Вакцины против хламидиоза

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим белки или полинуклеотиды Chlamydia sp., в частности комбинации белков или кодирующих их полинуклеотидов, и к способам применения данных белков или полинуклеотидов в лечении, предупреждении или диагностике хламидиоза. 014527 Область изобретения Настоящее изобретение относится, по существу, к лечению или предупреждению хламидиоза. В частности, изобретение относится к композициям полипептидов, содержащим хламидийный антиген, и их комбинациям и к применению таких композиций для профилактического или терапевтического лечения хламидиоза. Предшествующий уровень техники Хламидии являются внутриклеточными патогенными бактериями, ответственными за широкий спектр важных инфекций человека и животных.Chlamydia trachomatis переносится между людьми посредством бытового или полового контакта. Существует множество сероваров Chlamydia trachomatis, и, хотя идентификация и классификация сероваров продолжают развиваться, до настоящего времени было сообщено по меньшей мере о 18 сероварах. Серовары от А до С ассоциируются, прежде всего, с трахомой глаз, серовары от D до K - с окулогенитальным заболеванием, а серовары от L1 до L3 - с венерической лимфогранулемой (LGV) (Brunham, R.C.Chlamydia trachomatis является одной из наиболее частых причин заболеваний, передаваемых половым путем, и может приводить к воспалению тазовых органов (PID), что заканчивается обструкцией маточных труб и бесплодием. Chlamydia trachomatis может играть роль также в бесплодии у мужчин. В 1990 г. стоимость лечения PID в США оценивали в 4 миллиона долларов. Всемирная Организация Здравоохранения подсчитала, что в 1990 г. во всем мире наблюдали 90 миллионов новых случаев венерических заболеваний, вызванных Chlamydia trachomatis (Global Prevalence and Incidence of Selected CurableSexually Transmitted Infections, World Health Organization, Geneva, 2001). Кроме того, язвенные венерические заболевания, такие как инфекция Chlamydia trachomatis, являются главным фактором риска приобретения ВИЧ (Brunham, R.C. et al., J. Nat. Rev. Immunol. 2005, 5:149-161; Igietseme, J.U. et al., Expert Rev.Vaccines, 2003, 2(1):129-146). Трахома вследствие глазной инфекции, вызываемой Chlamydia trachomatis, является ведущей причиной предотвращаемой слепоты во всем мире, и, по оценкам, от нее страдают 300-500 миллионов человек (West, S.K. Prog. Ret. Eye Res. 2004, 23:381-401). Современное лечение включает применение антибиотиков, таких как тетрациклин (ежедневно в течение периода от 4 до 6 недель) или азитромицин (однократная доза). Несмотря на эффективность борьбы с инфекцией, обычно имеет место повторная инфекция из-за эндемической природы инфекции. Повторяющаяся инфекция в течение многих лет приводит к рубцеванию века, деформации края века и трению ресниц о роговицу (трихиаз). Постоянная травма роговицы болезненна и приводит к помутнению роговицы и слепоте (Mabey, D.C.W. et al., The Lancet,2003, 362:223-229).Chlamydia pneumoniae является главной причиной острых респираторных инфекций у человека, а также считают, что она играет роль в патогенезе атеросклероза и, в частности, ишемической болезни сердца. Показано, что индивидуумы с более высоким титром антител к Chlamydia pneumoniae по меньшей мере в два раза вероятнее страдают от ишемической болезни сердца по сравнению с серонегативными индивидуумами. Часто хламидиоз является бессимптомным и субклиническим, так что тяжелые и часто необратимые осложнения могут проявляться в виде первых симптомов генитальной инфекции. У детей,родившихся у матерей с генитальным хламидиозом, может развиться пневмония, и Chlamydia trachomatis считают наиболее частым возбудителем пневмонии в течение первых шести месяцев жизни(de la Maza, L.M. et al., Curr. Opin. Investig. Drugs, 2002, 3(7):980-986). Таким образом, хламидиоз представляет собой значимую проблему в здравоохранении как в развитых, так и в развивающихся странах. В свете задач общественного здравоохранения и того факта, что стоимость современного лечения во многих развивающихся странах является чрезмерной, разработка вакцин против видов Chlamydia была важной целью исследований. Поскольку строение генов Chlamydiatrachomatis является относительно стабильным и поскольку наличие животных резервуаров является ничтожно малым, даже вакцины с ограниченной эффективностью могут оказывать значительное влияние на распространенность инфекций. Таким образом, в данной области сохраняется потребность в улучшенных вакцинах и фармацевтических композициях для предупреждения и лечения хламидийных инфекций. Также в данной области сохраняется потребность в поливалентных вакцинах для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых Chlamydia trachomatis, которые являются эффективными в отношении ряда сероваров. В настоящем изобретении эти потребности удовлетворены и, кроме того, предложены другие сопутствующие преимущества.-1 014527 Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим антигены бактериальных патогеновChlamydia. Chlamydia. Такие бактериальные патогены включают в себя Chlamydia trachomatis, Chlamydiapsitacci, Chlamydia pneumonia и Chlamydia muridarum. Хламидийные антигены могут быть получены из любого количества сероваров в пределах видов Chlamydia. Следует отметить, что Chlamydia muridarum ранее была известна как штамм Chlamydia trachomatis,вызывающий мышиный пневмонит (MoPn), и оба названия до сих пор широко используются, хотя они относятся к одной и той же бактерии. Для согласованности в данном описании используют только название Chlamydia muridarum. Настоящее изобретение основано, в частности, на открытии авторов изобретения того, что хламидийные полипептиды обладают иммуногенными и антигенными свойствами и могут обеспечивать защиту против хламидиоза при введении в качестве профилактических вакцин. Между антигенами разных сероваров и видов можно видеть некоторый уровень перекрестной реактивности, и, следовательно, предполагают, что хламидийные антигены обеспечат защитный иммунный ответ против вида или серовара,отличного от того, из которого был получен антиген. Более конкретно, авторы изобретения обнаружили, что некоторые комбинации хламидийных полипептидов обеспечивают хороший иммунный ответ. Для некоторых комбинаций хламидийных полипептидов показано, что они обеспечивают защиту против хламидийной инфекции на мышиных моделях. В конкретном воплощении выделенные или очищенные хламидийные полипептиды по изобретению могут быть приготовлены в виде фармацевтических композиций для введения субъекту при предупреждении и/или лечении хламидиоза. Иммуногенность белковой композиции может быть усилена путем включения адъюванта. В конкретном воплощении выделенные или очищенные хламидийные полипептиды вводят в виде комбинации отдельных антигенов, возможно в комбинации с адъювантом. Альтернативно, хламидийные полипептиды вводят в форме слитого белка, возможно в комбинации с адъювантом. В другом аспекте по изобретению выделенные или очищенные полинуклеотиды используют для продуцирования рекомбинантных полипептидных антигенов in vitro. Альтернативно, полинуклеотиды можно вводить субъекту в качестве полинуклеотидных вакцин для того, чтобы вызвать экспрессию антигена у субъекта и последующую индукцию иммунного ответа против хламидий. В еще одном аспекте изобретения некоторые комбинации хламидийных полипептидов по настоящему изобретению, их иммуногенных фрагментов или кодирующих их полинуклеотидов, происходящих из первого серовара Chlamydia trachomatis, можно вводить субъекту для лечения или предупреждения хламидийной инфекции, вызываемой вторым сероваром Chlamydia trachomatis. Также целью изобретения является то, что полипептиды можно использовать для анализов in vitro для определения гуморальных антител или клеточно-опосредованного иммунитета против хламидий для диагностики инфекции или мониторинга прогрессирования заболевания. Альтернативно, полипептиды могут быть использованы в качестве иммуногенов для генерирования антихламидийных антител у животного, не являющегося человеком. Указанные антитела могут быть использованы для определения антигенов-мишеней in vivo и in vitro. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показаны данные бактериального шеддинга на 7-е сутки у мышей Balb/c, представляющие собой данные трех экспериментов, в которых группы из 5 мышей Balb/c были иммунизированы указанными комбинациями антигенов в AS01B. График представляет данные трех экспериментов, в которых группы из 5 мышей Balb/c были иммунизированы указанными комбинациями антигенов в адъювантеAS01B. UVEB из серовара Е, приготовленный в виде композиции с AS01B, служил в качестве положительного контроля защиты, а мышей, ложно иммунизированных AS01 В, использовали в качестве положительного контроля инфекции. Мышей, получавших прогестерон, заражали интравагинальной дозой 5105 IFU (инфекционные единицы, или единицы, образующие тельца-включения, от англ. inclusionforming units) серовара K. Бактериальный шеддинг количественно оценивали путем взятия мазков на 7-е сутки после инфицирования и определения IFU с использованием клеток McCoy. Данные одного эксперимента с прямым сравнением были объединены. На фиг. 2 показан шеддинг хламидий в LGT (нижние половые пути) и хламидийная нагрузка после заражения сероваром K Chlamydia trachomatis в UGT (верхние половые пути) мышей Balb/c, иммунизированных комбинациями антигенов. Графики представляют данные следующих друг за другом экспериментов, в которых группы из 8 мышей Balb/c иммунизировали указанной комбинацией антигенов в адъюванте AS01B. UVEB из серовара Е, приготовленный в виде композиции с AS01B, служил в качестве положительного контроля защиты, а мышей, ложно иммунизированных AS01 В, использовали в качестве положительного контроля инфекции. Мышей, получавших прогестерон, заражали интравагинальной дозой 5105 IFU серовара K. Бактериальный шеддинг количественно оценивали путем взятия мазков на 7-е сутки после инфицирования и определения IFU с использованием клеток McCoy. Мышей умерщвляли через 10 суток после инфицирования для определения хламидийной нагрузки в верхних половых путях-2 014527 посредством гомогенизации половины UGT и определения IFU с использованием клеток McCoy. Следует отметить, что предел обнаружения составлял 10 в отношении обоих вышеуказанных графиков. На фиг. 3 показаны данные бактериального шеддинга на 7-е сутки у мышей C57BI/6, иммунизированных указанными комбинациями антигенов в AS01B. Графики представляют данные следующих друг за другом экспериментов, в которых группы из 8 мышей C57BI/6 иммунизировали указанной комбинацией антигенов в AS01B. UVEB из серовара Е, приготовленный в виде композиции с AS01B, служил в качестве положительного контроля защиты, а мышей, ложно иммунизированных AS01 В, использовали в качестве положительного контроля инфекции. Мышей, получавших прогестерон, заражали интравагинальной дозой 5105 IFU серовара K. Бактериальный шеддинг количественно оценивали путем взятия мазков на 7-е сутки после инфицирования и определения IFU с использованием клеток McCoy. На фиг. 4 показаны данные бактериального шеддинга на 7-е сутки у мышей Balb/c, иммунизированных указанными комбинациями антигенов в AS01B. График представляет объединенные данные 5 экспериментов, в которых группы из 5-8 мышей Balb/c иммунизировали указанными комбинациями антигенов в AS01B. UVEB из серовара Е, приготовленный в виде композиции с AS01B, служил в качестве положительного контроля защиты, а мышей, ложно иммунизированных AS01B, использовали в качестве положительного контроля инфекции. Мышей, получавших прогестерон, заражали интравагинальной дозой 5105 IFU серовара K. Бактериальный шеддинг количественно оценивали путем взятия мазков на 7-е сутки после инфицирования и определения IFU с использованием клеток McCoy. На фиг. 5 показаны данные бактериального шеддинга на 7-е сутки у мышей C57BI/6, иммунизированных указанными комбинациями антигенов в AS01B. Графики представляют объединенные данные 3 экспериментов, в которых группы из 5-8 мышей C57BI/6 иммунизировали указанной комбинацией антигенов в AS01B. UVEB из серовара Е, приготовленный в виде композиции с AS01B, служил в качестве положительного контроля защиты, а мышей, ложно иммунизированных AS01 В, использовали в качестве положительного контроля инфекции. Мышей, получавших прогестерон, заражали интравагинальной дозой 5105 IFU серовара K. Бактериальный шеддинг количественно оценивали путем взятия мазков на 7-е сутки после инфицирования и определения IFU с использованием клеток McCoy. На фиг. 6 показано выравнивание последовательности Ct-089 из серовара Е Chlamydia trachomatis относительно Ct-089 из ряда других сероваров Chlamydia trachomatis. На фиг. 7 а и 7b показано выравнивание последовательности Ct-858 из серовара Е Chlamydiatrachomatis относительно Ct-858 из ряда других сероваров Chlamydia trachomatis. На фиг. 8 а и 8b показано выравнивание последовательности Ct-875 из серовара Е Chlamydiatrachomatis относительно Ct-875 из ряда других сероваров Chlamydia trachomatis. На фиг. 9 показаны результаты сравнения идентичности аминокислотной последовательностиCt-089 из серовара Е Chlamydia trachomatis с Ct-089 из ряда других сероваров Chlamydia trachomatis. На фиг. 10 показаны результаты сравнения идентичности аминокислотной последовательностиCt-858 из серовара Е Chlamydia trachomatis с Ct-858 из ряда других сероваров Chlamydia trachomatis. На фиг. 11 показаны результаты сравнения идентичности аминокислотной последовательностиCt-875 из серовара Е Chlamydia trachomatis с Ct-875 из ряда других сероваров Chlamydia trachomatis. На фиг. 12 показано выравнивание последовательности Ct-089 из серовара Е Chlamydia trachomatis относительно эквивалентных белков из других сероваров Chlamydia trachomatis и видов Chlamydia. На фиг. 13 показано выравнивание последовательности Ct-858 из серовара Е Chlamydia trachomatis относительно эквивалентных белков из других сероваров Chlamydia trachomatis и видов Chlamydia. На фиг. 14 показано выравнивание последовательности Ct-875 из серовара Е Chlamydia trachomatis относительно эквивалентных белков из других сероваров Chlamydia trachomatis и видов Chlamydia. На фиг. 15 показаны результаты мазков, взятых у мышей, иммунизированных Ct-089, Ct-858 иCt-875 из серовара Е Chlamydia trachomatis, после заражения сероварами D, K и J Chlamydia trachomatis.UVEB в каждом случае получают из одного и того же серовара, используемого для заражения (например,J, D и K соответственно). И UVEB, и комбинированное лечение осуществляют в присутствии адъювантаCt-875 из серовара Е Chlamydia trachomatis, через 7 суток после заражения сероварами D, K и J Chlamydiatrachomatis. UVEB в каждом случае получают из одного и того же серовара, используемого для заражения (например, J, D и K соответственно). И UVEB, и комбинированное лечение осуществляют в присутствии адъюванта (например, AS01 В). На фиг. 17 показана колонизация UGT мышей, иммунизированных Ct-089, Ct-858 и Ct-875 из серовара Е Chlamydia trachomatis, через 10 суток после заражения сероварами D, K и J Chlamydia trachomatis.UVEB в каждом случае получают из одного и того же серовара, используемого для заражения (например,J, D и K соответственно). И UVEB, и комбинированное лечение осуществляют в присутствии адъювантаCt-875 из серовара Е Chlamydia trachomatis, через 4 дня после заражения сероварами K или J Chlamydiatrachomatis. UVEB в каждом случае получают из одного и того же серовара, используемого для заражения (например, J и K соответственно). И UVEB, и комбинированное лечение осуществляют в присутствии адъюванта (например, AS01B). На фиг. 19 показаны результаты мазков, взятых у мышей, иммунизированных Ct-089, Ct-858 иCt-875 из серовара Е Chlamydia trachomatis, через 7 суток после заражения сероварами K или J Chlamydiatrachomatis. UVEB в каждом случае получают из одного и того же серовара, используемого для заражения (например, J и K соответственно). И UVEB, и комбинированное лечение осуществляют в присутствии адъюванта (например, AS01B). На фиг. 20 показана колонизация UGT мышей, иммунизированных Ct-089, Ct-858 и Ct-875 из серовара Е Chlamydia trachomatis, через 10 суток после заражения сероварами K или J Chlamydia trachomatis.UVEB в каждом случае получают из одного и того же серовара, используемого для заражения (например,J и K соответственно). И UVEB, и комбинированное лечение осуществляют в присутствии адъюванта(например, AS01B). На фиг. 21 показано количественное соотношение CD4-респондеров (для отсечения сигнал/фон S/N по меньшей мере 2:1) к стимуляции рядом антигенов для ряда групп серопозитивных субъектов. На фиг. 22 показано количественное соотношение CD4-респондеров (для отсечения сигнал/фон S/N по меньшей мере 3:1) к стимуляции рядом антигенов для ряда групп серопозитивных субъектов. На фиг. 23 показано количественное соотношение CD4-респондеров (для отсечения сигнал/фон S/N по меньшей мере 2:1) к стимуляции рядом антигенов и их комбинаций для ряда групп серопозитивных субъектов. Описание конкретных воплощений Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим комбинации антигенов, полезных для диагностики, предупреждения или лечения хламидиоза, полинуклеотиды, кодирующие такие