Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение
Номер патента: 16186
Опубликовано: 30.03.2012
Авторы: Лу Ли-Шэн, Пань Чинь, Хуан Хайчунь, Терретт Джонатан Александер, Кинг Дэвид Джон, Коччия Марко А., Кардарелли Жозефин М.
Формула / Реферат
1. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая включает последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, которая включает последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 21, а последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит SEQ ID NO: 36 и их консервативные модификации; где антитело специфично связывается с CD70.
2. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие:
a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий SEQ ID NO: 11;
b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий SEQ ID NO: 16;
c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий SEQ ID NO: 21;
d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающий SEQ ID NO: 26;
e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающий SEQ ID NO: 31;
f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающий SEQ ID NO: 36;
где антитело специфично связывается с CD70.
3. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие:
a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и
b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
где антитело специфично связывается с CD70.
4. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, где антитело специфично связывается с CD70.
5. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-4, где антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, которая выведена из гена VH 3-30.3 человека, и вариабельную область легкой цепи, которая выведена из гена VK L6 человека, где антитело специфично связывается с CD70.
6. Антитело по любому из пп.1-5, которое представляет собой:
а) полноразмерное антитело изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или
b) фрагмент антитела или одноцепочечное антитело.
7. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, где указанное антитело связывается с CD70 человека с KD 1´10-7 M или менее, с KD 5,5´10-9 М или менее, такой как KD 3´10-9 М или менее или KD 2´10-9 М или менее.
8. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, где указанное антитело интернализовано.
9. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, где указанное антитело связывается с клетками опухолевой клеточной линии почечно-клеточной карциномы.
10. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.9, где опухолевая клеточная линия почечно-клеточной карциномы выбрана из группы, состоящей из клеточных линий 786-O, А-498, ACHN, Caki-1 и Caki-2.
11. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, где указанное антитело связывается с клетками опухолевой клеточной линии В-клеток.
12. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.11, где опухолевая клеточная линия В-клеток выбрана из группы, состоящей из клеточных линий Daudi, HuT 78, Raji и Granta 519.
13. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, где указанное антитело лишено остатков фукозы.
14. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, где последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 16 и ее консервативные модификации, а последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит SEQ ID NO: 31 и ее консервативные модификации.
15. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.14, где последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 11 и ее консервативные модификации, а последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит SEQ ID NO: 26 и ее консервативные модификации.
16. Композиция, включающая антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель.
17. Иммуноконъюгат, включающий антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, связанные с терапевтическим агентом.
18. Композиция, включающая иммуноконъюгат по п.17 и фармацевтически приемлемый носитель.
19. Иммуноконъюгат по п.17, где терапевтический агент представляет собой цитотоксин.
20. Композиция, включающая иммуноконъюгат по п.19 и фармацевтически приемлемый носитель.
21. Иммуноконъюгат по п.17, где терапевтический агент представляет собой радиоактивный изотоп.
22. Композиция, включающая иммуноконъюгат по п.21 и фармацевтически приемлемый носитель.
23. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5.
24. Экспрессирующий вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.23.
25. Клетка-хозяин, включающая экспрессирующий вектор по п.24.
26. Способ получения антитела к CD70, который включает экспрессирование антитела в клетке-хозяине по п.25 и выделение антитела из клетки-хозяина.
27. Способ лечения или предотвращения заболевания, характеризующегося ростом опухолевых клеток, экспрессирующих CD70, включающий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 в количестве, эффективном для лечения или предотвращения заболевания.
28. Способ по п.27, где заболевание представляет собой раковое заболевание.
29. Способ по п.28, где раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из почечно-клеточных карцином (RCC), светлоклеточной RCC, глиобластомы, неходжкинской лимфомы (NHL), острой лимфоцитарной лейкемии (ALL), хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL), лимфомы Беркитта, анапластических крупноклеточных лимфом (ALCL), множественной миеломы, кожных Т-клеточных лимфом, фолликулярных мелкоклеточных лимфом с расщепленными ядрами, лимфоцитарных лимфом, периферических Т-клеточных лимфом, лимфом Леннерта, иммунобластных лимфом, Т-клеточной лейкемии/лимфомы (ATLL), Т-клеточной лейкемии взрослых (T-ALL), энтеробластных/центроцитарных фолликулярных лимфом, диффузных крупноклеточных лимфом В-клеточной линии, Т-клеточной лимфомы типа ангиоиммунобластной лимфаденопатии, ассоциированных с ВИЧ полостных лимфом, эмбриональных карцином, недифференцированных карцином носоглотки, опухоли Шминке, болезни Кастлемана, саркомы Капоши, множественной миеломы, макроглобулинемии Вальденстрема и В-клеточных лимфом.
30. Способ по п.28, где раковое заболевание представляет собой почечно-клеточную карциному.
31. Способ по п.28, где раковое заболевание представляет собой лимфому.
32. Способ по п.28, где антитело лишено остатков фукозы.
33. Способ лечения аутоиммунного заболевания у субъекта, который нуждается в указанном лечении, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5, посредством чего симптомы аутоиммунного заболевания улучшаются.
34. Способ по п.31, где аутоиммунное заболевание представляет собой туберкулезную волчанку.
35. Способ предотвращения аутоиммунного заболевания у субъекта с риском развития аутоиммунного заболевания, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5, посредством чего развитие симптомов аутоиммунного заболевания предотвращается или ослабляется.
36. Способ лечения воспаления у субъекта, который нуждается в указанном лечении, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5, посредством чего симптомы воспаления улучшаются.
37. Способ по п.36, где антитело лишено остатков фукозы.
38. Способ лечения вирусной инфекции у субъекта, который нуждается в указанном лечении, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5, посредством чего симптомы вирусной инфекции улучшаются.
39. Способ по п.38, где вирусная инфекция вызвана вирусами, выбранными из группы вирусов, состоящей из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), гепатита (А, В и С), герпес-вируса, аденовируса, вируса гриппа, флавивирусов, эховируса, риновируса, вируса коксаки, короновируса, респираторного синцитиального вируса, вируса свинки, ротавируса, вируса кори, вируса краснухи, парвовируса, вируса вакцинии, вируса HTLV, вируса тропической лихорадки, папилломавируса, вируса контагиозного моллюска, полиовируса, вируса бешенства, вируса JC и вируса арбовирусного энцефалита, вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV).
40. Способ по п.39, где указанный герпес-вирус выбран из группы, состоящей из VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, CMV и вируса Эпштейна-Барр.
41. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для ингибирования роста опухолевых клеток.
42. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для получения лекарственного средства для ингибирования роста опухолевых клеток.
43. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для улучшения симптомов аутоиммунного заболевания.
44. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для получения лекарственного средства для улучшения симптомов аутоиммунного заболевания.
45. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для улучшения симптомов вирусной инфекции.
46. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-5 для получения лекарственного средства для улучшения симптомов вирусной инфекции.
Текст
ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К CD70 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В настоящем изобретении предлагаются выделенные моноклональные антитела, в особенности человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с CD70 с высокой степенью сродства. Также предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела по изобретению, предлагаются экспрессирующие векторы, клетки-хозяева и способы экспрессии антител по изобретению. Также предлагаются иммуноконъюгаты, биспецифичные молекулы и фармацевтические композиции, включающие антитела по изобретению. В изобретении также предлагаются способы лечения рака, аутоиммунного заболевания, воспаления и вирусных инфекций. 016186 Перекрестная ссылка на родственные заявки Заявка на данный патент претендует на приоритет согласно предварительной заявке US60/720600 от 26 сентября 2005 г., согласно предварительной заявке US60/726695 от 13 октября 2005 г. и согласно предварительной заявке US60/748827 от 8 декабря 2005 г. в соответствии с 35 U.S.С.119(e), полное содержание всех заявок введено сюда с помощью ссылки. Уровень техники Цитокиновый рецептор CD27 является членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TFNR), который играет роль в клеточном росте и дифференцировке, а также в процессе апоптоза или программируемой клеточной смерти. Лигандом для CD27 является CD70, который принадлежит семейству лигандов фактора некроза опухоли. CD70 представляет собой полипептид из 193 аминокислот,имеющий N-концевой гидрофильный домен из 20 аминокислот и С-концевой домен, содержащий 2 потенциальных N-связанных сайта гликозилирования (Goodwin, R.G. et al. (1993), Cell 73:447-56; Bowmanet al. (1994), Immunol. 152:1756-61). Ha основании указанных свойств было определено, что CD70 представляет собой трансмембранный белок типа II, содержащий внеклеточный С-концевой участок. Была обнаружена временная экспрессия CD70 на активированных, но не находящихся в покое Т- и В-лимфоцитах и дендритных клетках (Hintzen et al. (1994), J. Immunol. 152:1762-1773; Oshima et al.(1998), Int. Immunol. 10:517-26; Tesselaar et al. (2003), J. Immunol. 170:33-40). В дополнение к экспрессии на нормальных клетках сообщалось об экспрессии CD70 при различных типах злокачественных заболеваний, включая почечно-клеточные карциномы, метастазирующие раковые заболевания груди, опухоли мозга, лейкемии, лимфомы и карциномы носоглотки (Junker et al. (2005), J. Urol. 173:2150-3; Sloan et al.(2004), Am J. Pathol. 164:315-23; Held-Feindt и Mentlein (2002), Int J. Cancer 98:352-6; Hishima et al. (2000),Am J. Surg Pathol. 24:742-6; Lens et al. (1999), Br J. Haematol. 106:491-503). Дополнительно, на Т-клетках,обработанных ингибиторами ДНК-метилтрансферазы или ингибиторами пути ERK, была обнаружена сверхэкспрессия CD70, возможно, приводящая к возникновению индуцированной лекарственными средствами и идиопатической туберкулезной волчанке (Oelke et al. (2004), Arthritis Rheum. 50:1850-60). Было также предположено, что взаимодействие CD70 с CD27 играет роль в клеточно-опосредованном аутоиммунном заболевании и в ингибировании продукции TNF-альфа (Nakajima et al. (2000), J. Neuroimmunol. 109:188-96). Соответственно CD70 представляет собой ценную мишень для лечения рака, аутоиммунных расстройств и множества других заболеваний, характеризующихся экспрессией CD70. Сущность изобретения В настоящем изобретении предлагаются выделенные моноклональные антитела, в частности человеческие моноклональные антитела, которые связываются с CD70 и которые проявляют многочисленные желаемые свойства. Эти свойства включают высокую степень сродства связывания с CD70 человека. Также предлагаются способы лечения множества заболеваний, опосредованных CD70, с применением антител и композиций по настоящему изобретению. В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, где антитело (а) связывается с CD70 человека с KD 110-7 М или менее и (b) связывается с клетками опухолевой клеточной линии почечно-клеточной карциномы. Предпочтительно антитело связывается с клетками опухолевой клеточной линии почечноклеточной карциномы, выбранной из группы, состоящей из 786-O (АТССдоступа CRL-1932), А-498Caki-2 (АТССдоступа НТВ-47). Предпочтительно антитело представляет собой человеческое антитело, хотя в альтернативных воплощениях антитело может представлять собой мышиное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело. В более предпочтительных воплощениях антитело связывается с CD70 человека с KD 5,510-9 М или менее, или связывается с CD70 человека с KD 310-9 М или менее, или связывается с CD70 человека с KD 210-9 М или менее, или связывается с CD70 человека с KD 1,510-9 М или менее. В другом воплощении антитело интернализуется опухолевыми клетками 786-O почечно-клеточной карциномы после связывания с CD70, который экспрессируется на этих клетках. В другом воплощении антитело связывается с клетками опухолевой клеточной линии В-клеток. Предпочтительно опухолевая клеточная линия В-клеток выбрана из группы, состоящей из клеточных линий Daudi (ATCCдоступа CCL-213), HuT 78 (АТССдоступа TIB-161), Raji (ATCCдоступаCCL-86) и Granta-519 (DSMZдоступа 342). В другом воплощении в настоящем изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, где антитело перекрестно конкурирует с эталонным антителом за связывание с CD70, где эталонное антитело (а) связывается с CD70 человека с KD 110-7 М или менее и (b) связывается с клетками опухолевой клеточной линии почечно-клеточной карциномы.-1 016186 В многочисленных воплощениях эталонное антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQ(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 6; или эталонное антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQ(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 7; или эталонное антитело включает:(а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQ(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 8; или эталонное антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQ(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 9; или эталонное антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQ(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 10. В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, включающим вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена VH 3-30.3 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с CD70. В настоящем изобретении также предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена VH 3-33 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается сCD70. В настоящем изобретении также предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена VH 4-61 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с CD70. В настоящем изобретении еще дополнительно предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена VK L6 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается сCD70. В настоящем изобретении еще дополнительно предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена VK L18 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с CD70. В настоящем изобретении дополнительно предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена VK L15 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с CD70. Предпочтительная комбинация включает:a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 11;b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 16;c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 21;d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 26;e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 31;f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 36. Другая предпочтительная комбинация включает:a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 12;b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 17;c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 22;d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 27;e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 32;f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 37. Другая предпочтительная комбинация включает:a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 13;b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 18;c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 23;d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 28;e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 33;f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 38. Другая предпочтительная комбинация включает:a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 14;b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 19;c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 24;d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 29;e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 34;f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 39. Другая предпочтительная комбинация включает:a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 15;b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 20;c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 25;d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 30;e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 35;f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 40. Другие предпочтительные антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки включают:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQ(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 6. Другая предпочтительная комбинация включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQ(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 7. Другая предпочтительная комбинация включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQ(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 8. Другая предпочтительная комбинация включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQ(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 9. Другая предпочтительная комбинация включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQ(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 10. Антитела по изобретению могут представлять собой, например, полноразмерные антитела, например антитела изотипа IgG1 или изотипа IgG4. В качестве альтернативы антитела могут представлять собой фрагменты антитела, такие как Fab- или Fab'2-фрагменты, или могут представлять собой одноцепочечные антитела. В изобретении также предлагается иммуноконъюгат, включающий антитело по изобретению или его антигенсвязывающий участок, связанные с терапевтическим агентом, таким как цитотоксин или радиоактивный изотоп. В изобретении также предлагается биспецифичная молекула, включающая антитело или его антигенсвязывающий участок по изобретению, связанные со вторым функциональным компонентом, обладающим специфичностью связывания, отличной от специфичности связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего участка. Также предлагаются композиции, включающие антитело либо его антигенсвязывающий участок,или иммуноконъюгат, или биспецифичную молекулу по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Также охвачены настоящим изобретением молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела или их антигенсвязывающие участки, а также экспрессирующие векторы, включающие такие нуклеиновые кислоты, также охвачены настоящим изобретением клетки-хозяева, включающие такие экспрессирующие векторы, и способы получения антител к CD70 с применением таких клеток-хозяев. Кроме того,в изобретении предлагается трансгенная мышь, включающая трансгены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека, где мышь экспрессирует антитело по изобретению, а также предлагаются гибридомы, полученные из такой мыши, где гибридома продуцирует антитело по изобретению.