Модифицированные гуманизированные антитела против интерлейкина-18 и их применение

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-18 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В настоящем изобретении раскрыты гуманизированные антитела против интерлейкина-18 (IL-18),способы их получения и способы лечения с использованием указанных антител. Дополнительно раскрыты способы скрининга с использованием, например, поверхностного плазмонного резонанса для идентификации антител с возможным терапевтическим использованием.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB) 017303 Область изобретения Настоящее изобретение в общем относится к области иммуноглобулинов, таких как антитела и, в частности, к гуманизированным антителам, полезным в лечении и диагностике состояний, опосредованных человеческим интерлейкином-18. Предшествующий уровень техники Человеческий интерлейкин-18 (hlL-18) является цитокином, который синтезируется как биологически неактивный белок-предшественник, состоящий из 193 аминокислот (Ushio et al., J. Immunol. 156:4274, 1996). Расщепление этого белка-предшественника, например каспазой-1 или каспазой-4, высвобождает зрелый белок, состоящий из 156 аминокислот (Gu et al., Science 275:206, 1997; Ghayur et al.,Nature 386:619, 1997), который проявляет биологические активности, включающие костимуляцию пролиферации Т-клеток, усиление цитотоксичности клеток-естественных киллеров (NK-клеток), индукцию продукции интерферона- (IFN-) Т-клетками и NK-клетками и потенциирование дифференцировки Тхелперов типа 1 (Th1) (Okamura et al., Nature 378:88, 1995; Ushio et al., J. Immunol. 156:4274, 1996; Micallef et al., Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996; Kohno et al., J. Immunol. 158:1541, 1997; Zhang et al., Infect.Immunol. 65:3594, 1997; Robinson et al., Immunity 7:571, 1997). В дополнение, IL-18 является эффективным индуктором провоспалительных медиаторов человеческих моноцитов, в том числе интерлейкина-8(IL-8), фактора некроза опухолей(TNF-) и простагландина Е 2 (PGE 2) (Ushio, S. et al., J. Immunol. 156:4274-4279, 1996; Puren, A. J. et al., J. Clin. Invest. 10:711-721, 1997; Podolin et al., J. Immunol., направлено в редакцию, 1999). Ранее клонированный белок, родственный рецептору IL-1 (IL-1Rrp) (Parnet et al., J. Biol. Chem. 271: 3967, 1996), был идентифицирован в качестве субъединицы рецептора IL-18 (Kd=18 нм) (Torigoe et al., J.Biol. Chem. 272:25737, 1997). Вторая субъединица рецептора IL-18 проявляет гомологию с вспомогательным белком рецептора IL-1 и была обозначена как AcPL (accessory protein-like). Экспрессия как IL1Rrp, так и AcPL требуется для индуцированной IL-18 активации NF-В и JNK (Born et al., J. Biol. Chem. 273:29445, 1998). В дополнение к NF-В и JNK, IL-18 передает сигнал через киназу, ассоциированную с рецептором IL-1 (IRAK), p56lck (LCK) и митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК) (Micallef et al.,Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996; Matsumoto et al., Biophys Biochem. Res. Comm. 234:454,1997; TsujiTakayama et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237:126, 1997).TH1-клетки, которые продуцируют провоспалительные цитокины, такие как IFN-, IL-2 и TNF(Mosmann et al., J. Immunol. 136:2348, 1986), вовлечены в опосредование многих аутоиммунных заболеваний, в том числе рассеянного склероза (MS), ревматоидного артрита (RA), диабета 1 типа или инсулинозависимого диабета (IDDM), воспалительного заболевания кишечника (IBD) и псориаза (Mosmann andSad, Immunol. Today 17:138, 1996). Таким образом, следует ожидать, что антагонизм в отношении ТН 1 активирующего цитокина, такого как IL-18, подавляет развитие этих заболеваний. В качестве антагониста могут быть использованы моноклональные антитела (mAb), специфичные к IL-18. Роль IL-18 в развитии аутоиммунных заболеваний была продемонстрирована. Соответственно, было продемонстрировано, что экспрессия IL-18 значительно повышена в поджелудочной железе и селезенке мышей с диабетом без ожирения (NOD) непосредственно перед началом возникновения заболевания (Rothe et al., J. Clin. Invest. 99:469, 1997). Аналогично, было показано, что уровни IL-18 заметно повышены в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом (Kawashima et al., Arthritis andRheumatism 39:598, 1996). Более того, было продемонстрировано, что введение IL-18 увеличивает клиническую тяжесть мышиного экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ), Th1 опосредованного аутоиммунного заболевания, которое является моделью рассеянного склероза. В дополнение, было показано, что нейтрализующая антисыворотка против крысиных IL-18 предотвращает развитие ЕАЕ у самок крыс Lewis (Wildbaum et al., J. Immunol. 161:6368, 1998). Соответственно, IL-18 является желательной мишенью для разработки новых терапевтических средств против аутоиммунитета. В Taniguchi et al., J. Immunol. Methods 206:107, описано семь мышиных и шесть крысиных моноклональных антител (mAb) против человеческого IL-18, которые связываются с четырьмя отдельными антигенными сайтами. Одно из мышиных mAb (125-214) и шесть крысиных mAb ингибируют индуцированную IL-18 продукцию IFN- клетками KG-1, где крысиные mAb проявляют нейтрализующие активности, которые в 10 раз ниже при сравнении с 125-214. Как продемонстрировано Вестернблоттингом, три из мышиных mAb, но ни одно из крысиных mAb, сильно взаимодействуют со связанным с мембраной человеческим IL-18. В дополнение, описан твердофазный иммуноферментный анализ(ELISA) для детектирования человеческого IL-18 с использованием 125-2 Н и крысиных mAb. Предел детектирования для данного ELISA составляет 10 пг/мл. В заявке на Европейский патент ЕР 0712931 раскрыты два мышиных mAb против человеческого IL18, Н 1 (lgG1) и Н 2 (IgM). Как продемонстрировано Вестерн-блоттингом, оба mAb взаимодействуют со связанным с мембраной человеческим IL-18, но не со связанным с мембраной человеческим IL-12. H1 используют в протоколе иммуноаффинной хроматографии для очистки человеческого IL-18 и в ELISA для определения человеческого IL-18. H2 используют в радиоиммуноанализе для определения человеческого IL-18.-1 017303 Нейтрализующие антитела против IL-18 потенциально могут быть полезными в облегчении аутоиммунных заболеваний и связанных с ними симптомов у человека. Следовательно, в данной области существует необходимость в высокоаффинном антагонисте IL-18, таком как нейтрализующее моноклональное антитело против человеческого интерлейкина 18, который будет снижать дифференцировку и пролиферацию Th1-клеток и, таким образом, аутоиммунные заболевания и связанные с ними симптомы. Все источники информации, упомянутые во всем этом описании, специально и полностью включены посредством ссылки. Краткое описание сущности изобретения В соответствии с настоящим изобретением предложено гуманизированное антитело против интерлейкина-18, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, имеющие следующие определяющие комплементарность участки (complementarity determining regions, CDRs): В соответствии с настоящим изобретением предложено гуманизированное антитело против интерлейкина-18, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, имеющие следующие CDRs: где остаток в положении 71 легкой цепи заменен соответствующим остатком, обнаруживаемым в донорском антителе, из которого эти CDRs происходят. Специалистам должно быть ясно, что термин происходит предназначен для определения не только источника в смысле физического происхождения вещества, но также определения вещества, которое является структурно идентичным этому веществу, но которое не происходит из указанного источника. Таким образом, соответствующий остаток, обнаруживаемый в каркасе донорского антитела, из которого происходят CDRs, не обязательно выделен из данного каркаса донорского антитела. Аналогичным образом, CDRs, происходящие из донорского антитела, не обязательно выделены из данного донорского антитела.CDRs и каркасные области (FR) и нумерация аминокислот следуют, если не указано иначе, определению Kabat, как указано в Kabat et al. "Sequences of immunological interest", NIH. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее CDRs, происходящие из донорского антитела, перенесенные на человеческий акцепторный каркас, где это антитело против интерлейкина-18 содержит CDRs, имеющие последовательности,представленные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6, где остаток в положении 71 легкой цепи указанного антитела против интерлейкина-18 идентичен остатку, обнаруживаемому в соответствующем положении в каркасе донорского антитела. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее CDRs, представленные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6, где это антитело содержит тирозин в положении 71 легкой цепи. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее тяжелую цепь, имеющую CDRs, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и легкую цепь,имеющую CDRs, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, где указанная легкая цепь CDRs происходит из донорского антитела, имеющего тирозин в положении 71 легкой цепи донорского антитела. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее CDRs из донорского антитела и тирозин в положении 71 легкой цепи указанного гуманизированного антитела, где донорское антитело представляет собой 2 С 10 или его каркасный вариант (то есть, гуманизированное антитело содержит те же самые CDRs, что и 2 С 10, но другой каркас, см. патент США 6706487). В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее:(а) тяжелую цепь, имеющую CDRs с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, перенесенными на акцепторный каркас человеческой тяжелой цепи, и(б) легкую цепь, имеющую CDRs с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 4, 5 и 6,перенесенными на акцепторный каркас человеческой легкой цепи, где указанный акцепторный каркас-2 017303 человеческой легкой цепи содержит каркасные области, происходящие из SEQ ID NO: 38, где положение 71 в SEQ ID NO: 38 представляет собой тирозин. В другом аспекте настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина-18, содержащее:(а) тяжелую цепь, имеющую CDRs, допускающие специфичное связывание с человеческим IL-18;(б) легкую цепь, содержащую акцепторный каркас и имеющую CDRs с последовательностями,представленными в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, и имеющую остаток тирозина в положении 71.CDRs легкой цепи предпочтительно локализованы в положениях в пределах акцепторного каркаса,которые соответствуют соответствующим положениям последовательностей, представленных в SEQ IDNO: 4, 5 и 6, в пределах последовательности, представленной в SEQ ID NO: 35. Легкая цепь и/или тяжелая цепь предпочтительно является неиммуногенной у пациента-человека. В другом аспекте настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина-18, содержащее:(б) легкую цепь, содержащую CDRs, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, перенесенные на акцепторный каркас человеческой легкой цепи, где указанный акцепторный каркас легкой цепи указанного гуманизированного антитела против интерлейкина-18 содержит каркасные области, происходящие из варианта последовательности, представленной в SEQ ID NO: 38, где указанный вариант содержит тирозин в положении 71 и где указанный вариант имеет 75%-ную или более чем 75%-ную идентичность каркасу, имеющему последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38. Предпочтительно указанный вариант имеет 80% или более, например 81, 82, 83, 84%, более предпочтительно 85% или более, например 86, 87, 88, 89%, даже более предпочтительно 90% или более, например 91, 92, 93, 94%, наиболее предпочтительно 95% или более, например 96, 97, 98, 99% идентичность каркасу, представленному в SEQ ID NO: 38. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее:(а) CDRs, представленные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6, происходящие из донорского антитела, которое содержит тирозин в положении 71 легкой цепи донорского антитела;(б) человеческий акцепторный каркас, который содержит фенилаланин в положении 71 человеческой легкой цепи; где это антитело против интерлейкина-18 содержит тирозин в положении 71 легкой цепи. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее:(а) CDRs, представленные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6, происходящие из донорского антитела, которое содержит ароматическую аминокислоту в положении 71 легкой цепи донорского антитела;(б) человеческий акцепторный каркас, который содержит в положении 71 легкой цепи акцепторного каркаса ароматическую аминокислоту другого типа, отличного от ароматической аминокислоты в части (а); где это антитело против интерлейкина-18 содержит легкую цепь, имеющую в положении 71 ароматическую аминокислоту, происходящую из антитела части (а). В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, которое проявляет константу равновесия (KD) 300 пМ или менее в отношении связывания с человеческим IL-18 при измерении поверхностным плазмонным резонансом (например Biacore, предпочтительно с использованием прибора Biacore 3000 и условий, изложенных ниже в 7.4.1) при 37 С. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, которое содержит CDRs, представленные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6, и проявляет константу равновесия (KD) 300 пМ или менее в отношении связывания с человеческим IL-18 при измерении поверхностным плазмонным резонансом (предпочтительно с использованием прибора Biacore 3000 и условий,изложенных ниже в 7.4.1) при 37 С. Предпочтительно константа равновесия (KD) антитела в отношении связывания с человеческим IL18 при измерении поверхностным плазмонным резонансом (предпочтительно с использованием прибораBiacore T100 и условий, изложенных ниже в 7.4.2) при 37 С составляет менее чем 90 пМ. Более предпочтительно константа равновесия составляет 70 пМ или менее и еще более предпочтительно 65, 60, 55 или 50 пМ или менее. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, которое проявляет константу диссоциации или скорость диссоциации (kd) 0,0002 1/с или более в отношении связывания с человеческим IL-18 при измерении поверхностным плазмонным резонансом (например Biacore, предпочтительно с использованием прибора Biacore Т 100 и условий, изложенных ниже в 7.4.2) при 37 С. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина-3 017303 18, содержащее:(а) тяжелую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, перенесенные на акцепторный каркас тяжелой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности, представленной вSEQ ID NO: 37, где один или более чем один остаток положения/й 27, 28, 29, 93, 39, 40, 36, 71, 89, 91 тяжелой цепи идентичен соответствующему остатку в тяжелой цепи донорского антитела;(б) легкую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, перенесенные на акцепторный каркас легкой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности, представленной в SEQID NO: 38, где положение 71 и возможно один или более чем один (например все) остаток/ки положения/й 45, 83, 84, 85 легкой цепи идентичны соответствующему остатку в легкой цепи донорского антитела. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее:(а) тяжелую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, перенесенные на акцепторный каркас человеческой тяжелой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности,представленной в SEQ ID NO: 37, где остатки в положениях 27, 28, 29, 93 тяжелой цепи идентичны соответствующим остаткам в тяжелой цепи донорского антитела;(б) легкую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, перенесенные на акцепторный каркас легкой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности, представленной в SEQID NO: 38, где остаток в положении 71 легкой цепи указанного антитела против интерлейкина-18 идентичен соответствующим остаткам в легкой цепи донорского антитела. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее:(а) тяжелую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, перенесенные на акцепторный каркас человеческой тяжелой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности,представленной в SEQ ID NO: 37, где остатки в положениях 27, 28, 29, 39, 40, 93 тяжелой цепи идентичны соответствующим остаткам в тяжелой цепи донорского антитела;(б) легкую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, перенесенные на акцепторный каркас легкой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности, представленной в SEQID NO: 38, где остаток в положении 71 легкой цепи идентичен соответствующим остаткам в легкой цепи донорского антитела. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее:(а) тяжелую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, перенесенные на акцепторный каркас человеческой тяжелой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности,представленной в SEQ ID NO: 37, где остатки в положениях 27, 28, 29, 36, 39, 40, 71, 89, 91, 93 тяжелой цепи идентичны соответствующим остаткам в тяжелой цепи донорского антитела;(б) легкую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, перенесенные на акцепторный каркас легкой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности, представленной в SEQID NO: 38, где остаток в положении 71 легкой цепи идентичен соответствующим остаткам в легкой цепи донорского антитела. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее:(а) тяжелую цепь, содержащую CDR, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, перенесенные на акцепторный каркас человеческой тяжелой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 37, где остатки в положениях 27, 28, 29, 93 тяжелой цепи идентичны соответствующим остаткам в тяжелой цепи донорского антитела;(б) легкую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, перенесенные на акцепторный каркас легкой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности, представленной в SEQID NO: 38, где остатки в положениях 71,45, 83, 84, 85 легкой цепи идентичны соответствующим остаткам в легкой цепи донорского антитела. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее:(а) тяжелую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, перенесенные на акцепторный каркас человеческой тяжелой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности,представленной в SEQ ID NO: 37, где остатки в положениях 27, 28, 29, 93, 39, 40 тяжелой цепи идентичны соответствующим остаткам в тяжелой цепи донорского антитела;(б) легкую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, перенесенные на акцепторный каркас легкой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности, представленной в SEQID NO: 38, где остатки в положениях 71, 45, 83, 84, 85 легкой цепи идентичны соответствующим остаткам в легкой цепи донорского антитела. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее:(а) тяжелую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, перенесенные на акцепторный каркас человеческой тяжелой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности,представленной в SEQ ID NO: 37, где остатки в положениях 27, 28, 29, 93, 39, 40, 36, 71, 89, 91 тяжелой цепи идентичны соответствующим остаткам в тяжелой цепи донорского антитела;(б) легкую цепь, содержащую CDRs, происходящие из донорского антитела, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, перенесенные на акцепторный каркас легкой цепи, который содержит каркасные области, происходящие из последовательности, представленной в SEQID NO: 38, где остатки в положениях 71, 45, 83, 84, 85 легкой цепи идентичны соответствующим остаткам в легкой цепи донорского антитела. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где соотношение между скоростью диссоциации (kd) указанного антитела при связывании с человеческим IL-18 при 25 С и скоростью диссоциации (kd) указанного антитела при связывании с человеческим IL-18 при 37 С составляет 1:5 или менее, и где указанное антитело содержит CDRs, происходящие из донорского антитела, и человеческий акцепторный каркас, и где остаток в положении 71 легкой цепи человеческого акцепторного каркаса замещен соответствующим остатком из донорского антитела. Скорость диссоциации предпочтительно измеряют с использованием прибора Biacore T100 и условий, изложенных ниже в 7.4.2. В другом аспекте этого изобретения предложено гуманизированное антитело против интерлейкина 18, содержащее тяжелую цепь, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQID NO: 21; и легкую цепь, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 29. В частности, в этом изобретении предложено гуманизированное антитело против интерлейкина-18,содержащее тяжелую цепь с SEQ ID NO: 9 и легкую цепь с SEQ ID NO: 13 или тяжелую цепь с SEQ IDNO: 9 и легкую цепь с SEQ ID NO: 29. В этом изобретении также предложено гуманизированное антитело против интерлейкина-18, содержащее тяжелую цепь с SEQ ID NO: 17 и легкую цепь с SEQ ID NO: 13 или тяжелую цепь с SEQ IDNO: 17 и легкую цепь с SEQ ID NO: 29. В этом изобретении также предложено гуманизированное антитело против интерлейкина-18, содержащее тяжелую цепь с SEQ ID NO: 21 и легкую цепь с SEQ ID NO: 13 или тяжелую цепь с SEQ IDNO: 21 и легкую цепь с SEQ ID NO: 29. В другом аспекте этого изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело против интерлейкина-18, описанное выше, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом аспекте этого изобретения предложен способ отбора антитела (в частности антитела, которое ингибирует взаимодействие между лигандом и рецептором, такого как антитело против интерлейкина-18) для терапевтического применения, включающий:(а) измерение аффинности связывания (с использованием, например, поверхностного плазмонного резонанса, такого как Biacore) антитела в отношении антигена, с которым это антитело специфично связывается при температуре от 30 до 45 С (предпочтительно 37 С);(б) измерение аффинности связывания (с использованием, например, поверхностного плазмонного резонанса, такого как Biacore) антитела в отношении антигена, с которым это антитело специфично связывается при температуре от 20 до 25 С (предпочтительно 25 С);(в) отбор указанного антитела для терапевтического применения, если аффинность по (а) выше аффинности по (б), предпочтительно если указанная аффинность по (а) выше в 2 или более чем в 2 раза,более предпочтительно в 4 или более чем в 4 раза, чем аффинность по стадии (б). В другом аспекте этого изобретения предложен способ отбора антитела (в частности антитела, которое ингибирует взаимодействие между лигандом и рецептором, такого как антитело против интерлейкина-18) для терапевтического применения, включающий:(а) измерение скорости диссоциации (с использованием, например, поверхностного плазмонного резонанса, такого как Biacore) антитела от антигена, с которым это антитело специфично связывается-5 017303 при температуре от 30 до 45 С (предпочтительно 37 С);(б) измерение скорости диссоциации (с использованием, например, поверхностного плазмонного резонанса, такого как Biacore) антитела от антигена, с которым это антитело специфично связывается при температуре от 20 до 25 С (предпочтительно 25 С);(в) отбор указанного антитела для терапевтического применения, если скорость диссоциации по (а) меньше скорости диссоциации по (б). Термин против интерлейкина-18 в отношении к антителам по изобретению означает, что такие антитела способны нейтрализовать биологическую активность человеческого интерлейкина-18. Однако это не исключает того, что такие антитела могут также в дополнение нейтрализовать биологическую активность интерлейкина-18 примата, не являющегося человеком (например, резус-макак и/или яванских макак Cynomolgus). Краткое описание графических материалов Это изобретение далее будет описано дополнительно со ссылками на следующие графические материалы, где: на фиг. 1 показано влияние температуры на скорость ассоциации (ka) H1L1 и H1L2; на фиг. 2 - влияние температуры на скорость диссоциации (kd); на фиг. 3 - влияние температуры на константу равновесия (KD); на фиг. 4 А-4 В - репрезентативные данные одного эксперимента, в котором получены величины ЕС 50, проиллюстрированные в табл. 7; на фиг. 5 - величины ЕС 50 четырех отобранных гуманизированных вариантов при связывании сIL18 человека; на фиг. 6 - величины ЕС 50 четырех отобранных гуманизированных вариантов при связывании сIL18 резуса; на фиг. 7 - связывание H1L2 с человеческим IL18 в присутствии 50% синовиальной жидкости; на фиг. 8 - ингибирование продукции IFN-, стимулированной IL18, в анализе с KG1; на фиг. 9 А и 9 Б - ингибирование продукции IFN-, стимулированной липополисахаридом (LPS), у человека донора мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) в 10 и 25% аутологичной сыворотке, соответственно; на фиг. 10 - связывание 2 С 10 с hlL18, захваченным связывающим белком hlL18BP; на фиг. 11 - способность девяти гуманизированных вариантов ингибировать высвобождение IFN-,стимулированное человеческим IL18, в клетках KG1; на фиг. 12 - ингибирование продукции IFN-, стимулированной IL-18, вариантами Н 1 и 2 С 10 в клетках KG1; на фиг. 13 - данные по IC50 для вариантов Н 1 с 95%-ным доверительным интервалом; на фиг. 14 - ингибирование продукции IFN-, стимулированной человеческим IL-18, в клетках KG1; на фиг. 15 - ингибирование продукции IFN-, стимулированной IL-18 резуса, в клетках KG1; на фиг. 16 - результаты по связыванию человеческого IL-18 в ELISA при использовании химерных 2 С 10; на фиг. 17 - результаты по связыванию IL-18 резуса в ELISA при использовании химерных 2 С 10 и на фиг. 18 А и 18 Б - результаты по связыванию человеческого IL-18, связанного с IL-18BP, в ELISA при использовании H1L2 и 2 С 10, соответственно. Гуманизированные антитела Применение интактных антител, не являющихся человеческими, в лечении расстройств или заболеваний человека влечет за собой хорошо известные в настоящее время проблемы потенциальной иммуногенности, особенно при повторном введении антитела. То есть, иммунная система пациента может распознать интактное антитело, не являющееся человеческим, как чужое и дать нейтрализующий ответ. В дополнение к разработке полностью человеческих антител (см. выше), для преодоления этих проблем за многие годы были разработаны различные методики, и, как правило, они включают сокращение содержания аминокислотных последовательностей, не являющихся человеческими, в интактном терапевтическом антителе при сохранении относительной простоты получения антител, не являющихся человеческими, из иммунизированного животного, например мыши, крысы или кролика. В широком смысле, для достижения этого использовали два подхода. Первый представляет собой химерные антитела, которые обычно содержат вариабельный домен, не являющийся человеческим (например, грызуна, такого как мышь), слитый с человеческой константной областью, см. Morrison (1984), PNAS, 81, 6851. Ввиду того,что антигенсвязывающий сайт антитела локализован в пределах вариабельных областей, химерное антитело сохраняет его аффинность связывания в отношении антигена, но приобретает эффекторные функции человеческой константной области и поэтому способно осуществлять эффекторные функции, такие как описанные выше. Химерные антитела в типичных случаях получают с использованием рекомбинантной ДНК. ДНК, кодирующую эти антитела (например, кДНК), выделяют и подвергают секвенированию, используя общепринятые способы (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими Н- и L-цепи антитела по изобретению,-6 017303 например, с ДНК, кодирующей SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5 и 6, описанные выше). В качестве типичного источника таких ДНК служат гибридомные клетки. Если желательно экспрессировать химерное антитело,выделенные кДНК, кодирующие полные зрелые вариабельные области легких и тяжелых цепей, вводят в рамке считывания в подходящие экспрессирующие векторы, которые содержат, среди прочего, соответствующие константные области иммуноглобулинов, обычно человеческого происхождения, вместе с сигнальными последовательностями, стоп-кодонами, промоторами, терминаторами и другими элементами, необходимыми для достижения экспрессии антитела. Такими векторами затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как E.coli, клетки COS, клетки СНО или клетки миеломы, которые не продуцируют иммуноглобулиновый белок иным образом, с достижением синтеза антитела. ДНК можно модифицировать путем замены последовательностей, кодирующих человеческие L- и Н-цепи, соответствующими Ни L-константными областями, не являющимися человеческими (например мышиными), см., например,Morrison: PNAS 81, 6851 (1984). Второй подход включает генерирование гуманизированных антител, в которых содержимое антитела, не являющееся человеческим, сокращают гуманизированием вариабельных участков. Две методики гуманизирования завоевали популярность. Первая представляет собой гуманизирование путем переносаCDRs. CDRs образуют петли вблизи N-конца антитела, где они образуют поверхность, вставленную в каркас, обеспечиваемый каркасными областями. Специфичность связывания антигена с антителом в основном определяется топографией и химическими характеристиками поверхности его CDR. Эти признаки, в свою очередь, определяются конформацией индивидуальных CDRs, относительным расположениемCDRs и природой и расположением боковых цепей остатков, составляющих CDRs. Сильное снижение иммуногенности может быть достигнуто путем переноса только CDRs антител (донорских антител), не являющихся человеческими (например, мышиных) на подходящие человеческие каркасные (акцепторный каркас) и константные области (см. Jones et al. (1986) Nature 321,522-525, и Verhoeyen M et al.(1988) Science 239, 1534-1536). Однако перенос CDR сам по себе может не привести к полному сохранению антигенсвязывающих свойств, и часто обнаруживают, что некоторые каркасные остатки донорского антитела нужно сохранять (иногда это обозначают как обратные мутации) в гуманизированной молекуле, если требуется сохранить значительную антигенсвязывающую аффинность (см. Queen С et al.(1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Со, М et al (1991) Nature 351, 501-502). В этом случае человеческие Vучастки, проявляющие наибольшую гомологию последовательности (в типичных случаях, 60% или более) с донорским антителом, не являющимся человеческим, могут быть выбраны из базы данных, для того чтобы обеспечить человеческий каркас (FR). Выбор человеческих FR можно осуществить либо из человеческого консенсуса, либо из индивидуальных человеческих антител. Если необходимо, в человеческий акцепторный каркас вводят ключевые остатки из донорского антитела для сохранения конформаций CDR. В помощь идентификации таких структурно важных остатков можно использовать компьютерное моделирование антитела, см. WO 99/48523. Альтернативно, гуманизирование можно осуществлять способом маскировки (veneering). Статистический анализ уникальных вариабельных участков тяжелых и легких цепей человеческих и мышиных иммуноглобулинов показал, что точные картины экспонированных остатков отличаются в человеческих и мышиных антителах, и наиболее индивидуальные поверхностные положения имеют сильное предпочтение к малому числу разных остатков (см. Padlan E.A. et al.; (1991) Mol. Immunol, 489-498 иPedersen J.T. et al. (1994) J. Mol. Biol. 235; 959-973). Поэтому возможно снизить иммуногенность Fv, не являющегося человеческим, путем замены тех экспонированных остатков в его каркасных областях, которые отличаются от обычно обнаруживаемых в человеческих антителах. По причине того что антигенность белка может коррелировать с поверхностной доступностью, замена поверхностных остатков может быть достаточной для превращения мышиного вариабельного участка в невидимый для человеческой иммунной системы (см. также Mark G.E. et al. (1994) в Handbook of Experimental Pharmacology vol, 113:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp 105-134). Этот способ гуманизирования обозначают как маскировку, так как изменяют только поверхность антитела, несущие остатки остаются неизменными. Дополнительные альтернативные подходы включают подходы, изложенные в WO 04/006955, и способ Humaneering (KaloBios), в котором использованы бактериальные экспрессионные системы и в котором получают антитела, которые близки по последовательностям к человеческим антителам зародышевой линии (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics, January 2007, San Diego,California). Другой современный подход гуманизирования включает селекцию человеческих акцепторных каркасов на основании структурного сходства человеческих участков CDR с таковыми в участкахCDR донорских мышиных антител, а не на основании гомологии между другими участками антитела,такими как каркасные области. Этот способ также известен как Superhumanisation (Evogenix Inc.;Hwang et al. (2005) Methods 36:35-42). Таким образом, настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам, изложенным выше в разделе 3. Такие гуманизированные антитела предпочтительно содержат человеческую константную область изотипа IgG, такого как lgG1 или lgG4. В альтернативных воплощениях гуманизированные вариабельные участки, изложенные выше в-7 017303 разделе 3, могут быть подвергнуты слиянию с константной областью, не являющейся человеческой (обратная химера), например не являющейся человеческой областью примата, крысы, мыши или кролика. Разумеется, специалистам должно быть ясно, что акцепторные каркасы, представленные в SEQ IDNO: 37 и 38, составляют аминокислоты иммуноглобулина, кодируемые геном VH и Vkappa, соответственно. Как таковые они содержат и каркасные области, и CDRs акцепторного антитела. В пределах способностей специалиста осуществить замену CDRs акцепторного антитела донорскими CDRs, представленными в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6, и объединить получившиеся в результате последовательности с подходящими каркасными 4 последовательностями, такими как представленные в SEQ ID NO: 39 и SEQ IDNO: 40, так чтобы получить полный вариабельный участок иммуноглобулина, такой как представлено вSEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 15. 4.1. Другие модификации Считают, что взаимодействие между Fc-областью антитела и различными рецепторами Fc (FcR) опосредует эффекторные функции антитела, которые включают антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), фиксацию комплемента, фагоцитоз и период полувыведения/клиренс антитела. Различные модификации Fc-области антител по этому изобретению могут быть осуществлены в зависимости от желаемого эффекторного свойства. Например, специфические мутации вFc-области для того, чтобы сделать нелитическим антитело, которое в других случаях является литическим, подробно описаны в ЕР 0629240 В 1 и ЕР 0307434 В 2, или можно включить в антитело эпитоп связывания со спасительным (salvage) рецептором для увеличения периода полувыведения из сыворотки,см. US 5739277. В настоящее время выявлено пять человеческих рецепторов Fc: FcR(I), FcRIIa,FcRIIb, FcRIIIa и неонатальный FcRn. Shields et al. (2001) J.Biol.Chem 276, 6591-6604 продемонстрировали, что в связывании всех FcRs участвует общая совокупность lgG1 остатков, в то время как FcRII иFcRIII используют отдельные сайты вне этой общей совокупности. Одна группа lgG1 остатков снижает связывание со всеми FcR при изменении на аланин: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 и Pro-239. Все они находятся в СН 2-домене IgG и кластеризованы вблизи шарнира, соединяющего СН 1 и CH2. В то время как FcRI использует для связывания только общую совокупность lgG1 остатков, FcRII и FcRIII взаимодействуют с отдельными остатками в дополнение к общей совокупности. Изменение некоторых остатков снижает связывание только с FcRII (например, Arg-292) или FcRIII (например, Glu-293). Некоторые варианты показали улучшенное связывание с FcRII или FcRIII, но без влияния на связывание с другим рецептором (например, Ser-267Ala улучшает связывание с FcRII, но не влияет на связывание сFcRIII). Другие варианты проявляли улучшенное связывание с FcRII или FcRIII при снижении связывания с другим рецептором (например, Ser-298Ala улучшал связывание с FcRIII и снижал связывание сFcRII). Для FcRIIIa наилучшее связывание вариантов lgG1 было сопряжено с заменами Ser-298, Glu333 и Lys-334 аланином. Считают, что неонатальный рецептор FcRn вовлечен как в клиренс антител, так и в их трансцитоз через ткани (см. Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 и Ghetie et al. (2000)Annu.Rev.lmmunol. 18, 739-766). Определено, что человеческие lgG1 остатки, непосредственно взаимодействующие с человеческим FcRn, включают Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435. Таким образом, настоящее изобретение относится к антителам по изобретению, имеющим любое одно(или более чем одно) изменение остатка, подробно описанное выше, для модификации периода полувыведения/клиренса и/или эффекторных функций, таких как ADCC и/или опосредованный комплементом лизис. Другие модификации включают варианты гликозилирования антител по изобретению. Известно,что гликозилирование антител по консервативным положениям в их константных областях оказывает огромное влияние на функции антитела, особенно эффекторные функции, такие как описанные выше,см. например, Boyd et al. (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Предусмотрены варианты гликозилирования терапевтических антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, где одна или более чем одна углеводная группировка добавлена, заменена, удалена или модифицирована. Введение мотива аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин создает потенциальный сайт для ферментативного присоединения углеводных группировок и поэтому может быть использовано для воздействия на гликозилирование антитела. В Raju et al. (2001) Biochemistry 40, 8868-8876, концевое сиалилирование иммуноадгезина TNFR-IgG было увеличено с помощью процесса перегалактозилирования и/или пересиалилирования при использовании бета-1,4-галактозилтрансферазы и/или альфа-2,3 сиалилтрансферазы. Считают, что увеличение концевого сиалилирования увеличивает период полувыведения иммуноглобулина. Антитела аналогично большинству гликопротеинов обычно образуются в природе в виде смеси гликоформ. Эта смесь, в частности, наблюдается, когда антитела образуются в клетках эукариот, особенно млекопитающих. Множество разных способов было разработано для получения определенных гликоформ, см. Zhang et al., Science (2004), 303, 371; Sears et al., Science, (2001) 291, 2344; Wacker et al., (2002)Science, 298, 1790; Davis et al., (2002) Chem.Rev. 102, 579; Hang et al., (2001) Acc.Chem.Res. 34, 727. Таким образом, это изобретение относится к множеству терапевтических (в типичных случаях моноклональных) антител (которые могут представлять собой изотип IgG, например lgG1), как описано здесь, содер-8 017303 жащих определенное число (например, 7 или менее, например 5 или менее, например две или одну) гликоформ указанных антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Дополнительные воплощения этого изобретения включают терапевтические антитела по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты, соединенные с небелковым полимером, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или полиоксиалкилен. Конъюгация белков с ПЭГ является признанной методикой увеличения периода полувыведения белков, а также снижения антигенности и иммуногенности белков. Применение ПЭГилирования при использовании разных молекулярных масс и видов (линейных или разветвленных) было исследовано с интактными антителами, а также с Fab'фрагментами, см. Koumenis I.L. et al., (2000) Int. J.Pharmaceut. 198:83-95. Способы продуцирования Антитела по настоящему изобретению могут быть продуцированы в трансгенных организмах, таких как козы (см. Pollock et al. (1999), J. lmmunol. Methods 231:147-157), куры (см. Morrow KJJ (2000)Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J. et al., BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al.; (2000) Plant Mol.Biol. 42:583-590). Антитела также могут быть продуцированы химическим синтезом. Однако антитела по изобретению в типичных случаях продуцируют с использованием технологий культивирования рекомбинантных клеток, хорошо известных специалистам в данной области техники. Полинуклеотид, кодирующий антитело, выделяют и встраивают в реплицируемый вектор, такой как плазмида, для дополнительного клонирования (амплификации) или экспрессии в клетке-хозяине. Одной из полезных экспрессионных систем является система глутаматсинтетазы (например, продаваемаяLonza Biologics), особенно если клеткой-хозяином является СНО или NS0 (см. ниже). Полинуклеотид,кодирующий антитело, легко выделить и секвенировать с использованием общепринятых способов (например, при использовании олигонуклеотидных зондов). Векторы, которые могут быть использованы,включают плазмиду, вирус, фаг, транспозоны, минихромосомы, из которых типичным воплощением являются плазмиды. Обычно такие векторы дополнительно включают сигнальную последовательность,точку инициации репликации, одну или более чем одну последовательность маркерных генов, энхансерного элемента, промотора и терминатора транскрипции, функциональным образом связанные с полинуклеотидом легкой и/или тяжелой цепи, так чтобы способствовать экспрессии. Полинуклеотиды, кодирующие легкие и тяжелые цепи, могут быть встроены в отдельные векторы и введены (например, трансформацией, трансфекцией, электропорацией или трансдукцией) в одну и ту же клетку-хозяин одновременно или последовательно либо, если желательно, обе цепи, тяжелая и легкая, могут быть встроены в один и тот же вектор перед таким введением. Специалистам должно быть сразу ясно, что из-за вырожденности генетического кода также являются доступными альтернативные раскрытым здесь полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды по изобретению. Сигнальные последовательности Антитела по настоящему изобретению могут быть продуцированы в виде слитого белка с гетерологичной сигнальной последовательностью, имеющей сайт специфичного расщепления на N-конце зрелого белка. Сигнальную последовательность должна распознавать и процессировать клетка-хозяин. Сигнальная последовательность для прокариотических клеток-хозяев может представлять собой щелочную фосфатазу, пенициллиназу или лидерные последовательности стабильного к нагреванию энтеротоксина II. Сигнальные последовательности для секреции дрожжами могут представлять собой лидерную последовательность дрожжевой инвертазы, лидерную последовательность фактора- или лидерные последовательности кислой фосфатазы; см., например, WO 90/13646. В системах клеток млекопитающего доступны вирусные секреторные лидерные последовательности, такие как gD-сигнальная последовательность простого герпеса и сигнальная последовательность нативного иммуноглобулина (например, тяжелая цепь человеческого Ig). В типичных случаях сигнальную последовательность лигируют в рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим антитело по изобретению. Точка инициации репликации Точки инициации репликации хорошо известны в данной области техники, причем pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, плазмида 2 для большинства дрожжей, и точки инициации репликации различных вирусов, таких как SV40 (вирус обезьян 40), полиома, аденовирус,VSV (вирус варицелла-зостер) или BPV (вирус папилломы крупного рогатого скота), для большинства клеток млекопитающих. Обычно компонент, представляющий собой точку инициации репликации, не нужен в интегрированных экспрессионных векторах для млекопитающих, если не требуется размножение вектора в Е. coli. Однако SV40 ori может быть использован, так как он содержит ранний промотор. Селекционный маркер Типичные селекционные гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, или (б) восполняют ауксотрофные дефициты или снабжают питательными веществами, недоступными в комплексных средах, или (в) представляют собой комбинации и того, и другого. Схема селекции может включать-9 017303 остановку роста клеток-хозяев, которые не содержат вектор или векторы. Клетки, которые были успешно трансформированы генами, кодирующими терапевтическое антитело по настоящему изобретению, выживают благодаря, например, лекарственной устойчивости, придаваемой одновременно доставляемым селекционным маркером. Одним из примеров является селекционная система с дегидрофолатредуктазой(DHFR), где трансформантов генерируют в DHFR-отрицательных штаммах-хозяевах (например, см. Pageand Syden ham 1991 Biotechnology 9: 64-68). В этой системе ген DHFR доставляют одновременно с полинуклеотидными последовательностями антител по изобретению, и DHFR-положительные клетки затем отбирают по удалению нуклеозидов. Если требуется, также используют ингибитор DHFR метотрексат для отбора трансформантов при использовании амплификации гена DHFR. Путем связывания функциональным образом гена DHFR с последовательностями, кодирующими антитело по изобретению, или их функциональными производными, амплификация гена DHFR приводит в результате к одновременной амплификации последовательностей желаемого антитела, представляющего интерес. Клетки СНО представляют собой особенно полезную клеточную линию для этой селекции с DHFR/метотрексатом, и способы амплификации и селекции клеток-хозяев с использованием DHFR-системы хорошо установлены в данной области техники, см. Kaufman R.J. et al. J. Mol. Biol. (1982) 159, 601-621; обзор, см. в Werner RG,Noe W., Kopp K., Schluter M., "Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals",Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug. Дополнительным примером является экспрессионная система с глутаматсинтетазой (Lonza Biologies). Подходящим селекционным геном для применения в дрожжах является ген trp1; см. Stinchcomb et al. Nature 282, 38, 1979. Промоторы Подходящие промоторы для экспрессии антител по изобретению функциональным образом связаны с ДНК/полинуклеотидом, кодирующим антитело. Промоторы для прокариотических хозяев включают промотор phoA, промоторные системы, представляющие собой бета-лактамазу и лактозу, щелочную фосфатазу, триптофан, и гибридные промоторы, такие как Тас. Промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжевых клетках, включают 3-фосфоглицераткиназу или другие гликолитические ферменты, например енолазу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, гексокиназу, пируватдекарбоксилазу, фосфофруктокиназу, глюкозо-6-фосфатизомеразу, 3-фосфоглицератмутазу и глюкокиназу. Индуцибельные дрожжевые промоторы включают алкогольдегидрогеназу 2, изоцитохром С, кислую фосфатазу, металлотионеин и ферменты, ответственные за метаболизм азота или утилизацию мальтозы/галактозы. Промоторы для экспрессии в системах клеток млекопитающего включают промоторы РНКполимеразы II, в том числе промоторы вирусов, таких как вирус полиомы, вирус птичьей оспы и аденовирусы (например аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус птичьей саркомы,цитомегаловирус (в частности, промотор непосредственно раннего гена), ретровирус, вирус гепатита В,актин, промотор вируса саркомы Рауса (RSV) и ранний или поздний промотор вируса обезьян 40 (SV40),а также невирусные промоторы, такие как EF-1 альфа (Mizushima and Nagata Nucleic Acid Res 1990 18(17):5322). Выбор промотора может быть основан на подходящей совместимости с клеткой-хозяином,используемой для экспрессии. Энхансерный элемент Когда это целесообразно, например, для экспрессии в высших эукариотах, дополнительные энхансерные элементы можно включать вместо тех, которые, как обнаружено, локализованы в промоторах,описанных выше, или вместе с ними. Подходящие энхансерные последовательности млекопитающих включают энхансерные элементы из генов глобина, эластазы, альбумина, фетопротеина, металлотионеина и инсулина. Альтернативно, может быть использован энхансерный элемент из вируса эукариотической клетки, такой как энхансер SV40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы, бакуловирусный энхансер или мышиный локус lgG2 (см. WO 04/009823). В то время как такие энхансеры в типичных случаях локализованы на векторе в сайте перед промотором, они также могут быть локализованы в других местах, например, в пределах нетранслируемого участка или за сигналом полиаденилирования. Выбор и позиционирование энхансера могут быть основаны на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии. Полиаденилирование/терминация В эукариотических системах сигналы полиаденилирования функциональным образом связаны с полинуклеотидом, кодирующим антитело по изобретению. Такие сигналы в типичных случаях помещены с 3'-стороны от открытой рамки считывания. В системах млекопитающего неограничивающие примеры сигналов включают происходящие из гормонов роста, фактора-1-альфа элонгации и вирусных (напримерSV40) генов или ретровирусных длинных концевых повторов. В дрожжевых системах неограничивающие примеры сигналов полиаденилирования/терминации включают происходящие из генов фосфоглицераткиназы (PGK) и алкогольдегидрогеназы-1 (ADH). В прокариотической системе сигналы полиаденилирования в типичных случаях не требуются, и обычно вместо них используют более короткие и более определенные терминаторные последовательности. Выбор последовательностей полиаденилирования/ терминации может быть основан на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии.- 10017303 Другие способы/элементы для увеличения выхода В дополнение к указанным выше, другие признаки, которые можно использовать для увеличения выхода, включают элементы перестройки хроматина, интроны и специфические для клетки-хозяина модификации кодонов. Таким образом, для увеличения выхода транскрипта и/или продукта использование кодонов антитела по изобретению может быть модифицировано с учетом предпочтения кодонов в клетке-хозяине (например, Hoekema A et al Mol. Cell Biol 1987 7(8):2914-24). Выбор кодонов может быть основан на подходящей совместимости с клеткой-хозяином, используемой для экспрессии. Клетки-хозяева Подходящими клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела по изобретению, являются прокариотические, дрожжевые или высшие эукариотические клетки. Подходящие прокариотические клетки включают эубактерии, например энтеробактерии, такие как Escherichia, например E. coli (например АТСС 31446; 31537; 27325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella,Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, например Serratia marcescans, и Shigella, а также бациллы, такие как B. subtilis и B.licheniformis (см. DD 266710), псевдомонады, такие какA.niger. В этом изобретении конкретно предусмотрены прокариотические и дрожжевые клетки-хозяева, однако в типичных случаях клетки-хозяева по настоящему изобретению представляют собой клетки из позвоночных. Подходящие клетки-хозяева из позвоночных включают клетки млекопитающих, такие какCOS-1 (АТСС No. CRL 1650), COS-7 (АТСС CRL 1651), линия 293 человеческой эмбриональной почки,PerC6 (Crucell), клетки почки детеныша хомячка (ВНК) (АТСС CRL.1632), ВНК 570 (АТСС NO: CRL 10314), 293 (АТСС No. CRL 1573), клетки яичника китайского хомячка (СНО) (например СНО-К 1, АТССNO: CCL 61, клеточная линия DHFR-CHO, такая как DG44 (см. Urlaub et al., (1986) ibid), особенно линии клеток СНО, адаптированные к суспензионной культуре, мышиные клетки Сертоли, клетки почки обезьяны, клетки почки африканской зеленой мартышки (АТСС CRL-1587), клетки HeLa, клетки почки собаки(АТСС CCL 34), клетки легкого человека (АТСС CCL 75), Hep G2 и клетки миеломы или лимфомы, например NS0 (см. US 5807715), Sp2/0, Y0. Таким образом, в одном из воплощений этого изобретения предложена стабильно трансформированная клетка-хозяин, содержащая вектор, кодирующий тяжелую цепь и/или легкую цепь терапевтического антитела, как оно описано здесь. В типичных случаях такие клетки-хозяева содержат первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий указанную тяжелую цепь. Такие клетки-хозяева можно также дополнительно конструировать или адаптировать для модификации качества, функции и/или выхода антитела по изобретению. Неограничивающие примеры включают экспрессию специфических модифицирующих (например, гликозилирующих) ферментов и шаперонов для фолдинга белка. Способы культивирования клеток Клетки-хозяева, трансформированные векторами, кодирующими терапевтические антитела по изобретению, можно культивировать любым способом, известным специалистам в данной области техники. Клетки-хозяева можно культивировать во вращающихся колбах, встряхиваемых колбах, переворачиваемых флаконах или системах полых волокон, но предпочтительно, когда для крупномасштабного получения используют реакционные аппараты с мешалкой или аппараты с рубашкой (например, WaveBiotech, Somerset, New Jersey USA), особенно для суспензионных культур. В типичных случаях апараты с мешалкой адаптированы для аэрации при использовании, например, барботеров, дефлекторов или лопастей с низким градиентом сдвига. Для барботажных колонок и аэрлифтных реакторов можно использовать прямую аэрацию пузырьками воздуха или кислорода. При культивировании клеток-хозяев в бессывороточных культуральных средах предпочтительно, когда в среды добавляют агенты защиты клеток,такие как Pluronic F-68, чтобы способствовать предотвращению повреждения клеток в результате процесса аэрации. В зависимости от характеристик клетки-хозяина любые микроносители могут быть использованы в качестве субстратов роста для заякоренных клеточных линий, либо клетки могут быть адаптированы к суспензионной культуре (что является типичным). При культивировании клеток-хозяев,в частности клеток-хозяев из позвоночного, может быть использовано множество разных рабочих режимов, таких как периодический, с периодической подпиткой, повторный периодический (см. Drapeau et al.(1994) Cytotechnology 15: 103-109), удлиненный периодический или проточное культивирование. Хотя трансформированные рекомбинантным способом клетки-хозяева из млекопитающего могут быть культивированы в содержащих сыворотку средах, где такие среды содержат фетальную телячью сыворотку(FCS), предпочтительно, когда клетки-хозяева культивируют в синтетических бессывороточных средах,таких как раскрытые в Keen et al. (1995) Cytotechnology 17:153-163, или имеющихся в продаже средах,таких как ProCHO-CDM или UltraCHO (Cambrex NJ, USA), обогащенных, если необходимо, источни- 11017303 ком энергии, таким как глюкоза, и синтетическими факторами роста, такими как рекомбинантный инсулин. При бессывороточном культивировании клеток-хозяев может потребоваться, чтобы эти клетки были адаптированы к росту в бессывороточных условиях. Один из адаптационных подходов состоит в том, что такие клетки-хозяева культивируют в средах, содержащих сыворотку, и повторно заменяют 80% культуральной среды бессывороточными средами, так чтобы клетки-хозяева приобрели способность адаптироваться к бессывороточным условиям (см., например, Scharfenberg K. et al. (1995) в Animal Cell Technology: Developments towards the 21st Century (Beuvery E.C. et al. eds), pp 619-623, Kluwer Academic Publishers). Антитела по изобретению, секретируемые в среды, можно извлекать и очищать из сред с использованием множества разных методик с достижением степени очистки, подходящей для предназначенного применения. Например, применение терапевтических антител по изобретению для лечения пациентовлюдей в типичных случаях требует по меньшей мере 95%-ной чистоты, как определено восстанавливающим электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), в более типичных случаях 98%-ной или 99%-ной чистоты, по сравнению с культуральной средой, содержащей терапевтические антитела. В первом случае клеточные остатки из культуральной среды в типичных случаях удаляют с использованием центрифугирования с последующей стадией осветления супернатанта при использовании, например, микрофильтрации, ультрафильтрации и/или фильтрации через пористый фильтр. Альтернативно, антитело можно собирать микрофильтрацией, ультрафильтрацией или фильтрацией через пористый фильтр без предварительного центрифугирования. Доступно множество других методик, таких как диализ и гель-электрофорез, и хроматографических методик, таких как хроматография на гидроксиапатите (НА), аффинная хроматография (возможно включающая систему введения аффинных меток, таких как полигистидин) и/или хроматография на основе гидрофобных взаимодействий(HIC, см. US 5429746). В одном из воплощений антитела по изобретению после различных стадий осветления захватывают при использовании аффинной хроматографии с Протеином А или G с последующими дополнительными стадиями хроматографии, такой как ионообменная хроматография и/или НАхроматография, анионный или катионный обмен, гель-фильтрация, и осаждением сульфатом аммония. В типичных случаях также используют различные стадии удаления вирусов (например, нанофильтрацию при использовании, например, фильтра DV-20). После этих различных стадий получают очищенный (в типичных случаях моноклональный) препарат, содержащий по меньшей мере 10 мг/мл или более, например 100 мг/мл или более антитела по изобретению, и поэтому он образует одно из воплощений этого изобретения. Концентрацию до 100 мг/мл или более можно получить ультрацентрифугированием. Подходящим является то, что такие препараты являются, по существу, свободными от агрегированных форм антител по изобретению. Бактериальные системы являются особенно подходящими для экспрессии фрагментов антитела. Такие фрагменты локализованы внутри клеток или в пределах периплазмы. Нерастворимые периплазматические белки могут быть экстрагированы и подвергнуты повторному фолдингу с образованием активных белков в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, см. Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72, 13-20 и Cupit P.M. et al. (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277. Фармацевтические композиции Очищенные препараты антител по изобретению (в частности, моноклональные препараты), описанные выше, можно включать в состав фармацевтических композиций для применения в лечении заболеваний и расстройств у человека, таких как указанные выше. В типичных случаях такие композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый (то есть, инертный) носитель, как известно и как рекомендуется в приемлемой фармацевтической практике, см. например, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th ed, (1980), Mack Publishing Co. Примеры таких носителей включают стерилизованный носитель, такой как физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы, забуференный подходящими буферами до рН в диапазоне от 5 до 8. Фармацевтические композиции для инъекции (например,внутривенной, внутрибрюшинной, интрадермальной, подкожной, внутримышечной или в воротную вену) или длительной инфузии являются подходящим образом свободными от видимых частиц и могут содержать от 0,1 нг до 100 мг антитела, в типичных случаях от 5 до 25 мг антитела. Способы изготовления таких фармацевтических композиций хорошо известны специалистам в данной области техники. В одном из воплощений фармацевтические композиции содержат от 0,1 нг до 100 мг терапевтических антител по изобретению в стандартной лекарственной форме, возможно вместе с инструкциями по применению. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть лиофилизированными (подвергнуты сублимационной сушке) для разведения перед введением в соответствии со способами, хорошо известными или очевидными специалистам в данной области техники. Если воплощения данного изобретения включают антитела по изобретению с изотипом lgG1, хелатор меди, такой как цитрат (например цитрат натрия), или этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), или гистидин могут быть добавлены к фармацевтической композиции для снижения степени опосредованного медью разложения антител этого изотипа, см. ЕР 0612251. Эффективные дозы и режимы лечения для введения антитела по изобретению обычно определяют эмпирически, и они зависят от таких факторов, как возраст, масса и состояние здоровья пациента, а так- 12017303 же заболевания или расстройства, подлежащего лечению. Такие факторы находятся в компетенции лечащего врача. Руководство по выбору подходящих доз можно найти, например, в Smith et al. (1977) Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Raven Press, New York, но в общем они должны составлять от 1 до 1000 мг. В одном из воплощений дозовый режим для лечения пациента-человека, страдающего ревматоидным артритом (РА), составляет 100 мг или около того (то есть от 50 до 200 мг) антитела по изобретению (или его антигенсвязывающего фрагмента), вводимых подкожно раз в неделю или раз в две недели. Композиции по настоящему изобретению могут также быть использованы в профилактике. В зависимости от заболевания или расстройства, подлежащего лечению, фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество антитела по изобретению, могут быть использованы одновременно, раздельно или последовательно с эффективным количеством другого лекарственного средства, такого как противовоспалительный агент, например нестероидное противовоспалительное средство (NSAID), метотрексат, буцилламин, тиомалат натрия или одно, или более чем одно средство против TNF-альфа, такое как Enbrel (этанерцепт), Remicade (инфликсимаб), Humira (адалимумаб) и/или CDP870. Антитела по изобретению могут быть использованы в комбинации с эффективным количеством антитела против рецептора TNF-альфа, см. Davis MW et al. (2000) Ann Rheum Dis 59(Suppl 1): 41-43. В других воплощениях антитела по изобретению могут быть использованы в комбинации с эффективным количеством агента против IL-1/IL-1R (например, Kineret), CTLA4-lg, IL-6 (см.Choy et al., (2002) Ann. Rheum. Dis 61(suppl 1): 54), IL-8, IL-15, фактора роста сосудистого эндотелия(VEGF), IL-17, IL-18 (см. Taylor et al. (2001) Curr. Opin. Immunol, 13: 611-616), антитела против молекул межклеточной адгезии (ICAM) и/или против CD4, агентов против члена семейства матриксных металлопротеиназ (ММР), например ММР-1, 2, 3 и/или 13. Антитела по изобретению могут также быть использованы в комбинации с агентом, который удаляет клетки, про которые известно, что они вовлечены в воспалительный процесс, например CD20-положительные В-клетки, с использованием, например, Mabthera (Ритуксимаб). Другие терапевтические средства в комбинации с антителами по изобретению включают антиангиогенные терапевтические средства, такие как антагонисты интегрина V3, Kringles 15 (см. Sumariwalla P et al. (2003), Arthritis Res Ther 5:R32-R39.), растворимый Flt-1 (см. Miotla et al., (2000)Lab.Invest. 80:1195-1205), агент против циклооксигеназы-2 (СОХ-2) или агент против онкостатина М(OSM), такой как антитело против OSM, см. WO 2005/095457, все содержание которого конкретно включено в данное описание ссылкой для читателя. Понятно, что фармацевтическая композиция в виде набора компонентов, представляющих собой антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент вместе с такими другими лекарственными средствами, возможно вместе с инструкциями по применению также предусмотрена настоящим изобретением. Эти комбинации могут быть особенно полезными в лечении артритных заболеваний/расстройств, таких как ревматоидный артрит. Клинические применения Антитела по изобретению могут быть использованы в терапевтическом лечении заболеваний, опосредованных IL-18, таких как аутоиммунные заболевания. Особенно следует отметить рассеянный склероз, артритные заболевания, такие как ревматоидный артрит, диабет 1 типа, воспалительное заболевание кишечника (IBD) и псориаз. Таким образом, это изобретение дополнительно включает способ лечения пациента-человека, страдающего заболеванием, чувствительным к нейтрализации hlL-18 (таким как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет 1 типа, IBD, псориаз), включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества антитела по изобретению, в частности антитела,имеющего тяжелую цепь с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 9, и легкую цепь,имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13. Также предложено применение антитела по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения любого одного (или более чем одного) указанного заболевания/расстройства. Примеры Следующие примеры иллюстрируют различные аспекты этого изобретения. Все общие технологии клонирования, лигирования и другие технологии рекомбинантных ДНК осуществляют в общем, как указано в Maniatis et al., Molecular Cloning (Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratories, или Sambrook et al. Molecular Cloning (Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratories. Векторные системы и дополнительные способы молекулярной биологии, использованные здесь, раскрыты в заявке WO 2005/095457, все содержание которой включено в данное описание ссылкой для читателя. Клонирование гибридомных вариабельных областей Исходное крысиное антитело 2 С 10 описано в патенте США 6706487, конкретная ссылка на кото- 14017303 рый дана для читателя. Химерное антитело 2 С 10 с было сконструировано на основании вышеописанных опубликованных крысиных V-областей, соединенных с человеческими lgG1 или kappa С-областями. Для конструктов тяжелой и легкой цепи были введены общая для иммуноглобулинов сигнальная последовательность и трансляционный старт-кодон АТС. Сайты для рестрикционных эндонуклеаз Hind III и BsiWI были сконструированы для обрамления VL-домена и возможности клонирования в векторах для млекопитающих, уже содержащих человеческую область Ckappa (SEQ ID NO: 36). Сайты для рестрикционных эндонуклеаз Hind III и Spel были сконструированы для обрамления VH-домена и возможности клонирования в векторах для млекопитающих, уже содержащих человеческую 1 С-область (SEQ ID NO: 34). Это привело в результате к двум заменам аминокислот для Vh-области 2 С 10 в каркасной области 4 (остатки 107 и 108 по Kabat) из опубликованной последовательности, как показано в SEQ ID NO: 33. Для построения всей кодирующей последовательности при использовании ПЦР и клонирования в экспрессионных векторах, указанных выше, использовали перекрывающиеся олигонуклеотиды. После подтверждения последовательности химерное антитело экспрессировали в клетках СНО. Полученное антитело очищали из супернатантов клеточной культуры аффинной хроматографией на Сефарозе с рекомбинантным Протеином А. Химерные антитела 2 С 10 оценивали в анализах связывания in vitro для демонстрации эффективности, сравнимой с исходным крысиным 2 С 10. Это осуществляли путем определения величин ЕС 50 для связывания с IL18 человека или резуса в ELISA (фиг. 16 и 17) или по ингибированию высвобождения IFN- в биоанализе на KG-1, см. фиг. 15. Гуманизирование Стратегия гуманизирования легкой цепи Для вариабельной последовательности легкой цепи крысиного 2 С 10 выбрали акцепторный каркас человеческой зародышевой линии (FJGKV1D-12-1, SEQ ID NO:38), которая имела 64%-ную идентичность (включая CDR) с вариабельной последовательностью легкой цепи крысиного 2 С 10. V-область зародышевой линии объединяли in silico с подходящей FR4, в данном случае с J-областью минигена kappa 2 (Kabat Vol.II) на основании сходства последовательностей (SEQ ID NO: 40). Три гуманизированных варианта генерировали на основании сравнения последовательностей и возможного влияния на функцию антитела. Конструкт L1 представлял собой непосредственный объект для переноса крысиных CDR (при определении по Kabat) на человеческий акцепторный каркас, выбранный как указано выше. КонструктL2 был основан на L1 с одной дополнительной обратной мутацией по остатку 71. Конструкт L3 был основан на L2 с 4 дополнительными обратными мутациями по остаткам 45, 83, 84 и 85. См. табл. 1. Таблица 1. Данные по полученным гуманизированным вариантам VL Стратегия гуманизирования тяжелой цепи Для крысиной вариабельной последовательности тяжелой цепи 2 С 10 выбрали акцепторный каркас человеческой зародышевой линии (FpIGHY1-f2, SEQ ID NO: 37), которая имела 59%-ную идентичность (включая CDR) с вариабельной последовательностью тяжелой цепи крысиного 2 С 10. V-область из зародышевой линии объединяли in silico с подходящей FR4, в данном случае с минигеном JH6 (KabatVol.II) на основании сходства последовательностей (SEQ ID NO: 39). Три гуманизированных варианта вариабельной последовательности тяжелой цепи сконструировали на основании этой рамки. Н 1 представляет собой объект для переноса крысиных CDR (при определении по Kabat) с 4 дополнительными обратными мутациями по остаткам 27, 28, 29 и 93. Это дало очень необычную аминокислотную последовательность непосредственно перед CDR1 исходного (то есть, донорского) антитела, которая может составлять часть CDR (как определено по Chothia). Н 2 был основан на Н 1 с двумя дополнительными обратными мутациями по остаткам 39 и 40. Н 3 был, в свою очередь, основан на Н 2 с другими 4 дополнительными обратными мутациями по остаткам 36, 71, 89 и 91. См. табл. 2.- 15017303 Таблица 2. Данные по полученным гуманизированным вариантам VH Гуманизирование 2 С 10 С Гуманизированные V-области синтезировали de novo построением перекрывающихся олигонуклеотидов и ПЦР-амплификацией. Праймеры включали рестрикционные сайты для клонирования в экспрессионных векторах для млекопитающих и сигнальные последовательности человеческого иммуноглобулина для секреции. Гуманизированные V-области клонировали в экспрессионных векторах для млекопитающих как Н 1, Н 2 и Н 3, используя HindIII и Spel, содержащих константную область человеческогоgamma 1, и как L1, L2 и L3, используя HindIII и BsiWI, в экспрессионных векторах млекопитающего,содержащих человеческую константную область kappa. Это дало гуманизированные варианты тяжелой цепи человеческого изотипа lgG1 и гуманизированные варианты легкой цепи человеческого изотипаkappa. Экспрессия комбинаций гуманизированной тяжелой и легкой цепи антитела Клетки CHOK1 подвергали временной трансфекции в четырех параллелях. Супернатант анализировали на концентрацию антитела и затем использовали в анализах связывания in vitro сравнением с крысино-человеческой химерой 2 С 10. Крупномасштабную временную экспрессию всех 9 вариантов осуществляли смешиванием для каждой колбы 51,4 мкг плазмиды легкой цепи и 8,6 мкг плазмиды тяжелой цепи с 240 мкг трансфекционного липида (этот липид описан в WO 2006/053783, пример 13, все содержание которого включено в данное описание ссылкой) в 8 мл среды (OpiMEM/glutamax/5% FBS) и внесением этой смеси в две колбы Т 175 с почти конфлюэнтными клетками CHOK1 на 72 ч в типичных условиях тканевой культуры. Антитела также экспрессировали в поликлональной системе клеток СНО в миллиграммовых количествах с использованием встряхиваемых колб и очищали с использованием жидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC) и Протеина А. Анализы связывания in vitro Анализ Biacore Кинетический анализ Biacore гуманизированных антител 2 С 10 осуществляли на прибореBiacore 3000 при использовании захвата антител Протеином А в буфере HBS-EP (Biacore). Вкратце,Протеин А иммобилизовали на матрице СМ 5 сочетанием с первичным амином при использовании протокола, рекомендованного изготовителями, до плотностей около 2000-4000 единиц резонанса (ЕР). Затем пропускали над поверхностью Протеина А гуманизированное антитело, которое захватывалось до уровней около 200-500 ЕР, после периода стабилизации над поверхностью с захваченным антителом пропускали IL18 (человека или резуса) при определенных концентрациях и получали сенсограммы связывания. Регенерация при использовании условий кислотной элюции приводила к полному удалению захваченного антитела с поверхности Протеина А и незначительно снижала связывающую способность этой поверхности. Все кривые подвергали двойному контролю против инъекции буфера вместо IL18 и данные аппроксимировали согласно модели связывания 1:1 при использовании параметров глобальной аппроксимации в BiaEval 4.1. Эксперименты по ранжированию скоростей диссоциации проводили при использовании того же способа захвата Протеином А, однако использовали только одну концентрацию IL18 (10 нМ). Хотя данные аппроксимировали, используя для кинетического анализа ту же модель связывания,этот результат является полезным только для ранжирования, а не для точного кинетического измерения,поскольку при записи скорости диссоциации использовали только одну концентрацию определяемого вещества и его использовали в селекции антител для дополнительного исследования. Исходные результаты при 25 С свидетельствовали о том, что у всех конструктов были такие же аффинности связывания с человеческим IL18, как и у крысиного 2 С 10 в качестве исходного антитела.