Безопасные мутантные вирусные вакцины

009391 Область изобретения Настоящее изобретение относится в общем случае к вакцинам против вирусных инфекций, подходящим для введения животным. Более конкретно, настоящее изобретение относится к безопасным вакцинам и способам приготовления таких вакцин. Вакцины по настоящему изобретению содержат по меньшей мере два(е) живых мутантных вируса одного и того же семейства или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие вирусы, где каждый(ая) из вирусов или кодирующих нуклеиновых кислот содержит мутацию, которая обеспечивает желаемый фенотип, и эти мутации в вирусах находятся в одном и том же геномном сайте, так что мутантные вирусы не могут рекомбинировать друг с другом с устранением данных мутаций. Предшествующий уровень техники Семейство вирусов Flaviviridae состоит из родов Pestivirus, Flavivirus и Hepacivirus. Род Pestivirus представлен следующими видами: вирусом бычьей вирусной диареи типа 1 (Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV-1), BVDV-2, вирусом классической лихорадки свиней и вирусом болезни Бордера (Border). Вирионы членов этого семейства содержат инкапсулированные "плюс" РНК-содержащие геномы размером от приблизительно 9,5 до 12,3 т.н. Геномные РНК содержат смежные длинные открытые рамки считывания (ORF), в результате трансляции которых образуются полипротеины, которые подвергаются процессингу клеточными и вирусными протеазами с образованием зрелых вирусных белков. У членов родаPestivirus ORF кодирует полипротеин приблизительно из 3900 аминокислот, который подвергается котрансляционному и посттрансляционному процессингу с образованием следующих зрелых вирусных белков (от 5' к 3'): Npro, С, Erns, E1, E2, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Среди некоторых членов Pestivirus обнаружены два биотипа на основе их влияния на клетки тканевых культур, а именно цитопатогенный (цитопатический или cp) и нецитопатогенный (нецитопатический или ncp). Анализы генома показали наличие вставок клеточных последовательностей, в некоторых случаях сопровождающихся удвоением вирусных последовательностей, геномными перегруппировками и/или делециями вирусных последовательностей в геномах cp пестивирусов, но не в РНК соответствующих ncp пестивирусов. Это позволяет предположить, что cp пестивирусы произошли из ncp пестивирусов в результате рекомбинации РНК.BVDV является широко распространенным патогеном крупного рогатого скота. BVDV-1 обычно вызывает только легкую форму диареи у иммунокомпетентных животных, в то время, как BVDV-2 может вызывать тромбоцитопению, кровотечения и острую форму заболевания с летальным исходом.BVDV способен проникать через плаценту стельных коров и может приводить к рождению персистентно инфицированных (PI) телят (Malmquist, J. Am. Vet. Med. Assoc. 152: 763-768 (1968); Ross, et al., J. Am.Vet. Med. Assoc. 188: 618-619 (1986. Виремичные телята являются иммунотолерантными к вирусу и персистентно виремичными до конца своей жизни. Они представляют собой источник вспышек вирусной диареи (заболевания слизистых оболочек) (Liess, et al., Dtsch. Tieraerztl. Wschr. 81: 481-487 (1974 и в высокой степени предрасположены к инфекции микроорганизмами, вызывающими такие заболевания,как пневмония или кишечное заболевание (Barber, et al., Vet. Rec. 117: 459-464 (1985. Вирусы любого из двух генотипов могут существовать в виде одного из двух биотипов, cp или ncp. Фенотип ср коррелирует с экспрессией NS3, хотя клетки, инфицированные либо ср, либо ncp BVDV, в обоих случаях экспрессируют NS2-3, тогда как NS3 детектируется только после инфицирования cp BVDV. NS3 колинеарен с Сконцевой областью NS2-3. Экспрессия NS3, по-видимому, является результатом геномных изменений,наблюдаемых в случае cp BVDV. Доступные в настоящее время вирусные вакцины включают убитые или аттенуированные живые вирусные вакцины, живые векторные вакцины, субъединичные вакцины и ДНК- или РНК-вакцины. Смотри Roth et al., "New Technology For Improved Vaccine Safety And Efficacy", Veterinary Clinics NorthAmerica: Food Animal Practice 17 (3): 585-597 (2001). Аттенуация вирусов может быть достигнута посредством УФ-облучения, химической обработки или в результате многократного пассирования in vitro. Количество, расположение и природа мутаций, индуцированных этими способами, не известны ввиду отсутствия анализа геномной последовательности. Кроме того, аттенуация может быть достигнута путем создания определенных генетических изменений, например специфической делеции вирусных последовательностей, известных для обеспечения вирулентности, или вставки последовательностей в вирусный геном. Одна из причин озабоченности в отношении использования аттенуированных живых вирусных вакцин состоит в том, что аттенуированные мутантные вирусы способны рекомбинировать in vivo с устранением аттенуирующей(их) мутации(й) и восстановлением таким образом вирулентности. Например, в присутствии вирулентного (дикого типа) полевого штамма аттенуированные вирусы, имеющие делеции в вирусном геноме, способны рекомбинировать с вирулентным штаммом с восстановлением делетированной последовательности. Смотри, например, Roth с соавт., выше. Цитопатические пестивирусы с клеточными вставками также