Антитела к цитомегаловирусу человека (hcmv)

Изобретение относится к новым последовательностям антитела, которое связывается с цитомегаловирусом человека (hCMV) и нейтрализует инфекцию hCMV. Новые последовательности могут быть использованы для медикаментозного лечения инфекций hCMV, в частности, для получения фармацевтических композиций, применяемых в профилактическом или терапевтическом лечении инфекций hCMV.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: РИБОВАКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ СА (CH) Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к новым последовательностям антител, выделенных из В-клеток человека,обладающих биологической активностью, специфичной в отношении вируса, инфицирующего клетки человека. Предпосылки к созданию изобретения Цитомегаловирус человека (hCMV) представляет собой широко распространенный, высоковидоспецифичный герпесвирус, вызывающий значительную заболеваемость и смертность у лиц с иммунодефицитом или незрелой иммунной системой. В нескольких обзорах, сделанных в последнее время, представлен анализ биологии hCMV и клинических проявлений (Landolfo S. et al., 2003; Gandhi M. и Khanna R., 2004; Soderberg-Naucler С, 2006 а). Этот вирусный патоген инфицирует большую часть популяции во всем мире и приобретается в детстве,после контакта с физиологической жидкостью, так как вирус проникает через эндотелиальные и эпителиальные клетки верхних отделов пищеварительной или дыхательной системы, или через мочеполовую систему. Серопозитивность к hCMV больше распространена в слаборазвитых странах или в малообеспеченных географических областях. После первичного инфицирования hCMV может персистировать в латентной стадии в специфичных клетках-хозяевах миелоидной линии, реплицируясь и диссеминируя в различные типы клеток (гематопоэтические, эпителиальные, эндотелиальные клетки или фибробласты), минуя иммунную систему хозяина. Инфекция hCMV у здорового человека протекает в основном бессимптомно, поскольку инфекция hCMV и диссеминирование проходит под контролем иммунной системы, но полное исчезновениеhCMV достигается редко. Действительно, у вируса hCMV развились эффективные механизмы, которые позволяют его геному оставаться в выбранных местах в латентном состоянии. Любая ситуация, которая ослабляет иммунную систему, например стресс или специфическое медицинское лечение, может приводить к активации hCMV. Клинические проявления hCMV (такие как воспаление сетчатки, энтероколит, пневмония, гастрит или гепатит) могут появляться после первичной вирусной инфекции, повторной инфекции или активации. К 6-му месяцу жизни около 10% детей инфицируются вирусом в результате трансплацентарного переноса, во время родов или через грудное вскармливание. Вирион hCMV состоит из икосаэдрического нуклеокапсида, который содержит линейный двухспиральный ДНК геном, длиной 230 тыс. н.п. Экспрессия генома hCMV находится под контролем сложного каскада транскрипционных событий и приводит к синтезу более 200 белков, вовлеченных в большое разнообразие биологических функций, участвующих в вирусном инфицировании, латентности и репликации (Britt W. и Mach M., 1996). Структурные белки образуют оболочку вириона, которая является чрезвычайно сложной и до сих пор полностью неопределенной. Оболочка включает гликопротеины, которые гомологичны структурным белкам, идентифицированным у других герпесвирусов, и которые могут образовывать белковые комплексы, связанные дисульфидными связями в пределах вириона: gCI (включая только gB), gCII (включаяgM и gN) и gCIII (включая gH, gL и gO). Гены gB, gH и gN также использовались для генотипирования штаммов hCMV (Coaquette A. et al., 2004; Dar L., 2007). Гликопротеины gN и gM являются наиболее распространенными и было показано, что вместе они необходимы для начального взаимодействия оболочки hCMV и поверхности клетки-хозяина, и, следовательно, для продукции инфекционных hCMV. По этой причине соединения, нацеленные на gB, gH, gN и/или gM, могут эффективно ингибировать инфицирование hCMV, блокируя проникновение циркулирующих вирионов hCMV в клетки, после инфицирования hCMV, повторной инфекции или активации. Лечение инфекций hCMV является трудным, так как существует лишь несколько способов лечения. Доступные в настоящее время лекарственные соединения, которые ингибируют репликацию вируса(ганцикловир, цидофивир, фоскарнет, марибавир и другие лекарственные средства, находящиеся на стадии разработки) дают значимое клиническое улучшение, но могут иметь плохую пероральную биодоступность, низкую эффективность, вызывать резистентность к hCMV (вследствие мутаций вирусных мишеней) и быть токсичными при увеличении дозы (De Clercq E., 2003; Baldanti F. и Gerna G., 2003; Gilbert С. и Boivin G., 2005). Необходимы новые средства для профилактики и лечения инфекции hCMV, в особенности у лиц с иммунодефицитом, в случаях трансплантации и для пренатальной профилактики. Действительно, hCMV является клинически важным оппортунистическим патогеном у больных СПИДом и реципиентов с трансплантированными органами, у которых этот вирус вносит вклад в отторжение трансплантата, независимо от тканевой совместимости донора и реципиента, что приводит в результате к заболеваемости и смертности (Puius Y. и Snydman D., 2007). Повышение числа реципиентов с пересадкой костного мозга и цельных органов повышает вероятность клинических проявлений hCMV, таких как вызванное hCMV воспаление сетчатки (Wiegand Т. и Young L., 2006). Более того, hCMV является основной инфекцией,вызывающей пороки развития (например, потерю слуха, задержку развития или умственную отсталость),которые возникают в результате врожденной или перинатальной инфекции hCMV, передаваемой от матери, инфицированной hCMV (Griffiths P. и Walter S., 2005). Таким образом, создание лекарственных средств, универсальных для упреждающего иммунитета,для профилактических hCMV-специфичных способов лечения, например, для профилактики заболеваемости hCMV у реципиентов с трансплантатами (Hebart H. и Einsele H., 2004; Kalil A. et al., 2005; SnydmanD., 2006), у пациентов с развивающимися hCMV-связанными нейропатологиями (Griffiths P., 2004) и у беременных с повышенным риском (Schleiss М., 2003), а также для профилактики вертикальной трансмиссии и опасной для жизни инфекции hCMV для эмбрионов и новорожденных, является крайне важным. Более того, фармацевтические композиции против hCMV могут быть использованы для лечения других, более широко распространенных заболеваний (таких как сердечно-сосудистые и аутоиммунные заболевания, или при некоторых видах рака), для которых hCMV является возможным дополнительным фактором и/или может активироваться во время иммуносупрессирующей терапии. Например, в настоящее время hCMV является патогеном человека, важность которого возрастает для расстройств, таких как многолетние осложнения при опухолевой инвазии и ускользании от механизмов иммунологического надзора, поскольку инфекция hCMV может оказывать онкомодулирующее действие на апоптоз, дифференцировку и миграцию клеток. При аутоиммунных или сосудистых заболеваниях инфекция hCMV может изменять иммунологические и воспалительные реакции (Cinatl J. et al., 2004; Soderberg-Naucler C.,2006b). Альтернативным путем профилактики инфекции hCMV является вакцинация в рамках обеспечения защиты групп пациентов с высоким риском. Однако корреляция между вакцинацией и получаемой иммунной реакцией полностью не выяснена и оптимальная вакцинная стратегия hCMV (с использованием возможных антигенов или живых аттенуированных вакцин), по-видимому, зависит от группы пациентов,которым необходима защита. Следовательно, стратегии профилактической вакцинации все еще разрабатываются (McLean G. et al., 2006; Schleiss M., 2005). Принимая во внимание существующие ограничения для фармакологических стратегий в отношении инфекций hCMV, улучшение понимания о взаимоотношениях хозяин-hCMV и, в частности, о hCMVспецифичном иммунном ответе делают способы лечения на иммунологической основе эффективной альтернативой для замены или дополнения существующих способов лечения осложнений, связанных сhCMV (Gandhi M. и Khanna R., 2004). Недавно устойчивая защита от летального исхода инфекции CMV у мышей с иммунодефицитом была достигнута за счет переноса вирус-специфичных В-клеток памяти,что предполагает, что такие клетки могут иметь терапевтическое применение (Klenovsek K. et al., 2007). Более простой альтернативой способам лечения на клеточной основе может быть пассивная иммунотерапия, предусматривающая введение индивидуумам фармацевтических композиций, содержащих терапевтические антитела с определенной нейтрализующей активностью в отношении антигена человека или вируса (например, hCMV). Этот терапевтический подход был создан на основании антигенсвязывающих и биологических особенностей антител и фрагментов антител, нацеленных на терапевтические мишени человека или вирусов(Dunman P. and Nesin M., 2003; Keller M. and Stiehm E., 2000). Пассивная иммунотерапия была введена в клиническую практику, быстро расширив возможности лечения целого ряда заболеваний (в том числе инфекционных заболеваний, иммунологических заболеваний и рака). Этот подход может быть особенно эффективным у пациентов, иммунная система которых не способна продуцировать антитела в тех количествах и/или с той специфичностью, которая необходима для блокирования и/или уничтожения молекулы-мишени (Chatenoud L., 2005; Laffly Е. and Sodoyer R., 2005). В терапии hCMV этот подход осуществляется путем внутривенного введения препарата иммуноглобулинов человека, полученных путем объединения плазмы крови человека с высокими титрами антиhCMV антител, и коммерциализации для клинического использования (под названием Cytotect или CytoGam). Однако эти продукты лишь частично удовлетворяют потребности блокирования инфекцииhCMV. Действительно, этот способ лечения применяется у пациентов с иммунодефицитом, главным образом, для упреждающего лечения и профилактики, когда параллельно, как правило, вводят противовирусные средства (Marasco W. and Sui J., 2007; Nigro G. et al., 2005; Bonaros N. et al., 2004; Kocher A. et al.,2003; Kruger R. et al., 2003). Более того, вопросы безопасности и хранения таких препаратов, как сообщалось в литературе, вызывают растущее беспокойство (Bayry J. et al., 2007; Hamrock D., 2006). Рекомбинантные антитела человека, которые имеют высокую аффинность в отношении антигенов,экспрессируемых на оболочке hCMV и способные нейтрализовать инфекцию, могли бы быть более подходящими лекарственными средствами для пассивной иммунизации. Действительно, некоторые гликопротеины hCMV вызывают сильные иммунологические реакции организма хозяина, в том числе продукцию вирус-нейтрализующих антител, несмотря на то, что стехиометрия белков оболочки является изменчивой и может изменяться, минуя иммунологические реакции организма хозяина. Полагают, что такая реакция является ключевой составляющей иммунитета хозяина и является целью для развития как антител, так и вакцин. Моноклональные антитела человека являются наиболее предпочтительными антителами для клинического использования из-за ограничений, свойственных мышиным/крысиным моноклональным антителам. Однако разработка ранее идентифицированных антител человека для лечения hCMV (MatsumotoY. et al., 1986) была прервана из-за отсутствия клинических эффектов в исследованиях, в которых оценивали эффективность таких антител, например при трансплантации гематопоэтических стволовых клеток(Boeckh M. et al., 2001) или при воспалении сетчатки (Gilpin A. et al., 2003). Эти неудачные испытания послужили основой дальнейших исследований, направленных на отбор моноклональных антител человека, которые более эффективно нейтрализуют