антигены, и к способам их применения. Антигены по настоящему изобретению представляют собой полипептиды хламидийных антигенов и их иммуногенные фрагменты. В частности, композиции по настоящему изобретению могут содержать комбинацию двух или более хламидийных белков или их иммуногенных фрагментов. Такие белки могут быть выбраны из Swib(также известный как Ct-460), Momp (главный белок наружной мембраны, также известный как Ct-681),Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089 (также известный как CopN), домена-"пассажира" PmpG (PmpGpd, также известный как Ct-871) и домена-"пассажира" PmpD (PmpDpd, также известный как Ct-812). Например, композиция по настоящему изобретению может содержать Ct-089 и Ct-858 или их иммуногенные фрагменты и, возможно, дополнительные антигены, которые могут быть выбраны, например, из Momp, Ct-875, Ct-622, PmpGpd и PmpDpd. В еще одном примере композиция по настоящему изобретению может содержать Ct-875 и Ct-858 или их иммуногенные фрагменты и, возможно, дополнительные антигены, которые могут быть выбраны, например, из Momp, Ct-622, Ct-089, PmpGpd и PmpDpd. Например, композиция по настоящему изобретению может содержать одну из следующих комбинаций хламидийных полипептидов или их иммуногенных фрагментов: 1Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, Ct-089 Все вышеперечисленные комбинации содержат Ct-089 и Ct-858. В другом наборе примеров композиция по настоящему изобретению содержит одну из следующих комбинаций при условии, что все комбинации содержат Ct-089 и Ct-858: 1 а Все пять из Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd и Ct-089 1'а Три из PmpDpd, Ct-858, Ct-089, Swib 2a Пять из Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-089 и Swib 3a Пять из Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622 и Ct-089 4a Три из Ct-858, Ct-875, Ct-622 и Ct-089 5a Два из Ct-858, Ct-875 и Ct-089 5'a Три из PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089 6a Четыре из Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd и Ct-089 или альтернативно 1a" Пять из Swib, Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd и Ct-089-4 014527 Другие композиции для примера по настоящему изобретению могут содержать одну из следующих комбинаций хламидийных полипептидов или их иммуногенных фрагментов: 1 бMomp, PmpD, Ct-858, PmpGpd, Ct-875, Ct-089 Все вышеперечисленные комбинации содержат Ct-875 и Ct-858. В еще одном наборе примеров композиция по настоящему изобретению содержит одну из следующих комбинаций при условии, что все комбинации содержат Ct-875 и Ct-858: 1 в Пять из Swib, Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd и Ct-875 1 в' Три из PmpDpd, Ct-858, Ct-0875, Swib 2 в Пять из Momp, PmpDpd, Ct-858, Ct-622, Ct-875 и Swib 3 в Пять из Momp, PmpDpd, Ct-858, PmpGpd, Ct-622 и Ct-875 4 в Три из Ct-858, Ct-875, Ct-622 и Ct-089 5 в' Три из PmpDpd, Ct-858, Ct-875, Ct-089 6 в Четыре из Momp, PmpD, Ct-858, PmpGpd и Ct-875 Композиции по изобретению содержат два или более хламидийных белков или их иммуногенных фрагментов, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 белков или иммуногенных фрагментов. Для композиций,содержащих каждую из комбинаций, перечисленных выше под номерами 1-6, 1 а-6 а, 1 б-6 б и 1 в-6 в (например, 1-6 и 1 а-6 а), комбинация может включать дополнительные хламидийные антигены, например один дополнительный хламидийный антиген, или она не может содержать больше хламидийных антигенов, чем те, что перечислены. Например, композиция 1 а" может содержать только пять антигенов, которые представляют собой комбинацию тех хламидийных антигенов, которые перечислены, и никаких других антигенов, или композиция 1 а" может содержать комбинацию пяти хламидийных антигенов, которые перечислены (например, все шесть перечисленных антигенов или пять из шести перечисленных антигенов плюс один другой хламидийный антиген), и так далее для композиций 2-6, 2 а-6 а, 1 б-6 б и 1 в-6 в(например, 2-6 и 2 а-6 а). Будет очевидным, что в случае домена-"пассажира" PmpD или PmpG, они могут быть представлены в контексте большей части антигена или полинуклеотида PmpD или PmpG, например полноразмерногоPmpD или PmpG или их фрагмента, при условии, что фрагмент содержит домен-"пассажир". Белки или иммуногенные фрагменты Momp и Swib могут быть, например, из Chlamydia trachomatis или они могут быть из других видов Chlamydia. Антигены, обозначенные выше "Ct" могут представлять собой белки или иммуногенные фрагменты Chlamydia trachomatis или, где возможно, они могут представлять собой эквивалентные белки из других видов Chlamydia (т.е. виды Chlamydia, отличные отChlamydia trachomatis). В одном примере все антигены в композиции по изобретению получены изChlamydia trachomatis. Композиция по настоящему изобретению может альтернативно содержать полинуклеотиды, кодирующие комбинацию двух или более хламидийных белков или иммуногенных фрагментов, которые могут быть выбраны из Swib (также известного как Ct-460), Momp (главного белка наружной мембраны,также известного как Ct-681), Ct-858, Ct-875, Ct-622, Ct-089 (также известного как CopN), домена"пассажира" PmpG (PmpGpd, также известного как Ct-871) и домена-"пассажира" PmpD (PmpDpd, также известного как Ct-812), например комбинации антигенов, перечисленных выше как 1-6, 1 а-6 а, 1 б-6 б и 1 в 6 в (например, 1-6). Композиции полинуклеотидов по изобретению включают те, которые кодируют комбинации антигенов по изобретению, как описано выше (например, Ct-858 и Ct-875). Полинуклеотиды,кодирующие другие антигены, могут быть представлены в виде отдельных нуклеиновых кислот или могут быть представлены вместе в одной нуклеиновой кислоте или в комбинации отдельных и комбинированных нуклеиновых кислот. Ниже предложены полинуклеотидные и полипептидные последовательности некоторых антигенов,которые могут быть использованы в композициях по изобретению и которые были перечислены выше.-5 014527 Краткое описание идентификаторов последовательностейSEQ ID NO:1 представляет собой кДНК-последовательность Ct-460, также известного как Swib, изChlamydia trachomatis, серовар LGVII (серовар LGVII также упоминают как серовар LII).SEQ ID NO:2 представляет собой последовательность белка Ct-460, также известного как Swib, изSEQ ID NO:3 представляет собой кДНК-последовательность хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), из Chlamydia trachomatis, серовар F.SEQ ID NO:4 представляет собой последовательность белка хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), из Chlamydia trachomatis, серовар F, который кодируетсяSEQ ID NO:6 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia trachomatis,серовар Е, который кодируется SEQ ID NO:5.SEQ ID NO:8 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia trachomatis,серовар Е, который кодируется SEQ ID NO:7.SEQ ID NO:10 представляет собой последовательность белка Ct-622 из Chlamydia trachomatis,серовар Е, который кодируется SEQ ID NO:9.SEQ ID NO:11 представляет собой кДНК-последовательность домена-"пассажира" PmpG, также известного как Ct-871, из Chlamydia trachomatis, серовар LGVII.SEQ ID NO:12 представляет собой последовательность белка домена-"пассажира" PmpG, также известного как Ct-871, из Chlamydia trachomatis, серовар LGVII, который кодируется SEQ ID NO:11.SEQ ID NO:13 представляет собой кДНК-последовательность домена-"пассажира" PmpD, также известного как Ct-812, из Chlamydia trachomatis, серовар LGVII.SEQ ID NO:14 представляет собой последовательность белка домена-"пассажира" PmpD, также известного как Ct-812, из Chlamydia trachomatis, серовар LGVII, который кодируется SEQ ID NO:13.SEQ ID NO:16 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia trachomatis,серовар Е, который кодируется SEQ ID NO:15.SEQ ID NO:17 представляет собой кДНК-последовательность хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), из Chlamydia psitacci.SEQ ID NO:18 представляет собой последовательность белка хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), из Chlamydia psitacci, который кодируетсяSEQ ID NO:19 представляет собой кДНК-последовательность хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), из Chlamydia pneumoniae.SEQ ID NO:20 представляет собой последовательность белка хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), из Chlamydia pneumoniae, который кодируетсяSEQ ID NO:22 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia trachomatis,серовар D, который кодируется SEQ ID NO:21.SEQ ID NO:24 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia muridarum, который кодируется SEQ ID NO:23.SEQ ID NO:26 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia psitacci, который кодируется SEQ ID NO:25.SEQ ID NO:27 представляет собой кДНК-последовательность PmpG, также известного как Ct-871,из Chlamydia trachomatis, серовар D.SEQ ID NO:28 представляет собой последовательность белка PmpG, также известного как Ct-871, изSEQ ID NO:29 представляет собой кДНК-последовательность PmpG, также известного как Ct-871,из Chlamydia muridarum.SEQ ID NO:30 представляет собой последовательность белка PmpG, также известного как Ct-871, изSEQ ID NO:31 представляет собой кДНК-последовательность PmpG, также известного как Ct-871,из Chlamydia psitacci.SEQ ID NO:32 представляет собой последовательность белка PmpG, также известного как Ct-871, изSEQ ID NO:34 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia trachomatis,серовар D, который кодируется SEQ ID NO:33.SEQ ID NO:36 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia muridarum, который кодируется SEQ ID NO:35.SEQ ID NO:38 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia psitacci, который кодируется SEQ ID NO:37.SEQ ID NO:40 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia pneumoniae, который кодируется SEQ ID NO:39.SEQ ID NO:41 представляет собой кДНК-последовательность PmpD, также известного как Ct-812,из Chlamydia trachomatis, серовар D.SEQ ID NO:42 представляет собой последовательность белка PmpD, также известного как Ct-812, изChlamydia trachomatis, серовар D, который кодируется SEQ ID NO:41. Домен-"пассажир" охватывает аминокислоты от 31 до 1203.SEQ ID NO:43 представляет собой кДНК-последовательность PmpD, также известного как Ct-812,из Chlamydia muridarum.SEQ ID NO:44 представляет собой последовательность белка PmpD, также известного как Ct-812, изSEQ ID NO:45 представляет собой кДНК-последовательность PmpD, также известного как Ct-812,из Chlamydia psitacci.SEQ ID NO:46 представляет собой последовательность белка PmpD, также известного как Ct-812, изSEQ ID NO:47 представляет собой кДНК-последовательность хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), также известного как Ct-681, из Chlamydia trachomatis,серовар LGVII.SEQ ID NO:48 представляет собой последовательность белка хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), также известного как Ct-681, из Chlamydia trachomatis,серовар LGVII, который кодируется SEQ ID NO:47.SEQ ID NO:49 представляет собой кДНК-последовательность хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), также известного как Ct-681, из Chlamydia trachomatis,серовар J.SEQ ID NO:50 представляет собой последовательность белка хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), также известного как Ct-681, из Chlamydia trachomatis,серовар J, который кодируется SEQ ID NO:49.SEQ ID NO:51 представляет собой кДНК-последовательность хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), также известного как Ct-681, из Chlamydia trachomatis,серовар Н.SEQ ID NO:52 представляет собой последовательность белка хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), также известного как Ct-681, из Chlamydia trachomatis,серовар Н, который кодируется SEQ ID NO:51.SEQ ID NO:53 представляет собой кДНК-последовательность хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), также известного как Ct-681, из Chlamydia trachomatis,серовар Е.SEQ ID NO:54 представляет собой последовательность белка хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), также известного как Ct-681, из Chlamydia trachomatis,серовар Е, который кодируется SEQ ID NO:53.SEQ ID NO:55 представляет собой кДНК-последовательность хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), также известного как Ct-681, из Chlamydia trachomatis,серовар D.SEQ ID NO:56 представляет собой последовательность белка хламидийного антигена, известного как главный белок наружной мембраны (Momp), также известного как Ct-681, из Chlamydia trachomatis,серовар D, который кодируется SEQ ID NO:55.SEQ ID NO:58 представляет собой последовательность белка Ct-622 из Chlamydia trachomatis,серовар D, который кодируется SEQ ID NO:57.SEQ ID NO:60 представляет собой последовательность белка Ct-622 из Chlamydia psitacci, который кодируется SEQ ID NO:59.SEQ ID NO:62 представляет собой последовательность белка Ct-622 из Chlamydia pneumoniae, который кодируется SEQ ID NO:61.SEQ ID NO:63 представляет собой кДНК-последовательность Ct-460, также известного как Swib, изSEQ ID NO:64 представляет собой последовательность белка Ct-460, также известного как Swib, изSEQ ID NO:65 представляет собой кДНК-последовательность Ct-460, также известного как Swib, изSEQ ID NO:66 представляет собой последовательность белка Ct-460, также известного как Swib, изSEQ ID NO:67 представляет собой кДНК-последовательность Ct-460, также известного как Swib, изSEQ ID NO:68 представляет собой последовательность белка Ct-460, также известного как Swib, изSEQ ID NO:69 представляет собой кДНК-последовательность Ct-460, также известного как Swib, изSEQ ID NO:70 представляет собой последовательность белка Ct-460, также известного как Swib, изSEQ ID NO:72 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia trachomatis,серовар D, который кодируется SEQ ID NO:71.SEQ ID NO:74 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia muridarum, который кодируется SEQ ID NO:73.SEQ ID NO:76 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia psitacci, который кодируется SEQ ID NO:75.SEQ ID NO:78 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia pneumoniae, который кодируется SEQ ID NO:77.SEQ ID NO:80 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia trachomatis,серовар А, который кодируется SEQ ID NO:79.SEQ ID NO:82 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia trachomatis,серовар В, который кодируется SEQ ID NO:81.SEQ ID NO:84 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia trachomatis,серовар G, который кодируется SEQ ID NO:83.SEQ ID NO:86 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia trachomatis,серовар Н, который кодируется SEQ ID NO:85.SEQ ID NO:88 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia trachomatis,серовар I, который кодируется SEQ ID NO:87.SEQ ID NO:90 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia trachomatis,серовар J, который кодируется SEQ ID NO:89.SEQ ID NO:92 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia trachomatis,серовар K, который кодируется SEQ ID NO:91.SEQ ID NO:94 представляет собой последовательность белка Ct-089 из Chlamydia trachomatis,серовар L2, который кодируется SEQ ID NO:93.SEQ ID NO:96 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia trachomatis,серовар А, который кодируется SEQ ID NO:95.SEQ ID NO:98 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia trachomatis,серовар В, который кодируется SEQ ID NO:97.SEQ ID NO:100 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia trachomatis,серовар G, который кодируется SEQ ID NO:99.SEQ ID NO:102 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia trachomatis,серовар Н, который кодируется SEQ ID NO:101.SEQ ID NO:104 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia trachomatis,серовар I, который кодируется SEQ ID NO:103.SEQ ID NO:106 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia trachomatis,серовар J, который кодируется SEQ ID NO:105.SEQ ID NO:108 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia trachomatis,серовар K, который кодируется SEQ ID NO:107.SEQ ID NO:110 представляет собой последовательность белка Ct-858 из Chlamydia trachomatis,серовар L2, который кодируется SEQ ID NO:109.SEQ ID NO:112 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia trachomatis,серовар А, который кодируется SEQ ID NO:111.SEQ ID NO:114 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia trachomatis,серовар В, который кодируется SEQ ID NO:113.SEQ ID NO:116 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia trachomatis,серовар G, который кодируется SEQ ID NO:115.SEQ ID NO:118 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia trachomatis,серовар Н, который кодируется SEQ ID NO:117.SEQ ID NO:120 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia trachomatis,серовар I, который кодируется SEQ ID NO:119.SEQ ID NO:122 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia trachomatis,-9 014527 серовар J, который кодируется SEQ ID NO:121.SEQ ID NO:124 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia trachomatis,серовар K, который кодируется SEQ ID NO:123.SEQ ID NO:126 представляет собой последовательность белка Ct-875 из Chlamydia trachomatis,серовар L2, который кодируется SEQ ID NO:125. Некоторые из вышеперечисленных последовательностей и других родственных полипептидов и полинуклеотидов из ряда сероваров Chlamydia известны и доступны в данной области. Дополнительные родственные последовательности могут быть найдены в опубликованных патентах США 6447779,6166177, 6565856, 6555115, 6432916 и 6448234, а также раскрыты в заявках на патент США 10/197220,10/762058 и 10/872155, каждая из которых включена в данное описание посредством ссылки. Последовательность Ct-089 из серовара D и возможное применение этого белка в качестве антигена были раскрыты, например, в WO 02/08267 (Corixa Corporation). Последовательность Ct-089 из серовара L2 была раскрыта в WO 99/28475 (Genset). Роль CopN (также известного как Ct-089) как предполагаемого экспортируемого регулятора III типа систем секреции белка обсуждена в Fields, K.A. and Hadkstadt, T Mol. Microbiol. 