рассматривались как дающие начало нецитопатическим вирусам в клеточной культуре в результате делеции клеточных последовательностей, возможно посредством рекомбинации РНК. Смотри, например, Baroth et al., "Insertion of cellular NEDD8 coding sequences in a pestivirus", Virology 278 (2): 456-66 (2000) и Becher et al., "RNA recombination between persisting pestivirus and a vaccine strain:-1 009391 Когда в вакцинную композицию желательно включение двух аттенуированных мутантных вирусов из одного и того же вида, рода или семейства, существует озабоченность в отношении того, что этих два вируса могут рекомбинировать в вакцинированном животном с устранением таким образом аттенуирующих мутаций. Смотри, например, Glazenburg et al., "Genetic recombination of pseudorabies virus: evidencethat homologous recombination between insert sequences is less frequent than between autologous sequences",Archives of Virology, 140 (4): 671-85 (1995). Сохраняется необходимость в разработке безопасных и эффективных вакцин, которые защищают животных от вирусных инфекций. Краткое изложение сущности изобретения В настоящем изобретении предложены безопасные вакцины, содержащие по меньшей мере два(е) живых мутантных вируса одного и того же семейства или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие вирусы, где каждый вирус или кодирующая нуклеиновая кислота содержит мутацию, которая обеспечивает желаемый фенотип, и эти мутации в вирусах находятся в одном и том же геномном сайте,так что мутантные вирусы не могут рекомбинировать друг с другом с устранением данных мутаций. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ приготовления безопасной вирусной вакцины посредством селекции или конструирования двух или более живых мутантных вируса одного и того же семейства, рода или вида, где каждый вирус содержит мутацию, которая обеспечивает желаемый фенотип, и эти мутации в вирусах находятся в одном и том же геномном сайте, так что мутантные вирусы не могут подвергаться гомологичной рекомбинации с устранением данных мутаций. В настоящем изобретении, кроме того, предложен способ защиты животного против вирусных инфекций путем введения животному вакцинной композиции по настоящему изобретению. Краткое описание графических материалов На фигуре показано выравнивание клеточных вставок и фланкирующих вирусных последовательностей из NS2-3 областей штамма BVDV-1 NADL и штамма BVDV-2 53637. Подробное описание изобретения В настоящем изобретении однозначно установлено, что живые мутантные вирусы одного и того же семейства, содержащие мутации в одном и том же геномном сайте вирусов, не могут рекомбинировать друг с другом с устранением данных мутаций. В соответствии с этим в одном воплощении настоящего изобретения предложены безопасные вакцинные композиции, содержащие по меньшей мере два(е), т.е. два(е) или более, живых мутантных вируса одного и того же семейства или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие вирусы, где мутации в вирусах находятся в одном и том же геномном сайте, так что эти мутантные вирусы не могут рекомбинировать друг с другом с устранением данных мутаций. В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ приготовления безопасной вирусной вакцины, как она изложена в данном описании выше. Конкретно, безопасную вакцину готовят путем селекции или конструирования двух или более живых мутантных вирусов одного и того же семейства, рода или вида, где каждый из вирусов содержит мутацию, которая обеспечивает желаемый фенотип(например аттенуацию вирулентности, изменение клеточного тропизма или биотипа, изменение видового тропизма или экспрессию чужеродной генной кассеты), и эти мутации в вирусах находятся в одном и том же геномном сайте, так что мутантные вирусы не могут подвергаться гомологичной рекомбинации друг с другом с устранением данных мутаций. Термин "вакцина" или "вакцинная композиция" относится к композиции, содержащей живые мутантные вирусы, которая после введения животному индуцирует полный или частичный иммунитет к патогенному варианту этих вирусов или облегчает симптомы заболеваний, вызываемых патогенными вариантами этих вирусов. Защитные эффекты вакцинной композиции против вируса обычно достигаются путем индукции у субъекта иммунного ответа, или клеточно-опосредованного или гуморального иммунного ответа, или комбинации того и другого. В общих чертах, показателями защитных эффектов вакцинной композиции являются устранение или снижение распространенности вирусной инфекции, ослабление симптомов или ускорение выведения вирусов из инфицированных субъектов. Под "животным" подразумевают птиц, например цыплят, индеек, домашних водоплавающих птиц,и любое млекопитающее, например крупный рогатый скот, овец, свиней, коз, собак, кошек и лошадей. Термин "вирусы", "вирусные изоляты" или "вирусные штаммы", как он использован в данном описании, относится к вирусным частицам или вирионам, содержащим вирусную геномную ДНК или РНК,ассоциированным белкам и другим химическим составляющим (таким, как липиды). Под "молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей вирус" или "молекулой нуклеиновой кислоты вируса" подразумевают геномную молекулу нуклеиновой кислоты вируса либо в форме РНК, либо