Модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора fgf и fc с улучшенной биологической активностью и их применение

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ РАСТВОРИМЫЕ СЛИТЫЕ КОНСТРУКЦИИ РЕЦЕПТОРАFGF И Fc С УЛУЧШЕННОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Изобретение относится к модифицированным растворимым слитым конструкциям рецептораFGF и Fc, содержащим слияние растворимого фрагмента или домена части рецептора FGF(нацеливающий или связывающий компонент) с Fc-областью части иммуноглобулина (компонент с эффекторной функцией), обладающим улучшенной биологической активностью, включая активности в отношении ADCC/CDC, содержащим их композициям и способу получения таких модифицированных растворимых слитых молекул рецептора FGF и Fc. Область изобретения и введение Изобретение относится к модифицированным растворимым слитым конструкциям рецептора FGF иFc, содержащим слияние растворимого фрагмента или домена рецептора FGF с Fc-областью иммуноглобулина, обладающим улучшенной биологической активностью, содержащим их композициям и способу получения таких модифицированных растворимых слитых молекул рецептора FGF и Fc. В частности,модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора FGF и Fc обладают улучшенной антиангиогенной активностью и противоопухолевыми активностями в отношении антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, а именно ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) и/или CDC (комплементзависимая цитотоксичность), и, таким образом, пригодны в лечении рака,метастатических опухолей и для замедления роста опухоли у субъекта. Изобретение дополнительно относится к способам ингибирования роста опухоли и способам лечения или предотвращения патологических ситуаций, включая в качестве неограничивающих примеров рак молочной железы, меланому, лейкоз, метастазы в мозге, рак почки, первичную меланому, первичный рак толстой кишки, первичный рак мочевого пузыря, младенческую гемангиому, рак яичника, рак предстательной железы и рак легкого. Предпосылки и актуальность изобретения Ангиогенез, т.е. образование новых кровеносных сосудов из предсуществующих, включает сложную координацию пролиферации эндотелиальных клеток, миграции, деградации базальной мембраны и организации новых сосудов (Ji et al., 1998, FASEB J. 12:1731-1738). Местное, неконтролируемое высвобождение ангиогенных факторов роста и/или изменения продукции природных ангиогенных ингибиторов с последующим изменением ангиогенного равновесия (Hanahan et al., 1996, Cell. 86:353-64) несут ответственность за неконтролируемую пролиферацию эндотелиальных клеток, которая имеет место в ходе неоваскуляризации опухоли и при связанных с ангиогенезом заболеваниях (Folkman, 1995, Nat.Med. 1:27-31). Идентифицированы многочисленные природные индукторы ангиогенеза, в том числе члены семейства фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтины, трансформирующие факторы ростаи(TGF- и -), факторы роста тромбоцитов (PDGF), фактор некроза опухолей(TNF-), интерлейкины,хемокины и члены семейства фактора роста фибробластов (FGF). Эти мощные ангиогенные факторы часто сверхэкспрессируются опухолевыми тканями (Presta, 2005, CytokineGrowth Factors Reviews. 16:159-178; Grose, 2005, CytokineGrowth Factors Reviews. 16:179-186). Действительно, FGF и более конкретно FGF2, сверхэкспрессируются в многочисленных видах рака человека, включая меланомуLeukemia. 15:228-37, Bieker et al., 2003, Cancer Res. 63:7241-7246), рак почки (Hanada, 2001, Cancer Res. 61:5511-5516), рак толстой кишки (Tassi, 2006, Cancer Res. 66:1191-1198), рак яичника (Whitworth et al.,2005, Clin Cancer Res. 11:4282-4288, Gan et al., 2006, Pharm Res. 23:1324-31), рак предстательной железыBrattstrom et al., 1998, Anticancer Res. 18:1123-1127). Кроме того, сверхэкспрессия FGF2 может коррелировать с хеморезистентностью определенных видов рака, включая виды рака мочевого пузыря, молочной железы, головы и шеи (Gan et al., 2006, Pharm Res. 23:1324-31). Что касается членов семейства FGF, то,поскольку FGF, секретируемые опухолевыми клетками, обладают аффинностями к боковым цепям гликозаминогликанов клеточной поверхности и протеогликанам матрикса, эти секретируемые FGF наиболее вероятно секвестрируются около опухолевых клеток, образуя резервуары FGF. Эта особенность делает направленность на FGF хорошей стратегией для направления активной молекулы, для которой необходима стабильно экспрессируемая и легко доступная молекула-мишень. Различные продукты на основе антител в настоящее время используют в качестве лекарственных средств, и несколько видов моноклональных антител (mAb) в настоящее время одобрены в различных областях терапии, таких как онкология, воспаление, инфекционные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания. Эти mAb вызывают уничтожение опухолевых клеток посредством множества механизмов, включая мобилизацию иммунной системы (Harris, 2004, Lancet Oncol, 5:292-302). Fc-фрагмент mAb отвечает за эти иммуноопосредованные эффекторные функции, которые включают два главных механизма: антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимую цитотоксичность (CDC). ADCC возникает, если mAb сначала связывается посредством своего антигенсвязывающего участка со своей мишенью на опухолевых клетках, и затем Fc-часть узнается специфическими Fc-рецепторами (FcR) на эффекторных клетках (т.е. NK, нейтрофилах, макрофагах), которые атакуют клетку-мишень. CDC представляет собой процесс, в котором каскад разных белков комплемента активируется при связыванииmAb с C1q, что ведет к образованию C3b на поверхности покрытых антителами опухолевых клеток рядом с участком активации комплемента. Присутствие C3b контролирует образование атакующего мембрану комплекса C5-C9, который может встраиваться в мембрану для лизирования опухолевых клеток(Sharkey, 2007, CA Cancer J Clin, 56:226-243). Способность mAb стимулировать ADCC зависит от их изотипа. Антитела IgG1 и IgG3 хорошо связываются с FcR, в то время как антитела IgG4 и IgG2 связываются слабо. Способность mAb в отношении CDC также зависит от изотипа mAb. IgG3 и, в меньшей степе-1 018700 ни, IgG1 представляют собой наиболее эффективные изотипы в отношении стимуляции классического каскада комплемента. mAb IgG2 в меньшей степени эффективны в отношении активации каскада комплемента, в то время как IgG4 не способен это делать (Strome, 2007, The Oncologist, 12:1084-1095). Использование слитого белка, который может обладать, как и антитела, двойной функциональностью, где связывающаяся часть осуществляет специфическое нацеливание, и эффекторная часть способна индуцировать лизис клеток-мишеней путем мобилизации иммунной системы, представляет собой один из аспектов этих терапевтических стратегий. Кроме того, чтобы быть пригодной в терапии, желательно, чтобы эта молекула обладала полезными фармакокинетическими свойствами РК. Fc-фрагмент может заметно повышать время полужизни в сыворотке модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc, но все еще существует потребность в слитом белке с более продолжительным временем полужизни в сыворотке. Наконец, если этот слитый белок следует использовать в качестве лекарственного средства, то необходимо, чтобы его получение являлось надежным, эффективным и обладало подходящей продуктивностью. Таким образом, существует потребность в слитом белке с активностями в отношении ADCC и/илиCDC, нацеленном на FGF для лечения рака, метастатических опухолей и для замедления роста опухолей у субъекта, с улучшенными характеристиками РК, и который можно эффективно продуцировать. Заявители в данной работе обнаружили, что растворимые слитые белки из растворимой части рецептора FGF (связывающего или направляющего компонента) и Fc-части (компонента с эффекторной функцией) (sFGFR-Fc), которые модифицированы таким образом, чтобы обладать характерным гликановым профилем, фактически обладают, по существу, улучшенными видами биологической активности,включая активности в отношении ADCC и/или CDC, и их, таким образом, можно использовать в качестве эффективных антиангиогенных и противоопухолевых лекарственных средств для лечения неконтролируемого клеточного роста или рака. Эти модифицированные растворимые слитые белки обладают полезными свойствами РК вследствие их уровня сиалирования, и их можно получать с соответствующей продуктивностью и минимальной агрегацией благодаря их паттерну гликозилирования. Сущность изобретения Настоящее изобретение, таким образом, относится к модифицированному растворимому рецепторуFGF-Fc, содержащему слияние растворимого фрагмента или домена рецептора FGF с Fc-областью иммуноглобулина, где, по меньшей мере, занят 5-й участок N-гликозилирования компонента рецептора FGF и где не более чем 45% N-гликанов компонента рецептора FGF не имеют сиалильных групп. Кроме того,согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления изобретения заняты 3-й, 4-й, 6-й и 7-й участки N-гликозилирования компонента рецептора FGF. Предпочтительно заняты все участки Nгликозилирования. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления среднее количество сиаловой кислоты на N-гликан в компоненте рецептора FGF слитых конструкций по изобретению составляет по меньшей мере 0,9; более предпочтительно оно составляет по меньшей мере 1,2. Каждая молекула N-гликана модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc согласно настоящему изобретению содержит 3 остатка маннозы, в среднем от 1,5 до 3,0 остатков галактозы, от 3,5 до 5 остатков N-ацетилглюкозамина и от 0,6 до 1 остатка фукозы. Настоящее изобретение также относится к модифицированным растворимым слитым конструкциям рецептора FGF и Fc, содержащим слияние растворимого фрагмента или домена рецептора FGF с Fcобластью иммуноглобулина, где заняты все участки N-гликозилирования, и где не более чем 45% Nгликанов компонента рецептора FGF не имеют сиалильных групп, и где N-гликан Fc-области является фукозилированным на 60-100%. В одном из вариантов осуществления растворимый фрагмент или домен рецептора FGF представляет собой растворимый или внеклеточный домен рецептора 1 FGF (sFGFRl) или рецептора 2 FGF (sFGFR2). В другом варианте осуществления растворимый фрагмент или домен рецептора FGF представляет собой растворимый или внеклеточный домен рецептора 1 FGF изотипа или варианта IIIc (sFGFRl (IIIc, или рецептора 2 FGF изотипа IIIc (SFGFR2 (IIIc. Согласно предпочтительному варианту осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc кодируется полинуклеотидом, обладающим нуклеотидной последовательностью, как представлено на SEQ ID No. 1, или полинуклеотидом, обладающим по меньшей мере 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No. 1. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc по изобретению обладает аминокислотной последовательностью, как представлено на SEQ ID No. 2, или последовательностью, обладающей по меньшей мере 95, 97, 98 или 99% идентичностью с последовательностью, как представлено в SEQ ID No. 2. Модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc по изобретению обладает активностью в отношении ADCC и/или CDC и, таким образом, пригодна для лечения заболеваний, таких как рак. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора FGF и Fc. Настоящее изобретение дополнительно относится к сочетанию модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc с химиотерапевтическим средством или биотерапевтическим средством с противоопухолевыми и/или антиангиогенными свойствами. Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения рака или способ предотвращения или замедления роста опухоли и уменьшения объема и метастазирования опухолей, включающий введение субъекту модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc по настоящему изобретению в терапевтически эффективном количестве. Краткое описание фигур На фиг. 1 А и В представлены карты экспрессирующих векторов для SIAT6 (ST3GAL3) иB4GT1(B4GALT1) соответственно. На фиг. 2 А и В представлены последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID No. 9) и аминокислотная последовательность (SEQ ID No. 10) B4GT1(B4GALT1) для экспрессии с pXL4551. На фиг. 3A и В представлены последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID No. 11) и аминокислотная (SEQ ID No. 12) последовательность SIAT6 (ST3GAL3) для экспрессии с pXL4544. Фиг. 4 А соответствует последовательности нуклеиновой кислоты sFGFR2-Fc для экспрессии сpXL4410, pXL4429 или pXL4636 (SEQ ID No. 1), фиг. 4 В соответствует аминокислотной последовательности sFGFR2-Fc (участки N-гликозилирования указаны полужирным шрифтом), кодируемой pXL4410,pXL4429 или pXL4636 (SEQ ID No. 2), фиг. 4 С соответствует аминокислотной последовательностиSFGFR2 (SEQ ID No. 4), фиг. 4D соответствует аминокислотной последовательности Fc (SEQ ID No. 6),фиг. 4 Е соответствует аминокислотной последовательности линкера, и фиг. 4F соответствует аминокислотной последовательности сигнального пептида (SEQ ID No. 8). Он представляет собой сигнальный пептид, описанный для интерлейкина-2. Наблюдали, что слияние этого пептида выше последовательности, представленной SEQ ID No. 2, приводит к секретируемому белку с однородной N-концевой аминокислотной последовательностью. Фиг. 5 представляет собой схематическое представление стратегии, использованной для конструирования pXL4 636, кодирующей sFGFR2-Fc и глутаминсинтетазу. На фиг. 6 А и В представлены карты экспрессирующих векторов pXL4429 для sFGFR2-Fc и DHFR, иpXL4417, кодирующей ген устойчивости к неомицину. Фиг. 7 представляет собой график, на котором представлена корреляция между средним количеством сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2 и клиренсом sFGFR2-Fc в крови. Оптимальное соотношение 1,2. Предпочтительное соотношение 0,9. На фиг. 8 представлен SDS-PAGE (невосстанавливающие условия) 1 мкг sFGFR2-Fc, инкубируемого в отсутствие (-) или в присутствии (+) ПНГазы F. М: маркер молекулярной массы. На фиг. 9 представлено положение N-гликанов и нумерация в димере sFGFR2-Fc. Нумерация начинается от N-концевой аминокислотной последовательности FGFR2 (FGFR2HUMAN) таким образом,что положение N1 соответствует Asn83, N2 - Asn123, N3 - Asn228, N4 - Asn241, N5 - Asn 265, N6 - Asn 297, N7 - Asn318, N8 - Asn331. Положение N297 соответствует положению Asn Fc (IgG1) человека. Фиг. 10 представляет собой график, на котором представлена кинетика исчезновения белкаsFGFR2-Fc (квадраты) в крови с течением времени вплоть до 72 ч. На фиг. 11 представлено количество выявленного белка sFGFR2-Fc в плазме и печени, выраженное в % от инъецируемой дозы. Фиг. 12 представляет собой график анализа объема опухоли А 549 после лечения вплоть до 40 суток(100 мкг/мышь/введен: треугольники; 300 мкг/мышь/введен: квадраты; 500 мкг/мышь/введен: закрашенные круги; контроль с PBS: незакрашенные круги). Фиг. 13 представляет собой график анализа массы опухоли А 549 после лечения на 40 сутки. Фиг. 14 представляет собой график анализа объема опухоли H460 после лечения вплоть до 22 суток(группа, подвергнутая лечению: закрашенные круги; контрольная группа с PBS: незакрашенные круги). Фиг. 15 представляет собой график анализа массы опухоли H460 после лечения на 22 сутки. Фиг. 16 представляет собой график оценки in vitro активности в отношении ADCC для sFGFR2-Fc на опухолевых клетках Н 460 и А 549. На фиг. 17 представлены графики анализа объема опухоли А 549 при имплантации в три линии мышей, т.е. SCID (фиг. 17 А), NOD/SCID (фиг. 17 В) и SCID/bg (фиг. 17 С), вплоть до 41 суток (sFGFR2-Fc,100 мкг/мышь/введен: ромбы; контроль с PBS: незакрашенные круги). На фиг. 18 представлены графики анализа объема опухоли Н 460 при имплантации в три линии мышей, т.е. SCID (фиг. 18 А), NOD/SCID (фиг. 18 В) и SCID/bg (фиг. 18 С), вплоть до 22 суток (sFGFR2-Fc,100 мкг/мышь/введен: ромбы; контроль с PBS: незакрашенные круги). На фиг. 19 А представлена карта плазмиды, кодирующей sFGFR2-Fc (A265 in Fc), и на фиг. 19 В представлена последовательность белка sFGFR2-Fc (A265 в Fc) (SEQ ID No. 14). Положение 392 представляет собой положение мутации в Fc-домене (Asp2 65Ala) и оно отмечено полужирным шрифтом. Фиг. 20 представляет собой график, на котором представлен анализ объема опухоли H460 при имплантации в линии голых мышей вплоть до 23 суток (незакрашенные круги: контроль с PBS; ромбы:: p0,01 по сравнению с контролем, послеэкспериментальный тест Anova и Ньюмана-Кеулса). Подробное описание На протяжении этого описания заявители ссылаются на журнальные статьи, патентные документы,-3 018700 опубликованные ссылки, веб-страницы, информацию в отношении последовательностей, доступную в базах данных, и другие источники информации. Специалист в данной области может использовать полное содержание любого из цитированных источников информации для осуществления и применения аспектов этого изобретения. Каждый цитированный источник информации конкретно приведен здесь в качестве ссылки в полном объеме. Части этих источников можно включать в этот документ при возможности или потребности. Однако значение любого термина или фразы, конкретно определенных или объясненных в этом описании, не следует модифицировать посредством содержания любого из источников. Описание и примеры, которые следуют далее, приведены исключительно в качестве иллюстрации объема этого изобретения и содержания этого описания. Специалист в данной области может разработать и сконструировать многочисленные модификации перечисленных ниже примеров без отступления от объема этого изобретения. Настоящее изобретение относится к растворимым слитым белкам, содержащим домены рецепторовFGF. Изобретение, в общем, относится к фрагментам, доменам и, в особенности, к растворимым или внеклеточным доменам рецептора FGF. Внеклеточный домен рецептора FGF связан с соответствующим слитым партнером, таким как Fc-компонент иммуноглобулина. Таким образом, в самом широком смысле, модифицированные растворимые слитые рецепторы FGF по изобретению могут являться белками,фрагментами, доменами, внеклеточными доменами, растворимыми доменами рецептора FGF (FGFR), и любой из них связан со слитым партнером, в особенности, со слитым партнером на основе Fc-области. Данным заявителем обнаружено, что модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc, содержащая слияние растворимого домена рецептора FGF и Fc-области иммуноглобулина,где не более чем 45% N-гликанов не имеют сиалильных групп, обладает предпочтительными свойствами. Преимущества паттерна сиалирования модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc по изобретению включают лучший фармакокинетический профиль и улучшенную устойчивость к расщеплению in vivo. Как правило, N-гликаны присоединяются котрансляционно посредством специфических остатков аспарагина (Asn). Консенсусная последовательность Asn-X-Ser/Thr (где X представляет собой любую аминокислоту за исключением Pro) является необходимой, но не достаточной потому, что локальная вторичная структура может детерминировать присоединение (Jefferis et al., 2006, Nature Biotechnology 24:1241). Как предполагают, несколько факторов отвечают за то, что участки N-гликозилирования не заняты (Jones etal., 2005, Biochimica et Biophysica Acta 1726:121). Несколько участков N-гликозилирования присутствуют в растворимых рецепторах FGF по изобретению. Например, существуют 8 участков N-гликозилирования во внеклеточном домене FGFR2IIIC (см. фиг. 9). N-гликаны содержат консервативный олигосахаридный кор, связанный с Asn. Этот кор образован тремя маннозными (Man) и двумя N-ацетилглюкозаминовыми(Fucl,6) и разделяющий GlcNAc (1,4) могут присутствовать или отсутствовать (Jefferis ef al., 2006, Nature Biotechnology 24:1241). Заявителем показано, что присутствие N-гликана на 5-ом участке N-гликозилирования от N-конца компонента FGFR придает предпочтительные свойства в отношении продуктивности и слабой агрегации,как показано в экспериментальных примерах. В частности, в отсутствие гликозилирования этого конкретного участка продуктивность существенно снижается, в то время как агрегация усиливается. Кроме того, присутствие этого N-гликана, как обнаружено, является необходимым для связывания FGF. Настоящее изобретение, таким образом, относится к модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc, содержащей слияние растворимого домена рецептора FGF и Fc-области иммуноглобулина, где, по меньшей мере, занят 5-й участок N-гликозилирования компонента рецептораFGF, и не более чем 45% N-гликанов указанного компонента рецептора FGF не имеют сиалильных групп. Согласно дополнительному варианту осуществления изобретения заняты 3-й, 4-й, 6-й и 7-й участкиN-гликозилирования компонента рецептора FGF. Если, по меньшей мере, 7 участков Nгликозилирования компонента рецептора FGF гликозилированы, то слитая конструкция по изобретению обладает даже лучшими свойствами в отношении продуктивности и слабой агрегации. Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к слитой конструкции растворимого фрагмента или домена рецептора FGF и Fc-области иммуноглобулина, где, по меньшей мере, занято 7 участков Nгликозилирования, и не более чем 45% N-гликанов слитой конструкции рецептора FGF и Fc не имеют сиалильных групп. В конкретном варианте осуществления изобретению заняты все участки Nгликозилирования. В другом аспекте модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc по изобретению содержит среднее количество сиаловой кислоты на N-гликан компонента рецептора FGF, по меньшей мере, равное 0,9, т.е. это количество может составлять 0,9 или любую величину больше 0,9. В предпочтительном варианте осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецеп-4 018700 тора FGF и Fc по изобретению содержит среднее количество сиаловой кислоты на N-гликан, по меньшей мере, равное 1,2. Такое соотношение, как обнаружено заявителем, обеспечивает максимальную концентрацию в крови растворимого слитого рецептора FGF по изобретению, которая может являться сравнимой с оптимальной концентрацией в крови, найденной для Fc-молекул. Настоящее изобретение дополнительно относится к модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc, содержащей слияние растворимого фрагмента или домена рецептора FGF сFc-областью иммуноглобулина, где заняты все участки N-гликозилирования, и где не более чем 45% Nгликанов компонента рецептора FGF не имеют сиалильных групп, и где N-гликаны Fc-области не фукозилированы. В другом варианте осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc по изобретению частично фукозилирована, например, фукозилирована на 0-60%. В другом варианте осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF иFc по изобретению полностью фукозилирована. В предпочтительном варианте осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc по изобретению фукозилирована на 60100%. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления каждая молекула N-гликана модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc согласно настоящему изобретению дополнительно содержит 3 остатка маннозы и в среднем от 1,5 до 3,0 остатков галактозы, от 3,5 до 5 остатков N-ацетилглюкозамина на молекулу гликана и от 0,6 до 1 остатка фукозы. Согласно изобретению модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc связывается с лигандом FGF с высокой аффинностью. Например, указанная слитая конструкция связывается с FGF2 с величиной KD, измеренной с помощью Biacore, находящейся между 1 и 5 нМ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения величина KD указанной слитой конструкции дляFGF2, измеренной с помощью Biacore, составляет приблизительно 1,5 нМ. Такие модифицированные слитые конструкции, как описано выше, пригодны в качестве мощных и терапевтически эффективных ингибиторов роста опухолей. Действительно, заявителем показано, что модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора FGF и Fc по изобретению способны к ингибированию роста опухоли in vivo. Более того, указанные модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора FGF и Fc по изобретению способны запускать ответы в виде ADCC и/или CDC как in vitro, так и in vivo. В качестве молекул, эффективно опосредующих ADCC и/или CDC, эти соединения в особенности пригодны для лечения сверхэкспрессирующих FGF раковых опухолей. Последовательности FGFR, используемые для соединений на основе FGFR, полноразмерного FGFR или фрагментов FGFR, синтетических последовательностей FGFR, внеклеточных доменов, растворимых доменов или их слитых конструкций, можно выбрать из любых доступных или известных последовательностей. FGFR принадлежит к тирозинкиназному семейству рецепторов и к семейству иммуноглобулиновых (Ig) супергенов. В трансмембранных формах рецептора тирозинкиназный домен является внутриклеточным, и Ig-подобные домены являются внеклеточными. Как трансмембранная, так и секретируемая формы связываются с FGF. Существует по меньшей мере четыре гена, которые кодируют FGFR, которые обладают общей структурой из двух или трех внеклеточных иммуноглобулин-(Ig)-подобных петель (IgI-IgIII) и одного внутриклеточного тирозинкиназного домена. Также известны продукты альтернативного сплайсинга, из экзонов, кодирующих внеклеточную область, что приводит к нескольким формам рецептора. Третья Ig-подобная петля дает по меньшей мере три варианта рецептора, и две трансмембранных формы получаются при альтернативном сплайсинге двух экзонов (IIIb и IIIc), кодирующих вторую половину петли III. Например, селективный участок полиаденилирования, предшествующий экзонам IIIb и IIIc, используют для получения растворимой формы FGFR1 (IIIa). У человека и мыши сплайсированный вариант IgIIIa FGFR1 кодирует белок, который явным образом не обладает гидрофобным трансмембранным доменом и может, таким образом, являться секретируемой или растворимой формой рецептора. Соединения на основе FGFR могут также содержать последовательности из FGFR1(белковый локус на NCBI, NP075598); FGFR2 (белковый локус на NCBI, NP000132); FGFR3 (белковый локус на NCBI, P22607) и FGFR4 (белковый локус на NCBI, NP002002) (Kiefer et al., 1991, Growth Factors 5:115-127). Растворимые формы рецепторов FGF, содержащие внеклеточные домены, также рассмотрены в патентах США No. 5288855; 6656728; WO 91/00916; WO 92/00999; WO 00/46380; WO 2005/016966; WO 2005/113295; WO 2006/113277; WO 2007/014123; и европейском патенте 529076. Фрагменты, домены или растворимые или внеклеточные домены FGFR, как применяют по изобретению, могут включать фрагмент FGFR, который является внеклеточным в своей нативной форме или состоит изо всей секретируемой формы или ее части в естественных условиях. Более того, последовательности FGFR, как применяют по этому изобретению, могут представлять собой последовательности, конкретно описанные или перечисленные, и последовательности, обладающие приблизительно 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 или 90% идентичностью аминокислотной последовательности по сравнению с полноразмерной полипептидной последовательностью, описанной или представленной, или обладающие приблизительно 95, 90, 85, 80 или 75% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с кодирующей полипептид областью нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности FGFR по изобретению. Фраг-5 018700 мент или домен может также содержать дополнительные аминокислоты или другие области FGFR при условии, что эти дополнительные аминокислоты или области не нарушают или значительно не снижают возможность использования соединения на основе FGFR, как описано в этом изобретении. Полипептид или слитый белок, состоящий в существенной степени из домена или фрагмента FGFR, может содержать другие аминокислоты, при условии, что сохраняются способность к экспрессии в клетке млекопитающих и связывание с FGF и, не обязательно, кроме того, при условии, что сохраняется способность замедлять клеточный рост или снижать степень васкуляризации. В одном из вариантов осуществления растворимый фрагмент или домен рецептора FGF является растворимым или внеклеточным доменом рецептора 1 FGF (sFGFRl) или рецептора 2 FGF (sFGFR2). Выбранные фрагменты FGFR1 и FGFR2 могут обладать одной или несколькими из следующих мутаций: N-концевая делеция 1-7 аминокислот; или N-концевое замещение; делеция последовательности петли 1; делеция последовательности кислого участка. Полинуклеотиды, кодирующие мутанты по аминокислотной последовательности, можно получать множеством способов, известных в данной области,включая в качестве неограничивающих примеров олигонуклеотид-опосредованный (или сайтнаправленный) мутагенез, PCR-мутагенез и кассетный мутагенез ранее полученной мутантной или немутантной версии интересующей молекулы (см., например, Kunkel, 1985, Proc Natl Acad Sci USA 82:488). В другом варианте осуществления растворимый фрагмент или домен рецептора FGF представляет собой растворимый или внеклеточный домен рецептора 1 FGF изотипа IIIc (sFGFRl (IIIc и рецептора 2FGF изотипа IIIc (sFGFR2(IIIc. Предпочтительные варианты осуществления включают растворимый фрагмент или домен рецептора 2 FGF изотипа или варианта IIIc, кодируемый полинуклеотидом, обладающим последовательностьюSEQ ID No. 3, и/или обладающий аминокислотной последовательностью SEQ ID No. 4, или последовательностью по меньшей мере с 95, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID No. 4. Согласно этому последнему варианту осуществления модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc (sFGFR2-Fc) по настоящему изобретению успешно обладает высокой аффинностью в отношении своего естественного лиганда FGF2 или высокой величиной KD порядка наномолей, находящейся между 1 и 5 нМ и, более конкретно, составляющей приблизительно 1,5 нМ. Конкретные примеры доменов иммуноглобулинов включают без ограничения Fc-область молекулы иммуноглобулина; шарнирную область молекулы иммуноглобулина; CH1-область молекулы иммуноглобулина; CH2-область молекулы иммуноглобулина; CH3-область молекулы иммуноглобулина; CH4 область молекулы иммуноглобулина; и легкую цепь молекулы иммуноглобулина и гуманизированные варианты любой из них. Последовательности этих областей также доступны специалисту в данной области (см., например, Huck et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14:1779). Как применяют в описании и формуле изобретения, "Fc-область иммуноглобулина или Fc" означает карбоксиконцевую часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Fc-области, в частности,важны для детерминирования биологических функций иммуноглобулина, и эти биологические функции называют эффекторными функциями. Как известно в данной области тяжелые цепи подклассов иммуноглобулинов содержат четыре или пять доменов: IgM и IgE обладают пятью доменами тяжелой цепи, иIgA, IgD и IgG обладают четырьмя доменами тяжелой цепи. Fc-область IgA, IgD и IgG представляет собой димер доменов "шарнирная область-CH2-CH3", и у IgM и IgE она представляет собой димер доменов"шарнирная область-CH2-CH3-CH4". Кроме того, CH3-домен IgM и IgE структурно эквивалентен СН 2 домену IgG, и CH4-домен IgM и IgE является гомологом CH3-домена IgG (см., W. Е. Paul, ed., 1993, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, New York). Любая из известных Fc-областей может являться пригодной в качестве Fc-области в модифицированных растворимых слитых конструкциях рецептораFGF и Fc по изобретению. В одном из вариантов осуществления ген, кодирующий Fc-область IgG человека (Fc), получают с помощью обратной транскрипции и PCR с использованием РНК, полученной из лейкоцитов человека, и соответствующих 5'- и 3'-праймеров. Полученные в результате фрагменты ДНК содержат полные последовательности шарнирной области, CH2- и CH3-доменов IgG, и их можно использовать в качестве матрицы для получения вариантов, в которых замещены определенные аминокислоты, как известно в данной области. Праймер, кодирующий пептидный линкер, включающий необязательный участок для фермента рестрикции, можно встроить в ходе процесса PCR. Полученные в результате фрагменты ДНК вставляют в несущий вектор и подтверждают секвенированием ДНК. Предпочтительно используют Fc-область иммуноглобулина гамма-1, которая включает по меньшей мере часть шарнирной области, CH1-область, CH2-область и CH3-область. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина гамма-1 может представлять собой Fc с удаленным CH1 или Fc с удаленным CH2 и включает часть шарнирной области и CH3-область, где CH1- и/или CH2-область можно удалить. Fc с удаленным СН 2 описан у Gillies et al., (1990, Hum. Antibod. Hybridomas, 1:47). Наиболее предпочтительно Fc-область IgG1 содержит последовательность, кодируемую полинуклеотидом, обладающим последовательностью SEQ ID No. 5, и/или аминокислотную последовательность,как представлено на SEQ ID No. 6, или последовательность по меньшей мере с 95% идентичностью с являться пригодными в качестве Fc-области. Кроме того, можно получить делеционные конструкции этих Fc-областей, в которых удалены один или несколько константных доменов. Специалист в данной области может получить такие делеционные конструкции с использованием хорошо известных способов молекулярной биологии. Кроме того, используемая Fc-область может представлять собой область, которая обладает приблизительно 99% или приблизительно 98%, или приблизительно 95%, или приблизительно 90%, или приблизительно 85%, или приблизительно 80%, или приблизительно 75% аминокислотной идентичностью с областью, представленной на SEQ ID No. 6. Конкретные мутации по сравнению с SEQ ID No. 6, которые можно отобрать и использовать по отдельности или в любом сочетании, представляют собой: делецию или замещение одного из Cys внутри первых 20 N-концевых аминокислот; делецию Cys в положении 5 в SEQ ID No. 6; или замещение Cys в положении 5. Выбранная последовательность Fc-области может заметным образом увеличить время полужизни в сыворотке модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc. Модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc по изобретению может содержать шарнирную или спейсерную область, которую можно использовать между растворимой частью рецептора и Fc-областью (Ashkenazi et al., 1997, Current Opinion in Immunology, 9:195-200). Примеры включают гибкий пептидный линкер приблизительно с 20 или менее аминокислотами в длину. Более предпочтительно пептидный линкер может представлять собой по меньшей мере три аминокислоты в длину и/или пептидный линкер, содержащий две или более из следующих аминокислот: глицин, серин,аланин и треонин. В предпочтительном варианте осуществления пептидный линкер не включает участок расщепления протеазой. Наиболее предпочтительный линкер представляет собой SAL (Ser-Ala-Leu). Настоящее изобретение также относится к конструированию полинуклеотидов, кодирующих модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc согласно настоящему изобретению, а также вектор, способный экспрессировать модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc при введении в соответствующую клетку-хозяина. Согласно предпочтительному варианту осуществления полинуклеотид, кодирующий модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc, обладает последовательностью SEQ ID No. 1 или последовательностью,обладающей по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID No. 1. Как применяют здесь, "вектор" понимают как обозначающий любую нуклеиновую кислоту, содержащую интересующую нуклеотидную последовательность и способную к введению в клетку-хозяина и, не обязательно, к экспрессии кодируемого белка или полипептида. Векторы включают линейные нуклеиновые кислоты, плазмиды, фагмиды,космиды и т.