Химерный белок, способ его получения и способ лечения заболеваний с применением химерного белка

Формула / Реферат | Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Код ссылки

Номер патента: 12566

Опубликовано: 30.10.2009

Авторы: Статтел Джеймс М., Петерс Роберт Т., Мезо Адам Р., Лоу Сьюзан С., Битонти Алан Дж., Ривера Дэниел С.

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Химерный белок, содержащий первую и вторую полипептидную цепь,

(a) где указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и FcRn-связывающий сайт константного домена иммуноглобулина и

(b) где указанная вторая цепь содержит FcRn-связывающий сайт иммуноглобулина, но не содержит биологически активной молекулы или вариабельного домена иммуноглобулина,

где химерный белок обладает повышенной способностью к трансцитозу.

2. Химерный белок по п.1, где указанная вторая цепь также содержит аффинную метку.

3. Химерный белок по п.2, где аффинная метка представляет собой метку FLAG.

4. Химерный белок по п.1, где часть иммуноглобулина представляет собой Fc-фрагмент.

5. Химерный белок по п.1, где FcRn-связывающий сайт представляет собой пептидный миметик FcRn-связывающего сайта.

6. Химерный белок по п.1, где иммуноглобулин представляет собой IgG.

7. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой полипептид.

8. Химерный белок по п.6, где IgG представляет собой IgG1 или IgG2.

9. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой ингибитор слияния вируса.

10. Химерный белок по п.9, где ингибитор слияния вируса представляет собой ингибитор слияния ВИЧ.

11. Химерный белок по п.10, где ингибитор слияния ВИЧ представляет собой Т20 (SEQ ID NO:1), Т21 (SEQ ID NO:2) или Т1249 (SEQ ID NO:3).

12. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой фактор свертывания крови.

13. Химерный белок по п.12, где фактор свертывания крови представляет собой фактор VII или VIIa.

14. Химерный белок по п.12, где фактор свертывания крови представляет собой фактор IX.

15. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой малую молекулу.

16. Химерный белок по п.15, где биологически активная молекула представляет собой лейпролид.

17. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой интерферон.

18. Химерный белок по п.17, где интерферон представляет собой интерферон a и имеет линкер из 15-25 аминокислот.

19. Химерный белок по п.18, где интерферон a имеет линкер из 15-20 аминокислот.

20. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой нуклеиновую кислоту.

21. Химерный белок по п.20, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК.

22. Химерный белок по п.20, где нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловую молекулу.

23. Химерный белок по п.20, где нуклеиновая кислота представляет собой рибозим.

24. Химерный белок по п.1, где биологически активная молекула представляет собой фактор роста.

25. Химерный белок по п.24, где фактор роста представляет собой эритропоэтин.

26. Химерный белок по п.15, где низкомолекулярная молекула представляет собой антагонист VLA4.

27. Химерный белок по п.1, где указанная вторая цепь состоит из FcRn-связывающего сайта константного домена иммуноглобулина и, необязательно, аффинной метки.

28. Химерный белок по п.27, где аффинная метка представляет собой метку FLAG.

29. Химерный белок по п.1, где указанная вторая цепь состоит, по существу, из FcRn-связывающего сайта константного домена иммуноглобулина и, необязательно, аффинной метки.

30. Химерный белок по п.29, где аффинная метка представляет собой метку FLAG.

31. Химерный белок по п.1, где:

a) первая цепь содержит биологически активную молекулу, FcRn-связывающий сайт константного домена иммуноглобулина и первый домен, имеющий по меньшей мере один специфичный связывающий партнер; и

b) вторая цепь содержит FcRn-связывающий сайт константного домена иммуноглобулина, но не содержит биологически активную молекулу или вариабельный домен иммуноглобулина и дополнительно содержит специфичный связывающий партнер первого домена.

32. Химерный белок по п.31, где указанная вторая цепь также содержит аффинную метку.

33. Химерный белок по п.32, где аффинная метка представляет собой таг FLAG.

34. Химерный белок по п.31, где первый домен связывается со вторым доменом нековалентно.

35. Химерный белок по п.31, где первый домен представляет собой половину двойной спирали лейцинового зиппера и указанный второй домен представляет собой комплементарный связывающий партнер указанной двойной спирали лейцинового зиппера.

36. Фармацевтическая композиция, содержащая химерный белок по п.1 или 31 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

37. Способ получения биологически активного химерного белка по п.1, включающий:

а) трансфекцию первой клетки первой конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую полипептид, содержащий биологически активную молекулу, оперативно связанную со второй молекулой ДНК, кодирующей по крайней мере часть константного домена иммуноглобулина, содержащего FcRn-связывающий сайт;

b) трансфекцию второй клетки второй конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую полипептид, содержащий по крайней мере часть константного домена иммуноглобулина без FcRn-связывающего сайта и не содержащий биологически активную молекулу или вариабельный домен иммуноглобулина;

c) культивирование клетки стадии а) и b) в условиях, при которых экспрессируется полипептид, кодируемый указанной первой конструкцией ДНК и указанной второй конструкцией ДНК; и

d) выделение димеров стадии а) и b) из указанной трансфецированной клетки.

38. Способ лечения индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, включающий введение химерного белка по п.1 индивидууму, причем указанное заболевание или состояние излечивается.

39. Способ по п.38, где указанный химерный белок вводят внутривенно, подкожно, перорально, защечно, подъязычно, назально, парентерально, ректально, вагинально или через дыхательные пути.

40. Способ по п.38, где указанное заболевание или состояние представляет собой вирусную инфекцию.

41. Способ по п.38, где указанное заболевание или состояние представляет собой гемостатическое заболевание.

42. Способ по п.38, где указанное заболевание или состояние представляет собой гемофилию А.

43. Способ по п.38, где указанное заболевание или состояние представляет собой гемофилию В.

44. Способ по п.38, где указанное заболевание или состояние представляет собой анемию.

45. Химерный белок формулы

где X представляет собой биологически активную молекулу, L представляет собой линкер, F представляет собой FcRn-связывающий сайт константного домена иммуноглобулина, и а представляет собой любое целое число или ноль,

где химерный белок обладает повышенной способностью к трансцитозу.

46. Химерный белок по п.45, где FcRn-связывающий сайт представляет собой пептидный миметик FcRn-связывающего сайта.

47. Химерный белок по п.45, где каждый F химически ассоциирован с другим F.

48. Химерный белок по п.47, где химическая ассоциация представляет собой нековалентное взаимодействие.

49. Химерный белок по п.47, где химическая связь представляет собой ковалентную связь.

50. Химерный белок по п.47, где химерная связь представляет собой дисульфидную связь.

51. Химерный белок по п.45, где F присоединен к F посредством связи, отличной от дисульфидной связи.

52. Химерный белок по п.45, где F представляет собой константный домен иммуноглобулина IgG.

53. Химерный белок по п.45, где F представляет собой IgG1.

54. Химерный белок по п.45, где F представляет собой Fc-фрагмент.

55. Химерный белок по п.45, где X представляет собой полипептид.

56. Химерный белок по п.45, где X представляет собой лейпролид.

57. Химерный белок по п.45, где X представляет собой низкомолекулярную молекулу.

58. Химерный белок по п.57, где малая молекула представляет собой антагонист VLA4.

59. Химерный белок по п.45, где X представляет собой ингибитор слияния вируса.

60. Химерный беыюъ по п.59, где ингибитор слияния вируса представляет собой ингибитор слияния ВИЧ.

61. Химерный белок по п.60, где ингибитор слияния ВИЧ представляет собой Т20 (SEQ ID NO:1) или Т21 (SEQ ID NO:2) или Т1249 (SEQ ID NO:3).

62. Химерный белок по п.45, где X представляет собой фактор свертывания крови.

63. Химерный белок по п.62, где фактор свертывания крови представляет собой фактор VII или VIIa.

64. Химерный белок по п.62, где фактор свертывания крови представляет собой фактор IX.

65. Химерный белок по п.45, где X представляет собой нуклеиновую кислоту.

66. Химерный белок по п.65, где нуклеиновая кислота представляет собой молекулу ДНК или РНК.

67. Химерный белок по п.45, где X представляет собой фактор роста.

68. Химерный белок по п.67, где фактор роста представляет собой эритропоэтин.

69. Способ лечения заболевания или состояния у индивидуума, включающий введение химерного белка по п.45 указанному индивидууму.

70. Способ по п.69, где заболевание или состояние представляет собой вирусную инфекцию.

71. Способ по п.70, где вирусная инфекция представляет собой ВИЧ.

72. Способ по п.69, где заболевание или состояние представляет собой нарушение свертываемости крови.

73. Способ по п.72, где нарушение свертываемости крови представляет собой гемофилию А.

74. Способ по п.72, где нарушение свертываемостикрови представляет собой гемофилию В.

75. Способ по п.69, где заболевание или состояние представляет собой анемию.

76. Способ по п.69, где химерный белок вводят внутривенно, подкожно, перорально, защечно, подъязычно, назально, парентерально, ректально, вагинально или через дыхательные пути.

77. Способ по п.76, где химерный белок вводят через дыхательные пути.

78. Способ по п.76, где химерный белок вводят перорально.

79. Способ по п.69, где иммуноглобулин представляет собой IgG.

80. Способ по п.69, где часть иммуноглобулина представляет собой Fc фрагмент.

81. Химерный белок по п.1, где вторая цепь нековалентно связана с любой молекулой с молекулярной массой более 2 кДа.

82. Способ получения первой полипептидной цепи белка по п.1, включающий:

a) трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую Fc-фрагмент иммуноглобулина, и вторую последовательность ДНК, кодирующую интеин;

b) культивирование указанной клетки в условиях, при которых экспрессируется Fc-фрагмент и интеин;

c) выделение указанного Fc-фрагмента и интеина из указанный клетки;

d) химический синтез биологически активной молекулы с N-концевым Cys;

e) взаимодействие выделенного интеина Fc стадии с) с MESNA с получением С-концевого тиоэфира;

f) взаимодействие биологически активной молекулы стадии d) с Fc стадии е) с получением химерного белка, содержащего Fc, связанного с биологически активной молекулой.