самое широкое разнообразие штаммов hCMV. Лечение инфекций CMV было бы эффективным в результате наличия более сильнодействующих фармацевтических композиций, содержащих моноклональные антитела человека, которые очищены из В-клеток человека, культивированы с увеличением количества или выделены как рекомбинантные белки, экспрессирующиеся с помощью последовательностей человека, введенных в клеточные линии млекопитающих. Описание изобретения Изобретение относится к новым последовательностям антител, которые связываются с hCMV и нейтрализуют его и которые могут быть использованы для выявления, лечения, ингибирования, профилактики и/или улучшения состояния при инфекции hCMV или заболевании, связанном с hCMV. В-клетки человека были получены у hCMV-серопозитивных индивидуумов и иммортализованы. Эту поликлональную популяцию иммортализованных В-клеток человека разделили с получением субкультур, которые тестировали на наличие антител (иммуноглобулинов G, IgG) в супернатанте культуры клеток, нейтрализующих инфективность hCMV in vitro. В частности, тип нейтрализующей активности,изотип и клональные свойства определяли для антитела, секретируемого субкультурой, названной 26 А 1. Это антитело аффинно очищали из супернатанта исходной клеточной культуры в виде рекомбинантного моноклонального антитела человека, подтверждая hCMV-специфичную нейтрализующую активность,используя in vitro модели инфекции hCMV. Это антитело может быть использовано для характеристики нейтрализующих антигенов на оболочке hCMV. Последовательности ДНК, которые кодируют вариабельные домены антитела, секретируемого субкультурой 26 А 1, амплифицировали, клонировали и секвенировали. Соответствующие белковые последовательности анализировали с целью идентификации областей, определяющих комплементарность (CDR),которые ответственны за hCMV-специфичную биологическую активность. Эти последовательности могут быть использованы для получения белков, обладающих свойством специфично связываться с hCMV и нейтрализовать его, в форме полноразмерных антител, фрагментов антител или любом другом формате функционально активного белка (например, биологически активного пептида, слитых белков), используя соответствующие технологии для получения рекомбинантных белков. Композиции, подходящие для терапевтического, профилактического и/или диагностического применения при лечении инфекции hCMV и нарушений, связанных с hCMV, могут быть получены с использованием белков по настоящему изобретению, либо в виде рекомбинантных белков, либо в виде естественных антител, очищенных из клеточных культур, полученных из субкультуры 26 А 1. Такие композиции могут быть использованы для дополнения или замещения существующих в настоящее время способов лечения hCMV, основанных на противовирусных соединениях и/или препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения (IVIg). Другие варианты осуществления настоящего изобретения будут представлены в следующем подробном описании. Описание фигур Фиг. 1: (А) схематическое представление антигена CG3, который был синтезирован и использован вgB-специфичном ELISA, как описано в литературе (Rothe M. et al., 2001). Рекомбинантный межштаммовый слитый антиген CG3 соответствует сочетанию gB антигенного домена 2 (AD2; SEQ ID NO:1 и 2) штаммов AD169 hCMV (SwissProt Acc. No. P06473; аминокислоты 27-84) и Towne (SwissProt Acc. No.P13201; аминокислоты 27-84). Область AD2 содержит сайт (аминокислоты 70-81, подчеркнуты), который является консервативным в различных вирусных штаммах и, как было показано, распознается нейтрализующими антителами (Qadri I. et al., 1992; Kropff B. et al., 1993); (В) схематическое представление антигена gH, включенного в слитый белок gH(Ag)-GST, используемого для gH-специфичного ELISA анализа. Рекомбинантный антиген gH(Ag)-GST соответствует слиянию в рамке считывания между gH аминоконцевой областью (аминокислоты 16-144; SEQ ID NO:3) из hCMV штамма VR1814 (Revello M. et al., 2001) и глутатион-S-трансферазой (GST). Аминоконец gH содержит линейный сайт связывания с антителом(аминокислоты 34-43; подчеркнут), который распознается нейтрализующими антителами (Urban M. et al.,1992). Фиг. 2: общие сведения о процессе отбора для идентификации и характеристики субкультур (лунки), которые содержат IgG антитела, связывающиеся с hCMV и нейтрализующие его. Эти субкультуры были получены путем иммортализации В-клеток больных hCMV (CMV7), используя процесс иммортализации, на основе EBV, описанный в РСТ/ЕР 2005/056871. Супернатанты из субкультур (лунок), в которых демонстрируется значительный рост клеток, подвергали скринингу непосредственно в анализе микронейтрализации hCMV. Супернатанты, демонстрирующие нейтрализующую активность, затем подвергали скринингу с помощью gB- и gH-специфичного ELISA. Количество позитивных лунок для каждого скринингового анализа указано в серых овалах. Фиг. 3: hCMV нейтрализующая активность естественного антитела 26 А 1, очищенного аффинной хроматографией с использованием белка А из супернатанта клеточной культуры, полученной из субкультуры 26 А 1, выращенной в бесклеточной среде. Кривая доза-ответ была построена в анализе нейтрализации hCMV, включающем либо эмбриональные фибробласты человека (HELF) вместе со штаммомAD169 hCMV (1000 PFU/реакция; IC50 0,82 мкг/мл), либо эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) вместе со штаммом VR1814 hCMV (1000 PFU/реакция; IC50 0,67 мкг/мл). Фиг. 4: gH(Ag)-специфичная (А) и CG3 антиген-специфичная (В) связывающая активность IgGсодержащих супернатантов из субкультур иммортализованных В-клеток. ELISA проводили, используя только клеточную культуральную среду (среда, отрицательный контроль), или супернатант от субкультур 26 А 1, 1F7 (идентифицированных в иммортализированных клетках, полученных от донора CMV5,как описано в патентной заявке ЕР 07111741), и 8 С 10 (идентифицированной в иммортализованных клетках, полученных от донора CMV7, как описано в настоящей патенте и патентной заявке ЕР 07115410). Пунктирная линия представляет пороговую величину (O.D.=0,1) для учета позитивных субкультур. Фиг. 5: (А) выравнивание ДНК (строчные буквы, 393 пары оснований) и белковой (заглавные буквы, 131 аминокислота) консенсусной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи 26 А 1 IgG(VH 26A1; SEQ ID NO:4 и 5); (В) консенсусная последовательность белка VH 26A1 с указанием предполагаемых CDR (HCDR1, HCDR2, и HCDR3; подчеркнуты; SEQ ID NO:6, 7 и 8). Альтернативные аминокислоты, которые кодировались последовательностями ДНК, клонированными в плазмиде из выделенных трансформантов Е.coli, указаны ниже консенсусной последовательности белка. Фиг. 6: (А) выравнивание ДНК (строчные буквы, 330 пар оснований) белковой (заглавные буквы,110 аминокислот) консенсусной последовательности вариабельного домена легкой цепи 26 А 1 IgG (VL 26A1; SEQ ID NO:9 и 10); (В) консенсусная последовательность белка для VL 26A1 с указанием предполагаемых CDR VL 26A1 (LCDR1, LCDR2 и LCDR3; подчеркнуты; SEQ ID NO:11, 12 и 13). Фиг. 7: выравнивание ДНК (строчные буквы, 1449 пар оснований; SEQ ID NO:14) и белковой (заглавные буквы, 482 аминокислоты) консенсусной последовательности тяжелой цепи рекомбинантного моноклонального антитела человека 26 А 1 (SEQ ID NO:15). Наиболее вероятный сайт расщепления для сигнального пептида находится между положениями 19 и 20 (VLS-QV), как определено с помощью сетевой программы прогнозирования SignalP 3.0 (Bendtsen J. et al., 2004). Последовательность, первоначально идентифицированная в кДНК, полученная из клеток в субкультуре 26 А 1, подчеркнута (см. фиг. 5). Аминокислоты 153-482 соответствуют константной области тяжелой цепи IgG1 человека (SwissProt Acc.No. P01857). Фиг. 8: выравнивание ДНК (строчные буквы, 705 пар оснований; SEQ ID NO:16) и белковой (заглавные буквы, 234 аминокислоты) консенсусной последовательности тяжелой цепи рекомбинантного 26 А 1 IgG человека (SEQ ID NO:17). Наиболее вероятный сайт расщепления для сигнального пептида находится между положениями 16 и 17 (CTG-SV), как определено с помощью сетевой программы прогнозирования SignalP 3.0 (Bendtsen J. et al., 2004). Последовательность, первоначально идентифицированная в клетках из субкультуры 26 А 1, подчеркнута (см. фиг. 5). Аминокислоты 1-19 и 131-234 соответствуют 1-19 и 131-234 лямбда цепи Ig человека (SwissProt Acc. No. Q8N355). Фиг. 9: hCMV-нейтрализующая активность рекомбинантного антитела человека 26 А 1 по сравнению с естественным антителом 26 А 1, очищенным с использованием белка А. Активность была протестирована с использованием клеток HELF и штамма AD169 hCMV в анализе микронейтрализации (А; 1000 PFU/реакция, 72 ч после инфицирования) или в анализе подавления бляшкообразования (В). Фиг. 10: hCMV-нейтрализующая активность рекомбинантного моноклонального антитела человека 26 А 1 по сравнению с естественным антителом 26 А 1, очищенным с использованием белка А. Активность была протестирована с использованием HUVEC клеток человека и штамма VR1814 hCMV в анализе микронейтрализации (А; 1000 PFU/реакция), или с использованием клеток человека HELF и штамма AL1 hCMV в анализе подавления бляшкообразования (В; 1000 PFU/реакция). Подробное описание изобретения Способы, описанные в РСТ/ЕР 2005/056871, дают возможность осуществить эффективную иммортализацию изотип-специфичных В-клеток человека, полученных у индивидуума, в крови которого содержатся антитела, имеющие биологическую активность (например, связывающую и/или нейтрализующую мишень человека или вирусную мишень), в рамках получения поликлональных популяций клеток,которые секретируют антитела, представляющие такие биологические активности. Широкомасштабные скрининговые исследования затем могут быть выполнены с использованием супернатантов субкультур,полученных с помощью этих способов после однократной стадии клонирования при низкой плотности клеток (например, 50, 20 клеток или менее на лунку). Таким образом, возможно получить поликлональные популяции иммортализованных В-клеток, в которых может быть охарактеризован огромный репертуар IgG-секретирующих субкультур и, следовательно, может быть идентифицирован ряд моноклональных IgG человека, имеющих желаемую связывающую активность с антигенами и/или биологическую активность. В данном случае, поликлональную популяцию IgG-секретирующих иммортализированных Вклеток получали из крови больных hCMV, в сыворотке которых была обнаружена в качестве биологической активности сильная hCMV-нейтрализующая активность. Эту поликлональную популяцию исполь-4 018701 зовали для получения одной стадией субклонирования 20 клеток на лунку и в соответствующих условиях культивирования тысячи субкультур, которые содержат иммортализованные В-клетки человека. Специфическую биологическую активность затем тестировали в супернатанте сотни эффективно растущих клеточных культур в рамках отбора тех, которые обеспечивают более сильную активность, а затем определяли изотип, и, если возможно, эпитоп секретируемого антитела. Одну из самых многообещающих субкультур, названную 26 А 1, использовали как для очистки естественного антитела человека из массовых культур, так и для выделения ДНК, кодирующей такое антитело, из иммортализованных В-клеток. Последовательность ДНК использовали для получения естественного антитела человека в виде рекомбинантного антитела человека. Естественное и рекомбинантное моноклональное антитело человека 26 А 1 использовали для проведения более широкомасштабных биологических анализов и для оценки их возможного использования в клинических применениях, связанных сhCMV. В примерах показано, что супернатант клеточной культуры, естественное антитело человека и рекомбинантное антитело человека имеют одинаковую биологическую активность, определенную в исходной сыворотке крови и поликлональной популяции EBV-иммортализированных В-клетках человека. Эти доказательства подтверждают, что способы, описанные в РСТ/ЕР 2005/056871, позволяют осуществлять идентификацию, характеристику и получение биологически активных, изотип-специфичных, естественных и рекомбинантных моноклональных антител человека. Действительно, полный процесс иммортализации клеток и роста в условиях культивирования клеток дает доступ к репертуару антител человека быстро, эффективно и просто. Более того, клетки, полученные в результате этого процесса, могут быть заморожены и подвергнуты скринингу в другое время, или параллельно с другими биологическими активностями и/или антигенами. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к белкам, содержащим последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности HCDR3 (CDR3 тяжелой цепи вариабельного домена) антитела 26 А 1 (SEQ ID NO:8). Вместе с HCDR1 и HCDR2 (SEQ IDNO:6 и SEQ ID NO:7), HCDR3 входит в состав вариабельного домена тяжелой цепи антитела 26 А 1 (VH 26 А 1; фиг. 5; SEQ ID NO:5). Эта последовательность кодируется последовательностью ДНК (фиг. 5 А;SEQ ID NO:4), которую амплифицировали и клонировали с использованием клеток, полученных из исходной субкультуры, секретирующей антитело 26 А 1. Таким образом, белок по настоящему изобретению может содержать вместе с HCDR3 антитела 26 А 1 (SEQ ID NO:8) последовательность HCDR1 (SEQ IDNO:6) и/или HCDR2 (SEQ ID NO:7) антитела 26 А 1 (фиг. 5 В). Такой белок может содержать последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности вариабельного домена тяжелой цепи антитела 26 А 1 в целом. Антитело 26 А 1 также содержит вариабельный домен легкой цепи, для которой, используя тот же подход, были определены последовательности ДНК (SEQ ID NO:9) и белка (SEQ ID NO:10), вместе со специфичными LCDR (SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13) (фиг. 6). Таким образом, белок по настоящему изобретению может дополнительно содержать одну или несколько последовательностей,выбранных из группы, состоящей из единичных LCDR антитела 26 А 1 (SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 иSEQ ID NO:13), которые могут быть представлены в виде последовательности белка, содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична VL 26A1 (фиг. 6 В; SEQ ID NO:10). Это используется, в частности, когда желательно получить рекомбинантное антитело человека, содержащее природные последовательности VL и VH 26A1 в качестве легкой и тяжелой цепей (в природной конформации тетрамерного комплекса, содержащего две легких и две тяжелых цепи, или в одном белке в качестве рекомбинантного варианта естественного антитела). Везде, где указан уровень идентичности, этот уровень идентичности следует определять по полной длине релевантной последовательности по настоящему изобретению.HCDR3 антитела 26 А 1 может рассматриваться как характеристика антигенсвязывающей части специфического антитела человека, которое способно связываться с hCMV и нейтрализовать его, как показано в разделе "Примеры". Даже если несколько или все CDR антитела необходимы для получения антигенсвязывающей последовательности, HCDR3 представляет собой CDR, проявляющую наиболее высокие отличия между антителами не только в отношении последовательности, а также в отношении длины. Такие различия являются фундаментальными компонентами связывающих областей для распознавания фактически любого антигена гуморальной иммунной системой (Xu and Davis, 2000; Barrios Y. et al. 2004;Bond С. et al., 2003). Альтернативно, сочетания CDR могут быть связаны друг с другом в очень коротких белках, которые сохраняют первоначальные свойства связывания, как обсуждается в последнее время(Ladner R., 2007). Таким образом, hCMV-нейтрализующие белки могут быть получены, используя HCDR3 антитела 26 А 1 в качестве составной части, связывающей hCMV, в сочетании или нет с другими CDR из антитела 26 А 1, которые могут быть экспрессированы в каркасной области белка антитела (Knappik A. et al., 2000),или в каркасной области белка, не родственного антителам (Kiss С. et al., 2006). Вариабельный домен тяжелой и легкой цепей, образующий антитело 26 А 1 (или выбранные части,такие как выделенные HCDR и LCDR), может быть включен в любой другой формат белка для функцио-5 018701 нально активных фрагментов антител, описанных в литературе под разными названиями, такими какScfv (вариабельный одноцепочечный фрагмент), Fab (гетеродимер вариабельного домена тяжелой/легкой цепи), диатело, пептатело, VHH (вариабельный домен тяжелой цепи антитела), выделенные тяжелые или легкие цепи, биспецифичные антитела, и другие сконструированные варианты антител для не-/клинических применений (Jain M. et al., 2007; Laffly Е. и Sodoyer R., 2005). Альтернативные антитела могут быть получены с использованием последовательностей антитела 26 А 1, с помощью процесса шаффлинга вариабельных доменов легких цепей (VL). Действительно, некоторые различные антитела могут быть получены и протестированы на hCMV-специфическую активность, с использованием одиночного вариабельного домена тяжелой цепи VH (например, один из 26 А 1) объединенного с библиотекой VL доменов, в рамках определения комбинаций VH/VL с улучшенными свойствами в смысле аффинности, стабильности и/или получения рекомбинантным путем (Ohlin M. et al.,1996; Rojas G. et al., 2004; Watkins N. et al., 2004). Новые подходы к разработке новых биологически активных пептидов также показали применимость синтезирования CDR-производных пептидов, которые содержат L-аминокислоты и/или Dаминокислоты, которые сохраняют первоначальную активность и которые могут иметь более подходящий фармацевтический профиль (Smith J. et al., 1995; Levi M. et al., 2000; Wijkhuisen A. et al., 2003). Таким образом, HCDR3 антитела 26 А 1, а также последовательности, значительно сходные сHCDR3 антитела 26 А 1, слитые белки, содержащие эту область, и синтетические пептиды, полученные из них (например, содержащие L-аминокислоты, D-аминокислоты, в нормальной или ретро-инверсо конформации), могут быть протестированы в качестве hCMV-связывающих и нейтрализующих белков. Более того, известно, что антитела могут быть модифицированы в особых положениях для получения антител с улучшенными свойствами, в частности, для клинических применений (например, улучшенным фармакокинетическим профилем или более высокой аффинностью в отношении антигена). Эти изменения могут быть сделаны в CDR и/или каркасной области антитела 26 А 1, и эта последовательность может быть выбрана с помощью любой специализированной методики для рационального создания антител, в которых используется созревание аффинности или другие процессы (Kim S. et al., 2005; Jain M.et al., 2007). Белки по настоящему изобретению могут быть представлены в большинстве случаев в виде антител, например, моноклональных антител, полностью являющихся антителами человека, имеющих специфический изотип. Например, изотип IgG представляет собой формат антитела почти всех одобренных к применению терапевтических антител (Laffly E. и Sodoyer R., 2005). Однако антигенсвязывающие части, выделенные из HIV-нейтрализующих IgG1, были перенесены на последовательность IgA человека, и полученное в результате антитело способно также ингибировать ВИЧ-инфекцию (Mantis N. et al., 2007). Белок по настоящему изобретению также может быть представлен в виде фрагментов антител, биологически активных пептидов или слитых белков. Все эти альтернативные молекулы должны сохранять,если не усиливать, исходные свойства связывания и нейтрализации hCMV, которые были определены для антитела 26 А 1. В случае слитых белков гетерологичные белковые последовательности могут быть расположены в положении N- или С-конца к последовательности, происходящей из 26 А 1, не оказывая влияния на правильную экспрессию и биологическую активность hCMV-специфичной части (например,фрагмента антитела). Термин "гетерологичная белковая последовательность" указывает на белковую последовательность,которая естественным образом не присутствует в N- или С-концевом положении к hCMV-специфичной части (например, фрагмента антитела). Последовательность ДНК, кодирующая эту белковую последовательность, в основном является слитой с помощью технологий рекомбинантных ДНК и содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере 5 аминокислот. Такая гетерологичная белковая последовательность в основном выбрана для обеспечения дополнительных свойств hCMV-специфичному фрагменту антитела для специфической диагностики и/или для терапевтических применений. Примеры таких дополнительных свойств включают: улучшенные средства для выявления или очистки, дополнительные части связывания или биологические лиганды, или посттрансляционные модификации слитого белка (например, фосфорилирование, гликозилирование, убиквитинилирование, SUMO-илирование или эндопротеолитическое расщепление). Альтернативно (или кроме слияния с гетерологичной белковой последовательностью), активность белка по изобретению может быть улучшена путем конъюгирования с другим соединением, например,терапевтическими, стабилизирующими или диагностическими средствами. Примерами таких средств являются визуализируемые метки (например, радиоизотоп, флуоресцентное соединение, токсин, атом металла, хемилюминесцентное соединение, биолюминесцентное соединение или фермент), которые могут быть связаны с помощью химических линкеров или полимеров. hCMV-специфическая биологическая активность может быть улучшена путем слияния с другим терапевтическим белком, таким как белок или полимер, изменяющий метаболизм и/или стабильность при диагностических или терапевтических применениях. Способы выбора и создания частей белка, лигандов и соответствующих линкеров, а также способов и стратегий для конструирования, очистки, выявления и применения слитых белков представлены в ли-6 018701Vol. 326-328, Academic Press, 2000; WO 01/77137) и являются общедоступными в клинических и исследовательских лабораториях. Например, слитый белок может содержать последовательности, распознаваемые коммерческими антителами (в том числе тэги, такие как полигистидин, FLAG, с-Мус, или НА тэги), которые могут облегчать in vivo и/или in vitro идентификацию слитого белка или его очистку. Другие белковые последовательности могут быть идентифицированы с помощью прямого флуоресцентного анализа (как в случае зеленого флуоресцирующего белка) или с использованием специфических субстратов или ферментов (например, используя протеолитические сайты). Стабильность hCMVспецифичных антител, фрагментов антител, биологически активных пептидов и слитых белков может быть улучшена путем слияния с белком-носителем, таким как белок оболочки фага (ср 3 или ср 8), мальтозасвязывающий белок (MBP), бычий сывороточный альбумин (BSA) или глутатион-S-трансфераза(GST). Антитело 26 А 1 является основным объектом настоящего изобретения, и оно было охарактеризовано в супернатанте особой субкультуры, как моноклональное антитело человека IgG1, которое было выбрано благодаря способности нейтрализовать hCMV. Это свойство сначала было определено анализами нейтрализации in vitro с использованием супернатанта клеточной культуры (см. таблицу), и затем очищенного с использованием белка А (фиг. 3) и рекомбинантного (фиг. 9 и 10; SEQ ID NO:15 и 17) моноклонального антитела человека. Специфический антиген hCMV, который распознается антителом 26 А 1, был определен с помощью панели известных нейтрализующих эпитопов hCMV в вирусных антигенах (см. фиг. 1, 2 и 4). Следовательно, это IgG антитело может быть использовано для установления hCMV-нейтрализующего эпитопа и белков, связывающихся с таким антигеном (например, в виде антител, фрагментов антител, биологически активных пептидов, слитого белка или любых природных/рекомбинантных белков), которые должны быть способны нейтрализовать инфекцию hCMV путем распознавания такого эпитопа. В прошлом также использовали ELISA или Вестерн-блот с использованием hCMV-специфичных процессированных белков или синтетических пептидов (Greijer A. et al., 1999; Ohlin M. et al., 1993), и,таким образом, антитела, направленные на hCMV, были установлены в соответствии с их антигеном,являющимся гликопротеином Н (WO 94/16730, WO 94/09136, WO 92/11018), гликопротеином В(ЕР 248909, WO 93/21952) или гликопротеином М/гликопротеином N (Shimamura M. et al., 2006). Более того, другие компоненты вириона hCMV не только влияют на тропизм вируса, но могут быть мишенями для антител, нейтрализующих hCMV, как в случае pUL130 и pUL128 (Wang D. и Shenk T., 2005). Таким образом, CMV антиген/эпитоп, распознаваемый антителами 26 А 1, может быть идентифицирован с помощью различных анализов in vitro, на основе процитированной выше литературы. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является антитело человека IgG1, секретируемое субкультурой 26 А 1, которое может быть представлено как естественное антитело, очищенное с использованием белка А, которое связывается с hCMV и нейтрализует его. Это антитело IgG1 может быть использовано для идентификации конкурентных белков, которые также могут связываться сhCMV и нейтрализовать его. Аналогичные белки представлены в приведенном выше описании и в разделе "Примеры", в частности, в виде рекомбинантных антител человека и фрагментов антител. Механизм нейтрализации hCMV, связанный с вирусным эпитопом, распознаваемым антителом 26 А 1 и другими белками, определенными выше, может быть охарактеризован с использованием доступных анализов специфичных структурных белков hCMV и/или штамма, как показано в литературе с использованием панелей сывороток человека (Navarro D. et al., 1997; Klein M. et al., 1999; Weber В. et al.,1993; Rasmussen L. et al., 1991; Marshall G. et al., 2000) или моноклональных антител (Schoppel K. et al.,1996; Simpson J. et al., 1993; Gicklhorn D. et al., 2003). Другими объектами настоящего изобретения являются нуклеиновые кислоты, кодирующие любое из антител, фрагментов антител, слитых белков, биологически активных пептидов или выделенныхHCDR и LCDR, определенных выше. В примерах представлены такие последовательности, в частности последовательности, кодирующие полные вариабельные домены тяжелой (SEQ ID NO:4) и легкой (SEQID NO:9) цепей 26 А 1 (фиг. 5 А и 6 А). Эти последовательности ДНК (или выбранные части, например,кодирующие специфические HCDR и LCDR; фиг. 5 и 6) могут быть перенесены в векторы экспрессии в одном из альтернативных форматов для антител (например, полноразмерных, аффинно зрелых, илиCDR-трансплантированных, или фрагментов антител) или слитых белков. Эти нуклеиновые кислоты могут содержать последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQID NO:4, с последовательностью, дополнительно содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:9, или без нее, в зависимости от того, необходимы ли последовательности только из тяжелой цепи 26 А 1 или как тяжелой, так и легкой цепи. В тех случаях, когда желательным является полноразмерное антитело человека, это антитело должно дополнительно содержать константную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE. Предпочтительно константная область тяжелой цепи представляет собой IgA, IgG1 (как в естественном антителе 26 А 1, охарактеризованным из субкультуры 26 А 1), IgG2 или IgG4 человека. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей 26 А 1, были клонированы и охарактеризованы с помощью ПЦР и векторов, содержащих продукты, полученные в результате ПЦР, которые использовали для трансформации клеток Е.coli. Такие последовательности могут быть перенесены (частично или полностью) в другой вектор, в частности в экспрессионную кассету вектора или отдельных векторов, где они оперативно связаны с соответствующими регуляторными последовательностями (например, промоторами, терминаторами транскрипции). Моноклональное антитело человека 26 А 1 или любые другие белковые последовательности, полученные из такого антитела, могут быть экспрессированы в виде рекомбинантного белка с использованием таких векторов для трансформации соответствующих клеток-хозяев. Клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты по изобретению, могут быть прокариотическими или эукариотическими клеткамихозяевами и должны обеспечивать секрецию желаемого рекомбинантного белка. Способы получения таких белков включают культивирование клеток-хозяев, трансформированных векторами экспрессии,содержащими кодирующие их последовательности в условиях, подходящих для экспрессии белка и извлечения этого белка из культуры клеток-хозяев. Эти векторы должны включать промотор, сайт связывания с рибосомой (при необходимости), стартовые и стоп-кодоны, и лидерную/секретирующую последовательность, которая может направлять экспрессию моно или бицистронного транскрипта для получения желаемого белка. Эти векторы должны обеспечивать экспрессию рекомбинантного белка в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах. Клеточная линия, значительно обогащенная такими клетками, затем может быть выделена с получением стабильной клеточной линии. Нуклеиновые кислоты и клетки-хозяева могут быть использованы для получения белка по изобретению, используя общепринятые технологии рекомбинантных ДНК. Вкратце, желаемые последовательности ДНК могут быть либо экстрагированы путем расщепления исходного клонирующего вектора ферментами рестрикции, либо амплифицированы с использованием в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) такого вектора и ПЦР-праймеров для специфической амплификации вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей полностью или только их участков (например, последовательностиHCDR3). Эти фрагменты ДНК затем могут быть перенесены в векторы, более подходящие для экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, как описано в книгах и обзорах по клонированию и получению рекомбинантных белков, в том числе названиях в сериях "А Practical Approach",опубликованных Oxford Univ. Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001). Для эукариотических клеток-хозяев (например, клеток дрожжей, насекомых или млекопитающих) могут быть использованы различные транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, в зависимости от природы хозяина. Они могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирусы, вирус папилломы крупного рогатого скота, обезьяний вирус или т.п., в которых регуляторные сигналы связаны с конкретным геном, который имеет высокий уровень экспрессии. Примерами являются промотор ТК вируса герпеса, ранний промотор SV40, промотор гена gal4 дрожжей и т.п. Могут быть выбраны регуляторные сигналы начала транскрипции, которые допускают транзиторную(или конститутивную) репрессию и активацию, а также модуляцию генной экспрессии. Последовательность, кодирующая рекомбинантный белок, может быть адаптирована и вновь клонирована с получением модификаций на уровне ДНК только тех, которые могут быть выявлены, например, с помощью программного обеспечения для отбора последовательностей ДНК, в которых частота использования кодона и сайты рестрикции являются наиболее подходящими для клонирования и экспрессии рекомбинантного белка в специфических векторах и клетках-хозяевах (Grote A. et al., 2005; Carton J. et al., 2007). Во время дальнейших стадий клонирования последовательности белка могут быть добавлены с учетом желаемого формата антитела (Scfv, Fab, фрагмент антитела, полноразмерное антитело человека и т.д.) к вставке, замене или элиминации одной или нескольких внутренних аминокислот. Эти технологии также могут быть использованы для дальнейшей структурной и функциональной характеристики и оптимизации терапевтических свойств белков в целом и антител в частности (Kim S. et al., 2005), или для получения векторов, обеспечивающих их стабильную доставку in vivo (Fang J. et al., 2005). Например,рекомбинантные антитела также могут быть модифицированы на уровне структуры и/или активности путем выбора специфической области Fc, сливаемой с вариабельными доменами (Furebring С. et al.,2002; Logtenberg T, 2007) путем получения одноцепочечных фрагментов антител (Gilliland L. et al., 1996) и путем добавления стабилизирующих пептидных последовательностей, (WO 01/49713), полимеров или радиохимических веществ к химически модифицированным остаткам (Chapman A. et al., 1999). Последовательность ДНК, кодирующая рекомбинантный белок, когда-то вставленная в подходящий эписомальный или негомологичный или гомологичный интегрирующий вектор, может быть введена в соответствующие клетки-хозяева любым подходящим способом (трансформацией, трасфекцией, конъюгацией, слиянием протопластов, электропорацией, преципитацией фосфатом кальция, прямой микроинъекцией и т.п.) для трансформации их. Важные факторы, рассматриваемые при выборе конкретного фактора, включают простоту, с которой клетки-хозяева, которые содержат вектор, могут быть распознаны и отобраны; количество желаемых копий вектора; и является ли вектор "вектором-шаттл", переме-8 018701 щающимся между клеками-хозяевами и другими видами. Клетки, которые были стабильно трансформированы введенной ДНК, могут быть выбраны только введением одного или нескольких маркеров, которые дают возможность проводить отбор клеток-хозяев,которые содержат вектор экспрессии. Маркер также может обеспечивать фототрофность ауксотропному хозяину, биоцидную резистентность, например, к антибиотикам, или тяжелым металлам, таким как медь или подобным, и может быть расщепляемым или репрессируемым при необходимости. Ген селектируемого маркера может быть либо непосредственно связан с экспрессируемыми генными последовательностями ДНК, либо введен в ту же клетку путем котрансфекции. Дополнительные транскрипционные регуляторные элементы также могут быть необходимы для оптимальной экспрессии. Клетки-хозяева могут быть либо прокариотическими, либо эукариотическими. Среди прокариотических клеток-хозяев предпочтительными клетками являются В. subtilis и Е.coli. Среди эукариотических клеток-хозяев предпочтительными являются клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих. В частности, такие клетки, как клетки человека, обезьяны, мыши, насекомого (используя экспрессионные системы на основе бакуловирусов) и клетки ооцитов китайского хомяка (СНО) (как показано в примерах),обеспечивают посттрансляционные модификации молекулам белка, в том числе правильную укладку или определенные формы гликозилирования в правильных сайтах. Также клетки дрожжей могут осуществлять посттрансляционные пептидные модификации, в том числе гликозилирование. Существует целый ряд стратегий рекомбинантных ДНК, в которых используются последовательности сильного промотора и высокое число копий плазмид, которые могут быть использованы для получения желаемых белков в дрожжевых клетках. Дрожжи распознают лидерные последовательности в клонированных генных продуктах млекопитающих и секретирует пептиды, несущие лидерные последовательности (т.е. препептиды). Клеточные линии млекопитающих, доступные в качестве клеток-хозяев для экспрессии, известны из уровня техники и включают большое число иммортализированных клеточных линий, доступных из Американской коллекции типовых культур (АТСС), в том числе, но ими не ограничиваясь, ооциты китайского хомяка (СНО), HeLa, клетки почек детенышей хомяка (BHK), почек обезьяны (COS), C127, 3 Т 3,BHK, HEK293, Per.