребляемая по отношению к фрагментам антител, полученным из другого антитела, такого как моноклональное антитело, относится к получению фрагментов антител (например, Fab, F(ab'), F(ab')2, одноцепочечных Fv (scFv), Fv, dsFv, диател, Fd и Fd' фрагментов), которые сохраняют специфичность связывания исходного антитела. Такие фрагменты могут быть получены различными способами, известными в данной области, включая, но не ограничиваясь, ферментативным расщеплением, химическим сшиванием, рекомбинантными методами или их комбинацией. Как правило, вариабельный район тяжелой цепи (VH) и вариабельный район легкой цепи (VL) фрагмента производного антитела идентичен или существенно идентичен аналогичным областям исходного антитела, так что фрагмент антитела и антитело связывают один эпитоп. В настоящем документе "исходное антитело" или "начальное антитело" относится к антителу, из которого получен фрагмент антитела (например, Fab, F(ab'), F(ab')2, одноцепочечный Fv (scFv) Fv, dsFv,диатело, Fd и Fd' фрагменты). Используемый в настоящем документе термин "эпитоп" относится к любой антигенной детерминанте антигена, который связывает паратоп антитела. Эпитопы, как правило, содержат химически активные поверхностные группировки молекул, такие как боковые цепи аминокислот или сахара, и, как правило, имеют специфическую трехмерную структуру, а также особенности распределения зарядов. В настоящем документе химерный полипептид относится к полипептиду, который содержит части по меньшей мере двух различных полипептидов или две части одного полипептида, не формирующие непрерывную последовательность. Таким образом, химерный полипептид обычно включает в себя целую последовательность аминокислотных остатков полипептида или ее часть и целую последовательность аминокислот другого полипептида или ее часть. Указанные две части могут быть связаны напрямую или не напрямую, могут быть связаны пептидной связью, другой ковалентной связью или нековалентными взаимодействиями достаточной силы, которые приводят к сохранению целостности значительной части химерного полипептида в равновесных физиологических условиях, таких как в изотонический буферный раствор с рН 7. В настоящем документе химерные полипептиды включают полипептиды,которые содержат полное анти-РСВ антитело или его часть, связанную с другим полипептидом, таким как, например, домен мультимеризации, константный домен или каркасный район гетерологичного иммуноглобулина, диагностический или терапевтический полипептид. В настоящем документе гибридный белок представляет собой искусственный полипептид, содержащий последовательность аминокислот, соответствующую двум различным полипептидам, которые соединены вместе, полученный, например, экспрессией гибридного белка с помощью вектора, содержащего близко расположенные, например, примыкающие друг к другу в последовательности вектора, две нуклеиновые кислоты, кодирующие два полипептида. Как правило, гибридный белок по настоящему документу относится к полипептиду, содержащему полипептид с аминокислотной последовательностью антитела или антигенсвязывающего фрагмента и полипептид или пептид с аминокислотной последовательностью гетерологичного полипептида или пептида, такого как, например, диагностический или терапевтический полипептид. Таким образом, гибридный белок относится к химерному белку, содержащему два белка или части из двух или более белков или пептидов, которые связаны напрямую или не напрямую пептидной связью. Две молекулы могут примыкать друг к другу в конструкции или могут быть разделены линкером или разделяющим полипептидом. Разделяющий полипептид может кодировать полипептид, который изменяет свойства полипептида, такие как растворимость или внутриклеточная локализация. В настоящем документе "линкер" или "разделяющий пептид" относится к короткой последователь- 11023179 ности аминокислот, которая объединяет две полипептидные последовательности (или к нуклеиновой кислоте, кодирующей такую последовательность аминокислот). "Пептидный линкер" относится к короткой последовательности аминокислот, соединяющей две полипептидные последовательности. Примеры полипептидных линкеров включают линкеры, соединяющие домен переноса белка с антителом, или линкеры, соединяющие две цепи антитела в синтетический фрагмент антитела, такой как фрагмент scFv. Линкеры хорошо известны в уровне техники, и любой известный линкер может быть использован в предусмотренных настоящим документах способах. Примеры полипептидных линкеров включают (Gly-Ser)n аминокислотные последовательности с включенными для увеличения растворимости остатками Glu илиLys. Другие примеры линкеров описаны в настоящем документе, и любой из указанных и других известных линкеров может быть использован в предусмотренных композициях и способах. В настоящем документе "шарнирный район антитела" или "шарнирный район" относится к району полипептида, который присутствует в природных тяжелых цепях антител гамма-, дельта- и альфаизотипов между CH1 и CH2 доменами и который не имеет гомологии с другими доменами антител. Этот фрагмент богат остатками пролина и придает гибкость IgG, IgA и IgD антителам, позволяя двум "рукам"(каждая из которых содержит один сайт связывания антитела) Fab фрагмента быть подвижными, то есть располагаться под различными углами по отношению друг к другу при связывании антигена. Такая гибкость позволяет Fab рукам двигаться для взаимодействия сайтов связывания антитела с эпитопами на поверхности клеток или другими антигенами. Две внутрицепочечные дисульфидные связи в шарнирном районе стабилизируют взаимодействия между двумя тяжелыми цепями. В некоторых вариантах по настоящему документу искусственные фрагменты антител содержат один или несколько шарнирных районов, например, способствующих стабилизации молекулы через взаимодействие двух цепей антитела. Шарнирный район является примером домена димеризации. В настоящем документе диатело представляет собой димер scFv; диатела, как правило, имеют более короткие пептидные линкеры по сравнению с scFv, что приводит к их димеризации. В настоящем документе гуманизированные антитела относятся к антителам, которые были модифицированы включением "человеческих" последовательностей аминокислот, так что введение антител человеку не вызывает иммунного ответа. Гуманизированные антитела, как правило, содержат определяющие комплементарность районы (CDR), полученные из иммуноглобулинов не человеческого происхождения, а остальная часть молекулы антитела получена, как правило, из человеческого иммуноглобулина. Методы получения таких антител известны в уровне техники. Например, ДНК, кодирующая моноклональное антитело, может быть изменена с помощью технологии рекомбинантной ДНК для кодирования антитела, в котором аминокислотный состав не вариабельных фрагментов основан на человеческих антителах. Методы определения таких фрагментов известны в уровне техники, включая компьютерные программы, которые предназначены для определения вариабельных и не переменная фрагментов иммуноглобулинов. В настоящем документе идиотип относится к набору из одной или нескольких антигенных детерминант, характерных для вариабельного домена молекулы иммуноглобулина. В настоящем документе антиидиотипическое антитело относится к антителу против антигенспецифической части последовательности антитела или Т-клеточного рецептора. Антиидиотипическое антитело ингибирует специфический иммунный ответ. В настоящем документе домен Ig представляет собой домен, распознаваемый в качестве такового в уровне техники, который отличается характерной иммуноглобулиновой (Ig) структурой, которая состоит из двух бета-листов, каждый из которых содержит антипараллельные бета-цепи аминокислот, соединенные петлями. Два бета-листа в Ig структуре соединены между собой гидрофобными взаимодействиями и консервативными внутрицепочечными дисульфидными связями. Индивидуальные домены иммуноглобулина в цепи антитела далее могут быть выделены на основе их функций. Например, легкая цепь содержит один домен с вариабельным районом (VL) и один домен с константным районом (CL), в то время как тяжелая цепь содержит один домен с вариабельным районом (VH) и три или четыре домена с константным районом (CH). Каждый VL, CL, VH и CH домен представляет собой пример иммуноглобулинового домена. Используемый в настоящем документе термин вариабельный домен или вариабельный район представляет собой определенный Ig домен тяжелой или легкой цепи антитела, который содержит последовательность аминокислот, которая различается в разных антителах. Каждая легкая цепь и каждая тяжелая цепь имеет один домен с вариабельным районом, VL и VH соответственно. Вариабельные домены определяют антигенную специфичность и, следовательно, отвечают за распознавание антигена. Каждый вариабельный район содержит районы CDR, которые являются частью антигенсвязывающего домена, и каркасные районы (FR). В настоящем документе "антигенсвязывающий домен", "антигенсвязывающий участок", "район связывания антигена" и "связывающий район антитела" используются как синонимы для обозначения домена антитела, который распознает и физически взаимодействует с распознаваемым антигеном. Нативная полноразмерная молекула антитела содержит два обычных антигенсвязывающих участка, каждый из которых содержит части вариабельного района тяжелой цепи и части вариабельного района легкой- 12023179 цепи. Обычный антигенсвязывающий сайт содержит петли, которые соединяют антипараллельные бетацепи в доменах с вариабельным районом. Связывающие антиген участки могут содержать другие части доменов с вариабельными районами. Каждый обычный антигенсвязывающий участок содержит три гипервариабельных района из тяжелой цепи и три гипервариабельных района из легкой цепи. Гипервариабельные районы также называют определяющими комплементарность районами (CDR). В настоящем документе "гипервариабельный район", "HV", "определяющий комплементарность район", "CDR" и "CDR антитела" используются как синонимы для обозначения одной из нескольких частей внутри каждого вариабельного домена, которые вместе образуют антигенсвязывающий участок антитела. Каждый домен с вариабельным районом включает три CDR, обозначаемые CDR1, CDR2 и CDR3. Три CDR не соседствуют друг с другом в линейной аминокислотной последовательности, но сближены в фолдированном полипептиде. CDR расположены в пределах петель, соединяющих параллельные цепи бета-листов вариабельного домена. Как описано в настоящем документе, специалист в данной области может определить CDR по нумерации Кабат или Chothia (см., например, Kabat E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication91-3242, и Chothia С. et al. (1987) J Mol. Biol. 196:901-917). В настоящем документе каркасные районы (FR) представляют собой домены антитела в доменах с вариабельными районами, которые находятся в бета-листах; FR районы сравнительно более консервативны по аминокислотным последовательностям по сравнению с гипервариабельными районами. В настоящем документе домен "константного района" представляет собой домен в тяжелой или легкой цепи антитела, который содержит сравнительно более консервативную последовательность аминокислот относительно домена вариабельного района. В обычных полноразмерных молекулах антител каждая легкая цепь имеет один константный домен легкой цепи (CL) И каждая тяжелая цепь содержит один или несколько доменов константного района тяжелой цепи (CH), которые включают CH1, CH2, CH3 иIgE и IgM содержат CH1, CH2, CH3 и CH4. CH1 и CL домены формируют Fab руку молекулы антитела, способствуя тем самым взаимодействию с антигеном и вращению рук антитела. Константный район антитела может выполнять эффекторные функции, включая, но не ограничиваясь, удалением антигенов, патогенов и токсинов, которые специфически связывает антитело, например, через взаимодействие с различными клетками, биомолекулами и тканями. В настоящем документе функциональный район антитела представляет собой часть антитела, которая содержит, по меньшей мере, VH, VL, CH (например, CH1, CH2 и CH3), CL или шарнирный район антитела, или, по меньшей мере, его функциональный район. В настоящем документе функциональный район домена VH представляет собой по меньшей мере часть полного домена VH, которая сохраняет по меньшей мере часть специфичности связывания полного домена VH (например, при сохранении одного или нескольких CDR полного домена VH), так что функциональный район домена VH либо самостоятельно, либо в комбинации с другими доменами антитела(например, VL доменом) или их фрагментами связывает антиген. Примеры функциональных районов доменов VH представляют собой районы, содержащие CDR1, CDR2 и/или CDR3 домена VH. В настоящем документе функциональный район домена VL представляет собой по меньшей мере часть полного домена VL, которая сохраняет по меньшей мере часть специфичности связывания полного домена VL (например, при сохранении одного или нескольких CDR полного домена VL), так что функциональный район домена VL либо самостоятельно, либо в комбинации с другими доменами антитела(например, VH доменом) или их фрагментами связывает антиген. Примеры функциональных районов доменов VL представляют собой районы, содержащие CDR1, CDR2 и/или CDR3 домена VL. В настоящем документе "специфическое связывание" или "иммуноспецифическое связывание" в отношении антитела или его антигенсвязывающего фрагмента используются взаимозаменяемо и относятся к способности антитела или антигенсвязывающего фрагмента формировать одну или несколько нековалентных связей с распознаваемым антигеном за счет нековалентных взаимодействий между сайтом связывания антитела и антигена. Антиген может представлять собой выделенный антиген или может быть представлен в вирусе. Как правило, антитело, которое иммуноспецифически связывает (или специфически связывает) антиген вируса, или вирус представляет собой антитело, которое связывает антиген вируса (или антиген на вирусе или вирус) с константой аффинности Ka приблизительно 1 107 М-1, или 1 108 М-1, или выше (или константой диссоциации (Kd) 1 10-7 М или 1 10-8 М и менее). Константы аффинности могут быть определены с помощью стандартных кинетических тестов для антител, например, иммуноанализа, поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (Rich и Myszka (2000) Curr. Opin.