83. Способ получения первой полипептидной цепи белка по п.1, включающий:

а) трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую Fc-фрагмент иммуноглобулина, и вторую последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, где указанный сигнальный пептид расположен рядом с цистеином Fc-фрагмента;

b) культивирование указанной клетки в условиях, при которых экспрессируется Fc-фрагмент и сигнальный пептид и Fc-фрагмент секретируется из клетки без сигнального пептида, но с N-концевым цистеином;

c) выделение димеров указанного Fc-фрагмента с N-концевым цистеином из указанной клетки;

d) химический синтез биологически активной молекулы, имеющей тиоэфир;

e) взаимодействие биологически активной молекулы стадии d) с Fc стадии с) в условиях, при которых биологически активная молекула может связываться с одной цепью димера стадии с) с получением химерного белка, содержащего Fc, связанного с биологически активной молекулой.

84. Способ по п.83, где тиоэфир представляет собой С-концевой тиоэфир.

85. Способ получения первой полипептидной цепи белка по п.1, включающий:

a) трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую Fc-фрагмент иммуноглобулина, и вторую последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, где указанный сигнальный пептид расположен рядом с цистеином Fc-фрагмента;

b) культивирование указанной клетки в таких условиях, при которых экспрессируется Fc-фрагмент и сигнальный пептид, связанные вместе, и указанный сигнальный пептид отщепляется от Fc-фрагмента в клетке в первом положении, расположенном рядом с цистеином, или во втором положении, расположенном рядом с валином;

c) выделение димеров указанных Fc-фрагментов с двумя N-концевыми цистеинами или двумя N-концевыми валинами или N-концевым цистеином и N-концевым валином из указанной клетки;

d) химический синтез биологически активной молекулы с тиоэфиром;

e) взаимодействие биологически активной молекулы стадии d) с димерами стадии с) с получением химерного белка, содержащего первую цепь, включающую в себя Fc, связанный с биологически активной молекулой, и вторую цепь, включающую в себя Fc, не связанный ни с какой биологически активной молекулой или вариабельной областью иммуноглобулина.

86. Способ по п.85, где тиоэфир представляет собой С-концевой тиоэфир.

87. Химерный белок по п.19, где линкер представляет собой (GGGGS)₃.

88. Способ выделения химерного белка по п.1 из смеси, где смесь содержит:

a) гибрид мономер-димер, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, где первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина;

b) димер, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, где первая и вторая цепи содержат биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина; и

c) часть константной области иммуноглобулина; где указанный способ предусматривает:

i) приведение в контакт смеси с лигандом-красителем, связанным с твердой подложкой в подходящих условиях, при которых гибрид мономер-димер и димер связываются с лигандом-красителем;

ii) удаление несвязанной части константной области иммуноглобулина;

iii) изменение подходящих условий i) для того, чтобы связь между гибридом мономер-димер и лигандом-красителем, связанным с твердой подложкой, разрывалась;

iv) выделение гибрида мономер-димер.

89. Способ по п.88, где лигандом-красителем является молекула биомиметика.

90. Способ по п.88, где лиганд-краситель выбран из Mimetic Red 1Ф, Mimetic Red 2Ф, Mimetic Orange 1Ф, Mimetic Orange 2Ф, Mimetic Orange 3Ф, Mimetic Yellow 1Ф, Mimetic Yellow 2Ф, Mimetic Green 1Ф, Mimetic Blue 1Ф и Mimetic Blue 2Ф.

91. Способ по п.90, где лигандом-красителем является Mimetic Red 2Ф.

92. Способ по п.90, где лигандом-красителем является Mimetic Green 1Ф.

93. Способ по п.88, где подходящие условия включают буфер с рН в области от 4-9 включительно.

94. Способ по п.93, где изменение подходящих условий заключается в добавлении по меньшей мере одной соли к буферу в концентрации, достаточной для разрушения связи гибрида мономер-димер с лигандом-красителем с выделением, таким образом, гибрида мономер-димер.

95. Способ по п.94, где по крайней мере одна соль представляет собой NaCl.

96. Способ по п.93, где рН буфера составляет 8.

97. Способ по п.96, где концентрация соли составляет 400 мМ, а химерный белок содержит Еро.

98. Способ по п.94, также включающий добавление высококонцентрированной соли, сравнимощ ё концентрацией соли, которая разрушает связь гибрида мономер-димер с лигандом-красителем, так что более высокая концентрация соли разрушает связь димера с лигандом-красителем с выделением, таким образом, димера.

99. Химерный белок по п.17, где биологически активная молекула представляет собой интерферон a.

100. Химерный белок по п.17, где биологически активная молекула представляет собой интерферон b.

101. Химерный белок по п.45, где X представляет собой ЕРО, L представляет собой линкер из восьми аминокислот с аминокислотной последовательностью EFAGAAAV и F представляет собой FcRn-связывающий сайт с заменой аспарагина на аланин в положении 297.

102. Химерный белок по п.101, также содержащий аффинную метку.

103. Химерный белок по п.45, где sX представляет собой IFNb, L представляет собой линкер из восьми аминокислот с аминокислотной последовательностью EFAGAAAV и F представляет собой FcRn-связывающий сайт с заменой аспарагина на аланин в положении 297.

104. Химерный белок по п.103, также содержащий аффинную метку.

105. Химерный белок по п.45, где X представляет собой фактор IX, L представляет собой линкер из восьми аминокислот с аминокислотной последовательностью EFAGAAAV и F представляет собой FcRn-связывающий сайт с заменой аспарагина на аланин в положении 297.

106. Химерный белок по п.105, также содержащий аффинную метку.

107. Химерный белок по п.12, где фактор свертываемости крови представляет собой фактор VIII, VIIIa или их биологически активный фрагмент.

108. Химерный белок по п.62, где фактор свертываемости крови представляет собой фактор VIII, VIIIa или их биологически активный фрагмент.