п., все они известны специалисту в данной области. Полинуклеотиды, кодирующие FGFR или слитое соединение по изобретению, а также векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, в которые эти векторы можно ввести, также конкретным образом включены в объем изобретения. Наиболее предпочтительно слитые молекулы по изобретению кодируются ДНК, содержащей внеклеточный домен FGFR, слитый на С-конце с Fc1-областью гена иммуноглобулина 1 человека. Fc1 область гена иммуноглобулина 1 содержит, по меньшей мере, часть шарнирного домена и CH3-домена или по меньшей мере часть шарнирного домена, СН 2-домена и СН 3-домена. ДНК, кодирующая химерные полипептидные молекулы согласно настоящему изобретению, может представлять собой свою геномную конфигурацию или свою конфигурацию в виде кДНК. Сигнальные пептиды можно использовать для эффективной инициации транспорта белка через мембрану эндоплазматического ретикулума. Сигнальные последовательности хорошо охарактеризованы в данной области, и известно, что они, как правило,содержат от 16 до 30 аминокислотных остатков, хотя возможны и другие размеры. Подробное рассмотрение последовательностей сигнальных пептидов представлено у von Heijne (1986, Nucleic Acids Res.,14:4683). Согласно предпочтительному варианту осуществления сигнальный пептид получают из сигнального пептида интерлейкина-2 (SEQ ID No. 8), как известно в данной области. Заявителем замечено,что слияние этого пептида с внеклеточным доменом FGFR дает секретируемый белок с гомогенной Nконцевой аминокислотной последовательностью, что не имеет места в случае, если использовать эндогенный сигнальный пептид FGFR. Экспрессирующий вектор, содержащий последовательности, кодирующие модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc по изобретению, помещенную под управление соответствующих транскрипционных и трансляционных регуляторных последовательностей, можно конструировать с помощью технологии рекомбинантных ДНК, как известно в данной области. Такой экспрессирующий вектор вводят в клетку-хозяина любым способом, известным специалисту в данной области. Полученную в результате клетку, содержащую вектор, затем выращивают для продукции модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc или ее фрагмента, с использованием любого способа, известного специалисту в данной области. Согласно изобретению, можно использовать множество экспрессионных систем для экспрессии модифицированных растворимых слитых молекул рецептора FGF и Fc. В одном из аспектов такие экспрессионные системы представляют собой носители, с помощью которых интересующие кодирующие последовательности можно получать и затем очищать, но также представляют собой клетки, которые могут, при транзиентной трансфекции соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями, экспрессировать модифицированную растворимую слитую молекулу рецептора FGF и Fc по изобретению in situ. Клетки млекопитающих обычно используют для экспрессии рекомбинантной модифицированной растворимой слитой молекулы рецептора FGF и Fc, в особенности для экспрессии полноразмерной рекомбинантной модифицированной растворимой слитой молекулы рецептора FGF иFc. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки HEK293 или CHO, в сочетании с вектором, содержащим сигнал для экспрессии, таким как сигнал, несущий элемент промотора главного промежуточного раннего гена цитомегаловируса человека, представляют собой эффективную систему для экспрессии модифицированных растворимых слитых конструкций рецептора FGF и Fc по изобретению (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). Кроме того, клетку-хозяина выбирают так, что она модулирует экспрессию встроенных последовательностей или модифицирует и процессирует продукт гена желаемым специфическим образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг белковых продуктов могут являться важными для функции белка. Разные клетки-хозяева обладают характеристиками и специфическими механизмами для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Соответствующие линии клеток или системы-хозяева выбирают так, чтобы обеспечить правильную модификацию и процессинг экспрессируемой интересующей модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc. Таким образом, можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточными механизмами для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают без ограничения клетки CHO, COS,HEK293, 3T3 или миеломы. Клетку-хозяина можно совместно трансфицировать двумя или более экспрессирующими векторами, включая вектор, экспрессирующий белок по изобретению. Например, клетку-хозяина можно трансфицировать первым вектором, кодирующим модифицированный растворимый слитый полипептид рецептора FGF и Fc, как описано выше, и вторым вектором, кодирующим полипептид гликозилтрансферазы. Альтернативно, второй вектор может экспрессировать малую интерферирующую РНК против гликозилтрансферазы. Для долговременной, высокопродуктивной продукции рекомбинантных белков, предпочтительна стабильная экспрессия. В одном из вариантов осуществления изобретения можно сконструировать линии клеток, которые стабильно экспрессируют модифицированную растворимую слитую молекулу рецептора FGF и Fc. Вместо использования экспрессирующих векторов, которые содержат вирусные ориджины репликации, клетки-хозяева трансформируют ДНК под управлением соответствующих экспрессионных регуляторных элементов, включая промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, участки полиаденилирования и другие соответствующие последовательности, известные специалисту в данной области,и селектируемый маркер. После ведения чужеродной ДНК сконструированным клеткам можно дать возможность расти в течение одних или двух суток в обогащенной среде и затем перенести в селективную среду. Селектируемый маркер на рекомбинантной плазмиде сообщает устойчивость в отношении селекции и дает возможность клеткам стабильно интегрировать плазмиду в хромосому и развиться в линию клеток. Ряд систем селекции можно использовать согласно изобретению, включая в качестве неограничивающих примеров гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (Szybalska et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 48:202), селекции с помощью глутаматсинтетазы в присутствии метионинсульфоксимида (Adv Drug Del Rev, 2006,58:671 и вебсайт или литература от Lonza Group Ltd.) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al.,1980, Cell 22:817) в клетках tk, hgprt или aprt, соответственно. Также устойчивость к антиметаболитам можно использовать в качестве основы для селекции на следующие гены: dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Wigler et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA 77:357); gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan et al., 1981, Proc Natl Acad Sci USA 78:2072); neo, который придает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Wu et al., 1991, Biotherapy 3:87); и hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Способы, известные в данной области технологии рекомбинантных ДНК, можно обычным образом использовать для селекции требуемого рекомбинантного клона, и такие способы описаны, например, в Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons (1993). Уровни экспрессии модифицированной растворимой слитой молекулы рецептора FGF и Fc можно повышать путем амплификации вектора. Если маркер в векторной системе, экспрессирующей модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc,можно амллифицировать, то повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре, будет повышать количество копий маркерного гена. Так как амплифицируемая область ассоциирована с геном, кодирующим модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc по изобретению,продукция указанной модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc также возрастет (Crouse ef al., 1983, Mol Cell Biol 3:257). Специалисту в данной области известен ряд факторов, которые влияют на уровень гликозилирования гликопротеина. Например, модифицированные клетки-хозяева млекопитающих можно использовать для изменения профиля гликозилирования модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc путем повышения или снижения экспрессии гликозилтрансферазы. Такие модифицированные клетки-хозяева млекопитающих включают без ограничения клетки CHO, COS, HEK293, PER.C6,3T3, YB2/0 и миеломы (Stanley et al., 1986, Archives of Biochemistry and Biophysics, 249:533; Mori et al.,2006, Biotechnology and Bioengineering 94:68; Chitlaru et al., 1998, Biochem. J. 336:647; Umana et al., 1999Nature Biotechnology 17:176). Специалисту в данной области также известно, что факторы биопроцессинга влияют на биосинтез олигосахаридов гликопротеинов (Goochee et al., 1994, Curr Opin Biotechnol. 5:546). Эффект условий культивирования клеток, таких как концентрация глюкозы или ионов аммония,pH, сыворотка, и эффекты других факторов биопроцессинга, таких как скорость роста клеток, время культивирования, влияют на N-связанное гликозилирование (Biotechnol. Bioeng. 39:327 (1993);Biotechnol. Bioeng. 68:370 (2000); Bio/technology 11:720 (1993); Cytotechnology 17:13 (1995); Biochem J. 272:333 (1990. Известно также, что в дополнение к клеткам-хозяевам и факторам биопроцессинга, на процессинг олигосахаридов влияют местное окружение в каждом участке N-гликозилирования, в зависимости от местного окружения гликопротеина. Различия от участка к участку могут быть значительными, как те, которые наблюдают для t-PA, или могут включать более тонкие отличия в разветвлении и конечном процессинге, как те, которые наблюдают для трех участков N-гликозилирования EPO (Goocheeet al., 1991, Bio/Technology 9:1347). После осуществления продукции модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептораFGF и Fc по изобретению можно очищать любым способом, известным в данной области для очистки молекулы иммуноглобулина, например хроматографией (например, ионообменной, аффинной, в частности по аффинности к белку А для Fc, и т.п.), центрифугированием, по дифференциальной растворимости или с помощью любого другого общепринятого способа очистки белков. Количественное определение сиаловой кислоты (остатков N-ацетилнейраминовой кислоты), анализ углеводного состава и количественное олигосахаридное картирование N-гликанов в очищенных модифицированных растворимых слитых белках рецептора FGF и Fc можно осуществлять в существенной степени, как описано ранее (Saddic et al. Methods Mol. Biol. 194:23-36 (2002) и Anumula et al. Glycobiology 8:685-694 (1998. Слитые белки, содержащие растворимые домены рецептора FGF, можно продуцировать способами для любой другой экспрессируемой или биологически активной слитой конструкции млекопитающих, с которыми знакомы специалисты в данной области, с соответствующими изменениями. Например, как сообщалось, способы сочетания Fc-областей IgG с доменами цитокинов и растворимых рецепторов можно применить для конструирования и продукции соединений FGFR по изобретению (см., например, Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989); Chamow et al., Trends Biotechnol., 14:52-60 (1996); US 5116964,5349053 и 5541087). Другие примеры слитых белков рецептор-Ig, которые можно применять, включают примеры в US 5726044, 5707632 и 5750375. Так как внеклеточные домены рецептора FGF обладают значительной степенью гомологии с семейством иммуноглобулиновых генов, и внеклеточный домен FGFR содержит Ig-подобные сегменты, использование Fc-областей является особенно предпочтительным. В одном из примеров слитая конструкция представляет собой гомодимерный белок, связанный посредством остатков цистеина в шарнирной области IgG Fc, что приводит к молекуле с характеристиками, сходными с молекулой IgG. Одним из преимуществ использования Fc-области является увеличенное время полужизни в циркуляции. Кроме того, модификации по гликозилированию модифицированных растворимых слитых белков рецептора FGF и Fc по изобретению приводят к улучшению фармакокинетических свойств, так как слитые конструкции по изобретению обладают фармакокинетическими профилями invivo, сравнимыми с IgG человека сходного изотипа. Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения модифицированного растворимого слитого белка рецептора FGF и Fc, содержащего фрагмент или доменFGFR, гибкий пептидный линкер и вариант IgG Fc человека, где способ включает: (a) получение линии клеток, происходящей из СНО; (b) выращивание линии клеток в условиях, таких, что происходит экспрессия рекомбинантного слитого белка; и (c) очистка экспрессируемого белка со стадии (b). В этом случае, предпочтительно гибкий пептидный линкер, содержащий, по меньшей мере, приблизительно 3 аминокислоты между растворимым рецептором FGF и вариантом IgG Fc человека, содержит две или более аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из глицина, серина, аланина и треонина. В дополнительных и связанных вариантах осуществления линкерный пептид отсутствует или представляет собой только одну аминокислоту в длину. В предпочтительном варианте осуществления пептидный линкер не содержит участок расщепления протеазой. Наиболее предпочтительный линкер представляет собой SAL(Ser-Ala-Leu). Предпочтительно модифицированный растворимый слитый белок рецептора FGF продуцируют в клетках CHO суспензионным способом, как описано здесь в примерах. Как здесь показано в примерах, модифицированные растворимые слитые конструкции рецептораFGF и Fc по настоящему изобретению обладают противоопухолевой активностью, по меньшей мере,посредством индукции ответов в виде ADCC и/или CDC и, таким образом, пригодны при лечении метастатических опухолей и заболеваний, таких как рак. Один из аспектов изобретения, таким образом, отно-9 018700 сится к модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc, как описано выше, с активностями в отношении ADCC и/или CDC. Особый интерес представляют модифицированные растворимые слитые конструкции рецептораFGF и Fc с повышенной способностью опосредовать клеточные цитотоксические эффекторные функции,такие как ADCC. Такие белки можно получать, производя одиночные или множественные замещения вFc-области молекулы, таким образом, изменяя ее взаимодействие с Fc рецепторами. Способы конструирования таких мутантов можно найти, например, в Lazar et al. (2006, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(11):4005-4010) и Okazaki et al. (2004, J. Mol. Biol. 336(5):1239-49). См. также WO 03/074679, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO 2006/047350, WO 2006/019447, WO 2006/105338, WO 2007/041635. Также возможно использование линий клеток, конкретным образом сконструированных для продукции улучшенных модифицированных растворимых слитых конструкций рецептора FGF и Fc. В частности,эти линии обладают измененным регулированием пути гликозилирования, приводя к модифицированным растворимым слитым конструкциям рецептора FGF и Fc, которые слабо фукозилированы или даже полностью дефукозилированы. Такие линии клеток и способы их конструирования описаны, например, вWO 99/54342. Способы ингибирования роста опухоли у субъекта и способы лечения или предотвращения метастазирования у субъекта, включающие введение эффективного количества таких модифицированных растворимых слитых конструкций рецептора FGF и Fc, как описано выше, представляют собой аспект изобретения. Изобретение, таким образом, также относится к модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc, как описано выше, в качестве лекарственного средства. Настоящее изобретение также относится к применению модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc, как описано выше, для получения лекарственного средства для лечения или ингибирования роста опухоли у субъекта. Другой аспект изобретения относится к фармацевтическим композициям модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc по изобретению. Фармацевтические композиции по изобретению, как правило, содержат модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Как применяют здесь, "фармацевтически приемлемый носитель" включает все без исключения растворители,буферы, солевые растворы, диспергенты, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства,изотонические и замедляющие всасывание средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Тип носителя можно выбрать на основе намеченного способа введения. В различных вариантах осуществления носитель пригоден для внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, местного, трансдермального или перорального введения. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или коллоидные растворы и стерильные порошки для полученияex tempora стерильных растворов или коллоидных растворов для инъекций. Использование сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Как подробно рассмотрено ниже в данном описании, дополнительные активные соединения можно также вносить в композиции, такие как противораковые и/или антиангиогенные средства; в частности, дополнительное активное соединение может являться антиангиогенным средством, химиотерапевтическим средством или низкомолекулярным средством. Типичную фармацевтическую композицию для внутривенной инфузии можно получать таким образом, чтобы она содержала 250 мл стерильного раствора Рингера и 100 мг сочетания. Фактические способы получения парентерально вводимых соединений хорошо известны или очевидны специалистам в данной области и описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985) и его 18-ом и 19-ом изданиях, которые приведены здесь в качестве ссылки. Модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc по изобретению можно также получать с носителями и формуляциями с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые и биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген,полиортоэфиры, полимолочную кислоту и сополимеры полимолочной, полигликолевой кислот (PLG). Специалистам в данной области, как правило, известно множество способов получения таких формуляций. Модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc в композиции предпочтительно получают в формуляций в эффективном количестве. "Эффективное количество" относится к количеству, эффективному, в необходимых дозировках и в течение необходимых периодов времени, для достижения требуемого результата, такого как модуляция активности FGF и/или FGFR и индукция ответов в виде ADCC и/или CDC. "Терапевтически эффективное количество" означает количество, достаточное для оказания влияния на курс лечения состояния конкретного заболевания. Терапевтически эффективное количество представляет собой также количество, в котором любые токсические или вредные эффекты перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами. Для терапевтических применений модифицированные растворимые слитые конструкции рецептораFGF и Fc по изобретению вводят млекопитающему, предпочтительно человеку, в фармацевтически приемлемой лекарственной форме, такой как формы, рассмотренные выше, включая формы, которые можно вводить человеку внутривенно в виде болюса или непрерывной инфузией в течение периода времени,внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным, интратекальным, пероральным, местным или ингаляционным способами. Модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора FGF и Fc также соответствующим образом вводят интратуморальным, перитуморальным, внутриочаговым или околоочаговым способами для вызывания местных, а также системных терапевтических эффектов. Как ожидают, внутрибрюшинный способ особенно пригоден, например, при лечении опухолей яичника. Режимы дозирования можно приспосабливать для обеспечения оптимального ответа. Например,можно вводить одиночный болюс, можно вводить несколько отдельных доз с течением времени, или дозу можно пропорционально понижать или повышать. Композиции по изобретению можно вводить субъекту для влияния на активность клеточного роста у субъекта. Как применяют здесь, термин "субъект" предназначен для включения живых организмов, у которых имеет место FGF-зависимый клеточный рост, и, в частности, включает млекопитающих, таких как кролики, собаки, кошки, мыши, крысы, обезьяны, их трансгенные виды и человека. Модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора FGF и Fc и фармацевтические композиции по изобретению пригодны при лечении или предотвращении множества видов рака, включая (в качестве неограничивающих примеров) следующее: карциному, включая карциному мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, головы и шеи, почки, включая почечноклеточную карциному,печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи; включая плоскоклеточную карциному; гематопоэтические опухоли лимфоидного происхождения, включая лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Тклеточную лимфому, лимфому Беркитта; гематопоэтические опухоли миелоидного происхождения,включая острый и хронический миелогенные лейкозы и промиелоцитарный лейкоз; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому; другие опухоли, включая меланому, семиному, тератокарциному, нейробластому и глиому; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому; и другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциному, и другие виды рака, которые еще не определены, но которые вызываются сверхэкспрессией FGF. В предпочтительном варианте осуществления модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc по изобретению применяют для лечения меланомы, лейкоза, рака почки, рака толстой кишки, рака яичника, рака предстательной железы, рака легкого, рака мочевого пузыря,рака молочной железы или рака головы и шеи. Настоящее изобретение, таким образом, относится к применению модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc, описанной выше, для получения лекарственного средства для лечения или ингибирования связанных с раком заболеваний у субъекта. Аспект или цель настоящего изобретения состоит в предоставлении способа лечения заболеваний и процессов, которые возникают в результате пролиферации раковых клеток, и композиции для лечения или подавления роста рака. Другой аспект изобретения состоит в предоставлении композиций и способов, пригодных для генной терапии для регуляции рака. Способ по настоящему изобретению можно применять, в частности, для лечения меланомы, лейкоза, рака почки, рака толстой кишки, рака яичника, рака предстательной железы, рака легкого, рака мочевого пузыря, рака молочной железы или рака головы и шеи. Эффективность модифицированной растворимой слитой конструкции рецептора FGF и Fc по предотвращению или лечению заболевания можно улучшать введением указанной слитой конструкции последовательно или в сочетании с другим средством, которое эффективно для этих целей, таким как фактор некроза опухолей (TNF), антагонист, способный ингибировать или нейтрализовать ангиогенную активность кислого или основного фактора роста фибробластов (FGF), фактора роста тромбоцитов (PDGF) или фактора роста гепатоцитов (HGF), антагонист, способный ингибировать или нейтрализовать коагулирующие активности тканевого фактора, белка С или белка S (смотри WO 91/01753), антагонист, такой как антитела, способный связываться с рецептором HER2 (смотри US 5772997), или одно или несколько общепринятых терапевтических средств, таких как, например, алкилирующие средства, антагонисты фолиевой кислоты, антиметаболиты метаболизма нуклеиновых кислот, антибиотики, аналоги пиримидина, 5-фторурацил, цисплатин, пуриновые нуклеозиды, амины, аминокислоты, триазоловые нуклеозиды или кортикостероиды. В другом аспекте изобретения введение сочетают с введением терапевтически эффективного количества химиотерапевтического средства, такого как, например, таксол (паклитаксел) или таксотер (доцетаксел). Химиотерапевтические средства включают в качестве неограничивающих примеров антимикротрубочковые средства, такие как дитерпеноиды и алкалоиды барвинка; координационные комплексы платины; алкилирующие средства, такие как аналоги горчичного газа, оксазафосфорины, алкилсульфонаты,- 11018700 нитрозомочевины и триазены; антибиотические средства, такие как антрациклины, актиномицины и блеомицины; ингибиторы топоизомеразы II, такие как эпиподофиллотоксины; антиметаболиты, такие как аналоги пуринов и пиримидинов и антифолатные соединения; ингибиторы топоизомеразы I, такие как камптотецины; гормоны и аналоги гормонов; ингибиторы путей передачи сигнала; ингибиторы ангиогенеза, связанного с нерецепторной тирозинкиназой; иммунотерапевтические средства; проапоптотические средства; и ингибиторы передачи сигнала в клеточном цикле. Кроме того, способы по изобретению можно сочетать с другим противораковым лечением, антиангиогенным средством или химиотерапевтическим средством или радиотерапией. Предпочтительным примером является доцетаксел или таксотер. Другие примеры включают гемцитабин, цисплатин, дитерпеноиды и алкалоиды барвинка, паклитаксел, винбластин, винкристин и винорелбин, карбоплатин, циклофосфамид, мелфалан и хлорамбуцил, бусульфан, кармустин, дакарбазин,циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, кармустин, дакарбазин, антинеопластические средства, включая в качестве неограничивающих примеров, актиномицины, такие как дактиномицин, антроциклины, такие как даунорубицин и доксорубицин, блеомицины, эпиподофиллотоксины, этопозид и тенипозид; антиметаболические неопластические средства, 5-фторурацил, метотрексат, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, камптотецины, иринотекан-HCl и топотекан-HCl. Можно также выбрать множество различных химиотерапевтических средств или противораковых полипептидов. Источники информации, такие как www.clinicaltrials.gov, www.ncbi.nlm.nih иwww.drugs.com. содержат ссылки на полипептиды и средства, которые можно выбрать. Другие средства, например антиангиогенные средства или химиотерапевтические средства, могут присутствовать во вводимой композиции, или их можно вводить по отдельности. В одном из аспектов изобретения введение осуществляют с другим активным средством или одновременно или по отдельности, или последовательно с течением времени. Если введение осуществляют одновременно, то два активных средства можно сочетать в одной фармацевтической композиции, содержащей две композиции,такой как таблетка или гелевая капсула. С другой стороны, два активных средства, при одновременном или неодновременном введении, могут присутствовать в отдельных фармацевтических композициях. Для этой цели, сочетание может находиться в виде набора, содержащего, с одной стороны, модифицированную растворимую слитую конструкцию рецептора FGF и Fc, как описано выше, и, с другой стороны,второе активное средство, где модифицированная растворимая слитая конструкция рецептора FGF и Fc,как описано выше, и второе активное средство находятся в разных отделениях и предназначены для введения одновременно, по отдельности или последовательно с течением времени. Сочетание согласно настоящему изобретению можно вводить в особенности при противоопухолевой терапии в сочетании с химиотерапией, белковой терапией (т.