-3 016186 Еще в другом аспекте в изобретении предлагается способ лечения или предотвращения заболевания, которое характеризуется ростом опухолевых клеток, экспрессирующих CD70, включающий введение субъекту человеческого антитела к CD70 по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или предотвращения заболевания. Заболевание может представлять собой рак, например почечно-клеточную карциному или лимфому. Еще в другом аспекте в изобретении предлагается способ лечения аутоиммунного заболевания,включающий введение субъекту человеческого антитела к CD70 по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения аутоиммунного заболевания. Другие свойства и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и примеров, которые не должны быть истолкованы как ограничения изобретения. Содержание всех ссылок, записей Genbank, патентов и опубликованных патентных заявок, которые цитируются по всему настоящему описанию, с точностью введены в настоящее описание с помощью ссылки. Краткое описание чертежей На фиг. 1 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 41) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2 Н 5. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 11), CDR2 (SEQ ID NO: 16) и CDR3 (SEQ ID NO: 21) разграничены и указаны эмбриональные участки V и J. На фиг. 1 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 46) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 6) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2 Н 5. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 26), CDR2 (SEQ ID NO: 31) и CDR3 (SEQ ID NO: 36) разграничены и указаны эмбриональные участки V и J. На фиг. 2 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 42) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 10 В 4. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 12), CDR2 (SEQ ID NO: 17) и CDR3 (SEQ ID NO: 22) разграничены и указаны эмбриональные участки V, D и J. На фиг. 2 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 47) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела 10 В 4. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 27), CDR2 (SEQ ID NO: 32) и CDR3 (SEQ ID NO: 37) разграничены и указаны эмбриональные участки V и J. На фиг. 3 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 43) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 8 В 5. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 18) и CDR3 (SEQ ID NO: 23) разграничены и указаны эмбриональные участки V, D и J. На фиг. 3 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 48) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 8) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела 8 В 5. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 28), CDR2 (SEQ ID NO: 33) и CDR3 (SEQ ID NO: 38) разграничены и указаны эмбриональные участки V и J. На фиг. 4 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 44) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 18 Е 7. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 19) и CDR3 (SEQ ID NO: 24) разграничены и указаны эмбриональные участки V, D и J. На фиг. 4 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 49) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 9) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела 18 Е 7. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO: 34) и CDR3 (SEQ ID NO: 39) разграничены и указаны эмбриональные участки V и J. На фиг. 5 А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 45) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 5) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 69 А 7. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 20) и CDR3 (SEQ ID NO: 25) разграничены и указаны эмбриональные участки V, D и J. На фиг. 5 В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 50) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 10) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела 69 А 7. Участки CDR1 (SEQ ID NO: 30), CDR2 (SEQ ID NO: 35) и CDR3 (SEQ ID NO: 40) разграничены и указаны эмбриональные участки V и J. На фиг. 6 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антител 2 Н 5 и 10 В 4 с эмбриональной аминокислотной последовательностью VH 3-30.3 человека(SEQ ID NO: 51). На фиг. 7 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антител 8 В 5 и 18 Е 7 с эмбриональной аминокислотной последовательностью VH 3-33 (SEQ ID NO: 52). На фиг. 8 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела 69 А 7 с эмбриональной аминокислотной последовательностью VH 4-61 человека (SEQ ID-4 016186 На фиг. 9 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела 2 Н 5 с эмбриональной аминокислотной последовательностью VK L6 человека (SEQ ID NO: 54). На фиг. 10 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела 10 В 4 с эмбриональной аминокислотной последовательностью VK L18 человека (SEQ IDNO: 55). На фиг. 11 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи антител 8 В 5 и 18 Е 7 с эмбриональной аминокислотной последовательностью VK L15 человека (SEQID NO: 56). На фиг. 12 показано сравнение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела 69 А 7 с эмбриональной аминокислотной последовательностью VK L6 человека (SEQ IDNO: 54). На фиг. 13 показаны результаты экспериментов ELISA, демонстрирующие, что антитела противCD70 человека специфично связываются с CD70. На фиг. 14 показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческое моноклональное антитело 2 Н 5 против CD70 связывается с клетками клеточных линий почечно-клеточной карциномы. На фиг. 15 А, 15 В показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие,что человеческие моноклональные антитела против CD70 человека связываются с клетками клеточных линий почечно-клеточной карциномы (RCC) зависимым от концентрации антитела образом. (А) Клеточная линия RCC 786-O; (В) клеточная линия RCC A498. На фиг. 15 С показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела против CD70 человека связываются с клетками клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-O. На фиг. 15D показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческое моноклональное антитело (HumAb) 69 А 7 против CD70 человека связывается с клетками клеточных линий почечно-клеточной карциномы (RCC) зависимым от концентрации антитела образом. На фиг. 16 показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческое моноклональное антитело 2 Н 5 против CD70 связывается с клетками клеточных линий лимфомы человека. На фиг. 17 А, 17 В показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие,что человеческое моноклональное антитело 2 Н 5 против CD70 связывается с клетками клеточных линий лимфомы человека зависимым от концентрации антитела образом. (А) Клеточная линия лимфомы Raji;(В) клеточная линия лимфомы Granta-519. На фиг. 17 С показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела против CD70 человека связываются с клетками клеточной линии лимфомы Raji. На фиг. 17D показаны результаты экспериментов конкурентного анализа проточной цитометрии,демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела 2 Н 5 и 69 А 7 используют похожие эпитопы связывания. На фиг. 17 Е показаны результаты экспериментов проточной цитометрии, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела против CD70 человека связываются с клетками клеточной линии лимфомы Daudi и клеточной линии почечно-клеточной карциномы 786-O. На фиг. 18 показаны результаты экспериментов Hum-Zap интернализации, демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела против CD70 человека могут интернализоваться в CD70+ клетках. На фиг. 19 А-19 С показаны результаты анализов пролиферации клеток, демонстрирующие, что конъюгированные с токсином человеческие моноклональные антитела к CD70 убивают клетки клеточных линий почечно-клеточной карциномы (RCC). (A) Caki-2 RCC; (В) 786-O RCC; (С) ACHN RCC.Ha фиг. 20 А-20D показаны результаты анализов зависимой от антитела клеточной цитотоксичности(ADCC), демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела к CD70 убивают клетки клеточных линий лейкемии и лимфомы человека в зависимости от ADCC. (А) Клеточная линия лейкемииARH-77; (В) клеточная линия лимфомы HuT 78; (С) клеточная линия лимфомы Raji и (D) клеточная линия L-540, которая не экспрессирует CD70. На фиг. 21 показаны результаты анализа пролиферации клеток, демонстрирующие, что конъюгированные с токсином человеческие моноклональные антитела к CD70 убивают клетки клеточных линий лимфомы человека. На фиг. 22 А, 22 В показаны результаты анализов пролиферации клеток, демонстрирующие, что конъюгированные с токсином человеческие моноклональные антитела к CD70 проявляют цитотоксичность по отношению к клеткам Raji (А) при условии трехчасовой отмывки и (В) при условии продолжительной отмывки. На фиг. 23 А, 23 В показаны результаты in vivo исследования модели опухоли мыши, демонстри-5 016186 рующие, что обработка с помощью конъюгированного с токсином антитела к CD70, 2 Н 5, имеет непосредственный ингибирующий эффект на опухоли почечно-клеточной карциномы (RCC) in vivo. (А) Опухоли RCC А-498; (В) опухоли RCC ACHN. На фиг. 24 А-24F показаны результаты анализа зависимой от антитела клеточной цитотоксичности в(ADCC), демонстрирующие, что дефукозилированные человеческие моноклональные антитела к CD70 обладают увеличенной цитотоксичностью клеток по отношению к клеткам лейкемии в зависимости отADCC. (А) Клетки ARH-77; (В) клетки МЕС-1; (С) клетки МЕС-1, обработанные антителом к CD16; (D) клетки SU-DHL-6; (Е) клетки IM-9; (F) клетки HuT 78. На фиг. 25 показаны результаты анализа зависимой от антитела клеточной цитотоксичности(ADCC), демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела к CD70 убивают клетки лейкемии человека зависимым от ADCC образом. На фиг. 26 показаны результаты анализа зависимой от антитела клеточной цитотоксичности(ADCC), демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела к CD70 убивают клетки лейкемии человека зависимым от ADCC образом, но цитотоксичность зависит от CD16. На фиг. 27 показаны результаты анализа зависимой от антитела клеточной цитотоксичности(ADCC), демонстрирующие, что человеческие моноклональные антитела к CD70 убивают активированные Т-клетки человека, причем данный эффект является обратимым при добавлении антитела к CD16. На фиг. 28 показаны результаты блокирующего анализа, демонстрирующие, что некоторые человеческие моноклональные антитела к CD70 блокируют связывание CD70 с CD27, тогда как другие человеческие моноклональные антитела к CD70 не блокируют связывание CD70 с CD27. На фиг. 29 А, 29 В показаны результаты in vivo исследования модели опухоли мыши, демонстрирующие, что обработка с помощью изолированного антитела к CD70, 2 Н 5, имеет непосредственный ингибирующий эффект на опухоли лимфомы in vivo. (А) Опухоли Raji; (В) опухоли ARH-77. На фиг. 30 А-30 С показаны результаты in vivo исследования модели опухоли мыши, демонстрирующие, что обработка с помощью конъюгированного с токсином антитела к CD70, 2 Н 5, имеет непосредственный ингибирующий эффект на опухоли лимфомы in vivo. (А) Опухоли ARH-77; (В) опухолиGranta 519; (С) опухоли Raji. На фиг. 31 показаны результаты исследования, показывающего, что антитело к CD70, 69 А 7, перекрестно реагирует с CD70, который экспрессируется на CD70+ В-клетках клеточной линии лимфомы макаки резус. На фиг. 32 показаны результаты блокирующего анализа, демонстрирующие, что человеческое моноклональное антитело к CD70 блокирует связывание известного мышиного антитела к CD70 человека. На фиг. 33 А, 33 В показаны результаты обработки с помощью антитела к CD70 или с помощью нефукозилированной формы антитела. (А) Антитела к CD70 ингибируют стимулированную совместно сCD70 пролиферацию клеток зависимым от дозы антитела образом; (В) антитела к CD70 ингибируют стимулированную совместно с CD70 секрецию IFN- зависимым от дозы антитела образом. На фиг. 34 А-34 С показаны результаты обработки с помощью антитела к CD70 или с помощью нефукозилированной формы антитела клеток, стимулированных пептидом. (А) Антитела к CD70 ингибируют опосредованный пептидом рост CD8+ Т-клеток; (В) не наблюдалось значительного уменьшения общей выживаемости клеток; (С) не наблюдалось значительного уменьшения общего количества CD8+ клеток. На фиг. 35 показано, что эффект антител к CD70 на опосредованный пептидом рост CD8+ Т-клеток блокируется при добавлении антител к CD16. На фиг. 36 А, 36 В показаны результаты in vivo исследования модели опухоли мыши, демонстрирующие, что обработка с помощью конъюгированного с токсином антитела к CD70, 2 Н 5, имеет непосредственный ингибирующий эффект на опухоли почечно-клеточной карциномы in vivo. (А) Опухоли 786-O; (В) опухоли Caki-1.-6 016186 Подробное описание Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в особенности к человеческим моноклональным антителам, которые специфически связываются с CD70 с высокой степенью сродства. В определенных воплощениях антитела по изобретению выведены из конкретных эмбриональных последовательностей тяжелой и легкой цепей и/или включают конкретные структурные черты,такие как участки CDR, включающие конкретные аминокислотные последовательности. В настоящем изобретении предлагаются выделенные антитела, способы получения указанных антител, иммуноконъюгаты и биспецифичные молекулы, включающие указанные антитела, и предлагаются фармацевтические композиции, содержащие антитела, иммуноконъюгаты или биспецифичные молекулы по изобретению. Настоящее изобретение также относится к способам применения антител, таким способам, как лечение заболеваний, таких как рак. Для того чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, некоторым терминам были даны определения. Дополнительные определения представлены по тексту подробного описания."Путь сигнальной трансдукции" означает биохимическую связь между множеством молекул сигнальной трансдукции, которые играют роль в передаче сигнала от одного участка клетки к другому. Как применяется в настоящем описании, фраза "поверхностный клеточный рецептор" включает, например,молекулы и комплексы, способные получать сигнал и передавать указанный сигнал через плазматическую мембрану клетки. Примером "поверхностного клеточного рецептора" по настоящему изобретению является рецептор CD70. Термин "антитело", как обозначено здесь, включает цельные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. "антигенсвязывающий участок") или их одноцепочечные формы. "Антитело" означает гликопротеин, включающий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающий участок. Каждая тяжелая цепь включает вариабельный участок тяжелой цепи (обозначенный в настоящем описании как VH) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи включает три домена: СН 1, СН 2 и СН 3. Каждая легкая цепь включает вариабельный участок легкой цепи (обозначенный в настоящем описании как VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи включает один домен CL. Участки VH и VL могут быть дополнительно разделены на участки гипервариабельности, определенные как участки, определяющие комплементарность (CDR), перемежающиеся с участками, которые являются более консервативными, определенными как каркасные участки (FR). Каждый участок VH и VL включает три участка CDR и четыре участка FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные участки тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или с факторами, включающими разнообразные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент(C1q) классической системы комплемента. Термин "антигенсвязывающий участок" антитела (или "участок антитела"), как применяется в настоящем описании, означает один или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфического связывания с антигеном (например, CD70). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченные термином "антигенсвязывающий участок" антитела, включают (i) Fabфрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком на шарнирном участке; (iii) Fab'-фрагмент, который, по существу, представляет собой Fab с частью шарнирного участка(см. Fundamental Immunology (Paul ed., 3rd ed. 1993; (iv) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1;(v) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (vi) dAb-фрагмент (Ward et al.