С 6, меланомы кишечника и гепатоклеточной карциномы человека (например, Hep G2) и ряд других клеточных линий. В бакуловирусной системе материалы для бакуловирусных/клеток насекомых экспрессионных систем коммерчески доступны в виде набора (например, коммерциализованные фирмой Invitrogen). Для длительной продукции рекомбинантного полипептида с высоким выходом предпочтительной является стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют интересующий полипептид, могут быть трансформированы с использованием векторов экспрессии, которые могут содержать вирусные точки начала репликации и/или эндогенные экспрессионные элементы и ген селектируемого маркера в том же или в отдельном векторе. После введения вектора клеткам можно обеспечить рост в течение одного или нескольких дней в обогащенной среде, перед их пересадкой на селективную среду. Назначением селективного маркера является придание резистентности для селекции,и его наличие обеспечивает рост и извлечение клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток можно размножить, используя технологии тканевых культур, подходящие для этого типа клеток. Клеточную линию, в значительной степени обогащенную такими клетками, затем можно выделить для получения стабильной клеточной линии. В случае полноразмерных рекомбинантных иммуноглобулинов человека важной стадией является отбор специфического изотипа и константной области. Векторы, специально созданные для экспрессии антител желаемого изотипа и подтипа (например, IgA, IgG1, IgG2 или IgG4 человека) широко описаны в литературе. Затем, полноразмерные антитела или слитые белки могут быть экспрессированы в виде рекомбинантных белков в прокариотических организмах (например, Escherichia coli; Sorensen H. andMortensen K., 2005; Venturi M. et al., 2002), растениях (Ma J. et al., 2005) или эукариотических клетках,что обеспечивает высокий уровень экспрессии в виде транзиторных или стабильных трансформированных клеток (Dinnis D. and James D., 2005). Это может быть необходимо, в частности, когда должна проводиться характеристика антител с использованием более сложных анализов, в том числе анализов invivo, в которых можно определить период полужизни антитела. Клетки-хозяева дополнительно могут быть выбраны исходя из уровня экспрессии рекомбинантного белка. Кроме того, при экспрессии белка, в особенности в виде антитела, в эукариотических клеткаххозяевах (клеточных линиях млекопитающих, в частности) различные векторы экспрессии и экспрессионные системы были сконструированы для получения стабильных пулов трансфектированных клеточных линий (Aldrich T. et al., 2003; Bianchi A. and McGrew J., 2003). Высокий уровень оптимизированной стабильной экспрессии рекомбинантных антител достигался (Schlatter S. et al., 2005) также благодаря оптимизации условий культивирования клеток (Grunberg J. et al., 2003; Yoon S. et al., 2004) и путем селекции и инженерии клонов с более высокими уровнями продукции антител и секреции (Bohm E. et al.,2004; Butler M., 2005). Антитело, фрагменты антител, биологически активный пептид, слитый белок и любой другой бе-9 018701 лок, определенный выше как способный связываться и нейтрализовать hCMV, может быть очищен с использованием общепринятых методик, которые позволяют выделить либо не-/рекомбинантные белки из культуры, либо из синтетических препаратов. Эти технологии обеспечили бы достаточное количество белка (в интервале от микрограмма до миллиграмма) для проведения более тщательной характеристики и подтверждения, связанных с hCMV профилактических, диагностических и других терапевтических применений. С этой целью препараты рекомбинантных или природных белков могут быть протестированы в in vitro или in vivo анализах (биохимических, анализах на основе тканей или клеток, моделей заболеваний, созданных у грызунов или приматов, биофизических способах для определений аффинности,картирования эпитопов и т.п.), в частности, используя любой из тех, что описаны в примерах или литературе для изучения патогенеза и иммунобиологии hCMV. Антитела, в виде очищенных препаратов из супернатантов В-клеток человека или экспрессированные в виде рекомбинантных белков, могут быть дополнительно проверены с использованием in vitro исследований на основе органов и клеток, известных в литературе (Eggers M. et al. 1998; Lam V. et al., 2006;Reinhardt В. et al., 2003; Forthal D. et al., 2001; Goodrum F. et al., 2002). Более того, релевантные доклинические испытания могут быть проведены у животных, инфицированных hCMV, в частности, на моделях,в которые могут быть трансплантированы клетки-хозяева человека (Barry P. et al., 2006; Gosselin J. et al.,2005; Thomsen M. et al., 2005). Очистку рекомбинантных белков по изобретению можно проводить любым из общепринятых способов, известных для этой цели, т.е. любым способом, включающим экстракцию, преципитацию, хроматографию и подобное. В частности, в способах для очистки антител могут применяться иммобилизованные гелевые матрицы, содержащиеся в колонке (Nisnevitch M. and Firer M., 2001; Huse K. et al., 2002;Horenstein A. et al., 2003), использующих сильную аффинность антител для таких субстратов, как белок А, белок G, или синтетических субстратов (Verdoliva A. et al., 2002; Roque A. et al., 2004), или для специфических антигенов или эпитопов (Murray A. et al., 2002; Jensen L. et al., 2004). После промывания белок элюируют из геля путем изменения рН или ионной силы. Альтернативно, может быть использованаHPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография). Элюирование можно проводить, используя растворитель на основе воды-ацетонитрила, обычно используемый для очистки белков. Антитело, фрагменты антител, биологически активные пептиды, слитые белки и любое другое соединение, определенное выше, в которых используются последовательности антитела 26 А 1, может быть использовано для выявления, лечения, ингибирования, профилактики и/или облегчения инфекцииhCMV. Для этой цели такие соединения могут быть использованы для получения диагностических, терапевтических или профилактических композиций для лечения инфекции hCMV. В частности, такие соединения могут быть использованы для получения фармацевтических композиций вместе с любым фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем. Эти композиции могут дополнительно содержать любое дополнительное терапевтическое или профилактическое средство, такое как вакцины, hCMV-нейтрализующее антитело, препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения, иммуномодулирующие соединения и/или противовирусные соединения. В литературе представлены некоторые примеры таких соединений, действующих на репликацию hCMV (фоскарнет,ванганцикловир, фомивирсен или ганцикловир) и уже протестированных у людей, отдельно или в сочетании с препаратами иммуноглобулинов для внутривенного использования (De Clercq E., 2003; Nigro G.et al., 2005). Более того, недавние литературные данные дают возможность предположить, что моноклональные антитела человека могут быть использованы для дополнения (и замены, если возможно) существующих в настоящее время лекарственных средств, таких как препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения и/или противовирусные соединения, позволяя уменьшить частоту и/или дозу таких фармацевтических композиций (Bayry J. et al., 2007). Эти композиции могут содержать антитело, фрагмент антитела, биологически активный пептид,слитый белок и любое другое соединение, определенное выше на основе последовательности и активности моноклонального антитела человека 26 А 1. Эти композиции дополнительно могут содержать другоеhCMV-нейтрализующее антитело, препарат иммуноглобулинов для внутривенного введения (IVIg) и/или противовирусное соединение. Другое hCMV-нейтрализующее антитело должно характеризоваться другим эпитопом, например, уже описанными в литературе или в патентных заявках ЕР 07114782,ЕР 07115410 и ЕР 07111741 (10 В 7, 8 С 10 и 1F7 соответственно), которые связаны с gH, gB, или другими антигенами hCMV. Действительно, в литературе представлено много примеров, в которых, когда два или более антитела направлены на вирусную мишень или мишень человека, объединены в фармацевтической композиции, полученная в результате композиция может иметь улучшенную терапевтическую эффективность не вследствие простого аддитивного эффекта, а вследствие специфичного синергетического эффекта (Logtenberg T., 2007). Композиции, содержащие любой из белков (например, антитела, фрагменты антител, слитые белки,биологически активные пептиды) и любую из определенных выше нуклеиновых кислот, могут быть использованы и введены индивидууму с диагностической, терапевтической или профилактической целью в связи с hCMV. Эти композиции могут быть введены как средства для hCMV-специфичной пассивной иммунизации, которые предоставляют терапевтические соединения (в частности, терапевтические антитела или фрагменты терапевтических антител), которые путем нацеливания на вирионы hCMV могут ингибировать размножение вируса у пациента, подвергаемого лечению, и потенциально блокировать вспышку вирусной инфекции в популяции. В зависимости от специфического применения композиция должна предоставлять это соединение пациенту человеку (в частности, беременной женщине или любому другому индивидууму, инфицированному hCMV, или у которого предполагают риск наличия hCMV вследствие контакта с индивидуумом, инфицированным hCMV) в течение более длительного или более короткого периода времени. С этой целью композицию можно вводить, в однократной или многократных дозах, и/или используя соответствующие устройства, посредством различных путей: внутримышечно, внутривенно, подкожно, местно, через слизистые, с помощью небулайзера или ингалятора, в виде глазных капель, в не-/биоразлагаемых матричных материалах, или используя конкретные системы доставки лекарственного средства. В частности, эта композиция может позволить осуществить местное или офтальмологическое введение, что представляет эффективный подход, принимая во внимание наличие hCMV в слизистых оболочках или в глазах. Более того, антитела и фрагменты антител могут быть эффективными при местном наложении на раны (Streit M. et al., 2006), роговицу (Brereton H. et al., 2005) или влагалище (Castle P. et al., 2002). Фармацевтическая композиция по изобретению должна обеспечить терапевтически или профилактически эффективное количество соединения пациенту, которое позволяет этому соединению проявлять его активность в течение достаточного периода времени. Желаемым эффектом является улучшение состояния пациента с hCMV за счет контролирования инфекции hCMV, реактивации и/или реинфекции, и за счет уменьшения, по меньшей мере, некоторых клинических проявлений инфекции hCMV, таких как воспаление сетчатки или пневмония (Landolfo S. et al., 2003). Например, эту композицию следует вводить в эффективном количестве примерно от 0,005 примерно до 50 мг/кг/массы тела, в зависимости от пути введения, количества вводимых доз и состояния индивидуума. В том случае, когда композиции имеют диагностическое применение, это соединение должно выявляться с помощью технологий, обычно установленных в клинических и исследовательских лабораториях для выявления вируса в биологических образцах (например, ELISA или другие серологические анализы),или при введении пациенту in vivo по меньшей мере через 1, 2, 5, 10, 24 или более часов после введения. Выявление hCMV может быть выполнено с использованием белков по настоящему изобретению, взамен или вместе с известными средствами и способами, которые были установлены для мониторинга хронической или острой инфекции hCMV в популяциях с риском как у иммунокомпетентных хозяев, так и хозяев с иммудефицитом, где существует корреляция между данными, полученными in vitro и клиническим статусом (Gilbert G., 2002; Gerna G. and Lilleri D., 