(ITC) и других известных кинетических анализов межмолекулярного взаимодействия (см., например,Paul, Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, с. 332-336 (1989), см. также патент США 7229619 для описания примеров применения методов SPR и ITC для определения аффинности антиРСВ антител). Оборудования и методы определения и отслеживания скоростей связывания в реальном времени известны и являются коммерчески доступными (например, BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala,- 13023179Sweden и GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335). Антитело, которое иммуноспецифически связывает антиген вируса (или вирус), может связывать другие пептиды, полипептиды или белки или вирусы с равной или меньшей аффинностью. Как правило, антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему документу, которые иммуноспецифически связывают белок F РСВ(или РСВ вирус), не связывают другие антигены или связывают такие антигены с существенно меньшей(по меньшей мере в 10-100 раз) аффинностью. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают определенные антигены вируса (например, белок F РСВ), можно определить, например, иммунологически, например, с помощью радиоиммунного анализа (РИА), иммуноферментного анализа (ИФА), поверхностного плазмонного резонанса или других методов, которые известны специалистам в данной области. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связывают эпитоп белка F РСВ, обычно связывают эпитоп (представленный в белке или вирусе) с большей аффинностью, чем любой перекрестно-реактивный эпитоп, как это определяется с помощью экспериментальных методов, включающих, но не ограничивающихся иммунохимическим анализом, поверхностным плазмонным резонансом или другими методами, известными специалистам в данной области. Иммуноспецифическое связывание выделенного белка РСВ (например, полученного рекомбинантно белка), такого как белок F РСВ, не обязательно означает, что антитело будет так же иммуноспецифически связывать и/или нейтрализовать вирус. Подобные анализы и свойства различны. Может быть определена аффинность антитела или антигенсвязывающего фрагмента к вирусу или антигену,представленному в вирусе. В настоящем документе при описании аффинности или сходных понятий используется такая мишень, как выделенный белок или вирус. Используемый в настоящем документе термин "поверхностный плазмонный резонанс" относится к оптическому явлению, которое позволяет анализировать взаимодействия в режиме реального времени путем выявления изменений концентрации белка на биосенсорной матрице, например, с помощью системы Biacore (GE Healthcare, Life Sciences). В настоящем документе "поливалентное" антитело представляет собой антитело, содержащее два или более антигенсвязывающих участков. Поливалентные антитела включают двухвалентные, трехвалентные, четырехвалентные, пятивалентные, шестивалентные, семивалентные или антитела большей валентности. В настоящем документе "моноспецифичное" антитело представляет собой антитело, которое содержит два или более антигенсвязывающих участков, где каждый антигенсвязывающий участок иммуноспецифически связывает один и тот же эпитоп. В настоящем документе "мультиспецифичное" антитело представляет собой антитело, которое содержит два или более антигенсвязывающих участков, где по меньшей мере два антигенсвязывающих участка иммуноспецифически связывают различные эпитопы. В настоящем документе "биспецифичное" антитело представляет собой мультиспецифичное антитело, которое содержит два или более антигенсвязывающих участков и может иммуноспецифически связывать два различных эпитопа. "Триспецифичное" антитело представляет собой мультиспецифичное антитело, которое содержит три или более антигенсвязывающих участков и может иммуноспецифически связывать три различных эпитопа, "тетраспецифичное" антитело представляет собой мультиспецифичное антитело, которое состоит из четырех или более антигенсвязывающих участков и может иммуноспецифически связывать четыре различных эпитопа, и так далее. В настоящем документе "гетеробивалентное" антитело представляет собой биспецифичное антитело, которое включает два участка связывания антигена, где антигенсвязывающие сайты иммуноспецифически связывают различные эпитопы. В настоящем документе "гомобивалентное" антитело представляет собой моноспецифическое антитело, которое включает два участка связывания антигена, где антигенсвязывающие сайты иммуноспецифически связывают один и тот же эпитоп. Гомобивалентные антитела включают, но не ограничиваются обычными полноразмерными антителами, искусственными или синтетическими полноразмерными антителами, любыми мультимерами двух одинаковых антигенсвязывающих фрагментов или мультимерами двух антигенсвязывающих фрагментов, содержащих тот же антигенсвязывающий домен. В настоящем документе домен мультимеризации относится к последовательности аминокислот, которая способствует стабильному взаимодействию полипептидной молекулы с одной или несколькими дополнительными полипептидными молекулами, каждая из которых содержит комплементарный домен мультимеризации, который может представлять собой тот же или другой домен мультимеризации, формирующий стабильный мультимер с первым доменом. Как правило, полипептид присоединен к домену мультимеризации напрямую или не напрямую. Примеры доменов мультимеризации включают последовательности иммуноглобулинов или их части, лейциновые молнии, гидрофобные фрагменты, гидрофильные фрагменты и совместимые домены, отвечающие за белок-белковые взаимодействия. Домен мультимеризации, например, может представлять собой константный домен или район иммуноглобулина, такой как, например, домен Fc или из IgG, включая IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 подтипов, IgA, IgE, IgD и IgM и их модифицированных форм, или часть указанного домена. В настоящем документе домен димеризации представляет собой домен мультимеризации, который- 14023179 способствует взаимодействию двух полипептидных последовательностей (таких как, например, цепи антитела). Домен димеризации включает, но не ограничивается, аминокислотными последовательностями, содержащими остаток цистеина, которые способствуют формированию дисульфидной связи между двумя полипептидными цепями, такими как полноразмерный шарнирный домен антитела или его часть,или одной или несколькими димеризующимися последовательностями, которые представляют собой известные последовательности аминокислот, способствующие взаимодействию между полипептидами(например, лейциновые молнии, GCN4 молнии). В настоящем документе "Fc", или "Fc район", или "Fc домен" относится к полипептиду, содержащему константный район тяжелой цепи антитела, за исключением первого домена константного района иммуноглобулина. Таким образом, Fc относится к последним двум доменам константного района иммуноглобулинов IgA, IgD и IgE или к последним трем доменам константного района иммуноглобулиновIgE и IgM. При желании район Fc может включать в себя гибкие шарнирные N-концевые районы указанных доменов или их части. Для IgA и IgM Fc может включать J-цепь. Например, домен Fc из IgG содержит иммуноглобулиновые домены С 2 и С 3, и, по желанию, шарнирный район между C1 и С 2 или его часть. Границы домена Fc могут варьировать, но обычно включают по меньшей мере часть шарнирного района. Кроме того, Fc также включает любые видовые или аллельные варианты, любые модифицированные формы, такие как любые варианты или модифицированные формы, которые характеризуются измененным связыванием с FcR или измененными Fc-опосредованными эффектерными функциями. В настоящем документе "химерный Fc" относится к химерному полипептиду, в котором один или более полипептидов связаны, напрямую или не напрямую, с доменом Fc или его производным. Как правило, химерный Fc сочетает в себе Fc домен иммуноглобулина с другим полипептидом, таким как, например, фрагмент анти-РСВ антитела. Производные полипептида Fc или модифицированные полипептиды Fc известны специалистам в данной области. В настоящем документе "домены переноса белков" или "PTD" представляет собой пептидные домены, которые могут быть конъюгированы с белком, таким как антитела по настоящему документу, для прикрепления к клетке-мишени и/или поглощения белков клеткой-мишенью. В настоящем документе "метка" или "эпитопная метка" относится к последовательности аминокислот, как правило, добавляемой к N- или С-концу полипептида, такого как антитело по настоящему документу. Включение метки, слитой с последовательностью полипептида, может быть использовано для очистки и/или обнаружения полипептида. Как правило, метка или полипептидная метка относится к полипептиду, который включает достаточное количество остатков для формирования эпитопа для антитела, и может служить для обнаружения и очистки, но в то же время является достаточно коротким, чтобы не мешать активности химерного полипептида, с которым она связана. Полипептидная метка обычно является достаточно уникальной, чтобы антитело, которое ее специфически связывает, не проявляло существенного перекрестного связывания с эпитопами полипептида, к которому она присоединена. Подходящая полипептидная метка состоит, как правило, по меньшей мере из 5 или 6 аминокислотных остатков, обычно приблизительно из 8-50 аминокислотных остатков, как правило, из 9-30 остатков. Метки могут быть связаны с одним или несколькими химерными полипептидами в мультимеры, что позволяет обнаружение мультимеров или их выделение из образца или смеси. Такие метки хорошо известны и могут быть легко синтезированы и сконструированы. Примеры полипептидных меток включают метки,которые используют для аффинной очистки, и включают His метки, полипептидную метку гемагглютинина (НА) гриппа и ее антитело 12 СА 5 (Field и др. (1988) Mol Cell. Biol. 5:2159-2165); c-myc метку и 8F9,3 С 7, 6 Е 10, G4, В 7 и 9 Е 10 антитела к ней (см., например, Evan и др. (1985) Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616) и метку гликопротеина D вируса простого герпеса (GD) и ее антитела (Paborsky и др. (1990)Protein Engineering 5:547-553 (1990. Антитела для обнаружения связанных с эпитопной меткой антител,как правило, упоминаются в настоящем документе как вторичные антитела. В настоящем документе "полипептид" относится к двум или более ковалентно соединенным аминокислотам. Термины "полипептид" и "белок" используются в настоящем документе взаимозаменяемо. В настоящем документе "пептид" относится к полипептиду, который включает от 2 до приблизительно 40 аминокислот в длину. В настоящем документе "аминокислота" представляет собой органическое соединение, содержащее аминогруппу и карбоксильную группу. Полипептид содержит две или более аминокислот. В настоящем документе аминокислоты, содержащиеся в антителах по настоящему документу, включают двадцать природных аминокислот (табл. 1), неприродные аминокислоты и аналоги аминокислот (например, аминокислоты, в которых -углерод имеет боковую цепь). В настоящем документе аминокислоты, включенные в различные аминокислотные последовательности полипептидов в настоящем документе, определяются в соответствии с их известными