ДНК. Под "мутацией" подразумевают делецию, вставку или замену одного или более нуклеотидов или их комбинацию. В соответствии с настоящим изобретением мутация предпочтительно обеспечивает желаемый фенотип, например аттенуацию вирулентности, изменение клеточного тропизма или биотипа, изменение видового тропизма или экспрессию чужеродной генной кассеты. Особенно предпочтительными мутациями являются мутации, которые обеспечивают аттенуированную вирулентность. Под "аттенуацией" подразумевают, что вирус частично или полностью теряет свою способность-2 009391 пролиферировать и/или вызывать заболевание у животного, инфицированного данным вирусом. Например, аттенуированный вирус может представлять собой вирус, вовсе не способный к репликации или ограниченный одним или несколькими раундами репликации, либо ограниченный в клеточном или тканевом тропизме, когда он находится в животном, в котором может реплицироваться дикий тип патогенного варианта аттенуированного вируса. Аттенуированный вирус может иметь одну или более мутаций в гене или генах, вовлеченных в патогенность этого вируса. Такие мутации также обозначаются в данном описании как "аттенуирующая(ие) мутация(и)". Аттенуированный вирус может быть получен из патогенного вируса дикого типа УФ-облучением, химической обработкой или многократным пассированием патогенного вируса дикого типа invitro. Альтернативно, аттенуированный вирус может быть получен из патогенного вируса дикого типа путем создания специфической делеции вирусных последовательностей, известных для обеспечения вирулентности, вставки последовательностей в вирусный геном или внесения одной или более точечных мутаций в вирусный геном. Аттенуированный вирус может представлять собой вирусный изолят, выделенный из животного, происходящий из патогенного варианта вируса дикого типа в результате событий,отличных от событий, вызванных искусственными причинами, например в результате событий, которые имели место в животном-хозяине, таких как рекомбинация. Два или более живых мутантных вируса, присутствующих в вакцинных композициях по настоящему изобретению, содержат мутации, которые находятся в одном и том же геномном сайте. Под "одним и тем же геномным сайтом" подразумевают, что когда геномные нуклеотидные последовательности вирусов выравнивают, тогда мутации в вирусных геномах перекрываются друг с другом, так что нет возможности для осуществления гомологичной рекомбинации между и среди вирусных геномов с устранением данных мутаций. Другими словами, когда геномные нуклеотидные последовательности вирусов выравнивают, тогда существует по меньшей мере одна перекрывающаяся область выровненных последовательностей, в которой последовательности в выровненных вирусных геномах являются мутантными последовательностями. Существует целый ряд компьютерных программ для сравнения и выравнивания последовательностей нуклеиновых кислот, которые может использовать специалист в данной области. Последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения (например, для оптимального выравнивания со второй нуклеотидной последовательностью в первую нуклеотидную последовательность могут быть введены бреши). Например, программы NBLAST и XBLAST описаны в Altschul et al., 1990, J.BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно использовать по умолчанию параметры соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST; смотри http://www.ncbi.nlm.nih.gov). В общих чертах, концепция настоящего изобретения, т.е. включение в одну и ту же вакцинную композицию двух или более живых мутантных вируса одного и того же семейства, имеющих мутации в одном и том же геномном сайте, применима к мутантным вирусам из любого семейства, где вирусные геномы имеют достаточную идентичность последовательностей, допускающую гомологичную рекомбинацию. Было показано, что даже такая небольшая идентичность нуклеотидной последовательности, как 15 нуклеотидов, может приводить к эффективной гомологичной рекомбинации (Nagy and Bujarski, J. Virol. 69: 131-140, 1995). Настоящее изобретение особенно применимо к вирусам семейства Flaviviridae. Семейство Flaviviridae состоит из родов Pestivirus, Flavivirus и Hepacivirus. Вирионы представителей семейства Flaviviridae содержат инкапсулированные геномы в виде плюс-цепи РНК размером от приблизительно 9,5 до 12,3 т.н. Геномные РНК содержат перекрывающиеся длинные открытые рамки считывания, в результате трансляции которых образуются полипротеины, которые подвергаются процессингу клеточными и вирусными протеазами, приводящему к образованию зрелых вирусных белков. Предпочтительно, чтобы мутантные вирусы вакцинной композиции по настоящему изобретению происходили из одного и того же рода либо одного и того же или разных видов. В предпочтительном воплощении вакцинная композиция по настоящему изобретению содержит два или более живых мутантных вируса из рода Pestivirus. Род Pestivirus представлен следующими видами: вирусом бычьей вирусной диареи типа 1 (BVDV-1), вирусом бычьей вирусной диареи типа 2 (BVDV-2),вирусом классической лихорадки свиней и вирусом болезни Бордера. ORF кодирует полипротеин приблизительно из 3900 аминокислот, который подвергается котрансляционному и посттрансляционному процессингу с образованием следующих зрелых вирусных белков (от 5' к 3'): Npro, С, Ernc, E1, E2, NS2-3,NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Обычно BVDV имеет геном в форме РНК. РНК может быть обратно транскрибирована в ДНК для использования в клонировании. Таким образом, приведенные в данном описании ссылки на нуклеиновую кислоту и вирусные последовательности BVD охватывают как вирусные последовательности РНК,так и последовательности ДНК, происходящие из вирусных последовательностей РНК. Для удобства,геномные последовательности BVDV, приведенные в перечне последовательностей в данном описании ниже, отображают только последовательности ДНК. Соответствующая последовательность РНК для каждого случая является очевидной для специалиста в данной области.