е., с использованием терапевтического средства, такого как антитела или рекомбинантный белок), генной терапией, радиотерапией, иммунотерапией, хирургическим вмешательством или их сочетанием. Длительная терапия равновозможна в качестве адъювантной терапии в контексте других стратегий лечения, как описано выше. Примеры, которые следуют далее, только иллюстрируют объем этого изобретения и содержание этого описания. Специалист в данной области может разработать и сконструировать множество модификаций примеров, перечисленных ниже, без отступления от объема этого изобретения. Примеры Пример 1. Продукция sFGFR2-Fc с высоким содержанием сиаловой кислоты и низким клиренсом в крови в HEK293. кДНК, кодирующие -1,4-галактозилтрансферазу человека (B4GT1) (SEQ ID No. 9) или -2,3 сиалилтрансферазу человека (SIAT6) (SEQ ID No. 11), получали из клональной коллекции (Invitrogen) и клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих pXL4214, экспрессия с которого управляется промотором CMV. Тот же экспрессирующий вектор также использовали для клонирования слитого белка sFGFR2-Fc и получения pXL4410. Карта плазмид pXL4551, кодирующей B4GT1, pXL4544, кодирующей SIAT6, и pXL4410, кодирующей модифицированную растворимую слитую конструкцию FGFR2IIIcFc (обозначенную здесь как sFGFR2-Fc), а также нуклеиновая кислота и соответствующая аминокислотная последовательность B4GT1 (фиг. 2), SIAT6 (фиг. 3) и sFGFR2-Fc (фиг. 4 А и В), представлены на фиг. 1 и 5. sFGFR2-Fc продуцировали в прикрепленных клетках HEK293 EBNA (Invitrogen) транзиентной трансфекцией одной тремя экспрессионными плазмидами, кодирующими sFGFR2-Fc, B4GT1 или SIAT6 в комплексе с JET PEI (Q-Biogen). Соотношение плазмид составляло 90/5/5 дляpXL4410/pXL4544/pXL4551. Соотношение плазмид нужно было оптимизировать для обеспечения оптимальной продуктивности и качества полипептида sFGFR2-Fc. Секретируемые белки собирали через восемь суток после трансфекции и центрифугировали. Белки очищали аффинной хроматографией на протеин-G-сефарозе (Amersham Biosciences) после элюции с колонки 100 мМ глицином/HCl, pH 2,7. Из белков sFGFR2-Fc получали формуляцию в PBS и фильтровали через 0,22 мкм. Концентрацию белка определяли анализом microBC (Interchim). Количественное определение сиаловой кислоты, анализ углеводного состава и количественное олигосахаридное картирование N-гликанов в очищенных белках sFGFR2-Fc осуществляли в существенной степени, как описано ранее (Saddic et al. 2002. Methods Mol. Biol. 194:23-36 и Anumula et al. 1998. Glyco- 12018700biology 8:685-694). Во-первых, остатки сиаловой кислоты высвобождали после мягкого гидролизаsFGFR2-Fc и осуществляли флуоресцентное мечение орто-фенилендиамином, и разделяли обращеннофазной HPLC. Индивидуальные пики детектировали флуоресцентной детекцией (возбуждение 230 нм; испускание 425 нм), идентифицировали и количественно определяли сравнением со стандартами Nацетилнейраминовой и N-гликолилнейраминовой кислот. Во-вторых, углеводный состав определяли после кислотного гидролиза образцов sFGFR2-Fc для высвобождения индивидуальных моносахаридов. После гидролиза получали производные моносахаридов (нейтральных Сахаров и аминосахаров) с помощью антраниловой кислоты и затем разделяли обращенно-фазной HPLC, и детектировали флуоресцентной детекцией (возбуждение 360 нм; испускание 425 нм). Индивидуальные пики идентифицировали и количественно определяли сравнением со стандартами моносахаридов. В-третьих, олигосахариды ферментативно высвобождали с помощью ПНГазы F и флуоресцентно метили антраниловой кислотой перед разделением по количеству в них остатков сиаловой кислоты с помощью нормальной фазово-анионной обменной HPLC на колонке Asahipak-NH2P (Phenomenex). Меченые гликаны детектировали и количественно определяли детекцией флуоресценции (возбуждение 360 нм; испускание 425 нм). Среднее количество сиаловой кислоты на N-гликан в домене FGFR2 вычисляли на основе общего количества моль Nгликана на моль FGFR2-Fc и моль N-гликана на моль Fc после высвобождения Fc папаином. Очищенные белки sFGFR2-Fc инъецировали в хвост мышей Swiss Nude (Charles River). Всего использовали трех мышей на партию белка. Кровь собирали через 6 ч после инъекции 500 мкг sFGFR2-Fc,получали плазму и концентрацию FGFR2-FC определяли с помощью ELISA с использованием двухвалентного способа с помощью моноклональных антител против FGFR2 человека (RD system) и конъюгированных поликлональных антител против IgG-HRP человека (Pierce) (2 анализа в 2 разведениях в трех параллелях). В контрольных экспериментах мышей предварительно обрабатывали фетуином и асиалофетуином за один час перед инъекцией SFGFR2-Fc. На табл. 1 суммировано состояние продукции разных партий sFGFR2-Fc, N-гликановый профиль и моносахаридный состав каждой партии и концентрация в плазме sFGFR2-Fc спустя 6 ч после внутривенной инъекции мышей. Таблица 1. Содержание N-гликанов и фармакокинетика FGFR2-FC, продуцируемого в HEK293. Улучшенный паттерн сиалирования слитых белков sFGFR2-Fc, продуцированных в HEK293EBNA,показан при транзиентной совместной экспрессии слитого белка с -1,4-галактозилтрансферазой человека или -2,3-сиалилтрансферазой человека. Это значительное улучшение статуса сиалирования показано снижением в 2 раза процентной доли несиалированных гликанов, повышением в 2 раза суммарного содержания сиаловой кислоты на моль белка и повышением в 2,5 раза среднего количества сиаловой кислоты на N-гликан. Известное содержание моносахаридов не было затронуто (см. табл. 1). Это повышение в 2,5 раза сиалированных N-гликанов прямо коррелировало со значительным улучшением фармакокинетических параметров sFGFR2-Fc. В частности, возрастание в 100 раз количества sFGFR2-Fc в плазме было измерено спустя 6 после инъекции i.v. мышей. Также происходило улучшение фармакокинетики в 100 раз при предварительной обработке мышей асиалофетуином в сравнении с предварительной обработкой фетуином. Асиалофетуин, но не фетуин, как известно, связывается с асиалогликопротеиновым рецептором в печени (ASGPR) (Webster et al., 2003,Xenobiotica 33:945). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что специфическое связывание с асиалогликопротеиновым рецептором посредством экспонированных концевых остатков галактозы из N-гликана отвечает за клиренс sFGFR2-Fc, в то время как присутствие одной сиаловой кислоты на N-гликан на sFGFR2-Fc значительно снижает этот клиренс. Пример 2. Скрининг стабильных клонов CHO, экспрессирующих белок sFGFR2-Fc со среднем количеством остатков сиаловой кислоты на N-гликан FGFR2 более 1,2, для оптимальной фармакокинетики. Экспрессионную плазмиду млекопитающих pXL4636 для стабильной экспрессии sFGFR2-Fc в клетках CHO получали из плазмиды рЕЕ 14.4, кодирующей селективный маркер глутаминсинтетазу(Lonza), и плазмиды pXL4410, содержащей последовательность кДНК, кодирующей sFGFR2-Fc, фиг. 5. Плазмиду pXL4636 вводили в клетки CHO K1 с помощью нуклеофекции с использованием набора Nucleofactor с линией клеток АМАХА, как рекомендовано поставщиком. Трансфицированные клетки переносили в селективную среду, и после размножения клеток семь лучших полуклонов-продуцентовCHO/GS (SC 9, 11, 26, 58, 112, 118, 170) скринировали на содержание сиаловой кислоты в очищенных молекулах sFGFR2-Fc. Два полуклона с самым высоким содержанием сиаловой кислоты (SC 11 и 118) отбирали для клонирования и увеличения масштаба продукции; в частности, клон из SC 118 далее описан как GC111. Хотя молекулы sFGFR2-Fc, полученные изо всех полуклонов, обладали высоким содержанием сиаловой кислоты, они не обладали одинаковой фармакокинетикой. Интересно отметить наблюдение, что из двух полуклонов (SC 11 и 118) sFGFR2-Fc с наиболее высоким содержанием сиаловой кислоты приводил к самой высокой концентрации sFGFR2-Fc в крови спустя 6 ч после инъекции i.v. мышей, как описано в табл. 2. И из двух клонов (SC 9 и 170) sFGFR2-Fc с самым низким содержанием сиаловой кислоты обладал самой низкой концентрацией sFGFR2-Fc в крови спустя 6 ч после инъекции i.v. мышей. Таблица 2. Стабильные клоны CHO, экспрессирующие белок sFGFR2-Fc с соотношением остатков сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2 более 1,2 для оптимальной фармакокинетики Скрининг клонов на основе высокой степени сиалирования N-гликана sFGFR2-Fc обладает предсказательной силой в отношении оптимальных параметров фармакокинетики sFGFR2-Fc. Пример 3. Корреляция между средним количеством сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2 и клиренсом sFGFR2-Fc в крови. В другом эксперименте, сходном с экспериментом, описанным в примере 2, стабильные клоныCHO/DHFR, экспрессирующие SFGFR2-Fc, получали с использованием селекции в отношении DHFR и системы амплификации с соответствующими экспрессионными плазмидами млекопитающих pXL4429 иpXL4417 (фиг. 6). Эти клоны CHO-DHFR также скринировали на содержание сиаловой кислоты на молекулу sFGFR2-Fc и также анализировали клиренс sFGFR2-Fc, продуцируемого этими клонами. Среднее количество сиаловой кислоты на N-гликан в домене FGFR2 подсчитывали на основе суммарного количества моль N-гликана на моль FGFR2-FC и моль N-гликана на моль Fc, полученного после высвобождения Fc папаином. Результаты, представленные на фиг. 7, показывают, что соотношение остатков сиаловой кислоты на N-гликан FGFR2 более 1,2 обеспечивает оптимальную концентрациюsFGFR2-Fc в крови по сравнению с оптимальной концентрацией в крови, найденной для молекул Fc. Только отобранные клоны достигали этого оптимального соотношения. Таким образом, скрининг клонов по соотношению остатков сиаловой кислоты на N-гликан FGFR2 позволяет специалисту предсказать низкий клиренс sFGFR2-Fc в крови. Пример 4. Аминокислотная последовательность слитого белка sFGFR2-Fc. Белок sFGFR2-Fc, кодируемый плазмидой pXL4410 или pXL4636, или pXL4429 (фиг. 5 и 6), представляет собой слитый белок последовательности растворимого FGFR2 человека и Fc-фрагмента, полученного из последовательности IgG1 человека. Последовательность полинуклеотида, кодирующего sFGFR2-Fc, представлена на SEQ ID No. 1 и на фиг. 4 А. Сходным образом, полная аминокислотная последовательность белка sFGFR2-Fc представлена на SEQ ID No. 2 на фиг. 4 В. Аминокислоты положений с 1 по 350 соответствуют изотипу FGFR2IIIC (см. фиг. 4 С, SEQ ID No. 4) и являются аминокислотами положений с 27 по 376, описанными в SwissProt(FGFR2HUMAN). Аминокислоты положений с 354 по 584 являются аминокислотами IgG1 положений с 99 по 329, как описано в SwissProt (IGHG1HUMAN); см. фиг. 4D и SEQ ID No. 6. Аминокислоты положений с 351 по 353 представляют собой аминокислоты синтетического линкера SAL (Ser Ala Leu), см. фиг. 4 Е. Пример 5. Определение содержания N-гликана sFGFR2-Fc, продуцируемого стабильным клономCHO GC111. Были оптимизированы условия для продукции sFGFR2-Fc, таким образом, чтобы соотношение остатков сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2 могло превышать 1,2. Этот пример предоставляет условия для достижения этого состояния. В биореактор 5-L