трехбуквенными или однобуквенными аббревиатурами (см. табл. 1). Нуклеотиды, которые включены в различные молекулы нуклеиновых кислот, и их фрагменты обозначены стандартными однобуквенными обозначениями, используемыми обычно в уровне техники. В настоящем документе "аминокислотный остаток" относится к аминокислоте, образующейся при химическом расщеплении (гидролизе) полипептида по пептидным связям. Аминокислотные остатки,- 15023179 описанные в настоящем документе, как правило, представляют собой "L" изомерные формы. Остатки в"D" изомерной форме могут быть заменены на любой L-аминокислотный остаток, пока сохраняются желаемые функциональные свойства полипептида. NH2 относится к свободной аминогруппе на аминоконце полипептида. СООН относится к свободной карбоксильной группе, присутствующей на карбоксильном конце полипептида. В соответствии со стандартной полипептидной номенклатурой, описанной в J. Biol.Chem., 243:3557-59 (1968), принятой на 37 C.F.R.1,821-1,822, сокращения аминокислотных остатков приведены в табл. 1. Таблица 1. Таблица соответствия Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков, представленные в настоящем документе в виде формулы, ориентированы слева направо в обычном направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Кроме того, термин "аминокислотный остаток" в широком смысле включает аминокислоты, перечисленные в табл. соответствия (табл. 1), модифицированные и необычные аминокислоты. Кроме того, тире в начале или в конце аминокислотной последовательности указывает на пептидную связь с дальнейшей последовательностью из одного или более аминокислотных остатков, с аминоконцевой группой, такой как NH2, или с карбоксильной группой, такой как СООН. В пептид или белок могут в целом без изменения биологической активности полученной молекулы быть введены подходящие консервативные замены аминокислот, как это известно специалистам в данной области. Специалистам в уровне техники очевидно, что, как правило, одна аминокислотная замена в несущественном районе полипептида существенно не изменяет биологическую активность (см., например, Watson и др., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub., с. 224). Такая замена может быть сделана в соответствии с табл. 2 следующим образом. Таблица 2 Другие замены также допустимы и могут быть определены эмпирически или в соответствии с другим известными консервативными или не консервативными заменами. В настоящем документе "природные аминокислоты" относятся к 20 L-аминокислотам, которые встречаются в полипептидах. Используемый здесь термин "не природные аминокислоты" относится к органическим соединениям, которые имеют структуру, похожую на природные аминокислоты, но структурно измененным, чтобы имитировать строение и реакционную способность природных аминокислот. Не природные аминокислоты, таким образом, включают, например, аминокислоты или аналоги аминокислот, отличные от 20 при- 16023179 родных аминокислот, и включают, но не ограничиваются D-изостереомерами аминокислот. Примеры не природных аминокислот известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются 2 аминоадипиновой кислотой (AaD), 3-аминоадипиновой кислотой (Baad), -аланином/-аминопропионовой кислотой (Bala), 2-аминомасляной кислотой (Abu), 4-аминомасляной кислотой/пиперидиновой кислотой (4Abu), 6-аминокапроновой кислотой (Аср), 2-аминогептановой кислотой (Ahe), 2-аминоизобутановой кислотой (Aib), 3-аминоизобутановой кислотой (Baib), 2-аминопимелиновой кислотой (Apm),2,4-диаминобутановой кислотой (Dbu), десмозином (Des), 2,2'-диаминопимелиновой кислотой (Dpm),2,3-диаминопропионовой кислотой (Dpr), N-этилглицином (EtGly), N-этиласпаранином (EtAsn), гидроксилизином (Hyl), аллогидроксилизином (Ahyl), 3-гидроксипролином (3 Нур), 4-гидроксипролином(4 Нур), изодесмозином (Ide), аллоизолейцином (Aile), N-метилглицином, саркозином (MeGly), N-метилизолейцином (MeIle), 6-N-метиллизином (MeLys), N-метилвалином (MeVal), норвалином (Nva), норлейцином (Nle) и орнитином (Orn). В настоящем документе "нативный полипептид" или "нативная нуклеиновая кислота" относится к молекуле полипептида или молекуле нуклеиновой кислоты соответственно, которые встречаются в природе. Нативный полипептид или нуклеиновая кислота может представлять собой молекулу полипептида или нуклеиновой кислоты дикого типа. Нативная молекула полипептида или нуклеиновой кислоты может представлять собой преобладающую форму полипептида или ее аллельный или другой природный вариант. Варианты полипептидов и нуклеиновых кислот по настоящему документу могут иметь модификации по сравнению с нативным полипептидом и нуклеиновой кислотой. В настоящем документе молекула полипептида или нуклеиновой кислоты дикого типа представляет собой форму, кодирующуюся геном или кодирующей последовательностью, кодируемой геном. Как правило, форма гена дикого типа, кодируемая таким образом молекула, не содержит мутации или другие модификации, которые изменяют ее функцию или структуру. Термин дикий тип также включает в себя формы с аллельными различиями, встречающимися в рамках одного вида и между видами. В настоящем документе преобладающая форма полипептида или нуклеиновой кислоты относится к форме, которая представляет собой основную форму, синтезирующуюся с гена. "Преобладающая форма" варьирует от источника к источнику. Например, различные клетки или типы ткани может продуцировать различные формы полипептидов, например, за счет альтернативного сплайсинга и/или альтернативного процессинга белка. В каждом типе клеток или тканей различные полипептиды могут представлять собой "преобладающую форму". В настоящем документе "аллельный вариант" или "аллельные различия" относятся к любой из двух или более альтернативных форм гена, занимающих тот же хромосомный локус. Аллельные различия естественно возникают в результате мутаций и могут привести к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в закодированном полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Термин"аллельный вариант" также используется здесь для обозначения белка, кодируемого аллельными вариантами гена. Обычно образцовая форма гена кодирует полипептид дикого типа и/или преобладающую форму полипептида в популяции или у одного представителя вида. Как правило, аллельные варианты,которые включают варианты между видами и внутри видов, обладают по меньшей мере 80, 85, 90, 95% или большей идентичностью аминокислотной последовательности с формой дикого типа и/или преобладающей формой у того же вида, причем степень идентичности зависит от гена и от того, является сравнение межвидовым или внутривидовым. Как правило, внутривидовые аллельные варианты обладают, по меньшей мере, приблизительно 80, 85, 90 или 95% или большей идентичностью с формой дикого типа и/или преобладающей формой, включая 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью с формой дикого типа и/или преобладающей формой полипептида. Упоминание аллельного варианта в настоящем документе обычно относится к различиям в белках между представителями одного и того же вида. Используемый здесь термин "аллель" является взаимозаменяемым с термином "аллельный вариант" и относится к альтернативным формам генов или их частей. Аллели занимают одинаковый локус или позицию в гомологичных хромосомах. Когда субъект имеет два одинаковых аллеля гена, субъект называется гомозиготным субъектом по этому гену или аллелю. Когда субъект имеет два различных аллеля гена, субъект называется гетерозиготным по гену. Аллели конкретного гена могут отличаться друг от друга одним нуклеотидом или несколькими нуклеотидами и могут включать изменения, такие как замены, делеции и вставки нуклеотидов. Аллель гена также может быть одной из форм гена, содержащей мутацию. В настоящем документе "видовой вариант" относятся к вариантам полипептида среди различных видов, включая различные виды млекопитающих, такие как мышь и человек, и видов микроорганизмов,таких как вирусы и бактерии. В настоящем документе "домен" полипептида представляет собой часть полипептида (последовательность из трех или более, как правило, 5, 10 или более аминокислот), которая является структурно и/или функционально различимой или отделимой. Пример полипептидного домена представляет собой часть полипептида, которая может самостоятельно формировать пространственную структуру в полипептиде, состоящую из одного или нескольких структурных мотивов (например, комбинации альфа- 17023179 спиралей и/или бета-цепей, связанных петлевыми фрагментами), и/или которая проявляет частичную функциональную активность, такую как ферментативная активность, способность к димеризации или связывание антигена. Полипептид может иметь один или несколько, как правило, больше одного различных доменов. Например, полипептид может иметь один или несколько структурных доменов и один или несколько функциональных доменов. Полипептидный домен может быть выделен на основе структуры и функции. Домен может включать непрерывные линейные последовательности аминокислот. Кроме того,домен может включать множество не следующих непрерывно друг за другом частей последовательности аминокислот, которые не соседствуют в линейной последовательности аминокислот полипептида. Как правило, полипептид содержит множество доменов. Например, каждая тяжелая цепь и легкая цепь каждой молекулы антитела содержит множество иммуноглобулиновых (Ig) доменов, каждый из которых включает приблизительно 110 аминокислот в длину. Специалистам в данной области очевидно понятие полипептидного домена, и домены могут быть определены в силу их структурной и/или функциональной гомологии с другими такими доменами. Определения в настоящем документе даны в иллюстративных целях, но подразумевается, что специалист в данной области может определить конкретные домены. При необходимости для определения доменов может быть использовано соответствующее программное обеспечение. В настоящем документе функциональный район полипептида представляет собой район полипептида, который содержит по меньшей мере один функциональный домен (который осуществляет ту или иную функцию, такую как способность взаимодействовать с биомолекулами, например связывать антиген, связывать ДНК, связывать лиганд, димеризоваться, или проявляет ферментативную активность, например киназную или протеолитическую активность), примеры функциональных районов полипептидов представляют собой домены антител, такие как VH, VL, CH, CL, и их части, например, CDR, включаяCDR1, CDR2 и CDR3, или антигенсвязывающие фрагменты, такие как районы связывания антител. В настоящем документе структурный район полипептида представляет собой район полипептида,который содержит хотя бы один структурный домен. В настоящем документе район полинуклеотида представляет собой часть полинуклеотида, содержащую два или более, как правило, по меньшей мере шесть или более, как правило, десять или более смежных нуклеотидов, например, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или более нуклеотидов полинуклеотида, но не обязательно все нуклеотиды, которые составляют полинуклеотид. В настоящем документе "свойство" полипептида, такого как антитело, относится к любому свойству, проявляемому полипептидом, включая, но не ограничиваясь специфичностью связывания, структурной конфигурацией или конформацией белка, стабильностью, устойчивостью к протеолизу, конформационной стабильностью, тепловой стабильностью и рН стабильностью. Изменения свойств могут изменить "активность" полипептида. Например, изменения специфичности связывания антитела может изменить способность к связыванию антигена, и/или различных свойств связывания, таких как аффинность или авидность, либо активности полипептида in vivo. В настоящем документе "активность" или "функциональная активность" полипептида, такого как антитело, относится к любой активности, проявляемой полипептидом. Такая активность может быть определена эмпирически. Примеры активности включают, но не ограничиваются способностью взаимодействовать с биомолекулами, например, связывать антиген, связывать ДНК, связывать лиганд, димеризоваться, или ферментативной активностью, например киназной или протеолитической активностью. Для антител (включая фрагменты антител) активность включает, но не ограничивается возможностью специфически связывать определенный антиген, аффинностью связывания антигена (например, высокой или низкой аффинностью), авидностью связывания антигена (например, высокой или низкой авидностью),скоростью присоединения, скоростью диссоциации, эффекторными функциями, такими как способность содействовать нейтрализации антигена или клиренсу, нейтрализации вируса и активностью in vivo, такой как способность предотвращать инфекцию или инвазию патогена, либо