Текст

Смотреть все

012566 Данная заявка претендует на приоритет по предварительной заявке на выдачу патента США 60/469600, поданной 6 мая 2003 года, предварительной заявке на выдачу патента США 60/487964,поданной 17 июля 2003 года, и предварительной заявке на выдачу патента США 60/539207, поданной 26 января 2004 года, все указанные заявки включены в виде ссылки в полном объеме. Непредварительная заявка на выдачу патента США, озаглавленная Methods for Chemically Synthesizing Immunoglobulin Chimeric Proteins, поданная 6 мая 2004 года, включена в виде ссылки. Область техники, к которой относится изобретение Изобретение в общем относится к терапевтическим химерным белкам, состоящим из двух полипептидных цепей, в которых первая цепь состоит из терапевтической биологически активной молекулы, а вторая цепь не состоит из терапевтической биологически активной молекулы первой цепи. Более конкретно изобретение относится к химерным белкам, состоящим из двух полипептидных цепей, в которых обе цепи состоят по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина, где первая цепь модифицирована так, чтобы она, кроме того, содержала биологически активную молекулу, а вторая цепь не модифицирована таким образом. Следовательно, изобретение относится к химерному белку, который является гибридом мономер-димер, т.е. химерному белку, имеющему димерный аспект и мономерный аспект, при этом димерный аспект относится к тому факту, что он состоит из двух полипептидных цепей,каждая из которых состоит из части константной области иммуноглобулина, а мономерный аспект относится к тому факту, что только одна из двух цепей состоит из терапевтической биологически активной молекулы. Фиг. 1 иллюстрирует один пример гибрида мономер-димер, в котором биологически активной молекулой является эритропоэтин (ЕРО), а часть константной области иммуноглобулина представляет собой Fc-область IgG. Уровень техники Иммуноглобулины состоят из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых цепей и двух легких цепей, которые связаны посредством дисульфидных связей с образованием тетрамеров. Каждая цепь,кроме того, состоит из одной вариабельной области одной константной области. Вариабельные области опосредуют узнавание и связывание антигена, тогда как константные области, в частности константные области тяжелых цепей, опосредуют множество эффекторных функций, например связывание комплемента и связывание Fc-рецептора (смотрите, например, патенты США 6086875, 5624821, 5116964). Константная область, кроме того, состоит из доменов, называемых СН-доменами (константная тяжелая) (CH1, CH2 и т.д.). В зависимости от изотипа (например, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) константная область может состоять из трех или четырех СН-доменов. Константные области некоторых изотипов (например, IgG) также содержат шарнирную область, Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing,N. Y., N. Y. Создание химерных белков, состоящих из константных областей иммуноглобулина, связанных с представляющей интерес частью или ее фрагментом, описано (смотрите, например, патенты США 5480981 и 5808029; Gascoigne et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936; Capon et al. 1989, Nature 337:525; Traunecker et al. 1989, Nature 339:68; Zettmeissl et al. 1990, DNA Cell Biol. USA 9:347; Byrn et al. 1990, Nature. 344:667; Watson et al. 1990, J. Cell. Biol. 110:2221; Watson et al. 1991, Nature 349:164; AruffoUSA 89:10360; Ridgway and Gorman, 1991, J. Cell. Biol. 115, Abstract No. 1448; Zheng et al. 1995, J. Immun. 154:5590). Указанные молекулы обычно обладают как биологической активностью, ассоциированной со связанной представляющей интерес молекулой, так и эффекторной функцией или некоторыми другими требуемыми характеристиками, связанными с константной областью иммуноглобулина (например, биологической стабильностью, клеточной секрецией).Fc-часть константной области иммуноглобулина в зависимости от изотипа иммуноглобулина, может включать в себя домены СН 2, СН 3 и СН 4, а также шарнирную область. Химерные белки, содержащие Fc-часть иммуноглобулина, приобретают несколько требуемых свойств химерного белка, включая повышенную стабильность, увеличенное время полужизни в сыворотке (смотрите Capon et al. 1989, Nature 337: 525), а также связывание с Fc-рецепторами, такими как неонатальный Fc-рецептор (FcRn) (патенты США 6086875, 6485726, 6030613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).FcRn является активным в эпителиальной ткани взрослых особей и экспрессируется в просвете кишечника, легочных дыхательных путях, назальных поверхностях, вагинальных поверхностях и ректальных поверхностях (патент США 6485726). Химерные белки, состоящие из FcRn-связывающих партнеров (например, IgG, Fc-фрагментов), могут быть эффективно перемещены через эпителиальные барьеры посредством FcRn, таким образом обеспечивая неинвазивные способы системного введения требуемой терапевтической молекулы. Кроме того, химерные белки, содержащие FcRn-связывающий партнер,подвергаются эндоцитозу клетками, экспрессирующими FcRn. Но вместо того, чтобы стать мишенью для разрушения, указанные химерные белки снова возвращаются в циркуляцию, таким образом увеличивая время полужизни указанных белков in vivo.-1 012566 Части константных областей иммуноглобулина, например, FcRn-связывающие партнеры, обычно связаны посредством дисульфидных связей и других неспецифичных взаимодействий друг с другом,образуя димеры и мультимеры более высокого порядка. Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии того, что трансцитоз химерных белков, состоящих из FcRn-связывающих партнеров, по-видимому, ограничен молекулярной массой химерного белка, при этом формы с более высокой молекулярной массой транспортируются менее эффективно. Химерные белки, состоящие из биологически активных молекул, после введения обычно будут взаимодействовать с молекулой-мишенью или клеткой. Настоящее изобретение, кроме того, частично основано на неожиданном открытии того, что гибриды мономер-димер с одной биологически активной молекулой, но с двумя частями константной области иммуноглобулина, например двумя FcRnсвязывающими партнерами, функционируют и могут транспортироваться более эффективно, чем гомодимеры, также называемые в данном описании просто димеры, или мультимеры более высокого порядка с двумя или более копиями биологически активной молекулы. Отчасти это является следствием того факта, что химерные белки, состоящие из двух или более биологически активных молекул, которые существуют в виде димеров и мультимеров более высокого порядка, могут иметь стерические препятствия для взаимодействия с молекулой-мишенью или клеткой вследствие присутствия двух или более биологически активных молекул в тесном соседстве друг с другом, и что биологическая молекула может обладать высокой аффинностью к себе самой. Соответственно, один аспект изобретения относится к химерным белкам, состоящим из биологически активной молекулы, которая транспортируется через эпителиальный барьер. Дополнительный аспект изобретения относится к химерным белкам, состоящим по меньшей мере из одной биологически активной молекулы, которая способна взаимодействовать со своей молекулой-мишенью или клеткой с небольшим стерическим препятствием или самоагрегацией или в отсутствие таковых. Аспекты изобретения относятся к химерным белкам, содержащим первую и вторую полипептидные цепи, при этом первая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, где часть константной области иммуноглобулина была модифицирована так, чтобы она включала в себя биологически активную молекулу, а вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, где часть константной области иммуноглобулина не была модифицирована таким образом, чтобы она содержала биологически активную молекулу первой цепи. Сущность изобретения Изобретение относится к химерному белку, содержащему одну биологически активную молекулу и две молекулы по меньшей мере части константной области иммуноглобулина. Химерный белок способен взаимодействовать с молекулой-мишенью или клеткой с меньшим стерическим препятствием по сравнению с химерным белком, состоящим по меньшей мере из двух биологически активных молекул и по меньшей мере части двух константных областей иммуноглобулина. Изобретение также относится к химерному белку, содержащему по меньшей мере одну биологически активную молекулу и две молекулы по меньшей мере части константной области иммуноглобулина, который транспортируется через эпителиальный барьер более эффективно, чем соответствующий гомодимер, т.е. в котором обе цепи связаны с одной и той же биологически активной молекулой. Таким образом изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, связанные вместе, где указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, а указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, но не содержит вариабельной области иммуноглобулина и не содержит какой-либо связанной биологически активной молекулы. Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи,связанные вместе, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без вариабельной области иммуноглобулина или какой-либо биологически активной молекулы и где указанная вторая цепь нековалентно связана с любой молекулой, имеющей молекулярную массу более 1, 2, 5, 10 или 20 кДа. В одном варианте вторая цепь нековалентно связана с любой молекулой, имеющей молекулярную массу более 0-2 кДа. В одном варианте вторая цепь нековалентно связана с любой молекулой, имеющей молекулярную массу более 510 кДа. В одном варианте вторая цепь нековалентно связана с любой молекулой, имеющей молекулярную массу более 15-20 кДа. Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи,связанные вместе, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, нековалентно связанную с любой другой молекулой, за исключением части иммуноглобулина указанной первой полипептидной цепи. Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи,связанные вместе, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и указанная вторая цепь состоит по мень-2 012566 шей мере из части константной области иммуноглобулина и необязательно аффинной метки. Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи,связанные вместе, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и указанная вторая цепь, по существу, состоит по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина и необязательно аффинной метки. Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи,связанные вместе, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без вариабельной области иммуноглобулина или какой-либо биологически активной молекулы и необязательно молекулу с молекулярной массой менее 10, 5, 2 или 1 кДа. В одном варианте вторая цепь содержит молекулу менее 15-20 кДа. В одном варианте вторая цепь содержит молекулу менее 5-10 кДа. В одном варианте вторая цепь содержит молекулу менее 1-2 кДа. Изобретение относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, в котором указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере первый домен, при этом указанный первый домен имеет по меньшей мере один специфичный связывающий партнер, и в котором указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере второй домен, где указанный второй домен является специфичным партнером при связывании с указанным первым доменом, без какой-либо вариабельной области иммуноглобулина или биологически активной молекулы. Изобретение относится к способу получения химерного белка, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь неодинаковы,при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки первой конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую первую полипептидную цепь, содержащую биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и необязательно линкер, и второй конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую вторую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без какой-либо биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина и необязательно линкер, культивирование клеток в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая первой конструкцией ДНК, и экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая второй конструкцией ДНК, и выделение гибридов мономер-димер, состоящих из полипептидной цепи, кодируемой первой конструкцией ДНК, и полипептидной цепи, кодируемой второй конструкцией