(1989), Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; (vii) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть объединены с применением рекомбинантных методов с помощью синтетического линкера, который дает им возможность существовать в виде одной белковой цепи, в которой участкиVL и VH спарены с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см.,например, Bird et al. (1988), Science 242:423-426; Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:58795883). Подразумевается также, что такие одноцепочечные антитела будут охвачены термином "антигенсвязывающий участок" антитела. Эти фрагменты антитела получают с применением подходящих методик, известных специалисту в данной области, и фрагменты скринируют на предмет их применимости таким же способом, как и интактные антитела. Подразумевается, что "выделенное антитело", как применяется в настоящем описании, означает антитело, которое, по существу, свободно от других антител, обладающих отличными антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфично связывается с CD70, является, по существу, свободным от антител, которые специфично связывают антигены, отличные от CD70). Выделенное антитело, которое специфично связывается с CD70, может, однако, иметь перекрестную реакци-7 016186 онноспособность по отношению к другим антигенам, таким как молекулы CD70 других видов. В определенных воплощениях выделенное антитело специфично связывается с CD70 человека и не реагирует перекрестно с другими, нечеловеческими антигенами CD70. Кроме того, выделенное антитело может быть,по существу, свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ. Термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела", как применяется в настоящем описании, означает препарат молекул антитела одной молекулярной композиции. Композиция моноклонального антитела проявляет одну связывающую специфичность и сродство для конкретного эпитопа. Подразумевается, что термин "человеческое антитело", как применяется в настоящем описании,включает антитела, имеющие вариабельные участки, в которых оба участка - каркасный и CDR выведены из эмбриональных иммуноглобулиновых последовательностей человека. Кроме того, если антитело содержит константный участок, то он также выведен из эмбриональных иммуноглобулиновых последовательностей человека. Человеческие антитела могут включать поздние модификации, включающие природные или синтетические модификации. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, которые не кодируются эмбриональными иммуноглобулиновыми последовательностями человека (например, мутации, вводимые путем случайного или сайтспецифического мутагенеза in vitro или путем соматической мутации in vivo). Однако подразумевается,что термин "человеческое антитело", как применяется в настоящем описании, не включает антитела, в которых последовательности CDR, выделенные из эмбрионального источника других видов млекопитающих, таких как мышь, были пересажены на человеческие каркасные последовательности. Термин "человеческое моноклональное антитело" означает антитела, проявляющие одну связывающую специфичность, которые имеют вариабельные участки, в которых оба участка - каркасный иCDR - выделены из эмбриональных иммуноглобулиновых последовательностей человека. В одном воплощении человеческие моноклональные антитела получают с помощью гибридомы, которая включает иммортализованную клетку, образующую гибрид с В-клеткой, полученной из трансгенного животного,отличного от человека, например из трансгенной мыши, имеющей геном, включающий трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи. Термин "рекомбинантное человеческое антитело", как применяется в настоящем описании, включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным для иммуноглобулиновых генов человека, или полученная из них гибридома (описано дополнительно ниже); (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии человеческого антитела,например,из трасфектомы;(с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител;(d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами,которые включают сплайсинг последовательностей иммуноглобулиновых генов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные участки, в которых каркасный и CDR-участки выделены из эмбриональных иммуноглобулиновых последовательностей человека. Однако в определенных воплощениях такие рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвергнуты in vitro мутагенезу (или in vivo соматическому мутагенезу, когда применяется трансгенное животное для последовательностей Ig человека) и, таким образом, аминокислотные последовательности участков VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи выделенными из эмбриональных последовательностей VH и VL человека и являясь им родственными, не могут в естественных условиях существовать в эмбриональном наборе антител человека in vivo. Как применяется в настоящем описании, "изотип" означает класс антитела (например, IgM илиIgG1), который кодируется константными участками генов тяжелой цепи. Фразы "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфичное для антигена", применяются в настоящем описании взаимозаменяемо с термином "антитело, которое специфично связывается с антигеном". Термин "модификации человеческого антитела" означает любую модифицированную форму человеческого антитела, например конъюгат антитела, с другим агентом или антителом. Подразумевается, что термин "гуманизированное антитело" означает антитела, в которых CDR последовательности, выведенные из эмбриональных источников других видов млекопитающих, таких как мышь, были пересажены на человеческие каркасные последовательности. Дополнительные модификации каркасного участка могут быть произведены внутри каркасных последовательностей человека. Подразумевается, что термин "химерное антитело" означает антитела, в которых последовательности вариабельного участка выведены из одного вида, а последовательности константного участка выведены из другого вида, такие антитела, как антитело, в котором последовательности вариабельного участка выделены из мышиного антитела, а последовательности константного участка выделены из человеческого антитела. Как применяется в настоящем описании, подразумевается, что антитело, которое "специфично свя-8 016186 зывается с CD70 человека", означает антитело, которое связывается с CD70 человека с KD 510-8 М или менее, более предпочтительно 110-8 М или менее, более предпочтительно 610-9 М или менее, более предпочтительно 310-9 М или менее, еще более предпочтительно 2109 М или менее. Подразумевается, что термин "Kassoc" или "Ka", как применяется в настоящем описании, означает скорость ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как подразумевается, что термин "Kdis" или "Kd", как применяется в настоящем описании, означает скорость диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Подразумевается, что термин "KD", как применяется в настоящем описании, означает константу диссоциации, которая получается из отношения Kd к Ka (т.е. Kd/Ka) и выражается в виде молярной концентрации (М). Значения KD для антител могут быть определены с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Предпочтительным способом для определения KD антитела является способ с применением плазмонного резонанса, предпочтительно с применением такой биосенсорной системы, как система Biacore. Как применяется в настоящем описании, термин "высокое сродство" для IgG антитела означает антитело, имеющее KD 10-7 М или менее, более предпочтительно 10-8 М или менее, более предпочтительно 10-9 М или менее и еще более предпочтительно 10-10 М или менее для антигена мишени. Однако "высокое сродство" связывания может варьироваться для других изотипов антител. Например, "высокое сродство" связывания для IgM изотипа означает антитело, имеющее KD 10-7 М или менее, более предпочтительно 10-8 М или менее, еще более предпочтительно 10-9 М или менее. Как применяется в настоящем описании, термин "субъект" включает любое животное, включая человека и отличное от человека. Термин "отличное от человека животное" включает всех позвоночных,например млекопитающих и немлекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овцы, собаки,кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рыба, рептилии и т.д. Различные аспекты изобретения описаны в дополнительных подробностях в следующих подразделах. Антитела к CD70. Антитела по изобретению характеризуются конкретными функциональными чертами или свойствами антител. Например, антитела специфически связываются с CD70 человека. Предпочтительно антитело по изобретению связывается с CD70 с высокой степенью сродства, например с KD 510-7 М или менее, еще более предпочтительно 5,510-9 или менее, еще более предпочтительно 310-9 или менее, еще более предпочтительно 210-9 или менее или еще более предпочтительно 1,510-9 или менее. Стандартные анализы для оценки способности связывания антител с CD70 известны из уровня техники, включают, например, ELISA, Western-блоттинг и RIA. Подходящие анализы подробно описаны в примерах. Кинетику связывания (например, сродство связывания) антител также оценивают с помощью стандартных анализов, известных из уровня техники, таких как ELISA, Scatchard и Biacore. В качестве другого примера антитела по настоящему изобретению могут связываться с клетками опухолевой клеточной линии почечно-клеточной карциномы, например с клеточными линиями 786-O, А-498, ACHN, Caki-1 или Caki2. В качестве еще одного другого примера антитела по настоящему изобретению могут связываться с клетками опухолевой клеточной линии В-клеток, например с клеточными линиями Daudi, HuT 78, Raji или Granta-519. Моноклональные антитела 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7. Взятые для примера антитела по изобретению включают человеческие моноклональные антитела 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7, выделенные и структурно охарактеризованные, как описано в примерах 1 и 2. Аминокислотные последовательности VH из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7 показаны в SEQ ID NO: 1, 2,3, 4 и 5 соответственно. Аминокислотные последовательности VL из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7 показаны в SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 и 10 соответственно. Поскольку каждое из этих антител может связываться с CD70, VH- и VL-последовательности могут быть "перемешаны и подобраны" для создания других молекул по изобретению, связывающихся с CD70. Связывание с CD70 таких "смешанных и подобранных" антител может быть протестировано с применением анализов связывания, описанных выше и в примерах (например, FACS или ELISA). Предпочтительно, когда VH- и VL-цепи смешивают и подбирают, VH-последовательность из конкретной пары VH/VL заменяется структурно подобной VH-последовательностью. Подобным образом, предпочтительно VLпоследовательность из конкретной пары VH/VL заменяется структурно подобной VLпоследовательностью. Соответственно в одном аспекте в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие:(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5; и(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 и 10; где антитело специфично связывается с-9 016186 Предпочтительные комбинации тяжелой и легкой цепей включают:(а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 1; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из(а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 2; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из(а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 3; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из(а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 4; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность из(а) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность из SEQID NO: 5; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность изSEQ ID NO: 10. В другом аспекте в изобретении предлагаются антитела, которые включают участки CDR1, CDR2 иCDR3 тяжелой цепи и легкой цепи из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7 или их комбинации. Аминокислотные последовательности VH CDR1 из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7 показаны в SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14 и 15 соответственно. Аминокислотные последовательности VH CDR2 из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7 показаны в SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19 и 20 соответственно. Аминокислотные последовательности VH CDR3 из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7 показаны в SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 и 25 соответственно. Аминокислотные последовательности VK CDR1 из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7 показаны в SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 и 30 соответственно. Аминокислотные последовательности VK CDR2 из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7 показаны в SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34 и 35 соответственно. Аминокислотные последовательности VKCDR3 из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7 показаны в SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39 и 40 соответственно. CDR участки разделены с применением системы Kabat (Kabat, E.A., et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication913242). Поскольку каждое из этих антител может связываться с CD70 и специфичность связывания с антигеном обеспечивается главным образом участками CDR1, CDR2 и CDR3, последовательности VH CDR1,CDR2 и CDR3 и последовательности VK CDR1, CDR2 и CDR3 могут быть "смешаны и подобраны" (т.е.CDR из различных антител могут быть смешаны и подобраны, хотя каждое антитело должно содержатьVH CDR1, CDR2 и CDR3 и VK CDR1, CDR2 и CDR3) для создания других анти-CD70 связывающих молекул по изобретению. Связывание с CD70 таких "смешанных и подобранных" антител может быть протестировано с применением анализов, описанных выше и в примерах (например, анализы FACS, ELISA,Biacore). Предпочтительно, когда VH CDR последовательности смешивают и подбирают, CDR1, CDR2 и/или CDR3 последовательность из конкретной VH-последовательности заменяется структурно подобнойCDR последовательностью. Подобным образом, когда VK CDR последовательности смешивают и подбирают, CDR1, CDR2 и/или CDR3 последовательность из конкретной VK-последовательности заменяется структурно подобной CDR последовательностью. Будет совершенно очевидно специалисту в данной области, что новые VH- и VL-последовательности могут быть созданы путем замены одной или более последовательностям участка VH и/или VL CDR на структурно подобные последовательности из CDR последовательностей, описанных в настоящем описании для моноклональных антител 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5,18 Е 7 и 69 А 7. Соответственно в другом аспекте в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, включающие:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-15;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16-20;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-25;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-30;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31-35;(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 36-40; где антитело специфично связывается с CD70, предпочтительно с CD70 человека. В предпочтительном воплощении антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 11;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 16;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 21;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 26;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 31;(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 36. В другом предпочтительном воплощении антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 12;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 17;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 22;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 27;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 32;(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 37. В другом предпочтительном воплощении антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 13;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 18;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 23;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 28;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 33;(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 38. В другом предпочтительном воплощении антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 14;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 19;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 24;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 29;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 34;(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 39. В другом предпочтительном воплощении антитело включает:(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 15;(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 20;(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 25;(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SEQ ID NO: 30;(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий SEQ ID NO: 35;(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, включающий SEQ ID NO: 40. Хорошо известно из уровня техники, что CDR3 домен сам по себе, независимо от CDR1 и/илиCDR2 домена(ов), может определять специфичность связывания антитела для родственного антигена и что, как и ожидалось, могут быть получены многочисленные антитела, обладающие такой же специфичностью связывания, основанной на обычной CDR3 последовательности. См., например, Klimka et al.,British J. of Cancer 83(2): 252-260 (2000) (описание получения гуманизированного антитела к CD30 с применением только вариабельного домена тяжелой цепи CDR3 мышиного антитела Ki-4 к CD30); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (описание рекомбинантных антител к эпителиальному гликопротеину-2 (EGP-2) с применением только CDR3 последовательности тяжелой цепи родительского мышиного антитела МОС-31 к EGP-2); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:8910-8915 (1998) (описание панели гуманизированных антител к интегрину v3 с применением вариабельного домена CDR3 тяжелой и легкой цепей мышиного антитела LM609 к интегрину v3, где каждый член из панели антител включает отдельную последовательность вне CDR3 домена и способен связывать тот же эпитоп, что и родительское мышиное антитело с высокой степенью сродства или с более высокой степенью сродства,чем родительское мышиное антитело); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (описание того, что CDR3 домен обеспечивает наиболее значительный вклад в связывание с антигеном); Barbas etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:2529-2533 (1995) (описание пересадки CDR3 последовательностей тяжелой цепи из трех Fab (SI-1, SI-40 и SI-32) против человеческой плацентарной ДНК на тяжелую цепьFab к анатоксину столбняка, таким образом заменяя существующий домен CDR3 тяжелой цепи и демонстрируя, что CDR3 домен сам по себе отвечает за специфичность связывания); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (описание исследований по пересадке, где переноса только домена CDR3 тяжелой цепи родительского полиспецифичного Fab LNA3 на тяжелую цепь моноспецифичного IgG Fab p313 антитела, связывающего анатоксин столбняка, было достаточно для сохранения специфичности связывания родительского Fab). Каждая из этих ссылок введена в настоящее описание полностью с помощью ссылки. Соответственно в настоящем изобретении предлагаются моноклональные антитела, включающие один или более CDR3 домен(ов) тяжелой и/или легкой цепи из антитела, выделенного из человека или из животного, отличного от человека, где моноклональное антитело способно специфично связываться сCD70. В определенных аспектах в настоящем изобретении предлагаются моноклональные антитела,- 11016186 включающие один или более CDR3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из антитела животного, отличного от человека, такие