-3 009391 В более предпочтительном воплощении вакцинная композиция по настоящему изобретению содержит цитопатический BVDV-1 и цитопатический BVDV-2, где мутации в обоих вирусах, ассоциированные с цитопатическим биотипом, находятся в одном и том же геномном сайте, так что два мутантных вируса не могут рекомбинировать с устранением данных мутаций.BVDV-1 и BVDV-2 представляют собой два близкородственных генотипа BVDV. Нуклеотидные последовательности двух данных вирусов обладают приблизительно 70%-ной идентичностью в пределах всего генома и немного большей процентной идентичностью в пределах области NS2-3. Полагают, что процентная идентичность между вирусными геномами BVDV-1 и BVDV-2, по меньшей мере в областиNS2-3, достаточна для разрешения осуществления гомологичной рекомбинации.BVDV-1 обычно вызывают только слабую форму диареи у животных, в то время как BVDV-2 представляют собой вирусы с высокой вирулентностью, которые могут вызывать тромбоцитопению, кровотечения и острую форму заболевания с летальным исходом (Corapi et al., J. Virol. 63: 3934-3943; Bolin etal., Am. J. Vet. Res. 53: 2157-2163; Pellerin et al., Virology 203: 260-268, 1994; Ridpath et al., Virology 205: 66-74, 1994; Carman et al., J. Vet. Diagn. Invest. 10: 27-35, 1998). Эти два типа вирусов имеют различную антигенность, определяемую с использованием панели MAb (моноклональных антител) и путем перекрестной нейтрализации с применением вирусспецифичной антисыворотки животных (Corapi et al., Am. J.Vet. Res. 51: 1388-1394, 1990). Вирусы обоих генотипов могут существовать в виде одного из двух биотипов, цитопатогенного (цитопатического или cp) или нецитопатогенного (нецитопатического или ncp).Cp вирусы индуцируют цитопатические эффекты (например, клеточный лизис) в культивируемых клетках, тогда как нецитопатические вирусы не индуцируют цитопатические эффекты. Желательно приготовить вакцины, которые обеспечивают защиту как против BVDV-1, так и противBVDV-2. Однако из-за высокой степени идентичности последовательностей между этими двумя вирусами существует возможность того, что живой цитопатический BVDV-1 и живой цитопатический BVDV-2,включенные в одну и ту же вакцинную композицию, смогут рекомбинировать друг с другом в вакцинированном животном с получением нецитопатических вирусов. Рекомбинация между BVDV-1 и BVDV-2 подтверждена документально. Смотри, например, Ridpath et al., Virology 212: 259-262 (1995). Заражение плода у стельных коров ncp вирусами до развития иммунокомпетентности может привести к тому, что плод будет виремичным в течение периода созревания и после рождения теленок останется персистентно виремичным. Такой теленок может умереть от вирусной диареи в результате суперинфекции посредством cp BVDV. В связи с этим вакцинные композиции, предложенные в настоящем изобретении, которые содержат живой cp BVDV-1 и живой cp BVDV-2, имеющие мутации в одном и том же геномном сайте,особенно желательны для защиты животных как против BVDB-1, так и против BVDB-2. В одном воплощении в вакцинной композиции по настоящему изобретению могут быть использованы выделенные из животных cp изоляты BVDB. Сообщалось, что cp изоляты как BVDV-1, так иBVDB-2 доступны для специалистов в данной области, например BVDB-1 NADL (АТССVR1422 илиVR-534), штамм BVDV-253637 (депонирован с АТСС как РТА-4859) и полевые изоляты типа 2, описанные в Ridpath and Neill, J. Virol. 74: 8771-8774 (2000). Известные к настоящему времени ср изоляты типично содержат вставку гетерологичной последовательности, например, среди прочего, последовательности, кодирующей убиквитин (номер доступа в Genbank М 96687 или De Moerlooze et al., J. Gen. Virol. 74: 1433-1438 (1993, последовательности, кодирующей бычий NEDD8 (Baroth et al., выше), или последовательности, кодирующей Bos taurus DnaJ1 (как описано в примерах ниже). В другом воплощении cp BVDV получают, производя определенные изменения в геноме BVDV,например путем делеции специфических вирусных последовательностей, вставки последовательностей в специфические сайты вирусного генома, или производя одну или более замен, либо путем их комбинаций. В том случае, когда cp BVDV получают посредством вставки гетерологичной (например, чужеродной по отношению к вирусу) последовательности в специфический сайт генома, природа вводимой последовательности, как правило, не критична для настоящего изобретения. Кроме того, вставка не ограничивается каким-либо конкретным сайтом до тех пор, пока введение