2006; Lazzarotto T. et al., 2007). Способ лечения, профилактики или диагностики hCMV, или заболевания, связанного hCMV, может включать введение белка или нуклеиновой кислоты, как определено выше. Этот способ дополнительно может включать введение другого hCMV-нейтрализующего антитела, препарата иммуноглобулинов для внутривенного введения (IVIg) и/или противовирусного соединения. Клинические разработки и применение должны быть основаны на фармакокинетике и фармакодинамике антитела (Lobo E. et al., 2004; Arizono H. et al., 1994), доклинических и клинических данных по безопасности (Tabrizi M. and Riskos L., 2007) и соблюдении международных требований для получения и контроля качества моноклональных антител, используемых для лечения и в in vivo диагностике у людей(Harris R. et al. 2004). Белки по изобретению также могут быть использованы для получения композиции для выявления,лечения, ингибирования, профилактики и/или улучшения других, более широко распространенных заболеваний (таких как сердечно-сосудистые и аутоиммунные заболевания или при некоторых видах рака),которые могут быть определены как hCMV-родственные или hCMV-связанные заболевания. При этих состояниях hCMV считается возможным кофактором, поскольку хорошо известно, что этот вирус связан с клеточными/иммунологическими воспалительными процессами (путем стимуляции экспрессии Fc рецепторов, молекул клеточной адгезии, хемокинов и цитокинов), аутоиммунной активности (например,при атеросклерозе, рестенозе) и с изменениями в каскаде презентации антигена (путем ингибирования экспрессии МНС класса I и II), что приводит к клеточному апоптозу, дифференцировке и миграции, например, в кровеносных сосудах и в активно пролиферирующих клетках (Cinatl J. et al., 2004; SoderbergNaucler С., 2006b). Более того, было обнаружено, что инфекция hCMV также связана с изменением клеточного метаболизма (Munger J. et al., 2007), угнетением (Phillips A. et al., 2007) или фактором риска случаев тромбоза(Fridlender Z. et al., 2007). Реактивация hCMV и связанных с этим осложнений также была обнаружена у пациентов со злокачественными опухолями (Sandherr M. et al., 2006; Han X., 2007) или пациентов с воспалительными заболеваниями соединительной ткани (Yoda Y. et al., 2006), и в основном у пациентов,получающих иммуносупрессирующее лечение, например, кортикостероидами (Yamashita M. et al., 2006),или химиотерапевтическое лечение и другие иммуносупрессирующие схемы лечения на основе антител Настоящее изобретение теперь будет описано посредством следующих примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение. Примеры Пример 1. Получение клеточных культур, секретирующих моноклональные антитела человека, которые нейтрализуют инфицирующую способность hCMV. Материалы и методы. Выбор людей доноров, у которых в сыворотке крови представлены IgC антитела, нейтрализующиеhCMV-нейтрализующие антитела выявляли в соответствии с анализом микронейтрализации hCMV,основанного на эмбриональных фибробластах легкого (HELF клетках) и штамме hCMV AD169 (лабораторный штамм hCMV из АТСС, cod. VR-538). Анализы микронейтрализации hCMV также проводили с использованием эндотелиотропного штамма hCMV VR1814, производного клинического изолята, извлеченного из цервикального мазка беременной женщины (Revello M et al., 2001), и эндотелиальных клеток пупочной вены человека(HUVEC). Эти клетки были получены путем ферментативной обработки пуповинных вен и культивированы в эндотелиальной ростовой среде (EGM-2, Cambrex Bio Science), дополненной 2% эмбриональной сывороткой теленка (FBS), рекомбинантным эндотелиальным фактором роста сосудов человека (VEGF),основным фактором роста фибробластов (bFGF), эпидермальным фактором роста человека (hEGF), инсулиноподобным фактором роста (IGF-1), гидрокортизоном, аскорбиновой кислотой, гепарином, гентамицином и амфотерицином В, (1 мкг/мл каждого). Эксперименты проводили с клетками 2-6 пассажей. Применение клеток HELF и HUVEC для изучения инфекции hCMV и репликации с использованием клинических и лабораторных штаммов было описано во многих статьях (Gerna G. et al., 2002). В случае по настоящему изобретению клетки высевали (2,0-2,5104/лунку) в плоскодонные лунки 96-луночного планшета в 100 мкл ростовой среды, которая содержит минимальную эссенциальную среду (MEM;Gibco-BRL) с 10% эмбриональной сывороткой теленка (FCS), 1 мМ пирувата натрия (NaP) и GPS (2 мМ глутамина, 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Клетки культивировали в течение 24 ч при 37 С. 50 мкл образцов, содержащих антитела (сыворотка человека, супернатанты клеточных культур или очищенные с использованием белка А естественные или рекомбинантные IgG в указанных концентрациях), инкубировали с лабораторным штаммом hCMV AD169 [500 бляшкообразующих единиц (pfu) в 50 мкл MEM с 5% FCS; общий объем смеси составил 100 мкл] в течение 1 ч при 37 С. Смесь препарата антител и вируса затем добавляли к монослою клеток HELF (для штаммов AD169 и AL-1 hCMV) или монослою клеток HUVEC (для VR1814 hCMV) и инкубировали в течение 1 ч. Ростовую среду удаляли из клеточных монослоев и заменяли смесью антитело-вирус. Затем планшеты центрифугировали при 2000 g в течение 30 мин и инкубировали в течение 90 мин при 37 С в 5% СО 2. Добавляли ростовую среду(100 мкл) и культуры подращивали в инкубаторе в течение еще 72 ч. Действие В-клеточных супернатантов на инфицирующую способность hCMV определяли окрашиванием промежуточных ранних антигенов hCMV (IEA, IE1+IE2) путем непрямого иммунопероксидазного окрашивания. Эти клеточные монослои фиксировали с использованием раствора ацетон/метанол (хранился при -20 С) в течение 1 мин, затем промывали с использованием PBS. Затем нарушали проницаемость мембраны клетки в 0,1% Тритоне Х-100 в PBS с 1% Н 2 О 2, 5 мин на льду, затем промывали PBS. Эндогенную пероксидазу блокировали PBS с 50% метанолом и 0,6% Н 2 О 2, 30 мин при комнатной температуре в темноте, а затем промывали PBS. 50 мкл блокирующего белкового реагента (Ultra Tech HRP 500-600 Test; Streptavidin-Biotin Universal Detection System; PN IM2391) добавляли на 10 мин при комнатной температуре, а затем вымывали с помощью PBS. Мышиные анти-HCMV IEA (клон Е 13; ArgeneBiosoft; ref. 11-003) добавляли в лунки на 60 мин при комнатной температуре. После промывания клетки инкубировали с 50 мкл биотин-конъюгированных вторичных антител против IgG человека (Ultra TechHRP 500-600 Test; Streptavidin-Biotin Universal Detection System; PN IM2391) или конъюгированных с пероксидазой козьих антимышиных IgG (Ultratech HRP) в течение 10 мин. Субстрат DAB (Merck; no. 1.02924.0001) в 0,1% Н 2 О 2 добавляли на 30-45 мин при 20 С в темноте и реакцию останавливали разбавлением PBS. IEA-позитивные ядра подсчитывали под микроскопом. Только среда или супернатанты клеточных культур, содержащие нерелевантные IgG антитела, использовались в качестве отрицательного контроля. Коммерческий препарат IgG человека, очищенный из сыворотки hCMV-серопозитивных пациентов (Cytotect; Biotest), использовали в качестве положительного контроля с постепенными разбавлениями, начиная с 125 мкг/мл. Позитивность определяли как 40% ингибирование IEA-позитивных клеток, по сравнению с лунками отрицательного контроля. Конечная точка 50%-ингибирования, рассчитанная по методу Рида-Мюнха (Reed-Mnch), будет считаться титром нейтрализации (NT):(% ингибирования свыше 50% - % ингибирования ниже 50%)] Выбор доноров человека исходя из наличия в сыворотке IgG, которые свяжутся с участками гликопротеинов gB или gH оболочки hCMV.hCMV-специфичные анализы связывания проводили, как изложено в РСТ/ЕР 2005/056871, или указано производителем, и проверяли с коммерческой смесью антител IgG, специфичных к CMV (Cytotect;Biotest). Сыворотку тестировали в ELISA, специфичном для связывания IgG человека с белками вирионаhCMV, которые являются коммерчески доступными (BEIA-CMV IgG Quant; Bouty, cod. 21465), и gB(AD2) hCMV IgG ELISA также являются коммерчески доступными (антиген CG3 Biotest AG, cod. 807035; фиг. 1 А). Вкратце, распадающиеся полоски, покрытые инактивированной hCMV белковой смесью (полученной из лабораторного штамма AD169), помещали в микропланшеты и инкубировали с В-клеточными супернатантами, разведенными 1:81 (10 мкл супернатантов добавляли к 800 мкл разведения образца системы BEIA), и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. После цикла промывки добавляли предварительно разведенное моноклональное антитело против IgG человека, конъюгированное с пероксидазой хрена (100 мкл) и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение еще 30 мин. После второго цикла промывки добавляли предварительно разбавленный раствор субстратТМВ (100 мкл) и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Реакцию останавливали, используя стоп-раствор (100 мкл/лунку), и измеряли оптическую плотность в бихроматизме при 450/620 нм. Получение культуры иммортализованных В-клеток человека. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) получали от пациента после перенесенной острой инфекции hCMV (CMV7), выбранного по наличию в сыворотке hCMVнейтрализующих антител. EBV-процесс иммортализации, которому в последствии подвергали РВМС отCMV7 пациента, проводили в соответствии с указаниями РСТ/ЕР 2005/056871. Вкратце, РВМС очищали из периферической крови с помощью обычного центрифугирования в градиенте плотности на Фиколл/Гипаке. CD22-позитивные клетки выделяли из свежих РВМС (90% чистоты) с использованием бус, покрытых антителами против CD22 человека по технологии VarioMACS (Miltenyi Biotec Inc.), как описано производителем. Очищенные клетки стимулировали сочетанием CpG2006 (Coley, 1 мкг/мл) иIL-2 (Roche, 200 Ед./мл). После 4-дневной стимуляции клетки промывали свежей культуральной средой(RPMI-1640), и В-клетки были обогащены IgG-позитивными клетками, используя бусы, покрытые антителами против IgG человека, используя методику VarioMACS (Miltenyi Biotec Inc.), следуя инструкциям производителя. Выбранные и стимулированные клетки суспендировали и подращивали в клеточной культуральной среде RPMI-1640, дополненной 10% (об./об.) инактивированной нагреванием FCS (эмбриональной сывороткой теленка), 1 мМ пируватом натрия, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 Ед./мл пенициллина, в 24 луночных планшетах при 37 С и 5% СО 2. EBV-иммортализацию проводили, используя супернатант клеток В 95.8 (1:1 об/об в течение 16 ч). В конце этого процесса иммортализованные клетки промывали свежей культуральной средой(RPMI 1640, дополненной 10% эмбриональной сывороткой теленка) и вводили в культуру на 3 недели при плотности 1,5106 клеток/мл в 24 луночные планшеты с питающим подслоем (облученные аллогенные РВМС высеянные при 5105 клеток/лунку), без CpG2006 (и без CPG2006, как описано в РСТ/ЕР 2006/069780 для процесса, начинающегося с РВМС, полученных от донора CMV5). Отбор субкультур иммортализованных В-клеток человека, которые секретируют антитела, нейтрализующие hCMV. Через пятнадцать дней после воздействия EBV активность, нейтрализующую hCMV, подтверждали в размноженной, поликлональной клеточной культуре с помощью анализа микронейтрализации на основе AD169/HELF, как описано выше. Затем, клетки высевали по 20 клеток/лунку на облученные (30 Гр),аллогенные РВМС (50000/лунку) в 100 мкл IMDM, дополненной 10% FCS и заменимыми аминокислотами (NEAA, разведенными IX из 100 Х коммерческого маточного раствора; EuroClone) в отсутствиеCpG2006 и IL-2. Всего было получено 4224 субкультур и через две недели добавляли 50 мкл той же среды. Еще через 1-2 недели культивирования супернатанты клеточных культур, которые представляли растущие и агрегированные клетки, тестировали параллельно, используя анализ нейтрализации hCMV на основе клеток HELF