как мышиное или крысиное антитело, где моноклональное антитело способно специфично связываться с CD70. В некоторых воплощениях указанные антитела по изобретению, включающие один или более CDR3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из антитела животного, отличного от человека, (а) способны конкурировать за связывание с антигеном; (b) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом и/или (d) имеют сродство связывания как у соответствующего родительского антитела из отличного от человека животного. В других аспектах в настоящем изобретении предлагаются моноклональные антитела, включающие один или более CDR3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из человеческого антитела, такого как, например, человеческое антитело, полученное из животного, отличного от человека, где человеческое антитело способно специфично связываться с CD70. В других аспектах в настоящем изобретении предлагаются моноклональные антитела, включающие один или более CDR3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела, такого как, например, человеческое антитело, полученное из животного, отличного от человека, где первое человеческое антитело способно специфично связываться с CD70 и где CDR3 домен из первого человеческого антитела заменяет CDR3 домен в человеческом антителе, которое лишено специфичности связывания с CD70, с получением второго человеческого антитела, которое способно специфично связываться с CD70. В некоторых воплощениях указанные антитела по изобретению, включающие один или более CDR3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела, (а) способны конкурировать за связывание с антигеном; (b) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом и/или (d) имеют сродство связывания как у соответствующего родительского первого человеческого антитела. Антитела, имеющие конкретные эмбриональные последовательности. В определенных воплощениях антитело по изобретению включает вариабельный участок тяжелой цепи из конкретного эмбрионального иммуноглобулинового гена тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи из конкретного эмбрионального иммуноглобулинового гена легкой цепи. Например, в предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи,который представляет собой продукт гена VH 3-30.3 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с CD70. В другом предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена VH 3-33 человека или выделен из него,где антитело специфично связывается с CD70. В другом предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена VH 4-61 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с CD70. В другом предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена VK L6 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с CD70. В другом предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена VK L18 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается с CD70. В другом предпочтительном воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена VK L15 человека или выделен из него, где антитело специфично связывается сCD70. Еще в одном другом воплощении в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, где антитело:(а) включает вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт гена VH 330.3, 3-33 или 4-61 человека или выделен из них (эти гены кодируют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 51, 52 и 53 соответственно);(b) включает вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт гена VK L6,L18 или L15 человека или выделен из них (эти гены кодируют аминокислотные последовательности,представленные в SEQ ID NO: 54, 55 и 56 соответственно);(c) антитело специфично связывается с CD70. Примером антитела, имеющего VH и VK из VH 3-30.3 и VK L6 соответственно, является 2 Н 5. Примером антитела, имеющего VH и VK из VH 3-30.3 и VK L18 соответственно, является 10 В 4. Примерами антител, имеющих VH и VK из VH 3-33 и VK L15 соответственно, являются 8 В 5 и 18 Е 7. Примером антитела,имеющего VH и VK из VH 4-61 и VK L6 соответственно, является 69 А 7. Как применяется в настоящем описании, человеческое антитело включает вариабельные участки тяжелой или легкой цепи, которое является "продуктом" или "выведено из" конкретной эмбриональной последовательности, если вариабельные участки антитела получены из системы, в которой применяются эмбриональные иммуноглобулиновые гены человека. Такие системы включают иммунизацию трансген- 12016186 ной мыши, несущей иммуноглобулиновые гены человека, с помощью интересующего антигена, или указанные системы включают скрининг библиотеки фагового дисплея иммуноглобулиновых генов человека с помощью интересующего антигена. Человеческое антитело, которое является "продуктом" или "выведено из" эмбриональной последовательности иммуноглобулина человека, может быть идентифицировано, по существу, путем сравнения аминокислотной последовательности человеческого антитела с аминокислотными последовательностями эмбриональных иммуноглобулинов человека и путем селекции эмбриональной последовательности иммуноглобулина человека, которая является ближайшей по последовательности (т.е. с наибольшим процентом идентичности) с последовательностью человеческого антитела. Человеческое антитело, которое является "продуктом" или "выведено из" конкретной эмбриональной последовательности иммуноглобулина человека, может содержать аминокислотные отличия по отношению к эмбриональной последовательности, благодаря, например, природным соматическим мутациям или намеренному введению сайт-направленной мутации. Однако селектированное человеческое антитело обычно по меньшей мере на 90% идентично по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой эмбриональным геном иммуноглобулина человека, и содержит аминокислотные остатки, по которым человеческое антитело идентифицируют как человеческое при сравнении с эмбриональными аминокислотными последовательностями иммуноглобулина из других видов (например, мышиными эмбриональными последовательностями). В определенных случаях человеческое антитело может быть по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентично по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой эмбриональным геном иммуноглобулина. Обычно человеческое антитело, выделенное из конкретной эмбриональной последовательности человека, проявляет не более чем 10 аминокислотных отличий от аминокислотной последовательности, кодируемой эмбриональным геном иммуноглобулина человека. В определенных случаях человеческое антитело может проявлять не более чем 5 или даже не более чем 4,3, 2 или 1 аминокислотное отличие от аминокислотной последовательности, кодируемой эмбриональным геном иммуноглобулина. Гомологичные антитела. Еще в одном другом воплощении антитело по изобретению включает вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включающие аминокислотные последовательности, которые являются гомологичными аминокислотным последовательностям предпочтительных антител, описанных в настоящем описании, и где антитела сохраняют желательные функциональные свойства антител к CD70 по изобретению. Например, в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, где:(a) вариабельный участок тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% гомологичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-5;(b) вариабельный участок легкой цепи включает аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% гомологичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-10;(c) антитело специфично связывается с CD70. В других воплощениях аминокислотные последовательности VH и/или VL могут быть на 85, 90, 95,96, 97, 98 или на 99% гомологичны последовательностям, представленным выше. Антитело, имеющееVH- и VL-участки, имеющее высокую (т.е. 80% или больше) гомологию с VH- и VL-участками последовательностей, представленных выше, может быть получено путем мутагенеза (например, сайтнаправленного или опосредованного ПЦР мутагенеза) молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих SEQID NO: 41-50, с последующим тестированием кодируемых измененными последовательностями антител на сохранившуюся функцию (т.е. связывание с CD70 человека с KD 510-8 М или менее) с применением функциональных анализов, описанных в настоящем изобретении. Как применяется в настоящем описании, процент гомологии между двумя аминокислотными последовательностями является эквивалентным проценту идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от количества идентичных положений, разделяемых последовательностями (т.е. % homology =количество идентичных положений/общее количествоположений 100), принимая во внимание количество пропусков и размер каждого пропуска, которые необходимо вводить для оптимального сравнения двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с применением математического алгоритма, как описано ниже в не ограничивающих изобретение примерах. Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с применением алгоритма Е. Meyers и W. Miller (Comput, Appl. Biosci., 4:11-17 (1988, который вводится в программу ALIGN (версия 2.0), использующей таблицу весового остатка РАМ 120, штраф на- 13016186 длину пропуска - 12 и штраф на пропуск - 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с применением алгоритма Needleman и WunschGCG (доступного на http://www.gcg.com), использующего матрицу Blossum 62 или матрицу РАМ 250 и размер пропуска 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и размер длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Дополнительно или альтернативно, белковые последовательности по настоящему изобретению могут дополнительно применяться в качестве "входной последовательности" для осуществления поиска против общедоступной базы данных, например для идентификации родственных последовательностей. Такие поиски осуществляются с применением программы XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al. (1990), J.Mol. Biol. 215:403-10. BLAST поиски по белку могут быть осуществлены с помощью программыXBLAST, счет равен 50, размер слова равен 3, для получения аминокислотных последовательностей,гомологичных молекулам антител по изобретению. Для целей сравнения может быть применен GappedBLAST для получения сравнений, содержащих пропуски, как описано у Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При применении программ BLAST и Gapped BLAST могут использоваться стандартные параметры соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Антитела с консервативными модификациями. В определенных воплощениях антитело по изобретению включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельный участок легкой цепи,включающий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где одна или более из этих CDR последовательностей включает определенные аминокислотные последовательности, основанные на предпочтительных антителах, описанных в настоящем описании (например, 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 или 69 А 7), или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют желательные функциональные свойства антител кCD70 по изобретению. Соответственно в изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, включающие вариабельный участок тяжелой цепи, включающий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельный участок легкой цепи, включающий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где:(a) последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID(b) последовательность вариабельного участка легкой цепи CDR3 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID(c) антитело специфично связывается с CD70. В предпочтительном воплощении последовательность CDR2 вариабельного участка тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO: 16-20 и их консервативных модификаций; и последовательностьCDR2 вариабельного участка легкой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO: 31-35 и их консервативных модификаций. В другом предпочтительном воплощении последовательность CDR1 вариабельного участка тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO: 11-15 и их консервативных модификаций; и последовательность CDR1 вариабельного участка легкой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO: 26-30 и их консервативных модификаций. Подразумевается, что термин "консервативные модификации последовательности", как применяется в настоящем описании, означает аминокислотные модификации, которые не оказывают значительного влияния на характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность,или не изменяют их. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, вставки или делеции. Модификации могут вводиться в антитело по изобретению с помощью стандартных методик, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез или опосредованный ПЦР мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой те, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим подобную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи, определены из уровня техники. Эти семейства включают боковые цепи со свойствами основания (например, лизин, аргинин, гистидин), боковые цепи со свойствами кислоты (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин,метионин), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков внутри CDR участков антитела по изобретению могут быть заменены другими аминокислотными остатками из того же семейства боковой цепи, и измененное антитело может быть- 14016186 протестировано на сохранившуюся функцию (т.е. функцию, представленную в (с с применением функциональных анализов, описанных в настоящем описании. Антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и антитела к CD70 по изобретению. В другом воплощении в изобретении предлагаются антитела, которые связываются с тем же эпитопом на CD70 человека, как и любое из моноклональных антител к CD70 по изобретению (т.е. антитела,которые способны перекрестно конкурировать за связывание с CD70 с любым из моноклональных антител по изобретению). В предпочтительных воплощениях эталонное антитело для исследований перекрестной конкуренции может представлять собой моноклональное антитело 2 Н 5 (имеющее VH- и VLпоследовательности, как показано в SEQ ID NO: 1 и 6 соответственно), или моноклональное антитело 10 В 4 (имеющее VH- и VL-последовательности, как показано в SEQ ID NO: 2 и 7 соответственно), или моноклональное антитело 8 В 5 (имеющее VH- и VL-последовательности, как показано в SEQ ID NO: 3 и 8 соответственно), или моноклональное антитело 18 Е 7 (имеющее VH- и VL-последовательности, как показано в SEQ ID NO: 4 и 9 соответственно), или моноклональное антитело 69 А 7 (имеющее VH- и VLпоследовательности, как показано в SEQ ID NO: 5 и 10 соответственно). Такие перекрестно конкурирующие антитела могут быть идентифицированы на основе их способности перекрестно конкурировать с 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 или 69 А 7 в стандартных анализах на связывание с CD70. Например, анализBIAcore, анализ ELISA или проточная цитометрия могут быть применены для того, чтобы продемонстрировать перекрестную конкуренцию с антителами по настоящему изобретению. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание, например, 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 или 69 А 7 с CD70 человека демонстрирует, что тестируемое антитело может конкурировать с 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 или 69 А 7 за связывание с CD70 человека, и, таким образом, связывается с тем же эпитопом на CD70 человека, что и 2 Н 5,10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 или 69 А 7. В предпочтительном воплощении антитело, которое связывается с тем же эпитопом на CD70 человека, что и 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 или 69 А 7, является человеческим моноклональным антителом. Такие человеческие моноклональные антитела могут быть получены и выделены, как описано в примерах. Сконструированные и модифицированные антитела. Антитело по изобретению дополнительно может быть получено с применением антитела, имеющего одну или более VH- и/или VL-последовательностей, описанных в настоящем описании, в качестве стартового материала для конструирования модифицированного антитела, которое может иметь измененные свойства по сравнению со стартовым антителом. Антитело может быть сконструировано путем модификации одного или более остатков внутри одного или обоих вариабельных участков (т.е. VH и/илиVL), например, внутри одного или более CDR участков и/или внутри одного или более каркасных участков. Дополнительно или альтернативно, антитело может быть сконструировано путем модификации остатков внутри константного(ых) участка(ов), например, для изменения эффекторной(ых) функции(й) антитела. Один тип конструкции вариабельного участка, которая может быть осуществлена, представляет собой пересадку CDR. Антитела взаимодействуют с антигенами мишенями преимущественно через аминокислотные остатки, которые расположены в шести участках тяжелой и легкой цепей, определяющих комплементарность (CDR). По этой причине аминокислотные последовательности внутри CDR являются более разнотипными между индивидуальными антителами, чем последовательности вне CDR. ПосколькуCDR последовательности ответственны за большинство взаимодействий антитело-антиген, то возможно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител, путем конструкции экспрессирующих векторов, которые включают CDR последовательности из специфического природного антитела, пересаженные на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann, L. et al. (1998), Nature 332:323-327; Jones, P. et al.(1986), Nature 321:522-525: Queen, С. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sie. USA, 86:10029-10033; US патент 5225539, Winter и US патенты 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, Queen et al.). Соответственно другое воплощение изобретения относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, включающим вариабельный участок тяжелой цепи, включающий CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности, включающие аминокислотную последовательность,выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-15, SEQ ID NO: 16-20 и SEQ ID NO: 21-25 соответственно, и вариабельный участок легкой цепи, включающий CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности,включающие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2630, SEQ ID NO: 31-35 и SEQ ID NO: 36-40 соответственно. Таким образом, такие антитела содержат VH иVL CDR последовательности моноклональных антител 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 или 69 А 7, при этом могут содержать различные каркасные последовательности из этих антител. Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или из опубликованных ссылок, которые включают эмбриональные последовательности генов антител. Например, эмбриональные последовательности ДНК для генов вариабельного участка тяжелой и легкой цепей можно обнаружить в "VBase", базе данных эмбриональных последовательностей человека (доступной в сети Интернет по адресу www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также у Kabat, E.A., et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services,- 15016186in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание каждой из статей в точности введено в настоящее описание с помощью ссылки. В качестве другого примера эмбриональные последовательности ДНК для генов вариабельного участка тяжелой и легкой цепей человека можно обнаружить в базе данных Genbank. Например, следующие эмбриональные последовательности тяжелой цепи, обнаруженные у мыши вHumAb HCo7, являются доступными в Genbank и сопровождаются присвоенными номерами Genbank: 169 (NG0010109, NT024637 и ВС 070333), 3-33 (NG0010109 и NT024637) и 3-7 (NG0010109 иNT024637). В качестве другого примера следующие эмбриональные последовательности тяжелой цепи,обнаруженные у мыши в HumAb НСо 12, являются доступными в Genbank и сопровождаются присвоенными номерами Genbank: 1-69 (NG0010109, NT024637 и ВС 070333), 5-51 (NG0010109 и NT024637),4-34 (NG0010109 и NT024637), 3-30.3 (CAJ556644) и 3-23 (AJ406678). Предпочтительными каркасными последовательностями для применения в антителах по изобретению являются те, что структурно подобны каркасным последовательностям, применяемым в выбранных антителах по изобретению, например подобны VH 3-30.3 каркасным последовательностям (SEQ ID NO: 51), и/или VH 3-33 каркасным последовательностям (SEQ ID NO: 52), и/или VH 4-61 каркасным последовательностям (SEQ ID NO: 53), и/или VK L6 каркасным последовательностям (SEQ ID NO: 54), и/или VK(SEQ ID NO: 56), применяемым предпочтительными антителами по изобретению. VH CDR1, CDR2 иCDR3 последовательности и VK CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности могут быть пересажены на каркасные участки, которые имеют идентичные последовательности тем, что обнаружены у эмбрионального гена иммуноглобулина, из которого каркасная последовательность выделена, или CDR последовательности могут быть пересажены на каркасные участки, которые содержат одну или более мутаций по сравнению с эмбриональными последовательностями. Например, было обнаружено, что в некоторых случаях бывает полезно вводить мутации в остатки внутри каркасных участков для поддержания или усиления антигенсвязывающей способности антитела (см., например, US патенты 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 Queen et at). Другой тип модификации вариабельного участка представляет собой мутации аминокислотных остатков внутри VH и/или VK CDR1, CDR2 и/или CDR3 участков с тем, чтобы таким образом улучшить связывающие свойства (например, сродство) интересующего антитела. Может быть осуществлен сайтнаправленный мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез для введения мутации(й), и с помощью invitro или in vivo анализов, как описано в настоящем описании и предлагается в примерах, можно оценить эффект мутации на связывание антитела или другое интересующее функциональное свойство. Предпочтительно вводят консервативные модификации (как обсуждалось выше). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены, вставки или делеции, но предпочтительно замены. Кроме того, обычно внутри CDR участка изменено не более одного, двух, трех, четырех или пяти остатков. Соответственно в другом воплощении в изобретении предлагаются выделенные моноклональные антитела к CD70 или их антигенсвязывающие участки, включающие вариабельной участок тяжелой цепи, включающий (a) VH CDR1 участок, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-15, или включающий аминокислотную последовательность,имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению сSEQ ID NO: 11-15; (b) VH CDR2 участок, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16-20, или включающий аминокислотную последовательность,имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению сSEQ ID NO: 16-20; (с) VH CDR3 участок, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-25, или включающий аминокислотную последовательность,имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению сSEQ ID NO: 21-25; (d) VK CDR1 участок, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-30, или включающий аминокислотную последовательность,имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению сSEQ ID NO: 26-30; (е) VK CDR2 участок, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31-35, или включающий аминокислотную последовательность,имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению сSEQ ID NO: 31-35; и (f) VK CDR3 участок, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 36-40, или включающий аминокислотную последовательность,имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению сSEQ ID NO: 36-40. Сконструированные антитела по изобретению включают те, в которых были произведены модификации на остатках каркасного участка в VH и/или VK, например, для улучшения свойств антитела. Обычно такие модификации каркасного участка производят для уменьшения иммуногенности антитела. Например, один из способов представляет собой "обратную мутацию" одного или более остатков каркасно- 16016186 го участка до соответствующей эмбриональной последовательности. Более конкретно, антитело, которое было подвергнуто соматической мутации, может содержать остатки каркасного участка, которые отличаются от эмбриональной последовательности, из которой выделено антитело. Такие остатки могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей каркасного участка антитела с эмбриональными последовательностями, из которых выделено антитело. Подразумевается, что такие антитела с "обратными мутациями" охвачены изобретением. Например, для 10 В 4 аминокислотный остаток 2 (внутриFR1) из VH представляет собой изолейцин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности VH 3-30.3 представляет собой валин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, соматические мутации могут быть подвергнуты "обратной мутации" до эмбриональной последовательности с помощью, например, сайт-направленного мутагенеза или ПЦР-опосредованного мутагенеза (например, остаток 2 из FR1 VH 10B4 может быть подвергнут "обратной мутации" из изолейцина в валин). В качестве другого примера для 10 В 4 аминокислотный остаток 30 (внутри FR1) из VH представляет собой глицин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности VH 330.3 представляет собой серин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 30 из FR1 VH 10B4 может быть подвергнут "обратной мутации" из глицина в серин. В качестве другого примера для 8 В 5 аминокислотный остаток 24 (внутри FR1) из VH представляет собой треонин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности VH 3-33 представляет собой аланин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 24 из FR1 VH 8B5 может быть подвергнут "обратной мутации" из треонина в аланин. В качестве другого примера для 8 В 5 аминокислотный остаток 77 (внутри FR3) из VH представляет собой лизин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности VH 3-33 представляет собой аспарагин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 11 из FR3 VH 8B5 может быть подвергнут "обратной мутации" из лизина в аспарагин. В качестве другого примера для 8 В 5 аминокислотный остаток 80 (внутри FR3) из VH представляет собой серин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности VH 3-33 представляет собой тирозин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 14 из FR3 VH 8B5 может быть подвергнут "обратной мутации" из серина в тирозин. В качестве другого примера для 69 А 7 аминокислотный остаток 50 (внутри FR2) из VH представляет собой лейцин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности VH 4-61 представляет собой изолейцин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 13 из FR2 VH 69A7 может быть подвергнут "обратной мутации" из лейцина в изолейцин. В качестве другого примера для 69 А 7 аминокислотный остаток 85 (внутри FR3) из VH представляет собой аргинин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности VH 4-61 представляет собой серин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 18 из FR3 VH 69A7 может быть подвергнут "обратной мутации" из аргинина в серин. В качестве другого примера для 69 А 7 аминокислотный остаток 89 (внутри FR3) из VH представляет собой треонин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности VH 4-61 представляет собой аланин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 22 из FR3 VH 69A7 может быть подвергнут "обратной мутации" из треонина в аланин. В качестве другого примера для 10 В 4 аминокислотный остаток 46 (внутри FR2) из VL представляет собой фенилаланин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности VLL18 представляет собой лейцин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 12 из FR2 VL 10B4 может быть подвергнут "обратной мутации" из фенилаланина в лейцин. В качестве другого примера для 69 А 7 аминокислотный остаток 49 (внутри FR2) из VL представляет собой фенилаланин, тогда как этот остаток в соответствующей эмбриональной последовательности VLL6 представляет собой тирозин. Чтобы вернуть последовательности каркасного участка к их эмбриональной конфигурации, например, остаток 15 из FR2 VL 69A7 может быть подвергнут "обратной мутации" из фенилаланина в тирозин. Другой тип модификаций каркасного участка включает мутирование одного или более остатков внутри каркасного участка или даже внутри одного или более CDR участков с удалением Т-клеточных эпитопов с тем, чтобы таким образом уменьшить потенциальную иммуногенность антитела. Этот способ также обозначается как "деиммунизация" и описан в дополнительных подробностях в US публикации патента 20030153043, Carr et al.- 17016186 Сконструированные антитела по изобретению также включают те антитела, в которых были произведены модификации аминокислотных остатков для увеличения или уменьшения иммуногенных ответов через аминокислотные модификации, которые изменяют взаимодействие Т-клеточного эпитопа на антителе (см., например, US патенты 6835550, 6897049 и 6936249). Дополнительно или альтернативно, модификациям, произведенным внутри каркасных участков илиCDR участков, антитела по изобретению могут быть сконструированы так, что они включают модификации внутри Fc-участка, обычно для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как сывороточный период полужизни, фиксация комплемента, связывание Fc-рецептора и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело по изобретению может быть химически модифицировано (например, к антителу может быть присоединен один или более химических компонентов) или может быть модифицировано для изменения его гликозилирования и еще для изменения одного или более функциональных свойств антитела. Каждое из этих воплощений описано в дополнительных подробностях ниже. Нумерация остатков в Fc-участке соответствует индексу EU Kabat. В одном воплощении шарнирный участок CH1 модифицируют так, что изменяется количество цистеиновых остатков в шарнирном участке, например увеличивается или уменьшается. Указанный способ описан дополнительно в US патенте 5677425, Bodmer et al. Количество цистеиновых остатков в шарнирном участке CH1 изменяется, например, для облегчения сборки легкой и тяжелой цепей или для увеличения или уменьшения стабильности антитела. В другом воплощении Fc шарнирный участок антитела подвергают мутации для уменьшения биологического периода полужизни антитела. Более конкретно, одну или более аминокислотных мутаций вводят в СН 2-СН 3 домен контактного участка Fc-шарнирного фрагмента так, что у антитела ослабевает связывание стафилококкового белка A (SpA) по отношению к связыванию с SpA нативного Fcшарнирного домена. Этот способ описан в дополнительных подробностях в US патенте 6165745, Wardet al. В другом воплощении антитело модифицируют для увеличения его биологического периода полужизни. Возможны разнообразные способы. Например, может быть введена одна или более из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в US патенте 6277375, Ward. Альтернативно, для увеличения биологического периода полужизни антитело может быть изменено внутри CH1- или CL-участка так, чтобы оно содержало эпитоп связывания с утилизирующим рецептором, заимствованный из двух шпилек СН 2-домена Fc-участка IgG, как описано в US патентах 5869046 и 6121022, Presta et al. Еще в других воплощениях Fc-участок изменяют путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком для изменения эффекторной функции(й) антитела. Например, одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297,318, 320 и 322, может быть заменена другим аминокислотным остатком, так что у антитела изменяется сродство к эффекторному лиганду, но сохраняется антигенсвязывающая способность родительского антитела. Эффекторный лиганд, к которому изменяется сродство, может представлять собой, например, Fcрецептор или С 1 компонент комплемента. Этот способ описан в дополнительных подробностях в US патентах 5624821 и 5648260, оба Winter et al. В другом примере одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, может быть заменена другим аминокислотным остатком, так что у антитела изменяется C1qсвязывание и/или уменьшается или отменяется комплементзависимая цитотоксичность (CDC). Этот способ описан в дополнительных подробностях в US патенте 6194551, Idusogie et al. В другом примере изменяют один или более аминокислотных остатков на участке между положениями аминокислот 231 и 239, таким образом изменяя способность антитела фиксировать комплемент. Этот способ описан в дополнительных подробностях в РСТ публикации WO 94/29351, Bodmer et al. Еще в другом примере модифицируют Fc-участок для увеличения способности антитела опосредовать зависимую от антитела цитотоксичность клеток (ADCC) и/или для увеличения сродства антитела кFc-рецептору путем модификации одной или более аминокислот в следующих положениях: 238, 239,248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292,293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334,335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Этот способ описан дополнительно в РСТ публикации WO 00/42072, Presta. Кроме того, сайты связывания на IgG1 человека для FcRI, FcRII, FcRIII и FcRn были картированы, варианты для улучшения связывания описаны (см. Shields, R.L. et al. (2001), J. Biol Chem. 276:6591-6604). Было показано, что конкретные мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с FcRIII. Дополнительно, было показано, что следующая комбинация мутаций улучшает связывание с FcRIII:T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A. Еще в одном воплощении модифицируют гликозилирование антитела. Например, может быть получено дегликозилированное антитело (т.е. антитело лишено гликозилирования). Гликозилирование может быть изменено, например, для увеличения сродства антитела к антигену. Такие углеводные модификации могут быть выполнены, например, путем изменения одного или более- 18016186 сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например, может быть произведена одна или более аминокислотных замен, что приводит в результате к исключению одного или более вариабельных участков каркасных сайтов гликозилирования, таким образом исключая гликозилирование по этому сайту. Такое гликозилирование может увеличить сродство антитела к антигену. Такой способ описан в дополнительных подробностях в US патентах 5714350 и 6350861, Со et al. Дополнительно или альтернативно, может быть получено антитело, которое имеет измененный тип гликозилирования, такое антитело, как гипофукозилированное антитело, имеющее уменьшенное количество фукозных остатков, или антитело, имеющее увеличенное количество бисекторных GlcNac структур. Было продемонстрировано, что такие образцы с измененным гликозилированием увеличивают ADCC способность антител. Такие углеводные модификации могут быть выполнены, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Описание клеток с измененным механизмом гликозилирования известно из уровня техники, и они могут применяться в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируются рекомбинантные антитела по изобретению и, таким образом,продуцируются антитела с измененным гликозилированием. Например, клеточные линии Ms704, Ms705 и Ms709 лишены гена фукозилтрансферазы, FUT8 (альфа (1,6) фукозилтрансфераза), так что углеводы антител, экспрессирующихся в клеточных линиях Ms704, Ms705 и Ms709, лишены фукозы. Клеточные линии Ms704, Ms705 и Ms709 FUT8-/- были созданы путем направленного нарушения гена FUT8 в клетках CHO/DG44 с применением двух замещающих векторов (см. US публикацию патента 20040110704 от Yamane et al. и Yamane-Ohnuki et al. (2004), Biotechnol Bioeng 87:614-22). В качестве другого примера,в ЕР 1176195 от Hanai et al. описана клеточная линия с функционально нарушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, так что антитела, экспрессирующиеся в такой клеточной линии, проявляют гипофукозилирование путем уменьшения или исключения альфа 1,6 связанного фермента. Hanaiet al. также описывают клеточные линии, которые обладают низкой ферментативной активностью, связанной с добавлением фукозы к N-ацетилглюкозамину, который связывается с Fc-участком антитела, или не обладают ферментативной активностью, например крысиная клеточная линия миеломы YB2/0 (АТССCRL 1662). РСТ публикация WO 03/035835 от Presta описывает вариант клеточной линии СНО, клеткиLec13, с уменьшенной способностью присоединять фукозу к Asn(297)-связанным углеводам, что также приводит в результате к гипофукозилированию антител, экспрессирующихся в такой клетке-хозяинеUmana et al. описывает клеточные линии, сконструированные для экспрессии модифицированных по гликопротеину гликозилтрансфераз (например, бета (1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III(GnTIII, так что антитела, экспрессирующиеся в сконструированных клеточных линиях, проявляют увеличенные бисекторные структуры GlcNac, которые приводят в результате к увеличенной ADCC активности антител (см. также Umana et al. (1999), Nat. Biotech. J. 7:176-180). Альтернативно, фукозные остатки антитела могут быть отщеплены с применением фермента фукозидазы. Например, фукозидаза альфа-L-фукозидаза - удаляет фукозильные остатки из антитела (Tarentino, A.L. et al. (1975), Biochem. 