ДНК. Изобретение относится к способу получения химерного белка, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь неодинаковы и в котором указанная первая полипептидная цепь содержит биологически активную молекулу, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере первый домен, при этом указанный первый домен имеет по меньшей мере один специфичный связывающий партнер, и в котором указанная вторая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и второй домен, где указанный второй домен является специфичным партнером при связывании с указанным первым доменом, без какой-либо биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки первой конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую указанную первую полипептидную цепь, и второй конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую указанную вторую полипептидную цепь, культивирование клеток в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь,кодируемая первой конструкцией ДНК, и экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая второй конструкцией ДНК, и выделение гибридов мономер-димер, состоящих из полипептидной цепи, кодируемой первой конструкцией ДНК, и полипептидной цепи, кодируемой второй конструкцией ДНК. Изобретение относится к способу получения химерного белка согласно изобретению, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки первой конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую первую полипептидную цепь, содержащую биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и необязательно линкер, культивирование клетки в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая первой конструкцией ДНК, выделение полипептидной цепи кодируемой первой конструкцией ДНК, и трансфекцию клетки второй конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую вторую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без какой-либо биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина, культивирование клетки в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая второй конструкцией ДНК, выделение полипептидной цепи, кодируемой второй конструкцией ДНК, объединение полипептидной цепи, кодируемой первой конструкцией ДНК, и полипептидной цепи, кодируемой второй конструкцией ДНК, в таких условиях, при которых образуются гибриды мономер-димер, содержащие поли-3 012566 пептидную цепь, кодируемую первой конструкцией ДНК, полипептидную цепь, кодируемую второй конструкцией ДНК, и выделение указанных гибридов мономер-димер. Изобретение относится к способу получения химерного белка, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь не являются одинаковыми, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, культивирование клеток в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая конструкцией ДНК, с N-концевым цистеином, так что образуются димеры полипептидной цепи, выделение димеров, состоящих из двух копий полипептидной цепи,кодируемой конструкцией ДНК, и химическое взаимодействие выделенных димеров с биологически активной молекулой, при этом указанная биологически активная молекула имеет сложный тиоэфир на Сконце, в таких условиях, при которых биологически активная молекула взаимодействует преимущественно только с одной полипептидной цепью димера, тем самым образуя гибрид мономер-димер. Изобретение относится к способу получения химерного белка, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь не являются одинаковыми, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, культивирование клеток в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая конструкцией ДНК, с N-концевым цистеином, так что образуются димеры полипептидных цепей, и выделение димеров, содержащих две копии полипептидной цепи,кодируемой конструкцией ДНК, и химическое взаимодействие выделенных димеров с биологически активной молекулой, при этом указанная биологически активная молекула имеет сложный тиоэфир на Сконце, так что биологически активная молекула связывается с каждой цепью димера, денатурацию димера, состоящего из части иммуноглобулина, связанного с биологически активной молекулой с образованием мономерных цепей, объединение мономерных цепей с полипептидной цепью, содержащей по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, не имеющей связанной с ней биологически активной молекулы, с образованием гибридов мономер-димер и выделение гибридов мономер-димер. Изобретение относится к способу получения химерного белка, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь не являются одинаковыми, при этом указанный способ включает в себя трансфекцию клетки конструкцией ДНК, содержащей молекулу ДНК, кодирующую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, культивирование клеток в таких условиях, при которых экспрессируется полипептидная цепь, кодируемая конструкцией ДНК, в виде смеси двух полипептидных цепей,где смесь содержит полипептид с N-концевым цистеином и полипептид с цистеином вблизи N-конца,выделение димеров, состоящих из смеси полипептидных цепей, кодируемых конструкцией ДНК, и химическое взаимодействие выделенных димеров с биологически активной молекулой, при этом указанная биологически активная молекула имеет активный сложный тиоэфир, так что образуются, по меньшей мере, несколько гибридов мономер-димер, и выделение гибрида мономер-димер из указанной смеси. Изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, включающему в себя введение химерного белка согласно изобретению, благодаря чему лечат заболевание или состояние. Дополнительные объекты и преимущества изобретения будут указаны частично в описании, которое следует далее, и частично будут очевидными, исходя из описания, или могут быть исследованы при практическом осуществлении изобретения. Объекты и преимущества изобретения будут понятны и достигнуты с помощью элементов и комбинаций, подробно указанных в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что и приведенное выше общее описание и следующее далее подробное описание являются только примерными и пояснительными и не ограничивают изобретение, которое заявлено. Краткое описание чертежей Фиг. 1 является схематичной диаграммой, сравнивающей структуру гомодимера EPO-Fc или димера и структуру гибрида мономер-димер Epo-Fc. На фиг. 2 а показана аминокислотная последовательность химерного белка фактор VII-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой, и пропептид(жирным шрифтом), который узнается витамин K-зависимой -карбоксилазой, которая модифицирует фактор VII с достижением полной активности. Последовательность впоследствии расщепляется РАСЕ с получением фактор VII-Fc. На фиг. 2b показана аминокислотная последовательность химерного белка фактор IX-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой, и пропептид(жирным шрифтом), который узнается витамин K-зависимой -карбоксилазой, которая модифицирует фактор IX, с достижением полной активности. Последовательность впоследствии расщепляется РАСЕ с получением фактор IX-Fc. На фиг. 2 с показана аминокислотная последовательность химерного белка IFN-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в-4 012566 результате зрелого IFN-Fc. На фиг. 2d показана аминокислотная последовательность химерного белка IFN-Fcлинкер. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого IFN-Fcлинкер. На фиг. 2 е показана аминокислотная последовательность химерного белка Flag-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого Flag-Fc. На фиг. 2f показана аминокислотная последовательность химерного белка Epo-CCA-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого Epo-CCA-Fc. Также жирным шрифтом показан кислый двухспиральный домен. На фиг. 2g показана аминокислотная последовательность химерного белка CCB-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого CCB-Fc. Также жирным шрифтом показан основной двухспиральный домен. На фиг. 2h показана аминокислотная последовательность химерного белка Cys-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого Cys-Fc. Когда данная последовательность образуется в клетках СНО, некоторый процент молекул неправильно расщепляется сигнальной пептидазой, так что слева от N-конца имеются две дополнительные аминокислоты, тем самым препятствуя связыванию биологически активной молекулы с С-концевым тиоэфиром (например, посредством простого лигирования). Когда указанные неправильно расщепленные формы димеризуются с правильно расщепленным Cys-Fc и затем подвергаются взаимодействию с биологически активными молекулами с С-концевыми тиоэфирами, образуются гибриды мономер-димер гибриды мономер-димер. На фиг. 2i показана аминокислотная последовательность химерного белка IFN-GS15-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате зрелого IFN-GS15-Fc. На фиг. 2j показана аминокислотная последовательность химерного белка Epo-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой с образованием в результате Epo-Fc. Также жирным шрифтом показан 8-аминокислотный линкер. На фиг. 3 а показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка фактор VII-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут) и пропептид (жирным шрифтом), который узнается витамин K-зависимой -карбоксилазой, которая модифицирует фактор VII с достижением полной активности. Транслируемая последовательность затем расщепляется РАСЕ с получением зрелого фактор VII-Fc. На фиг. 3b показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка фактор IX-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут) и пропептид (жирным шрифтом), который узнается витамин K-зависимой -карбоксилазой, которая модифицирует фактор IX с достижением полной активности. Транслируемая последовательность затем расщепляется РАСЕ с получением зрелого фактор IX-Fc. На фиг. 3 с показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка IFN-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляцией с образованием в результате зрелого IFN-Fc. На фиг. 3d показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка IFN-Fcлинкер. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого IFN-Fc -линкер. На фиг. 3 е показана аминокислотная последовательность химерного белка Flag-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого Flag-Fc. На фиг. 3f показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка Epo-CCA-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого Epo-CCA-Fc. Также жирным шрифтом показан кислый двухспиральный домен. На фиг. 3g показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка CCB-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого CCB-Fc. Также жирным шрифтом показан основной двухспиральный домен. На фиг. 3h показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка Cys-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого Cys-Fc. На фиг. 3i показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка IFN-GS15-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого IFN-GS15-Fc.-5 012566 На фиг. 3j показана последовательность нуклеиновой кислоты химерного белка Epo-Fc. В последовательность включен сигнальный пептид (подчеркнут), который отщепляется клеткой после трансляции с образованием в результате зрелого Epo-Fc. Также жирным шрифтом показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 8-аминокислотный линкер. Фиг. 4 показывает пути образования гибридов мономер-димер посредством обычного лигирования. На фиг. 5 а показана аминокислотная последовательность Fc MESNA (SEQ ID NO:4). На фиг. 5b показана последовательность ДНК Fc MESNA (SEQ ID NO:5). На фиг. 6 приведено сравнение противовирусной активности гомодимера IFN (т.е. состоящего из 2 молекул IFN) с активностью гибрида мономер IFN-димер (т.