содействовать клиренсу, либо проникать в определенную ткань, или жидкость, или клетки в организме. Активность можно оценить invitro или in vivo с применением известных анализов, таких как ИФА, проточная цитометрия, поверхностный плазмонный резонанс, или эквивалентных анализов для измерения скорости связывания или скорости диссоциации, иммуногистохимии и иммунофлуоресцентной гистологии и микроскопии, клеточных анализов, проточной цитометрии и анализов связывания (например, пэннинга - связывания анализируемых антител с сорбентом или подложкой с иммобилизованным лигандом). Например, для антител активность может быть оценена путем измерения аффинности, авидности и/или коэффициентов связывания (например, скоростей связывания/диссоциации), и других параметров in vitro или путем измерения различных эффектов in vivo, таких как иммунные эффекты, например, клиренс антигена, проникновение или локализация антител в тканях, защиты от заболевания, например, инфекции, титр антител в сыворотке или других жидкостях или другие анализы, которые хорошо известны в данной области. Результаты указанных тестов, которые показывают, что полипептид проявляет активность, могут коррелировать с активностью полипептида in vivo, где активность in vivo может быть отнесена к терапевтической активности или биологической активности. Активность модифицированного полипептида может составлять- 18023179 любую величину относительно активности не модифицированного полипептида, включая, но не ограничиваясь, 1% активности, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100,200, 300, 400, 500% или большей активностью по сравнению с не модифицированным полипептидом. Тесты для определения функциональности или активности модифицированных антител (например, вариантов по изобретению) хорошо известны в уровне техники. Используемый в настоящем документе термин "терапевтическая активность" относится к активности терапевтического полипептида in vivo. Как правило, терапевтическая активность представляет собой активность, которая используется для лечения заболевания или патологических состояний. Терапевтическая активность модифицированного полипептида может составлять любую величину относительно терапевтической активности не модифицированного полипептида, включая, но не ограничиваясь, 1% активности, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400,500% или большей терапевтической активностью по сравнению с не модифицированным полипептидом. В настоящем документе фраза "проявляет по меньшей мере один вид активности" или "сохраняет по меньшей мере один вид активности" относится к активности, проявляемой модифицированным полипептидом, таким как вариант полипептида, полученный в соответствии с предусмотренными способами,такой как модифицированное антитело, например вариант антитела, или другой терапевтический полипептид (например, модифицированное анти-РСВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), по сравнению с целевым или не модифицированным полипептидом, который не содержит модификаций. Модифицированный полипептид или вариант полипептида, который сохраняет активность целевого полипептида, может обладать улучшенной активностью или сохранять активность не модифицированного полипептида. В некоторых случаях модифицированный полипептид или вариант полипептида может проявлять увеличенную активность по сравнению с целевым или не модифицированным полипептидом. В некоторых случаях модифицированный полипептид или вариант полипептида может проявлять активность, уменьшенную по сравнению с не модифицированным или целевым полипептидом. Активность модифицированного полипептида или варианта полипептида может составлять любую величину относительно активности не модифицированного или целевого полипептида, включая, но не ограничиваясь, 1% активности, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400,500% или большей активностью по сравнению с не модифицированным или целевым полипептидом. В других вариантах изменение активности может составлять по меньшей мере приблизительно 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз, 100 раз, 200 раз, 300 раз, 400 раз, 500 раз, 600 раз, 700 раз, 800 раз, 900 раз, 1000 раз или более по сравнению с не модифицированным или целевым полипептидом. Анализы для определения сохраняемой активности зависят от активности, которую необходимо определить. Такие анализы могут быть проведены in vitro или in vivo. Активность может быть измерена, например, с помощью известных и описанных в приведенных ниже примерах анализов активности, включая, но не ограничиваясь, ИФА и пэннингом. Активность модифицированного полипептида или варианта полипептида по сравнению с не модифицированным или целевым полипептидом также может быть оценена как терапевтическая или биологическая активность in vivo или как результат после введения полипептида. Используемый в настоящем документе термин "оценка" относятся к качественному и количественному определению абсолютного значения активности полипептида или его домена, присутствующего в образце, а также к получению индекса, коэффициента, процента, визуального показателя или другого показателя уровня активности. Оценка может быть прямой или косвенной, например, обнаружение расщепления субстрата может осуществляться не прямым измерением продукта, а косвенным путем, например, через определение его производных или других веществ. Например, обнаружение продукта расщепления белка системы комплемента может быть проведено с помощью SDS-PAGE и окрашивания белков Кумасси синим. Используемый в настоящем документе термин "нуклеиновая кислота" означает по меньшей мере два связанных нуклеотида или производных нуклеотидов, соединенных вместе, как правило, фосфодиэфирной связью, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Кроме того, в понятие "нуклеиновая кислота" включены аналоги нуклеиновых кислот, такие как пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), фосфоротиоатная ДНК и другие подобные аналоги и производные или их комбинации. Нуклеиновые кислоты также включают ДНК и РНК, содержащие производные, например, аналоги нуклеотидов, или отличные от фосфодиэфирной связи в скелете молекулы, например, фосфотриэфирные связи, фосфоамидатные связи, фосфоротиоатные связи, тиоэфирные связи или пептидные связи (в пептидных нуклеиновых кислотах). Этот термин также включает в себя эквиваленты, производные, варианты и аналоги молекул РНК или ДНК из аналогов нуклеотидов, одноцепочечные (смысловые или антисмысловые) и двухцепочечные нуклеиновые кислоты. Дезоксирибонуклеотиды включают дезоксиаденозин, дезоксицитидин, дезоксигуанозин и дезокситимидин. Для РНК урациловое основание представляет собой уридин. Нуклеиновые кислоты могут содержать аналоги нуклеотидов, включая, например, нуклеотиды с измененной массой, которые позволяют дифференцировать молекулы нуклеиновых кислот по массе,нуклеотиды, содержащие обнаруживаемые метки, такие как люминесцентные, радиоактивные, люминес- 19023179 центные или хемилюминесцентные метки, которые позволяют определять молекулы нуклеиновых кислот, или нуклеотиды, содержащие реактивные группы, такие как биотин или тиоловые группы, что способствует иммобилизации молекул нуклеиновой кислоты на твердом носителе. Нуклеиновые кислоты также могут содержать одну или несколько связей в скелете, которые являются селективно расщепляемыми, например, химически, ферментативно или фотолитически расщепляемыми. Так, например, нуклеиновые кислоты могут включать один или несколько дезоксирибонуклеотидов, а затем один или несколько рибонуклеотидов, за которыми могут следовать один или более дезоксирибонуклеотидов, такая последовательность является расщепляемой по рибонуклеотидной последовательности при щелочном гидролизе. Нуклеиновые кислоты также могут содержать одну или несколько связей, которые относительно устойчивы к расщеплению, например, химерный олигонуклеотидный праймер может включать нуклеотиды, связанные пептидными связями, и по меньшей мере один нуклеотид на 3'-конце, связанный фосфодиэфирной или другой подходящей связью, который может быть использован для элонгации полимеразой. Последовательности пептидных нуклеиновых кислот могут быть получены известными методами (см., например, Weiler и др. (1997), Nucleic Acids Res. 25:2792-2799). Используемый в настоящем документе термин "полинуклеотид" и "молекула нуклеиновой кислоты" относится к олигомеру или полимеру, содержащему по меньшей мере два связанных нуклеотида или производных нуклеотидов, соединенных вместе, как правило, фосфодиэфирной связью, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Полинуклеотиды также включают ДНК и РНК, содержащие производные, например аналоги нуклеотидов, или отличные от фосфодиэфирной связи в скелете молекулы, например фосфотриэфирные связи, фосфоамидатные связи, фосфоротиоатные связи, тиоэфирные связи или пептидные связи (в пептидных нуклеиновых кислотах). Полинуклеотиды (молекулы нуклеиновых кислот) включают одноцепочечные и/или двухцепочечные полинуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК), а также аналоги или производные РНК или ДНК. Этот термин также включает в себя эквиваленты, производные, варианты и аналоги молекул РНК или ДНК из аналогов нуклеотидов, одноцепочечные (смысловые или антисмысловые) и двухцепочечные нуклеиновые кислоты. Дезоксирибонуклеотиды включают дезоксиаденозин, дезоксицитидин, дезоксигуанозин и дезокситимидин. Для РНК урациловое основание представляет собой уридин. Полинуклеотиды могут содержать аналоги нуклеотидов, включая, например,нуклеотиды с измененной массой, которые позволяют дифференцировать полинуклеотиды по массе,нуклеотиды, содержащие обнаруживаемые метки, такие как люминесцентные, радиоактивные, люминесцентные или хемилюминесцентные метки, которые позволяют определять полинуклеотиды, или нуклеотиды, содержащие реактивные группы, такие как биотин или тиоловые группы, что способствует иммобилизации полинуклеотидов на твердом носителе. Полинуклеотиды также могут содержать одну или несколько связей в скелете, которые являются селективно расщепляемыми, например, химически, ферментативно или фотолитически расщепляемыми. Так, например, полинуклеотиды могут включать один или несколько дезоксирибонуклеотидов, а затем один или несколько рибонуклеотидов, за которыми могут следовать один или более дезоксирибонуклеотидов, такая последовательность является расщепляемой по рибонуклеотидной последовательности при щелочном гидролизе. Полинуклеотиды также могут содержать одну или несколько связей, которые относительно устойчивы к расщеплению, например, химерный олигонуклеотидный праймер может включать нуклеотиды, связанные пептидными связями, и по меньшей мере один нуклеотид на 3'-конце, связанный фосфодиэфирной или другой подходящей связью,который может быть использован для элонгации полимеразой. Последовательности пептидных нуклеиновых кислот могут быть получены известными методами (см., например, Weiler и др. (1997), NucleicAcids Res. 25:2792-2799). Примеры молекул нуклеиновых кислот (полинуклеотидов), предусмотренных в настоящем документе, представляют собой олигонуклеотиды, включая синтетические олигонуклеотиды,олигонуклеотидные дуплексы, праймеры, включая праймеры заполнения (fill-in primers), и олигонуклеотидные дуплексные кассеты. В настоящем документе "ДНК конструкции" представляет собой одноцепочечные или двуцепочечные, линейные или кольцевые молекулы ДНК, которые содержат сегменты ДНК, объединенные и составленные в порядке, не встречающемся в природе. Конструкции ДНК являются результатом человеческой манипуляции и включают в себя клоны и другие копии используемых молекул. В настоящем документе "сегмент ДНК" представляет собой часть более длинной молекулы ДНК с заданными свойствами. Например, сегмент ДНК, кодирующий указанный полипептид, представляет собой часть более длинной молекулы ДНК, такой как плазмида или фрагмент плазмиды, который при чтении в направлении от 5' к 3' кодирует последовательность аминокислот указанного полипептида. В настоящем документе полинуклеотидная плюс-цепь относится к "смысловой цепи" полинуклеотидного дуплекса, которая комплементарна минус-цепи или "антисмысловой" цепи. В случае полинуклеотидов, кодирующих гены, смысловая цепь представляет собой цепь, которая идентична цепи мРНК,которая транслируется в полипептид, а антисмысловая цепь комплементарна этой цепи. Плюс-цепь и минус-цепь дуплекса комплементарны. В настоящем документе генетический элемент относится к гену или любому его району, которые кодируют полипептид, или белок, или его фрагмент. В некоторых примерах генетический элемент коди- 20023179 рует белок слияния. В настоящем документе регуляторный район молекулы нуклеиновой