14:5516-23). Другая модификация антител по изобретению, которая предлагается в настоящем описании, представляет собой пегилирование. Антитело может быть пегилировано, например, для увеличения биологического (например, сывороточного) периода полужизни антитела. Для того чтобы пегилировать антитело, обычно проводят взаимодействие антитела или его фрагмента с полиэтиленгликолем (PEG), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное PEG, при условиях, в которых одна или более PEG групп присоединяется к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно пегилирование проводится через реакцию ацилирования или реакцию алкилирования с реакционноспособной молекулой PEG (или с аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). Подразумевается, что термин "полиэтиленгликоль", как применяется в настоящем описании, охватывает любую из форм PEG, которая применялась для модификации других белков, таких форм, как моно (С 1-С 10) алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В определенных воплощениях антитело будет пегилировано, если оно является дегликозилированным. Способы пегилирования белков известны из уровня техники и могут применяться к антителам по изобретению. См.,например, ЕР 0154316 от Nishimura et al. и ЕР 0401384 от Ishikawa et al. Физические свойства антитела. Антитела по настоящему изобретению могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью разнообразных физических свойств антител к CD19. Могут применяться разнообразные анализы для того, чтобы детектировать и/или дифференцировать антитела на различные классы на основе этих физических свойств. В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению могут содержать один или более сайтов гликозилирования в вариабельном участке легкой или тяжелой цепи. Присутствие одного или более сайтов гликозилирования в вариабельном участке может привести в результате к увеличенной иммуногенности антитела или к изменению pK антитела благодаря изменению в связывании антигенаParekh et al. (1985), Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000), Mol. Immunol. 37:697-706). Известно, что гликозилирование встречается на мотивах, содержащих последовательность N-X-S/T. Гликозилирование вариабельного участка может быть протестировано с применением анализа Гликоблот, при котором антитело расщепляется с получением Fab, и затем тестируется на гликозилирование с применением анализа, при котором измеряется окисление периодатом и образование основания Шиффа. Альтернативно,гликозилирование вариабельного участка может быть протестировано с применением хроматографии с рассеянием света (Dionex-LC), при которой сахариды отщепляются от Fab до моносахаридов, и анализируется содержание индивидуального сахарида. В некоторых случаях предпочтительно иметь антитело кCD19, которое не содержит гликозилирования в вариабельном участке. Этого можно достичь путем селекции антител, которые не содержат мотива гликозилирования в вариабельном участке, или путем введения мутаций в остатки внутри мотива гликозилирования с применением стандартных методик, хорошо известных из уровня техники. В предпочтительном воплощении антитела по настоящему изобретению не содержат сайтов изомеризации аспарагина. Деамидирование или эффект изоаспарагиновой кислоты может встречаться на N-G или D-G последовательностях соответственно. Деамидирование или эффект изоаспарагиновой кислоты приводит в результате к созданию изоаспарагиновой кислоты, которая уменьшает стабильность антитела путем создания ломаной структуры скорее благодаря карбоксиконцу боковой цепи, чем основной цепи. Создание изоаспарагиновой кислоты может быть измерено с применением изоквантового анализа, при котором применяется ВЭЖХ с обращенной фазой для тестирования на изоаспарагиновую кислоту. Каждое антитело будет иметь уникальную изоэлектрическую точку (pi), но в основном антитела попадают в предел рН между 6 и 9,5. pi для IgG1 антитела обычно попадает в предел рН 7-9,5, и pi дляIgG4 антитела обычно попадает в предел рН 6-8. Антитела могут иметь pi, которая находится вне этого предела. Хотя эффекты в основном не изучены, существуют предположения, что антитела с pi вне нормального предела могут иметь частично неправильную сборку и проявлять нестабильность при in vivo условиях. Изоэлектрическая точка может быть протестирована с применением капиллярного анализа изоэлектрического фокусирования, при котором создается градиент рН и может применяться лазерное фокусирование для увеличенной точности (Janini et al. (2002), Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001),Chromatographia 53: S75-89; Hunt et al. (1998), J. Chromatogr A 800:355-67). В некоторых случаях предпочтительно иметь антитело CD19, которое содержит pi с величиной, которая попадает в нормальный предел. Этого можно достичь или путем селекции антител с pi в нормальном пределе, или путем введения мутаций в заряженные поверхностные остатки с применением стандартных методик, хорошо известных из уровня техники. Каждое антитело будет иметь температуру плавления, которая является индикатором термостабильности (Krishnamurthy R. и Manning M.C. (2002), Curr Pharm. Biotechnol. 3:361-71). Большая термостабильность указывает на большую стабильность антитела in vivo и в целом. Точка плавления антитела может быть измерена с применением таких методик, как дифференциальная сканирующая калориметрия(Chen et al. (2003), Pharm. Res. 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999), Immunol. Lett 68:47-52). Тм 1 указывает на температуру начала разборки антитела. Тм 2 указывает на температуру полной разборки антитела. В основном предпочтительно, чтобы Тм 1 антитела по настоящему изобретению была выше 60 С, предпочтительно выше 65 С, еще более предпочтительно выше 70 С. Альтернативно, термостабильность антитела может быть измерена с применением циклического дихроизма (Murray et al. (2002), J. ChromatogrSci. 40:343-9). В предпочтительном воплощении селектируются антитела, которые не деградируют быстро. Фрагментация антитела к CD19 может быть измерена с применением капиллярного электрофореза (СЕ) иMALDI-MS, как хорошо понятно из уровня техники (Alexander A.J. и Hughes D.E. (1995), Anal. Chem. 67:3626-32). В другом предпочтительном воплощении селектируются антитела, которые обладают минимальными эффектами агрегации. Агрегация может приводить к запуску нежелательного иммунного ответа и/или к измененным или неблагоприятным фармакокинетическим свойствам. В основном антитела являются приемлемыми с агрегацией 25% или менее, предпочтительно 20% или менее, еще более предпочтительно 15% или менее, еще более предпочтительно 10% или менее и еще более предпочтительно 5% или менее. Агрегация может быть измерена с помощью нескольких методик, хорошо известных из уровня техники, включающих эксклюзионную колоночную (SEC) высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и светорассеяние для идентификации мономеров, димеров, тримеров или мультимеров. Способы конструирования антител. Как обсуждалось выше, антитела к CD70, имеющие последовательности VH и VK, описанные в настоящем изобретении, могут применяться для создания новых антител к CD70 путем модификации VHи/или VK-последовательностей или присоединенного к ним константного участка(ов). Таким образом, в другом аспекте изобретения структурные черты антитела к CD70 по изобретению, например 2 Н 5, 10 В 4,8 В 5, 18 Е 7 или 69 А 7, применяются для создания родственных по структуре антител к CD70, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител по изобретению, такое как связывание с CD70 человека. Например, один или более CDR участков из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 или 69 А 7 или их- 20016186 мутированные формы могут быть рекомбинантно объединены с известными каркасными участками и/или другими CDR участками для создания дополнительных рекомбинантно сконструированных антител к CD70 по изобретению, как обсуждалось выше. Другие типы модификаций включают те, что описаны в предыдущем разделе. Стартовый материал для способа конструирования представляет собой одну или более VH- и/или VK-последовательностей, предложенных здесь, или один или более CDR участков из них. Для создания сконструированного антитела не является необходимым фактическое получение (т.е. экспрессия в виде белка) антитела, имеющего одну или более VH- и/или VK-последовательностей, предложенных здесь, или один или более CDR участков из них. Чаще, информация, содержащаяся в последовательности(ях), применяется в качестве стартового материала для создания "второй генерации" последовательности(ей), выделенных из исходной последовательности(ей), и затем получают "вторую генерацию" последовательности(ей) и экспрессируют в виде белка. Соответственно в другом воплощении в изобретении предлагается способ получения антитела к(а) предоставление (i) последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела, включающей CDR1 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-15, CDR2 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16-20, и/или CDR3 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-25; и/или (ii) последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела, включающей CDR1 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-30, CDR2 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID(b) изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка внутри последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела и/или внутри последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела; и(c) экспрессию измененной последовательности антитела в виде белка. Стандартные методики молекулярной биологии могут применяться для получения и экспрессии измененной последовательности антитела. Предпочтительно антитело, кодируемое измененной последовательностью(ями) антитела, представляет собой антитело, которое сохраняет одну, некоторые или все функциональные свойства антител к CD70, описанных в настоящем описании, причем функциональные свойства включают, но не ограничены специфическим связыванием с CD70. Функциональные свойства измененных антител можно оценить с применением стандартных анализов, доступных из уровня техники и/или описанных в настоящем описании, таких как те, что представлены в примерах (например, проточная цитометрия, анализы связывания). В определенных воплощениях способов конструирования антител по изобретению могут случайно или выборочно вводиться мутации по всей последовательности, кодирующей антитело к CD70, или в части последовательности, и полученные в результате модифицированные антитела к CD70 можно проскринировать на связывающую активность и/или на другие свойства, как описано в настоящем описании. Описание способов введения мутаций известно из уровня техники. Например, РСТ публикацияWO 02/092780 от Short описывает способы создания и скрининга мутаций с применением насыщенного мутагенеза, сборки синтетического лиганда или их комбинации. Альтернативно, РСТ публикацияWO 03/074679 от Lazar et al. описывает способы применения компьютерного скрининга для оптимизации физико-химических свойств антитела. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела по изобретению. Другой аспект изобретения относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют антитела по изобретению. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или, по существу, в чистой форме. Нуклеиновая кислота является "выделенной" или "представлена, по существу, в чистом виде" при очистке от других клеточных компонентов или других загрязнений, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков с помощью стандартных методик, включающих обработку щелочью/SDS, разделение на CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез на агарозном геле и другие методики, хорошо известные из уровня техники. См., F.Ausubel, et al., ed. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience,New York. Нуклеиновая кислота по изобретению может представлять собой, например, ДНК или РНК и может содержать или не содержать интронных последовательностей. В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК. Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены с применением стандартных методик молекулярной биологии. Для антител, экспрессирующихся с помощью гибридом (например, гибридом,полученных из трансгенных мышей, несущих гены иммуноглобулинов человека, как описано дополнительно ниже), кДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, полученного с помощью гибридомы, могут быть получены с помощью стандартных методик ПЦР-амплификации или клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки иммуноглобулиновых генов (например, с применением методик фагового дисплея), нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, может быть получена из библиотеки.- 21016186 Предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот по изобретению представляют собой молекулы,кодирующие VH- и VL-последовательности моноклональных антител 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 или 69 А 7. Последовательности ДНК, кодирующие VH-последовательности из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7, показаны в SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44 и 45 соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие VLпоследовательности из 2 Н 5, 10 В 4, 8 В 5, 18 Е 7 и 69 А 7, показаны в SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49 и 50 соответственно. С однажды полученными фрагментами ДНК, кодирующими VH- и VL-сегменты, могут дополнительно производиться манипуляции посредством стандартных методик рекомбинантной ДНК, например,для превращения генов вариабельного участка в полноразмерные гены цепей антитела, в гены Fabфрагмента или в scFv. В указанных манипуляциях фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, является функционально связанным с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константный участок антитела или гибкий линкер. Подразумевается, что термин "функционально связанный", как применяется в настоящем описании, обозначает два фрагмента ДНК, объединенные так, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в одной рамке. Выделенная ДНК, кодирующая VH-участок, может быть превращена в полноразмерный ген тяжелой цепи путем функционального связывания VH-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные участки тяжелой цепи (CH1, CH2 и СН 3). Последовательности генов константного участка тяжелой цепи человека известны из уровня техники (см., например, Kabat, Е.A., el al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services,NIH Publication91-3242), и ДНК-фрагменты, охватывающие эти участки, могут быть получены путем стандартной ПЦР-амплификации. Константный участок тяжелой цепи может представлять собой константный участок из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно представляет собой константный участок из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Для гена Fab-фрагмента тяжелой цепи, VH-кодирующая ДНК может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константный участок CH1 тяжелой цепи. Выделенная ДНК, кодирующая VL-участок, может быть превращена в полноразмерный ген легкой цепи (а также Fab ген легкой цепи) путем функционального связывания VL-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константный участок легкой цепи CL. Последовательности генов константного участка легкой цепи человека известны из уровня техники (см., например, Kabat, E.A., et al.Services, NIH Publication91-3242), и ДНК-фрагменты, охватывающие эти участки, могут быть получены путем стандартной ПЦР-амплификации. Константный участок легкой цепи может представлять собой константный участок каппа или лямбда, но наиболее предпочтительно представляет собой константный участок каппа. Для создания гена scFv, VH- и VL-кодирующие ДНК-фрагменты функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, так что VH- и VL-последовательности могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка с VL- и VH-участками, объединенными с помощью гибкого линкера (см., например, Bird et al. (1988), Science 242:423-426; Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;McCafferty et al. (1990), Nature 348:552-554). Получение моноклональных антител по изобретению. Моноклональные антитела (mAb) по настоящему изобретению могут быть получены с помощью разнообразных методик, включающих подходящую методологию моноклонального антитела, например стандартную методику гибридизации соматических клеток по Kohler и Milstein (1975), Nature 256:495. Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе, могут применяться другие методики получения моноклонального антитела, например вирусная или онкогенная трансформация В-лимфоцитов. Предпочтительной животной системой для получения гибридом является мышиная система. Получение гибридомы с помощью мыши представляет собой хорошо изученную процедуру. Протоколы иммунизации и методики выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны из уровня техники. Партнеры для слияния (например, мышиные клетки миеломы) и процедуры слияния также известны. Химерные и гуманизированные антитела по настоящему изобретению могут быть получены на основе последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного, как описано выше. ДНК,кодирующие иммуноглобулиновые гены тяжелой и легкой цепей, могут быть получены из интересующей мышиной гибридомы и сконструированы с применением стандартных методик молекулярной биологии так, чтобы они содержали немышиные (например, человеческие) иммуноглобулиновые последовательности. Например, для создания химерного антитела мышиный вариабельный участок может быть связан с человеческими константными участками с применением способов, известных из уровня техники(см., например, US патент 4816567 от Catilly et al.). Для создания гуманизированного антитела, мышиные CDR участки могут быть вставлены в человеческие каркасные участки с применением способов,известных из уровня техники (см., например, US патент 5225539 от Winter и US патенты 5530101;- 22016186 5585089; 5693762 и 6180370 от Queen et al.). В предпочтительном воплощении антитела по изобретению являются человеческими антителами. Такие человеческие моноклональные антитела непосредственно против CD70 могут быть получены с применением трансгенных или трансхромосомных мышей, чаще несущих части иммунной системы человека, чем иммунной системы мыши. Указанные трансгенные или трансхромосомные мыши включают мышей, обозначенных в настоящем описании как HumAb Mouse и KM Mouse соответственно и вместе обозначены в настоящем описании как "мыши с человеческими Ig".HumAb Mouse (Medarex, Inc.) содержит минилокусы человеческих иммуноглобулиновых генов,которые кодируют несгруппированные последовательности тяжелой ( и ) и легкой цепииммуноглобулинов человека, вместе с направленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусыицепей (см., например, Lonberg, et al. (1994), Nature 368(6474): 856-859). Соответственно мыши проявляют пониженную экспрессию мышиного IgM или , и в ответ на иммунизацию введенные трансгены тяжелой и легкой цепей человека подвергаются переключению классов и соматической мутации для получения высокоаффинных IgG моноклональных антител человека (Lonberg, N. et al. (1994), указано выше; обзор(1994), J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994), International Immunology 6:579-591; и Fishwild,D. et al. (1996), Nature Biotechnology 14:845-851, содержание каждой из которых в точности полностью введено в настоящее описание с помощью ссылки. См. дополнительно US патенты 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; все от Lonberg и Kay;Korman et al. В