е. состоящего из 1 молекулы IFN). На фиг. 7 приведено сравнение свертывающей активности химерного гибрида мономер-димер фактор VIIa-Fc (одна молекула фактора VII) и химерного гомодимера фактор VIIa-Fc (две молекулы фактораVII). На фиг. 8 приведено сравнение перорального дозирования у новорожденных крыс химерного гибрида мономер-димер фактор VIIa-Fc (одна молекула фактора VII) и химерного гомодимера фактор VIIaFc (две молекулы фактора VII). На фиг. 9 приведено сравнение перорального дозирования у новорожденных крыс химерного гибрида мономер-димер фактор IX-Fc (одна молекула фактора IX) и химерного гомодимера. На фиг. 10 показано временное исследование, сравнивающее химерный гибрид мономер-димер фактор IX-Fc (одна молекула фактора IX), вводимого перорально новорожденным крысам, с вводимым перорально химерным гомодимером. Фиг. 11 показывает фармакокинетику димера Epo-Fc по сравнению с гибридом мономер-димерEpo-Fc у макак-крабоедов после однократной легочной дозы. На фиг. 12 приведено сравнение сывороточной концентрации у обезьян подкожно введенного гибрида мономер-димер Epo-Fc и подкожно введенного Aranesp (дарбепоэтин альфа). На фиг. 13 приведено сравнение сывороточной концентрации у обезьян внутривенно введенного гибрида мономер-димер Epo-Fc и внутривенно введенного Aranesp (дарбепоэтин альфа) и Epogen(эпоэтин альфа). На фиг. 14 показана кривая для колонки Mimetic Red 2 (ProMetic LifeSciences, Inc., Wayne, NJ) иSDS-ПААГ-фракций с колонки, содержащих гибрид мономер-димер EpoFc, димер EpoFc и Fc. Гидрид мономер-димер EpoFc обнаружен во фракциях 11, 12, 13 и 14. Димер EpoFc обнаружен во фракции 18. Fc обнаружен во фракциях 1/2. На фиг. 15 показана фармакокинетика IFNFc с 8-аминокислотным линкером у макак-крабоедов после однократной легочной дозы. На фиг. 16 показан стимуляция неоптерина в ответ на гомодимер IFN-Fc и гибрид мономер-димерIFN-Fc N297A у макак-крабоедов. На фиг. 17 а показан нуклеотидная последовательность интерферон -Fc. На фиг. 17b показана аминокислотная последовательность интерферон -Fc. На фиг. 18 показана аминокислотная последовательность Т 20(а); Т 21(b) и Т 1249(с). Описание вариантов А. Определения Аффинная метка в используемом в данном описании смысле означает молекулу, связанную со второй представляющей интерес молекулой, способную взаимодействовать со связывающим партнером в целях выделения или идентификации указанной второй представляющей интерес молекулы. Аналоги химерных белков согласно изобретению или белки или пептиды, по существу, идентичные химерным белкам согласно изобретению, в используемом в данном описании смысле означают, что соответствующая аминокислотная последовательность белка или пептида по меньшей мере на 70, 75, 80,85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентична данной последовательности. В качестве примера такие последовательности могут быть вариантами, полученными из разных видов, или они могут быть получены из данной последовательности посредством укорочения, делеции, замены или добавления аминокислот. Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием стандартных алгоритмов выравнивания, например посредством Basic Local Alignment ToolMol. Biol., 48: 444-453; алгоритма Meyers et al. 1988, Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17; или Tatusova et al. 1999, FEMS Microbiol. Lett., 174: 247-250, и т.д. Такие алгоритмы включены в программы BLASTN,BLASTP и BLAST 2 Sequences (см. www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). При использовании таких программ можно использовать параметры по умолчанию. Например, для нуклеотидных последовательностей можно использовать следующие установки в случае BLAST 2 Sequences: программа BLASTN, награда за совпадение 2, штраф за несовпадение -2, штрафы за открытие пробела и удлинение пробела 5 и 2, соответственно, gap xdropoff 50, ожидание 10, размер слова 11, фильтр ON. Для аминокислотных последовательностей можно использовать следующие установки в случае BLAST 2 Sequences: программаBLASTP, матрица BLOSUM62, штрафы за открытие пробела и удлинение пробела 11 и 1, соответствен-6 012566 но, gap xdropoff 50, ожидание 10, размер слова 3, фильтр ON. Биодоступность в используемом в данном описании смысле означает степень и скорость, с которой вещество поглощается в живой системе или становится доступным в месте физиологической активности. Биологически активная молекула в используемом в данном описании смысле означает неиммуноглобулиновую молекулу или ее фрагмент, обеспечивающую лечение заболевания или состояния или локализацию или направление молекулы к месту заболевания или состояния в организме посредством осуществления функции, или действия, или стимулирования, или ответа на функцию, действие или реакцию в биологическом контексте (например, в организме, клетке или ее модели in vitro). Биологически активные молекулы могут включать в себя по меньшей мере оно из следующих веществ: полипептиды,нуклеиновые кислоты, малые молекулы, такие как малые органические или неорганические молекулы. Химерный белок в используемом в данном описании смысле относится к любому белку, состоящему из первой аминокислотной последовательности, полученной из первого источника, связанной ковалентно или нековалентно со второй аминокислотной последовательностью, полученной из второго источника, где первый и второй источники не являются одинаковыми. Первый источник и второй источник, которые не являются одинаковыми, могут включать два разных биологических объекта или два разных белка из одного и того же биологического объекта или биологический объект и небиологический объект. Химерный белок может включать, например, белок, полученный по меньшей мере из 2 разных биологических источников. Биологический источник может включать любую несинтетически полученную последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность (например,последовательность геномной или кДНК, плазмидный или вирусный вектор, нативный вирион или мутант или аналог, которые описаны далее в данном описании, любого из указанных выше). Синтетический источник может включать последовательность белка или нуклеиновой кислоты, полученную химически,а не в биологической системе (например, твердофазный синтез аминокислотных последовательностей). Химерный белок также может включать белок, полученный по меньшей мере из 2 разных синтетических источников, или белок, полученный по меньшей мере из одного биологического источника и по меньшей мере из одного синтетического источника. Химерный белок также может содержать первую аминокислотную последовательность, полученную из первого источника, ковалентно или нековалентно связанную с нуклеиновой кислотой, полученной из любого источника, или малой органической или неорганической молекулой, полученной из любого источника. Химерный белок может содержать молекулу линкера между первой и второй аминокислотными последовательностями, или между первой аминокислотной последовательностью и нуклеиновой кислотой, или между первой аминокислотной последовательностью и малой органической или неорганической молекулой. Фактор свертывания в используемом в данном описании смысле означает любую молекулу или ее аналог природного происхождения или полученную рекомбинантно, которая предотвращает или снижает продолжительность эпизода кровотечения у субъекта с гемостатическим нарушением. Другими словами фактор свертывания означает любую молекулу, обладающую свертывающей активностью. Свертывающая активность в используемом в данном описании смысле означает способность принимать участие в каскаде биохимических реакций, который завершается образованием сгустка фибрина,и/или уменьшать тяжесть, продолжительность или частоту геморрагии или эпизода кровотечения. Димер в используемом в данном описании смысле относится к химерному белку, содержащему первую и вторую полипептидные цепи, в котором и первая, и вторая цепи содержат биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина. Гомодимер относится к димеру, в котором обе биологически активные молекулы являются одной и той же молекулой. Димерно связанный гибрид мономер-димер относится к химерному белку, состоящему по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина, например фрагмента Fc иммуноглобулина, биологически активной молекулы и линкера, который связывает их вместе, так что одна биологически активная молекула связана с 2 полипептидными цепями, каждая из которых содержит часть константной области иммуноглобулина. На фиг. 4 показан пример димерно связанного гибрида мономер-димер. Конструкция ДНК в используемом в данном описании смысле означает молекулу ДНК или клон такой молекулы либо однонитевой, либо двунитевой, которая была модифицирована в результате вмешательства человека так, что она содержит участки ДНК, объединенные таким образом, чтобы они как целое не могли бы существовать в природе в ином случае. Конструкции ДНК содержат информацию,необходимую для управления экспрессией представляющих интерес полипептидов. Конструкции ДНК могут содержать промоторы, энхансеры и терминаторы транскрипции. Конструкции ДНК, содержащие информацию, необходимую для управления секрецией полипептида, также буду содержать по меньшей мере одну сигнальную последовательность секреции. Домен в используемом в данном описании смысле означает область полипептида (включая белки, в том виде, как данный термин определен), имеющую некоторое отличительное физическое свойство или роль, включая, например, структуру с независимой укладкой, состоящую из участка полипептидной цепи. Домен может содержать последовательность с отличительным физическим признаком полипептида или может содержать фрагмент с физическим признаком, который сохраняет свои связывающие свойства (т.е. он может связываться со вторым доменом). Домен может быть связан с другим доменом. Други-7 012566 ми словами, первый домен может в естественных условиях связываться со вторым доменом. Фрагмент в используемом в данном описании смысле относится к пептиду или полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность по меньшей мере из 2 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 5 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 следующих друг за другом аминокислотных остатков или по меньшей мере 200 следующих друг за другом аминокислотных остатков или любую делецию или укорочение белка, пептида или полипептида. Гемостаз в используемом в данном описании смысле означает остановку кровотечения или геморрагии или остановку потока крови через кровеносный сосуд или часть тела. Гемостатическое расстройство в используемом в данном описании смысле означает генетически наследуемое или приобретенное состояние, характеризуемое тенденцией к геморрагии, либо спонтанно либо в результате травмы, или неспособностью образовывать сгусток фибрина. Связанная в используемом в данном описании смысле относится к первой последовательности нуклеиновой кислоты, ковалентно связанной со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Первая последовательность нуклеиновой кислоты может быть непосредственно связана или помещена рядом со второй последовательностью нуклеиновой кислоты или, альтернативно, промежуточная последовательность может ковалентно связывать первую последовательность со второй последовательностью. Связанная в используемом в данном описании смысле также может относиться к первой аминокислотной последовательности, ковалентно или нековалентно связанной со второй аминокислотной последовательностью. Первая аминокислотная последовательность может быть непосредственно связана или помещена рядом со второй аминокислотной последовательностью или, альтернативно, промежуточная последовательность может ковалентно связывать первую аминокислотную последовательность со второй аминокислотной последовательностью. Оперативно связанная в используемом в данном описании смысле означает, что первая последовательность нуклеиновой кислоты связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты так, что обе последовательности способны экспрессироваться в виде биологически активного белка или пептида. Полипептид в используемом в данном описании смысле относится к полимеру аминокислот и не имеет отношения к конкретной длине продукта; таким образом, пептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Данный термин не исключает постэкспрессионные модификации полипептида, например гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, пэгилирование, добавление липидного остатка или добавление любой органической или неорганической молекулы. В определение включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты), и полипептиды с замещенными связями, а также другими модификациями, известными в данной области, как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе. Высокая жесткость в используемом в данном описании смысле включает условия, легко определяемые специалистом в данной области на основании, например, длины ДНК. В общем такие условия определены в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 1.101-104, ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989), и включают применение раствора для предварительно промывки нитроцеллюлозных фильтров 5SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0), условия гибридизации в 50% формамиде, 6SSC при 42 С (или другом сходном растворе для гибридизации, таком как раствор Старка,в 50% формамиде при 42 С), и с промывкой примерно при 68 С, 0,2SSC, 0,1% SDS. Специалисту в данной области будет известно, что температуру и концентрацию соли в растворе для промывки можно корректировать так, как это необходимо в соответствии с такими факторами, как длина зонда. Умеренная жесткость в используемом в данном описании смысле включает условия, которые могут быть легко определены специалистом в данной области на основании, например длины ДНК. Основные условия приведены в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. Vol. 1, pp. 1.101-104,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) и включают применение раствора для предварительной промывки нитроцеллюлозных фильтров 5SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0), условия гибридизации в 50% формамиде, 6SSC при 42 С (или другом сходном растворе для гибридизации, таком как раствор Старка, в 50% формамиде при 42 С) и условия промывки при 60 С, в 0,5 SSC, 0,1% SDS. Малая неорганическая молекула в используемом в данном описании смысле означает молекулу, не содержащую атомов углерода и имеющую размер не больше 50 кДа. Малая органическая молекула в используемом в данном описании смысле означает молекулу, содержащую по меньшей мере один атом углерода и имеющую размер не больше 50 кДа. Лечить, лечение, осуществление лечения в используемом в данном описании смысле означает любое из следующего: уменьшение тяжести заболевания или состояния; уменьшение продолжительности-8 012566 течения заболевания; ослабление одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или состоянием; оказание благотворного действия на субъект с заболеванием или состоянием без обязательного исцеления заболевания или состояния, профилактику одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или состоянием. В. Усовершенствования, предлагаемые некоторыми вариантами осуществления изобретения В изобретении предлагаются химерные белки (гибриды мономер-димер), содержащие первую и вторую полипептидные цепи, в которых указанная первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и указанная вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без какой-либо биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина. На фиг. 1 сопоставлены традиционные слитые белковые димеры с одним примером гибрида мономер-димер согласно изобретению. В данном варианте биологически активной молекулой является ЕРО и часть иммуноглобулина представляет собой Fcобласть IgG. Подобно другим химерным белкам, состоящим по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина, изобретение относится к химерным белкам, которые обеспечивают повышенную стабильность и повышенную биодоступность химерного белка по сравнению с отдельной биологически активной молекулой. Однако, кроме того, поскольку только одна из двух цепей содержит биологически активную молекулу, химерный белок имеет меньшую молекулярную массу, чем химерный белок, в котором все цепи содержат биологически активную молекулу, и не желая при этом быть привязанными к какой-либо теории, это может приводить к химерному белку, более легко подвергаемому трансцитозу через эпителиальный барьер, например, посредством связывания с рецептором FcRn, таким образом повышая время полужизни химерного белка. Таким образом, в одном варианте изобретение относится к улучшенному неинвазивному способу (например, через любую поверхность слизистой оболочки, а именно пероральным, буккальным, подъязычным, назальным, ректальным, вагинальным или легочным или глазным путями) введения терапевтического химерного белка согласно изобретению. Таким образом,изобретение относится к способам достижения терапевтических уровней химерных белков согласно изобретению с использованием менее частых и более низких доз по сравнению с ранее описанными химерными белками (например, химерными белками, состоящими по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина и биологически активной молекулы, в которых все цепи химерного белка содержат биологически активную молекулу). В другом варианте изобретение относится к инвазивному способу, например, подкожного, внутривенного введения терапевтического химерного белка согласно изобретению. Инвазивное введение терапевтического химерного белка согласно изобретению обеспечивает повышенное время полужизни терапевтического химерного белка, что в результате приводит к применению менее частых и более низких доз по сравнению с ранее описанными химерными белками (например, химерными белками, состоящими по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина и биологически активной молекулы, в которых все цепи химерного белка содержат биологически активную молекулу). Еще одним преимуществом химерного белка, в котором только одна из цепей содержит биологически активную молекулу, является повышенная доступность биологически активной молекулы для ее клетки-мишени или молекулы-мишени, возникающая в результате уменьшенных стерических помех,уменьшенных гидрофобных взаимодействий, уменьшенных ионных взаимодействий или пониженной молекулярной массы по сравнению с химерным белком, в котором все цепи содержат биологически активную молекулу. С. Химерные белки Изобретение относится к химерным белкам, содержащим одну биологически активную молекулу,по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и необязательно по меньшей мере один линкер. Часть иммуноглобулина будет иметь N- или аминоконец и С- или карбоксильный конец. Химерный белок может иметь биологически активную молекулу, связанную с N-концом части иммуноглобулина. Альтернативно, биологически активная молекула может быть связана с С-концом части иммуноглобулина. В одном варианте связь является ковалентной связью. В другом варианте связь является нековалентной связью. Химерный белок необязательно может содержать по меньшей мере один линкер; таким образом,биологически активная молекула не должна быть непосредственно связана с частью константной области иммуноглобулина. Линкер может располагаться между биологически активной молекулой и частью константной области иммуноглобулина. Линкер может быть связан с N-концом части константной области иммуноглобулина или С-концом части константной области иммуноглобулина. Если биологически активная молекула состоит по меньшей мере из одной аминокислоты, то биологически активная молекула будет иметь N-конец и С-конец и линкер может быть связан с N-концом биологически активной молекулы или С-концом биологически активной молекулы. Изобретение относится к химерному белку формулы X-La-F:F или F:F-La-X, где X означает биологически активную молекулу, L означает необязательный линкер, F означает по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и а является любым целым числом или нулем. Изобретение также-9 012566 относится к химерному белку формулы Ta-X-La-F:F или Ta-F:F-La-X, где X означает биологически активную молекулу, L означает необязательный линкер, F означает по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, а является любым целым числом или нулем, Т означает второй линкер или, альтернативно, метку, которая может быть использована для облегчения очистки химерного белка, например, FLAG-метка, гистидиновая метка, GST-метка, метка в виде связывающего мальтозу белка и (:) означает химическую ассоциацию, например по меньшей мере одну непептидную связь. В некоторых вариантах химическая ассоциация, т.е. (:) является ковалентной связью. В других вариантах химическая ассоциация, т.е. (:) является нековалентным взаимодействием, например ионным взаимодействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, взаимодействием Ван-дер-Ваальса, водородной связью. Специалисту в данной области будет понятно, что когда а равно нулю, X будет непосредственно связан с F. Таким образом, например, а может равняться 0, 1, 2, 3, 4, 5 или быть больше 5. В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2 а (SEQ ID NO:6). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2b (SEQ ID NO:8). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2 с (SEQ ID NO:10). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2d (SEQ ID NO:12). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2 е(SEQ ID NO:14). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2f (SEQ ID NO:16). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2g (SEQ ID NO:18). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность,показанную на фиг. 2h (SEQ ID NO:20). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2i (SEQ ID NO:22). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2j (SEQ ID NO:24). В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 17b (SEQ ID NO:27). 1. Варианты химерных белков Рассматриваются производные химерных белков согласно изобретению, антитела против химерных белков согласно изобретению и антитела против связывающих партнеров химерных белков согласно изобретению, и они могут быть получены изменением их аминокислотных последовательностей посредством замен, присоединений и/или делеций/укорочение или посредством введения химической модификации, которая приводит к функционально эквивалентным молекулам. Специалисту в данной области будет понятно, что некоторые аминокислоты в последовательности любого белка могут быть заменены другими аминокислотами без неблагоприятного влияния на активность белка. Следовательно, могут быть осуществлены различные изменения в аминокислотных последовательностях химерных белков согласно изобретению или в кодирующих последовательностях ДНК без существенной потери их биологической активности, функции или применимости. Производные, аналоги или мутанты, возникающие в результате таких изменений, и применение таких производных входит в объем настоящего изобретения. В конкретном варианте производное является функционально активным, т.е. способным проявлять одну или несколько активностей, связанных с химерными белками согласно изобретению, например связывание FcRn, ингибирование вирусов, гемостаз, продукция красных кровяных клеток. Многие анализы, позволяющие тестировать активность химерного белка, содержащего биологически активную молекулу, известны в данной области. В том случае, когда биологически активная молекула является ингибитором ВИЧ, активность можно тестировать измерением активности обратной транскриптазы, используя известные способы (см., например, Barre-Sinoussi et al. 1983, Science 220: 868;Gallo et al. 1984, Science 224: 500). Альтернативно, активность можно измерить посредством измерения фузогенной активности (см., например, Nussbaum et al. 1994, J. Virol. 