кислоты относится к цисдействующей нуклеотидной последовательности, которая влияет на экспрессию оперативно связанного гена, положительно или отрицательно. Регуляторные районы включают последовательности нуклеотидов, которые обеспечивают индуцибельную экспрессию гена (например, требующую вещества или стимула для увеличения транскрипции). Когда индуктор присутствует в среде или при повышении его концентрации в среде, может быть увеличена экспрессия гена. Регуляторные районы также включают последовательности, которые подавляют экспрессию генов (то есть вещество или стимул уменьшают транскрипцию). Когда репрессор присутствует в среде или при повышении его концентрации в среде, экспрессия гена может быть уменьшена. Регуляторные районы влияют, изменяют и контролируют многие биологические процессы in vivo, включая пролиферацию клеток, клеточный рост и гибель, дифференцировку клеток и модуляцию иммунной системы. Регуляторные районы, как правило, связываются с одним или более транс-действующими белками, что приводит к увеличению или уменьшению транскрипции гена. Конкретные примеры регуляторных районов генов включают промоторы и энхансеры. Промоторы представляют собой последовательности, расположенные вокруг места старта транскрипции или трансляции, как правило, к 5' концу от сайта начала трансляции. Промоторы обычно расположены в пределах 1 Кб от сайта начала трансляции, но могут быть расположены дальше, например, на расстоянии 2, 3, 4, 5 Кб и более, вплоть до 10 Кб. Энхансеры влияют на экспрессию генов, когда расположены к 5' и 3' концу от гена, находясь на расстоянии от гена или в экзоне или интроне. Энхансеры также могут функционировать, находясь на значительном расстоянии от гена, например, на расстоянии 3, 5, 7, 10, 15 Кб и более. Регуляторные районы также включают, в дополнение к промоторам, последовательности, которые облегчают трансляцию, сигналы сплайсинга для интронов, обеспечивающие правильную рамку считывания гена для трансляции мРНК, стоп-кодоны, лидерные последовательности и последовательности слитого белка-партнера, внутренний сайт связывания рибосомы (IRES) для создания мультигенного или полицистронного транскрипта, сигналы полиаденилирования, обеспечивающие надлежащее полиаденилирование транскрипта интересующего гена, и стоп-кодоны, и могут быть дополнительно включены в вектор экспрессии. В настоящем документе термин "функционально связанный", употребляемый в отношении последовательности нуклеиновой кислоты, районов, фрагментов или доменов, означает, что фрагменты нуклеиновой кислоты функционально связаны друг с другом. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая лидерный пептид, может быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, так что нуклеиновая кислота может быть транскрибирована и транслирована с образованием функционального белка слияния, в котором лидерный пептид вызывает секрецию полипептида слияния. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота, кодирующая первый полипептид (например, лидерный пептид), функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей второй полипептид, и нуклеиновые кислоты транскрибируются как одна молекула мРНК, но трансляция мРНК может привести к одному из двух полипептидов. Например, нонсенс стоп-кодон может быть расположен между нуклеиновой кислотой, кодирующей первый полипептид, и нуклеиновой кислотой, кодирующей второй полипептид, так что при введении в частично супрессирующие нонсен стоп-кодоны клетки полученный транскрипт мРНК может быть транслирован с получением белка слияния, содержащим первый и второй полипептиды, или может быть транслирована с получением только первого полипептида. В другом примере промотор может быть функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, в результате чего промотор регулирует или направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты. В настоящем документе термин "синтетический", упомянутый в отношении, например, молекулы нуклеиновой кислоты, или гена, или пептида, относится к молекуле нуклеиновой кислоты или молекуле полипептида, которая получена рекомбинантными методами и/или методами химического синтеза. В настоящем документе получение рекомбинантными методами с помощью методов рекомбинантной ДНК означает применение известных методов молекулярной биологии для экспрессии белков, кодируемых клонированной ДНК. В настоящем документе "экспрессия" относится к процессу, при котором полипептиды получают транскрипцией и трансляцией полинуклеотидов. Уровень экспрессии полипептида можно оценить, используя любой метод, известный в уровне техники, включая, например, методы определения количества полипептида, получаемого в клетках-хозяевах. Такие методы включают, но не ограничиваются количественным определением полипептида в клеточном лизате с помощью ИФА, гель-электрофореза с последующим окрашиванием Кумасси синим, определением белка по методу Лоури и определением белка по методу Брэдфорд. В настоящем документе "клетка-хозяин" представляет собой клетку, которая используется для получения, сохранения и амплификации вектора. Клетки-хозяева могут быть использованы для экспрессии полипептида, кодируемого вектором. Нуклеиновая кислота, содержащаяся в векторе, реплицируется при делении клетки-хозяина, тем самым амплифицируя нуклеиновую кислоту. В одном примере клеткахозяин представляет собой "упаковку" для гена, которая при индукции может экспрессировать вариант- 21023179 полипептида на ее поверхности. В другом примере клетка-хозяин заражена "упаковкой" для гена. Например, клетка-хозяин может представлять собой клетку-хозяина для фагового дисплея, которая может быть трансформирована фаговым или фагмидным вектором, и может быть использована для упаковки фага, экспрессирующего белки слияния, содержащие варианты полипептидов. В настоящем документе "вектор" представляет собой реплицируемую нуклеиновую кислоту, с помощью которой при трансформации вектора в соответствующую клетку-хозяина могут быть экспрессированы один или более гетерологичных белков. Упоминание вектора включает в себя вектора, в которые может быть введена нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид или его фрагмент, как правило, с помощью рестриктного расщепления и лигирования. Упоминание вектора также включает вектора, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид. Вектор используется для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, в клетку-хозяина для амплификации нуклеиновой кислоты или экспрессии/дисплея полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. Векторы обычно остаются в эписомном состоянии, но могут быть предназначены для интеграции гена или его части в хромосому генома. Также предусмотрены векторы, которые представляют собой искусственные хромосомы,такие как искусственные хромосомы дрожжей и искусственные хромосомы млекопитающих. Выбор и применение таких носителей хорошо известны специалистам в данной области. В настоящем документе вектор включает также "вирусный вектор". Вирусные векторы представляют собой искусственные вирусы, которые оперативно связаны с экзогенными генами для переноса (как носители или челноки) экзогенных генов в клетки. В настоящем документе "вектор экспрессии" включает вектора, способные экспрессировать ДНК,которая оперативно связана с регуляторными последовательностями, например, промоторным районом,которые способны осуществлять экспрессию таких фрагментов ДНК. Дополнительные последовательности могут включать промотор и терминатор и, по желанию, могут включать один или несколько ориджинов репликации, один или нескольких селективных маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и тому подобное. Вектора экспрессии обычно являются производными плазмиды или вирусной ДНК или могут содержать элементы того и другого. Таким образом, вектор экспрессии относится к рекомбинантной ДНК или РНК конструкции, такой как плазмида, фаг, рекомбинантный вирус или другой вектор,которая при введении в соответствующую клетку-хозяина приводит к экспрессии клонированной ДНК. Соответствующие вектора экспрессии хорошо известны специалистам в данной области и включают вектора, которые реплицируются в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках, вектора,которые остаются в эписомном состоянии, и вектора, которые интегрируются в геном клетки-хозяина. Олигонуклеотиды представляют собой полинуклеотиды, которые содержат ограниченное число нуклеотидов в длину. Специалисту в данной области очевидно, что длина олигонуклеотида составляет,как правило, менее чем приблизительно двести пятьдесят, как правило, менее чем приблизительно двести, как правило, менее чем приблизительно сто нуклеотидов. Как правило, предусмотренные в настоящем документе олигонуклеотиды представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Синтетические олигонуклеотиды содержат менее чем приблизительно 250 или 200 нуклеотидов в длину, например, менее 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 нуклеотидов в длину. Как правило, олигонуклеотиды представляют собой одноцепочечные олигонуклеотид. Окончание"-мер" может быть использовано для обозначения длины олигонуклеотида. Например, понятие "100-мер" может быть использовано для обозначения олигонуклеотида, содержащего 100 нуклеотидов в длину. Примеры синтетических олигонуклеотидов, предусмотренных в настоящем документе, включают цепи олигонуклеотидов, кодирующие часть плюс-цепи и минус-цепи, рандомизированные олигонуклеотиды,олигонуклеотиды сравнения, матричные олигонуклеотиды и праймеры заполнения. В настоящем документе синтетические олигонуклеотиды представляют собой олигонуклеотиды,полученные путем химического синтеза. Химические способы синтеза олигонуклеотидов хорошо известны. Для получения олигонуклеотидов, разработанных и использованных в предусмотренных методах, могут быть использованы любые из известных методов синтеза. Например, синтетические олигонуклеотиды обычно получают химическим присоединением одиночных нуклеотидных мономеров или нуклеотидных триммеров, содержащих защитные группы. Как правило, в реакцию вводят по одному фосфорамидиту нуклеотида, содержащему защитные группы. Синтез обычно начинают с 3'-конца олигонуклеотида. 3'-Концевой фосфорамидит прикреплен к твердой поддержке, и синтез проводят, присоединяя каждый следующий фосфорамидит к 5'-концу предыдущего. После каждой реакции присоединения с 5'-фосфатной группой самого последнего основания удаляют защитную группу, что позволяет присоединить следующий фосфорамидит. Автоматизированные синтезаторы, как правило, могут синтезировать олигонуклеотиды до приблизительно 150-200 нуклеотидов в длину. Как правило, для получения олигонуклеотидов, разработанных и использованных в предусмотренных методах, применяли стандартную цианоэтильную реакцию фосфорамидитов мономеров. Синтетические олигонуклеотиды, полученные указанным стандартным методом, можно приобрести в Integrated DNA Technologies (IDT) (Coralville, IA) или TriLink Biotechnologies (San Diego, CA). В настоящем документе "праймер" относится к молекуле нуклеиновой кислоты (что более типично,к популяции таких молекул с идентичными последовательностями), которая может выступать в качестве- 22023179 точки начала матричного синтеза нуклеиновых кислот при соответствующих условиях (например, в при наличии четырех разных нуклеозидтрифосфатов и полимеризующего агента, такого как ДНКполимераза, РНК-полимераза или обратная транскриптаза) в соответствующем буфере и при подходящей температуре. Следует иметь в виду, что определенные молекулы нуклеиновых кислот могут служить"зондом" и "праймером". Праймер обладает 3' гидроксильной группой для удлинения. Праймер можно использовать в различных методах, включая, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), RT-ПЦР(ПЦР с обратной транскриптазой), ПЦР на РНК. ЛЦР, мультиплексную ПЦР, супрессионную ПЦР, ПЦР с захватом, ПЦР с экспрессией, 3' и 5' RACE (быстрая амплификация концов кДНК), ПЦР in situ, ПЦР с лигированием и другие способы амплификации. Используемый в настоящем документе термин "пары праймеров" относится к набору праймеров,который включает 5' праймер (прямой), который гибридизуется с 5' концом амплифицируемой (например, методом ПЦР) последовательности, и 3' праймер (обратный), который гибридизуется с 3' концом амплифицируемой последовательности. Посколько "праймер" может относиться к популяции одинаковых молекул нуклеиновой кислоты, пара праймеров обычно представляет собой пару из двух популяций праймеров. В настоящем документе термины "один праймер" и "одна популяция праймеров" являются синонимами и относятся к популяции молекул праймера, где все праймеры популяции имеют сходные последовательности, например к