Фармацевтическая композиция

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим короткие одноцепочечные олигонуклеотиды длиной 8-26 нуклеотидов, комплементарных человеческим микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-19b, miR-21, miR-122a, miR-155 и miR-375. Короткие олигонуклеотиды особенно эффективно способствуют подавлению миРНК in vivo. Было обнаружено, что включение высокоаффинных нуклеотидных аналогов в олигонуклеотиды приводит к образованию высокоэффективных молекул, которые подавляют микроРНК и, очевидно,действуют посредством образования почти необратимых дуплексов с миРНК-мишенью, но не посредством механизмов на основе расщепления РНК, таких как механизмы, ассоциированные с действием РНКазы Н или RISC. 015570 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающимLNA-содержащие одноцепочечные олигонуклеотиды, способные ингибировать вызывающие заболевания микроРНК, в частности человеческие микроРНК miR-19b, miR-21, miR-122a, miR-155 и miR-375. Предшествующий уровень техники МикроРНК - новые регуляторы экспрессии генов. МикроРНК (миРНК) принадлежат к широкому классу коротких эндогенных РНК, которые действуют как посттранскрипционные регуляторы экспрессии генов посредством спаривания оснований с основаниями их мРНК-мишеней. Зрелые миРНК последовательно процессируются из более длинных шпилечных транскриптов под действием рибонуклеаз РНКазы III Drosha (Lee et al., 2003) и Dicer (Hutvagneret al., 2001, Ketting et al., 2001). На октябрь 2005 г. в базе данных микроРНК, miRBase, версия 7.1, имеется более чем 3400 миРНК позвоночных, беспозвоночных и растений (Griffith-Jones 2004, Griffith-Jones etal., 2006), а также были идентифицированы многие миРНК, соответствующие предполагаемым генам. У большинства животных миРНК распознают свои сайты-мишени, локализованные в 3'-UTR, посредством неполного спаривания оснований, что приводит к подавлению трансляции генов-мишеней(Bartel, 2004). Более широкомасштабные исследования показали, что миРНК животных играют фундаментальную биологическую роль в росте и апоптозе клеток (Brennecke et al., 2003), в дифференцировке гемопоэтических клеток (Chen et al., 2004), в регуляции продолжительности жизни клеток (Boehm and(Yekta et al., 2004, Hornstein et al., 2005), в формировании асимметрии нейронов (Johnston et al., 2004), в секреции инсулина (Роу et al., 2004), в морфогенезе головного мозга (Giraldez et al., 2005), в пролиферации и дифференцировке мышечных клеток (Chen, Mandel et al., 2005, Kwon et al., 2005, Sokol and Ambros,2005), в кардиогенезе (Zhao et al., 2005) и в позднем эмбриональном развитии позвоночных (Wienholds etal., 2005). МикроРНК, участвующие в развитии заболеваний человека. миРНК участвуют в развитии человеческих заболеваний широкого ряда. Одним из таких заболеваний является мышечная атрофия спинного мозга (SMA), нейродегенеративные заболевания у детей, вызываемые снижением уровней белка или мутацией, что обусловлено потерей функции гена, ответственного за выживание двигательных нейронов (SMN) (Paushkin et al., 2002). Недавно было обнаружено, что мутация в сайте-мишени miR-189 человеческого гена SLITRK1 ассоциируется с развитием синдрома Туретта (Abelson et al., 2005), хотя в других недавно проведенных исследованиях сообщалось, что РНК-содержащий геном вируса гепатита С взаимодействует с микроРНК клетки-хозяина, т.е. с печеньспецифической miR-122a, и, тем самым, облегчает ее репликацию в хозяине (Jopling et al., 2005). Другим заболеванием, в развитии которого участвуют миРНК или которое вызвано механизмами их процессинга, является умственная отсталость, ассоциированная с синдромом ломкой Х-хромосомы (FXMR) и вызываемая отсутствием белка, ответственного за развитие указанного синдрома ломкой Х-хромосомы,приводящего к снижению продолжительности жизни (FMRP) (Nelson et al., 2003, Jin et al. 2004), и синдрома Ди Георге (Landthaler et al., 2004). Кроме того, сообщалось, что при многих раковых заболеваниях человека наблюдалось нарушенние профилей экспрессии миРНК. Так, например, в большинстве случаев хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) человеческие гены миРНК miR-15a и miR-16-1 подвергаются делеции или ингибированию, и недавно было показано, что уникальная "сигнатура" из 13 генов миРНК может быть использована для прогноза и прогрессирования заболевания (Calin et al., 2002, Calin et al. 2005). Роль миРНК в развитии рака подтверждается тем фактом, что более 50% человеческих генов миРНК расположено в ассоциированных с раком геномных областях или в "ломких" сайтах (Calin et al., 2004). Недавно проведенный анализ системной экспрессии у людей с различными злокачественными заболеваниями показал, что в опухолях, по сравнению с нормальными тканями, происходит общее ингибирование миРНК (Lu et al., 2005). Интересно отметить, что классификация низкодифференцированных опухолей на основе миРНК была проведена успешно, тогда как в тех же самых образцах профили миРНК оказались в высокой степени неточными. Было также обнаружено, что нарушение регуляции миРНК происходит при раке молочной железы (Iorio et al., 2005), раке легких (Johnson et al., 2005) и раке толстой кишки(Michael et al., 2004), и сообщалось, что кластер miR-17-92, который амплифицируется в человеческих Вклеточных лимфомах, а также miR-155, который активируется в лимфоме Беркитта, являются главными человеческими миРНК-онкогенами (Eis et al., 2005, Не et al., 2005). Таким образом, в будущем человеческие миРНК могут быть с успехом использованы не только в качестве биомаркеров для диагностики рака, но также, как уже обсуждается в последнее время, в качестве привлекательных мишеней для лечения заболеваний с применением олигонуклеотидной технологии.-1 015570 Ингибирование микроРНК с использованием одноцепочечных олигонуклеотидов. Для ингибирования миРНК было описано несколько способов с применением олигонуклеотидной технологии. В WO 03/029459 (Tuschl) заявлены олигонуклеотиды, кодирующие микроРНК и их комплементы длиной в 18-25 нуклеотидов, которые могут включать нуклеотидные аналоги. Было также высказано предположение, что возможным нуклеотидным аналогом является LNA, хотя в данной заявке LNAсодержащие олигонуклеотиды не описаны. В заявке Tuschl указывается, что олигонуклеотиды миРНК могут быть использованы в терапии. В заявке US2005/0182005 описан 24-мерный олигорибонуклеотид 2'ОМе-РНК, комплементарный самой длинной форме miR-21, который, как было обнаружено, снижает уровень miR-21-индуцированной репрессии, тогда как эквивалентный ДНК-содержащий олигонуклеотид не обладает такой функцией. Термин "2'OMe-РНК" означает аналог РНК, где во 2-положении имеется замещение метилом(2'-O-метил). Заявка US2005/0227934 (Tuschl) относится к mir-ингибирующим молекулам (antimir), содержащим до 50% остатков ДНК. Также сообщалось, что 2'ОМе-РНК, содержащие молекулы antimir, могут быть использованы для подавления микроРНК поджелудочной железы, однако фактические структуры этих олигонуклеотидов не описаны. В US200/50261218 (ISIS) заявлено олигомерное соединение, включающее первую область и вторую область, где по меньшей мере одна область содержит модификацию, а часть олигомерного соединения нацелена на небольшую некодирующую нуклеиновую кислоту, являющуюся РНК-мишенью, где указанный небольшой некодирующей нуклеиновой кислотой, которая представляет собой РНК-мишень, является миРНК. Были также заявлены олигомерные соединения, имеющие длину 17-25 нуклеотидов. Примеры относятся, главным образом, к 2'ОМе-PS-соединениям, 21-мерам, 20-мерам и к 2'ОМе-гэп-мерным олигонуклеотидам, нацеленным на ряд пре-миРНК и зрелых миРНК-мишеней. В работе Boutla et al., 2003 (Nucleic Acids Research, 31: 4973-4980) описано использование антисмысловых ДНК-олигонуклеотидов, комплементарных 11 различным миРНК у дрозофил (Drosophila), а также их использование для инактивации миРНК путем введения ДНК-олигонуклеотидов в эмбрионы мух. Из 11 антисмысловых ДНК-олигонуклеотидов лишь 4 конструкции вызывали значительное подавление нормального развития, а остальные 7 олигонуклеотидов не давали какого-либо изменения фенотипа, что,вероятно, обусловлено их неспособностью ингибировать рассматриваемую миРНК.Hutvagner et al. (2004) и Leaman et al. (2005) был описан альтернативный метод, в котором антисмысловые 2'-O-метил-олигонуклеотиды, комплементарные зрелой миРНК, могут быть использованы в качестве сильнодействующих и необратимых ингибиторов функций короткой интерферирующей РНК(киРНК) и миРНК in vitro и in vivo у Drosophila и С.elegans и, следовательно, в качестве индукторов фенотипа, характеризующихся отсутствием таких функций. Недостатком такого метода является необходимость проведения экспериментов по трансфекции и инъекции высоких концентраций 2'-O-метилолигонуклеотидов (100 мкмоль), которые могут быть токсичными для животного. Этот метод был недавно применен в исследованиях на мышах и включает конъюгирование антисмысловых 2'-О-метилолигонуклеотидов, комплементарных четырем различным миРНК, с холестерином для сайленсинга РНКin vivo (Krtzfedt et al., 2005). Эти так называемые антагонисты mir (antagomir) были введены мышам путем внутривенных инъекций. Хотя такие эксперименты приводили к эффективному сайленсингу эндогенных миРНК in vivo, который, как было обнаружено, был специфическим, эффективным и продолжительным, однако главным недостатком такого метода является то, что для эффективного сайленсинга необходимо вводить высокую дозу (80 мг/кг) 2'OMe-antagomir. Ингибирование микроРНК с использованием LNA-модифицированных олигонуклеотидов было описано в работах Chan et al. Cancer Research, 2005, 65 (14), 6029-6033, Lecellier et al. Science, 2005, 308,557-560, Naguibneva et al. Nature Cell Biology, 2006, 8 (3), 278-84 и rum et al. Gene 2006 (доступных онлайн с 24 февраля 2006 г.). Во всех случаях LNA-модифицированные олигонуклеотиды-антагонисты mir были комплементарны полноразмерной зрелой микроРНК, т.е. имели длину в 20-23 нуклеотида, что препятствовало эффективному поглощению этих молекул in vivo и их широкому биологическому распределению. В работе Naguibneva (Naguibneva et al. Nature Cell Biology, 2006, 8) описано использование смешанного антисмыслового олигонуклеотида "ДНК-LNA-ДНК", направленного против mir, для ингибирования функции микроРНК miR-181 in vitro, где блок из 8 нуклеотидов LNA расположен в центре молекулы,фланкированной 6 нуклеотидами ДНК у 5'-конца и 9 нуклеотидами ДНК у 3'-конца соответственно. Главным недостатком такой антисмысловой конструкции является ее низкая стабильность in vivo, обусловленная низкой резистентностью фланкирующих ДНК-концов к нуклеазе. В своих исследованиях Chan et al. (Chan et al. Cancer Research, 2005, 65 (14), 6029-6033) и rum et al.(rum et al. Gene, 2006) (доступных он-лайн с 24 февраля 2006 г.) не описывают конструирования LNAмодифицированных молекул-антагонистов mir, a Lecellier et al. (Lecellier et al. Science, 2005, 308, 557560) описывают использование гэп-мерного антисмыслового LNA-ДНК-LNA-олигонуклеотида, являющегося антагонистом mir, в целях ингибирования функций микроРНК, где в указанном олигонуклеотиде-2 015570 блок из 4 LNA-нуклеотидов расположен у 5'- и 3'-конца соответственно, при этом в центре данной молекулы имеется "окно" из 13 ДНК-нуклеотидов. Главными недостатками такой антисмысловой конструкции являются низкий уровень поглощения in vivo, а также низкая стабильность in vivo, обусловленные присутствием в указанном олигонуклеотиде-антагонисте mir ДНК-фрагмента из 13 нуклеотидов. Таким образом, необходимость в повышении способности олигонуклеотидов ингибировать микроРНК остается актуальной. Описание сущности изобретения Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что использование коротких олигонуклеотидов, сконструированных для высокоаффинного связывания с миРНК-мишенями, является в высокой степени эффективным для ослабления репрессии мРНК под действием микроРНК in vivo. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, следует лишь отметить, что высокоэффективное нацеливание на миРНК in vivo может быть осуществлено путем конструирования олигонуклеотидов для получения в высокой степени стабильного дуплекса с миРНК-мишенью in vivo. Это может быть достигнуто с использованием высокоаффинных нуклеотидных аналогов, таких как по меньшей мере один изLNA-остатков, и других подходящих высокоаффинных аналогов нуклеотидных аналогов, таких как,LNA, 2'MOe-РНК, состоящие из 2'-фтор-нуклеотидных аналогов, короче, таких как олигонуклеотиды,состоящие из 10-17 или 10-16 нуклеотидных оснований. В одном из аспектов целью изобретения является получение олигонуклеотида, имеющего длину, недостаточную для образования киРНК-комплекса (т.е. короткого олигонуклеотида), и содержащего достаточное количество высокоаффинных нуклеотидных аналогов, благодаря которым такой олигонуклеотид почти всегда связывается со своей миРНКмишенью, что приводит к эффективному образованию стабильного и нефункционального дуплекса с миРНК-мишенью. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что такие конструкции являются значительно более эффективными, чем известные олигонуклеотиды, а в частности гэп-мерные и блокмерные конструкции, и олигонуклеотиды, имеющие длинную последовательность, например 20-23 меры. Термин "2'-фтор-ДНК" означает аналог ДНК, в котором во 2'-положении имеется замещение фтором (2'F). Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей олигонуклеотид,имеющий длину 8-17, например 10-17, а именно 8-16 или 10-16 нуклеотидных остатков, фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант, где по меньшей мере одно из нуклеотидных остатков одноцепочечного олигонуклеотида представляет собой высокоаффинный нуклеотидный аналог,такой как остаток нуклеотидного основания блокированной нуклеиновой кислоты (LNA), и где указанный одноцепочечный олигонуклеотид комплементарен человеческой последовательности микроРНК,выбранной из группы, состоящей из человеческих микро-РНК miR-19b, miR-21, miR-122a, miR-155 иmiR-375. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей олигонуклеотид,имеющий длину в 10-26 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант, где указанный олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или от положений 3-8, если считать от 3'-конца, 3'-acgttt-5' (SEQ ID NO: 6, 5'-tttgca-3'), где по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, ДНК-остатка в указанной последовательности были замещены соответствующими нуклеотидами LNA и где, но необязательно, указанный олигонуклеотид не содержит область из более чем 7 смежных остатков ДНК. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей олигонуклеотид,имеющий длину в 10-26 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант, где указанный олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или от положений 3-8, если считать от 3'-конца, 3'-ctcaca-5' (SEQ ID NO: 7, 5'-acactc-3'), где по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, ДНК-остатка в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками LNA и где указанный олигонуклеотид, но необязательно, не содержит область из более чем 7 смежных остатков ДНК. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей олигонуклеотид,имеющий длину в 10-26 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант, где указанный олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или от положений 3-8, если считать от 3'-конца, 3'-ttacga-5' (SEQ ID NO: 8, 5'-agcatt-3'), где по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, ДНК-остатка в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками LNA и где, но необязательно, указанный олигонуклеотид не содержит область из более чем 7 смежных остатков ДНК. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий длину в 10-26 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый разбавитель,носитель или адъювант, где указанный олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или от положений 3-8, если считать от 3'-конца, 3'-acaagc-5' (SEQ ID NO: 9, 5'-cgaaca-3'),где по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, ДНК-остатка в указанной последовательности были заменены соответствующими нуклеотидами LNA и где указанный олигонуклеотид, необязательно, не содержит область из более чем 7 смежных остатков ДНК.-3 015570 Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий длину в 10-26 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый разбавитель,носитель или адъювант, где указанный олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или от положений 3-8, если считать от 3'-конца, 3'-cgaata-5' (SEQ ID NO: 10, 5'-ataagc-3'),где по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, ДНК-остатка в указанной последовательности были замещены соответствующими остатками LNA и где указанный олигонуклеотид, необязательно, не содержит область из более чем 7 смежных остатков ДНК. Высокоаффинными нуклеотидными аналогами являются нуклеотидные аналоги, образующие олигонуклеотид, который, в случае если он образует дуплекс с комплементарным нуклеотидом РНК, имеет более высокую термостабильность, чем в случае его аффинного связывания с эквивалентным нуклеотидом ДНК. Такое свойство обычно определяют путем измерения Тm. Авторы настоящего изобретения при использовании указанных коротких высокоаффинных олигонуклеотидов, направленных против специфичных миРНК, не обнаружили каких-либо нежелательных эффектов. Действительно, данные, приведенные в настоящем описании, указывают на то, что влияние на экспрессию мРНК обусловлено присутствием последовательности, комплементарной миРНК-мишени(первичной мРНК-мишени), в мРНК или вторичным действием на мРНК, которые регулируются первичными мРНК-мишенями (вторичными мРНК-мишенями). При этом не было обнаружено какого-либо токсического действия, что указывало на отсутствие каких-либо явных негативных побочных эффектов. Настоящее изобретение также относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению,такого как олигонуклеотид, который может образовывать часть фармацевтической композиции, в целях приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или патологического расстройства,ассоциированного с присутствием или со сверхэкспрессией (активацией) микроРНК. Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания или патологического расстройства, ассоциированного с присутствием или со сверхэкспрессией микроРНК, где указанный способ включает стадию введения композиции (такой как фармацевтическая композиция) согласно изобретению индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. Настоящее изобретение также относится к способу снижения эффективного количества миРНК в клетке или в организме, включающему введение композиции (такой как фармацевтическая композиция) согласно изобретению или одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению в указанную клетку или в указанный микроорганизм. В контексте настоящего описания снижение эффективного количества означает снижение количества функциональной миРНК, присутствующей в данной клетке или в данном организме. При этом следует отметить, что предпочтительные олигонуклеотиды согласно изобретению не всегда могут значительно снижать фактическое количество миРНК, присутствующей в клетке или в организме, поскольку они обычно образуют в высокой степени стабильные дуплексы со своими миРНКмишенями. Настоящее изобретение также относится к способу дерепрессии мРНК-мишени для миРНК в клетке или организме, включающему введение композиции (такой как фармацевтическая композиция) или одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению в клетку или организм. Настоящее изобретение также относится к использованию одноцепочечного олигонуклеотида длиной в 8-16, например 10-16, нуклеотидных оснований в целях приготовления лекарственного препарата для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного с присутствием или со сверхэкспрессией микроРНК. Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания или патологического расстройства, ассоциированного с присутствием или со сверхэкспрессией микроРНК, где указанный способ включает введение композиции (такой как фармацевтическая композиция), содержащей одноцепочечный олигонуклеотид длиной 8-16, например 10-16, нуклеотидных оснований индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. Настоящее изобретение также относится к способу снижения эффективного количества миРНКмишени (т.е. количества миРНК, которое является достаточным для ингибирования мРНК-мишеней) в клетке или в организме, где указанный способ включает введение композиции (такой как фармацевтическая композиция), содержащей одноцепочечный олигонуклеотид длиной в 8-16, например 10-16, нуклеотидных оснований в клетку или организм. Настоящее изобретение также относится к способу дерепрессии мРНК-мишени для миРНК в клетке или организме, включающему введение одноцепочечного олигонуклеотида длиной в 8-16, например 1016, нуклеотидных оснований (или композиции, содержащей указанный олигонуклеотид) в клетку или в организм.-4 015570 Настоящее изобретение также относится к способу синтеза одноцепочечного олигонуклеотида, направленного против человеческой микроРНК, выбранной из группы, состоящей из человеческих микроРНК miR-19b, miR-21, miR-122a, miR-155 и miR-375, такого как описанный здесь одноцепочечный олигонуклеотид, где указанный способ включает стадии:a) необязательного выбора первого, считая с 3'-конца, нуклеотидного основания, которое представляет собой нуклеотидный аналог, такой как нуклеотидное основание LNA;b) необязательного выбора второго, считая с 3'-конца, нуклеотидного основания, которое представляет собой нуклеотидный аналог, такой как нуклеотидное основание LNA;c) выбора области одноцепочечного олигонуклеотида, которая соответствует уникальной области(seed-области) миРНК, где указанная область определена в настоящем изобретении;e) необязательного выбора 1-10 дополнительных нуклеотидных оснований, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из нуклеотидов (х) и нуклеотидных аналогов (X), таких как LNA;g) необязательного выбора 5'-концевого одноцепочечного олигонуклеотида, определенного в настоящем изобретении. Если указанный синтез осуществляют путем последовательного присоединения областей, определенных в стадиях а)-g), то этот синтез может быть проведен либо в направлении 3'-5' (а-g), либо в направлении 5'-3' (g-a), где указанный одноцепочечный олигонуклеотид комплементарен последовательности миРНК-мишени. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению конструируют так, чтобы он не подвергался связыванию под действием RISC или не мог опосредовать RISC-направленное расщепление миРНК-мишени. При этом считается, что при использовании длинных олигонуклеотидов, например 21- или 22-меров, в частности РНК-олигонуклеотидов или РНК-олигонуклеотидов-"аналогов", которые комплементарны миРНК-мишени, указанный олигонуклеотид может конкурировать с мРНКмишенью за связывание с RISC-комплексом и тем самым ослаблять репрессию мРНК, являющейся мишенью для миРНК, посредством включения олигонуклеотида, который конкурирует как субстрат за связывание с миРНК. Однако настоящее изобретение было разработано для предупреждения такого нежелательного расщепления мРНК-мишени или ингибирования ее трансляции путем создания олигонуклеотидов, способных к комплементарному, а в некоторых случаях, вероятно, почти к необратимому их связыванию со зрелой микроРНК. Это, очевидно, приводит к запуску механизма защиты от деградации или расщепления (например, под действием RISC или РНКазы Н или других эндо- или экзонуклеаз), и такой запуск не может приводить к значительному или даже значимому снижению уровней миРНК в клетке (например,как было определено с помощью нозерн-блот-анализа, проводимого с использованием LNA-зондов), но гарантирует значительное снижение эффективного количества миРНК, как было определено в анализе на дерепрессию. Поэтому в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам,которые были специально сконструированы так, чтобы они были несовместимы с RISC-комплексом и чтобы миРНК можно было удалять путем титрования олигонуклеотидом. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, объясняющей причину такой эффективности олигонуклеотидов согласно изобретению, можно лишь отметить, что если провести аналогию с РНК-олигонуклеотидами (или полноразмерными 2'OМе-олигонуклеотидами), то становится очевидным, что олигонуклеотиды согласно изобретению действуют по механизму неконкурентного ингибирования функции миРНК, поскольку они эффективно удаляют имеющуюся миРНК из цитоплазмы, тогда как известные олигонуклеотиды являются альтернативными субстратами для миРНК, которые могут действовать как конкурентные ингибиторы, эффективность которых должна в высокой степени зависеть от концентрации олигонуклеотида в цитоплазме, а также от концентрации мРНК- и миРНК-мишени. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, следует отметить, что еще одной проблемой, которая может возникать в случае использования олигонуклеотидов, имеющих длину, приблизительно аналогичную длине миРНК-мишеней (т.е. миРНК), является то, что эти олигонуклеотиды могут образовывать киРНК-подобный дуплекс с миРНК-мишенью, а это приводит к снижению эффективности олигонуклеотида. Возможно также, что сами олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве ведущей цепи в RISC-комплексе, в результате чего возникает возможность осуществления RISC-направленной деградации неспецифических мишеней, которые чисто случайно могут быть достаточно комплементарными "ведущему" олигонуклеотиду. Эти проблемы можно решить путем выбора коротких олигонуклеотидов для нацеливания на последовательности миРНК.-5 015570 Короткие олигонуклеотиды, которые включают LNA, известны специалистам, работающим с такими реагентами, как LNA (см., например, WO 2005/098029 и WO 2006/069584). Однако молекулы, предназначенные для их использования в целях диагностики или в качестве реагентов, по своей конструкции значительно отличаются от олигонуклеотидов, используемых в фармацевтических целях. Так, например,концевыми нуклеотидными основаниями этих олигонуклеотидных реагентов обычно являются ДНК, а не LNA, a межнуклеозидными связями обычно являются другие, нефосфортиоатные связи, т.е. связи,которые не являются предпочтительными для использования в олигонуклеотидах согласно изобретению. Поэтому настоящее изобретение, по существу, относится к новому классу олигонуклеотидов. Настоящее изобретение также относится к (одноцепочечному) олигонуклеотиду, описанному в разделе, посвященном фармацевтической композиции согласно изобретению, где указанный олигонуклеотид включает:(i) по меньшей мере одну фосфортиоатную связь, и/или(ii) по меньшей мере один 3'-концевой остаток LNA, и/или(iii) по меньшей мере один 5'-концевой остаток LNA. Для большинства терапевтических применений предпочтительно, чтобы олигонуклеотид был полностью фосфортиолирован, за исключением терапевтических олигонуклеотидов, применяемых для лечения заболеваний ЦНС, таких как заболевания головного мозга или позвоночника, где такое фосфортиолирование может быть токсичным, что обусловлено отсутствием нуклеаз, при этом фосфордиэфирные связи могут быть использованы даже между смежными ДНК-остатками. Как указывается в настоящем изобретении, в соответствии с другими предпочтительными аспектами изобретения олигонуклеотидом согласно изобретению является олигонуклеотид, в котором второе нуклеотидное основание и/или 9- и 10-е нуклеотидные основания (от 3'-конца) могут также представлять собой LNA. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что могут быть также применены и другие методы предотвращения расщепления РНК (такого как деградация под действием экзонуклеаз в сыворотке крови или RISC-ассоциированное расщепление олигонуклеотида согласно изобретению), а поэтому настоящее изобретение также относится к одноцепочечному олигонуклеотиду, который содержит:b) остаток LNA в положениях 9 и/или 10, также считая от 3'-конца; и/илиc) любой один или два остатка 5'-LNA. Хотя преимущества указанных других аспектов можно продемонстрировать на примере более длинных олигонуклеотидов, таких как нуклеотиды длиной до 26 нуклеотидных оснований, однако, принимая во внимание указанные отличительные признаки, можно также использовать и более короткие олигонуклеотиды, описанные в настоящем изобретении, такие как олигонуклеотиды, имеющие 8-17,8-16, 10-17 или 10-16 нуклеотидных оснований. Особенно предпочтительно, чтобы олигонуклеотиды содержали высокоаффинные нуклеотидные аналоги, такие как аналоги, описанные в настоящем изобретении, а наиболее предпочтительно остатки LNA. Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что правильно сконструированные одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие остатки блокированной нуклеиновой кислоты(LNA) в определенном порядке, играют важную роль в сайленсинге микроРНК, что приводит к снижению уровней микроРНК. Было обнаружено, что важное значение имеет жесткое связывание указанных олигонуклеотидов с так называемой уникальной (seed) последовательностью микроРНК-мишеней в положении нуклеотидов 2-8 или 2-7 от 5'-конца. Нуклеотид 1 микроРНК-мишеней представляет собой неспаривающееся основание и, по всей вероятности, скрытое в связывающем кармане белка Ago 2. Не высказывая какой-либо конкретной теории, авторы настоящего изобретения лишь отмечают, что посредством отбора последовательностей уникальной области, в частности области, включающей олигонуклеотиды, содержащие LNA, а предпочтительно остатки LNA в области, комплементарной уникальной области, т.е. где дуплекс, образованный между миРНК и олигонуклеотидом, является особенно эффективным для нацеливания на миРНК, можно избежать возникновения побочных эффектов и сообщать олигонуклеотиду другое отличительное свойство, которое позволяло бы предотвращатьRISC-направленное действие на миРНК. Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что сайленсинг микроРНК может оказаться даже еще более сильным в том случае, если LNA-модифицированные одноцепочечные олигонуклеотиды не содержат нуклеотида у 3'-конца, соответствующего данному неспаренному нуклеотиду 1. Было также обнаружено, что два остатка LNA у 3'-конца олигонуклеотидов согласно изобретению придают указанным олигонуклеотидам высокий уровень резистентности к нуклеазе. Было также обнаружено, что олигонуклеотиды согласно изобретению, которые имеют по меньшей мере один нуклеотидный аналог, такой как нуклеотид LNA в положениях, соответствующих положениям 10 и 11 от 5'-конца микроРНК-мишени, могут предупреждать расщепление олигонуклеотидов согласно изобретению.-6 015570 В соответствии с этим в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, имеющему длину от 12 до 26 нуклеотидов, где:i) первый нуклеотид, от 3'-конца, представляет собой остаток блокированной нуклеиновой кислотыii) второй нуклеотид, от 3'-конца, представляет собой остаток LNA;iii) девятый и/или десятый нуклеотиды, от 3'-конца, представляют собой остаток LNA. Настоящее изобретение также относится к определенным здесь олигонуклеотидам, которые могут быть использованы в качестве лекарственного средства. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим определенные здесь олигонуклеотиды и фармацевтически приемлемый носитель. Как упоминалось выше, микроРНК ассоциируются с развитием ряда заболеваний. Следовательно, в своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению определенного здесь олигонуклеотида в целях получения лекарственного средства для лечения заболеваний, ассоциированных с экспрессией микроРНК и выбранных из группы, состоящей из атрофии мышц позвоночника, синдрома Туретта, заболевания, вызываемого вирусом гепатита С, умственной отсталости, т.е. синдрома "ломкой" Х-хромосомы, синдрома Ди Георге и рака, такого как хронический лимфоцитарный лейкоз, рак молочной железы, рак легких и рак толстой кишки. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения уровней микроРНКмишени, который включает контактирование микроРНК-мишени с определенным здесь олигонуклеотидом, где указанный олигонуклеотид: 1) является комплементарным микроРНК-мишени; 2) не содержит нуклеотида у 3'-конца, соответствующего первому нуклеотиду у 5'-конца микроРНК-мишени. Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27,SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87,SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 89; где строчные буквы обозначают азотистые основания остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистые основания остатка LNA и где цитозины LNA являются, но необязательно, метилированными, или к его конъюгату. Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95,SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 101; где строчные буквы обозначают азотистые основания остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистые основания остатка LNA и где цитозины LNA являются, но необязательно, метилированными, или к его конъюгату. Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31,SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37,SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 и SEQ ID NO: 105; где строчные буквы обозначают азотистые основания остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистые основания остатка LNA и где цитозины LNA являются, но необязательно, метилированными, или к его конъюгату. Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49,SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55,SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 и SEQ ID NO: 109; где строчные буквы обозначают азотистые основания остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистые основания остатка LNA и где цитозины LNA являются, но необязательно, метилированными, или к его конъюгату. Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67,SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41,SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, где строчные буквы обозначают азотистые основания остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистые основания остатка LNA и где цитозины LNA являются, но необязательно, метилированными, или к его конъюгату. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид может иметь нуклеотидную последовательность из 1-17 нуклеотидных оснований, например из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеотидных оснований, и в таком варианте изобретения олигонуклеотидные основания могут составлять непрерывную подпоследовательнось в описанных здесь олигонуклеотидах.-7 015570 Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что антисмысловые олигонуклеотиды определенной длины, содержащие конкретную коровую ДНК-последовательность и блокированные нуклеиновые кислоты (LNA) в указанной коровой последовательности, обладают превосходными микроРНК-ингибирующими свойствами. Краткое описание графического материала Фиг. 1. Влияние обработки различными LNA-олигонуклеотидами, направленными против miR, на экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени в miR-122 а-экспрессирующей клеточной линии HuH-7. Указаны также количества miR-122a (в условных единицах), полученные в результате проведения miR-122 аспецифической количественной ОТ-ПЦР, по сравнению с необработанными клетками (контроль). LNAолигонуклеотиды, направленные против miR, были использованы в двух концентрациях, 1 и 100 нМ соответственно. Был также включен контроль с несоответствиями (SPC3350) по сравнению с SPC3349(также обозначенный здесь SPC3549). Фиг. 2. Оценка дозозависимого ингибирования нуклеиновой кислотой LNA против miR-122a,SPC3548 и SPC3549 по сравнению с SPC3372, где указанную оценку проводили in vivo в мышиной печени с помощью miR-122 а-специфической ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Фиг. 2b. Уровни miR-122 в мышиной печени после обработки различными LNA, направленными против miR (LNA-antimiR). Молекулы LNA-antimiR, SPC3372 и SPC3649, вводили здоровым мышам посредством трех i.р.-инъекций через день в течение шести дней в указанных дозах и мышей умерщвляли через 48 ч после введения последней дозы. Полноразмерную РНК экстрагировали из мышиной печени, а уровни miR-122 определяли с помощью miR-122-специфической количественной ПЦР. Фиг. 3. Оценка уровней холестерина в плазме у мышей, обработанных LNA против miR-122a, по сравнению с уровнями холестерина у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор. Фиг. 4 а. Оценка относительных уровней мРНК Bckdk у мышей, обработанных LNA против miR122a, по сравнению с уровнями у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор, где указанную оценку проводили с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Фиг. 4b. Оценка относительных уровней мРНК альдолазы А у мышей, обработанных LNA противmiR-122a, по сравнению с уровнями у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор,где указанную оценку проводили с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Фиг 4 с. Оценка относительных уровней мРНК GAPDH у мышей, обработанных LNA против miR122a (животные 4-30), по сравнению с уровнями у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор (животные 1-3), где указанную оценку проводили с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Фиг. 5. Оценка дозозависимого ингибирования miR-122a нуклеиновой кислотой LNA, проводимая in vivo в мышиной печени с помощью miR-122 а-специфической ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Шесть групп животных (5 мышей на группу) обрабатывали следующим образом. Животным группы 1 вводили i.v. 0,2 мл физиологического раствора каждый день в течение 3 дней, животным группы 2 вводили 2,5 мг/кг SPC3372, животным группы 3 вводили 6,25 мг/кг SPC3372, животным группы 4 вводили 12,5 мг/кг SPC3372, животным группы 5 вводили 25 мг/кг SPC3372, а животным группы 6 вводили 25 мг/кг SPC3373 (олигонуклеотида LNA против miR с несоответствующими основаниями), где каждую инъекцию вводили одним и тем же способом. Этот эксперимент повторяли (n=10) и результаты объединяли. Фиг. 6. Проводили сравнение нозерн-блотов SPC3649 и SPC3372. Полноразмерную РНК от одной мыши в каждой группе подвергали miR-122-специфическому нозерн-блоттингу. Показаны зрелый miR122 и дуплекс (блокированной микроРНК), образованный между LNA-antimiR и miR-122. Фиг. 7. Мышей обрабатывали 25 мг/кг/день LNA-antimiR или физиологическим раствором каждый день в течение трех дней и умерщвляли через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы. Включены также значения, полученные для животных, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы (пример 11, "старая конструкция"). Уровни miR-122 оценивали с помощью количественной ПЦР и нормализовали по среднему значению, полученному для группы мышей, которым вводили физиологический раствор в каждый выбранный момент времени. Включены также значения, полученные для животных, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы (указано среднее и среднеквадратическая ошибка, n=7, 24 ч, n=10). Умерщвление на дни 9, 16 или 23 соответствует умерщвлению через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы. Фиг. 8. Мышей обрабатывали 25 мг/кг/день LNA-antimiR или физиологическим раствором каждый день в течение трех дней и умерщвляли через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы. Включены также значения, полученные для животных, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы (пример 11, "старая конструкция"). Измеряли уровень холестерина в плазме и нормализовали по значению, полученному для группы мышей, которым вводили физиологический раствор в каждый выбранный момент времени (указано среднее и среднеквадратическая ошибка, n=7, 24 ч, n=10).-8 015570 Фиг. 9. Дозозависимое индуцирование мРНК, являющейся мишенью для miR-122a, путем ингибирования miR-122a под действием SPC3372. Мышей обрабатывали различными дозами SPC3372 каждый день в течение трех дней, как описано выше, и умерщвляли через 24 ч после введения последней дозы. Полноразмерную РНК, экстрагированную из печени, подвергали количественной ПЦР. Гены, которые имели предсказанный сайт-мишень для miR-122 и активировались, как наблюдалось в анализе, проводимом на микромассивах, оценивали с помощью количественной ПЦР на дозозависимое индуцирование путем увеличения доз SPC3372. Полноразмерную РНК печени, взятую от 2-3 мышей на группу, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы, подвергали количественной ПЦР для указанных генов. На фиг. 9 показаны уровни мРНК по сравнению с уровнями мРНК у животных в группе, которой вводили физиологический раствор, n=2-3 (2,5-12,5 мг/кг/день: n=2, без среднеквадратической ошибки). Показан также контроль с несоответствиями (mm, SPC3373). Фиг. 10. Временное индуцирование мРНК-мишеней для miR-122a-мишени после обработки молекулой SPC3372. Самок мышей NMRI обрабатывали 25 мг/кг/день SPC3372, а контрольным животным вводили физиологический раствор каждый день в течение трех дней и умерщвляли через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы соответственно. РНК экстрагировали из печени и уровни предсказанных мРНК, которые являются мишенью для miR-122 а и которые были отобраны исходя из данных анализа на микромассивах, оценивали с помощью количественной ПЦР. Были проанализированы по три животных от каждой группы. Фиг. 11. Индуцирование Vldlr в печени путем SPC3372-обработки. Те же самые образцы РНК печени, которые были использованы в предыдущем примере (фиг. 10), оценивали на индуцирование Vldlr. Фиг. 12. Стабильность дуплекса miR-122a/SPC3372 в плазме мышей. Стабильность SPC3372 и дуплекса SPC3372/miR-122a анализировали в плазме мышей при 37 С в течение 96 ч. На фиг. 12 проиллюстрирован электрофорез в ПААГ, окрашенном SYBR-золотом. Фиг. 13. Секвестрация зрелой miR-122a под действием SPC3372 приводит к образованию дуплекса. На фиг. 13 показана мембрана, зондированная miR-122 а-специфическим зондом (верхняя панель) и повторно зондированная Let-7-специфическим зондом (нижняя панель). С использованием miR-122 специфического зонда были детектированы две полосы, где одна полоса соответствовала зрелой miR122, а другая полоса соответствовала дуплексу, образованному между SPC3372 и miR-122. Фиг. 14. Секвестрацию miR-122a под действием SPC3372, а также распределение SPC3372 оценивали с помощью in situ гибридизации срезов печени. На фигуре представлены криосрезы печени обработанных животных. Фиг. 15. Экспрессия генов печени у мышей, обработанных LNA против miR-122. Мышей, обработанных физиологическим раствором и LNA-antimiR, сравнивали по профилю экспрессии всего генома с помощью программ типа массивов Affymetrix Mouse Genome 430 2.0.