вставки не приводит к получению аттенуированного фенотипа. Поскольку гетерологичные вставки в cp изолятах часто обнаруживаются в области NS2-3, то область NS2-3, в особенности ее часть, окружающая предполагаемый сайт расщепления NS2-3, который соответствует, например, аминокислотным остаткам от 1679 до 1680 штаммаBVDB-1 NADL (нумерация основана на опубликованной геномной последовательности из Genbank с номером доступа М 31182, SEQ ID NO: 4), является особенно предпочтительной для введения вставок.cp BVDV-1 может быть получен путем создания определенного изменения в геноме, которое имитирует мутацию, идентифицированную в cp изоляте BVDV-2, выделенном из животного, так что эти вирусы приобретают мутации, ассоциированные с cp биотипом, в том же самом геномном сайте. Аналогично, cp BVDV-2 может быть получен путем создания определенного изменения в геноме, которое имитирует мутацию, идентифицированную в cp изоляте BVDV-1, выделенном из животного. В предпочтительном воплощении вакцинная композиция по настоящему изобретению содержитNADL (cp изолят BVDV-1) и BVDV-2 53637 (cp изолят BVDV-2), где каждый из этих двух ср изолятов содержит мутацию в одном и том же геномном сайте, приводящую к образованию цитопатического биотипа. Геномная последовательность штамма BVDV-1 NADL приведена в SEQ ID NO: 4, а штамм BVDV-4 009391 2 53637 депонирован в АТСС как РТА-4859. Оба изолята содержат вставку в области NS2-3. Аттенуированный cp BVDV-1 содержит вставку Bos taurus DnaJ1 кодирующей последовательности на 3'-конце тимидина в положении 4993 нуклеотидной последовательности (нумерация последовательности NADL),который является третьим нуклеотидом кодона, кодирующего остаток глицина в положении 1536 аминокислотной последовательности. Аттенуированный cp BVDV-2 содержит вставку Bos taurus DnaJ1 кодирующей последовательности в том же геномном сайте. Согласно настоящему изобретению cp изоляты BVDV, используемые в настоящей вакцинной композиции, были аттенуированы и поэтому являются непатогенными. Способы аттенуации известны специалистам в данной области и также изложены в данном описании ниже. В другом воплощении вакцинная композиция по настоящему изобретению содержит атттенуированный BVDV-1 и атттенуированный BVDV-2, где аттенуирующие мутации в обоих вирусах находятся в одном и том же геномном сайте, так что два мутантных вируса не могут рекомбинировать с устранением данных аттенуирующих мутаций. Аттенуированный BVDV получают УФ-облучением, химической обработкой или многократным пассированием патогенного варианта вируса in vitro. Для определения природы и геномной локализации мутаций, произведенных этими способами, можно осуществить анализ последовательности. Мутация может быть в виде делеции, вставки или замены одного или более нуклеотидов или их комбинации. Альтернативно, аттенуированный BVDV получают, производя определенные изменения в геноме BVDV,например путем делеции специфических вирусных последовательностей, вставки последовательности в специфический сайт вирусного генома, или производя одну или более замен, либо путем их комбинаций. Как описано выше, живые мутантные вирусы для использования в вакцинной композиции по настоящему изобретению могут происходить из одного и того же семейства, рода или вида, где вирусные геномы имеют идентичность последовательностей, достаточную для осуществления гомологичной рекомбинации. Дополнительные примеры комбинаций вирусов, подходящих для использования в вакцинной композиции по настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, комбинации различных типов полиовируса, комбинации множественных живых мутантных штаммов инфекционного вируса бронхита, комбинации множественных живых мутантных штаммов вируса болезни Ньюкасла(Newcastle), комбинации аденовируса собак типа 1 и аденовируса собак типа 2, комбинации вируса герпеса лошадей типа 1 и вируса герпеса лошадей типа 4, комбинации множественных живых мутантных штаммов вируса гриппа, комбинации множественных живых аттенуированных штаммов калицивируса кошек, комбинации множественных серотипов ротавируса, комбинации множественных серотипов риновируса, комбинации множественных серотипов вируса ящура, комбинации европейского и североамериканского генотипов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, комбинации стандартных и вариантных штаммов вируса инфекционного бурсита. В соответствии с настоящим изобретением, хотя вирусные частицы являются предпочтительной формой для использования в вакцинах, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие мутантные вирусы одного и того же семейства, рода или вида, также могут быть непосредственно использованы в вакцинах. Молекула ДНК или РНК может присутствовать в "голой" форме, или она может быть объединена с агентом, который облегчает клеточный захват (например, с липосомами или катионными липидами). Вакцины и процедуры вакцинации, в которых используются нуклеиновые кислоты (ДНК или мРНК), хорошо описаны в литературе, смотри, например, патенты США 5703055, 5580859, 5589466, международную патентную публикацию WO 98/35562 и Ramsay et al., 1997, Immunol. Cell Biol. 75: 360-363; Davis,1997, Cur. Opinion Biotech. 8: 635-640; Manickan et al., 1997, Critical Rev. Immunol. 