68 (9): 5411). В том случае, когда биологической активностью является гемостаз, может быть осуществлен анализ StaCLot FVIIa-rTF, чтобы оценить активность производных фактора VIIa (Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11: S159). Заменители аминокислот в последовательности могут быть выбраны из других представителей класса, к которому относится аминокислота (смотрите табл. 1). Кроме того, различные аминокислоты обычно заменяют нейтральными аминокислотами, например аланином, лейцином, изолейцином, валином, пролином, фенилаланином, триптофаном и метионином (см., например, MacLennan et al. 1998, Acta 2. Биологически активные молекулы Изобретение предполагает применение любой биологически активной молекулы в качестве терапевтической молекулы согласно изобретению. Биологически активной молекулой может быть полипептид. Биологически активной молекулой может быть одна аминокислота. Биологически активная молекула может включать в себя модифицированный полипептид. Биологически активная молекула может включать в себя липидную молекулу (например, стероид или холестерин, жирную кислоту, триацилглицерин, глицерофосфолипид или сфинголипид). Биологически активная молекула может включать в себя молекулу сахара (например, глюкозу, сахарозу, маннозу). Биологически активная молекула может включать в себя молекулу нуклеиновой кислоты (например,ДНК, РНК). Биологически активная молекула может включать в себя малую органическую молекулу или малую неорганическую молекулу. а) Цитокины и факторы роста В одном варианте биологически активной молекулой является фактор роста, гормон или цитокин или их аналог или фрагмент. Биологически активной молекулой может быть любой агент, способный индуцировать рост и пролиферацию клеток. В конкретном варианте биологически активной молекулой является любой агент, который может индуцировать пролиферацию эритроцитов. Таким образом, один из примеров биологически активной молекулы, предлагаемой в изобретении, является ЕРО. Биологически активная молекула также может включать, без ограничения, RANTES, MIP1, MIP1, IL-2, IL-3,GM-CSF, гормон роста, фактор некроза опухолей (например, TNF или ). Биологически активная молекула может включать интерферон , полученный либо синтетически,либо рекомбинантно, включая, без ограничения, любой из примерно двадцати пяти структурно родственных подтипов, как, например, интерферон-2 а, новый коммерчески доступный для клинического применения (Roferon, Roche), и интерферон-2b, также одобренный для клинического применения (Intron, Schering), а также генетически сконструированные варианты различных подтипов, включая, но не ограничивая указанным, коммерчески доступный консенсусный интерферон(Infergen, Intermune,разработанный Amgen) и консенсусный интерферон лейкоцитов человека, см., например, патенты США 4695623, 4897471, интерферон , эпидермальный фактор роста, гонадотропин-рилизинг гормон(GnRH), лейпролид, фолликулостимулирующий гормон, прогестерон, эстроген или тестостерон. Список цитокинов и факторов роста, которые могут быть использованы в химерном белке согласно изобретению, описан ранее (см., например, патенты США 6086875, 6485726, 6030613; WO 03/077834;b) Противовирусные агенты В одном варианте биологически активной молекулой является противовирусный агент, включая его фрагменты и аналоги. Противовирусный агент может включать любую молекулу, которая ингибирует или предотвращает репликацию вирусов, или ингибирует или предотвращает внедрение вируса в клетку,или ингибирует или предотвращает выход вируса из клетки. В одном варианте противовирусным агентом является ингибитор слияния. В одном варианте противовирусным агентом является цитокин, кото- 11012566 рый ингибирует репликацию вирусов. В другом варианте противовирусным агентом является интерферон . Ингибитором слияния вирусов для применения в химерном белке может быть любая молекула, которая снижает или предотвращает проникновение вируса через клеточную мембрану клетки-мишени. Ингибитором слияния вирусов может быть любая молекула, которая уменьшает или предотвращает образование синцитиев по меньшей мере между двумя чувствительными клетками. Ингибитором слияния вирусов может быть любая молекула, которая снижает или предотвращает связывание липидной бислойной мембраны эукариотической клетки и липидного бислоя вируса, имеющего оболочку. Примеры вируса, покрытого оболочкой, включают, но не ограничивают указанным, ВИЧ-1, ВИЧ-2, SIV, вирус гриппа,парагриппа, вирус Эпштейн-Барра, CMV, вирус простого герпеса 1, вирус простого герпеса 2 и респираторно-синцитиальный вирус. Ингибитором слияния вирусов может быть любая молекула, которая уменьшает или предотвращает слияние вирусов, включая, без ограничения, полипептид, малую органическую молекулу или малую неорганическую молекулу. В одном варианте ингибитором слияния является полипептид. В одном варианте ингибитором слияния вирусов является полипептид длиной 3-36 аминокислот. В другом варианте ингибитором слияния вирусов является полипептид длиной 3-50 аминокислот, 10-65 аминокислот, 10-75 аминокислот. Полипептид может состоять из встречающейся в природе аминокислотной последовательности (например, фрагмент gp41), включая ее аналоги и мутанты, или полипептид может состоять из аминокислотной последовательности, не встречающейся в природе, при условии, что полипептид проявляет активность ингибитора слияния вирусов. В одном варианте ингибитором слияния вирусов является полипептид, идентифицированный как ингибитор слияния вирусов с использованием по меньшей мере одного компьютерного алгоритма, например, ALLMOTI5, 1071784 и PLZIP (см., например, патенты США 6013263, 6015881, 6017536,6020459, 6060065, 6068973, 6093799 и 6228983). В одном варианте ингибитором слияния вирусов является ингибитор слияния ВИЧ. В одном варианте ВИЧ представляет собой ВИЧ-1. В другом варианте ВИЧ представляет собой ВИЧ-2. В одном варианте ингибитором слияния ВИЧ является полипептид, состоящий из фрагмента белка оболочки gp41 ВИЧ-1. Ингибитор слияния ВИЧ может содержать, например, Т 20 (SEQ ID NO:1) или его аналог, Т 21Chem. 276: (31) 29485) или его аналог или 5-helix (Root et al. 2001, Science 291: 884) или его аналог. Анализы, известные в данной области, можно использовать для того, чтобы тестировать ингибирующую слияние вирусов активность полипептида, малой органической молекулы или малой неорганической молекулы. Такие анализы включают анализ обратной транскриптазы, анализ р 24 или анализ образования синцитиев (см., например, патент США 5464933). Список противовирусных агентов, которые можно использовать в химерном белке согласно изобретению, описан ранее (см., например, патенты США 6086875, 6485726, 6030613; WO 03/077834;US2003-0235536A1). с. Гемостатические агенты В одном варианте биологически активной молекулой является фактор свертывания или другой агент, который стимулирует гемостаз, включая его фрагменты и аналоги. Фактор свертывания крови может включать любую молекулу, которая обладает свертывающей активностью или активирует молекулу,обладающую свертывающей активностью. Фактор свертывания крови может состоять из полипептида. Фактором свертывания крови может быть, например, без ограничения, фактор VIII, фактор IX, факторXI, фактор XII, фибриноген, протромбин, фактор V, фактор VII, фактор X, фактор XIII или фактор фон Виллебранда. В одном варианте фактором свертывания крови является фактор VII или фактор VIIa. Фактором свертывания крови может быть фактор, который принимает участие во внешнем пути свертывания крови. Фактором свертывания крови может быть фактор, который принимает участие во внутреннем пути свертывания крови. Альтернативно, фактором свертывания крови может быть фактор, который принимает участие как во внешнем, так и во внутреннем пути. Фактором свертывания крови может быть фактор свертывания крови человека или фактор свертывания крови животного, отличного от человека, например полученный от примата, отличного от человека, свиньи или любого млекопитающего. Фактором свертывания крови может быть химерный фактор свертывания крови, например, фактор свертывания крови может содержать часть фактора свертывания крови человека и часть фактора свертывания крови свиньи или часть первого фактора свертывания крови животного, отличного от человека, и часть второго фактора свертывания крови животного, отличного от человека. Фактором свертывания крови может быть активированный фактор свертывания крови. Альтернативно, фактором свертывания крови может быть неактивная форма фактора свертывания крови, например зимоген. Неактивный фактор свертывания крови может подвергаться активации после связывания по меньшей мере с частью константной области иммуноглобулина. Неактивный фактор свертывания крови может быть активирован после введения субъекту. Альтернативно, неактивный фактор свертывания кро- 12012566 ви может быть активирован перед введением. В некоторых вариантах может быть использована эндопептидаза, например фермент, расщепляющий спаренные основные аминокислоты (РАСЕ), или любой представитель семейства РАСЕ, такой какPCSK1-9, включая его укороченные варианты, или его дрожжевой эквивалент Кех 2 из S. cerevisiae и укороченные варианты Кех 2 (Кех 2 1-675) (см., например, патенты США 5077204, 5162220, 5234830,5885821, 6329176), чтобы отщепить пропептид с образованием зрелого химерного белка согласно изобретению (например, фактора VII, фактора IX).d) Другие белковые биологически активные молекулы В одном варианте биологически активной молекулой является рецептор или его фрагмент или аналог. Рецептор может быть экспрессирован на поверхности клетки или, альтернативно, рецептор может быть экспрессирован внутри клетки. Рецептор может быть вирусным рецептором, например CD4, CCR5,CXCR4, CD21, CD46. Биологически активной молекулой может быть бактериальный рецептор. Биологически активной молекулой может быть белок внеклеточного матрикса или его фрагмент или аналог,важный для колонизации бактерий и инфекции (см., например, патенты США 5648240, 5189015,5175096), или белок поверхности бактерий, важный для адгезии и инфекции (см., например, патент США 5648240). Биологически активной молекулой может быть рецептор фактора роста, гормона или цитокина или его фрагмент или аналог, например рецептор TNF, рецептор эритропоэтина, CD25, CD122 илиCD132. Список других белковых молекул, которые можно использовать в химерном белке согласно изобретению, описан ранее (см., например, патенты США 6086875, 6485726, 6030613, WO 03/077834;e) Нуклеиновые кислоты В одном варианте биологически активной молекулой является нуклеиновая кислота, например,ДНК, РНК. В одном конкретном варианте биологически активной молекулой является нуклеиновая кислота, которая может использована в интерференции РНК (RNAi). Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой в качестве примера, но не ограничивая указанным, антисмысловую молекулу,или рибозим, или аптамер. Молекулы антисмысловой РНК и ДНК действуют, прямо блокируя трансляцию мРНК посредством гибридизации с мРНК-мишенью и предотвращая трансляцию белка. Способы на основе антисмысловых последовательностей заключаются в конструировании олигонуклеотидов, которые комплементарны мРНК гена-мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды будут связываться с комплементарными мРНКтранскриптами гена-мишени и предотвращать трансляцию. Абсолютная комплементарность не требуется. Последовательность комплементарная части РНК, в используемом в данном описании смысле означает последовательность, обладающую достаточной комплементарностью, чтобы быть способной гибридизоваться с РНК, образуя стабильный дуплекс; таким образом в случае двунитевых антисмысловых нуклеиновых кислот может быть тестирована одна нить ДНК-дуплекса или может быть исследовано образование триплекса. Способность гибридизоваться будет зависеть как от степени комплементарности,так и от длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. В общем, чем длиннее гибридизующаяся нуклеиновая кислота, тем больше ошибочно спариваемых оснований с РНК она может содержать и все еще образовывать стабильный дуплекс (или триплекс, в зависимости от обстоятельств). Специалист в данной области может выяснить приемлемую степень ошибочного спаривания, используя стандартные способы определения точки плавления гибридизованного комплекса. Антисмысловые нуклеиновые кислоты должны иметь по меньшей мере шесть нуклеотидов в длину и предпочтительно являются олигонуклеотидами длиной в пределах от 6 до примерно 50 нуклеотидов. В конкретных аспектах олигонуклеотид имеет по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 17 нуклеотидов, по меньшей мере 25 нуклеотидов или по меньшей мере 50 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут быть ДНК или РНК, или их химерными смесями, или производными, или модифицированными вариантами, однонитевыми или двунитевыми. Олигонуклеотид может быть модифицирован по остатку основания, остатку сахара или фосфатному остову, например, чтобы повысить стабильность молекулы, гибридизацию и т.д. Олигонуклеотид может включать в себя другие боковые группы, такие как полипептиды (например, для нацеливания на рецепторы клеток-хозяев in vivo), или агенты, способствующие транспорту через клеточную мембрану (см., например, Letsinger et al. 1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553; Lemaitre et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648; WO 88/09810,) или гематоэнцефалический барьер (см., например, WO 89/10134), агенты для запускаемого гибридизацией расщепления (см., например, Krol et al. 1988, BioTechniques 6: 958) или интеркалирующие агенты (см.,например, Zon 1988, Pharm. Res. 5: 539). С этой целью олигонуклеотид может быть конъюгирован с другой молекулой, например полипептидом, агентом для запускаемого гибридизацией перекрестного сшивания, транспортирующим агентом или агентом запускаемого гибридизацией расщепления. Молекулы рибозимов, сконструированные для каталитического расщепления транскриптов мРНК гена-мишени, также можно использовать для того, чтобы предотвратить трансляцию мРНК гена-мишени и, следовательно, экспрессию продукта гена-мишени (см., например, WO 90/11364; Sarver et al. 1990, Science 247, 1222-1225).