популяции праймеров, в которой последовательности праймеров по меньшей мере приблизительно на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны. Праймеры из одной популяции (обладающие сходными последовательностями) выступают в качестве 5' (прямого) праймера (специфически гибридизуются с 5' концом амплифицируемой (например, с помощью ПЦР) последовательности), а также 3' (обратного) праймера (специфически гибридизуются с 3' концом амплифицируемой последовательность). Таким образом, один праймер может быть использован без других праймеров для затравления синтеза комплементарных нитей и амплификации нуклеиновой кислоты в полимеразной реакции амплификации. В настоящем документе термин "комплементарность", употребленный в отношении двух нуклеотидов, относится к способности двух нуклеотидов образовывать пару друг с другом при гибридизации двух молекул нуклеиновых кислот. Две молекулы нуклеиновых кислот, проявляющие комплементарность,называются комплементарными молекулами нуклеиновой кислоты, примером комплементарных молекул нуклеиновых кислот являются плюс-цепь и минус-цепь в полинуклеотидном дуплексе. В настоящем документе, если молекула нуклеиновой кислоты или ее фрагмент комплементарны другой молекуле нуклеиновой кислоты или ее фрагменту, то молекулы и фрагменты специфически гибридизуются друг с другом. Две комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть описаны в терминах процентов комплементарности. Например, две молекулы нуклеиновой кислоты, по 100 нуклеотидов в длину каждая, которые специфически гибридизуются друг с другом, но содержат 5 не комплементарных оснований по отношению друг к другу, комплементарны на 95%. Для двух молекул нуклеиновых кислот гибридизация со 100% комплементарностью не обязательно требует, чтобы комплементарность имела место по всей длине обеих молекул. Например, молекула нуклеиновой кислоты, содержащая 20 нуклеотидов в длину, может специфически гибридизоваться с частью второй молекулы нуклеиновой кислоты из 20 непрерывно расположенных нуклеотидов, где вторая молекула содержит 500 нуклеотидов в длину. Если в пределах содержащей 20 нуклеотидов части молекулы отсутствуют не комплементарные нуклеотиды,молекула, содержащая 20 нуклеотидов, гибридизуется со 100% комплементарностью. Как правило, комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты выравниваются с менее чем 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1% несоответствия между комплементарными нуклеотидами (другими словами, обладают по меньшей мере приблизительно 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% комплементарностью). В другом примере комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты обладают приблизительно по меньшей мере 50, 55, 60, 65,70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% комплементарностью. В одном из примеров комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты содержат менее 5, 4, 3, 2 или 1 не комплементарных нуклеотидов. В одном из примеров комплементарные нуклеотиды комплементарны на 100%. При необходимости процент комплементарности может быть указан. Как правило, две молекулы выбраны так, что они специфически гибридизуются в жестких условиях. В настоящем документе комплементарная цепь молекулы нуклеиновой кислоты относится к последовательности нуклеотидов, например молекуле нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, такой как вторая молекула нуклеиновой кислоты в полинуклеотидном дуплексе. Например, в полинуклеотидном дуплексе олигонуклеотид, комплементарный плюсцепи, представляет собой минус-цепь, которая специфически гибридизуется с плюс-цепью в дуплексе. В одном из примеров в предусмотренных в настоящем документе способах для синтеза комплементарных цепей нуклеотидов для получения дуплексов используют полимеразную реакцию, как правило, начинающуюся с гибридизации олигонуклеотидных праймеров с полинуклеотидом. В настоящем документе термин "специфически гибридизуется" относится к отжигу молекулы нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотида или полинуклеотида) за счет спаривания комплементарных оснований на другую молекулу нуклеиновой кислоты. Специалистам в данной области известны- 23023179 параметры in vitro и in vivo, которые влияют на специфичность гибридизации, такие как длина и состав конкретной молекулы. Параметры, особенно значимые для гибридизации in vitro, также включают температуры отжига и отмывания, состав буфера и концентрации соли. Для специфической гибридизации двух молекул нуклеиновой кислоты не обязательно наличие 100% комплементарности указанных молекул. Например, две комплементарных молекулы нуклеиновых кислот с комплементарностью последовательностей, например, приблизительно по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 или 50% могут специфически гибридизоваться друг с другом. Чтобы изменить процент комплементарности, необходимый для конкретной гибридизации двух молекул нуклеиновых кислот, параметры, используемые в гибридизации in vitro по настоящему документу, например компоненты буфера, время и температура, могут быть скорректированы по строгости. Специалист в данной области может легко скорректировать эти параметры для достижения специфической гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, подходящей для конкретного применения. В настоящем документе "первичная последовательность" относится к последовательности аминокислотных остатков в полипептиде или последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты. В настоящем документе "сходство" между двумя белками или нуклеиновыми кислотами относится к близости аминокислотных последовательностей белков или нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот. Сходство может быть основано на степени идентичности и/или гомологии последовательностей остатков и идентичности и/или гомологии остатков, содержащихся в последовательностях. Способы оценки степени сходства белков или нуклеиновых кислот известны специалистам в данной области. Например, в одном способе оценки сходства последовательностей две аминокислотные или нуклеотидные последовательности выравнивают таким образом, чтобы достичь максимального уровня идентичности между последовательностями. "Идентичность" относится к степени, в которой аминокислотные или нуклеотидные последовательности инвариантны. При выравнивании аминокислотных последовательностей и, в некоторой степени, последовательностей нуклеотидов также можно принять во внимание консервативные различия и/или частые замены аминокислот (или нуклеотидов). Консервативными различиями являются те, при которых сохраняются физико-химические свойства участвующих остатков. Выравнивание может быть глобальным (выравнивание сравниваемых последовательностей по всей длине последовательностей и по всем остаткам) или локальным (выравнивание частей последовательностей, которые включают только наиболее близкий район или районы). В настоящем документе, если полипептид или молекула нуклеиновой кислоты или ее фрагмент обладает или характеризуется "идентичностью" или "гомологией" с другим полипептидом или молекулой нуклеиновой кислоты или ее фрагментом, то две молекулы и/или фрагмента обладают идентичностью последовательности, большей или равной приблизительно 40%, как правило, большей или равной по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере приблизительно 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью последовательности; точный процент идентичности может быть указан, если это необходимо. Молекула нуклеиновой кислоты, или ее район, идентичные или гомологичные второй молекуле нуклеиновой кислоты или ее фрагменту, могут специфически гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты или фрагментом, которые на 100% комплементарны второй молекуле нуклеиновой кислоты или ее фрагменту. Альтернативно процент идентичности можно определять между двумя теоретическими нуклеотидными или аминокислотными последовательностями или между нуклеиновой кислотой или полипептидной молекулой и теоретической последовательностью."Идентичность" в настоящем документе имеет значение, принятое в данной области техники, и процент идентичности двух молекул нуклеиновых кислот или полипептидов, или их фрагментов может быть рассчитан на основе известных из литературы способов. Процент идентичности может быть определен для полной длины полипептида или полинуклеотида или для районов молекул (см., например,Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., изд, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov,M. and Devereux, J., изд., М Stockton Press, New York, 1991). Хотя существует множество способов определения идентичности двух полинуклеотидов или полипептидов, термин "идентичность" хорошо известен квалифицированному специалисту (Carillo, H.Lipton, D., SUM J Applied Math 48:1073 (1988. Идентичность последовательности при сравнении двух полинуклеотидов или полипептидов по всей длине означает процент одинаковых нуклеотидов или аминокислотных остатков по всей длине молекулы. Например, если полипептид А имеет 100 аминокислот в длину, а полипептид В имеет 95 аминокислот, которые являются идентичными аминокислотами 1-95 полипептида А, то полипептид В обладает 95% идентичностью при сравнении идентичности последовательности полипептида А по всей длине с последовательностью полипептида В по всей длине. Альтернативно, идентичность последовательностей полипептида А и полипептида В можно сравнить по фрагменту, такому как фрагмент из 20 аминокислот каждого полипептида. В этом случае, если полипептиды А и В имеют 20 идентичных аминокислот в рас- 24023179 сматриваемом фрагменте, идентичность последовательности для фрагментов составляет 100%. Альтернативно, идентичность последовательности можно определять по длине молекулы по сравнению с районом другой молекулы. Альтернативно, идентичность последовательностей полипептида А и полипептида В можно сравнивать по фрагментам одинаковой длины, но с учетом наличия консервативных аминокислотных замен или неконсервативных аминокислотных замен. Как будет показано ниже и как известно специалистам в данной области, доступно множество различных программ и методов оценки идентичности. Высокий уровень идентичности, такой как 90 или 95%, легко может быть определен без программного обеспечения. Обладают ли любые две молекулы нуклеотидными последовательностями или аминокислотными последовательностями, которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% "идентичны" или"гомологичны", может быть определено с помощью известных алгоритмов, таких как программа FASTA,с использованием, например, параметров по умолчанию, как описано Pearson и др. (1988) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85:2444 (другие программы включают пакет программ GCG (Devereux, J. и др., NucleicSIAM J Applied Math 48:1073). Например, функция BLAST базы данных Национального центра биотехнологической информации может быть использована для определения идентичности. Другие коммерчески доступные или общедоступные программы включают программу DNAStar "MegAlign" (Madison,Висконсин) и программу "Gap" генетической компьютерной группой университета Висконсина University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) (Madison, Висконсин). Процент гомологии или идентичности белков и/или молекул нуклеиновых кислот может быть определен, например, путем сравнения информации о последовательностях с использованием программы GAP (см., например, Needleman и др.,J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с изменениями, внесенными Smith и Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981. Программа GAP определяет сходство как число выровненных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), которые являются одинаковыми, деленное на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для совпадения и 0 для не совпадения) и взвешенную матрицу сравнения Gribskov и др., Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), как описано Schwartz и Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, c. 353-358 (1979); (2) штраф в размере 3,0 для каждого разрыва в последовательности, дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом разрыве и (3) штраф не применяется для разрывов в концах последовательности. В общем, для определения процента гомологии или идентичности последовательности выравнивают для достижения наибольшего сходства (см., например, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.,изд., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.,изд., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., и Griffin,H.G., изд., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. и Devereux, J., изд., М Stockton