- 16017303 Однако, когда эксперимент по ранжированию скорости диссоциации осуществляли при 37 С, конструкты L1 действовали хуже при сравнении с конструктами L2 и L3, где в скоростях диссоциации было заметно увеличение. (табл. 3 а и 3 б). Таблица 3 а. Кинетические параметры для Biacore-анализа антител против человеческого IL18,исследованных при 25 С Данные результатов двух экспериментов (стандартное отклонение) Таблица 3 б. Ранжирование скоростей диссоциации в Biacore-анализе связывания человеческого IL18 с гуманизированными антителами против IL18, захваченными Протеином А, при 37 С Данные результатов одного эксперимента Действуя слабее при 37 С, конструкты L1 кроме того были наименее эффективными по аффинности связывания с IL18 резуса (табл. 4 а) при 25 С. Выбранные на основании этих наблюдений антитела исследовали более подробно на связывание с IL18 человека и резуса при 37 С. Данные, показанные в табл. 4 б для человеческого IL-18, представляют собой среднее значение (и стандартное отклонение) шести отдельных определений. Данные для IL-18 резуса показывают среднее значение и стандартное отклонение по двум экспериментам для H1L2 и H1L3, в то время как данные для H3L2 и H3L3 взяты из одного эксперимента. Сравнительно высокие стандартные отклонения этих данных, возможно, являются результатом проведения этого эксперимента при 37 С. Тот факт, что конструкты L1 действовали относительно слабее, является удивительным, если учесть, что отличием конструктов L1 и L2 является замена фенилаланина тирозином при обратной мутации по положению 71 легкой цепи. Как тирозин, так и фенилаланин определенно являются ароматическими аминокислотами, поэтому тот факт, что столь легкое изменение в каркасной структуре привело к заметным результатам (в смысле аффинности связывания), наблюдаемым в системе Biacore при 37 С- 17017303 Таблица 4 а. Кинетические параметры для Biacore-анализа связывания IL18 резуса с конструктами гуманизированного антитела при 25 С Данные результатов одного эксперимента Таблица 4 б. Кинетические параметры Biacore-анализа связывания IL18 человека и резуса с выбранными конструктами гуманизированных антител при 37 С Варианты H1L1, H1L2 и H1L3 выбраны для дополнительного анализа в разделе 7.4.2 ниже. Данные анализа Biacore T100 Характеризацию некоторых вариантов антител дополнительно осуществляли с использованием прибора Т 100 Biacore. Этот прибор имеет преимущества над Biacore 3000 в показателях чувствительности, контроля температуры и стабильности базового уровня при повышенных температурах благодаря применению линейного дегазатора, который минимизирует буферные эффекты при повышенных температурах. Он также снабжен улучшенным программным обеспечением, таким как автоматизированный анализ данных. Методология была в основном такой же, как для способа, использованного в разделе 7.4.1 выше. Протеин А иммобилизовали на матрице СМ 5 при плотностях 2000-6000 ЕР сочетанием с первичным амином. Определения осуществляли в HBS-EP (Biacore). Антитела против IL18 захватывали при плотностях 100-500 ЕР, человеческий IL18 пропускали над этой захваченной поверхностью при концентрациях 16-0,0625 нМ, при концентрации 0 нМ (то есть инъекция только буфера для захвата антитела), используемой для двойного контроля. Регенерацию после каждой инъекции IL18 осуществляли мягкой кислотной элюцией при использовании двух инъекций 10 мМ глицина, рН 1,5. Эта стадия регенерации удаляла захваченное антитело с поверхности Протеина А (и, следовательно, любой IL18, связанный с ним). Регенерация незначительно изменяла способность поверхности с Протеином А связывать последующие впрыски антитела, что делало возможным другие акты захватывния. Полученные кривые связывания анализировали с использованием аналитического программного обеспечения, встроенного в прибор Т 100, применяя модель связывания 1:1. Измерения осуществляли при указанных температурах. Анализ связывания H1L1 и H1L2 при 15, 20, 25, 32 и 37 С Этот эксперимент осуществляли, используя указанный способ при различных температурах. На фиг. 1 показано влияние температуры на скорость ассоциации (ka), в то время как на фиг. 2 показано влияние на скорость диссоциации (kd), и на фиг. 3 показано влияние на константу равновесия (KD). В табл. 5 подробно описаны кинетические показатели, использованные для создания этих графиков.- 18017303 Таблица 5. Кинетические параметры из эксперимента по варьированию температуры Данные получены в одном эксперименте Эти данные показывают, что скорости ассоциации двух тестированных антител являются сходными во всем исследованном диапазоне температур, причем H1L2 в целом имеет более высокую скорость ассоциации вплоть до конечной величины при 37 С, когда H1L2 имеет более высокую скорость ассоциации. Однако более сильное отличие наблюдается, если посмотреть на скорости диссоциации: два антитела имеют подобные скорости диссоциации при 15, 20, 25 С, но начинают расходиться при 32 и 37 С, где более высокая скорость диссоциации наблюдается для H1L1. Эти изменения отражены в суммарной константе равновесия (которая представляет собой функцию kd/ka) и указывают на то, что различие междуH1L1 и H1L2 в основном состоит в стабильности комплекса антитело/IL18, как определено скоростью диссоциации (kd). Анализ связывания H1L1, H1L2, H1L3 и химерного 2 С 10 при 25 и 37 С Эти эксперименты осуществляли, как описано выше. В табл. 6 подробно описаны полученные кинетические параметры. Эти данные показывают, что H1L2 является лучшим антителом, чем H1L1 в отношении связывания, как определено константой равновесия KD и при 25, и при 37 С, но кинетические параметры показывают, что при 25 С H1L2 имеет лучшую скорость ассоциации (ka), чем H1L1. При 37 С положение является обратным, указывая на то, что лучшее связывание H1L2, наблюдаемое при 37 С, имеет место из-за скорости диссоциации (kd), указывая на то, что мутация, которая отличает L2 отL1, придает повышенную стабильность комплексу 1L18-антитело при повышенных температурах. Таблица 6. Кинетика связывания H1L1, H1L2, H1L3 и химерного 2 С 10 с человеческим IL18 при 25 С и 37 С Человеческий IL18 при 25 С Человеческий IL18 при 37 С Данные представляют собой среднее значение множества отдельных массивов данных (n), показаны среднее значение и стандартное отклонение, где стандартное отклонение показано в скобках. В этот массив данных включены показатели для анализов при 25 и 37 С для H1L1 и H1L2, полученные в анализе при пяти разных температурах. Оценка гуманизированных вариантов 2 С 10 с по связыванию IL18 в EL1SAELISA со всеми девятью гуманизированными вариантами осуществляли по меньшей мере 6 раз при использовании различных партий очищенных препаратов антитела. На фиг. 4 А-4 В показаны репрезентативные данные одного эксперимента, в котором получено ранжирование величин ЕС 50, проиллюстрированное в табл. 7. Человеческий IL-18 иммобилизовали на 96-луночных планшетах Nunc Maxisorp при использовании 2,5 мкг/мл 16D10 (не нейтрализующее мышиное моноклональное антитело) для захвата 5 нг/мл рекомбинантного человеческого IL-18. Гуманизированные антитела против IL-18 добавляли при различных разведениях. Связанные гуманизированные антитела детектировали с использованием конъ- 19017303 югата пероксидазы со специфичными Fc против человеческого IgG (Sigma A0170). Таблица 7. Повышение величин ЕС 50 (выражено в [мкг/мл]) гуманизированных вариантов 2 С 10 Все стандартные отклонения (SE) находились между 0,001 и 0,002 Эффективность всех вариантов оказалась очень близкой к таковой для химеры 2 С 10, подтверждая,что гуманизирование привело к очень малой потере эффективности. Хотя величины ЕС 50, полученные в нескольких повторах этих анализов, приводили к ранжированию вариантов, ELISA в отдельности не обеспечил четкого различения между этими вариантами (см. табл. 7 и фиг. 4 А-4 В). Четкое различение вариантов было достигнуто с использованием Biacore (разделы 7.4.1 и 7.4.2), что привело к тому, что только 4 варианта были исследованны более подробно в нескольких независимых повторных экспериментах с использованием IL18 человека и резуса (табл. 8, фиг. 5 [человек] и 6 [резус]). Таблица 8. Величины ЕС 50 в шести независимых повторных экспериментах с четырьмя гуманизированными вариантами, выбранными для связывания с человеческим IL18ELISA осуществляли с тремя гуманизированными Н 1 вариантами (H1L1, H1L2 и H1L3) для оценки связывания с человеческим IL-18 при комнатной температуре и при 37 С как в человеческой сыворотке,так и в блокирующем растворе (PBS 0,05% TWEEN с 1% BSA (мас./об Гуманизированные варианты антитела иммобилизовали на 96-луночных планшетах Nunc Maxisorp при 2,5 мкг/мл. Захват 5 нг/мл рекомбинантного человеческого IL-18 осуществляли либо при комнатной температуре, либо при 37 С в человеческой сыворотке или блокирующем растворе. Добавляли мышиное моноклональное антитело 16D10 против IL-18. Связанное мышиное антитело детектировали с использованием конъюгата пероксидазы с антителами против мышиных kappa (Serotec MCA 1291 Р). Репрезентативные величины ЕС 50, полученные из данных этого исследования, проиллюстрированы в табл. 9.- 20017303 Таблица 9. Величины ЕС 50 гуманизированных Н 1 вариантов 2 С 10 при комнатной температуре и при 37 С В этом анализе эффективность трех гуманизированных Н 1 вариантов не подвержена влиянию изменений температуры, при которой осуществляли стадию связывания человеческого IL-18, от комнатной температуры до 37 С. Сниженные сигналы связывания наблюдали, когда антитела присутствовали в человеческой сыворотке. Оценка стабильности гуманизированных Н 1 вариантов антител при 37 С Стабильность при хранении трех гуманизированных Н 1 вариантов (H1L1, H1L2 и Н 1L3) оценивали за период времени 14 суток при 37 С как в человеческой сыворотке, так и в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Антитела разбавляли до 50 мкг/мл, стабильность оценивали по связыванию IL18 в ELISA после периодов инкубации 0, 1, 4, 6, 8 и 14 суток при 37 С. Для связывания IL-18 в ELISA иммобилизовали 16D10 (не нейтрализующее мышиное моноклональное антитело) на планшетах NuncMaxisorp для захвата 5 нг/мл рекомбинантного человеческого IL-18. Добавляли гуманизированные антитела против IL-18, взятые в разные моменты времени в течение инкубации при 37 С. Связанные гуманизированные антитела детектировали с использованием конъюгата пероксидазы со специфичными Fc против человеческих IgG. Длительная экспозиция при температуре 37 С в течение 0, 1, 4, 6, 8 и 14 суток не влияет на связывающую способность гуманизированных Н 1 вариантов антител, как это следует из их способности связываться с человеческим IL-18 в этом формате анализа. Связывание H1L2 с человеческим IL18 в присутствии синовиальной жидкости Осуществляли ELISA, в котором в 50%-ную человеческую синовиальную жидкость добавляли рекомбинантный человеческий IL18 в диапазоне от 500 до 0 нг/мл. IL-18, содержащийся в этом растворе,затем вносили в лунки 96-луночного планшета Maxisorp (Nunc), покрытые антителом H1L2. Затем детектировали связанный IL-18 биотинилированным антителом против IL-18 (D045-6, MBL) и комплексом стрептавидина с пероксидазой хрена (HRP). Титрование рекомбинантного человеческого IL18 в 50%-ной синовиальной жидкости (СЖ) давало почти ту же кривую, что и титрование человеческого рекомбинантного IL-18 в буфере, с только лишь легким сдвигом при величине, половине от максимальной. См. фиг. 7. Это демонстрирует способность антитела связываться с hlL-18 даже в присутствии 50%-ной человеческой СЖ, которая более точно имитирует среду связывания антитела, которую можно встретить в терапевтических условиях.