2000, 38(5):1048-1060. Последовательности Ct-858 и Ct-875 из серовара D доступны из базы данных Swiss-Prot, основные инвентарные номера соответственно 084866 и 084883. Для дополнительной информации см.Stephens, R.S. et al., Science, 1998, 282:754-759. Применение Ct-858 в качестве антигена раскрыто, например, в WO 02/08267 (Corixa Corporation). Последовательность Ct-875 из серовара Е (включая His-метку) и ее применение в качестве антигена раскрыты, например, в US 20040137007. Однако в этом документе неправильно сделана ссылка на последовательность 139 как представляющую собой Ct-875, когда это фактически последовательность 140 в этом документе. Для индивидуумов, подвергнутых воздействию Chlamydia trachomatis, было показано, что у них развивается некоторая степень естественного иммунитета к повторной инфекции, по меньшей мере в случае того же самого серовара (Katz, B.P. et al., Sex. Transm. Dis. 1987, 14:160-164), хотя степень защиты может зависеть от времени, прошедшего после предшествовавшей инфекции. Было также показано, что возраст играет важную роль в длительности инфекции с более короткой длительностью инфекции, вызываемой глазным сероваром Chlamydia trachomatis у лиц старшего возраста (Bailey, R. et al., Epidemiol.Infect. 1999, 123:479-486), что снова дает возможность предположить существование адаптивной иммунологической защиты. Было сделано предположение, что применение антибиотиков может фактически задерживать развитие естественного иммунитета к Chlamydia trachomatis (Brunham, R.C. et al., J. Nat. Rev.Immunol. 2005, 5:149-161). Главный белок наружной мембраны (Momp) составляет приблизительно 60% белковой массы бактериальной наружной мембраны, и считают, что он является важным при определении специфичности серотипа. Аминокислотная последовательность содержит четыре области, которые экспонированы снаружи и в которых происходит большинство изменений последовательности. В последовательностиMomp приблизительно 400 аминокислот, до 70 аминокислот различаются между Momp из различных сероваров. Особенно неожиданным является обнаружение того, что группировка сероваров на основе идентичности аминокислотной последовательности не соответствует группировке сероваров на основе болезненного состояния (т.е. глазное, генитальное или LGV) (Stothard, D.R. et al., Infect. Immun. 1998,66(8):3618-3625). Аналогично, сравнения идентичности нуклеотидной последовательности для генаompA, который кодирует Momp, не соответствуют болезненным состояниям (Meijer, A. et al., J. Bacteriol. 1999, 181(15):4469-4475; Lysen, M. et al., J. Clin. Microbiol. 2004, 42(4):1641-1647). Моноклональные антитела к Momp эффективны в культуре микроорганизмов и в некоторых животных моделях, однако защита может быть ограничена и обычно является серовар-специфичной. У мышей, иммунизированных подкожно или перорально моноклональным антиидиотипическим антителом к экзогликолипидному антигену, развивается защитный ответ против серовара С, несмотря на то, что сохраняется чувствительность к заражению сероваром K (Whittum-Hudson, J.A. et al., Nat. Med. 1996, 2(10):1116-1121). Такие белки, как один белок, раскрытый к настоящему моменту времени и показавший высокий уровень гомологии последовательности среди разных сероваров, а именно доступный белок-1 класса I(упоминаемый как Сар 1 или Ct-529), потенциально полезны для разработки вакцин, стимулирующих защиту против более чем одного серовара (Fling, S.P. et al., PNAS 200, 98(3):1160-1165). Однако в дополнение к требованию высоких уровней гомологии последовательности между сероварами, белки, используемые в вакцинах, должны также вызывать достаточный иммунный ответ.Ct-875, являются высоко антигенными и имеют высокую степень идентичности последовательности среди различных сероваров Chlamydia trachomatis. Особенно высокая консервативность имеет место в области предполагаемых эпитопов. В свете этого открытия существует возможность разработки вакцин против Chlamydia, которые являются эффективными против широкого диапазона сероваров Chlamydiatrachomatis (т.е. которые могут быть использованы для перекрестной защиты). Согласно этому аспекту настоящего изобретения предложено применение одного или более хламидийных белков, их иммуногенных фрагментов или кодирующих их полинуклеотидов, выбранных из перечня, состоящего из Ct-089, Ct-858 и Ct-875, и происходящих из первого серовара Chlamydia trachomatis,в изготовлении вакцины для лечения или предупреждения хламидийной инфекции, вызываемой вторым сероваром Chlamydia trachomatis. В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения или предупреждения хламидийной инфекции, вызываемой вторым сероваром Chlamydia trachomatis, включающий введение вакцины, содержащей один или более хламидийных белков, их иммуногенных фрагментов или кодирующих их полинуклеотидов, выбранных из перечня, состоящего из Ct-089, Ct-858 и Ct-875, и происходящих из первого серовара Chlamydia trachomatis. В первом воплощении изобретения вакцина для перекрестной защиты содержит один белок, его иммуногенный фрагмент или кодирующий их полинуклеотид, выбранный из перечня, состоящего изCt-089, Ct-858 и Ct-875. Вакцины, содержащие только один белок, его иммуногенный фрагмент или кодирующий их полинуклеотид, выбранный из перечня, состоящего из Ct-089, Ct-858 и Ct-875, будут соответственно дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный хламидийный антиген(например, 1 или 2 дополнительных антигена). Во втором воплощении изобретения вакцина для перекрестной защиты содержит два белка, их иммуногенных фрагмента или кодирующих их полинуклеотида, выбранных из перечня, состоящего изCt-089, Ct-858 и Ct-875, например Ct-089 и Ct-858; Ct-089 и Ct-875 или Ct-858 и Ct-875. В третьем воплощении изобретения вакцина для перекрестной защиты содержит Ct-089, Ct-858 иCt-875, их иммуногенные фрагменты или кодирующие их полинуклеотиды. Первый серовар Chlamydia trachomatis может представлять собой любой серовар Chlamydiatrachomatis. Второй серовар Chlamydia trachomatis может представлять собой любой серовар Chlamydiatrachomatis, за исключением первого серовара Chlamydia trachomatis. В первом воплощении изобретения первый серовар Chlamydia trachomatis выбран из перечня, состоящего из сероваров А, В, Ва, С, D, Da, E, F, G, H, I, Ia, J, Ja, K, L1, L2 и L3 Chlamydia trachomatis. Во втором воплощении изобретения первый серовар Chlamydia trachomatis выбран из "глазных" сероваров Chlamydia trachomatis (например, А, В, Ва и С). В другом воплощении изобретения первый серовар Chlamydia trachomatis выбран из окулогенитальных сероваров Chlamydia trachomatis (например, D, Da, E, F, G, Н, I, Ia, J, Ja и K). В еще одном воплощении изобретения первый серовар Chlamydia trachomatis выбран из LGV сероваров Chlamydia trachomatis (например, L1, L2 и L3). В первом воплощении изобретения второй серовар Chlamydia trachomatis выбран из перечня, состоящего из сероваров А, В, Ва, С, D, Da, E, F, G, H, I, Ia, J, Ja, K, L1, L2 и L3 Chlamydia trachomatis. Во втором воплощении изобретения второй серовар Chlamydia trachomatis выбран из "глазных" сероваров Chlamydia trachomatis (например, А, В, Ва и С). В другом воплощении изобретения второй серовар Chlamydia trachomatis выбран из окулогенитальных сероваров Chlamydia trachomatis (например, D, Da, E, F, G, H, I, Ia, J, Ja и K). В еще одном воплощении изобретения второй серовар Chlamydia trachomatis выбран из LGV сероваров Chlamydia trachomatis (например, L1, L2 и L3). Для того чтобы максимально увеличить объем действия способа и применения по настоящему изобретению, может быть желательно, чтобы первый серовар Chlamydia trachomatis был выбран так, чтобы имел место высокий уровень идентичности последовательности (например, по меньшей мере 90%, особенно 95%, в частности 98%, более конкретно 99%-ная идентичность последовательности) с большинством других сероваров Chlamydia trachomatis (например, по меньшей мере с 50%, особенно с 70%, в частности с 80%, более конкретно с 90% других сероваров Chlamydia trachomatis). Для того чтобы максимизировать практическое применение способа и применения по настоящему изобретению, может быть желательно, чтобы первый серовар Chlamydia trachomatis был выбран так, чтобы имел место высокий уровень идентичности последовательности (например, по меньшей мере 90%,особенно 95%, в частности 98%, более конкретно 99%-ная идентичность последовательности) с большинством (например, по меньшей мере с 50%, особенно с 70%, в частности с 80%, более конкретно с 90%) широко распространенных сероваров Chlamydia trachomatis (таких как широко распространенные"глазные" серовары, широко распространенные окулогенитальные серовары, широко распространенныеLGV серовары, или комбинация любых двух из этих групп сероваров, например широко распространенных "глазных" сероваров и окулогенитальных сероваров). Широко распространенные "глазные"- 11014527 серовары Chlamydia trachomatis включают А и В. Широко распространенные окулогенитальные серовары Chlamydia trachomatis включают D, E, F и I (Lan, J. et al., J. Clin. Microbiol. 1995, 33(12):3194-3197;Chlamydia trachomatis включают L2. В первом воплощении настоящего изобретения первый серовар Chlamydia trachomatis представляет собой серовар Е Chlamydia trachomatis. Во втором воплощении изобретения первый серовар Chlamydia trachomatis представляет собой серовар K Chlamydia trachomatis. В одном воплощении изобретения второй серовар Chlamydia trachomatis выбран из сероваров D, J иK Chlamydia trachomatis (например, серовар K или J Chlamydia trachomatis). В другом воплощении изобретения первый серовар Chlamydia trachomatis представляет собой серовар Е Chlamydia trachomatis, а второй серовар Chlamydia trachomatis выбран из сероваров D, J и KChlamydia trachomatis (например, серовар K или J Chlamydia trachomatis). В первом примере настоящего изобретения, где вакцина содержит Ct-089, его иммуногенный фрагмент или кодирующий их полинуклеотид, происходящие из серовара Е Chlamydia trachomatis, вакцину можно использовать в лечении или профилактике инфекций, вызываемых сероварами А, В, D, G, H, I, J,K или L2; в частности А, В, D, G, Н, I или K; особенно А или В. Во втором примере настоящего изобретения, где вакцина содержит Ct-858, его иммуногенный фрагмент или кодирующий их полинуклеотид, происходящие из серовара Е Chlamydia trachomatis, вакцину можно использовать в лечении или профилактике инфекций, вызываемых сероварами А, В, D, G, H,I, J, K или L2; в частности J или L2. В другом примере настоящего изобретения, где вакцина содержит Ct-875, его иммуногенный фрагмент или кодирующий их полинуклеотид, происходящие из серовара Е Chlamydia trachomatis, вакцину можно использовать в лечении или профилактике инфекций, вызываемых сероварами А, В, D, G, H, I, J,K или L2; в частности А, В, D, G, Н, I или K. Первый и второй серовары Chlamydia trachomatis могут быть ассоциированы с одним и тем же болезненным состоянием (например, они оба могут представлять собой "глазные" серовары или оба могут представлять собой окулогенитальные серовары) или первый и второй серовары Chlamydia trachomatis могут быть ассоциированы с разными болезненными состояниями (например, первый серовар Chlamydiatrachomatis может представлять собой окулогенитальный серовар, а второй серовар Chlamydia trachomatis может представлять собой "глазной" серовар, или наоборот). В том случае, когда вакцина для применения в настоящем изобретении содержит более чем один белок, его иммуногенный фрагмент или кодирующий их полинуклеотид, выбранный из перечня, состоящего из Ct-089, Ct-858 и Ct-875, следует отметить, что каждый белок, его иммуногенный фрагмент или кодирующий их полинуклеотид может возможно происходить из различных первых сероваров Chlamydiatrachomatis, которые могут быть выбраны независимо. Вакцины для перекрестной защиты для применения по настоящему изобретению могут также содержать дополнительные хламидийные антигены (т.е. антигены, отличные от белков Ct-089, Ct-858 иCt-875, их иммуногенных фрагментов или кодирующих их полинуклеотидов), например 1, 2, 3, 4 или 5 других антигенов (выбранных, например, из Momp, Ct-622, PmpGpd и PmpDpd). Дополнительные антигены в вакцинах для перекрестной защиты также могут включать белки Ct-089, Ct-858 и Ct-875, их иммуногенные фрагменты или кодирующие их полинуклеотиды, которые происходят из второго серовара. В дополнительном воплощении изобретения полипептиды и полинуклеотиды Chlamydia, которые могут быть использованы согласно изобретению, включают полипептиды и полинуклеотиды из сероваров, ассоциированных с трахомой, таких как серовары А, В, Ва и С. Таким образом, в композициях по изобретению можно использовать полипептидные последовательности, приведенные выше, или их иммуногенные фрагменты, или кодирующие их полинуклеотидные последовательности, которые могут представлять собой, например, полинуклеотидные последовательности, приведенные выше, или их фрагменты, кодирующие иммуногенные фрагменты полипептидов. В конкретных воплощениях:(1) компоненты Ct-089 и Ct-858 композиции по изобретению могут представлять собой полипептид,имеющий по меньшей мере 95%-ную гомологию с полипептидом SEQ ID NO:16 (серовар Е С.trachomatis) или его иммуногенным фрагментом, или полипептид, имеющий по меньшей мере 95%ную гомологию с полипептидом SEQ ID NO:6 (серовар Е С.trachomatis), или его иммуногенным фрагментом соответственно, или кодирующими их полинуклеотидами. Альтернативно, компоненты Ct-089 иCt-858 композиции могут обнаруживать по меньшей мере 95%-ную гомологию с любой из полипептидных и полинуклеотидных последовательностей Ct-089 и Ct-858 из других сероваров С.Trachomatis, которые описаны в данном изобретении;(2) компонент Ct-875 может представлять собой полипептид по меньшей мере с 95%-ной гомологией с полипептидом SEQ ID NO:8 (серовар Е С.trachomatis), или его иммуногенным фрагментом, или кодирующими их полинуклеотидами. Альтернативно, компонент Ct-875 композиции может демонстрировать по меньшей мере 95%-ную гомологию с любой из полипептидных и полинуклеотидных последова- 12014527 тельностей Ct-875 из других сероваров C.trachomatis, которые описаны в данном изобретении;(3) компонент PmpDpd может представлять собой полипептид по меньшей мере с 95%-ной гомологией с полипептидом SEQ ID NO:14 (серовар LII С.trachomatis) или его иммуногенным фрагментом либо кодирующими их полинуклеотидами;(4) компонент PmpGpd может представлять собой полипептид по меньшей мере с 95%-ной гомологией с полипептидом SEQ ID NO:12 (серовар LII С.trachomatis) или его иммуногенным фрагментом либо кодирующими их полинуклеотидами;(5) компонент Momp может представлять собой полипептид по меньшей мере с 95%-ной гомологией с полипептидом SEQ ID NO:4 (серовар F С.trachomatis) или его иммуногенным фрагментом либо кодирующими их полинуклеотидами;(6) компонент Swib может представлять собой полипептид по меньшей мере с 95%-ной гомологией с полипептидом SEQ ID NO:8 (серовар LII С.trachomatis) или его иммуногенным фрагментом либо кодирующими их полинуклеотидами. Антигены, описанные в данном изобретении, включают полиморфные варианты и консервативно модифицированные вариации наряду с межштаммовыми или межвидовыми гомологами Chlamydia. Кроме того, антигены, описанные в данном изобретении, включают подпоследовательности или укороченные последовательности. Антигены, описанные в данном изобретении, могут быть представлены в форме слитых белков. Слитые белки могут также содержать дополнительные полипептиды, возможно гетерологичные пептиды из Chlamydia или других источников. Эти антигены могут быть модифицированы, например, посредством добавления линкерных пептидных последовательностей, как описано ниже. Эти линкерные пептиды могут быть встроены между одним или несколькими полипептидами, которые образуют каждый из слитых белков. Антигены, описанные в данном изобретении, могут быть также представлены в форме химических конъюгатов. Кроме того, изобретение относится к иммуногенным композициям и вакцинным композициям, содержащим композиции хламидийных антигенов по изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем и, возможно, иммуностимулятором. Композиции по настоящему изобретению могут также содержать другие компоненты, предназначенные для увеличения антигенности антигенов или для улучшения этих антигенов в других аспектах, например выделения этих антигенов посредством добавления фрагмента из остатков гистидина к одному концу антигена. Добавление цепи из остатков гистидина к одному концу антигена также может улучшить экспрессию. Композиции по изобретению могут содержать дополнительные копии антигенов или дополнительные полипептиды или полинуклеотиды из видовChlamydia. Композиции по изобретению также могут содержать дополнительные гетерологичные полипептиды или полинуклеотиды из других, нехламидийных, источников. Например, композиции по изобретению могут включать полипептиды или кодирующие полипептиды нуклеиновые кислоты, где полипептид усиливает экспрессию антигена, например NS1, белка вируса гриппа или его иммуногенной части(см., например, WO 99/40188 и WO 93/04175). Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть сконструированы на основе предпочтения кодонов у выбранных видов, например у человека. Композиции по изобретению могут дополнительно содержать адъюванты, например MPL, 3D-MPL,IFA, ENHANZYN (Detox), QS21, CWS, TDM, AGP, CPG, Leif, сапонин и миметики сапонина, и их производные. Альтернативно или дополнительно, композиции по изобретению могут содержать в качестве адъюванта BCG или Pvac. Определения"Слитый полипептид" или "слитый белок" относится к белку, содержащему по меньшей мере два хламидийных полипептида (которые могут быть одинаковыми или могут быть разными), связанных ковалентно, либо непосредственно, либо через аминокислотный линкер. В полипептидах, образующих слитый белок, С-конец типично связан с N-концом, хотя С-конец в них также может быть связан с С-концом, N-конец с N-концом или N-конец с С-концом. Полипептиды слитого белка могут располагаться в любом порядке. Этот термин также относится к консервативно модифицированным вариантам,полиморфным вариантам, аллелям, мутантам, подпоследовательностям, межвидовым гомологам и иммуногенным фрагментам антигенов, образующих слитый белок. Слитые белки по изобретению могут также содержать дополнительные копии антигенного компонента или его иммуногенного фрагмента. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок по изобретению, гибридизуется в жестких условиях по меньшей мере с двумя нуклеотидными последовательностями, каждая из которых кодирует антигенный полипептид, выбранный из группы, состоящей из Ct-681 (Momp) или его иммуногенного фрагмента; Ct-871 (PmpG) или его иммуногенного фрагмента; Ct-812 (PmpD) или его иммуногенного фрагмента; Ct-089 или его иммуногенного фрагмента; Ct-858 или его иммуногенного фрагмента;Ct-875 или его иммуногенного фрагмента; Ct-460 (swib) или его иммуногенного фрагмента и Ct-622 или его иммуногенного фрагмента. Вследствие этого полинуклеотидные последовательности, кодирующие отдельные антигены слитого полипептида, включают консервативно модифицированные варианты, полиморфные варианты, аллели, мутанты, подпоследовательности, иммуногенные фрагменты и межвидо- 13014527 вые гомологи Ct-681 (Momp), Ct-871 (PmpG), Ct-812 (PmpD), Ct-089, Ct-858, Ct-875, Ct-460 (swib) иCt-622. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие отдельные полипептиды слитого белка,могут располагаться в любом порядке. В некоторых воплощениях отдельные полипептиды слитого белка расположены в порядке (от N- к С-концу) от большого к малому. Большие антигены имеют размер приблизительно от 30 до 150 кД,средние антигены имеют размер приблизительно от 10 до 30 кД, и малые антигены имеют размер приблизительно менее 10 кД. Последовательность, кодирующая отдельный полипептид, может быть такой маленькой, как, например, иммуногенный фрагмент, такой как отдельный CTL-эпитоп, кодирующий приблизительно от 8 до 9 аминокислот, или, например, HTL- или В-клеточный эпитоп. Фрагмент может включать также множественные эпитопы. Слитый полипептид по изобретению специфически связывается с антителами, направленными по меньшей мере против двух антигенных полипептидов, выбранных из Ct-681 (Momp) или его иммуногенного фрагмента; Ct-871 (PmpG) или его иммуногенного фрагмента; Ct-812 (PmpD) или его иммуногенного фрагмента; Ct-089 или его иммуногенного фрагмента; Ct-858 или его иммуногенного фрагмента;Ct-875 или его иммуногенного фрагмента; Ct-460 (swib) или его иммуногенного фрагмента и Ct-622 или его иммуногенного фрагмента. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Возможно, слитый полипептид специфически связывается с антителами, направленными против слитого сочетания антигенов, которые не связываются с антигенами в отдельности, т.е. когда они не являются частью слитого белка. Слитые полипептиды возможно содержат дополнительные полипептиды, например три,четыре, пять, шесть или более полипептидов, вплоть до приблизительно 25 полипептидов, возможно гетерологичных полипептидов или повторяющихся гомологичных полипептидов, слитых по меньшей мере с двумя антигенами. Дополнительные полипептиды слитого белка возможно происходят из Chlamydia, а также из других источников, таких как другие бактерии, вирусы или беспозвоночные, позвоночные или млекопитающие. Отдельные полипептиды слитого белка могут располагаться в любом порядке. Как описано в данном изобретении, слитый белок может быть также связан с другими молекулами, включая дополнительные полипептиды. Композиции по изобретению могут также содержать дополнительные полипептиды, которые не связаны со слитыми белками по изобретению. Эти дополнительные полипептиды могут быть гетерологичными или гомологичными полипептидами. Термин "слитый" относится к ковалентной связи между двумя полипептидами в слитом белке. Полипептиды типично соединены посредством пептидной связи либо непосредственно друг с другом, либо через аминокислотный линкер. Возможно, пептиды могут быть соединены посредством непептидных ковалентных связей, известных специалистам в данной области."FL" относится к полноразмерному полипептиду, т.е. к полипептиду, который имеет такую же длину, что и полипептид дикого типа. Термин "его иммуногенный фрагмент" относится к полипептиду, содержащему эпитоп, который распознается цитотоксическими Т-лимфоцитами, хелперными Т-лимфоцитами или В-клетками. Способы определения эпитопных областей последовательности описаны в другом месте данного изобретения. Соответственно иммуногенный фрагмент будет содержать по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 50%, особенно предпочтительно по меньшей мере 75% и в частности по меньшей мере 90% (например, 95 или 98%) аминокислот контрольной последовательности. Иммуногенный фрагмент будет соответственно содержать все области эпитопов контрольной последовательности. Адъювант относится к компонентам в вакцине или терапевтической композиции, которые увеличивают специфический иммунный ответ на антиген (см., например, Edelman, AIDS Res. Hum. Retroviruses 8:1409-1411 (1992. Адъюванты индуцируют иммунные ответы Th1- и Th2-типа. Цитокины Th1-типа(например, IFN-, IL-2 и IL-12) имеют тенденцию индуцировать клеточно-опосредованный иммунный ответ на введенный антиген, тогда как цитокины Th2-типа (например, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и TNF-) имеют тенденцию индуцировать гуморальные иммунные ответы. Любой из множества адъювантов может быть использован в вакцинах по данному изобретению для усиления иммунного ответа. Некоторые адъюванты содержат вещество, предназначенное для защиты антигена от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и специфический или неспецифический стимулятор иммунных ответов, такой как липид A, Bortadella pertussis или Mycobacterium tuberculosis. Подходящие адъюванты коммерчески доступны и включают в себя, например, неполный адъювант Фрейнда и полный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories) и адъювант 65 Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.). Другие подходящие адъюванты включают в себя квасцы, биоразлагаемые микросферы, монофосфориллипид A, quil A, SBAS1c, SBAS2 (Ling et al., 1997, Vaccine 15:1562-1567), SBAS7, Al(OH)3 иCpG-олигонуклеотид (WO 96/02555). Подходящие адъюванты для применения в изобретении обсуждены более детально ниже."Нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам либо в одно-, либо в двухцепочечной форме. Указанный термин охватывает нуклеиновые кислоты,содержащие аналоги известных нуклеотидов или модифицированные остатки или связи основной цепи,которые являются синтетическими, природными и не встречающимися в природе, которые имеют похо- 14014527 жие связывающие свойства, что и контрольная нуклеиновая кислота, и подвергаются метаболизму схожим с контрольными нуклеотидами путем. Примеры таких аналогов включают в себя, без ограничения,фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, пептид-нуклеиновые кислоты (PNA). Если не указано иначе, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также, безусловно,охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также полностью указанную последовательность. В частности,замены вырожденных кодонов могут быть достигнуты путем создания последовательностей, в которых третье положение одного или более выбранных (или всех) кодонов замещено остатками смешанного основания и/или дезоксиинозина (Batzer et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994. Термин "нуклеиновая кислота" используют взаимозаменяемо с терминами ген, кДНК, мРНК, олигонуклеотид и полинуклеотид. Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют в данном описании взаимозаменяемо для указания на полимер из аминокислотных остатков. Указанные термины также относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к природным аминокислотным полимерам и не встречающемуся в природе аминокислотному полимеру. Термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые функционируют схожим с природными аминокислотами образом. Природными аминокислотами являются те, которые кодируются генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые были позднее модифицированы, например гидроксипролин,-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Термин "аминокислотные аналоги" относится к соединениям, имеющим такую же основную структуру, что и природная аминокислота, т.е. -углерод, связанный с водородом, карбоксильной группой,аминогруппой и R-группой, например гомосерину, норлейцину, метионин-сульфоксиду, метионинметилсульфонию. Такие аналоги содержат модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные скелеты, но сохраняют такую же основную химическую структуру, что и природная аминокислота. Термин "аминокислотные миметики" относится к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличную от обычной химической структуры аминокислоты, но которые функционируют схожим с природной аминокислотой образом. Аминокислоты в данном описании могут быть указаны либо с помощью их широко известных трехбуквенных символов, либо с помощью однобуквенных символов, рекомендованных IUPAC-IUB(Комиссией по биохимической номенклатуре). Аналогично, нуклеотиды могут быть указаны с помощью их широко распространенных однобуквенных кодов."Консервативно модифицированные варианты" относятся к последовательностям и аминокислот, и нуклеиновых кислот. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновых кислот, то консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или где нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность по существу к идентичным последовательностям. Изза вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой заданный белок. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU, все, кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в любом положении, где аланин определяется кодоном, этот кодон может быть заменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой "молчащие изменения", которые являются одним из видов консервативно модифицированных изменений. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в данном описании, которая кодирует полипептид, также описывает любое возможное "молчащее" изменение нуклеиновой кислоты. Квалифицированный специалист признает, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (кроме AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно каждое "молчащее" изменение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, подразумевается в каждой описанной последовательности. Полинуклеотид по изобретению может содержать некоторое количество "молчащих" изменений(могут быть изменены, например, 1-5, в частности 1 или 2 и особенно 1 кодон(ы по сравнению с контрольной последовательностью. Полинуклеотид по изобретению может содержать некоторое количество не "молчащих" консервативных изменений (могут быть изменены, например, 1-5, в частности 1 или 2 и особенно 1 кодон(ы по сравнению с контрольной последовательностью. Квалифицированные специалисты в данной области признают, что конкретная полинуклеотидная последовательность может содержать как "молчащие", так и не "молчащие" консервативные изменения.- 15014527 Что касается аминокислотных последовательностей, то квалифицированный специалист признает,что отдельные замены, делеции или вставки в последовательность нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или исключают одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, представляют собой "консервативно модифицированный вариант", где изменение приводит к замещению аминокислоты химически схожей аминокислотой. Таблицы консервативных замен, обеспечивающие функционально схожие аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты представляют собой дополнение к полиморфным вариантам, межвидовым гомологам и аллелям по изобретению и не исключают их. Полипептид по изобретению может содержать некоторое количество консервативных изменений(могут быть изменены, например, 1-5, в частности 1 или 2 и особенно 1 аминокислотный остаток(остатки по сравнению с контрольной последовательностью. Обычно такие консервативные замены будут находиться в пределах одной из аминокислотных группировок, описанных ниже, хотя в некоторых случаях возможны другие замены, по существу, без воздействия на иммуногенные свойства антигена. Ниже приведены восемь групп, каждая из которых содержит аминокислоты, которые представляют собой консервативные замены друг для друга: 1) алании (А), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серин (S), треонин (Т) и 8) цистеин (С), метионин (М)(см., например, Creighton, Proteins (1984. Подходящие аминокислотные замены ограничены неэпитопными областями антигена. Варианты полипептидной последовательности могут также включать те, в которые встроены дополнительные аминокислоты по сравнению с контрольной последовательностью, например такие вставки могут иметь место в 1 или 2 положениях (предпочтительно в 1) и могут содержать вставку из 50 или менее аминокислот (например, 20 или менее, в частности 10 или менее, особенно 5 или менее) в каждом положении. Предпочтительно такие вставки не имеют места в области эпитопа и, следовательно, не оказывают существенного влияния на иммуногенные свойства антигена. Один пример вставок включает в себя короткий участок из остатков гистидина (например, 1-6 остатков) для облегчения экспрессии и/или очистки интересующего антигена. Другие варианты полипептидных последовательностей включают в себя те, в которых аминокислоты были делетированы по сравнению с контрольной последовательностью, например такие делеции могут иметь место в 1 или 2 положениях (предпочтительно в 1) и могут, например, включать делецию 50 или менее аминокислот (например, 20 или менее, в частности 10 или менее, особенно 5 или менее) в каждом положении. Предпочтительно такие вставки не имеют места в области эпитопа и, следовательно,не оказывают существенного влияния на иммуногенные свойства антигена. Способы определения эпитопных областей антигена описаны и приведены в качестве примера в другом месте данной заявки. Термин "гетерологичный" при использовании со ссылкой на участки нуклеиновой кислоты указывает, что нуклеиновая кислота содержит две или более подпоследовательности, которые не обнаружены в такой же взаимосвязи друг с другом в природе. Например, нуклеиновую кислоту типично получают рекомбинантным способом, располагая две или более последовательностей неродственных генов для создания новой функциональной нуклеиновой кислоты, например, промотора из одного источника и кодирующей области из другого источника. Аналогично, гетерологичный белок указывает на то, что белок содержит две или более подпоследовательности, которые не обнаружены в такой же взаимосвязи друг с другом в природе (например, слитый белок). Фраза "селективно (или специфически) гибридизуется с" относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях гибридизации, где эта последовательность представлена в сложной смеси (например, общая клеточная или библиотека ДНК или РНК). Фраза "жесткие условия гибридизации" относится к условиям, в которых образец гибридизуется,типично в сложной смеси нуклеиновых кислот, со своей последовательностью-мишенью, но не с другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и будут различаться в разных случаях. Более длинные последовательности гибридизуются только при высоких температурах. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen, Techniques inBiochemistry and Molecular Biology -Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and strategy of nucleic acid assays" (1993). Обычно жесткие условия подбирают так, чтобы температура была примерно на 5-10 С ниже термической точки плавления (Tm) конкретной последовательности- 16014527 при определенной ионной силе рН. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе,рН и нуклеиновой концентрации), при которой 50% образцов, комплементарных мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в состоянии равновесия (поскольку последовательности-мишени представлены в избытке, при Tm 50% проб находятся в состоянии равновесия). Жесткими условиями будут те, при которых концентрация соли составляет менее чем примерно 1,0 М ионов натрия, типично концентрация ионов натрия (или других солей) составляет от примерно 0,01 до 1,0 М при рН от 7,0 до 8,3, а температура составляет по меньшей мере примерно 30 С для коротких образцов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60 С для длинных образцов (например, более 50 нуклеотидов). Жестких условий можно также достичь путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительным сигналом является по меньшей мере двукратная фоновая, возможно 10-кратная фоновая гибридизация. Примерные жесткие условия гибридизации могут представлять собой следующее: 50% формамида, 5 SSC и 1% SDS, инкубация при 42 С или 5 SSC, 1% SDS, инкубация при 65 С с промывкой в 0,2 SSC и 0,1% SDS при 65C. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в жестких условиях, все же остаются по существу идентичными, если полипептиды, которые они кодируют, являются по существу идентичными. Это имеет место, например, когда копию нуклеиновой кислоты создают с использованием максимальной вырожденности кодонов, допустимой генетическим кодом. В таких случаях нуклеиновые кислоты типично гибридизуются в умеренно жестких условиях гибридизации. Примерные "умеренно жесткие условия гибридизации" включают гибридизацию в буфере, содержащем 40% формамида, 1 МNaCl, 1% SDS, при 37 С и промывку в 1 SSC при 45 С. Положительной является по меньшей мере двукратная фоновая гибридизация. Квалифицированные специалисты охотно признают, что можно использовать альтернативные условия гибридизации и промывки для обеспечения условий схожей жесткости."Антитело" относится к полипептиду, содержащему область рамки из гена иммуноглобулина, или его фрагментам, которые специфически связывают и распознают антиген. Распознаваемые гены иммуноглобулинов включают в себя гены константных областей каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также бесчисленные гены вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют либо как каппа, либо как лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Примерная структурная единица иммуноглобулина (антитела) содержит тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну "легкую"(примерно 25 кД) и одну "тяжелую" цепь (примерно 50-70 кД). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область от примерно 100 до 110 и более аминокислот, ответственных, главным образом, за распознавание антигена. Термины "вариабельная легкая цепь (VL)" и "вариабельная тяжелая цепь (VH)" относятся соответственно к этим легким и тяжелым цепям. Антитела существуют, например, в виде интактных иммуноглобулинов или в виде некоторого количества хорошо изученных фрагментов, полученных путем расщепления различными пептидазами. Таким образом, пепсин, например, расщепляет антитело ниже дисульфидных связей в шарнирном участке с получением F(ab)'2, представляющего собой димер Fab, который сам по себе является легкой цепью, соединенной с VH-CH1 посредством дисульфидной связи. F(ab)'2 может быть восстановлен в мягких условиях с разрушением дисульфидной связи в шарнирном участке, превращением таким образом димера(см. Fundamental Immunology (Paul ed., 3rd ed. 1993). Несмотря на то что различные фрагменты антител определены в терминах расщепления интактного антитела, квалифицированному специалисту следует понимать, что такие фрагменты могут быть синтезированы de novo либо химически, либо с использованием методологии рекомбинантной ДНК. Таким образом, термин "антитело", используемый в данном описании, также включает в себя фрагменты антитела, либо полученные модификацией целых антител,либо синтезированные de novo с использованием методологии рекомбинантной ДНК (например, одиночная цепь Fv), либо идентифицированные с использованием библиотек фагового дисплея (см., например,McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990. Для получения моноклональных или поликлональных антител может быть использован любой метод, известный в данной области (см., например, KohlerMilstein, Nature, 256:495-497 (1975); Kozbor etal., Immunology Today, 4:72 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p. 77-96 (1985. Методы получения одноцепочечных антител (патент США 4946778) могут быть адаптированы для получения антител к полипептидам по данному изобретению. Кроме того, для экспрессии гуманизированных антител могут быть использованы трансгенные мыши или другие организмы, такие как другие млекопитающие. Альтернативно, для идентификации антител и гетеромерных фрагментов Fab, специфически связывающихся с выбранными антигенами, можно использовать технологию фагового дисплея- 17014527 Фраза "специфически (или селективно) связывается" с антителом или "специфически (или селективно) иммунореактивный по отношению к" при ссылке на белок или пептид относится к реакции связывания, которая определяет присутствие белка в гетерогенной популяции белков или других биопрепаратах. Таким образом, в определенных условиях иммунологического анализа описанные антитела связываются с конкретным белком по меньшей мере в два раза активнее по сравнению с фоном и, по существу, не связываются со значительным количеством других белков, представленных в образце. Для специфического связывания с антителом в таких условиях может требоваться антитело, которое выбирают на основании его специфичности к конкретному белку. Например, поликлональные антитела, направленные против слитых белков, могут быть выбраны так, чтобы получить только те поликлональные антитела,которые являются специфически иммунореактивными по отношению к слитому белку и не являются специфически иммунореактивными по отношению к индивидуальным компонентам слитых белков. Этот отбор может осуществляться посредством исключения антител, перекрестно взаимодействующих с отдельными антигенами. Для отбора антител, специфически иммунореактивных по отношению к конкретному белку, можно использовать множество форматов иммунологического анализа. Например, для отбора антител, специфически иммунореактивных по отношению к белку, рутинно используют твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) (см., например, HarlowLane, Antibodies, A Laboratory Manual(1988) для описания форматов иммунологического анализа и условий, которые можно использовать для определения специфической иммунореактивности). Типично, специфическое или селективное взаимодействие будет по меньшей мере в два раза выше по сравнению с фоновым сигналом или шумом и более типично более чем в 10-100 раз выше по сравнению с фоном. Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует отдельный антиген или его часть) или могут содержать вариант такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок так, чтобы биологическая активность кодируемого слитого полипептида не уменьшалась относительно слитого полипептида, содержащего нативные антигены. Варианты предпочтительно демонстрируют по меньшей мере примерно 70%-ную идентичность, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80%-ную идентичность и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90%ную идентичность с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует нативный полипептид или его часть. Термины "идентичный" или "процент идентичности" в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые представляют собой одну и ту же последовательность или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. 70%-ную идентичность,возможно 75, 80, 85, 90 или 95% (например, 98%) идентичность с определенной областью) при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в пределах окна сравнения или заданной области,как определяют с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или ручного выравнивания и визуального контроля. Такие последовательности тогда называют "по существу идентичными". Это определение также относится к комплементу тестируемой последовательности. Возможно, идентичность имеет место в области, которая имеет длину по меньшей мере от примерно 25 до примерно 50 аминокислот или нуклеотидов, или возможно в области, которая имеет длину 75-100 аминокислот или нуклеотидов. Для сравнения последовательностей типично одна последовательность служит в качестве контрольной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемые и контрольную последовательности вводят в компьютер, обозначают координаты подпоследовательности, если необходимо, и определяют параметры программы алгоритма последовательности. Можно использовать параметры программы по умолчанию или могут быть заданы альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно контрольной последовательности на основании параметров данной программы."Окно сравнения", используемое в данном описании, включает ссылку на сегмент любого из некоторого числа соседних положений, выбранных из группы, состоящей из 25-500, обычно от примерно 50 до примерно 200, более стандартно от примерно 100 до примерно 150, в котором последовательность можно сравнить с контрольной последовательностью того же количества соседних положений после того, как две последовательности оптимально выровнены. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть осуществлено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по SmithWatermann, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания поNeedlemanWunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью способа поиска сходства по PearsonLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988), с помощью компьютеризированных воплощений этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics ComputerGroup, 575 Science Dr., Madison, WI) или с помощью ручного выравнивания и визуального контроля (см.,например, Current Protocols in Molecular Biology (приложение Ausubel et al., eds. 1995.- 18014527 Одним примером полезного алгоритма является PILEUP. PILEUP осуществляет выравнивание множества последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессивных парных выравниваний для демонстрации взаимосвязи и процента идентичности последовательностей. Он также рисует дерево или дендрограмму, демонстрирующую кластерные взаимосвязи,используемые для осуществления выравнивания. PILEUP использует упрощение способа прогрессивного выравнивания по FengDoolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). Используемый способ похож на способ, описанный HigginsSharp, CABIOS 5:151-153 (1989). Программа может выравнивать до 300 последовательностей с максимальной длиной 5000 нуклеотидов или аминокислот каждая. Процедура множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее схожих последовательностей с созданием кластера из двух выровненных последовательностей. Этот кластер затем выравнивают со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей выравнивают с помощью простого расширения попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Конечное выравнивание достигается посредством серии прогрессивных попарных выравниваний. Программу запускают посредством обозначения специфических последовательностей и их аминокислотных или нуклеотидных координат для областей сравнения последовательностей и посредством определения параметров программы. При использованииPILEUP контрольную последовательность сравнивают с другими тестируемыми последовательностями для определения соотношения процента идентичности последовательности с использованием следующих параметров: масса интервала по умолчанию (3,00); масса длины интервала по умолчанию (0,10) и взвешенные концевые интервалы. PILEUP может быть получен из пакета программного обеспечения для анализа GCG последовательностей, например версия 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395(1984). Другим примером алгоритма, подходящего для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные соответственно в Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) и Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410(1990). Программное обеспечение для осуществления BLAST-анализа имеется в открытом доступе благодаря Национальному центру биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм включает сначала идентификацию пар последовательностей с высоким количеством меток (HSP) посредством идентификации коротких кодовых групп длины W запрашиваемой последовательности, которые либо соответствуют, либо удовлетворяют некоторым пороговым значениям Т с положительным значением при выравнивании с кодовой группой такой же длины в последовательности базы данных. Т относится к порогу значения соседней кодовой группы(Altschul et al., см. выше). Эта инициальная соседняя кодовая группа совпадает по действию с затравкой для инициации поиска с целью обнаружения более длинных HSP, содержащих ее. Совпадения кодовой группы распространены в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько далеко, насколько может быть увеличено совокупное значение выравнивания. Для нуклеотидных последовательностей совокупное значение рассчитывают с использованием параметров М (положительное значение за пару совпадающих остатков; всегда 0) и N (отрицательное значение за несовпадающие остатки; всегда 0). Для аминокислотных последовательностей для расчета совокупного значения используют матрицу значений. Распространение совпадения кодовой группы в каждом направлении останавливается, когда совокупное значение выравнивания резко снижается на число X от его максимального полученного значения; совокупное значение опускается до нуля или ниже из-за накопления одного или более выравниваний остатков с отрицательным значением или достигнут конец любой последовательности. ПараметрыBLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве параметров по умолчанию длину кодовой группы (W), равную 11, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обоих рядов. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует в качестве параметров по умолчанию длину кодовой группы, равную 3, и ожидание (Е), равное 10, а матрица значений BLOSUM62(см. HenikoffHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1989 использует выравнивания (В), равные 50, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обоих рядов. Алгоритм BLAST также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, KarlinAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993. Одним критерием сходства, обеспечиваемым алгоритмом BLAST, является вероятность наименьшей суммы(P(N, которая предоставляет указание на вероятность, с которой может иметь место случайное совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновую кислоту считают схожей с контрольной последовательностью, если вероятность наименьшей суммы при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с контрольной нуклеиновой кислотой составляет менее примерно 0,2, более предпочтительно менее примерно 0,01 и наиболее предпочтительно менее примерно 0,001.- 19014527 Полинуклеотидные композиции Используемые в данном описании термины "сегмент ДНК" и "полинуклеотид" относятся к молекуле ДНК, которую выделили из общей геномной ДНК конкретного вида. Следовательно, сегмент ДНК,кодирующий полипептид, относится к сегменту ДНК, который содержит одну или более кодирующих последовательностей, однако, по существу, выделен из или очищен от общей геномной ДНК вида, из которого получен сегмент ДНК. В термины "сегмент ДНК" и "полинуклеотид" включены сегменты ДНК и меньшие фрагменты таких сегментов, а также рекомбинантные векторы, включая, например, плазмиды, космиды, фагмиды, фаг, вирусы и т.п. Как будет понятно квалифицированным специалистам в данной области, сегменты ДНК по данному изобретению могут включать геномные последовательности, внегеномные последовательности и последовательности, кодируемые в плазмидах и меньшие генетически сконструированные сегменты, которые экспрессируют или могут быть адаптированы для экспрессии белков, полипептидов, пептидов и т.п. Такие сегменты могут быть выделены из естественных источников или модифицированы синтетически человеком. Термины "выделенный", "очищенный" или "биологически чистый", таким образом, относятся к материалу, по существу или существенно свободного от компонентов, которые в норме сопровождают его,как обнаружено в его нативном состоянии. Конечно, это относится к первоначально выделенному сегменту ДНК и не исключает другие выделенные белки, гены или кодирующие области, добавленные к композиции позднее человеком. Чистоту и гомогенность типично определяют с использованием методов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. Белок, который является преобладающим видом, представленным в композиции,по существу, очищен. Выделенную нуклеиновую кислоту отделяют от других открытых рамок считывания, которые фланкируют ген и кодируют другие белки, а не данный ген. Как признают квалифицированные специалисты в данной области, полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК (геномные, кДНК или синтетические) или РНК. Молекулы РНК включают в себя молекулы гяРНК (гетерогенная ядерная РНК), которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК взаимно-однозначным образом, и молекулы мРНК (матричная, или информационная РНК), которые не содержат интронов. В полинуклеотиде по настоящему изобретению могут присутствовать, но не обязательно, дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности и полинуклеотид может быть связан, но не обязательно, с другими молекулами и/или подложками. Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, кодирующую хламидийный антиген или его часть) или могут содержать вариант или биологический или антигенный функциональный эквивалент такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок, как дополнительно описано ниже, предпочтительно так, чтобы иммуногенность кодируемого полипептида не уменьшалась относительно нативного опухолевого белка. Влияние на иммуногенность кодируемого полипептида можно оценить в общем, как описано в данном изобретении. Термин "варианты" также охватывает гомологичные гены ксеногенного происхождения. В дополнительных воплощениях в настоящем изобретении предложены выделенные полинуклеотиды и полипептиды, содержащие различные длины смежных интервалов последовательности, идентичной или комплементарной одной или более последовательностям, раскрытым в данном описании. Например, согласно этому изобретению предложены полинуклеотиды, содержащие по меньшей мере примерно 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 или 1000 или более соседних нуклеотидов одной или более последовательностей, раскрытых в данном описании, а также среди них полинуклеотиды промежуточной длины. Легко понять, что "промежуточные длины" в этом контексте означают любую длину между приведенными значениями, такую как 16, 17, 18, 19 и т.д.; 21, 22, 23 и т.д.; 30, 31, 32 и т.д.; 50, 51,52, 53 и т.д.; 100, 101, 102, 103 и т.д.; 150, 151, 152, 153 и т.д.; включая все целые числа от 200 до 500; от 500 до 1000 и т.п. Полинуклеотиды по настоящему изобретению или их фрагменты, независимо от длины самой кодирующей последовательности, можно комбинировать с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты для рестриктаз, сайты множественного клонирования, другие кодирующие сегменты и т.п., так что их общая длина может значительно варьировать. Поэтому предполагают, что можно использовать фрагмент нуклеиновой кислоты практически любой длины с общей длиной, предпочтительно ограничиваемой легкостью получения и применения в предполагаемом протоколе рекомбинантной ДНК. Например, предполагают, что иллюстративные сегменты ДНК с общими длинами примерно 10000, примерно 5000, примерно 3000, примерно 2000, примерно 1000, примерно 500, примерно 200, примерно 100, примерно 50 пар оснований и т.п. (включая все промежуточные длины) являются полезными во многих воплощениях этого изобретения.- 20014527 Более того, средним специалистам в данной области следует принимать во внимание, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, как описано в данном изобретении. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют минимальную гомологию с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее полинуклеотиды, которые отличаются благодаря различиям в применении кодонов, специально рассмотрены в настоящем изобретении, например полинуклеотиды, которые оптимизированы для селекции кодонов человека и/или приматов. Кроме того, аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, предложенные в данном описании, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменены в результате одной или более мутаций,таких как делеции, вставки и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение с последовательностью из базы данных). Идентификация и определение характеристики полинуклеотида Полинуклеотиды можно идентифицировать, получать и/или подвергать манипуляциям с использованием любой из множества общепринятых методов. Например, полинуклеотид может быть идентифицирован, как описано более детально ниже, посредством скрининга микрочипа кДНК. Такие скрининги можно осуществлять, например, с использованием микрочипов Synteni (Palo Alto, CA) согласно инструкциям изготовителя (и, по существу, как описано у Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619(1996) и Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:2150-2155 (1997. Альтернативно, полинуклеотиды можно амплифицировать с кДНК, полученной из клеток, экспрессирующих белки, описанные в данном изобретении, таких как клетки C.trachomatis. Такие полинуклеотиды могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). При таком подходе могут быть сконструированы последовательность-специфические праймеры на основе последовательности, предложенной в данном описании, и эти праймеры могут быть приобретены или синтезированы. Амплифицированную часть полинуклеотида по настоящему изобретению можно использовать для выделения полноразмерного гена из подходящей библиотеки (например, библиотека кДНК C.trachomatis) с использованием хорошо известных методов. В таких методах библиотеку (кДНК или геномную) подвергают скринингу с использованием одного или более полинуклеотидных образцов или праймеров,подходящих для амплификации. Предпочтительно библиотеку отбирают по размеру для включения более крупных молекул. Рандомизированные библиотеки с праймерами будут также предпочтительны для идентификации 5'- и выше расположенных участков гена. Геномные библиотеки являются предпочтительными для получения интронов и выступающих 5'-последовательностей. Для гибридизационных методов частичная последовательность может быть помечена (например, с помощью ник-трансляции или концевого мечения с помощью 32 Р) с использованием хорошо известных методов. Затем бактериальную или бактериофаговую библиотеку обычно подвергают скринингу с помощью гибридизующихся фильтров, содержащих денатурированные бактериальные колонии (или газонов, содержащих фаговые бляшки) с меченым образцом (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: ALaboratory Manual (1989. Гибридизующиеся колонии или бляшки подвергают селекции и размножению и ДНК выделяют для последующего анализа. Клоны кДНК могут быть проанализированы для определения количества дополнительной последовательности посредством, например, ПЦР с использованием праймера из частичной последовательности и праймера из вектора. Для идентификации одного или более перекрывающихся клонов могут быть созданы рестрикционные карты и частичные последовательности. Затем может быть определена полная последовательность с использованием стандартных методов, которые могут включать создание ряда делеционных клонов. Полученные перекрывающиеся последовательности затем могут быть собраны в единую непрерывную последовательность. Полноразмерная молекула кДНК может быть получена посредством лигирования подходящих фрагментов с использованием хорошо известных методов. Альтернативно, существуют многочисленные методы амплификации для получения полноразмерной кодирующей последовательности из частичной последовательности кДНК. В таких методах амплификацию обычно осуществляют с помощью ПЦР. Для осуществления стадии амплификации можно использовать любой из множества имеющихся в продаже наборов. Праймеры могут быть сконструированы с использованием, например, хорошо известного в данной области программного обеспечения. Праймеры предпочтительно имеют длину 22-30 нуклеотидов и содержание GC по меньшей мере 50% и отжигают с последовательностью-мишенью при температурах от примерно 68 до 72 С. Амплифицированная область может быть секвенирована, как описано выше, а перекрывающиеся последовательности могут быть собраны в непрерывную последовательность. Одним из таких методов амплификации является обратная ПЦР (см. Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186 (1988, в которой используют рестриктазы для создания фрагмента в известной области гена. Затем данный фрагмент подвергают циркуляризации посредством внутримолекулярного лигирования и используют в качестве матрицы для ПЦР с расходящимися праймерами, происходящими из известной области. В альтернативном подходе последовательности, смежные с частичной последовательностью,- 21014527 могут быть воспроизведены посредством амплификации с праймером к линкерной последовательности и праймером, специфическим к указанной области. Амплифицированные последовательности типично подвергают второму раунду амплификации с тем же самым линкерным праймером и вторым праймером,специфическим к известной области. Вариант этого метода, в котором используют два праймера, инициирующих удлинение в противоположных направлениях от известной последовательности, описан вWO 96/38591. Другой такой метод известен как "быстрая амплификация концов кДНК" или RACE (от англ. rapid amplification of cDNA ends). Этот метод включает в себя использование внутреннего праймера и внешнего праймера, которые гибридизуются с поли-А-областью или векторной последовательностью,для идентификации последовательностей, представляющих собой 5' и 3' известной последовательности. Дополнительные методы включают ПЦР-захват (capture PCR) (Lagerstorm et al., PCR Methods Applic. 1:111-19 (1991 и ПЦР-"прогулку" (walking PCR) (Parker et al., Nucl. Acids Res. 19:3055-60 (1991. Другие способы с использованием амплификации могут быть также использованы для получения полноразмерной последовательности кДНК. В некоторых случаях можно получить полноразмерную последовательность кДНК с помощью анализа последовательностей, предложенных в базе данных экспрессированных свободных концов последовательностей (EST, expressed sequence tag), таких как те, которые доступны из Gen Bank. Поиски перекрывающихся EST обычно можно осуществлять с использованием хорошо известных программ (например, поиски в NCBI BLAST), и такие EST можно использовать для создания непрерывной полноразмерной последовательности. Полноразмерные последовательности ДНК могут быть также получены с помощью анализа геномных фрагментов. Экспрессия полинуклеотидов в клетках-хозяевах В других воплощениях изобретения полинуклеотидные последовательности или их фрагменты, кодирующие полипептиды по изобретению, или слитые белки, или их функциональные эквиваленты, могут быть использованы в молекулах рекомбинантных ДНК для непосредственной экспрессии полипептида в соответствующей клетке-хозяине. Благодаря природной вырожденности генетического кода могут быть получены другие последовательности ДНК, которые кодируют, по существу, такую же или функционально эквивалентную аминокислотную последовательность, и эти последовательности могут быть использованы для клонирования и экспрессии данного полипептида. Специалистам в данной области будет понятно, что в некоторых случаях может быть предпочтительным получение полипептид-кодирующих нуклеотидных последовательностей, имеющих не встречающиеся в природе кодоны. Например, могут быть выбраны кодоны, предпочтительные для некоторых прокариотических и эукариотических хозяев, для повышения уровня экспрессии белка или для получения рекомбинантного РНК-транскрипта с желаемыми свойствами, такими как более длительный период полураспада, чем у транскрипта, полученного из природной последовательности. Более того, полинуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут быть сконструированы с использованием способов, широко известных в данной области, для того чтобы изменить полипептид-кодирующие последовательности по различным причинам, включая, но не ограничиваясь этим, изменения, которые модифицируют клонирование, процессинг и/или экспрессию генного продукта. Например, для конструирования нуклеотидных последовательностей можно использовать "перетасовку" ДНК посредством рандомизированной фрагментации и повторной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР. Кроме того, может быть использован сайтнаправленный мутагенез для встраивания новых сайтов рестрикции, изменения картин гликозилирования, изменения предпочтения кодонов, получения сплайс-вариантов или введения мутаций и т.п. В другом воплощении изобретения природные, модифицированные или рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот могут быть лигированы в гетерологичную последовательность для кодирования слитого белка. Например, для скрининга пептидных библиотек в отношении ингибиторов полипептидной активности может быть полезным кодирование химерного белка, который может распознаваться коммерчески доступным антителом. Слитый белок может быть также сконструирован с содержанием сайта расщепления, расположенного между полипептид-кодирующей последовательностью и последовательностью гетерологичного белка так, чтобы полипептид мог быть отщеплен и очищен от гетерологичной группировки. Последовательности, кодирующие желаемый полипептид, могут быть синтезированы, целиком или частично, с использованием химических методов, хорошо известных в данной области (см.p. 225-232 (1980. Альтернативно, сам белок может быть получен с использованием химических способов синтеза аминокислотной последовательности полипептида или его части. Например, синтез пептида может быть осуществлен с использованием различных твердофазных методов (Roberge et al., Science,269:202-204 (1995, а автоматизированный синтез можно осуществить, например, с использованием пептидного синтезатора ABI 431 А (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).- 22014527 Вновь синтезированный пептид может быть, по существу, очищен с помощью препаративной жидкостной хроматографии высокого разрешения (например, Creighton, Proteins, Structures and MolecularPrinciples (1983 или других сравнимых методов, доступных в данной области. Структура синтетических пептидов может быть подтверждена с помощью аминокислотного анализа или секвенирования (например, метод деградации по Эдману (Edman. Кроме того, аминокислотная последовательность полипептида или любая ее часть может быть изменена во время непосредственного синтеза и/или комбинирована с помощью химических способов с последовательностями из других белков или любой их частью для получения вариантного полипептида. Для экспрессии желаемого полипептида нуклеотидные последовательности, кодирующие данный полипептид, или функциональные эквиваленты могут быть встроены в подходящий экспрессирующий вектор, например вектор, содержащий необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности. Для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие интересующий пептид, и подходящие контрольные элементы транскрипции и трансляции, можно использовать способы, хорошо известные специалистам в данной области. Эти способы включают методы рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo. Такие методы описаны в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) иAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989). Для содержания и экспрессии полинуклеотидных последовательностей может быть использовано множество экспрессирующих векторов/систем-хозяев. Они включают в себя, но не ограничиваются этим,микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные экспрессирующими векторами на основе ДНК рекомбинантного бактериофага, плазмиды или космиды; дрожжи, трансформированные дрожжевыми экспрессирующими векторами; системы на основе клеток насекомых, инфицированных вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусные системы); системы на основе растительных клеток, трансформированных вирусными экспрессирующими векторами (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус мозаики табака, TMV) или бактериальными экспрессирующими векторами(например, плазмиды Ti или pBR322) или системы на основе животных клеток."Контрольные элементы" или "регуляторные последовательности", представленные в экспрессирующем векторе, представляют собой те нетранслируемые области вектора, энхансеры, промоторы, 5'- и 3'-нетранслируемые области, которые взаимодействуют с белками клетки-хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Такие элементы могут различаться по своей силе и специфичности. В зависимости от используемых векторной системы и хозяина может быть использовано любое количество подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах можно использовать индуцибельные промоторы, такие как гибридный lacZ-промотор фагмиды PBLUESCRIPT (Stratagene, La Golla, Calif.) или плазмиды PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) и т.п. В клеточных системах млекопитающих обычно предпочтительными являются промоторы из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. При необходимости создания клеточной линии, содержащей множественные копии последовательности, кодирующей полипептид, может быть предпочтительным использование векторов на основе SV40 илиEBV с подходящим селектируемым маркером. В бактериальных системах количество экспрессирующих векторов может быть выбрано в зависимости от предполагаемого применения экспрессирующегося полипептида. Например, когда необходимы большие количества, например, для индукции антител, можно использовать векторы, которые определяют высокий уровень экспрессии слитых белков, которые без труда очищают. Такие векторы включают,но не ограничиваются этим, мультифункциональные векторы клонирования и экспрессии в Е.coli, такие как BLUESCRIPT (Stratagene), в которых последовательность, кодирующая интересующий полипептид,может быть лигирована в вектор в рамке с последовательностями для аминоконцевого Met и последующих 7 остатков -галактозидазы с тем, чтобы продуцировался слитый белок; pIN-векторы (Van HeekeSchuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989 и т.