17: 139-154; Robinson,1997, Vaccine 15 (8): 785-787; Robinson et al., 1996, AIDS Res. Hum. Retr. 12 (5): 455-457; Lai and Bennett,1998, Critical Rev. Immunol. 18: 449-484 и Vogel and Sarver, 1995, Clin. Microbiol Rev. 8 (3): 406-410; все они включены в данное описание посредством ссылки. В дополнение к двум или более живым мутантным вирусам одного и того же семейства, рода или вида, вакцинные композиции могут включать в себя другой антигенный компонент. Другие антигенные компоненты, подходящие для использования в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя, но не ограничиваются ими, антигены, выделенные из патогенных бактерий, таких как Mycoplasmarickettsii, Borelia spp., Ehrilichia spp., Chlamydia spp., Brucella spp., Vibrio spp., серовары Salmonella enterica,Leptospira spp.; патогенных грибов, таких как Candida; простейших, таких как Cryptosporidium parvum,Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimeria spp., Babesia spp., Giardia spp.; гельминтов, таких как Ostertagia,Cooperia, Haemonchus, Fasciola; или в форме инактивированного цельноклеточного препарата или препарата, содержащего части клеток, или в форме молекул антигенов, полученных с использованием генноинженерных методик или химического синтеза. Дополнительные антигены включают в себя патогенные вирусы, такие как вирус болезни Марека (Marek), вирус инфекционного бурсита, вирус болезни Ньюкас-5 009391 ла, вирус анемии цыплят, вирус птичьей оспы, вирус лейкоза птиц, вирус инфекционного ларинготрахеита, ретикулоэндотелиальный вирус, парвовирус собак, вирус чумы собак, вирус герпеса собак, коронавирус собак, вирус парагриппа собак типа 5, вирус панлейкопении кошек, вирус герпеса кошек, калицивирус кошек, вирус иммунодефицита кошек, вирус инфекционного перитонита кошек, вирус герпеса лошадей, вирус артериита лошадей, вирус инфекционной анемии лошадей, вирус восточного энцефалита лошадей, вирус западного энцефалита лошадей, вирус венесуэльского энцефалита лошадей, вирус западного Нила, трансмиссивный вирус гастроэнтерита, бычий коронавирус, вирусы бычьего герпеса типов 1,3, 6, вирус бычьего парагриппа, бычий респираторно-синцитиальный вирус, вирус бычьего лейкоза, вирус чумы рогатого скота, вирус ящура, вирус бешенства, вирус лихорадки африканских свиней, парвовирус свиней, PRRS-вирус, цирковирус свиней, вирус гриппа, вирус везикулярного заболевания свиней,вирус лихорадки Течена (Techen), вирус псевдобешенства, или в форме препарата модифицированных живых (аттенуированных) вирусов, препарата полностью или частично инактивированных вирусов, или в форме антигенных молекул, полученных методами генетической инженерии или химическим синтезом. При использовании дополнительных аттенуированных живых вирусов такие дополнительные вирусы предпочтительно должны происходить из семейства, отличного от того, из которого происходят два основных аттенуированных вируса, как описано выше. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложена вакцинная композиция, которая содержит аттенуированный cp BVDV-1, происходящий из штамма BVDV-1 NADL, аттенуированный cp BVDV-2, происходящий из штамма BVDV-2 53637, где каждый из двух ср изолятов содержит мутацию, ассоциированную с ср биотипом, в одном и том же геномном сайте, и по меньшей мере один(т.е. один или более) из следующих антигенных компонентов либо в инактивированной, либо в модифицированной живой форме: вирус бычьего герпеса типа 1, бычий респираторно-синцитиальный вирус,вирус парагриппа типа 3, Campylobaeter fetus, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospiraharjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona или Mannhemia haemolytica. Кроме того, вакцинные композиции по настоящему изобретению могут включать в себя один или более ветеринарно приемлемых носителей. Как использовано в данном описании, "ветеринарно приемлемый носитель" включает любые и все растворители, дисперсные среды, покрытия, адъюванты, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, противомикробные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, замедляющие адсорбцию, и т.п. Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Изотонические агенты могут включать, среди прочего,хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают, среди прочего, альбумин. Вакцинные композиции могут дополнительно содержать один или более других иммуномодулирующих агентов, таких как, например, интерлейкины, интерфероны или другие цитокины. Адъюванты, подходящие для использования в вакцинных композициях, включают, но не ограничиваются ими, RIBI-адъювантную систему (Ribi inc.), квасцы, гель гидроксида алюминия, эмульсии по типу "масло в воде", эмульсии по типу "вода в масле", такие как, например, полные и неполные адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), адъювант AMPHIGEN,сапонин, Quil А, холестерин, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA) или другие фракции сапонина, монофосфориллипид А, адъювант Avridine липидамин, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или полученный иным образом), холерный токсин или мурамилдипептид. Типично живой мутантный вирус представлен в вакцине в количестве от приблизительно 1x106 до приблизительно 1x108 вирусных частиц