(а,1) Показан ряд зондов, отображающих дифференциальную экспрессию в образцах печени мышей, обработанных LNA против miR-122 и физиологическим раствором, через 24 ч после обработки.(b,2) Показано присутствие уникальной последовательности (последовательности-"зерна" илиseed-последовательности) miR-122 в дифференциально экспрессируемых генах. На графике указано процентное содержание транскриптов по меньшей мере с одной уникальной последовательностью распознавания miR-122 в их 3'UTR. Рандомизация: были генерированы произвольные последовательности, которые были исследованы на присутствие уникальных последовательностей распознавания miR-122. Представлены профили временной экспрессии генов в печени у мышей, обработанных LNA-antimiR. Мышей обрабатывали 25 мг/кг/день LNA-antimiR, а контрольным животным в течение трех дней вводили физиологический раствор каждый день и через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы умерщвляли. Включены также величины, полученные от животных, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы.(с,3) РНК-образцы, полученные в различные промежутки времени, также анализировали на профили экспрессии. Иерархический кластерный анализ профилей экспрессии генов, идентифицированных как дифференциально экспрессированные гены, проводили у мышей, обработанных LNA против miR, и у мышей,обработанных физиологическим раствором через 24 ч, через одну неделю или через три недели после обработки.(d,4) Во время всего эксперимента у мышей, обработанных LNA-antimiR, и у мышей, обработанных физиологическим раствором, проводили мониторинг профилей экспрессии генов, идентифицированных как дифференциально экспрессирующиеся гены. Во время всего эксперимента отношение уровней экспрессии активируемых и ингибируемых генов у мышей, обработанных LNA-antimiR, составляло приблизительно 1, что указывало на обратимый эффект обработки LNA-antimiR. Фиг. 16. Влияние обработки молекулами SPC3372 и 3595 на уровни miR-122 в мышиной печени. Фиг. 17. Влияние обработки молекулами SPC3372 и 3595 на уровни альдолазы А в мышиной печени. Фиг. 18. Влияние обработки молекулами SPC3372 и 3595 на уровни Bckdk в мышиной печени. Фиг. 19. Влияние обработки молекулами SPC3372 и 3595 на уровни CD320 в мышиной печени. Фиг. 20. Влияние обработки молекулами SPC3372 и 3595 на уровни Ndrg3 в мышиной печени.-9 015570 Фиг. 21. Влияние длительной обработки молекулой SPC3649 на общий уровень холестерина в плазме у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей. Пробы плазмы крови брали еженедельно у мышей, обработанных молекулой SPC3649, и у контрольных мышей, обработанных физиологическим раствором, а затем проводили оценку общего уровня холестерина в плазме. Мышей обрабатывали 5 мг/кг SPC3649, SPC3744 или физиологического раствора два раза в неделю. Одновременно проводили обработку нормальных мышей. Фиг. 22. Влияние длительной обработки молекулой SPC3649 на уровни miR-122 у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей. Фиг. 23. Влияние длительной обработки молекулой SPC3649 на уровни альдолазы А у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей. Фиг. 24. Влияние длительной обработки молекулой SPC3649 на уровни Bckdk у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей. Фиг. 25. Влияние длительной обработки молекулой SPC3649 на уровни AST у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей. Фиг. 26. Влияние длительной обработки молекулой SPC3649 на уровни ALT у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей. Фиг. 27. Модуляция репликации HCV под действием SPC3649 в клеточной модели HuH-7. Нозернблот-анализ РНК HCV в клетках HuH-7 после трансфекции различными молекулами LNA против miR(SPC3648, SPC3649 и SPC3550) и 2'ОМе-молекулами-антагонистами mir-122 (верхняя панель). Интенсивности сигналов гибридизации количественно оценивали и нормализовали по сигналам мРНК спектрина на каждой дорожке (нижняя панель). Фиг. 28. Функциональная дерепрессия репрессированной люциферазы коралла (Renilla) под действием miR-19b-блокирующих олигонуклеотидов в клеточной линии Hela, эндогенно экспрессирующейmiR-19b. "miR-19b-мишень" представляет собой плазмиду, содержащую miR-19b-мишень, но не котрансфицированную олигонуклеотидом, блокирующим miR-19b, а поэтому она представляет miR-19b,которая полностью подавляет экспрессию люциферазы Renilla. Фиг. 29. Функциональная дерепрессия репрессированной люциферазы коралла (Renilla) под действием miR-122-блокирующих олигонуклеотидов в клеточной линии HuH-7, эндогенно экспрессирующейmiR-122. "miR-122-мишень" представляет собой соответствующую плазмиду, содержащую miR-122 мишень, но не котрансфицированную олигонуклеотидом, блокирующим miR-122, a поэтому она представляет miR-122, которая полностью подавляет экспрессию люциферазы Renilla. Фиг. 30. Диаграмма, иллюстрирующая выравнивание олигонуклеотида согласно изобретению и микроРНК-мишени. Подробное описание изобретения Олигонуклеотид согласно изобретению обычно является одноцепочечным. Поэтому следует отметить, что в соответствии с настоящим изобретением термин "олигонуклеотид" может быть синонимом термина "одноцепочечный олигонуклеотид". В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям,содержащим короткие (одноцепочечные) олигонуклеотиды длиной в 8-17 нуклеотидных оснований, например 10-17 нуклеотидных оснований, комплементарных человеческим микроРНК. Короткие олигонуклеотиды особенно эффективно способствуют подавлению миРНК in vivo. Было обнаружено, что включение высокоаффинных нуклеотидных аналогов в олигонуклеотиды приводит к образованию высокоэффективных молекул, которые подавляют микроРНК и, очевидно, действуют посредством образования почти необратимых дуплексов с миРНК-мишенью, а не посредством механизмов на основе расщепления РНК, таких как механизмы, ассоциированные с действием РНКазы Н или RISC. При этом особенно предпочтительно, чтобы одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению содержал область из последовательности смежных нуклеотидных оснований, которая на 100% комплементарна человеческой уникальной области микроРНК. Предпочтительно, чтобы одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению был комплементарен зрелой человеческой последовательности микроРНК. Предпочтительные олигонуклеотиды согласно изобретению комплементарны последовательности микроРНК, выбранной из группы, состоящей из hsa-miR-19b, hsa-miR-21, hsa-miR-122, hsa-miR-142 a7b,hsa-miR-155, hsa-miR-375. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению не содержит нуклеотидного основания у 3'-конца, соответствующего первому 5'-концевому нуклеотиду микроРНК-мишени. В одном из вариантов изобретения первым нуклеотидным основанием одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от 3'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA. В одном из вариантов изобретения вторым нуклеотидным основанием одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от 3'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA.- 10015570 В одном из вариантов изобретения девятым и/или десятым нуклеотидом одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от 3'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA. В одном из вариантов изобретения девятым нуклеотидным основанием одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от 3'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA. В одном из вариантов изобретения десятым нуклеотидным основанием одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от 3'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA. В одном из вариантов изобретения девятым и десятым нуклеотидным основанием одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от 3'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 5 смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 6 смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 7 смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 8 смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 3 смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 2 смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере,область, состоящую по меньшей мере из двух смежных остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере из двух смежных остатков LNA. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере,область, состоящую по меньшей мере из трех смежных остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере из трех смежных остатков LNA. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 7 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 6 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 5 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 4 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 3 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 2 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA. В одном из вариантов изобретения первое или второе 3'-нуклеотидное основание одноцепочечного олигонуклеотида соответствует второму 5'-нуклеотиду последовательности микроРНК. В одном из вариантов изобретения остатки нуклеотидных оснований 1-6 (включительно) одноцепочечного олигонуклеотида от 3'-конца области одноцепочечного олигонуклеотида комплементарны последовательности уникальной области микроРНК. В одном из вариантов изобретения остатки нуклеотидных оснований 1-7 (включительно) одноцепочечного олигонуклеотида от 3'-конца области одноцепочечного олигонуклеотида комплементарны последовательности уникальной области микроРНК. В одном из вариантов изобретения остатки нуклеотидных оснований 2-7 (включительно) одноцепочечного олигонуклеотида от 3'-конца области одноцепочечного олигонуклеотида комплементарны последовательности уникальной области микроРНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере один остаток нуклеотидного аналога, такой как по меньшей мере один остаток LNA, в положении, которое находится в области, комплементарной уникальной области миРНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид может включать 1-6 или 1-7 остатков нуклеотидных аналогов, например 1-6 и 1-7 остатков LNA, в положении, которое находится в области, комплементарной уникальной области миРНК.- 11015570 В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из (Х)Хххххх, (Х)хХхххх, (Х)ххХххх, (Х)хххХхх, (Х)ххххХх и (Х)хххххХ, расположенных в направлении 3'-5', где "X" обозначает нуклеотидный аналог, (X) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере два остатка нуклеотидного аналога, такие как по меньшей мере два остатка LNA, в положениях, комплементарных уникальной области миРНК. В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из (Х)ХХхххх, (Х)ХхХххх, (Х)ХххХхх, (Х)ХхххХх, (Х)ХххххХ, (Х)хХХххх,(Х)хХхХхх, (X)хХххХх, (X)хХхххХ, (X)ххХХхх, (X)ххХхХх, (X)ххХххХ, (Х)хххХХх, (Х)хххХхХ и(Х)ххххХХ, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, (X) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, a "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере три остатка нуклеотидного аналога, такие как по меньшей мере три остатка LNA, в положениях, комплементарных уникальной области миРНК. В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из (Х)ХХХххх, (Х)хХХХхх, (Х)ххХХХх, (Х)хххХХХ, (Х)ХХхХхх, (Х)ХХххХх,(X)ХХхххХ, (X)хХХхХх, (X)хХХххХ, (X)ххХХхХ, (X)ХхХХхх, (X)ХххХХх, (Х)ХхххХХ, (Х)хХхХХх,(Х)хХххХХ, (Х)ххХхХХ, (Х)хХхХхХ и (Х)ХхХхХх где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, (X) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере четыре остатка нуклеотидного аналога, такие как по меньшей мере четыре остатка LNA, в положениях,комплементарных уникальной области миРНК. В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из (Х)ххХХХ, (Х)хХхХХХ, (X)хХХхХХ, (X)хХХХхХ, (X)хХХХХх,(X)ХххХХХХ, (X)ХхХхХХ, (Х)ХхХХхХ, (Х)ХхХХх, (Х)ХХххХХ, (Х)ХХхХхХ, (Х)ХХхХХх,(X)ХХХххХ, (Х)ХХХхХх и (Х)ХХХХхх, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остатокLNA, (X) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, a "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере пять остатков нуклеотидного аналога, такие как по меньшей мере пять остатков LNA, в положениях,комплементарных уникальной области миРНК. В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из (Х)хХХХХХ, (Х)ХхХХХХ, (Х)ХХхХХХ, (Х)ХХХхХХ, (Х)ХХХХхХ и(Х)ХХХХХх, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, (X) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, a "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает шесть или семь остатков нуклеотидного аналога, такие как шесть или семь остатков LNA, в положениях, комплементарных уникальной области миРНК. В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из ХХХХХХ, ХхХХХХХ, ХХхХХХХ, ХХХхХХХ, ХХХХхХХ, ХХХХХхХ и ХХХХХХх, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения мотив из двух нуклеотидных оснований в положениях 7-8, если считать от 3'-конца, одноцепочечного олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из хх, XX, хХ и Хх,где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения мотив из двух нуклеотидных оснований в положениях 7-8, если считать от 3'-конца, одноцепочечного олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из XX, хХ и Хх,где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.