п. pGEX-векторы (Promega, Madison, Wis.) также могут быть использованы для экспрессии чужеродных полипептидов в качестве слитых белков с глутатион-Sтрансферазой (GST). Обычно такие слитые белки являются растворимыми и легко могут быть очищены от лизированных клеток путем абсорбции на гранулах глутатион-агарозы с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Белки, полученные в таких системах, могут быть сконструированы так, чтобы включать сайты расщепления протеазами гепарина, тромбина или фактора ХА, чтобы при желании клонированный интересующий полипептид мог высвобождаться из группировки GST. В дрожжах Saccharomyces cerevisiae может быть использован целый ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как альфа-фактор, алкогольоксидаза и PGH. Другие векторы, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы, включают в себя GAP, PGK, GAL и ADH. Для обзоров см. Ausubel et al. (см. выше), Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987) и- 23014527 В тех случаях, когда используют растительные экспрессирующие векторы, экспрессия последовательностей, кодирующих полипептиды, может управляться любым количеством промоторов. Например,вирусные промоторы, такие как промоторы 35S и 19S CaMV, могут быть использованы отдельно или в комбинации с омега-лидерной последовательностью из TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987. Альтернативно, могут быть использованы растительные промоторы, такие как малая субъединицаRUBISCO или промоторы теплового шока (Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science, 224:838-843 (1984) и Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991. Эти конструкции можно вводить в растительные клетки с помощью прямой трансформации ДНК или патогенопосредованной трансфекции. Такие методы описаны во многих общедоступных обзорах (см., например,Hobbs в McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, p. 191-196 (1992. Для экспрессии интересующего полипептида может быть также использована система клеток насекомых. Например, в одной такой системе в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клеткахSpodoptera frugiperda или в Trichoplusia larvae используют вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). Последовательности, кодирующие полипептид, могут быть клонированы в несущественную область вируса, такую как ген полиэдрина, и помещены под контроль промотора полиэдрина. Успешная инсерция последовательности, кодирующей полипептид, будет инактивировать ген полиэдрина и обеспечивать продукцию рекомбинантного вируса, лишенного оболочечного белка. Затем рекомбинантные вирусы могут быть использованы для инфицирования, например, клеток S.frugiperda илиTrichoplusia larvae, в которых может быть экспрессирован интересующий полипептид (Engelhard et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224-3227 (1994. В клетках-хозяевах из млекопитающих обычно доступен целый ряд систем экспрессии на основе вируса. Например, в тех случаях, когда в качестве экспрессирующего вектора используют аденовирус,последовательности, кодирующие интересующий полипептид, могут быть лигированы в аденовирусный комплекс транскрипции/трансляции, состоящий из позднего промотора и тройной лидерной последовательности. Для того чтобы получить жизнеспособный вирус, способный экспрессировать полипептид в инфицированных клетках-хозяевах, может быть использована инсерция в несущественные области Е 1 или Е 2 вирусного генома (LoganShenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984. Кроме того,для усиления экспрессии в клетках-хозяевах из млекопитающих могут быть использованы энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (RSV). Также могут быть использованы специфические сигналы инициации для достижения более эффективной трансляции последовательностей, кодирующих интересующий полипептид. Такие сигналы включают инициирующий кодон ATG и соседние последовательности. В тех случаях, когда последовательности, кодирующие полипептид, его инициирующий кодон и вышележащие последовательности вводят в подходящий экспрессирующий вектор, дополнительные контрольные сигналы транскрипции или трансляции могут не потребоваться. Однако в тех случаях, когда вводят только кодирующую последовательность или ее часть, должны быть обеспечены экзогенные сигналы контроля трансляции, включая инициирующий кодон ATG. Кроме того, инициирующий кодон должен находиться в правильной рамке считывания для обеспечения трансляции всей вставки. Экзогенные трансляционные элементы и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение: как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии может быть увеличена путем включения энхансеров, которые являются подходящими для конкретной используемой клеточной системы, такой как описано в литературе (Scharf. etal., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994. Кроме того, штамм клеток-хозяев может быть выбран за его способность модулировать экспрессию встроенных последовательностей или осуществлять процессинг экспрессирующегося белка желаемым образом. Такие модификации полипептида включают, но не ограничиваются этим, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. Посттрансляционный процессинг, при котором происходит отщепление "препро" формы от белка, также может быть использован для облегчения правильной вставки, фолдинга и/или функции. Для обеспечения правильных модификации и процессинга чужеродного белка могут быть выбраны различные клетки-хозяева, такие как СНО, HeLa, MDCK, HEK293 и WI38, имеющие специфический клеточный аппарат и характерные механизмы для такой посттрансляционной активности. Для длительной высокоэффективной продукции рекомбинантных белков обычно предпочтительной является стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, стабильно экспрессирующие интересующий полинуклеотид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные точки инициации репликации и/или эндогенные экспрессирующие элементы и селектируемый маркерный ген на том же или на отдельном векторе. После введения вектора клеткам дают возможность расти в течение 1-2 суток в обогащенных питательных средах, перед тем как перенести их на селективные питательные среды. Назначение селектируемого маркера состоит в том,чтобы придать устойчивость к селекции, и его присутствие дает возможность выращивать и выделять клетки, успешно экспрессирующие встроенные последовательности. Можно обеспечить пролиферацию устойчивых клонов стабильно трансформированных клеток с использованием методов тканевого культивирования, подходящих для данного клеточного типа.- 24014527 Для выделения трансформированных клеточных линий может быть использовано любое количество систем селекции. Они включают, но не ограничиваются этим, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., Cell, 11:223-32 (1977 и аденин-фосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., Cell,22:817-23 (1990, которые могут быть использованы в tk.sup.- или aprt.sup.-клетках соответственно. В качестве основы для селекции также может быть использована устойчивость к антиметаболитам, антибиотикам или гербицидам; например dhfr, придающий устойчивость к метотрексату (Wigler et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980; npt, придающий устойчивость к аминогликозидам, неомицину и G-418 (Colbere-Gaparin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981; и als или pat, придающие устойчивость к хлорсульфурону и фосфинотрицинацетилтрансферазе соответственно (Murray, см. выше). Были описаны дополнительные селектируемые гены, например trpB, который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана, или hisD, который позволяет клеткам утилизировать гистинол вместо гистидина(HartmanMulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988. В последнее время стало популярным использовать видимые маркеры, такие как антоцианы, -глюкуронидаза и ее субстрат GUS и люцифераза и ее субстрат люциферин, которые широко используются не только для идентификации трансформантов, но также для количественного определения временной или стабильной экспрессии белка,характерной для конкретной векторной системы (Rhobes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131(1995. Несмотря на то что присутствие/отсутствие маркерного гена экспрессии предполагает также присутствие интересующего гена, может быть необходимо подтверждение его присутствия и экспрессии. Например, если последовательность, кодирующая полипептид, встроена в последовательность маркерного гена, то рекомбинантные клетки, содержащие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может быть помещен в тандем с полипептид-кодирующей последовательностью под контроль одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индукцию или селекцию обычно указывает на экспрессию также тандемного гена. Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат и экспрессируют желаемую полинуклеотидную последовательность, могут быть идентифицированы с помощью различных методов, известных специалистам в данной области. Эти методы включают, но не ограничиваются этим, гибридизации ДНК-ДНК или ДНК-РНК и методы белкового биоанализа или иммуноанализа, которые включают технологии детекции и/или количественного определения нуклеиновой кислоты или белка с использованием мембран,растворов или чипов. В данной области известно множество протоколов детекции и измерения экспрессии продуктов,кодируемых полинуклеотидами, с использованием либо поликлональных, либо моноклональных антител, специфических к продукту. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA),радиоиммуноанализ (RIA) и сортировку клеток с активацией флуоресценции (FACS, fluorescenceactivated cell sorter). Для некоторых применений предпочтительным может быть иммуноанализ на основе двойных моноклональных антител с использованием моноклональных антител, реактивных в отношении двух, не реагирующих перекрестно эпитопов на данном полипептиде, но также может быть использован анализ конкурентного связывания. Эти и другие анализы описаны, помимо других источников,Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) и Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211-1216(1983). Широкий спектр меток и методов конъюгации известен специалистам в данной области и может быть использовано в различных анализах нуклеиновых кислот и аминокислот. Способы получения меченых зондов для гибридизации или ПЦР для детекции последовательностей, относящихся к полинуклеотидам, включают олигомечение, ник-трансляцию, мечение концов или ПЦР-амплификацию с использованием меченого нуклеотида. Альтернативно, последовательности или любые их части могут быть клонированы в вектор для получения мРНК-зонда. Такие векторы известны в данной области, коммерчески доступны и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов in vitro путем добавления подходящей РНК-полимеразы, такой как Т 7, Т 3 или SP6, и меченых полинуклеотидов. Эти методы можно осуществлять с использованием множества коммерчески доступных наборов. Подходящие репортерные группы или метки, которые могут быть использованы, включают радионуклиды, ферменты, флуоресцентные,хемилюминисцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Клетки-хозяева, трансформированные интересующей полинуклеотидной последовательностью,можно культивировать в условиях, подходящих для экспрессии и выделения белка из культуры клеток. Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может секретироваться или содержаться внутри клеток в зависимости от последовательности и/или используемого вектора. Специалистам в данной области будет понятно, что экспрессирующие векторы, содержащие полинуклеотиды по изобретению, могут быть сконструированы так, чтобы содержать сигнальные последовательности, которые направляют секрецию кодируемого полипептида через прокариотическую или эукариотическую клеточную мембрану. Могут быть использованы другие рекомбинантные конструкции для соединения последовательностей, кодирующих интересующий полипептид, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидный домен, который будет облегчать очистку растворимых белков. Такие домены, облегчающие очистку,включают, но не ограничиваются этим, метал-хелатирующие пептиды, такие как гистидин- 25014527 триптофановые модули, обеспечивающие очистку на иммобилизованных металлах, протеин А-домены,обеспечивающие очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе удлинения/аффинной очистки FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Для облегчения очистки может быть использовано включение расщепляемых линкерных последовательностей, таких как последовательности, специфические к фактору ХА или энтерокиназе (Invitrogen. San Diego, Calif.), между доменом очистки и кодируемым полипептидом. Один такой экспрессирующий вектор обеспечивает экспрессию слитого белка, содержащего интересующий полипептид, и нуклеиновой кислоты, кодирующей 6 остатков гистидина, предшествующих сайту расщепления для тиоредоксина или энтерокиназы. Остатки гистидина облегчают очистку на IMIAC (аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металла),как описано в Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3:263-281 (1992), тогда как сайт расщепления для энтерокиназы обеспечивает способ очистки желаемого полипептида из слитого белка. Обсуждение векторов, содержащих слитые белки, представлено в Kroll et al., DNA Cell Biol. 12:441-453 (1993. Помимо методов рекомбинантной продукции, полипептиды по изобретению и их фрагменты могут быть получены непосредственным синтезом пептидов с использованием твердофазных методов(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963. Белковый синтез можно осуществлять с использованием ручных методов или автоматики. Автоматический синтез можно осуществлять, например, с использованием пептидного синтезатора Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Альтернативно, различные фрагменты могут быть химически синтезированы по отдельности и комбинированы с использованием химических методов получения полноразмерной молекулы. Методы доставки полинуклеотидов in vivo В дополнительных воплощениях генетические конструкции, содержащие композиции полинуклеотидов по изобретению, вводят в клетки in vivo. Этого можно достичь с использованием любого из множества хорошо известных подходов, некоторые из которых описаны ниже для иллюстративных целей. 1. Аденовирус. Один из предпочтительных способов доставки in vivo одной или более последовательностей нуклеиновых кислот включает в себя использование аденовирусного экспрессирующего вектора. "Аденовирусный экспрессирующий вектор" подразумевает включение конструкций, которые содержат аденовирусные последовательности, достаточные для (а) поддержания упаковывания конструкции и (б) экспрессии полинуклеотида, который был клонирован в них в смысловой или антисмысловой ориентации. Конечно, в контексте антисмысловой конструкции экспрессия не требует синтеза генного продукта. Экспрессирующий вектор содержит генетически сконструированную форму аденовируса. Знание генетической организации аденовируса: вирус 36 т.п.н, содержащий двухцепочечную линейную ДНК,дает возможность замещать большие участки аденовирусной ДНК чужеродными последовательностями размером до 7 т.п.н. (GrunhausHorwitz, 1992). В отличие от ретровируса аденовирусная инфекция клеток-хозяев не приводит к хромосомной интеграции, поскольку аденовирусная ДНК может реплицироваться в виде эписомы без потенциальной генотоксичности. Кроме того, аденовирусы структурно стабильны, и никакой геномной перестройки не было обнаружено после активной амплификации. В сущности, аденовирус может инфицировать все эпителиальные клетки независимо от стадии их клеточного цикла. До сих пор аденовирусную инфекцию считают связанной только с легкими заболеваниями, такими как острое респираторное заболевание у людей. Аденовирус особенно подходит для применения в качестве вектора для переноса генов из-за его генома среднего размера, легкости манипуляции, высокого титра, широкого диапазона клеток-мишеней и высокой инфекционности. Оба конца вирусного генома содержат 100-200 пар оснований инвертированных повторов (ITR), которые являются цис-элементами, необходимыми для репликации и упаковки вирусной ДНК. Ранние (Е) и поздние (L) области генома содержат различные транскрипционные единицы,которые разделены началом репликации вирусной ДНК. Область Е 1 (Е 1 А и Е 1 В) кодирует белки, отвечающие за регуляцию транскрипции вирусного генома и нескольких клеточных генов. Экспрессия области Е 2 (Е 2 А и Е 2 В) приводит к синтезу белков для репликации вирусной ДНК. Эти белки вовлечены в репликацию ДНК, позднюю экспрессию генов и "выключение" клетки-хозяина (Renan, 1990). Продукты поздних генов, включая большинство вирусных капсидных белков, экспрессируются только после значительного процессинга единичного первичного транскрипта, считываемого с главного позднего промотора (MLP). MLP (локализован в 16,8 m.u.) является особенно эффективным во время поздней фазы инфекции, и все мРНК, считываемые с этого промотора, имеют 5-тройную лидерную (TPL) последовательность, которая делает их предпочтительными мРНК для трансляции. В настоящей системе рекомбинантный аденовирус создают посредством гомологичной рекомбинации между челночным вектором и провирусным вектором. Вследствие возможной рекомбинации между двумя провирусным векторами в данном процессе может образовываться аденовирус дикого типа. Поэтому это является критическим для выделения единичного клона вируса из индивидуальной бляшки и исследование его геномной структуры. Создание и размножение настоящих аденовирусных векторов, которые дефектны по репликации,зависит от уникальной вспомогательной клеточной линии, обозначенной 293, которую получили из клеток эмбриональной почки человека с помощью Ad5 ДНК-фрагментов и которая конститутивно экспрес- 26014527 сирует Е 1 белки (Graham et al., 1977). Поскольку область E3 является необязательной в аденовирусном геноме (JonesShenk, 1978), настоящие аденовирусные векторы с помощью клеток 293 несут чужеродную ДНК либо в Е 1, либо в E3, либо в обеих областях (GrahamPrevec, 1991). В природе аденовирус способен упаковать примерно 105%генома дикого типа (Ghosh-Choudhury et al., 1987), обеспечивая вместимость примерно для 2 дополнительных т.