на дозу с ветеринарно приемлемым носителем в объеме от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 мл. Точное количество вируса в вакцинной композиции, эффективной для обеспечения защитного эффекта, может быть определено опытным ветеринаром. Когда в вакцине используют молекулу ДНК или РНК вируса, количество нуклеиновых кислот обычно должно составлять от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 5,0 мг/мл. Вакцинные композиции по настоящему изобретению можно приготовить в различных формах в зависимости от пути введения. Например, вакцинные композиции можно приготовить в форме стерильных водных растворов или дисперсий, подходящих для применения в виде инъекций, или приготовить в лиофилизированных формах, используя методики сушки сублимацией. Лиофилизированные композиции типично хранят при приблизительно 4C, и они могут быть растворены в стабилизирующем растворе,например физиологическом растворе или/и HEPES с адъювантом или без него. Вакцинные композиции по настоящему изобретению можно вводить животному для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого патогенными вариантами вирусов в вакцинных композициях. Поэтому в настоящем изобретении также предложены способы вакцинации животного против заболевания, вызываемого вирусом. При осуществлении настоящих способов вакцинную композицию по настоящему изобретению вводят животному предпочтительно через парентеральные пути, хотя другие пути введения также могут быть использованы, такие как, например, пероральное, интраназальное, внутримышечное, введение внутрь лимфатического узла, интрадермальное, внутрибрюшинное, подкожное, ректальное или вагинальное введение или комбинация путей. Для обеспечения оптимальной вакцинации могут потребовать-6 009391 ся схемы ревакцинации и может быть подобрана схема дозирования. Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими далее примерами, но никоим образом не ограничивается ими. Пример 1. Определение положения клеточной вставки в штамме BVDV2-53637. Определяли часть последовательности области NS2-3 из BVDV2-53637 с целью идентификации и картирования положения любых клеточных вставок в этой области. RT-PCR продукт размером 670 оснований амплифицировали из вирусной РНК, используя прямой праймер 53637U1 (5'-CGTCCACAGATGGTTTGGT3'; SEQ ID NO: 1) и обратный праймер 53637L (5'-GGCTATGTATTGGACGTAACCC-3'; SEQ ID NO: 2).RT-PCR продукт очищали и представляли для секвенирования (SEQ ID NO: 3). При выравнивании сBVDV1-NADL (номер доступа в Genbank M31182, SEQ ID NO: 4) было обнаружено поразительное сходство (фиг. 1). Оба вируса содержат вставку в рамке, происходящую из гена Bos taurus DnaJ1. В случаеNADL имеется вставка длиной 90 аминокислот (270 нуклеотидов), и она расположена в NADL полипротеине между глицином-1536 и пролином 1627. Эти координаты соответствуют глицину-1536 и пролину 1537 в нецитопатических штаммах BVDV1, таких как SD-1 (номер доступа в Genbank AAA42860, SEQID NO: 6), указывая на то, что геномное изменение в NADL представляет собой простую вставку без какой-либо сопутствующей делеции или удвоения фланкирующих вирусных последовательностей. Подобно BVDV1-NADL, в BVDV2-53637 имеется вставка части гена Bos taurus DnaJ1. Эта клеточная вставка длиннее (131 аминокислота, 393 нуклеотида), простирается в обоих направлениях относительно вставки в BVDV1-NADL. Локализация клеточной вставки в области NS2-3 идентична в этих двух вирусах. В противоположность BVDV1-NADL, вставка в BVDV2-53637 сопровождается делецией 5 аминокислот(15 нуклеотидов) фланкирующих вирусных последовательностей. Отсутствуют три аминокислотных остатка, фланкирующих 5'-конец вставки, и отсутствуют два аминокислотных остатка, фланкирующих 3'-конец вставки. Поскольку клеточные вставки находятся в одном и том же положении генома в двух вакцинных вирусах, они не могут подвергаться гомологичной рекомбинации, приводящей к удалению вставки и образованию нецитопатического химерного вируса. Пример 2. Попытки детектировать нецитопатические BVDV-вирусы при совместном пассировании культур BVDV1-NADL/BVDV2-53637. Для того, чтобы определить, способны ли два вакцинных вируса рекомбинировать с образованием детектируемых уровней нецитопатического BVDV, вирусы совместно культивировали на чувствительных клетках, и для детектирования возможных нецитопатических вирусов среди избытка более длинных продуктов цитопатических вирусов, по-прежнему содержащих клеточную вставку, использовали чувствительный анализ с использованием полугнездовой RT-PCR. Для повышения вероятности межтиповой рекомбинации in vitro каждый тип вируса одновременно инокулировали в конфлюэнтные клетки BK-6 в 6-луночных планшетах с множественностью заражения 2-4 (12 повторов на эксперимент). Через 2-3 суток совместного культивирования клетки дважды замораживали и оттаивали и клеточный дебрис удаляли низкоскоростным центрифугированием. Полученную надосадочную жидкость затем использовали в качестве инокулята для следующего пассажа. Общее количество серийных пассажей, проведенных в нескольких исследованиях, равнялось 7. Во время пассирования BVDV1-NADL рос более быстро, чемBVDV2-53637, но вирус типа II по-прежнему можно было определить с использованием гнездовой RTPCR после 7 пассажей. Применяли чувствительный анализ с использованием полугнездовой RT-PCR при попытке детектирования любого нецитопатического вируса. В первом раунде RT-PCR использовали прямые праймеры 53637U1 (SEQ ID NO: 1) или NADL4744BVDV1, BVDV2 и межтиповых рекомбинантов использовали все четыре комбинации прямых и обратных праймеров. Ожидаемый размер RT-PCR продукта составил 562 п.