- 21017303 Связывание с IL18 в присутствии белка, связывающего IL18 (IL18bp) Технологию Biacore (Biacore 3000) и ELISA использовали для определения того, может ли все еще H1L2 связывать человеческий IL18 в присутствии человеческого IL18bp. IL18bp имеет высокую аффинность к IL18 и действует как природный ингибитор функции IL-18 (фиг. 8, фиг. 9 А и Б, табл. 10 и табл. 11). Анализ Biacore Вкратце, Протеин А иммобилизовали на поверхности матрицы СМ 5 до плотности около 4000 единиц резонанса (ЕР) сочетанием с первичным амином. Затем пропускали над ней рекомбинантный FCIL18 связывающий белок (RD Systems) в концентрации 3 мкг/мл при скорости потока 10 мкл/мин в течение 1 мин; это привело к захвату около 1400 ЕР IL18 связывающего белка. Затем над поверхностью с захваченным IL18 связывающим белком пропускали IL18 в концентрации 30 нМ при скорости потока 10 мкл/мин в течение 5 мин. После этого пропускали над поверхностью с комплексом IL18 связывающий белок/IL18 крысиное исходное антитело 2 С 10 в концентрации 10 нМ при скорости потока 30 мкл/мин в течение 3 мин. Если эпитоп, распознаваемый антителом 2 С 10 на IL18, перекрывается с сайтом взаимодействия для IL18 связывающего белка, то сигнал связывания наблюдаться не должен. На фиг. 10 показано, что 2 С 10 связывается с hlL-18, который, в свою очередь, захватывается hlL-18BP, указывая на то,что сайты связывания для 2 С 10 и hlL-18BP не перекрываются. Таблица 10. Влияние IL-18BP на секрецию IFN синовиальными клетками при ревматоидном артрите (РА)Kawashima, M. and Miossec, P., ArthritisRheumatism, Vol. 48, 3 (March 2003), pp 631-637 Анализ ELISA Связывание гуманизированных крысиных Mab H1L2 или 2 С 10 с человеческим IL18, связанным захваченным IL18bp, тестировали прямым связыванием в ELISA, при котором рекомбинантный человеческий слитый белок IL18bp-Fc (RD Systems 119-BP) наносили на планшеты Nunc Maxisorp при 0,5 мкг/мл. Рекомбинантный человеческий IL18 (собственный реагент) добавляли при 100 нг/мл в блокирующий буфер (PBS, содержащий 1% BSA, мас./об.). Очищенные антитела добавляли при концентрациях в диапазоне от 0,5 нг/мл до 1 мкг/мл. Связанное антитело детектировали конъюгатом HRP со специфичным антителом против человеческой легкой каппа-цепи (Sigma) или HRP с антителом против крысиных IgG. На фиг. 18 А и Б показаны полученные результаты. Биоанализ in vitro Активность гуманизированных конструктов в нейтрализации стимулированного IL18 высвобождения IFN- в клеточной линии KG-1 Этот анализ определяет нейтрализующую активность антитела, специфичного к IL-18, и основан наIL-18-опосредованной индукции IFN- в клетках KG-1. KG-1 (ATCC CCL-246) представляет собой человеческую миеломоноцитарную клеточную линию, которая конститутивно экспрессирует функциональный рецептор IL-18 и поэтому отвечает на стимуляцию экзогенным IL-18. Все девять гуманизированных вариантов оценивали по их способности ингибировать стимулированное человеческим IL18 высвобождение IFN- в клетках KG-1 (табл. 12 и фиг. 11).- 22017303 Таблица 12. Величины IC50 для нейтрализации рекомбинантного человеческого IL18 в биоанализе наKG-1 с использованием всех девяти гуманизированных вариантов По меньшей мере 6 дополнительных повторных экспериментов осуществляли на четырех предпочтительных гуманизированных вариантах, которые показали наилучшую аффинность к рекомбинантномуIL18 человека и резуса на основании анализа Biacore. На фиг. 8 приведен репрезентативный результат для четырех предпочтительных гуманизированных вариантов и для H1L1, и табл. 13 суммирует результаты этих анализов, все из которых осуществляли с одной и той же партией белкового вещества, полученного из клеток СНОе 1 а. Таблица 13. Величины IC50 для нейтрализации рекомбинантного человеческого IL18 в биоанализе наn.d. = не определяли;no fit = не аппроксимировали В случаях, когда H1L1 сравнивали с другими гуманизированными вариантами, H1L1 демонстрировало более низкую эффективность по сравнению с другими четырьмя тестированными гуманизированными конструктами, а также по сравнению с исходным Mab 2C10. Дополнительный анализ осуществляли с четырьмя предпочтительными моноклональными антителами, которые сравнивали по способности ингибировать стимулированное IL-18 высвобождение INFклетками KG-1: 2C10, и с гуманизированными вариантами, происходящими из 2 С 10 (H1L1, H1L2 иH1L3). Биоанализ на KG-1 осуществляли в 96-луночных планшетах инкубированием 50 нг/мл рекомбинантного человеческого IL-18 и различных концентраций антител, специфичных к IL18 (в диапазоне от 2 мкг/мл до 7,8 нг/мл, в двойных разведениях) или отрицательного изотипического контроля (Synagis, антитело против RSV) в течение 1 ч при 37 С и 5% СО 2 с последующим добавлением 3105 клеток KG-1 на лунку. Планшеты под конец инкубировали в течение 20-24 ч при 37 С, 5% CO2. Супернатант собирали и определяли продукцию IFN- с использованием коммерческого набора для ELISA на человеческий IFN(Biosource AHC4432; АНС 4539). Провели три эксперимента. Результаты по ингибированию стимулированной IL-18 продукции IFN нормализовали по отрицательному контролю. Статистический анализ проводили с целью получения оценки IC50 для каждого mAb в каждом эксперименте после поправок на любой ответ на Synagis. Оценки IC50 затем подвергали статистическому анализу с получением общей оценки IC50 для каждого mAb- 23017303 при использовании 95%-ного доверительного интервала (то есть, статистически вероятного диапазона). Наконец, каждый гуманизированный вариант сравнивали снова с 2 С 10 при использовании теста Даннетта (Dunnett). На фиг. 12 проиллюстрирован репрезентативный эксперимент. Таблица 14 и фиг. 13 дают общую оценку IC50 для каждого моноклонального антитела при использовании 95%-ного доверительного интервала и % отличия от крысиных 2 С 10 с р-значениями и доверительными интервалами. Таблица 14. Величины IC50 для нейтрализации стимулированной IL18 продукции INFв биоанализе на KG-1H1L1 является статистически достоверно менее сильнодействующим, чем 2 С 10(р 0,001). Другие гуманизированные варианты не отличаются от 2 С 10 достоверно, хотя сравнение H1L3 и 2 С 10 находится на грани достоверности. Активность H1L2 по нейтрализации высвобождения IFN- в стимулированных человеческих МКПК Стимулировали человеческие МКПК от трех доноров рекомбинантным человеческим IL18 и антителом против CD3 и исследовали эффект добавления серии разведений четырех выбранных вариантов гуманизированных антител. Для каждого донора включали для сравнения исходное антитело 2 С 10 иIL18bp. У двух из трех доноров стимуляция IL18 и антителом против CD3 была безуспешной, и IFN- не выявлялся. У оставшегося донора результаты сильно варьировали при низких концентрациях, но добавлением различных антител против IL18, в том числе гуманизированных вариантов, можно осуществить полное ингибирование индуцированной IL18 продукции IFN-. См. фиг. 14. Также проводили эксперименты по стимуляции человеческих МКПК при использовании LPS, который приводит к продукции IL18 и ассоциированному с ней высвобождению IFN-. LPS индуцировал продукцию IFN- в зависимости от концентрации, и добавление исходного моноклонального антитела 2 С 10 при фиксированной концентрации 1 мкг/мл полностью ингибировало эту стимуляцию, указывая на то, что этот эффект является IL18-опосредованным и что эндогенный IL18 может быть нейтрализован(данные не показаны). Это можно также продемонстрировать на цельной крови, но ингибиторный эффект 2 С 10, хотя и зависел от дозы, был менее заметным (данные не показаны). На фиг. 9 показаны результаты из эксперимента с 3 независимыми донорами и ингибированием исходными крысиными моноклональными 2 С 10, H1L2 и IL18bp. Донор 1 и 3 дали одинаковые результаты, тогда как донор 2 показал отсутствие высвобождения IFN- при стимуляции с использованием LPS (не показано). ОпосредованноеIL18 высвобождение IFN- можно полностью ингибировать в присутствии 10 или 25% человеческой сыворотки добавлением более чем 1 мкг/мл антитела или IL18bp. Ингибирование можно наблюдать уже при 10 нг/мл и выше, и величины IC50 для этого ингибирования в присутствии 10 или 25% человеческой сыворотки показаны в табл. 11. Таблица 11. Величины IC50 для ингибирования LPS-стимулированного высвобождения IFN-, вызванного нейтрализацией эндогенного IL18 с использованием 2 С 10, H1L2 или IL18bp в присутствии человеческой сыворотки Обобщение по связыванию с ортологами IL18 Связывание антитела с IL18 из других видов проверяли при использовании ELISA и Biacore, а также биоанализа на клетках KG-1. Для IL18 резуса/павиана это осуществили сначала при использовании исходного 2 С 10 и химерного 2 С 10 с, но повторили с некоторыми гуманизированными вариантами. Исходное 2 С 10 тестировали на связывание с IL18 свиньи, мыши и крысы и 4 наилучших гуманизированных варианта тестировали на связывание с IL18 резуса/павиана и собаки при использовании Biacore и ELISA. Биоанализ на KG-1 осуществляли с IL18 резуса/павиана и тремя моноклональными антителами, 2 С 10,химерным и репрезентативным для гуманизированных вариантов H3L3. С учетом сходства всех гуманизированных вариантов это, вероятно, является репрезентативным для других полученных вариантов, в том числе H1L2 (см. табл. 15, фиг. 8). Таблица 15. Общий обзор связывания с ортологами исходного крысиного Mab 2C10, крысиночеловеческой химеры 2 С 10 с и пула 4 выбранных гуманизированных вариантов+= детектируемое связывание Исследование кругового дихроизма и тепловой денатурации антител против IL18 Исследования кругового дихроизма (КД) использовали для изучения вторичных структурных изменений антител против IL18 в зависимости от температуры, особенно между 25 и 37 С. Исследования тепловой денатурации этих же антител осуществляли для определения их тепловой стабильности и их температур плавления (Tm.) Способ КД Спектры КД получали на спектрометре Applied Photophysics Chirascan, сканирующем в диапазоне 180 нм-280 нм с шагом 0,5 нм и шириной полосы 1 нм. Время получения данных по одной точке составляло 5 с. Пробу разбавляли прблизительно до 0,2 мг/мл в PBS и помещали в ячейку с длиной светового пути 1 мм. Спектры каждого белка снимали при установках термостата на 4, 25 и 37 С. Реальные температуры проб определяли зондом, помещенным в объем жидкости в ячейке, и они были в пределах примерно 3 С от каждой установленной температуры. Способ определения Tm Все белки разбавляли до 0,2 мг/мл в Sypro оранжевом в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), 1:1000. Эмиссию флуоресценции при 620 нм измеряли при использовании прибора Bioneer Exicycler (возбуждение при 490 нм) на каждом интервале 0,5 С, поднимая температуру от 10 до 95 С и ожидая 10 с на каждой температурной точке. Кривые денатурации аппроксимировали стандартной изотермой плавления при использовании Grafit. Как предполагалось, сравнение формы спектров КД все четырех антител показало, что их структура характеризуется высоким содержанием бета-слоя и, по существу, одним и тем же строением. В диапазоне температур от 4 до 37 С три антитела: не показывают значительных изменений в их вторичной структуре по данным КД. Однако химерное антитело 2 С 10 показало легкое снижение структурированности в этом температурном дапазоне. Это соответствует тенденции к термической стабильности, показанной в табл. 16 ниже. Таблица 16. Тепловая денатурация антител против IL18H1L1, H1L2 и H1L3 отчетливо стабильны далеко за 37 С без признаков какой-либо денатурации при температуре тела. Поэтому маловероятно, что их отличия в термической стабильности дают какиелибо характерные преимущества при нормальных температурах тела и окружающей среды.