п.н. ДНК. В комбинации примерно с 5,5 т.п.н. ДНК, способной замещаться в областях Е 1 и E3, максимальная способность настоящего аденовирусного вектора составляет менее 7,5 т.п.н. или примерно 15% от общей длины вектора. Более 80% вирусного генома аденовируса остается в векторном скелете и служит источником трансмиссивной цитотоксичности. Также дефектность по репликации вируса с делецией Е 1 является неполной. Например, у доступных в настоящее время векторов была обнаружена утечка экспрессии вирусных генов при высокой множественности заражения (MOI) (Mulligan, 1993). Вспомогательные клеточные линии могут быть получены из клеток человека, таких как клетки эмбриональной почки человека, мышечные клетки, кроветворные клетки или другие эмбриональные мезенхимальные или эпителиальные клетки человека. Альтернативно, вспомогательные клетки могут быть получены из клеток других видов млекопитающих, которые являются восприимчивыми к человеческому аденовирусу. Такие клетки включают, например, клетки Vero или другие эмбриональные мезенхимальные или эпителиальные клетки обезьяны. Как указано выше, предпочтительной в настоящее время вспомогательной клеточной линией является 293. Недавно Racher и др. (1995) раскрыли улучшенные способы культивирования клеток 293 и размножения аденовируса. В одном формате природные клеточные аггрегаты выращивают посредством инокуляции индивидуальных клеток в силиконизированные центрифужные флаконы объемом 1 л (Techne,Cambridge, UK), содержащие 100-200 мл среды. После перемешивания при 40 об/мин жизнеспособность клеток оценивают с помощью трипанового синего. В другом формате используют микроносители FibraCel (Bibby Sterlin, Stone, UK) следующим образом. Клеточный инокулят, ресуспендированный в 5 мл среды, добавляют к носителю (50 мл) в коническую колбу Эрленмейера объемом 250 мл и оставляют стационарно при редком взбалтывании на 1-4 ч. Затем среду замещают 50 мл свежей среды и начинают встряхивание. Для продукции вируса клеткам позволяют расти до примерно 80%-ной конфлюэнтности,после чего среду замещают (до 25% конечного объема) и добавляют аденовирус при MOI 0,05. Культуры оставляют стационарно на ночь, после чего увеличивают объем до 100% и начинают встряхивание в течение еще 72 ч. В отличие от требования, чтобы аденовирусный вектор был дефектным по репликации или, по меньшей мере, условно дефектным, природу аденовирусного вектора не считают критической для успешного применения изобретения. Аденовирус может представлять любой из 42 различных известных серотипов или подгрупп A-F. Аденовирус 5 типа подгруппы С является предпочтительным исходным материалом для получения условно дефектного по репликации аденовирусного вектора для применения в настоящем изобретении, поскольку аденовирус 5 типа представляет собой аденовирус человека, о котором известно большое количество биохимической и генетической информации и его исторически использовали для большинства конструкций, использующих аденовирус в качестве вектора. Как сказано выше, типичный вектор по настоящему изобретению является дефектным по репликации и не будет содержать область Е 1 аденовируса. Таким образом, он будет наиболее подходящим для введения полинуклеотида, кодирующего интересующий ген, в положение, из которого были удалены Е 1-кодирующие последовательности. Однако местоположение вставки конструкции в аденовирусные последовательности не является критическим для изобретения. Полинуклеотид, кодирующий интересующий ген, также может быть встроен вместо делетированной области E3 в E3-замещенных векторах,как описано у Karisson и др. (1986), или в область Е 4, когда вспомогательная клеточная линия или вспомогательный вирус комплементируют дефект Е 4. Аденовирус легко поддается выращиванию и манипуляции и демонстрирует широкий диапазон хозяев in vitro и in vivo. Эта группа вирусов может быть получена с высокими титрами, например 109-1011 бляшкообразующих единиц на 1 мл, и они являются высоко инфекционными. Жизненный цикл аденовируса не требует интеграции в геном клетки-хозяина. Чужеродные гены, доставляемые аденовирусными векторами, являются эписомальными и, следовательно, имеют низкую генотоксичность для клетокхозяев. Не было сообщений о побочных эффектах в исследованиях вакцинации аденовирусом дикого типа (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), что демонстрирует их безопасность и терапевтический потенциал в качестве векторов для переноса генов in vivo. Аденовирусные векторы использовали в экспрессии эукариотических генов (Levrero et al., 1991;Gomez-Foix et al., 1992) и разработке вакцин (GrunhausHorwitz, 1992; GrahamPrevec, 1992). В последнее время исследования на животных позволили предположить, что рекомбинантный аденовирус мог бы быть использован для генной терапии (Stratford-PerricaudetPericaudet, 1991; StratfordPerricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Исследования по введению рекомбинантного аденовируса в различные ткани включают капельное введение в трахею (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), внутримышечную инъекцию (Ragot et al., 1993), периферические внутривенные инъекции (HerzGerard,1993) и стереотаксическую инокуляцию в мозг (Le Gal La Salle et al., 1993).- 27014527 2. Ретровирусы. Ретровирусы представляют собой группу одноцепочечных РНК-вирусов, характеризующихся способностью превращать свою РНК в двухцепочечную ДНК в инфицированных клетках с помощью процесса обратной транскрипции (Coffin, 1990). Полученная ДНК затем стабильно интегрирует в клеточные хромосомы в виде провируса и направляет синтез вирусных белков. Интеграция приводит к сохранению последовательностей вирусных генов в клетке-реципиенте и ее потомках. Ретровирусный геном содержит три гена: gag, pol и env, которые кодируют соответственно капсидные белки, фермент полимеразу и компоненты оболочки. Последовательность, обнаруживаемая выше гена gag, содержит сигнал для упаковки генома в вирионы. Две последовательности длинных концевых повторов (LTR) представлены на 5'- и 3'-концах вирусного генома. Они содержат сильный промотор и энхансерные последовательности, а также необходимы для интеграции в геном клетки-хозяина (Coffin, 1990). Для конструирования ретровирусного вектора нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или более интересующих олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, встраивают в вирусный геном вместо определенных вирусных последовательностей для продукции вируса, дефектного по репликации. Для продукции вирионов конструируют упаковочную клеточную линию, содержащую геныgag, pol и env, но без LTR и упаковывающих компонентов (Mann et al., 1983). Когда рекомбинантную плазмиду, содержащую кДНК, вместе с ретровирусными LTR и упаковывающими последовательностями вводят в эту клеточную линию (с помощью, например, преципитации фосфатом кальция), упаковывающая последовательность позволяет упаковывать РНК-транскрипт рекомбинантной плазмиды в вирусные частицы, которые затем будут секретироваться в культуральные среды (NicolasRubenstein, 1988;Temin, 1986; Mann et al., 1983). Среды, содержащие рекомбинантные ретровирусы, затем собирают, возможно концентрируют и используют для переноса генов. Ретровирусные векторы способны инфицировать большое множество клеточных типов. Однако интеграция и стабильная экспрессия требуют деления клеток-хозяев (Paskind et al., 1975). Недавно был разработан новый подход, обеспечивающий специфическое нацеливание ретровирусных векторов, на основе химической модификации ретровируса путем химического добавления остатков лактозы к вирусной оболочке. Эта модификация смогла обеспечить специфическое инфицирование гепатоцитов через сиалогликопротеиновые рецепторы. Был разработан другой подход для нацеливания рекомбинантных ретровирусов, в котором использовали биотинилированные антитела к ретровирусному оболочечному белку и к специфическому клеточному рецептору. Антитела были соединены с помощью биотиновых компонентов с использованием стрептавидина (Roux et al., 1989). Используя антитела к антигенам главного комплекса гистосовместимости класса I и класса II, они показали инфицирование различных клеток человека, несущих эти поверхностные антигены, экотропным вирусом in vitro (Roux et al., 1989). 3. Аденоассоциированные вирусы.AAV (Ridgeway, 1988; HermonatMuzycska, 1984) представляет собой парвовирус, обнаруженный в виде контаминации аденовирусных штаммов. Это повсеместно распространенный вирус (антитела присутствуют у 85% населения США), который не связывают ни с каким заболеванием. Его также классифицируют как зависимый вирус, потому что его репликация зависит от наличия вспомогательного вируса, такого как аденовирус. Было выделено пять серотипов, из которых лучше охарактеризован AAV-2.AAV имеет одноцепочечную линейную ДНК, которая заключена в капсид из капсидных белковVP1, VP2 и VP3 с образованием икасаэдрического вириона диаметром от 20 до 24 нм (MuzycskaMcLaughlin, 1988). ДНК AAV имеет длину примерно 4,7 т.п.н. Она содержит две открытые рамки считывания и фланкирована двумя ITR. В геноме AAV есть два основных гена: rep и cap. Ген rep кодирует белки, отвечающие за вирусную репликацию, в то время как cap кодирует капсидный белок VP1-3. Каждый ITR образует Т-образную шпилечную структуру. Эти концевые повторы являются единственными существенными цис-компонентами AAV для интеграции в хромосомы. Следовательно, AAV может быть использован в качестве вектора с удалением всех вирусных кодирующих последовательностей и замещением их кассетой генов для доставки. Были идентифицированы и обозначены три вирусных промотора: р 5, р 19 и р 40 согласно их положению на карте. Транскрипция с р 5 и р 19 приводит к продукции rep белков, а транскрипция с р 40 дает капсидные белки (HermonatMuzycska, 1984). Существует несколько факторов, которые подтолкнули исследователей к изучению возможности использования rAAV в качестве экспрессирующего вектора. Одним из них является то, что требований для доставки гена для интеграции в хромосому хозяина неожиданно немного. Необходимо иметь ITR длиной 145 п.н., которые составляют только 6% генома AAV. Это оставляет пространство в векторе для сборки ДНК-вставки длиной 4,5 т.п.н. Несмотря на то, что такая вместимость может препятствовать доставке больших генов с помощью AAV, она вполне подходит для доставки антисмысловых конструкций по настоящему изобретению.AAV также является хорошим выбором носителей для доставки благодаря его безопасности. Существует относительно сложный механизм "спасения": для мобилизации rAAV требуются не только аденовирус дикого типа, но и гены AAV. Также AAV не является патогенным и не ассоциирован ни с каким заболеванием. Удаление вирусных кодирующих последовательностей минимизирует иммунные реакции на экспрессию вирусных генов, и, следовательно, rAAV не вызывает воспалительного ответа. 4. Другие вирусные векторы в качестве экспрессирующих конструкций. В качестве экспрессирующих конструкций по настоящему изобретению для доставки олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей в клетку-хозяина могут быть использованы и другие вирусные векторы. Могут быть использованы векторы, происходящие из вирусов, таких как вирус осповакцины (Ridgeway, 1988; Coupare et al., 1988), лентивирусы, полиовирусы и герпесвирусы. Они обеспечивают несколько интересных особенностей для различных клеток млекопитающих (Friedmann,1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990). В связи с недавним открытием дефектных вирусов гепатита В, сформировался новый взляд на структурно-функциональные взаимоотношения различных вирусных последовательностей. Исследования in vitro показали, что вирус мог сохранять способность к хелпер-зависимому упаковыванию и обратной транскрипции, несмотря на делецию вплоть до 80% его генома (Horwich et al., 1990). Этот факт предполагает, что большие участки генома могут быть замещены чужеродным генетическим материалом. Гепатотропизм и персистенция (интеграция) были особенно интересными свойствами для переноса генов, нацеленного на печень. Chang и др. (1991) вводили ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) в геном утиного вируса гепатита В в месте последовательностей, кодирующих полимеразу, поверхностные и околоповерхностные белки. Этот вирус подверали котрансфекции с вирусом дикого типа в клеточную линию гепатомы птиц. Для инфицирования первичных гепатоцитов утят использовали культуральные среды, содержащие высокие титры рекомбинантного вируса. Стабильную экспрессию гена CAT определяли по меньшей мере в течение 24 суток после трансфекции (Chang et al., 1991). Дополнительные "вирусные" векторы включают вирусоподобные частицы (VLP) и фаги. 5. Невирусные векторы. Для воздействия на экспрессию олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению в клетку необходимо доставить экспрессирующую конструкцию. Эту доставку можно осуществлять in vitro, как в лабораторных процедурах трансформации клеточных линий,или in vivo, или ex vivo, так и при лечении некоторых болезненных состояний. Как описано выше, один предпочтительный механизм доставки осуществляется через вирусную инфекцию, где экспрессирующая конструкция инкапсулирована в инфекционную вирусную частицу. Как только экспрессирующая конструкция будет доставлена в клетку, нуклеиновая кислота, кодирующая желаемые олигонуклеотидные и полинуклеотидные последовательности, может быть размещена и экспрессирована в различных сайтах. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, кодирующая указанную конструкцию, может быть стабильно интегрирована в геном клетки. Эта интеграция может происходить в специфическом положении и ориентации посредством гомологичной рекомбинации (замещение гена), или она может быть интегрирована в случайном неспецифическом положении (усиление гена). В дополнительных воплощениях нуклеиновую кислоту можно стабильно поддерживать в клетке в виде отдельного эписомального сегмента ДНК. Такие сегменты нуклеиновых кислот или "эписомы" кодируют последовательности, достаточные для возможности поддержания и репликации независимо от цикла клетки-хозяина или синхронно с ним. То, как экспрессирующую конструкцию доставляют в клетку и где в клетке пребывает эта нуклеиновая кислота, зависит от типа используемой экспрессирующей конструкции. В некоторых воплощениях изобретения экспрессирующая конструкция, содержащая одну или более олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, может состоять просто из "голой" рекомбинантной ДНК или плазмид. Перенос конструкции может быть осуществлен с помощью любого из вышеупомянутых способов, которые физически или химически нарушают проницаемость клеточной мембраны. Это особенно полезно для переноса in vitro, но может быть также использовано в примененииin vivo. Dubensky и др. (1984) успешно инъецировали полиомавирусную ДНК в форме кальцийфосфатных преципитатов в печень и селезенку взрослых и новорожденных мышей, демонстрируя активную вирусную репликацию и острую инфекцию. Benvenisty и Reshef (1986) также продемонстрировали,что прямая внутрибрюшинная инъекция плазмид в виде кальций-фосфатных преципитатов приводит к экспрессии трансфицированных генов. Можно представить, что ДНК, кодирующая интересующий ген,также может быть аналогичным образом перенесена in vivo и экспрессировать генный продукт. Другое воплощение изобретения, касающееся переноса конструкции для экспрессии "голой" ДНК в клетки, может включать бомбардировку частицами. Этот способ зависит от способности ускорять бомбардирующие микрочастицы, покрытые ДНК, до высокой скорости, позволяющей им проходить через клеточные мембраны и проникать в клетки без их уничтожения (Klein et al., 1987). Было разработано несколько устройств для ускорения маленьких частиц. Одно такое устройство использует высоковольтный заряд для создания электрического тока, который в свою очередь обеспечивает движущую силу (Yang etal., 1990). Используемые бомбардирующие микрочастицы состоят из биологически инертных веществ,- 29