другом воплощении человеческие антитела по изобретению могут быть получены с применением мыши, которая несет человеческие иммуноглобулиновые последовательности на трансгенах и трансхромосомах, такой мыши, которая несет трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому легкой цепи человека. Указанные мыши, обозначенные в настоящем описании как "KM Mouse", подробно описаны в РСТ публикации WO 02/43478 от Ishida et al. Кроме того, альтернативные трансгенные животные системы, экспрессирующие человеческие иммуноглобулиновые гены, доступны из уровня техники и могут применяться для получения антител кCD70 по изобретению. Например, может применяться альтернативная трансгенная система, обозначенная как Ксеномышь (Abgenix, Inc.); указанные мыши описаны, например, в US патентах 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 от Kucherlapati et al. Кроме того, альтернативные трансхромосомные животные системы, экспрессирующие человеческие иммуноглобулиновые гены, доступны из уровня техники и могут применяться для получения антител к CD70 по изобретению. Например, могут применяться мыши, несущие обе трансхромосомы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, обозначенные как "ТС-мыши"; указанные мыши описаныTomizuka et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. В качестве другого примера описание коров,несущих трансхромосомы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, известны из уровня техники(Kuroiwa et al. (2002), Nature Biotechnology 20:889-894) и могут применяться для получения антител кCD70 по изобретению. Человеческие моноклональные антитела по изобретению также могут быть получены с применением способов фагового дисплея для скрининга библиотек человеческих иммуноглобулиновых генов. Указанные способы фагового дисплея для выделения человеческих антител установлены из уровня техники. См., например, US патенты 5223409; 5403484 и 5571698 от Ladner et al.; US патенты 5427908 и 5580717 от Dower et al.; US патенты 5969108 и 6172197 от McCafferty et al. и US патенты 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 от Griffiths et al. Человеческие моноклональные антитела по изобретению также могут быть получены с применением мышей SCID, в которых человеческие иммунные клетки были восстановлены так, чтобы при иммунизации генерировался ответ человеческого антитела. Такие мыши описаны, например, в US патентах 5476996 и 5698767 от Wilson et al. Иммунизация мышей с человеческим Ig. Когда для получения человеческих антител по изобретению применяются мыши с человеческим Ig,такие мыши могут быть иммунизированы с помощью клеточной линии, экспрессирующей CD70, очищенного или обогащенного препарата антигена CD70 и/или рекомбинантного CD70 или сшитого с CD70 белка, как описано Lonberg, N. et al. (1994), Nature 368(6474):856-859; Fishwild, D. et al. (1996), Nature- 23016186 мышей достигает 6-16 недель при первой иммунизации. Например, очищенный или рекомбинантный препарат (5-50 мкг) антигена CD70 может применяться для иммунизации мышей с человеческим Ig внутрибрюшинно. Подробные процедуры для основательного получения человеческих моноклональных антител кCD70 описаны в примере 1 ниже. Накопленный опыт с разнообразными антигенами показал, что трансгенные мыши реагируют при начальной внутрибрюшинной иммунизации (IP) с антигеном в полном адъюванте Фрейнда (Freund), с последующими иммунизациями IP каждую неделю общим количеством из 6 иммунизаций в неполном адъюванте Фрейнда. Однако обнаружено, что адъюванты, отличные от адъюванта Фрейнда, также являются эффективными. Кроме того, обнаружено, что цельные клетки в отсутствие адъюванта являются высокоиммуногенными. Можно проследить за иммунным ответом в течение курса протокола иммунизации с образцами плазмы, полученными, например, при ретроорбитальных отборах крови. Плазма может быть проскринирована с помощью ELISA, и мыши с подходящими титрами человеческого иммуноглобулина к CD70 могут применяться для слияний (как описано в примере 1). Мышам можно вводить внутривенно антиген в течение 3 дней перед умерщвлением и удалением селезенки. Ожидается, что может быть необходимо осуществить 2-3 слияния для каждой иммунизации. Обычно иммунизируется от 6 до 24 мышей для каждого антигена. Обычно применяются обе линии НСо 7 и НСо 12. Получение мышиных линий НСо 7 и НСо 12 описано в US патенте 5770429 и примере 2 из РСТ публикации WO 01/09187 соответственно. Кроме того, оба трансгена, НСо 7 и НСо 12, могут быть размножены вместе в одной мыши, имеющей два различных трансгена тяжелой цепи человека(НСо 7/НСо 12). Альтернативно или дополнительно, может применяться линия KM мыши, как описано в РСТ публикации WO 02/43478. Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела по изобретению. Чтобы получить гибридомы, продуцирующие человеческие моноклональные антитела по изобретению, спленоциты и/или клетки лимфатического узла из иммунизированных мышей могут быть выделены и может быть проведено их слияние с подходящей иммортализованной клеточной линией, такой как мышиная клеточная линия миеломы. Полученные в результате гибридомы могут быть проскринированы на продуцирование антиген-специфических антител. Например, одноклеточные суспензии лимфоцитов селезенки из иммунизированных мышей могут быть слиты с одной шестой от количества Р 3 Х 63-Ag8.653 несекретирующихся мышиных клеток миеломы (АТСС, CRL 1580) в 50% PEG. Альтернативно, может быть проведено слияние одноклеточных суспензий лимфоцитов селезенки из иммунозированных мышей с применением способа электрослияния на основе электрического поля с применением Cyto Pulse крупнокамерного электропоратора для слияния клеток (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Клетки высевают с плотностью приблизительно 2105 на дно ячейки планшета для микротитрования с последующей инкубацией в течение одной недели в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы с Lглутамином и пируватом натрия (Mediatech, Inc., Herndon, VA) и дополнительно содержащей 20% фетальную бычью сыворотку (Hyclone, Logan, UT), 18% кондиционирующую среду P388DI, 5% фактор клонирования гибридомы Origen (BioVeris, Gaithersburg, VA), 4 мМ L-глутамин, 5 мМ HEPES, 0,055 мМ-меркаптоэтанол, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина и 1 среду гипоксантинаминоптерин-тимидин (HAT) (Sigma; HAT добавляют через 24 ч после слияния). Через одну неделю клеткам, культивированным в среде, в которой применялся HAT, заменяют его на НТ. Индивидуальные ячейки могут быть затем проскринированы с помощью ELISA на человеческие моноклональные антитела IgM и IgG. Рост гибридомы обычно может наблюдаться через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, могут быть пересеяны, проскринированы снова, и если все равно остается положительная реакция на человеческий IgG, то моноклональные антитела могут быть субклонированы по меньшей мере дважды путем ограничивающего разведения. Стабильные субклоны могут затем культивироваться invitro для получения небольших количеств антитела в среде для культивирования тканевых и клеточных культур для характеризации. Для очистки человеческих моноклональных антител селектированные гибридомы могут быть выращены в двухлитровых роллерных флаконах для очистки моноклонального антитела. Супернатанты могут быть отфильтрованы и сконцентрированы перед аффинной хроматографией с протеин Асефарозой (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Элюированный IgG можно проверить с помощью гельэлектрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии, чтобы удостовериться в чистоте. Буферный раствор можно заменить на PBS и концентрация может быть определена при OD280 с применением коэффициента угасания 1,43. Моноклональные антитела могут быть разделены на аликвоты и могут храниться при -80 С. Получение трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела по изобретению. Антитела по изобретению также могут быть получены в клетке-хозяине трансфектомы с применением, например, комбинации методик рекомбинантной ДНК и способов трансфекции генов, которые хорошо известны из уровня техники (например, Morrison, S. (1985), Science 229:1202). Например, для экспрессии антител или фрагментов антител, ДНК, кодирующие части или полноразмерные гены легкой и тяжелой цепей, могут быть получены с помощью стандартных методик моле- 24016186 кулярной биологии (например, ПЦР-амплификации или клонирования кДНК с применением гибридомы,которая экспрессирует интересующее антитело), и ДНК могут быть вставлены в экспрессирующие векторы так, чтобы гены были функционально связанными с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В данном случае подразумевается, что термин "функционально связанный" означает, что ген антитела лигируется в вектор так, чтобы последовательности контроля транскрипции и трансляции внутри вектора служили в соответствии со своей предназначенной функцией регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор и последовательности контроля экспрессии выбираются так, чтобы они были совместимы с применяемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, более типично, оба гена вставляют в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антитела вставляют в экспрессирующий вектор с помощью стандартных способов (например, лигирования комплементарных рестрикционных сайтов фрагмента гена антитела и вектора, или с помощью лигирования по тупым концам,если не присутствует никаких рестрикционных сайтов). Описанные в настоящем описании вариабельные участки легкой и тяжелой цепей антитела могут применяться для создания полноразмерных генов антитела любого изотипа антитела путем их вставки в экспрессирующие векторы, уже кодирующие константный участок тяжелой цепи и константный участок легкой цепи желаемого изотипа так, чтобы VHсегмент был функционально связан с CH-сегментом(ами) внутри вектора и чтобы VK-сегмент был функционально связан с CL сегментом внутри вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть проклонирован в вектор так, чтобы сигнальный пептид был связан в одной рамке с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть иммуноглобулиновым сигнальным пептидом или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальным пептидом из белка, отличного от иммуноглобулина). Дополнительно к генам цепей антитела рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Подразумевается, что термин "регуляторная последовательность" включает промоторы,энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990. Было бы удобно для специалистов в данной области, если бы разработка экспрессирующего вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, могла зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии целевого белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего включают вирусные элементы, которые управляют экспрессией белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, выделенные из цитомегаловируса (CMV), обезьяньего вируса 40(SV40), аденовируса, (например, главного позднего промотора аденовируса (AdMLP и полиомы. Альтернативно, могут применяться невирусные регуляторные последовательности, такие как убиквитиновый промотор или -глобиновый промотор. Более того, регуляторные элементы состоят из последовательностей из различных источников, таких как SR-промоторная система, которая содержит последовательности из раннего промотора SV40 и длинный концевой повтор из вируса Т-клеточной лейкемии типа 1 (Takebe, Y. et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 8:466-472). Дополнительно к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, последовательности начала репликации) и гены маркеров селекции. Ген маркера селекции облегчает селекцию клетокхозяев, в которые был введен вектор (см., например, US патенты 4399216, 4634665 и 5179017, все отAxel et al.). Например, обычно ген маркера селекции дает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, в клетке-хозяине, в которую был введен вектор. Предпочтительные гены маркеров селекции включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в dhfrклетках-хозяевах с селекцией на метотрексате/амплификации) и ген neo (для селекции на G418). Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессирующий вектор(ы), кодирующий тяжелую и легкую цепи, трансфецируют в клетку-хозяин с помощью стандартных методик. Подразумевается, что разнообразные формы термина "трансфекция" охватывают широкое разнообразие методик, обычно применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, например электропорацию, кальций-фосфатную преципитацию, DEAE-декстрановую трансфекцию и подобные. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению и в прокариотических или в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках и наиболее предпочтительно в клетках-хозяевах млекопитающих является наиболее предпочтительной, так как такие эукариотические клетки и в особенности клетки млекопитающих собирают и секретируют иммунологически активные антитела в правильно собранной форме с большей вероятностью, чем прокариотические клетки. Было опубликовано, что прокариотическая экспрессия генов антитела является неэффективной для- 25016186 продуцирования активного антитела с высоким выходом (Boss, M.А. и Wood, С.R. (1985), ImmunologyToday 6:12-13). Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичников китайского хомячка (клетки СНО) (включающие dhfr-клетки СНО, описанные Urlaub и Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216-4220, применяемые с маркером селекции DHFR, например, как описано R.J. Kaufman и P.A. Sharp (1982), Mol. Biol. 759:601-621),NSO-клетки миеломы, COS-клетки и SP2-клетки. В особенности, для применения с NSO-клетками миеломы другой предпочтительной системой экспрессии является система экспрессии гена GS, описанная вWO 87/04462, WO 89/01036 и ЕР 338841. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного, чтобы дать возможность экспрессии антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно дать возможность секреции антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела могут быть получены из культуральной среды с применением стандартных способов очистки белка. Характеризация связывания антитела с антигеном. Антитела по изобретению могут быть протестированы на связывание с CD70 с помощью, например,проточной цитометрии. Коротко, из только что собранных из флаконов для тканевых клеточных культурCD70-экспрессирующих клеток готовят одноклеточную суспензию. Суспензии CD70-экспрессирующих клеток или непосредственно инкубировали с первичным антителом, или после фиксации с 1% параформальдегидом в PBS. Приблизительно 1 млн клеток повторно суспендируют в PBS, содержащем 0,5%BSA и 50-200 мкг/мл первичного антитела, и инкубируют на льду в течение 30 мин. Клетки промывали дважды с PBS, содержащим 0,1% BSA, 0,01% NaN3, повторно суспендировали в 100 мкл разведенного 1:100 FITC-конъюгированного козьего антитела к человеческому IgG (Jackson ImmunoResearch, WestGrove, PA) и инкубировали на льду дополнительные 30 мин. Клетки снова промывали дважды, повторно суспендировали в 0,5 мл буфера для промывания и анализировали для флуоресцентного окрашивания на цитометре FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Альтернативно, антитела по изобретению могут быть протестированы на связывание с CD70 с помощью стандартного метода ELISA. Коротко, планшеты для микротитрования покрывали очищеннымCD70 с концентрацией 0,25 мкг/мл в PBS и затем блокировали с 5% бычьим сывороточным альбумином в PBS. Образцы с разведенным антителом (например, образцы разведенной плазмы из CD70 иммунизированных мышей) добавляли в каждую ячейку и инкубировали в течение 1-2 ч при 37 С. Планшеты промывали в PBS/Tween и затем инкубировали с вторичным реагентом (например, для человеческих антител, с козьим Fc-специфическим поликлональным реагентом к человеческому IgG), конъюгированным с щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37 С. После промывания планшеты проявляли сpNPP субстратом (1 мг/мл) и анализировали при OD 405-650. Предпочтительно мышей, которые проявили наибольший титр, использовали для слияний. Анализ ELISA, описанный выше, также может применяться для скрининга гибридом, которые показывают положительную реакционноспособность с иммуногеном CD70. Гибридомы, которые связываются с CD70 с высокой авидностью, субклонируют и дополнительно охарактеризовывают. Один клон из каждой гибридомы, который сохраняет реакционноспособность родительских клеток (по ELISA), может быть выбран для создания клеточного банка из 5-10 пробирок, которые хранятся при -140 С, и может быть выбран для очистки антитела. Для очистки антител к CD70 выбранные гибридомы могут быть выращены в двухлитровых роллерных флаконах для очистки моноклонального антитела. Супернатанты могут быть отфильтрованы и сконцентрированы перед аффинной хроматографией с протеин А-сефарозой (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Элюированный IgG можно проверить с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии, чтобы удостовериться в чистоте. Буферный раствор можно заменить на PBS, концентрация может быть определена при OD280 с применением коэффициента угасания 1,43. Моноклональные антитела могут быть разделены на аликвоты и могут храниться при -80 С. Чтобы определить, связываются ли выбранные моноклональные антитела к CD70 с уникальными эпитопами, каждое антитело может быть биотинилировано с применением коммерчески доступных реагентов (Pierce, Rockford, IL). Исследования по конкурированию с применением немеченых моноклональных антител и биотинилированных моноклональных антител могут быть осуществлены с применением покрытых CD70 планшетов для ELISA, как описано выше. Связывание биотинилированного mAb может детектироваться с помощью зонда стрептавидина-щелочной фосфатазы. Альтернативно, исследования по конкурированию могут быть осуществлены с применением радиоактивно меченного антитела, и немеченые конкурирующие антитела могут детектироваться с помощью анализа Scatchard, как дополнительно описано ниже в примерах. Для определения изотипа очищенных антител может быть осуществлен метод ELISA для изотипов с применением специфических реагентов, специфичных для антител конкретного изотипа. Например,для определения изотипа человеческого моноклонального антитела ячейки планшетов для микротитрования могут быть покрыты с 1 мкг/мл антитела к человеческому иммуноглобулину в течение ночи при- 26016186 4 С. После блокирования с 1% BSA планшеты вступают во взаимодействие с 1 мкг/мл или менее тестируемых моноклональных антител очищенных контрольных изотипов при температуре окружающей среды в течение 1-2 ч. Ячейки могут затем вступить во взаимодействие или с человеческим, специфичным кIgG к CD70 человека могут быть дополнительно протестированы на реакционноспособность с антигеном CD70 с помощью Western-блоттинга. Коротко, CD70 может быть получен и подвергнут электрофорезу на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют с 10% фетальной телячьей сывороткой и гибридизуют с тестируемыми моноклональными антителами. Связывание человеческих IgG может быть детектировано с применением IgG к щелочной фосфатазе человека и проявлено с применением таблетокBCIP/NBT субстрата (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.). Иммуноконъюгаты. В другом аспекте в настоящем изобретении представлено антитело к CD70 или его фрагмент,конъюгированные с терапевтическим компонентом, таким как цитотоксин, лекарственное средство (например, иммуносупрессант) или радиотоксин. Такие конъюгаты обозначены в настоящем описании как"иммуноконъюгаты". Иммуноконъюгаты, которые включают один или более цитотоксинов, обозначены как "иммунотоксины". Цитотоксин или цитотоксический агент включают любой агент, который является губительным (например, убивает) для клеток. Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин D,этидиум бромид, эметин, митомицин, этопосид, тенопосид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1 дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты также включают, например, антиметаболиты (например,метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин(известный как дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (известный как актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС и антимитотические агенты (например,винкристин и винбластин). Другие предпочтительные примеры терапевтических цитотоксинов, которые могут быть конъюгированы с антителом по изобретению, включают дуокармицины, калихеамицины, маитанзины и ауристатины и их производные. Пример конъюгата калихеамицина с антителом является коммерчески доступным (Mylotarg; Wyeth-Ayerst). Цитотоксины могут быть конъюгированы с антителами по изобретению с применением технологии линкеров, доступной из уровня техники. Примеры типов линкеров, которые применялись для конъюгирования цитотоксина с антителом, включают, но не ограничены ими, гидразоны, тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфиды и линкеры, содержащие пептид. Линкер может быть выбран так, чтобы он, например, был чувствителен к расщеплению при низком рН внутри лизосомного компартмента или был чувствителен к расщеплению протеазами, которые предпочтительно экспрессируются в опухолевой ткани,такие протеазы, как катепсины (например, катепсины В, С, D). Для дополнительного обсуждения типов цитотоксинов линкеров и способов конъюгации терапевтических агентов с антителами, см. также Saito, G. et al. (2003), Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail,P.A. et al. (2003), Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003), Cancer Cell 3:207-212; Allen,T.M. (2002), Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. и Kreitman, R.J. (2002), Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. и Springer, C.J. (2001), Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264. Антитела по настоящему изобретению также могут быть конъюгированы с радиоактивным изотопом с получением цитотоксических радиофармацевтических средств, также обозначенных как радиоиммуноконъюгаты. Примеры радиоактивных изотопов, которые могут быть конъюгированы с антителами для диагностического или терапевтического применения, включают, но не ограничены ими, йод 131,йод 125, индий 111, иттрий 90 и лютеций 177. Способы получения иммуноконъюгатов установлены из уровня техники. Примеры радиоиммуноконъюгатов коммерчески доступны и включают Зевалин (IDEC Pharmaceuticals) и Бексар (Bexxar) (Corixa Pharmaceuticals), подобные способы могут применяться для получения иммуноконъюгатов с применением антител по изобретению. Конъюгаты антител по изобретению могут применяться для модификации данного биологического ответа и не следует понимать компонент лекарственного средства как ограниченный классическими химическими терапевтическими агентами. Например, компонент лекарственного средства может представлять собой белок или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин,рицин А, эксотоксин синегнойной палочки или дифтерийный токсин; такой белок, как фактор некроза- 27016186 опухоли или интерферон-; или такие модификаторы биологического ответа, как, например, лимфокины,интерлейкин-1 ("IL-1"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), гранулоцит макрофаг колониестимулирующий фактор ("GM-CSF"), гранулоцит колониестимулирующий фактор ("G-CSF") или другие факторы роста. Методики конъюгации такого терапевтического компонента с антителами хорошо известны, см.,например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), p. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom etConjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). Биспецифичные молекулы. В другом аспекте в настоящем изобретении представлены биспецифичные молекулы, включающие антитело к CD70 или его фрагмент по изобретению. Антитело по изобретению или его антигенсвязывающие участки могут быть модифицированы или связаны с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом к рецептору) с получением биспецифичной молекулы, которая связывается по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или молекулами мишенями. Антитело по изобретению может быть фактически модифицировано или связано с более чем одной функциональной молекулой с получением мультиспецифичных молекул, которые связываются с более чем двумя различными сайтами связывания и/или молекулами мишенями; подразумевается, что такие мультиспецифичные молекулы охвачены термином "биспецифичная молекула", как применяется в настоящем описании. Для создания биспецифичной молекулы по изобретению антитело по изобретению может быть функционально связано (например, с помощью химической конденсации, генетической сшивки, нековалентной связи или по-другому) с одной или более связывающими молекулами, такими как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или связывающий миметик,так что в результате получается биспецифичная молекула. Соответственно настоящее изобретение включает биспецифичные молекулы, включающие по меньшей мере одну первую специфичность связывания с CD70 и вторую специфичность связывания со вторым эпитопом-мишенью. В конкретном воплощении изобретения второй эпитоп-мишень представляет собой Fc-рецептор, например человеческий FcRI (CD64) или человеческий Fc-рецептор (CD89). Таким образом, изобретение включает биспецифичные молекулы, способные к связыванию с обоими типами эффекторных клеток - экспрессирующими FcR или экспрессирующими FcR (например, с моноцитами, макрофагами или полиморфонуклеарными клетками (PMN, и способные к связыванию с клетками-мишенями, экспрессирующими CD70. Эти биспецифичные молекулы направляют CD70 экспрессирующие клетки к эффекторной клетке и передают опосредованные Fc-рецептором активности эффекторной клетки, такие как фагоцитоз CD70-экспрессирующих клеток, зависимая от антитела, опосредованная клеткой цитотоксичность (ADCC), высвобождение цитокина или получение супероксидного аниона. В воплощении по изобретению, в котором биспецифичная молекула является мультиспецифичной,молекула может дополнительно включать третью специфичность связывания в дополнение к специфичности связывания с Fc и специфичности связывания с CD70. В одном воплощении третья специфичность связывания представляет собой специфичность связывания с участком фактора усиления (EF), например участком молекулы, которая связывается с поверхностным белком, вовлеченным в цитотоксическую активность, и, посредством чего, усиливает иммунный ответ против клетки-мишени. "Антитело к участку фактора усиления" может представлять собой антитело, функциональный фрагмент антитела или лиганд, который связывается с указанной молекулой, например антиген или рецептор, и, посредством чего,приводит в результате к усилению эффекта связывающих детерминант для Fc-рецептора или антигена клетки-мишени. "Антитело к участку фактора усиления" может связывать Fc-рецептор или антиген клетки-мишени. Альтернативно, антитело к участку фактора усиления может связываться с объектом, который отличается от объекта, с которым связываются первая и вторая специфичности связывания. Например, антитело к участку фактора усиления может связывать цитотоксическую Т-клетку (например, черезCD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1, или другую иммунную клетку, что приводит в результате к усилению иммунных ответов против клетки-мишени). В одном воплощении биспецифичные молекулы по изобретению включают в качестве специфичности связывания по меньшей мере одно антитело или его фрагмент, включающий, например, Fab, Fab',F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv. Антитело также может представлять собой димер легкой цепи или тяжелой цепи или любой его минимальный фрагмент, такой как Fv, или одноцепочечную конструкцию,как описано Ladner et al., US патент 4946778, содержание которого в точности введено с помощью- 28016186 ссылки. В одном воплощении специфичность связывания для Fc рецептора представлена с помощью моноклонального антитела, связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином G (IgG). Как применяется в настоящем описании, термин "IgG-рецептор" представляет собой любой из восьми генов у цепи, локализованных на хромосоме 1. Эти гены кодируют в целом двенадцать трансмембранных или растворимых изоформ рецептора, которые сгруппированы в три класса Fc-рецептора: FcRI (CD64),FcRII (CD32) и FcRIII (CD16). В одном предпочтительном воплощении Fc-рецептор представляет собой человеческий FcRI с высоким сродством. Человеческий FcRI представляет собой молекулу с молекулярным весом 72 кДа, которая показывает высокое сродство к мономерному IgG (108-109 М-1). Получение и характеризация определенных предпочтительных моноклональных антител к Fc описаны Fanger et al. в РСТ публикации WO 88/00052 и в US патенте 4954617, руководства по которым полностью введены в настоящее описание с помощью ссылки. Эти антитела связываются с эпитопомFcRI/FcRII или FcRIII в сайте, который является удаленным от Fc-сайта связывания рецептора, и,таким образом, их связывание, по существу, не блокируется при физиологическом уровне IgG. Специфические антитела к FcRI, применяемые в настоящем изобретении, представляют собой mAb 22, mAb 32,mAb 44, mAb 62 и mAb 197. Гибридома, продуцирующая mAb 32, является коммерчески доступной из Американской типированной коллекции клеточных культур,доступа АТСС НВ 9469. В других воплощениях антитело к Fc-рецептору является гуманизированной формой моноклонального антитела 22(10): 4996-5002 и в РСТ публикации WO 94/10332. Клеточная линия, продуцирующая антитело Н 22, была депонирована в Американскую типированную коллекцию клеточных культур с обозначениемHA022CL1 и имеетдоступа CRL 11177. Еще в других предпочтительных воплощениях специфичность связывания с Fc-рецептором представлена в виде антитела, которое связывается с человеческим IgA-рецептором, например Fc-альфа рецептором (FcRI (CD89, связывание которого предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином А (IgA). Подразумевается, что термин "IgA-рецептор" включает генный продукт одного-гена (FcRI), локализованного на хромосоме 19. Известно, что указанный ген кодирует несколько альтернативно сплайсированных трансмембранных изоформ с молекулярным весом 55-110 кДа. FcRI(CD89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не экспрессируется на популяциях неэффекторных клеток. FcRI обладает средним сродством (приблизительно 5107 М-1) к обоим IgA1 и IgA2, которая увеличивается под воздействием цитокинов, таких как G-CSF или GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996), Critical Reviews in Immunology 26:423-440). Были описаны четыре FcRI-специфичных моноклональных антитела, идентифицированных как A3, А 59, А 62 и А 77, которые связывают FcRI вне домена связывания с лигандом IgA (Monteiro,R.C. et al. (1992), J. Immunol. 148:1764).FcRI и FcRI являются предпочтительными передающими рецепторами для применения в биспецифичных молекулах по изобретению, так как они (1) экспрессируются главным образом на иммунных эффекторных клетках, например на моноцитах, PMN, макрофагах и дендритных клетках; (2) экспрессируются с высоким уровнем (например, 5000-100000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксических активностей (например, ADCC, фагоцитоза); (4) опосредуют увеличение антигенной представленности антигенов, включающих собственные антигены, направленные к ним. В то время как человеческие моноклональные антитела являются предпочтительными, другие антитела, которые могут применяться в биспецифичных молекулах по изобретению, включают, например,мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела. Биспецифичные молекулы по настоящему изобретению могут быть получены путем конъюгации компонентов специфичностей связывания, например специфичности связывания с FcR и специфичности связывания с CD70, с применением способов, известных из уровня техники. Например, каждая специфичность связывания биспецифичной молекулы может быть получена по отдельности и затем конъюгирована одна с другой. Когда специфичности связывания представляют собой белки или пептиды, для ковалентной конъюгации могут применяться разнообразные конденсирующие или перекрестносвязывающие агенты. Примеры перекрестно-связывающих агентов включают белок А, карбодиимид, Nсукцинимидил-S-ацетил-тиоацетат (SATA), 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойную кислоту) (DTNB), офенилендималеимид (oPDM), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (см., например, Karpovsky etal. (1984), J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M.A. et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:8648). Другие способы включают описанные Paulus (1985), Behring Ins. Mitt.78, 118-132; Brennan et al. (1985), Science 229:81-83) и Glennie et al. (1987), J. Immunol. 139:2367-2375). Предпочтительными конъюгированными агентами являются SATA и сульфо-SMCC, оба коммерчески доступны от Pierce Chemical Co. (Rockford,IL). Когда специфичности связывания представляют собой антитела, они могут быть конъюгированы через сульфгидрильное связывание С-концевых шарнирных участков двух тяжелых цепей. В конкретном
МПК / Метки
МПК: A61P 31/00, C07K 16/28, A61P 35/00, A61P 37/00, A61K 39/395
Метки: человеческие, антитела, применение, моноклональные
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-16186-chelovecheskie-monoklonalnye-antitela-k-cd70-i-ih-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение</a>
Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
Номер патента: 13677
Опубликовано: 30.06.2010
Авторы: Бодсгорд Оле Д.М.Ск., Уильямс Дениз Ли, Хавенит Катарина Эманюэль Герарда, Ван Де Винкель Ян Г.Й., Петерсен Йорген, Схюрман Янин, Паррен Пауль
МПК: A61K 39/395, A61P 35/00, A61P 37/00...
Метки: применение, антитела, моноклональные, человеческие, против
Формула / Реферат:
1. Выделенное человеческое моноклональное антитело, которое связывается с человеческим CD25 и ингибирует связывание IL-2 с CD25, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область человеческого происхождения, выбранную из группы, состоящей из:(i) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16; или(ii) последовательности, которая по меньшей мере на 90% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична и более предпочтительно по меньшей...
Антиидиотипические моноклональные антитела, их применение в активной иммунотерапии злокачественных опухолей и содержащие их композиции
Номер патента: 3366
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Иглесиас Сьерра Эладио, Бомбино Лопес Гумерсинда, Босолей Дельгадо Ирене, Васкес Лопес Ана Мария, Перес Гонсалес Алексис, Перес Родригес Роландо
МПК: C07K 16/42, A61K 39/395, A61P 35/00...
Метки: применение, моноклональные, антитела, композиции, антиидиотипические, иммунотерапии, содержащие, активной, злокачественных, опухолей
Формула / Реферат:
1. Штамм гибридных клеток ECACC ь 97112901, продуцирующий антиидиотипическое моноклональное антитело 1E10, специфичное в отношении антител мыши к N-гликолилсодержащим ганглиозидным опухолевым антигенам. 2. Антиидиотипическое моноклональное антитело 1E10, специфичное в отношении антител мыши к N-гликолилсодержащим ганглиозидным опухолевым антигенам, продуцируемое штаммом гибридных клеток по п.1 и обладающее защитным действием в отношении...
Моноклональные антитела к растворимому рецептору лпнп человека, способы их получения и применения и гибридомы, продуцирующие указанные антитела
Номер патента: 7494
Опубликовано: 27.10.2006
Авторы: Йонах Начум, Антонетти Франческо, Суисса Дани, Смоларски Моше, Дреано Мишель, Бельзер Илана
МПК: C07K 16/28, A61P 31/20, C12N 5/20...
Метки: указанные, гибридомы, человека, рецептору, продуцирующие, получения, применения, растворимому, моноклональные, лпнп, способы, антитела
Формула / Реферат:
1. Моноклональное антитело, химерное антитело, полностью гуманизированное антитело, антитело к антиидиотипическому антителу или его фрагмент, которое специфически распознает и связывает растворимый рецептор ЛПНП человека и его фрагменты, которое получают путем иммунизации животных формой +291 растворимого рецептора ЛПНП человека, включающей аминокислотную последовательность от Asp +4 до Glu +291 последовательности ЛПНП человека, и которое...
Моноклональные антитела к миостатину и их применения
Номер патента: 15916
Опубликовано: 30.12.2011
Авторы: Сейерз Роберт Оуэн, Хуан Лихуа
МПК: A61P 21/00, C07K 16/22, A61K 39/395...
Метки: моноклональные, антитела, применения, миостатину
Формула / Реферат:
1. Моноклональное антитело к миостатину, включающее области HCVR и LCVR, в котором указанная область HCVR включает:a) CDRH1 с последовательностью SEQ ID NO:23,b) CDRH2 с последовательностью SEQ ID NO:25,c) CDRH3 с последовательностью SEQ ID NO:27,и в котором указанная область LCVR включает:a) CDRL1 с последовательностью SEQ ID NO:13,b) CDRL2 с последовательностью SEQ ID NO:14 иc) CDRL3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ...
Ингибиторы ароматазы и моноклональные антитела против her2 как противоопухолевые агенты
Номер патента: 5931
Опубликовано: 25.08.2005
Авторы: Пурандаре Дайнеш, Пишителли Габриэлла, Массимини Джорджо
МПК: A61P 35/00, A61K 39/395
Метки: антитела, ароматазы, агенты, против, противоопухолевые, моноклональные, ингибиторы
Формула / Реферат:
1. Применение ингибитора ароматазы для производства фармацевтической композиции для лечения гормонзависимого нарушения, характеризуемого сверхэкспрессией HER2. 2. Применение по п.1, где нарушение представляет собой рак молочной железы, шейки матки, яичников и эндометрия или эндометриоз. 3. Применение по п.2, где нарушение представляет собой рак молочной железы. 4. Применение по п.1, где ингибитор ароматазы выбран из эксеместана,...
Предыдущий патент: Моноклональное антитело или его фрагмент к подобному ангиопоэтину белку 4 (angptl4) и их применение
Следующий патент: Способ получения модификатора битума
Случайный патент: Ингибиторы коррозии для водных препаративных форм пестицидов