- 12015570 В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 12 нуклеотидных оснований, где мотив из двух нуклеотидных оснований в положениях 11-12, если считать от 3'-конца, одноцепочечного олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из хх, XX, хХ и Хх, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 12 нуклеотидных оснований, где мотив из двух нуклеотидных оснований в положениях 11-12, если считать от 3'-конца, одноцепочечного олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из XX, хХ и Хх, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, a "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 13 нуклеотидных оснований, где мотив из трех нуклеотидных оснований в положениях 11-13, если считать от 3'-конца, выбран из группы, состоящей из ххх, Ххх, хХх, ххХ, ХХх, ХхХ, хХХ и XXX, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения мотив из трех нуклеотидных оснований в положениях 11-13, если считать от 3'-конца, одноцепочечного олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из Ххх, хХх,ххХ, ХХх, ХхХ, хХХ и XXX, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 14 нуклеотидных оснований, где мотив из четырех нуклеотидных оснований в положениях 11-14, если считать от 3'-конца, выбран из группы, состоящей из хххх, Хххх, хХхх, ххХх, хххХ, ХХхх, ХхХх, ХххХ,хХХх, хХхХ, ххХХ, ХХХх, ХхХХ, хХХХ, ХХхХ и ХХХХ, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения мотив из четырех нуклеотидных оснований в положениях 11-14 одноцепочечного олигонуклеотида, если считать от 3'-конца, выбран из группы, состоящей из Хххх,хХхх, ххХх, хххХ, ХХхх, ХхХх, ХххХ, хХХх, хХхХ, ххХХ, ХХХх, ХхХХ, хХХХ, ХХхХ и ХХХХ, где"X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает 15 нуклеотидных оснований, где мотив из пяти нуклеотидных оснований в положениях 11-15, если считать от 3'-конца,выбран из группы, состоящей из Ххххх, хХххх, ххХхх, хххХх, ххххХ, ХХххх, ХхХхх, ХххХх, ХхххХ,хХХхх, хХхХх, хХххХ, ххХХх, ххХхХ, хххХХ, ХХХхх, ХХххХ, ХххХХ, хХХХх, ххХХХ, ХХхХХ,ХхХхХ, ХХХХх, ХХХхХ, ХХхХХ, ХхХХХХ, хХХХХ и ХХХХХ, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает 16 нуклеотидных оснований, а мотив из шести нуклеотидных оснований в положениях 11-16, если считать от 3'-конца,выбран из группы, состоящей из Хххххх, хХхххх, ххХххх, хххХхх, ххххХх, хххххХ, ХХхххх, ХхХххх,ХххХхх, ХхххХх, ХххххХ, хХХххх, хХхХхх, хХххХх, хХхххХ, ххХХхх, ххХхХх, ххХххХ, хххХХх,хххХхХ, ххххХХ, ХХХххх, ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, ХхХХхх, ХхХхХх, ХхХххХ, ХххХХх, ХххХхХ,ХхххХХ, хХХХхх, хХХхХх, хХХххХ, хХхХХх, хХхХхХ, хХххХХ, ххХХХх, ххХХхХ, ххХхХХ,хххХХХ, ХХХХхх, ХХХххХ, ХХххХХ, ХххХХХ, ххХХХХ, хХхХХХ, ХхХхХХ, ХХхХхХ, ХХХхХх,хХХхХХ, ХхХХхХ, ХХхХХх, хХХХхХ, ХхХХХх, хХХХХх, хХХХХХ, ХхХХХХ, ХХхХХХ, ХХХхХХ,ХХХХхХ, ХХХХХх и ХХХХХХ, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения мотив из шести нуклеотидных оснований в положениях 11-16 одноцепочечного олигонуклеотида, если считать от 3'-конца, представляет собой ххХххХ, где "X" обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения три крайних 5'-концевых нуклеотидных основания выбраны из группы, состоящей из Ххх, хХх, ххХ, ХХх, ХхХ, хХХ и XXX, где "X" обозначает нуклеотидный аналог,такой как остаток LNA, а "х" обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК. В одном из вариантов изобретения "х" обозначает остаток ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает, у 5'-конца, остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток LNA. В одном из вариантов изобретения остатки нуклеотидных аналогов, такие как X, независимо выбраны из группы, состоящей из остатка 2'-О-алкил-РНК, остатка 2'ОМе-РНК, остатка 2'-амино-ДНК, остатка 2'-фтор-ДНК, остатка LNA, остатка PNA, остатка HNA, остатка INA. В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные основания одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению представляют собой остатки нуклеотидных аналогов. В одном из вариантов изобретения остатки нуклеотидных аналогов, такие как X, независимо выбраны из группы, состоящей из остатков 2'ОМе-РНК, остатков 2'-фтор-ДНК и остатков LNA.- 13015570 В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает указанный по меньшей мере один остаток аналога LNA и по меньшей мере один дополнительный остаток нуклеотидного аналога, не являющийся остатком LNA. В одном из вариантов изобретения остаток или остатки нуклеотидных аналогов, не являющихсяLNA, независимо выбраны из остатков 2'ОМе-РНК и остатков 2'-фтор-ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид состоит по меньшей мере из одной последовательности XYX или YXY, где X представляет собой LNA, a Y представляет собой остаток 2'ОМе-РНК и остаток 2'-фтор-ДНК. В одном из вариантов изобретения последовательность нуклеотидных оснований одноцепочечного олигонуклеотида состоит из чередующихся остатков X и Y. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает чередующиеся остатки LNA и ДНК (Хх) или (хХ). В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает мотив из чередующихся остатков LNA, за которыми следуют 2 остатка ДНК (Ххх), хХх или ххХ. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из остатков нуклеотидных аналогов ДНК или остатков нуклеотидного аналога, не являющегося LNA, заменен нуклеотидным основанием LNA в положении, выбранном из положений, идентифицированных как остатки нуклеотидных оснований LNA согласно любому из вышеуказанных вариантов. В одном из вариантов изобретения "X" обозначает остаток LNA. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 2 остатка нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 3 остатка нуклеотидных аналогов,например по меньшей мере 4 остатка нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 5 остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 6 остатков нуклеотидных аналогов,например по меньшей мере 7 остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 8 остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 9 остатков нуклеотидных аналогов,например по меньшей мере 10 остатков нуклеотидных аналогов. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 2 остатка LNA, например по меньшей мере 3 остатка LNA, например по меньшей мере 4 остатка LNA, например по меньшей мере 5 остатков LNA, например по меньшей мере 6 остатков LNA, например по меньшей мере 7 остатков LNA, например по меньшей мере 8 остатков LNA, например по меньшей мере 9 остатков LNA, например по меньшей мере 10 остатков LNA. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток LNA, например остаток в положениях 1-10 нуклеотидного аналога, такой как остаток LNA, в частности, остаток в положении 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA,представляет собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере два остатка нуклеотидных аналогов, такие как остатки LNA, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере три остатка нуклеотидных аналогов, такие как остатки LNA, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере четыре остатка нуклеотидных аналогов, такие как остатки LNA, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере пять остатков нуклеотидных аналогов, такие как остатки LNA, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере шесть остатков нуклеотидных аналогов,такие как остатки LNA, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере семь остатков нуклеотидных аналогов, такие как остатки LNA, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере восемь остатков нуклеотидных аналогов, такие как остатки LNA, представляют собой цитозин или гуанин. В предпочтительном варианте изобретения нуклеотидные аналоги образуют дуплекс с комплементарным нуклеотидом РНК, который имеет более высокую термостабильность, чем дуплекс, в котором эквивалентный нуклеотид ДНК аффинно связан с указанным комплементарным нуклеотидом РНК. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги сообщают одноцепочечному олигонуклеотиду более высокую стабильность в сыворотке. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид образует А-спиральную конформацию с комплементарной одноцепочечной молекулой РНК. Дуплекс, образованный между двумя молекулами РНК, обычно присутствует в А-конформации, а дуплекс, образованный между двумя молекулами ДНК, обычно присутствует в В-конформации. Дуплекс, образованный между молекулами ДНК и РНК, обычно присутствует в промежуточной конформации (в А/В-форме). Нуклеотидные аналоги, такие как бета-D-окси-LNA, могут быть использованы для стимуляции образования конформации, наиболее близкой к А-конформации. Для определения формы дуплексов между олигонуклеотидами согласно изобретению и комплементарными молекулами РНК применяют стандартный метод кольцевого дихроизма (KD) или ЯМР-анализ.- 14015570 Поскольку считается, что рекрутинг под действием RISC-комплекса зависит от конкретной структурной конформации миРНК/мРНК-мишени, то в одном из вариантов изобретения олигонуклеотиды согласно изобретению могут образовывать дуплекс в А/В-конформации с комплементарной молекулой РНК. Однако авторами настоящего изобретения было также определено, что использование нуклеотидных аналогов, таких как альфа-L-изомер LNA, может также оказаться эффективным для стимуляции образования А-конформационной структуры. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид образует А/В-конформацию с комплементарной одноцепочечной молекулой РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид образует А-конформацию с комплементарной одноцепочечной молекулой РНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не опосредует расщепление комплементарной одноцепочечной молекулы РНК под действием РНКазы Н. Обычно для эффективного рекрутинга РНКазы Н под действием олигонуклеотида необходимо, чтобы олигонуклеотидный фрагмент состоял по меньшей мере из 5 (обычно он не является эффективным для рекрутинга РНКазы Н), более предпочтительно по меньшей мере из 6, а еще более предпочтительно по меньшей мере примерно из 7 или 8 смежных нуклеотидных оснований ДНК (или альтернативных нуклеотидных оснований, которые способны осуществлять рекрутинг РНКазы Н, таких как альфа-L-аминоLNA). В ЕР 1222309 описаны методы in vitro определения активности РНКазы Н, которые могут быть применены для определения способности олигонуклеотида к рекрутингу РНКазы Н. Считается, что соединение способно осуществлять рекрутинг РНКазы Н, если, в случае использования комплементарной РНК-мишени, исходный уровень РНКазы Н, измеряемый в пмоль/л/мин, составляет по меньшей мере 1%, например по меньшей мере 5%, например по меньшей мере 10% или менее чем 20% от исходного уровня, определяемого с использованием только эвивалентных ДНК-олигонуклеотидов, не имеющих 2'-замещений и имеющих фосфортиоатные связи между всеми нуклеотидами в данном олигонуклеотиде,как было определено с применением методики, описанной в примерах 91-95 ЕР 1222309. При этом считается, что соединение в основном не способно осуществлять рекрутинг РНКазы Н,если, в случае использования комплементарной РНК-мишени, исходный уровень РНКазы Н, измеряемый в пмоль/л/мин, составляет менее чем 1%, например менее чем 5%, например менее чем 10% или менее чем 20% от исходного уровня, определяемого с использованием только эквивалентных только ДНКолигонуклеотидов, не имеющих 2'-замещений и имеющих фосфортиоатные связывающие группы между всеми нуклеотидами в данном олигонуклеотиде, как было определено с применением методики, описанной в примерах 91-95 ЕР 1222309. В особенно предпочтительном варианте изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению обладает способностью образовывать дуплекс с комплементарной одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты РНК (обычно примерно такой же длины, как и указанный одноцепочечный олигонуклеотид), имеющей фосфодиэфирные межнуклеозидные связи, где указанный дуплекс имеет Tm по меньшей мере примерно 60 С, при этом предпочтительно, чтобы одноцепочечный олигонуклеотид обладал способностью образовывать дуплекс с комплементарной одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты РНК, имеющей фосфодиэфирные межнуклеозидные связи, где указанный дуплекс имеет Tm примерно 70-95 С, например примерно 70-90 С, например примерно 70-85 С. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению обладает способностью образовывать дуплекс с комплементарной одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты ДНК, имеющей фосфодиэфирные межнуклеозидные связи, где указанный дуплекс имеет Tm примерно 50-95 С, например примерно 50-90 С, например по меньшей мере примерно 55 С, например по меньшей мере примерно 60 С или не более чем примерно 95 С. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид может иметь длину 14-16 нуклеотидных оснований, включая 15 нуклеотидных оснований. В одном из вариантов изобретения остаток или остатки LNA независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA и амино-LNA, в любой из D и Lконфигураций или их комбинаций. В одном из конкретных вариантов изобретения остатками LNA могут быть нуклеотидные основания ENA. В одном из вариантов изобретения остатки LNA составляют бета-D-окси-LNA. В одном из вариантов изобретения остатки LNA составляют альфа-L-амино-LNA. В предпочтительном варианте изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает 3-17 остатков LNA. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере одну межнуклеозидную связывающую группу, которая не является фосфатом. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере одну фосфортиоатную межнуклеозидную связь.- 15015570 В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает фосфодиэфирную и фосфортиоатную связи. В одном из вариантов изобретения все межнуклеозидные связи представляют собой фосфортиоатные связи. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере одну фосфодиэфирную межнуклеозидную связь. В одном из вариантов изобретения все межнуклеозидные связи одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению представляют собой фосфодиэфирные связи. В одном из вариантов изобретения фармацевтическая композиция согласно изобретению включает носитель, такой как физиологический раствор или забуференный физиологический раствор. В одном из вариантов изобретения синтез одноцепочечного олигонуклеотида, направленного против человеческой микроРНК, осуществляют в направлении 3'-5' a-f. Такой способ синтеза одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению может быть осуществлен с применением стандартного твердофазного олигонуклеотидного синтеза. Другие варианты изобретения, которые могут быть объединены с вышеописанными вариантами,приводятся в формуле изобретения и в разделе, озаглавленном "Другие варианты изобретения". Определения Термин "нуклеотидное основание" обозначает нуклеотиды, такие как нуклеотиды ДНК и РНК, и нуклеотидные аналоги. Термин "олигонуклеотид" (или просто "олиго") в контексте настоящего описания обозначает молекулу, образованную посредством ковалентной связи двух или более нуклеотидных оснований. В одном из вариантов изобретения "олигонуклеотид", используемый в настоящем изобретении (также называемый одноцепочечным олигонуклеотидом), может иметь длину, например 8-26 нуклеотидов, например 10-26 нуклеотидов, например 12-26 нуклеотидов. В предпочтительном варианте изобретения, подробно описанном в настоящем изобретении, олигонуклеотид согласно изобретению имеет длину 8-17 нуклеотидов, например 20-27 нуклеотидов, например 8-16 нуклеотидов, например 12-15 нуклеотидов. В таком варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению может иметь длину 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов. Следует отметить, что в случае использования более коротких олигонуклеотидов может оказаться необходимым увеличение числа (высокоаффинных) нуклеотидных аналогов, таких как LNA. Поэтому в одном из вариантов, изобретения по меньшей мере примерно 30% нуклеотидов, например по меньшей мере примерно 33%, например по меньшей мере примерно 40% или по меньшей мере примерно 50% или по меньшей мере примерно 60%, например по меньшей мере примерно 66%, например по меньшей мере примерно 70%, например по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 90% нуклеотидов представляют собой нуклеотидные аналоги. Также очевидно, что указанный олигонуклеотид может состоять из нуклеотидной последовательности, состоящей только из последовательностей нуклеотидных аналогов. Используемый здесь термин "азотистое основание" включает пурины и пиримидины, такие как нуклеотидные основания ДНК А, С, Т и G, нуклеотидные основания РНК А, С, U и G, а также нуклеотидные основания, не являющиеся основаниями ДНК/РНК, такие как 5-метилцитозин (МеС), изоцитозин,псевдоизоцитозин, 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 5-пропинил-6-фторурацил, 5-метилтиазолурацил,6-аминопурин, 2-аминопурин, инозин, 2,6-диаминопурин, 7-пропин-7-деазааденин, 7-пропин-7 деазагуанин и 2-хлор-6-аминопурин, в частности МеС. При этом следует отметить, что практически выбор нуклеотидного основания, не являющегося основанием ДНК/РНК, зависит от соответствующего(или спаривающегося) нуклеотида, присутствующего в цепи микроРНК, т.е. олигонуклеотида, который,предположительно, является мишенью. Так, например, в случае если соответствующим нуклеотидом является G, то обычно необходимо выбрать такое нуклеотидное основание, не являющееся основанием ДНК/РНК, которое будет обладать способностью образовывать водородные связи с G. В этом конкретном случае, если соответствующим нуклеотидом является G, то типичным примером предпочтительного не-ДНК/РНК нуклеотидного основания является МеС. Термин "межнуклеозидная связывающая группа" означает группу, способную образовывать ковалентные связи между двумя нуклеотидами, например между остатками ДНК, между остатками ДНК и нуклеотидными аналогами, между двумя не-LNA-остатками, между нe-LNA-остатком и остатком LNA и между двумя остатками LNA и т.п. Предпочтительными примерами являются фосфатные, фосфодиэфирные и фосфортиоатные группы. Межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы, состоящей из -O-Р(O)2-O-, -O-Р(О,S)-O-,-O-Р(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-,O-PO(OCH3)-O-,-O-PO(NRH)-O-,-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-,-O-PO(BH3)-O-,-O-PO(NHRH)-O-,H-O-P(O)2-NR -, -NR -P(O)2-O-, -NR -CO-O-, -NR -CO-NR -, и/или межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы, состоящей из -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-,-O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-,-CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, где RH выбран из водорода иC1-4 алкила. В некоторых вариантах изобретения могут оказаться предпочтительными межнуклеозидные связи, содержащие серу (S), как описано выше. Термины "соответствующий" и "соответствует", относящиеся к олигонуклеотидам, используются здесь для сравнения нуклеотидных последовательностей соединений согласно изобретению и их обратных комплементов или в одном из вариантов изобретения для сравнения нуклеотидных последовательностей и эквивалентных (идентичных) нуклеотидных последовательностей, которые могут, например, содержать другие нуклеотидные основания, но при этом сохранять ту же самую последовательность оснований или их комплементов. Нуклеотидные аналоги непосредственно сравнивают с их эквивалентными или соответствующими природными нуклеотидами. Последовательности, образующие обратный комплемент данной последовательности, называются здесь последовательностями, комплементарными данной последовательности. Что касается длины описанной здесь нуклеотидной молекулы, то она соответствует числу мономерных остатков, т.е. нуклеотидных оснований, независимо от того, являются ли такие мономерные остатки нуклеотидами или нуклеотидными аналогами. Что касается нуклеотидных оснований, то термины"мономер" и "остаток" являются здесь взаимозаменяемыми. Следует отметить, что если при определении конкретных величин или интервалов величин используется слово "примерно", то при этом подразумевается, что данные величины включают конкретно указанную величину или указанный интервал величин. Предпочтительными аналогами ДНК являются аналоги ДНК, в которых группа 2'-Н замещена группой, не являющейся -ОН (РНК), например группами -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3,-O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH или -F. Предпочтительными аналогами РНК являются аналоги РНК, которые были модифицированы в их 2'-ОН-группе, например, путем замещения группой, не являющейся -Н (ДНК), например, группами-O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH или -F. В одном из вариантов изобретения нуклеотидным аналогом является "ENA". Используемые здесь термины "структурная единица LNA", "мономер LNA", "остаток LNA","структурная единица блокированной нуклеиновой кислоты", "мономер блокированной нуклеиновой кислоты" или "остаток блокированной нуклеиновой кислоты" означают бициклический нуклеозидный аналог. Структурные единицы LNA описаны inter alia в заявках WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748,WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 и WO 03/095467. Структурная единица LNA может быть также определена по ее химической формуле. Так, например, используемая здесь "структурная единицаLNA" имеет химическую структуру, представленную на схеме 1. Схема 1Y представляет собой (-СН 2)r, где r представляет собой целое число 1-4; и В представляет собой азотистое основание. Если в соответствии с настоящим изобретением остаток ДНК заменен соответствующим остаткомLNA, то термин "соответствующий остаток LNA" означает, что остаток ДНК был заменен остаткомLNA, содержащим такое же азотистое основание, как и замененный остаток ДНК, например остатокLNA, соответствующий остатку ДНК, содержащему азотистое основание А, также содержит азотистое основание А. Исключением является тот случай, когда остаток ДНК содержит основание С, и в этом случае соответствующий остаток LNA может содержать основание С или основание МеС, предпочтительно МеС. Используемый здесь термин "не-LNA-остаток" означает нуклеозид, отличающийся от LNA-остатка,т.е. термин "не-LNA-остаток" включает остаток ДНК, а также остаток РНК. Предпочтительным не-LNAостатком является остаток ДНК. Используемые здесь термины "структурная единица", "остаток" и "мономер" являются синонимами. Используемый здесь термин "конъюгат" означает гетерогенную молекулу, образованную посредством ковалентного связывания описанного здесь олигонуклеотида с одной или несколькими ненуклеотидными или не-полинуклеотидными молекулами. Примерами не-нуклеотидных или неполинуклеотидных молекул являются макромолекулярные агенты, такие как белки, цепи жирных кислот,сахарные остатки, гликопротеины, полимеры или их комбинации. Типичными белками могут быть антитела для белка-мишени. Типичными полимерами могут быть полиэтиленгликоли. Термин "по меньшей мере один" охватывает целое число, равное или превышающее 1, такое как 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д.- 17015570 При использовании терминов "нуклеотид", "агент", "остаток LNA" и т.п. подразумевается, что указанные объекты могут быть в единственном или во множественном числе. В частности, выражение"компонент (такой как нуклеотид, агент, остаток LNA или т.п.), выбранный из группы, состоящей из ",означает, что могут быть выбраны один или несколько из указанных компонентов. Так, например, выражения, подобные выражению "компонент, выбранный из группы, состоящей из А, В и С", означают все комбинации А, В и С, т.е. А, В, С, А+В, А+С, В+С и А+В+С. Термин "остаток тио-LNA" означает остаток LNA, в котором X на схеме 1 представляет собой S. Остаток тио-LNA может присутствовать в бета-D-форме и альфа-L-форме. Обычно предпочтительной является бета-D-форма остатка тио-LNA. Бета-D-форма и альфа-L-форма остатка тио-LNA представлены на схеме 3 как соединения 3 А и 3 В соответственно. Термин "остаток амино-LNA" означает остаток LNA, в котором X на схеме 1 представляет собойNH или NRH, где RH представляет собой водород или C1-4 алкил. Остаток амино-LNA может присутствовать в бета-D-форме и альфа-L-форме. Обычно предпочтительной является бета-D-форма остатка аминоLNA. Бета-D-форма и альфа-L-форма остатка амино-LNA представлены на схеме 4 как соединения 4 А и 4 В соответственно. Термин "остаток окси-LNA" означает остаток LNA, в котором X на схеме 1 представляет собой О. Остаток тио-LNA может присутствовать в бета-D-форме и альфа-L-форме. Обычно предпочтительной является бета-D-форма остатка окси-LNA. Бета-D-форма и альфа-L-форма остатка окси-LNA представлены на схеме 5 как соединения 5 А и 5 В соответственно. Используемый здесь термин "C1-6 алкил" означает прямую или разветвленную насыщенную углеводородную цепь, где самые длинные цепи имеют от одного до шести атомов углерода, например метил,этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изопентил, неопентил и гексил. Разветвленная углеводородная цепь представляет собой C1-6 алкил, замещенный у любого атома углерода углеводородной цепью. Используемый здесь термин "C1-4 алкил" означает прямую или разветвленную насыщенную углеводородную цепь, где самые длинные цепи имеют от одного до четырех атомов углерода, например метил,этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил. Разветвленная углеводородная цепь представляет собой С 1-4 алкил, замещенный у любого атома углерода углеводородной цепью. Используемый здесь термин "С 1-6 алкокси" означает C1-6 алкилокси, такой как метокси, этокси,н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентокси, изопентокси,неопентокси и гексокси. Используемый здесь термин "С 2-6 алкенил" означает прямую или разветвленную углеводородную группу, имеющую от двух до шести атомов углерода и содержащую одну или несколько двойных связей. Репрезентативными примерами С 2-6 алкенильных групп являются аллил, гомоаллил, винил, кротил, бутенил, бутадиенил, пентенил, пентадиенил, гексенил и гексидиенил. Положением ненасыщенной связи(двойной связи) может быть любое положение в углеродной цепи. Используемый здесь термин "С 2-6 алкинил" означает прямую или разветвленную углеводородную группу, имеющую от двух до шести атомов углерода и содержащую одну или несколько тройных связей. Репрезентативными примерами С 2-6 алкинильных групп являются ацетилен, пропинил, бутинил, пентинил и гексинил. Положением ненасыщенной связи (тройной связи) может быть любое положение в углеродной цепи. Более чем одна связь может быть ненасыщенной, а поэтому "С 2-6 алкинил" представляет собой диин или ендиин, известные специалистам. Используемый здесь термин "гибридизация" означает водородные связи, которыми могут быть водородные связи Уотсона-Крика, Хугстена, реверсивные водородные связи Хугстена и т.