Press, NewYork, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). По отношению к гомологии последовательностей количество консервативных аминокислот определяют с помощью стандартных программ с алгоритмами выравнивания, использующих выбранные по умолчанию штрафы за разрыв в последовательности, установленные разработчиком. Существенно гомологичные молекулы нуклеиновых кислот обычно гибридизуются в умеренных условиях или в жестких условиях по всей длине интересующей молекулы нуклеиновой кислоты. Также предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодона в гибридизуемой молекуле нуклеиновой кислоты. Таким образом, используемый здесь термин "идентичность", выраженный в виде числового значения, относится к сравнению двух полипептидов или полинуклеотидов, их районов и/или двух, теоретических последовательностей нуклеотидов или аминокислот. Используемый здесь термин по меньшей мере "на 90% идентичны" относится к идентичности последовательности от 90 до 99,99% по отношению к образцовой нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности полипептида. Принимая для иллюстративных целей длину исследуемого и образцового полипептидов за 100 аминокислот, идентичность на уровне 90% и более свидетельствует о том, что не более чем 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот в исследуемом полипептиде отличаются от образцового полипептида. Подобные сравнения можно провести между исследуемым и начальным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены в виде точечных мутаций, случайно распределенных по всей длине аминокислотной последовательности, или различия могут быть сосредоточены в одном или нескольких местах различной длины вплоть до максимально допустимой, например, длины 10 различающихся аминокислот из 100 (около 90% идентичности). Различия определяются как замены, вставки и удаления в нуклеиновых кислотах и последовательностях аминокислот. При уровне гомологии или идентичности выше приблизительно 8590% результат не должен зависеть от программы и параметров штрафа за разрыв, такие высокие уровни идентичности могут быть легко оценены часто вручную без использования программного обеспечения. В настоящем документе "выравнивание последовательности" относится к использованию гомологии (сходства и/или идентичности) для выравнивания соответствующих позиций в последовательности- 25023179 нуклеотидов или аминокислот. Как правило, две или более последовательности, которые связаны 50% и большей идентичностью, выравниваются. Выровненное множество последовательностей относится к 2 или более последовательностям, которые являются выровненными в соответствующих позициях, и может включать выравнивание последовательностей, полученных из РНК, таких как EST и другие кДНК, с последовательностью геномной ДНК. Близкие полипептиды или молекулы нуклеиновых кислот или варианты полипептидов или молекул нуклеиновых кислот могут быть выровнены любым способом, известным специалистам в данной области. Такие способы обычно позволяют выровнить последовательности с достижением максимального количества совпадений и включают выравнивание вручную и многочисленные доступные программы выравнивания (например, BLASTP и другие программы, известные специалистам в данной области). Используя выровненные последовательности полипептидов и нуклеиновых кислот, специалист в данной области может идентифицировать аналогичные части или позиции, используя консервативные и идентичные аминокислотные остатки в качестве ориентиров. Кроме того, чтобы найти соответствующие аминокислотные или нуклеотидные остатки в последовательностях человеческого и не человеческого происхождения, специалист в данной области также может использовать консервативные аминокислотные или нуклеотидные остатки в качестве ориентиров. Соответствующие позиции также могут быть выявлены на основе структурного выравнивания, например, с помощью компьютерного моделирования и выравнивания структур белков. В других случаях могут быть идентифицированы соответствующие фрагменты. Чтобы найти соответствующие аминокислотные остатки в последовательностях человеческого и не человеческого происхождения, специалист в данной области может использовать консервативные аминокислотные остатки в качестве ориентиров. В настоящем документе "аналогичные" и "соответствующие" части, позиции или районы представляют собой части, позиции или районы, которые выравнены друг с другом посредством выравнивания двух или более родственных полипептидов или нуклеиновых кислот (включая последовательности молекул, фрагментов молекулы и/или теоретических последовательностей), с достижением наибольшего совпадения, используя методы выравнивания, которые известны специалистам в данной области. Другими словами, две аналогичные позиции (или части, или района) выравниваются при наилучшем выравнивании двух или более последовательностей полипептидов или нуклеиновых кислот. Аналогичные части/позиции/районы определяются по положению в линейной нуклеиновой кислоте или аминокислотной последовательности, когда две или более последовательности выровнены. Аналогичные части могут не иметь схожие последовательности. Например, выравнивание (например, при достижении максимального количества совпадений) последовательностей двух гомологичных молекул нуклеиновых кислот, по 100 нуклеотидов в длину каждая, может выявить идентичность 70 из 100 нуклеотидов. Части этих молекул нуклеиновой кислоты, содержащие некоторые из неидентичных 30 аминокислот или все такие аминокислоты, являются аналогичными частями с не идентичными последовательностями. Альтернативно,аналогичные части или их фрагменты могут характеризоваться определенным процентом идентичности последовательностей друг с другом, например, приблизительно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97,98, 99% идентичностью. В одном из примеров аналогичные частей на 100% идентичны. В настоящем документе "модификация" рассматривается в контексте модификации последовательности аминокислот полипептида или последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты и включает удаления, вставки и замены аминокислот и нуклеотидов соответственно. Методы модификации полипептидов известны специалистам в данной области и включают, например, технологию рекомбинантной ДНК. В настоящем документе "удаление", когда речь идет о последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида, относится к удалению одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот по сравнению с другой последовательностью, такой как целевой полинуклеотид или полипептид, или нативный полинуклеотид или полипептид, или полинуклеотид или полипептид дикого типа. В настоящем документе "вставка", когда речь идет о последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида, относится к включению одного или нескольких дополнительных нуклеотидов или аминокислот, в целевую, нативную или другую близкую последовательность, или в последовательность дикого типа. Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит одну или несколько вставок по сравнению с последовательностью дикого типа, содержит один или несколько дополнительных нуклеотидов в линейной последовательности. В настоящем документе "добавления" в отношении последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот описывают добавления нуклеотидов или аминокислот на концы последовательностей. В настоящем документе "замещение" относится к замене одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот в нативной, целевой или другой последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида на альтернативные нуклеотиды или аминокислоты без модификации длины (выраженной в числе остатков) молекулы. Таким образом, одна или несколько замен в молекуле не меняют количество аминокислотных остатков и нуклеотидов в молекуле. Замена в определенном полипептиде может быть описана с указанием номера аминокислотного остатка по длине полипептидной последовательности. Например,модифицированный полипептид с модификацией в 19-й позиции в аминокислотной последовательности,- 26023179 которая представляет собой замену изолейцина (Ile, I) на цистеин (Cys; С), может быть описан как I19C,Ile19 С или просто С 19, чтобы показать, что аминокислота в модифицированном 19-м положении представляет собой цистеин. В этом примере молекула с заменой имеет модификацию в положении Ile-19 немодифицированного полипептида. В настоящем документе свойство связывания представляет собой характеристику молекулы, например полипептида, касающуюся связывания одного или нескольких партнеров, его степени или его отсутствия. Свойства связывания включают способность связывать партнер (партнеры), аффинность, с которой происходит связывание партнеров (например, высокая аффинность), авидность, с которой происходит связывание партнеров, прочность связывания и специфичность связывания. В настоящем документе аффинность описывает силу взаимодействия между двумя или более молекулами, такими как связывающиеся партнеры, как правило, силу нековалентного взаимодействия между двумя связывающимися партнерами. Аффинность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента к эпитопу антигена представляет собой меру силы всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания антитела и эпитопом. Взаимодействие антиген-антитело с низкой аффинностью является слабым, и молекулы стремятся быстро диссоциировать, в то время как взаимодействие антиген-антитело с высокой аффинностью является сильным, и молекулы остаются связанными в течение более длительного периода времени. Методы расчета аффинности хорошо известны и включают, например, способ определения константы ассоциации/диссоциации. Аффинность может быть оценена эмпирически или может быть определена сравнительно, например, путем сравнения аффинности одного антитела и другого антитела к определенному антигену. В настоящем документе авидность антитела относится к силе нескольких взаимодействий между поливалентным антителом и распознаваемым им антигеном, например, взаимодействий антитела, содержащего несколько сайтов связывания, с антигеном, содержащим повторяющиеся эпитопы, или матрицей эпитопов. Антитело с высокой авидностью характеризуется более высокой прочностью такого взаимодействия по сравнению с антителом с низкой авидностью. В настоящем документе "связывание" относится к участию любой молекулы во взаимодействии с другой молекулой, приводящем к устойчивой ассоциации, при которой две молекулы находятся в непосредственной близости друг к другу. Связывание включает, но не ограничивается нековалентным связыванием, ковалентным связыванием (таким как обратимое и необратимое ковалентное связывание), и включает в себя взаимодействие между молекулами, такими как, например, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, низкомолекулярные соединения, такие как химические соединения, включая лекарства. Примеры связывания включают взаимодействия антиген-антитело и рецептор-лиганд. Когда антитело "связывает" конкретный антиген, связывание относится к специфическому распознаванию антигена антителом через специфические взаимодействия антиген-антитело в сайте связывания антитела. Связывание также может включать объединение нескольких цепей полипептида, таких как цепи антитела, которые взаимодействуют через дисульфидные связи. В настоящем документе "константа аффинности" относится к константеассоциации (Ka), используемой для измерения аффинности антител к антигену. Чем больше константа аффинности, тем больше аффинность антитела к антигену. Константу аффинности выражают в единицах, обратных молярности(например, М-1), указанная константа может быть рассчитана из константы скорости реакции ассоциации-диссоциации, измеренной по стандартной кинетической методике для антител (например, с помощью иммуноанализа, поверхностного плазмонного резонанса или других известных кинетических анализов взаимодействия). Используемый в настоящем документе термин "то же", употребляемый в отношении аффинности антител, означает, что константа ассоциации (Ka) антител отличается в пределах от 1 до 100 раз или от 1 до 10 раз (аффинность антитела в 1-100 раз больше или 1-100 раз меньше по сравнению с референсным антителом, или отличается в любое число раз в пределах указанных диапазонов). В настоящем документе термин "в значительной степени то же", употребляемый в отношении аффинности антител, означает, что константа ассоциации (Ka) антител отличается в пределах от 5 до 5000 раз в большую или меньшую сторону по сравнению с константой ассоциации Ka антитела сравнения (55000 раз больше или 5-5000 раз меньше по сравнению с антителом сравнения). Аффинность антитела также может быть выражена в форме константы диссоциации или Kd. Константа диссоциации