и штамма AD169 hCMV. Супернатанты клеточных культур, в которых была представлена нейтрализующая активностьhCMV, тестировали, используя ELISA для выявления связывания IgG человека с участками гликопротеина gB оболочки hCMV, или всех белков hCMV, описанных выше. Альтернативно, антигены на основе gB или gH были получены в виде слитых белков с глутатион-Sтрансферазой (GST). В случае gB(Ag)-GST антигена, иммунодоминирующая область gB из штамма С 194hCMV была слита с GST (BioDesign, Cat. No. R18102; GS-4B аффинно очищены на сефарозе, 1 мг/мл). В случае антигена gH(Ag)-GST фрагмент гликопротеина gH HCMV штамма VR1814 клонировали с помощью ПЦР, сливали с геном GST, получали в Е.coli и очищали из лизата бактериальных клеток, исходя из аффинности GST. Рекомбинантный антиген gH(Ag)-GST соответствует слиянию с сохранением рамки считывания между аминоконцевой областью gH (аминокислоты 16-144; фиг. 1 В) из штамма VR1814 иGST hCMV. Только GST использовали в качестве отрицательного контроля. Эти ELISA проводили, применяя обычный протокол для ELISA в 96-луночном формате с незначительными модификациями. Вкратце, антиген разводят по 2 мкг/мл в PBS, и 50 мкл этого раствора белка(содержащего 100 нг бактериально экспрессированного слитого белка) использовали для покрытия EIA полистирольных планшетов (Nunc; Cat No. 469949). Покрытие планшетов для ELISA проводили в течение ночи при 4 С, затем после удаления раствора белка эти планшеты промывали четыре раза с использованием 150 мкл промывочного буфера (PBS, содержащий 0,05% Твина 20). Проводили обработку для блокировки неспецифического связывания, к тому времени разливая 100 мкл PBS, содержащего 1% молока в каждую лунку на 1 ч при 37 С. После четырех циклов промывки с использованием 150 мкл промывочного буфера 50 мкл супернатантов из клеточных культур инкубировали в каждой лунке в течение 2 ч при 37 С, используя 50 мкл/лунку клеточной культуральной среды в качестве отрицательного контроля. После четырех циклов промывки 50 мкл вторичного антитела [козье антитело против IgG человека (Fc специфичное), конъгированного с пероксидазой хрена; разбавленного 1:30000 в промывочном буфере; Sigma, Cat. No. А 0170] разливали в каждую лунку, и планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После четырех дополнительных циклов промывки развивалась ферментативная реакция путем добавления 50 мкл субстрата-ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина; Sigma, Cat. No. T0440) в каждую лунку еще на 30 мин при комнатной температуре. Хромогенную реакцию останавливали, разливая в каждую лунку 100 мкл стоп-раствора (1 н. серной кислоты) и оптическую плотность считывали при 450 нм. Результаты. РВМС человека получали от пациента с hCMV (CMV7), у которого представлен значительный титр нейтрализации hCMV в сыворотке (50% нейтрализация при разведении 1:105), вместе с сильной реактивностью в ELISA (позитивный при разведении 1:64 образец считается позитивным на наличие IgG против gB в разведении 1/4 или выше), на основе связывания с доменами AD2 гликопротеина В, одного из антигенов hCMV, лучше всего охарактеризованного как извлекающий сывороточные нейтрализующие антитела (Qadri I. et al., 1992; Kropff B. et al., 1993), и клонированного в антиген CG3 (фиг. 1 А). Более того, сыворотки CMV7 были позитивными в другом ELISA с использованием суммарных белков вириона hCMV, где измеренная активность составляет 74 AU/мл (образец считали позитивным на наличие анти-hCMV IgG, когда результат составляет по меньшей мере 10 AU/мл). В-клетки от пациента с CMV7 использовали для получения иммортализованной поликлональной клеточной культуры, высокообогащенной В-клетками, которые секретируют IgG, используя способ иммортализации на основе EBV, описанный в РСТ/ЕР 2005/056871 и РСТ/ЕР 2006/069780. По сравнению с последним документом, в котором описывается отбор анти-hCMV антител от другого донора (CMV5),субкультуры были получены из исходной суммарной, поликлональной популяции иммортализованных клеток в отсутствие CpG2006, и супернатанты сначала отбирали по наличию антител, нейтрализующих инфицирующую способность hCMV, с помощью анализа микронейтрализации, и только после по антителам, связывающимся с выбранными антигенами hCMV. Анализ микронейтрализации hCMV применяли только для субкультур, которые достоверно активно растут с кластерами клеток на 3 неделе культивирования. Супернатанты из 324 лунок сначала подвергали скринингу в анализе нейтрализации hCMV, было обнаружено, что среди них 20 супернатантов снижают инфицирующую способность штамма AD169 hCMV по меньшей мере на 40%. При характеристикеhCMV-связывающих активностей в этих лунках было обнаружено, что только две являются позитивными по gB (либо как CG3 антиген, либо слитый белок gB(Ag)-GST), ни одной по gH (как слитый белокgH(Ag)-GST; фиг. 1B) и 18 лунок ни по одному из них (фиг. 2). Вследствие низкого количества клеток, изначально высеянных в каждую лунку (20 клеток/лунку),каждая субкультура, представляющая hCMV-нейтрализующую активность, вероятно должна продуцировать моноклональные антитела (т.е. секретированные клетками, клонально происходящими из единственной, специфически иммортализованной клетки), особенно учитывая низкую частоту клеток в иммортализованной поликлональной клеточной популяции, которая, как ожидается, выращивает и секретируетhCMV-нейтрализующие IgG. Дальнейшие экспериментальные действия были разработаны для подтверждения этого предположения. Пример 2. Характеристика антитела 26 А 1. Материалы и методы. Размножение и характеристика субкультуры 26 А 1. Клетки из исходной субкультуры 26 А 1 размножались на облученных аллогенных РВМС в средеIMDM (дополненной 10% FCS и NEAA), и hCMV-нейтрализующую активность подтверждали по мень- 14018701 шей мере дважды во время этой стадии размножения, с помощью анализа микронейтрализации hCMV,как описано в примере 1 (см. таблицу). Количество антител, секретируемых субкультурой 26 А 1, определяли в 24, 48 и 72 ч, используя коммерческий набор для количественного ELISA IgG человека (Immunotek; cod. 0801182; ZeptometrixCorp.) в соответствии с инструкциями производителя. Подкласс антитела 26 А 1 определяли, используя коммерческий анализ (PeliClass human IgG subclass ELISA combi-kit; cod. RDI-M1551cib, RDI Divison ofFitzgerald Industries Intl.). Клеточную культуру постепенно размножали, путем посева клеток, содержащихся в 1 лунке 96 луночного планшета (1105) в одну лунку 48-луночного планшета на облученные аллогенные РВМС вIMDM, дополненной 5% FCS. Через 5-7 дней клетки размножали в одной лунке 24-луночного планшета в отсутствие питающего подслоя, в IMDM, дополненной 5% FCS. Затем, клетки (5105/мл) помещали в 6 луночный планшет в отсутствие питающего подслоя в 50% IMDM и 50% гибридома-SFM (Gibco, cod. 12045-084), дополненной 2,5% FCS. Клетки культивировали в этих условиях по меньшей мере одну неделю. Экспоненциально растущие клетки затем промывали и культивировали во флаконах Т 75 в среде гибридома-SFM с концентрацией в интервале от 5105 до 106/мл. Супернатант клеточной культуры собирали, IgG количественно анализировали и очищали на колонках с белком А, подвергали диализу против PBS буфера и фильтровали (0,2 мкМ). Характеристика антитела, секретируемого субкультурой 26 А 1.HSV анализ проводили в соответствии с литературными данными (Laquerre S. et al., 1998). Анализ подавления бляшкообразования hCMV проводили, используя штамм AD169 hCMV. Вкратце, вирус разбавляли до 1000 PFU/реакцию. Равные количества (0,1 мл) вируса и каждого антитела или супернатанта клеточной культуры перемешивали и инкубировали при 37 С в течение 1 ч. Эти смеси добавляли к монослою клеток HELF (в 24-луночных планшетах) и оставляли для адсорбции в течение 1 ч при 37 С. Затем смесь антитело-вирус удаляли и к инфицированным клеткам добавляли 1% метилцеллюлозный верхний слой-МЕМ-2% FCS. Бляшки будут подсчитывать как измерение инфицирующей способности на 10 или 12 день после заражения. Супернатант клеточной культуры 26 А 1 тестировали в иммунофлуоресценции на неинфицированных клетках HELF или HUVEC. Вкратце, клетки (7104/мл) высевали на покрытые желатином покровные стекла в 24-луночных планшетах в MEM, дополненной 10% FCS, а затем выращивали до полуконфлюэнтности. Затем клетки промывали дважды теплым PBS, фиксировали предварительно охлажденной смесью (при -20 С) 50% ацетона/50% метанола в течение 1 мин при комнатной температуре (КТ), а затем промывали PBS. У фиксированных клеток нарушали проницаемость мембраны 0,2% Тритоном Х-100 вPBS в течение 20 мин на льду, промывали PBS и инкубировали в течение 15 мин при КТ с блокирующим раствором (PBS, дополненный 2% FCS). Альтернативно, у фиксированных клеток проницаемость мембраны не нарушали для определения способности антител распознавать компоненты клеточной поверхности. В этом случае фиксированные клетки промывали PBS, инкубировали в течение 15 мин при КТ с блокирующим раствором (PBS, дополненный 2% FCS) и инкубировали с супернатантом клеточной культуры 26 А 1 (80 мкл) в течение 2 ч при 37 С. Затем клетки промывали теплым PBS (3 раза) и инкубировали с 80 мкл конъюгированных с FITC кроличьих антител против F(ab')2 IgG человека (Jackson ImmunoResearch), чтобы отследить окрашивание IgG человека в виде зеленого цвета. Вторичные антитела разводили 1:50 в PBS, дополненном 0,05% Твина 80 и добавляли к клеткам на 1 ч при 37 С в темноте. Затем,клетки промывали теплым PBS (3 раза) и контр-окрашивали йодидом пропидия (0,25 мкг/мл в PBS;Sigma). Покровные стекла устанавливали на предметное стекло микроскопа, используя заливочную среду (Vector Laboratories). Изображения регистрировали на инвертированном конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus Fluoview-IX70. Характеристика последовательности ДНК/белка IgG 26A1 и рекомбинантной экспрессии. Аликвоту клеточной культуры, полученной в результате размножения исходной клеточной культуры 26 А 1, использовали для секвенирования вариабельных доменов тяжелой цепи (VH) и легкой цепи(VL) антитела 26 А 1 в соответствии с методикой, установленной Fusion Antibodies Ltd. Дебрис замороженных клеток (содержащий по меньшей мере 50000 клеток) использовали для экстракции суммарной РНК. Соответствующие кДНК были получены с помощью обратной транскрипции с олиго(dT)праймером. ПЦР реакции проводили для амплификации области VH, используя смесь IgGспецифичных праймеров и области VL со смесью Igk/ праймеров. Продукты ПЦР двух реакций амплификации клонировали, используя сайт рестрикции Eco RI в векторе для секвенирования (pCR2.1; Invitrogen), и использовали для трансформации клеток ТОР 10 Е.coli. По меньшей мере 10 выбранных колоний, полученных из двух трансформаций, было отобрано и проанализировано путем секвенирования. Полученные в результате последовательности ДНК выравнивали и транслировали в белковую последовательность, получая консенсусную последовательность ДНК и белка для VH 26A1 (SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 соответственно) и VL 26A1 (SEQ ID NO:9 и SEQ ID последовательностями, представленными в общедоступных базах данных (используя базы данных GenomeQuest, GeneSeq и EBI). CDR, характеризующие белковые последовательности VH 26A1 (SEQ IDNO:5, 7 и 8) и VL 26A1 (SEQ ID NO:11, 12 и 13), были предварительно определены с помощью базы данных IMGT (Giudicelli V. et al., 2004). Рекомбинантное моноклональное антитело человека 26 А 1 экспрессировали в эукариотических клетках путем клонирования консенсусных последовательностей вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи 26 А 1 в том же векторе экспрессии, уже содержащем соответствующие константные области(для тяжелой цепи IgG1 человека и лямбда цепи Ig человека), и векторе с двойным