п. между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями. Четырьмя нуклеотидными основаниями, обычно присутствующими в ДНК, являются G, А, Т и С, из которых G спаривается с С, а А спаривается с Т. В РНК Т заменен урацилом (U), который спаривается с А. Химические группы в нуклеотидных основаниях, которые участвуют в образовании стандартного дуплекса, составляют основания Уотсона-Крика. За последние два года Хугстеном было показано, что пуриновые нуклеотидные основания (G и А), помимо оснований Уотсона-Крика, включают основания Хугстена, которые могут распознаваться с внешней стороны дуплекса и используются для связывания с пиримидиновыми олигонуклеотидами посредством водородных связей, образуя, тем самым, тройную спиральную структуру. В контексте настоящего изобретения термин "комплементарный" относится к способности двух нуклеотидных последовательностей точно спариваться друг с другом. Так, например, если нуклеотид в определенном положении олигонуклеотида способен образовывать водородную связь с нуклеотидом в соответствующем положении молекулы ДНК или РНК, то считается, что такой олигонуклеотид и ДНК или РНК являются комплементарными друг другу в этом положении. Считается, что цепи ДНК или РНК комплементарны друг другу в том случае, если достаточное число нуклеотидов в олигонуклеотиде могут образовывать водородные связи с соответствующими нуклеотидами в ДНК- или РНК-мишени и тем самым образовывать стабильный комплекс. При этом для сообщения стабильности последовательности олигонуклеотидов in vitro или in vivo эти последовательности необязательно должны быть на 100% комплементарны их микроРНК-мишеням. Так, например, термины "комплементарный" и "специфически- 18015570 гибридизующийся" означают, что олигонуклеотид достаточно сильно и специфически связывается с молекулой-мишенью, что обеспечивает необходимое подавление нормальной функции мишени, но при этом функция РНК, не являющаяся мишенью, остается неизменной. В предпочтительном примере олигонуклеотид согласно изобретению на 100% комплементарен человеческой последовательности микроРНК, такой как одна из описанных здесь последовательностей микроРНК. В предпочтительном примере олигонуклеотид согласно изобретению содержит непрерывную последовательность, которая на 100% комплементарна уникальной области человеческой последовательности микроРНК. МикроРНК представляют собой короткие некодирующие РНК, происходящие от эндогенных генов,действующих как посттранскрипционные регуляторы экспрессии генов. Они процессируются из более длинных (примерно 70-80 нуклеотидов) шпилькоподобных предшественников, называемых пре-миРНК,под действием фермента РНКазы III Dicer. МикроРНК образуют рибонуклеопротеиновые комплексы,называемые миРНП, и распознают их сайты-мишени благодаря антисмысловой комплементарности,опосредуя, тем самым, ингибирование их генов-мишеней. Почти полная или полная комплементарность между миРНК и ее сайтом-мишенью приводит к расщеплению мРНК-мишени, тогда как ограниченная комплементарность между микроРНК и сайтом-мишенью приводит к ингибированию трансляции генамишени. В контексте настоящего изобретения термин "микроРНК" или "миРНК" означает олигонуклеотид РНК, состоящий из 18-25 нуклеотидов. По своим функциям миРНК представляют собой типичные регуляторные эндогенные молекулы РНК. Термины "целевая микроРНК", или "целевая миРНК", или "миРНК-мишень" означают микроРНК,которая играет определенную биологическую роль в развитии заболевания у человека, например миРНК может стимулировать онкогенез или подавлять развитие опухоли при раке, а поэтому она является мишенью для терапевтического воздействие на рассматриваемое заболевание. Термины "ген-мишень" или "мРНК-мишень" означают регуляторные мРНК-мишени для микроРНК, где указанный "ген-мишень" или "мРНК-мишень" подвергаются посттранскрипционной регуляции под действием микроРНК, что обусловлено полной или почти полной комплементарностью между миРНК и ее сайтом-мишенью и приводит к расщеплению мРНК-мишени; либо ограниченной комплементарностью, часто определяемой как комплементарность между так называемой "уникальной" последовательностью (нуклеотидами 2-7 миРНК) и сайтом-мишенью, которая приводит к ингибированию трансляции мРНК-мишени. В контексте настоящего изобретения олигонуклеотид согласно изобретению является одноцепочечным, а это означает, что олигонуклеотид не имеет комплементарного олигонуклеотида, т.е. он не может быть двухцепочечным олигонуклеотидным комплексом, таким как киРНК. В одном из вариантов изобретения композиция согласно изобретению не содержит другого олигонуклеотида, который имеет область, комплементарную одноцепочечному олигонуклеотиду из пяти или более смежных нуклеотидных оснований, например из восьми или более, или из 12 или более смежных нуклеотидных оснований. Считается, что такой другой олигонуклеотид не связан ковалентной связью с одноцепочечным олигонуклеотидом.LNA-содержащие олигонуклеотиды согласно изобретению. Хотя LNA-остатки и нe-LNA-остатки могут быть объединены различными методами с образованием олигонуклеотидов, однако авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что присутствие определенной коровой последовательности ДНК и присутствие определенных остатков LNA в указанной последовательности ДНК приводят к особенно сильному ингибированию микроРНК. Такое присутствие остатков LNA в указанной коровой последовательности олигонуклеотидов согласно изобретению сообщает указанным олигонуклеотидам высокий уровень резистентности к нуклеазе. Нуклеотидами, расположенными за пределами коровой последовательности, могут бытьLNA-остатки и/или нe-LNA-остатки. В одном из вариантов изобретения нe-LNA-остатками, расположенными за пределами коровой последовательности, являются остатки ДНК. Коровая последовательность. Для более эффективного, по возможности, ингибирования микроРНК-мишеней антисмысловыми олигонуклеотидами согласно изобретению необходима определенная степень комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом согласно изобретению и соответствующей микроРНК-мишенью. При этом особенно важно, чтобы олигонуклеотиды согласно изобретению были комплементарны соответствующей микроРНК-мишени в положениях 3-8 от 5'-конца. В некоторых микроРНК-мишениях нуклеотид 1, если считать от 5'-конца, представляет собой неспаривающееся основание, которое, по все вероятности, скрыто в связывающем кармане белка Ago 2. В соответствии с этим олигонуклеотид согласно изобретению может иметь, а может и не иметь нуклеотид в положении 1 от 3'-конца, соответствующий нуклеотиду 1 от 5'-конца соответствующей микроРНК-мишени. В некоторых случаях, первые два нуклеотида от 5'-конца соответствующей микроРНК-мишени могут оставаться неспаренными.- 19015570 Поэтому коровой последовательностью олигонуклеотидов согласно изобретению является последовательность ДНК в 1-6-положениях, 2-7-положениях или 3-8-положениях, если считать от 3'-конца, соответствующая 3-8-положениям, если считать от 5'-конца, соответствующей микроРНК-мишени.miR-19b. Одна из конкретных микроРНК-мишеней обозначена miR-19b. Последовательность miR-19b в 3-8 положениях, если считать от 5'-конца, представляет собой ugcaaa (см. GenBank AJ421740 и AJ421739). Соответствующая ДНК-последовательность представляет собой acgttt. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что для максимального ингибирования микроРНК-мишеней олигонуклеотиды согласно изобретению должны содержать в своей коровой последовательности по меньшей мере один остаток LNA. В соответствии с этим в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, такому как олигонуклеотид длиной 12-26 нуклеотидов, в котором в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, имеется следующая последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. Комплементарность с другими нуклеотидами микроРНК-мишени может повышать уровень ингибирования указанной микро-РНК-мишени. Поэтому в одном из вариантов изобретения описанный выше олигонуклеотид в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-8, 2-9 или 310, а предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. В еще одном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три, а еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA.miR-122a. Другой представляющей интерес микроРНК-мишенью является miR-122a. ПоследовательностьHGNC:MIRN122A). Соответствующая последовательность ДНК представляет собой ctcaca. В соответствии с этим во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, такому как олигонуклеотид длиной 12-26 нуклеотидов, имеющий в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду-антагонистуmiR-122a, который в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA.- 20015570 В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-8, 2-9 или 310, а предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. В еще одном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три, а еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA.miR-155. Другой представляющей интерес микроРНК-мишенью является miR-155. Последовательность miR155 в положениях 3-8, считая от 5'-конца, представляет собой aaugcu (см. miRBase, имя файлаHGNC:MIRN155). Соответствующая последовательность ДНК представляет собой ttacga. В соответствии с этим в своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, такому как олигонуклеотид длиной 12-26 нуклеотидов, имеющий в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид против miR-155 в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-8, 2-9 или 310, а предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. В еще одном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три, а еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA.miR-375. Другой представляющей интерес микроРНК-мишенью является miR-375. ПоследовательностьHGNC:MIRN375). Соответствующая последовательность ДНК представляет собой acaagc. В соответствии с этим в своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, такому как олигонуклеотид длиной 12-26 нуклеотидов, имеющий в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA.- 21015570 В одном из вариантов изобретения описанный выше олигонуклеотид против miR-375 в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-8, 2-9 или 3-10, а предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. В еще одном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК: где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два,а более предпочтительно по меньшей мере три, например три, а еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. Модификация нуклеотидов в коровой последовательности. Как упоминалось выше, в коровой последовательности олигонуклеотидов согласно изобретению по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три,остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком LNA. Авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что ингибирование микроРНК-мишеней может быть еще более усилено, если два остатка LNA в указанной коровой последовательности будут разделены по меньшей мере одним остатком ДНК. В соответствии с этим в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к вышеописанному олигонуклеотиду, в котором по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, были заменены соответствующим остатком LNA и в котором остатки LNA разделены по меньшей мере одним остатком ДНК. Авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что ингибирование микроРНКмишеней может быть еще более усилено, если два остатка LNA в указанной коровой последовательности будут разделены максимум двумя остатками ДНК. В соответствии с этим в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к вышеописанному олигонуклеотиду, в котором число смежных остатков ДНК в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, составляет максимум два. Указанные данные относятся к коровой последовательности per se, т.е. они относятся к положениям олигонуклеотидов согласно изобретению, соответствующих коровой последовательности. Следовательно, в другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше олигонуклеотиду, где по меньшей мере два, например два, три или четыре, остатка ДНК в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9 от 3'-конца были заменены соответствующим остатком LNA и где остатки LNA разделены по меньшей мере одним остатком ДНК. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к описанному выше олигонуклеотиду, где число смежных остатков ДНК в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9 от 3'-конца составляет максимум два. В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к вышеописанному олигонуклеотиду, где по меньшей мере два, например два, три или четыре, остатка ДНК в положениях 1-8, 2-9 или 3-10,предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10 от 3'-конца были заменены соответствующим остатком LNA и где остатки LNA разделены по меньшей мере одним остатком ДНК. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше олигонуклеотиду, где число смежных остатков ДНК в положениях 1-8, 2-9 или 3-10, а предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10, считая от 3'-конца, составляет максимум два.- 22015570 В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к вышеописанному олигонуклеотиду, где по меньшей мере два, например два, три, четыре или пять, остатков ДНК в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, были заменены соответствующим остатком LNA и где остатки LNA разделены по меньшей мере одним остатком ДНК. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше олигонуклеотиду, где число смежных остатков ДНК в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, составляет максимум два. Модификация нуклеотидов, расположенных за пределами коровой последовательности. Как упоминалось выше, нуклеотидами, находящимися за пределами коровой последовательности,могут быть остатки LNA и/или нe-LNA-остатки. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше олигонуклеотиду, где число остатков LNA, находящихся за пределами коровой последовательности, составляет по меньшей мере один, например один, два, три или четыре и где указанные остатки LNA разделены по меньшей мере одним нe-LNA-остатком. В другом варианте изобретения замену за пределами коровой последовательности осуществляют таким образом, чтобы число смежных нe-LNA-остатков, находящихся за пределами коровой последовательности, составляло максимум два. Модификация нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца. В нижеследующих вариантах, которые относятся к модификации нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца, остатки LNA могут быть заменены другими нуклеотидными аналогами, такими как аналоги,описанные в настоящем изобретении. Поэтому "X" может быть выбран из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК-остатка, 2'ОМе-РНК-остатка, 2'-амино-ДНК-остатка, 2'-фтор-ДНК-остатка, LNA-остатка,PNA-остатка, HNA-остатка, INA-остатка, "х" предпочтительно обозначает ДНК или РНК, наиболее предпочтительно ДНК. В представляющем интерес варианте изобретения олигонуклеотиды согласно изобретению модифицированы в положениях 3-8 от 3'-конца. Конструкция этой последовательности может определяться числом нe-LNA-остатков или числом LNA-остатков, присутствующих в данной последовательности. В предпочтительном варианте первого аспекта по меньшей мере один, например один, нуклеотид в положениях 3-9 от 3'-конца представляет собой нe-LNA-остаток. В другом варианте изобретения по меньшей мере два, например два, нуклеотида в положениях 3-8 от 3'-конца представляют собой нe-LNA-остатки. В еще одном варианте изобретения по меньшей мере три, например три, нуклеотида в положениях 3-8 от 3'-конца представляют собой нe-LNA-остатки. В еще одном варианте изобретения по меньшей мере четыре, например четыре, нуклеотида в положениях 3-8 от 3'-конца представляют собой нe-LNA-остатки. В другом варианте изобретения по меньшей мере пять, например пять, нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'конца представляют собой нe-LNA-остатки. В еще одном варианте изобретения все шесть нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца представляют собой нe-LNA-остатки. В предпочтительном варианте изобретения указанным не-LNA-остатком является остаток ДНК. Альтернативно, в своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, содержащему по меньшей мере один остаток LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит один остаток LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. Тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из Хххххх, хХхххх, ххХххх, хххХхх, ххххХх и хххххХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере два остатка LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит два остатка LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. Тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из ХХхххх, ХхХххх, ХххХхх,ХхххХх, ХххххХ, хХХххх, хХхХхх, хХххХх, хХхххХ, ххХХхх, ххХхХх, ххХххХ, хххХХх, хххХхХ и ххххХХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из ХхХххх, ХххХхх, ХхххХх, ХххххХ, хХхХхх, хХххХх, хХхххХ, ххХхХх, ххХххХ и хххХхХ,где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из хХхХхх, хХххХх, хХхххХ, ххХхХх, ххХххХ и хххХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из хХхХхх, хХххХх и ххХхХх, где"X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В наиболее предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца представляет собой хХхХхх, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере три остатка LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит три остатка LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. Тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из ХХХххх, хХХХхх, ххХХХх,- 23015570 хххХХХ, ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, хХХхХх, хХХххХ, ххХХхХ, ХхХХхх, ХххХХх, ХхххХХ,хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ, хХхХхХ и ХхХхХх, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNAостаток. В предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'конца может быть выбран из группы, состоящей из ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, хХХхХх, хХХххХ,ххХХхХ, ХхХХхх, ХххХХх, ХхххХХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ, хХхХхХ и ХхХхХх, где Х" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца выбран из группы, состоящей из хХХхХх, хХХххХ,ххХХхХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ и хХхХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNAостаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца представляет собой хХхХхХ или ХхХхХх, где "X" обозначает остаток LNA, а "х" обозначает нe-LNA-остаток. В наиболее предпочтительном варианте изобретения, тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца представляет собой хХхХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере четыре остатка LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит четыре остатка LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. Тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из ххХХХХ, хХхХХХ,хХХхХХ, хХХХхХ, хХХХХх, ХххХХХ, ХхХхХХ, ХхХХхХ, ХхХХХх, ХХххХХ, ХХхХхХ, ХХхХХх,ХХХххХ, ХХХхХх и ХХХХхх, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере пять остатков LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит пять остатков LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. Тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из хХХХХХ, ХхХХХХ,ХХхХХХ, ХХХхХХ, ХХХХхХ и ХХХХХх, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNAостаток. При этом предпочтительно, чтобы олигонуклеотид согласно изобретению содержал один или два остатка LNA в положениях 3-8 от 3'-конца. Такая конструкция рассматривается как предпочтительная с точки зрения стабильности А-спирали, образованной дуплексом олигонуклеотид:микроРНК, т.е. дуплексом, который по своей структуре напоминает дуплекс РНК:РНК. В предпочтительном варианте изобретения указанным не-LNA-остатком является остаток ДНК. Изменение длин олигонуклеотидов. Длина олигонуклеотидов согласно изобретению необязательно должна точно соответствовать длине микроРНК-мишеней. Фактически, предпочтительнее использовать короткие олигонуклеотиды, такие как олигонуклеотиды длиной 10-17 или 10-16 нуклеотидов. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению имеет длину 8-24 нуклеотида, например 10-24 нуклеотида, 12-24 нуклеотида, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, предпочтительно 10-22, например 12-22 нуклеотида, а именно 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 нуклеотида, более предпочтительно 10-20, например 12-20 нуклеотидов, а именно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, еще более предпочтительно 10-19, например 12-19 нуклеотидов, а именно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 нуклеотидов, например 10-18, а именно 12-18 нуклеотидов, например 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 нуклеотидов, более предпочтительно 10-17, например 12-17 нуклеотидов, а именно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно 10-16, например 12-16 нуклеотидов, а именно 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов. Модификация нуклеотидов от положения 11 в направлении от 3'-конца до 5'-конца. Тип замены нуклеотидов от положения 11 в направлении от 3'-конца до 5'-конца может включать, а может и не включать остатки нуклеотидных аналогов (такие как LNA). В предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере один остаток нуклеотидного аналога (такого как LNA), например один остаток нуклеотидного аналога от положения 11 в направлении от 3'-конца до 5'-конца. В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере два остатка нуклеотидного аналога, такого как LNA,например два остатка нуклеотидного аналога от положения 11 до 5'-конца в направлении от 3'-5'. В нижеследующих вариантах, которые относятся к модификации нуклеотидов от положения 11 до 5'-конца данного олигонуклеотида, остатки LNA могут быть заменены другими нуклеотидными аналогами, такими как аналоги, описанные в настоящем изобретении. Поэтому "X" может быть выбран из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК-остатка, 2'ОМе-РНК-остатка, 2'-амино-ДНК-остатка, 2'-фторДНК-остатка, LNA-остатка, PNA-остатка, HNA-остатка, INA-остатка, "х" предпочтительно, обозначает ДНК или РНК, а наиболее предпочтительно ДНК.- 24015570 В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению имеет нижеследующий тип замены, который повторяется от нуклеотида 11 до 5'-конца в направлении от 3'-5': хХхХ или ХхХх,где "X" означает остаток LNA, а "х" означает не-LNA-остаток. В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению имеет нижеследующий тип замены, который повторяется от нуклеотида 11 до 5'-конца в направлении от 3'-5': ХххХхх, хХххХх или ххХххХ, где "X" означает остаток LNA, а"х" означает нe-LNA-остаток. В еще одном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению имеет нижеследующий тип замены, который повторяется от нуклеотида 11 до 5'-конца в направлении от 3'-5': ХхххХххх, хХхххХхх, ххХхххХх или хххХхххХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нeLNA-остаток. Характер специфической замены для нуклеотидов от положения 11 до 5'-конца в направлении от 3'-5' зависит от числа нуклеотидов в олигонуклеотидах согласно изобретению. В предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 12 нуклеотидов, и такую замену для положений 11-12 от 3'-конца выбирают из группы, состоящей из хХ и Хх, где "X" означает остатокLNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-12 от 3'-конца имеет характер хХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. Альтернативно, остатки LNA отсутствуют в положениях 11-12 от 3'-конца, т.е. замена имеет характер хх. В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 13 нуклеотидов, и замену для положений 11-13 от 3'-конца выбирают из группы, состоящей из Ххх,хХх, ххХ, ХХх, ХхХ, хХХ и XXX, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-13 от 3'-конца выбрана из группы,состоящей из хХх, ххХ и хХХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-13 от 3'-конца имеет характер ххХ, где"X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. Альтернативно, остатки LNA отсутствуют в положениях 11-12 от 3'-конца, т.е. замена имеет характер xxx. В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 14 нуклеотидов, и замену для положений 11-14 от 3'-конца выбирают из группы, состоящей из Хххх,хХхх, ххХх, хххХ, ХХхх, ХхХх, ХххХ, хХХх, хХхХ и ххХХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-14 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из хХхх, ххХх, хххХ, хХхХ и ххХХ, где "X" означает остаток LNA, a "х" означает нe-LNA-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-14 от 3'-конца имеет характер хХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. Альтернативно, остатки LNA отсутствуют в положениях 11-14 от 3'-конца, т.е. замена имеет характер хххх. В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 15 нуклеотидов, и такую замену для положений 11-15 от 3'-конца выбирают из группы, состоящей из Ххххх, хХххх, ххХхх, хххХх, ххххХ, ХХххх, ХхХхх, ХххХх, ХхххХ, хХХхх, хХхХх, хХххХ, ххХХх,ххХхХ, хххХХ и ХхХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-15 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из ххХхх, ХхХхх, ХххХх, хХхХх, хХххХ и ххХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNAостаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-15 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из ххХхх, хХхХх, хХххХ и ххХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-15 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из хХххХ и ххХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения, замена в положениях 11-15 от 3'-конца имеет характер ххХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. Альтернативно, остатки LNA отсутствуют в положениях 11-15 от 3'-конца, т.е. замена имеет характер ххххх. В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 16 нуклеотидов, и такую замену для положений 11-16 от 3'-конца выбирают из группы, состоящей из Хххххх, хХхххх, ххХххх, хххХхх, ххххХх, хххххХ, ХХхххх, ХхХххх, ХххХхх, ХхххХх, ХххххХ,хХХххх, хХхХхх, хХххХх, хХхххХ, ххХХхх, ххХхХх, ххХххХ, хххХХх, хххХхХ, ххххХХ, ХХХххх,ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, ХхХХхх, ХхХхХх, ХхХххХ, ХххХХх, ХххХхХ, ХхххХХ, хХХХхх,хХХхХх, хХХххХ, хХхХХх, хХхХхХ, хХххХХ, ххХХХх, ххХХхХ, ххХхХХ и хххХХХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-16 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из ХххХхх, хХхХхх, хХххХх, ххХхХх, ххХххХ,ХхХхХх, ХхХххХ, ХххХхХ, хХхХхХ, хХххХХ и ххХхХХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-16 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из хХхХхх, хХххХх, ххХхХх, ххХххХ, хХхХхХ, хХххХХ и ххХхХХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-16 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из ххХххХ,хХхХхХ, хХххХХ и ххХхХХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-16 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из ххХххХ и хХхХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. В наиболее предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-16 от 3'-конца имеет характер- 25015570 ххХххХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. Альтернативно, остатки LNA отсутствуют в положениях 11-16 от 3'-конца, т.е. замена имеет характер xxxxxx. В предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит остаток LNA у 5'-конца. В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит остаток LNA в первых двух положениях от 5'-конца. В особенно предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 13 нуклеотидов, и замена от 3'-конца имеет характер ХХхХхХххХХххХ, где "X" означает остатокLNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. Предпочтительной последовательностью этого варианта от 3'-конца является последовательность CCtCaCacTGttA, где прописные буквы означают азотистые основания в LNA-остатке, а строчные буквы означают азотистые основания в нe-LNA-остатке. В другом особенно предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 15 нуклеотидов, и замена от 3'-конца имеет характер ХХхХхХххХХххХхХ, где "X" означает остаток LNA, а "х" означает нe-LNA-остаток. Предпочтительной последовательностью этого варианта от 3'-конца является последовательность CCtCaCacTGttAcC, где прописные буквы означают азотистые основания в LNA-остатке, а строчные буквы означают азотистые основания в нe-LNA-остатке. Модификация межнуклеозидной связывающей группы. Типичными межнуклеозидными связывающими группами в олигонуклеотидах являются фосфатные группы, но эти группы могут быть заменены межнуклеозидными связывающими группами, не являющимися фосфатом. В другом представляющем интерес варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению имеет модифицированную структуру межнуклеозидных связывающих групп, т.е. модифицированный олигонуклеотид содержит межнуклеозидную связывающую группу, не являющуюся фосфатом. В соответствии с этим в предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере одну группу. Конкретные примеры межнуклеозидных связывающих групп, за исключением фосфата(-O-P(O)2-O-), включают -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-,-O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-,-O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -O-CO-O-,-O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-,-O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-,-CH2-NCH3-O-CH2-, где RH представляет собой водород или C1-4 алкил. Если межнуклеозидная связывающая группа является модифицированной, то указанная межнуклеозидная связывающая группа предпочтительно представляет собой фосфортиоатную группу(-O-P(O,S)-O-). В предпочтительном варианте изобретения все межнуклеозидные связывающие группы олигонуклеотидов согласно изобретению представляют собой фосфортиоат.- 26015570 Конструкции специфических микроРНК. В нижеследующей таблице приводятся примеры олигонуклеотидов согласно изобретению, а именно олигонуклеотидов, используемых в фармацевтических композициях, и для сравнения известных молекул.