обратна константе ассоциации, Kd = 1/Ka. В настоящем документе фраза "одинаковая специфичность связывания", используемая для описания свойств антитела по сравнению с другим антителом, означает, что антитело специфически связывает(иммуноспецифически связывает или специфически связывает с вирусом) тот же антигенный эпитоп, что и антитело сравнения, или его часть. Таким образом, анти-РСВ антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с такой же специфичностью связывания, как и антитело, обозначаемое 58 с 5, специфически связывает тот же эпитоп, который связывает анти-РСВ антитело 58 с 5 или его антигенсвязывающий фрагмент, или часть указанного эпитопа. Эпитоп может находиться в выделенном белке или в белке вируса. Возможность двух антител связывать один эпитоп может быть определена с помощью известных в данной области анализов, таких как, например, поверхностный плазмонный резонанс и анализы на кон- 27023179 куренцию антител. Как правило, антитела, которые иммуноспецифически связывают один эпитоп, могут конкурировать за связывание эпитопа, что можно измерить, например, in vitro с помощью анализа на конкуренцию связывания (например, ИФА на конкуренцию связывания), используя известные протоколы. Как правило, первое антитело, которое иммуноспецифически связывает тот же эпитоп, что и второе антитело, может конкурировать за связывание с эпитопом приблизительно на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%, где доля конкуренции измеряется по способности второго антитела вытеснять первое антитело со связанного эпитопа. Например, в анализе на конкуренцию связывания антиген инкубируют в присутствии меченого антитела с предварительно определенной методом предельных разведений концентрацией (например, 50-70% концентрации насыщения), а также серийных разведений немеченого конкурирующего антитела. Степень конкуренции определяют путем измерения связывания меченого антитела с антигеном при снижении связывания в присутствии конкурирующего антитела. Варианты проведения таких анализов, включая различные способы мечения и обнаружения, включая, например, радиометрическое, люминесцентное, ферментативное и колориметрическое обнаружение, известны в уровне техники. Возможность первого антитела связывать тот же эпитоп, что и второе антитело, также может быть определена, например, с помощью анализа нейтрализации вируса с применением устойчивых к моноклональным антителам мутантов (MARM). Например, если первое анти-РСВ антитело нейтрализует РСВ дикого типа, но не определенный мутант РСВ, то второе антитело, которое также нейтрализует РСВ дикого типа, но не определенный мутант РСВ, обычно связывает тот же эпитоп на РСВ,что и первое антитело. Если первое анти-РСВ антитело нейтрализует РСВ дикого типа, но не определенный мутант РСВ, то второе антитело, которое нейтрализует РСВ дикого типа, а также определенный мутант РСВ, обычно не связывает тот же эпитоп на РСВ, который связывает первое антитело. В настоящем документе " устойчивый к моноклональному антителу мутант" (MARM), также называемый "не подавляемый моноклональным антителом мутант", представляет собой мутант респираторно-синцитиального вируса (РСВ), который обладает повышенной устойчивостью к нейтрализации моноклональным антителом, которое нейтрализует вирус РСВ дикого типа. MARM создаются путем культивирования РСВ дикого типа в присутствии моноклональных антител, при последовательных циклах репликации вируса в присутствии антител, где после каждого цикла репликации вируса необходимо повышать концентрацию антител для получения эффекта нейтрализации вируса. Цитопатический эффект(СРЕ) наблюдается в присутствии возрастающих концентраций антител до получения мутанта вируса,который уже эффективно не нейтрализуется антителами. Если для появления MARM в присутствии первого антитела по сравнению со вторым антителом требуется больше раундов репликации, можно сделать вывод, что первое антитело связывает эпитоп, который отличается от эпитопа, который связывает второе антитело. Если первое антитело может нейтрализовать MARM, устойчивый ко второму антителу, можно сделать вывод, что антитела специфически связывают и взаимодействуют с различными эпитопами. С помощью MARM можно более точно определить антигенсвязывающие эпитопы антител по сравнению с конкуренцией связывания, например антитело может конкурировать за связывание с антигеном, но при этом может нейтрализовать MARM своего конкурента. В настоящем документе ЕС 50 относится к эффективной концентрации, при которой антитела могут ингибировать вирусную инфекцию на 50% в тесте нейтрализации in vitro, таком как, например, анализ подавления бляшкообразования, описанный в настоящем документе (например, анализ подавления бляшкообразования с применением для заражения клеток-хозяев Vero или других клеток-хозяев) или другой известный анализ на нейтрализацию вируса. Как правило, нейтрализующее вирус антитело представляет собой антитело, которое в анализе нейтрализации in vitro, таком как анализ подавления бляшкообразования, имеет ЕС 50 для ингибирования вируса 2 нМ или меньше. В настоящем документе "партнер связывания" относится к молекуле (например, полипептиду, липиду, гликолипиду, молекуле нуклеиновой кислоты, углеводу и другим молекулам), с которой специфически взаимодействует другая молекула, например, посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия, такого как взаимодействие антитела с распознаваемым антигеном. Партнер связывания может быть естественным или синтетическим. В одном из примеров желаемые варианты полипептидов выделяют с помощью одного или более партнеров связывания, например, используя in vitro или in vivo методы. Примеры in vitro методов включают выделение с помощью партнера связывания, иммобилизованного на твердой поддержке, такой как бусины, планшеты, колонки, матрицы или другой твердый носитель, или партнера связывания, конъюгированного с другой обнаруживаемой молекулой, такой как молекула биотина, с последующим отбором за счет связывания обнаруживаемой молекулы с твердой подложкой. Как правило, in vitro методы включают стадии промывания для удаления несвязанных полипептидов с последующей элюцией выбранного варианта полипептида (полипептидов). Этот процесс может повторяться один или несколько раз для дополнительного отбора вариантов полипептидов из выбранных полипептидов. В настоящем документе дисульфидная связь (также называемая S-S связь или дисульфидный мост) представляет собой одинарную ковалентную связь, образованную конъюгацией тиоловых групп. Дисульфидные связи в белках образуются между тиоловыми группами остатков цистеина и стабилизируют взаимодействия полипептидных доменов, таких как домены антитела.- 28023179 В настоящем документе "конъюгированные" или "соединенные" означает связывание через ковалентные или нековалентные взаимодействия. Используемые в настоящем документе выражения "конъюгированные с антителом" или "связанные с антителом", а также их грамматические модификации в контексте присоединения различных молекул к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, например, предназначенных для диагностики или терапии молекул, означают, что молекула присоединена к антителу или антигенсвязывающему фрагменту любым известным способом, например, при получении гибридного белка с помощью рекомбинантных методов или пост-трансляционно химическим путем. Для конъюгации можно использовать любой из множества сшивающих агентов, включая, но не ограничиваясь пептидными или непептидными линкерами и химическими сшивающими агентами. В настоящем документе "фаговый дисплей" относится к экспрессии полипептидов на поверхности нитевидных бактериофагов. В настоящем документе "совместимые с фаговым дисплеем клетки" или "совместимые с фаговым дисплеем клетки-хозяева" представляют собой клетки-хозяева, как правило, бактериальные клеткихозяева, которые могут быть заражены бактериофагом для получения бактериофагов, несущих белки слияния, содержащие полипептиды, например варианты полипептидов, такие клетки вследствие этого могут быть использованы для фагового дисплея. Примеры совместимых с фаговым дисплеем клеток включают, но не ограничиваются клетками XL1-Blue. В настоящем документе "пэннинг" относится к основанной на аффинности процедуре отбора бактериофагов, несущих специфичные к партнеру связывания молекулы, например связываемые молекулы(например, антигены) или последовательности аминокислот или нуклеотидов, или эпитопы, их фрагменты, части или локусы. В настоящем документе "дисплейный белок" или "дисплейный белок генетического пакета" означает любой полипептид генетического пакета, используемый для дисплея полипептида на генетическом пакете, такой, что при получении белка слияния дисплейного белка (например, получения гибридного белка) с интересующим полипептидом (например, полипептидом, для которого желательно снижение экспрессии), полипептид экспрессируется на внешней поверхности генетического пакета. Дисплейный белок обычно присутствует на поверхности или в составе внешней поверхности или внешнего компартмента генетического пакета (например, мембраны, клеточной стенки, оболочки или другой внешней поверхности или компартмента), например вирусного генетического пакета, например, фага, так что после слияния с интересующим полипептидом полипептид экспрессируется на генетическом пакете. В настоящем документе белок оболочки представляет собой дисплейный белок, по меньшей мере часть которого находится на внешней поверхности генетического пакета, такой, так что после слияния с интересующим полипептидом полипептид экспрессируется на внешней поверхности генетического пакета. Как правило, белки оболочки представляют собой вирусные белки оболочки, такие как белки оболочки фага. Вирусные белки оболочки, такие как белки оболочки фага, связываются с вирусной частицей во время сборки в клетке-хозяине. В одном примере белки оболочки используются в настоящем документе для дисплея (представления) полипептидов на генетическом пакете; белки оболочки экспрессируются как часть слитых белков, которые содержат последовательность аминокислот белка оболочки и последовательность аминокислот представляемого полипептида. Белки оболочки могут представлять собой полноразмерные белки оболочки или любые их части, способные представлять полипептид на поверхности генетического пакета. Пример белков оболочки включает белки оболочки бактериофагов, включая, но не ограничиваясь(I) минорными белками оболочки нитчатых бактериофагов, такими как белок III (gIIIp, ср 3) и (II) основными белками оболочки нитчатых бактериофагов (которые присутствуют в оболочке вируса в количестве 10 молекул и более, например, десятков, сотен или тысяч копий), такими как белок VIII (gVIIIp, cp8); также могут быть получены белки слияния с другими белками оболочки бактериофагов, такими как белок VI, белок VII или белок IX (см., например, WO 00/71694), а также частями (например, доменами или их фрагментами) указанных белков, включая, но не ограничиваясь доменами, которые стабильно включены в частицу бактериофага, например, такими как якорный домен gIIIp или gVIIIp. Кроме того, могут быть использованы мутанты gVIIIp, которые оптимизированы для экспрессии больших пептидов, такие как мутанты с улучшенными свойствами для дисплея, например, мутанты gVIIp (см., например, Sidhu etal. (2000) J. Mol. Biol. 296:487-495). Используемый здесь термин "заболевание или расстройство" относится к патологическим состояниям организма, которые возникли в результате факторов или состояний, включающих, но не ограничивающихся инфекцией, приобретенными состояниями, генетическими состояниями, и характеризуются идентифицируемыми симптомами. Заболевания и расстройства в настоящем документе включают РСВ инфекцию или заболевания и расстройства, которые увеличивают риск инфекции РСВ. В настоящем документе "инфекция" и "РСВ инфекция" относится ко всем стадиям жизненного цикла РСВ в хозяине (включая, но не ограничиваясь инвазией и репликацией РСВ в клетке или ткани организма), а также патологическому состоянию, являющемуся результатом инвазии и репликации РСВ. Инвазия и размножение РСВ включает, но не ограничивается следующими стадиями: докингом частицы
МПК / Метки
МПК: A61K 38/00, A61K 47/48, C12N 15/63, A61K 31/00, A61K 39/42, G01N 33/53, C12N 15/13, C12N 5/10, A61P 31/14, C07K 16/10
Метки: против, способы, синцитиального, вируса, применения, антитела, pcb, респираторного
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-23179-antitela-protiv-respiratornogo-sincitialnogo-virusa-pcb-i-sposoby-ih-primeneniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Антитела против респираторного синцитиального вируса (pcb) и способы их применения</a>