н. для цитопатического BVDV1NADL и 670 п.н. для цитопатического BVDV2-53637. Ожидалось, что нецитопатические вирусы, когда присутствуют на детектируемых уровнях, будут давать продукты первого раунда из 292 п.н. (BVDV1NADL) или 277 п.н. (BVDB2-53637). Межтиповые рекомбинанты должны иметь размер, схожий с размером одного из родителей, или должны иметь промежуточную длину, в зависимости от расположения сайта рекомбинации. Нецитопатические BVDV никогда не обнаруживались после первого раунда RT-PCR. Для повышения чувствительности детекции нецитопатического BVDV в присутствии большого избытка цитопатического BVDV перед гнездовой PCR вводили стадию переваривания рестриктазой для разрушения более длинных матриц NS2-3, происходящих из цитопатических вирусов. Была выбрана комбинация MspI и DraI на основании наблюдения, что они производят разрезание внутри вставки Bostaurus DnaJ1, но не разрезают фланкирующие вирусные последовательности. Во втором раунде (полугнездовой) PCR использовали прямые праймеры 53637U2 (5'-TGCACGATCTGTGAAGGGAAAGAA-3',SEQ ID NO: 9) или NADL4844 (5'-TGCACTGTATGTGAGGGCCGAGAG-3', SEQ ID NO: 10) в сочетании с такими же двумя обратными праймерами 53637L или NADL5305. Соответствующие комбинации праймеров использовали при попытке детектировать межтиповые рекомбинанты, а также BVDV1 и BVDV2. Ожидаемый размер RT-PCR продукта составляет 462 п.н. для цитопатического BVDV1-NADL и 570 п.н. для цитопатического BVDV2-53637 (присутствует в низких уровнях в результате неполного переварива-7 009391 ния RT-PCR продуктов цитопатического BVDV). Ожидалось, что нецитопатические вирусы, когда присутствуют на детектируемых уровнях, будут давать продукты второго раунда из 192 п.н. (BVDV1NADL) или 177 п.н. (BVDV2-53637). Межтиповые рекомбинанты должны иметь размер, схожий с размером одного из родителей, или они должны иметь промежуточную длину, в зависимости от расположения сайта рекомбинации. Нецитопатические BVDV никогда не обнаруживались после второго раунда PCR. В нескольких отдельных реакциях наблюдали аберрантные полосы разного размера. Все зоны между 100 и 300 п.н. рассматривали как потенциальные нецитопатические продукты и подвергали анализу последовательности ДНК. В каждом случае аберрантная полоса была результатом ошибочного праймирования во время PCR. Ни в одном из исследований не было обнаружено доказательства присутствия нецитопатического вируса. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Вакцинная композиция, содержащая по меньшей мере два живых мутантных вируса одного и того же семейства, где каждый вирус содержит мутацию в вирусном геноме и мутации в вирусах находятся в одном и том же геномном сайте, так что мутантные вирусы не могут рекомбинировать друг с другом с устранением данных мутаций. 2. Вакцинная композиция по п.1, где указанное семейство представляет собой семейство Flaviviridae. 3. Вакцинная композиция по п.1, где указанные два живых мутантных вируса оба происходят из рода Pestivirus. 4. Вакцинная композиция по п.1, где два мутантных живых вируса представляют собой мутантныйBVDV-1 (вирус бычьей вирусной диареи) и мутантный BVDV-2. 5. Вакцинная композиция по п.4, где два мутантных живых вируса представляют собой цитопатический (cp) BVDV-1 и cp BVDV-2 и оба являются аттенуированными. 6. Вакцинная композиция по п.5, где cp BVDV-1 и cp BVDV-2 оба содержат мутацию в областиNS2-3, что приводит к цитопатическому биотипу. 7. Вакцинная композиция по п.6, где cp BVDV-1 представляет собой BVDV-1 NADL и cp BVDV-2 представляет собой BVDV-253637. 8. Вакцинная композиция по п.4, дополнительно содержащая по меньшей мере один из следующих: вирус бычьего герпеса типа 1, бычий респираторно-синцитиальный вирус, вирус парагриппа типа 3, Campylobacterpomona или Mannhemia haemolytica. 9. Вакцинная композиция по п.1, дополнительно содержащая ветеринарно приемлемый носитель. 10. Способ приготовления безопасной вирусной вакцины, включающий селекцию или конструирование двух живых мутантных вируса одного и того же семейства, где каждый вирус содержит мутацию,и эти мутации в вирусах находятся в одном и том же геномном сайте, так что мутантные вирусы не могут подвергаться гомологичной рекомбинации с устранением данных мутаций. 11. Способ по п.10, где указанная мутация выбрана из делеции, вставки, замены или их комбинации. 12. Способ по п.10, где указанная мутация дает фенотип, выбранный из аттенуации вирулентности,изменения клеточного тропизма или биотипа, изменения видового тропизма, экспрессии чужеродной генной кассеты или их комбинации. 13. Способ по п.10, где указанное семейство представляет собой семейство Flaviviridae. 14. Способ по п.10, где указанные два живых мутантных вируса происходят из рода Pestivirus. 15. Способ по п.10, где два мутантных живых вируса представляют собой мутантный BVDV-1 и мутантный BVDV-2.