Celligen (New Brunswick), заполненный 4,4 л безбелковых сред CD-CHO с добав- 15018700 лением 100 мкм MSX и IX добавок GS, высевали клон GC111 с начальной плотностью клеток из расчета 3,5105 клеток/мл и культивировали при 37C. Применяли аэрацию барботированием с использованием смеси кислорода, азота, воздуха и диоксида углерода или чистого кислорода и насыщение воздуха растворенным кислородом поддерживали из расчета 30%. pH поддерживали при 7,2 добавлением диоксида углерода и инжекцией 1 М бикарбоната натрия в культуральную среду. Используемая скорость перемешивания составляла 110 об/мин с использованием импеллера с подъемом клеток. Осуществляли непрерывную подпитку питательным раствором (450 г/л глюкозы) для поддержания глюкозы на целевом уровне из расчета 2-3 г/л. Подпитку начинали на 5 сутки, когда остаточная концентрация глюкозы достигала 2,5 г/л. Непрерывную подпитку питательными веществами осуществляли на основе предполагаемого клеточного роста и потребления глюкозы, со скоростью подпитки добавками, равной скорости потребления глюкозы. Концентрацию глутамата поддерживали из расчета 1-3 ммоль/л пульсовым добавлением после ежедневного контроля в отключенном режиме. Осуществляли наблюдение культуры клеток в отношении количества клеток, жизнеспособности и метаболитов (глюкозы, лактата, глутамина, аммиака и глутамата), и в отношении концентрации продукта в ходе фазы продукции. Культивирование останавливали при снижении жизнеспособности клеток до 55% и осуществляли сбор культуры. Собранную культуру клеток осветляли, и sFGFR2-Fc очищали аффинной хроматографией (ProsepvA, Millipore) и двумя стадиями ионообменной хроматографии, затем стерильно фильтровали и хранили в фосфатносолевом буфере перед дальнейшим анализом и тестированием in vivo. Кажущаяся молекулярная масса sFGFR2-Fc, полученная с помощью анализа SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях, составляла 180 кДа. Это отличалось от теоретической молекулярной массы 130 кДа, вычисленной на основе аминокислотной последовательности гомодимера sFGFR2-Fc. Это значительное различие между кажущейся и вычисленной молекулярной массами объяснялось дополнительным наличием приблизительно 30% N-гликанов, см. табл. 3. Действительно, при расщеплении sFGFR2Fc пептид-N-гликозидазой F (ПНГаза F, Roche) с последующим анализом SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях, молекулярная масса дегликозилированного sFGFR2-Fc составила приблизительно 160 кДа (фиг. 7). Углеводный состав и N-гликановый профиль sFGFR2-Fc проанализирован, как описано в примере 1, и представлен в табл. 3. Таблица 3. Углеводный состав и N-гликановый профиль sFGFR2-Fc, продуцируемого в оптимальных условиях В сравнении с результатами, представленными на табл. 2, sFGFR2-Fc, полученный из клона GC111 в оптимальных условиях, обладал более значительным сиалированием N-гликана, чем SFGFR2-Fc, полученный из полуклона SC118, родителя клона GC111, продуцируемого в стандартных условиях. Например, % несиалированных форм снижался с 43 до 30%. На основе суммарного количества моль N-гликана на моль FGFR2-FC и моль N-гликана на моль Fc,полученного после высвобождения Fc папаином, измерено, что семь N-гликанов приходится на FGFR2. Таким образом, большинство участков домена FGFR2 почти все полностью заняты. Пример 6. Участки N-гликозилирования важны для аффинности и продуктивности FGF. Слитый белок sFGFR2-Fc обладает восемью участками N-гликозилирования в домене FGFR2 и одним в Fc-домене, см. фиг. 8 и табл. 5 для определения положений N-гликана N1-N8. Получены белки 4493 и 4565, два варианта sFGFR2-Fc, которые больше не обладают Ig-подобным доменом 1. 4493 обла- 16018700 дал характеристиками, сходными с FGFR2-FC дикого типа, происходящим из pXL4636, в терминах продуктивности и связывания с FGF-2 или гепарином. В то же время, 4565, в котором осуществили мутагенез всех участков гликозилирования в домене FGFR2 (замещение N на Q), не смог быть охарактеризован вследствие более чем 50-кратного снижения продуктивности мутанта, см. табл. 4. Таблица 4. Физико-химические характеристики вариантов sFGFR2-Fc Связывание с FGF-2 определяли на приборе BIAcore с использованием модели "двустадийной реакции с изменением конформации", как описано в Gamsjaeger et al., Biochem. J. 7 Apr. 2005/BJ20050156. В кратком изложении интегрирование осуществляли на полной сенсограмме за исключением областей "объемного эффекта". Диапазон концентрации выбирали между 1 и 8 нМ. Способ одновременной кинетики ka/kd дает возможность измерять две ka и две kd, исходя из следующих уравнений:ka1 и kdi для А+В АВ ка 2 и kd2 для АВ АВ,которые могут представлять димеризацию комплексов (FGF - FGFR2-Fc). Константу диссоциации KD вычисляли из следующей формулы: Согласно двум опубликованным конкурирующим моделям (симметричная двухконцевая модель отMohammadi и асимметричная модель от Pellegrini), участки с N3 по N7 могут потенциально взаимодействовать с аминокислотными остатками или FGF1 или FGFR2c, и/или взаимодействовать с гепарином, в то время как маловероятно, что участок N8 вовлечен во взаимодействия во всех кристаллических структурах (Pellegrini et al. 2000. Nature 407:1029; Ibrahimi et al. 2005 Mol. Cell. Biol. 25:671). На основе вышеизложенной информации уместно исследовать участки N-гликозилирования в положениях с N3 по N7 путем замещения соответствующего Asn на Gin и путем сохранения положения N8 без изменений для обеспечения значительной продуктивности. Позиционное влияние N-гликанов на физико-химические характеристики sFGFR2-Fc оценивали статистически в двухуровневом дробном факторном эксперименте. Выбирали пять переменных (занятость участка гликозилирования в положениях сN3 по N7) и исследовали 16 независимых конструкций. Планирование дробного эксперимента 25-1 и анализ данных осуществляли, как описано (Statistics for Experimenters, G. Box Ed., Willey, 1978). План дробного факторного эксперимента Сайт-специфичные варианты N-гликозилирования проектировали на основе 4493 и факторного плана на двух уровнях с пятью переменными (с N3 по N7), которые могли находиться или на плюсуровне (N) или на минус-уровне (Q). План являлся дробным с 16 конструкциями (25-1, т.е. разрешение плана V), позволяя идентифицировать основные эффекты и 2-факторные взаимодействия, но соединяя 2 факторные взаимодействия с 3-факторными. 16 плазмидных конструкций получили с помощью последовательной PCR и клонированием для получения замещения N на Q в положении N3, N4, N5, N6 или N7, но сохраняя положение N8 и участок Nгликозилирования Fc-домена без изменений. Эти варианты белка отличались от 4493 только 2- или 4 точечными мутациями, перечисленными в табл. 5. 16 спланированных конструкций тестировали на продукцию в малом масштабе. Два варианта (4572 и 4574) являлись очень плохими продуцентами (приблизительно 2 мг/л). Оставшиеся 14 конструкций продуцировали в масштабе литра и из них производили очистку параллельно в стандартных условиях с приемлемым выходом продукта. Их затем анализировали путем SDS-PAGE, гель-фильтрации, BIAcore. Результаты анализировали со статистическим дробным факторным разрешением - 25-1 DOE. ПродуктивностьN-гликозилирование в N3, N4, N5, N6, N7 обладало положительным вкладом в продуктивность. Сходный количественный эффект имел место для всех исследованных положений (т.е. N3, N4, N5, N6 иN7), и отсутствовал значимый эффект двухфакторных взаимодействий. Таблица 6. Продуктивность Агрегация Очищенные белки анализировали гель-фильтрацией (Superdex 2000) для количественного определения процентной доли высокомолекулярных форм (HMW; %) в очищенных препаратах. Наиболее высокое значение (наихудший случай) 80,2% HMW получили для 4587 и использовали в анализе DOE для двух конструкций (4572 и 4574), продукцию которых не могли получить (среднее значение процентной доли величины HMW, полученной для 14 конструкций, также использовали для сравнения, что приводило к сходному результату). N-гликозилирование в положении N5 и, в меньшей степени, в положении N6 не способствовало возникновению форм HMW. Взаимодействие N5-N6 обладало сходным эффектом на агрегацию. Связывание с FGF-2 Аффинность связывания с FGF-2 определяли с помощью BIAcore для каждой конструкции. Значения константы диссоциации (KD) между 0,49 и 2,31 нМ получали для конструкций, для которых показана измеримая аффинность. Для конструкций, которые не связываются с FGF-2 или не продуцируются,значение 10 нМ использовали для анализа DOE. N-гликозилирование в положении N5 и, в меньшей степени, в положениях N6 и N3 обладало положительным эффектом на связывание с FGF-2. Взаимодействия N3-N5 и N5-N6 обладали значительным положительным эффектом в отношении связывания, в то время как взаимодействия N3-N6 и N4-N7 обладали отрицательным эффектом в отношении связывания. Таблица 8. Связывание с FGF-2 Это разрешение V 25-1 DOE выявило, что N-гликозилирование обладало положительным влиянием на продуктивность в положениях N3, N4, N5, N6, N7; обладало положительным влиянием на связывание с FGF-2 в положениях N5N6 и N3; и не способствовало появлению высокомолекулярных молекул во всех положениях, особенно N5N6. Таким образом, занятость N-гликана является обязательной в положении N5 и рекомендуемой в положениях N3, N4, N6 и N7 соответственно (положение 265, 228, 241, 297 и 318 соответственно наFGFR2HUMAN (Swissprot). Пример 7. Фармакокинетика слитого белка sFGFR2-Fc В примере 7 sFGFR2-Fc представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID No. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2, равным 1,3. Трех мышей на временную точку инъецировали 500 мкг слитого белка в хвостовую вену. В разные моменты времени после инъекции продукта забирали кровь, на фиг. 10 показана концентрация белка в плазме и печени. На фиг. 11 показано количество выявленного белка в ранние моменты времени в плазме и печени, выраженное в процентной доли от инъецируемой дозы. Фармакокинетические параметры подсчитывали с использованием анализа без компартментализации. Время полувыведения подсчитывали с помощью последних 6 значений данных, которые давали наилучшее соответствие с логлинейной конечной фазой (табл. 9).AUClast - площадь под кривой от времени введения дозы до последней измеримой концентрации.Clobs - суммарный клиренс в организме для экстраваскулярного введения.Tlast - время последней измеримой (ненулевой) концентрации.Vss - оценка объема распределения в стационарном состоянии. После внутривенного введения для sFGFR2-Fc показан благоприятный фармакокинетический профиль с продолжительным временем полувыведения (почти 3 суток) и сниженным суммарным клиренсом в организме. Объем распределения был ограниченным и ниже суммарного объема воды в организме, что позволяет предположить ограниченное распределение в тканях. При 72 ч концентрация sFGFR2-Fc в плазме остается очень высокой, и клиренс также является хорошим. Фармакокинетические параметрыsFGFR2-Fc хорошо совместимы с использованием этого слитого белка в качестве лекарственного средства. Фактически, как показано в примерах, концентрация в плазме после внутривенной инъекции мышей является, по существу, высокой, и клиренс остается очень низким спустя 72 ч после инъекции. Важно отметить, что кинетика расщепления sFGFR2-Fc in vivo является также очень низкой, так как sFGFR2Fc оказался только частично расщепленным (40% после 18 ч), и концентрация полноразмерных молекул оставалась без изменения до 72 ч. Таким образом, для слитой молекулы, как представлено на SEQ ID No. 2, и среднего количества сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2 равного 1,3, показан благоприятный фармакокинетический профиль с продолжительным временем полувыведения (почти 3 суток) и удовлетворительным суммарным клиренсом в организме. Пример 8. Эффективность слитого белка sFGFR2-Fc в модели подкожной опухоли А 549 В этом примере sFGFR2-Fc представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID No. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на N-гликан sFGFR2, равным 1,3. Модель подкожной опухоли А 549 Линию клеток А 549 идентифицировали в качестве опухолевой линии клеток для оценки эффективности sFGFR2-Fc. Заявителем показано in vitro, что эта линия клеток экспрессирует FGF2 и также, чтоsFGFR2-Fc может прекращать аутокринную пролиферацию этих клеток. Модель подкожной опухоли А 549 реализована заявителем на голых мышах Balb/c. Более того, опухоль in vivo экспрессирует FGF2. В этом эксперименте эффективность молекулы sFGFR2-Fc оценивали на модели роста опухоли А 549. Продукты инъецировали подкожно два раза в неделю. Оценивали разные дозы, т.е. 25, 15 и 5 мг/кгsFGFR2-Fc. После полного анализа изменения объема опухоли, три группы, подвергнутые лечению sFGFR2-Fc,статистически отличались по развитию опухоли от группы, обработанной PBS. sFGFR2-Fc оказывает эффект на рост опухоли в этой модели в дозе 5 мг/кг два раза в неделю. Схема эксперимента 5106 клеток А 549 в 200 мкл инъецировали подкожно голым мышам Balb/c на 0 сутки. После инъекции клеток, в те же сутки мышей случайным образом распределяли в количестве 4 по четырем группам исходя из массы тела. Обработки начинали после случайного распределения спустя сутки после инъекции клеток. Каждая группа получала подкожно 500, 300 или 100 мкг/мышь/введение, что соответствует соответственно 25, 15 и 5 мг/кг, два раза в неделю: понедельник и среда, в течение 39 суток. Результаты Анализ объема опухоли Как представлено на фиг. 12, объем опухоли анализировали вплоть до 40 суток. Группы 100 мкг(треугольники), 300 мкг (квадраты) и 500 мкг/мышь/введение (закрашенные круги) статистически отличались от группы с PBS (незакрашенные круги). Авторы настоящего изобретения сделали вывод, чтоsFGFR2-Fc снижает рост опухоли в дозе 25, 15 и 5 мг/кг. Масса опухоли на 40 сутки Как представлено на фиг. 13, опухоли собирали и взвешивали в конце эксперимента. Группы 100 мкг, 300 мкг и 500 мкг/мышь/введение статистически отличались от группы с PBS. Авторы настоящего изобретения сделали вывод, что sFGFR2-Fc согласно настоящему изобретению снижал массу опухоли в дозе 25, 15 и 5 мг/кг. Динамика роста опухоли в группах sFGFR2-Fc100, sFGFR2-Fc300 и sFGFR2-Fc500 статистически отличалась от динамики в группе, обработанной PBS. Слитый белок sFGFR2-Fc согласно настоящему изобретению (аминокислотная последовательность SEQ ID No. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2, равным 1,3) способен в существенной степени замедлять рост опухоли в дозе 5 мг/кг. Пример 9. Эффективность слитого белка sFGFR2-Fc в модели подкожной опухоли Н 460. В Примере 9 sFGFR2-Fc представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID No. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2, равным 1,6. Модель подкожной опухоли H460 Линию клеток H460 идентифицировали в качестве опухолевой линии клеток для оценки эффективности sFGFR2-Fc. In vitro показано, что эта линия клеток экспрессирует FGF2. В этом эксперименте эффективность sFGFR2-Fc оценивали по росту опухоли. Продукты инъецировали подкожно два раза в неделю в дозе 25 мг/кг. После полного анализа динамики объема опухоли оказалось, что sFGFR2-Fc замедлял рост опухоли. Схема эксперимента 5106 клеток H460 в 200 мкл инъецировали подкожно в правую подвздошную область голых мышей Balb/c на 0 сутки. После инъекции клеток, в сутки инокуляции клеток (0 сутки) мышей случайным образом распределяли по измеренной массе тела и размещали по группам лечения. Лечение проводили два раза в неделю подкожными инъекциями (200 мкл) в течение 3 последовательных недель (понедельник и пятница). Первое введение осуществляли на 1 сутки после инокуляции клеток для максимизации воздействия обработки на клетки. Результаты Анализ объема опухоли На фиг. 14 представлен анализ объема опухоли вплоть до 22 суток. Авторы настоящего изобретения сделали вывод о том, что sFGFR2-Fc в существенной степени снижает рост опухоли. Анализ массы опухоли На фиг. 15 представлен анализ массы опухоли на 22 сутки. Авторы настоящего изобретения сделали вывод о том, что SFGFR2-Fc в существенной степени снижает массу опухоли. Динамика роста опухоли в группе с sFGFR2-Fc статистически отличалась от динамики в группе, обработанной PBS. Авторы настоящего изобретения сделали ясный вывод о том, что слитый белок согласно настоящему изобретению (аминокислотная последовательность SEQ ID No. 2 со средним количеством сиаловой кислоты наN-гликан SFGFR2, равным 1,6) способен в существенной степени замедлять рост опухоли H460 в дозе 25 мг/кг. Пример 10. Оценка активности in vitro в отношении ADCC слитого белка sFGFR2-Fc на линиях клеток А 549 и Н 460. В этом примере sFGFR2-Fc представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID No. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2 более 1,6. Способность sFGFR2-Fc опосредовать активность in vitro в отношении ADCC оценивали на обеих выбранных моделях опухолевых клеток H460 и А 549 (см. Примеры 8 и 9). Схема эксперимента Опухолевые клетки (А 549 и Н 460) в PBS с 2% BSA (1 млн/мл) инкубировали 30 мин при 4C с 500 нг/мл FGF2 (RDSystems) и 2 мкг/мл sFGFR2-Fc или контрольным IgG1 человека (Sigma). Опухолевые клетки разводили RPMI с 1% FBS и инкубировали в 96-луночном планшете исходя из 5000 клеток на лунку. Очищенные NK добавляли в соотношении NK/опухолевые клетки как 20/1 и 6/1. Планшеты инкубировали 4 ч при 37C, затем центрифугировали и титровали в супернатанте лактатдегидрогеназу (наборROCHE). 100% лизис получали с использованием 0,2% тритона Х 100. Специфическую ADCC, индуцируемую sFGFR2-Fc, вычисляли согласно требованиям производителя. Результаты Результаты, представленные на фиг. 16, показывают лизис опухолевых клеток, опосредованный натуральными киллерными клетками (NK) в присутствии sFGFR2-Fc, в обеих линиях опухолевых клеток А 549 и Н 460 близко к 25% при соотношении 20/1 (NK/опухолевые клетки), указывая на то, что sFGFR2Fc способен опосредовать эффект ADCC на эти опухолевые клетки. Пример 11. Оценка in vivo активности в отношении ADCC и CDC слитого белка sFGFR2-Fc в модели подкожной опухоли А 549. В этом примере sFGFR2-Fc представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID No. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2 более 1,6. Модель подкожной опухоли А 549 Линию клеток А 549 идентифицировали в качестве опухолевой линии клеток для оценки эффективности sFGFR2-Fc, так как эти клетки экспрессируют FGF2 in vivo на высоком уровне и чувствительны к Линии мышей Три разные линии мышей (мыши SCID, NOD/SCID и SCID/bg) выбрали для оценки способностиsFGFR2-Fc опосредовать активности в отношении ADCC и/или CDC in vivo. У мышей SCID сохранены функции NK и комплемента, и они способны к развитию ответов ADCC и CDC, и их выбрали в качестве положительного контроля. Мыши NOD/SCID не обладают ни функцией NK, ни способностью стимулировать активность комплемента, и они неспособны к развитию активностей ни в отношении ADCC, ни в отношении CDC. Мыши SCID/bg не обладают функцией NK и не способны к развитию активности в отношении ADCC. В этом эксперименте эффективность линии молекул sFGFR2-Fc оценивали на опухоли A549, имплантированной подкожно трем разным линиям мышей. sFGFR2-Fc инъецировали подкожно два раза в неделю в дозе 5 мг/кг в течение всего курса исследования. Схема экспериментаA549 имплантировали подкожно мышам SCID, NOD/SCID и SCID/bg, как описано ранее (см. Пример 8). Лечение проводили два раза в неделю подкожными инъекциями в течение 6 последовательных недель. В течение курса исследования массу тела и объем опухоли измеряли два раза в неделю. Результаты Как представлено на фиг. 17, объем опухоли анализировали вплоть до 41 суток в 3 экспериментах. У мышей SCID группа, подвергнутая лечению sFGFR2-Fc из расчета 5 мг/кг (ромбы), статистически отличалась от контрольной группы (незакрашенные круги), и для нее показано ингибирование опухолиsFGFR2-Fc исходя из 5 мг/кг частично восстанавливал свою активность (ингибирование опухоли = 18%). Согласно этим результатам, механизмы CDC и ADCC вносят вклад в эффективность SFGFR2-FC. Пример 12. Оценка in vivo активностей в отношении ADCC и CDC слитого белка sFGFR2-Fc в модели подкожной опухоли Н 460 В этом примере sFGFR2-Fc представляет собой слитый белок, соответствующий аминокислотной последовательности SEQ ID No. 2 со средним количеством сиаловой кислоты на N-гликан SFGFR2 более 1,6. Модель подкожной опухоли Н 460 Линию клеток H460 идентифицировали в качестве опухолевой линии клеток для оценки эффективности sFGFR2-Fc, эти клетки экспрессируют FGF2 in vivo на высоком уровне и чувствительны к sFGFR2Fc-опосредованной ADCC in vitro. Линии мышей Как описано ранее в примере 11, три линии мышей с разными иммунными функциями (мышиSCID, NOD/SCID и SCID/bg) были отобраны для оценки способности sFGFR2-Fc опосредовать активности в отношении ADCC и/или CDC in vivo в H460. В этом эксперименте эффективность молекулы sFGFR2-Fc оценивали на опухоли H460, имплантированной подкожно мышам трех разных линий. sFGFR2-Fc инъецировали подкожно два раза в неделю в дозе 25 мг/кг в течение всего курса исследования. Схема экспериментаH460 имплантировали подкожно мышам SCID, NOD/SCID и SCID/bg, как описано ранее (смотри Пример 9). Лечение проводили два раза в неделю подкожными инъекциями в течение 3 последовательных недель. В течение курса исследования массу тела и объем опухоли измеряли два раза в неделю. Результаты Как представлено на фиг. 18, объем опухоли анализировали вплоть до 22 суток в 3 экспериментах. У мышей SCID группа, подвергнутая лечению sFGFR2-Fc, исходя из 25 мг/кг (ромбы), статистически отличалась от контрольной группы (незакрашенные круги), и для нее показано ингибирование опухоли на 29%. У мышей NOD/SCID для sFGFR2-Fc, исходя из 5 мг/кг, наблюдали потерю активности с ингибированием опухоли на 14%. У мышей SCID/bg sFGFR2-Fc, исходя из 5 мг/кг, восстанавливал всю свою активность (ингибирование опухоли = 32%). В этих исследованиях, а также как отмечено для модели опухоли А 549 (см. GpnMep 11), механизмы CDC и ADCC давали вклад в эффективность sFGFR2-Fc. Пример 13. Оценка эффективности in vivo sFGFR2-Fc в сравнении с sFGFR2-Fc (A265 Fc) в модели подкожной опухоли Н 460. В Shields at al. описана точечная мутация Asp265Ala в Fc-домене IgG1 человека, обозначенная какA265 Fc, которая приводила к снижению связывания со всеми рецепторами FcR и очень низкой антителозависимой клеточной цитотоксичности (2001 J. Biol. Chem. 276:6591). Эту точечную мутацию вводили в последовательность ДНК, кодирующую Fc-домен sFGFR2-Fc, плазмиды pXL4547 (фиг. 19), давая в результате полинуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID No. 13. Стабильные клоны CHO/DHFR, экспрессирующие sFGFR2-Fc (A265 Fc) (SEQ ID No. 14), получали с использованием селекции с DHFR и системы амплификации с помощью соответствующих экспрессионных плазмид млекопитающих pXL4547 и pXL4417, как описано в примере 3. Белок sFGFR2-Fc (A265 Fc) затем продуци- 22018700 ровали и очищали для исследований in vivo. Подтверждено, что содержание в нем гликана сходно с содержанием гликана, найденным для sFGFR2-Fc, продуцируемого в примерах 3 или 5. Модель подкожной опухоли 460 Линию клеток H460 идентифицировали в качестве опухолевой линии клеток для оценки эффективности sFGFR2-Fc; эти клетки экспрессировали FGF2 in vivo на высоком уровне и были чувствительны кsFGFR2-Fc-опосредованной ADCC in vitro. В этом эксперименте эффективность молекулы sFGFR2-Fc и модифицированной молекулыsFGFR2-Fc (A265 Fc) оценивали на опухоли H460, имплантированной подкожно голым мышам. Схема экспериментаH460 имплантировали подкожно голым мышам Balb/C, как описано ранее (см. Пример 9). Лечение проводили два раза в неделю в течение всего курса исследования. В течение курса исследования массу тела и объем опухоли измеряли два раза в неделю. Результаты Как представлено на фиг. 20, объем опухоли анализировали вплоть до 23 суток. Группа, подвергнутая лечению sFGFR2-Fc из расчета 25 мг/кг (ромбы), статистически отличались от контрольной группы(незакрашенные круги), и для нее показано ингибирование опухоли на 50%. МодифицированныйsFGFR2-Fc (A265 Fc), исходя из 25 мг/кг, обладал потерей активности с ингибированием опухоли только на 25% (NS). Мутация внутри Fc sFGFR2-Fc (A265 Fc) вызывала снижение активности. Так как показано, что эта модификация снижает антителозависимую клеточную цитотоксичность,пример 13 дает непрямое доказательство того, что sFGFR2-Fc действует in vivo посредством механизма,включающего ADCC.