промотором, обеспечивающем экспрессию обеих цепей антитела. Полная последовательность рекомбинантного моноклонального антитела человека 26 А 1 в векторе подтверждалась секвенированием ДНК и использовалась для транзиторной трансфекции клеток СНО DG44 (Derouazi M. et al., 2006), которые были адаптированы для роста в бессывороточной суспензионной культуре, и их высевали с плотностью 1106 клеток на мл в 125 мл центрифужную пробирку. Трансфекцию проводили с использованием смеси 300 мкг вектора экспрессии с 900 мкг линейного 25 кДа поли(этилэнимина). Клетки инкубировали при 37 С в 5% CO2 в течение 6 дней в центрифужной пробирке до сбора среды. Рекомбинантное антитело очищали, используя колонку с белком G на хроматографическом блоке Akta Prime, следуя стандартной программе производителя. Результаты. Среди субкультур, содержащих растущие и IgG-секретирующие клетки, супернатанты клеточных культур немногих из них содержали антитела, которые нейтрализуют инфекцию hCMV, но не представляют значительное связывание со специфичными рекомбинатными антигенами gB и gH, протестированными с помощью ELISA (фиг. 1 и 2). В частности, субкультура 26 А 1, которая секретирует IgG1, демонстрировала более сильную и более репродуцируемую hCMV-нейтрализующую активность и была выбрана для более подробной молекулярной и биологической характеристики. Связывание IgG, находящихся в супернатанте из субкультуры 26 А 1, с hCMV было подтверждено с помощью ELISA, содержащего смесь белков hCMV (BEIA-CMV). В то же время у этого супернатанта была продемонстрирована значительная нейтрализующая активность hCMV в отношении различных штаммов hCMV в двух системах клеток-хозяев человека (как показано в таблице). Эта активность не наблюдалась, когда этот супернатант использовали в HSV-специфичном анализе нейтрализации. Более того, субкультура 26 А 1 была размножена и в дальнейшем субклонирована по 10 клеток на лунку для подтверждения ее моноклональности в смысле экспрессии hCMV-нейтрализующих IgG1 человека. Действительно, среди лунок, в которых демонстрировался клеточный рост, все проявили нейтрализующую активность в интервале от 50 до 98% в исходном анализе на основе AD169, подтверждая результаты, полученные с исходной субкультурой 26 А 1. Эти клетки в исходной субкультуре 26 А 1 использовали для увеличения продукции IgG, получая прогрессивно большие культуры, из которых IgG могут быть очищены и протестированы в анализахhCMV. Большие культуры получали путем постепенного размножения культуры 26 А 1 и устранения некоторых требований к росту в клеточной культуре (таких как питающий подслой, эмбриональная сыворотка теленка). Используя этот подход, было показано, что большие клеточные культуры, полученные из исходной субкультуры 26 А 1, секретируют IgG1 в концентрации приблизительно 16 мкг/мл/106 клеток. Эти большие культуры продемонстрировали время удвоения 4 дня даже в отсутствие питающего подслоя, и нейтрализующая активность hCMV сохранялась в культуре больше 2 месяцев. Анализы нейтрализации hCMV повторяли с антителом 26 А 1, в виде IgG человека, очищенного с помощью аффинной хроматографии из большой клеточной культуры. 26 А 1 IgG тестировали в экспериментах доза-ответ для оценки концентрации, необходимой для 50% ингибирования (ингибирующая концентрация 50, или IC50) инфицирующей способности hCMV, используя два анализа с различными сочетаниями штаммов hCMV и клеток-мишеней человека. Результаты показали, что мощная нейтрализующая активность естественного 26 А 1 IgG, очищенного с использованием белка А, является ни клеточного типа, ни специфичной к вирусному штамму, и может быть количественно определена как обеспечивающая значения IC50 приблизительно 1 мкг/мл и нейтрализующее действие, приближающееся к 100% в обоих анализах (фиг. 3). При сравнении нейтрализующей активности естественного 26 А 1 IgG, очищенного с использованием белка А, с нейтрализующей активностью коммерческого препарата гипериммунного IgG (IVIg) против hCMV (Cytotect, Biotest) против клинического изолята в клетках HUVEC, IC50 26 А 1 составляет в 25 раз меньше, чем это необходимо для коммерческого препарата, демонстрируя мощную нейтрализующую активность антитела 26 А 1. Для того чтобы исключить тот факт, что нейтрализующая активность, присутствующая в супернатанте от субкультуры 26 А 1, имеет место вследствие связывания с молекулой клеточной поверхности,супернатант протестировали в иммунофлуоресценции с неинфицированными клетками HELF или HUVEC. Этот анализ показал, что IgG1, продуцируемый культурой 26 А 1, не связывается с неинфицированными клетками человека. Когда тот же клеточный супернатант протестировали в ELISA против реле- 16018701 вантных антигенов hCMV, это антитело не связывалось с такими белками (фиг. 4), что указывает на то,что антитело 26 А 1 вероятно распознает другой, неопределенный антиген на оболочке hCMV, индуцируя продукцию нейтрализующих антител. Моноклональность hCMV нейтрализующего антитела, секретируемого в клеточных культурах,происходящих из 26 А 1, была дополнительно подтверждена путем секвенирования IgG-специфичных продуктов ПЦР, полученных из этой клеточной культуры. Клеточный дебрис получали для экстракции РНК и обратной транскрипции, используя клетки, происходящие из субкультуры 26 А 1. Полученную в результате кДНК затем использовали для амплификации последовательностей VH и VL, используя специфические праймеры для вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи IgG человека, соответственно. Продукты ПЦР затем клонировали в плазмидах, которые использовали для трансформации бактериальных клеток. Бактериальные трансформанты выбирали случайным образом и использовали для секвенирования клонированных продуктов ПЦР. Все клоны демонстрировали одну и ту же последовательность ДНК, за исключением незначительных отличий, возможно вследствие ПЦР-индуцированной ошибки,позволяя определить консенсусные последовательности и CDR для вариабельных доменов тяжелой цепи(фиг. 5) и легкой цепи (фиг. 6) моноклонального антитела 26 А 1 человека. Последовательности, кодирующие области VH VL антитела 26 А 1, могут быть снова клонированы в векторах экспрессии для соответствующей экспрессии вариабельных доменов 26 А 1 в виде фрагментов антитела (Fab или ScFv) или в пределах полностью человеческого рекомбинантного антитела, имеющего специфический изотип и подкласс (например, IgA, IgG1 или IgG4). Эти рекомбинантные антитела затем могут быть протестированы для подтверждения специфичной hCMV-нейтрализующей активности в соответствующих исследованиях. Рекомбинантное моноклональное антитело человека 26 А 1 было продуцировано в эукариотических клетках как рекомбинантный IgG1 человека, путем клонирования ДНК, кодирующей тяжелую цепь (фиг. 7) и легкую цепь (фиг. 8) в соответствующем векторе экспрессии, который был использован для трансфекции клеток СНО в экспериментах по транзиторной экспрессии. Рекомбинантное моноклональное антитело человека 26 А 1 было аффинно очищено из супернатантов клеточных культур и протестировано в различных анализах по нейтрализации hCMV. Эти тесты проводили с помощью клеточной системыAD169/HELF как в анализе микронейтрализации, так и в анализе подавления бляшкообразования. Рекомбинантное моноклональное антитело человека 26 А 1 эффективно нейтрализовало инфицирующую способность hCMV в некоторой степени сравнимо с естественным антителом 26 А 1, очищенным с использованием белка А, с рассчитанной IC50 приблизительно 1 мкг/мл (фиг. 9). Эти тесты также проводили в анализах нейтрализации и подавления бляшкообразования, основанных на различных сочетаниях штаммов hCMV и клеток-мишеней, полностью подтверждая сопоставимую эффективность как естественного, так и рекомбинантного моноклонального антитела человека 26 А 1 (фиг. 10). Таким образом, антитело 26 А 1 в виде либо естественного, либо рекомбинантного моноклонального антитела человека представляет собой антитело, которое может быть использовано для клинического лечения инфекции hCMV и заболевания, связанного с hCMV.c тропное к эндотелиальным клеткам производное клинического изолята, выделенного из цервикального мазка беременной женщины, инфицированной hCMV (Revello M. et al., 2001);d производное клинического изолята, выделенного из жидкости бронхоальвеолярного лаважа реципиента с легочным трансплантатом, инфицированного hCMV (Luganini A. et al., неопубликовано). Ссылки ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Белок, который обладает активностью антитела против hCMV и содержит следующие последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны CDR1 (SEQ ID NO:11), CDR2 (SEQ ID NO:12),CDR3 (SEQ ID NO:13) легкой цепи антитела и CDR1 (SEQ ID NO:6), CDR2 (SEQ ID NO:7), CDR3 (SEQID NO:8) тяжелой цепи антитела. 2. Белок по п.1, где указанный белок содержит последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:5, которая соответствует аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела. 3. Белок по п.1, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:10, которая соответствует аминокислотной последовательности легкой цепи антитела. 4. Белок по любому из пп.1-3, представляющий собой антитело, фрагмент антитела, короткий белок или слитый белок. 5. Белок по п.4, где указанное антитело представляет собой рекомбинантное антитело человека. 6. Белок по п.5, где указанное антитело содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:15, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:17. 7. Фрагмент по п.4, представляющий собой вариабельный гетеродимер тяжелой/легкой цепи или одноцепочечный вариабельный фрагмент. 8. Белок по любому из пп.1-7, который связывает и нейтрализует цитомегаловирус человека(hCMV). 9. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по любому из пп.1-8. 10. Нуклеиновая кислота по п.9, содержащая последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:4. 11. Нуклеиновая кислота по п.10, дополнительно содержащая последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:9, которая соответствует последовательности ДНК, кодирующей легкую цепь антитела. 12. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.9-11. 13. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп.9-12. 14. Клетка-хозяин по п.13, секретирующая белок по любому из пп.1-8. 15. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пп.9-12 для получения белка по любому из пп.1-8. 16. Применение клетки-хозяина по п.13 или 14 для получения белка по любому из пп.1-8. 17. Применение белка по любому из пп.1-8 для получения композиции для выявления, лечения, ингибирования, профилактики и/или облегчения инфекции hCMV или заболевания, связанного с hCMV. 18. Терапевтическая, профилактическая или диагностическая композиция против инфекции hCMV или заболевания, связанного с hCMV, содержащая белок по любому из пп.1-8 или нуклеиновую кислоту по любому из пп.9-12. 19. Композиция по п.18 для офтальмологического или местного применения. 20. Композиция по п.18 или 19, дополнительно содержащая другое hCMV-нейтрализующее антитело, препарат иммуноглобулинов для внутривенного введения для связывания и нейтрализации hCMV и/или противовирусное соединение. 21. Способ лечения или профилактики инфекции hCMV или заболевания, связанного с hCMV, предусматривающий введение белка по любому из пп.1-8 или нуклеиновой кислоты по любому из пп.9-12. 22. Способ диагностики инфекции hCMV или заболевания, связанного с hCMV, отличающийся тем,что предусматривает введение белка по любому из пп.1-8 или нуклеиновой кислоты по любому из пп.912. 23. Способ по п.21 или 22, дополнительно предусматривающий введение другого hCMVнейтрализующего антитела, препарата иммуноглобулинов для внутривенного введения и/или противовирусного соединения.