- 13012566 Рибозимы являются молекулами ферментной РНК, способными катализировать специфичное расщепление РНК (см. Rossi 1994, Current Biology 4: 469). Механизм действия рибозимов заключается в специфичной для последовательности гибридизации молекулы рибозима с комплементарной РНКмишенью с последующим событием эндонуклеолитического расщепления. В состав молекул рибозимов могут входить одна или несколько последовательностей, комплементарных мРНК гена-мишени, и должна входить хорошо известная каталитическая последовательность, ответственная за расщепление мРНК. В отношении указанной последовательности см., например, патент США 5093246. В одном варианте рибозимы, которые расщепляют мРНК в сайт-специфично узнаваемых последовательностях, можно использовать для разрушения мРНК генов-мишеней. В другом варианте предполагается применение рибозимов типа головки молота. Рибозимы типа головки молота расщепляют мРНК в положениях, продиктованных фланкирующими областями, которые образуют комплементарные пары оснований с мРНК-мишенью. Единственным требованием является, чтобы мРНК-мишень имела следующую последовательность из двух оснований: 5'-UG-3'. Конструирование и получение рибозимов типа головки молота хорошо известно в данной области и описано более полно в Myers 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, и в Haselofff) Малые молекулы Изобретение также предполагает применение любой терапевтической малой молекулы или лекарственного средства в качестве биологически активной молекулы в химерном белке согласно изобретению. Список малых молекула и лекарственных средств, которые можно использовать в химерном белке согласно изобретению, описан ранее (см., например, патенты США 6086875, 6485726, 6030613, WO 03/077834, US2003-0235536A1). 2. Иммуноглобулины Химерные белки согласно изобретению содержат по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина. Иммуноглобулины состоят из четырех белковых цепей, которые связаны ковалентно: двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Каждая цепь, кроме того, состоит из одной вариабельной области и одной константной области. В зависимости от изотипа иммуноглобулина константная область тяжелой цепи состоит 3 или 4 доменов константной области (например, CH1, CH2, СН 3, СН 4). Некоторые изотипы, кроме того, содержат шарнирную область. Часть константной области иммуноглобулина может быть получена от любого млекопитающего. Часть константной области иммуноглобулина может включать в часть константной области иммуноглобулина человека, константной области иммуноглобулина примата, отличного от человека, константной области бычьего иммуноглобулина, константной области иммуноглобулина свиньи, константной области иммуноглобулина мыши, константной области иммуноглобулина овцы или константной области иммуноглобулина крысы. Часть константной области иммуноглобулина может быть получена рекомбинантно или путем синтеза. Иммуноглобулин может быть выделен из библиотеки кДНК. Часть константной области иммуноглобулина может быть выделена из фаговой библиотеки (см., например, McCafferty et al. 1990, Nature 348: 552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363; EP 0589877 Bl). Часть константной области иммуноглобулина может быть получена перетасовкой генов с известными последовательностями (Mark etal. 1992, BiolTechnol. 10: 779). Часть константной области иммуноглобулина может быть выделена посредством рекомбинации in vivo (Waterhouse et al. 1993, Nucl. Acid Res. 21: 2265). Иммуноглобулин может быть гуманизированным иммуноглобулином (патент США 5585089, Jones et al. 1986, Nature 332: 323). Часть константной области иммуноглобулина может включать в себя часть IgG, IgA, IgM, IgD илиIgE. В одном варианте иммуноглобулин является IgG. В другом варианте иммуноглобулин являетсяIgG1. В другом варианте иммуноглобулин является IgG2. Часть константной области иммуноглобулина может включать в себя полную константную область тяжелой цепи или ее фрагмент или аналог. В одном варианте константная область тяжелой цепи может содержать домен СН 1, домен СН 2, домен СН 3 и/или шарнирную область. В другом варианте константная область тяжелой цепи может содержать домен СН 1, домен СН 2, домен СН 3 и/или домен СН 4. Часть константной области иммуноглобулина может содержать фрагмент Fc. Фрагмент Fc может состоять из доменов СН 2 и СН 3 иммуноглобулина и шарнирной области иммуноглобулина. Фрагмент Fc может представлять собой фрагмент Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В одном конкретном варианте часть константной области иммуноглобулина представляет собой фрагмент Fc IgG1. В другом варианте часть константной области иммуноглобулина представляет собой фрагмент Fc IgG2. В другом варианте часть константной области иммуноглобулина представляет связывающий партнер неонатального рецептора Fc (FcRn). FcRn-связывающим партнером является любая молекула, которая может быть специфично связана рецептором FcRn с последующим активным транспортом рецептором FcRn FcRn-связывающего партнера. Специфично связанный относится к двум молекулам, образующим комплекс, который является относительно стабильным в физиологических условиях. Специфичное связывание характеризуется высокой аффинностью и емкостью от низкой до умеренной, что отличаются- 14012566 от неспецифичного связывания, которое обычно имеет низкую аффинность при емкости от умеренной до высокой. Обычно связывание считают специфичным, когда константа аффинности KA выше 106 M-1 или более предпочтительно выше 108 М-1. При необходимости неспецифичное связывание может быть уменьшено без существенного влияния на специфичное связывание варьированием условий связывания. Соответствующие условия связывания, такие как концентрация молекул, ионная сила раствора, температура, время, разрешенное для связывания, концентрация блокирующего агента (например, сывороточного альбумина, казеина молока) и т.д., могут быть оптимизированы специалистом в данной области с использованием обычных способов. Рецептор FcRn был выделен из нескольких видов млекопитающих, включая человека. Последовательности FcRn человека, FcRn обезьян, FcRn крыс и FcRn мышей известны (Story et al. 1994, J. Exp.Med. 180: 2377). Рецептор FcRn связывает IgG (но не другие классы иммуноглобулинов, такие как IgA,IgM, IgD и IgE) при относительно низком рН, активно транспортирует IgG трансклеточным путем в просвет в направлении серозной оболочки и затем высвобождает IgG при относительно более высоком рН,обнаруженном в интерстициальных жидкостях. Он экспрессируется в эпителиальной ткани взрослого организма (патенты США 6485726, 6030613, 6086875, WO 03/077834; US2003-0235536A1), включая эпителий легких и кишечника (Israel et al. 1997, Immunology 92: 69), эпителий проксимальных почечных канальцев (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282: F358), а также эпителий носа, вагинальные поверхности и поверхности желчного дерева.FcRn-связывающие партнеры согласно настоящему изобретению охватывают любую молекулу, которая может быть специфично связана рецептором FcRn, включая целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты, которые содержат полную область связывания рецептора FcRn. Область Fc-части IgG, которая связывается с рецептором FcRn, была описана рентгеновской кристаллографией (Burmeister et al. 1994, Nature 372: 379). Основная область контакта Fc с FcRn расположена вблизи соединения доменов СН 2 и СН 3. Все контакты Fc-FcRn находятся в одной тяжелой цепи Ig. FcRn-связывающие партнеры включают полный IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты IgG, которые содержат полную область связывания FcRn. Основные места контакта включают в себя аминокислотные остатки 248, 250-257, 272,285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН 2 и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена СН 3. Все ссылки, сделанные на нумерацию аминокислот иммуноглобулинов или фрагментов иммуноглобулинов или областей, основаны на Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.Fc-область IgG может быть модифицирована в соответствии с хорошо известными способами, такими как сайт-направленный мутагенез и тому подобные, чтобы получить модифицированный IgG или его Fc-фрагменты или части, которые будут связываться рецептором FcRn. Такие модификации включают модификации, удаленные от сайтов контакта FcRn, а также модификации в сайтах контакта, которые сохраняют или даже усиливают связывание с FcRn. Например, следующие одиночные остатки аминокислот в Fc(Fc1) IgG1 человека могут быть заменены без существенной потери аффинности связыванияFc в отношении FcRn: Р 238 А, S239A, K246 А, K248 А, D249A, М 252 А, T256 А, Е 258 А, Т 260 А, D265A,S267A, Н 268 А, Е 269 А, D270A, Е 272 А, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, Е 283 А, Н 285 А, N286A,Т 289 А, K290 А, R292A, Е 293 А, Е 294 А, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A,Т 307 А, L309A, Q311A, D312A, N315A, К 317 А, Е 318 А, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A,A330Q, Р 331 А, Е 333 А, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, Е 345 А, Q347A, R355A,Е 356 А, М 358 А, Т 359 А, K360 А, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, Е 380 А, Е 382 А, S383A,N384A, Q386A, Е 388 А, N389A, N390A, Y391F, K392 А, L398A, S400A, D401A, D413A, K414 А, R416A,Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, Е 430 А, N434A, Т 437 А, Q438A, K439 А, S440A, S444A и К 447 А,где, например, Р 238 А означает пролин дикого типа, заменяемый аланином в положении номер 238. В качестве примера один конкретный вариант включает мутацию N2 97A, удаляющую высоко консервативный сайт N-гликозилирования. Кроме аланина, другие аминокислоты могут быть использованы для замены аминокислот дикого типа в указанных выше положениях. Мутации могут быть по отдельности введены в Fc с образованием более ста FcRn-связывающих партнеров, отличных от нативного Fc, кроме того, комбинации из двух, трех или более указанных отдельных мутаций могут быть введены вместе,приводя к образованию еще сотен FcRn-связывающих партнеров. Кроме того, один из FcRnсвязывающих партнеров в гибриде мономер-димер может быть мутирован, а другой FcRn-связывающий партнер вообще не мутирован, или они могут быть мутированы оба, но разными мутациями. Любую из приведенных в данном описании мутаций, включая N297A, можно использовать для модификации Fc,независимо от биологически активной молекулы (например, ЕРО, IFN, фактор IX, Т 20). Некоторые из указанных выше мутаций могут придавать новые функциональности FcRnсвязывающему партнеру. Например, один вариант включает N297A, удаляющую высоко консервативный сайт N-гликозилирования. Влияние мутации заключается в уменьшении иммуногенности и при этом увеличении времени полужизни в циркуляции FcRn-связывающего партнера, и в придании FcRnсвязывающему партнеру неспособности связываться с FcRI, FcRIIA, FcRIIB и FcRIIIA, не подвергая риску аффинность в отношении FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60: 847; Friend et al. 1999,- 15012566Transplantation 68: 1632; Shields et al. 1995, J.Biol. Chem. 276: 6591). В качестве следующего примера новой функциональности, возникающей в результате мутаций, описанных выше, может быть увеличена аффинность в отношении FcRn, в некоторых случаях выше чем аффинность дикого типа. Указанная повышенная аффинность может отражать повышенную скорость образования комплекса, пониженную скорость распада комплекса или/и повышенную скорость образования комплекса и пониженную скорость распада комплекса вместе. Мутации, которые предположительно придают повышенную аффинность в отношении FcRn, включают Т 256 А, Т 307 А, Е 380 А и N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591). Кроме того, по меньшей мере три рецептора Fc гамма человека, по-видимому, узнают сайт связывания на IgG в области ниже шарнира, обычно аминокислоты 234-237. Следовательно, другой пример новой функциональности и возможной пониженной иммуногенности может возникать в результате мутаций данной области, например при замене аминокислот 233-236 IgG1 человека ELLG на соответствующую последовательность из IgG2 PVA (с делецией одной аминокислоты). Показано, что FcRI,FcRII и FcRIII, которые опосредуют различные эффекторные функции, не будут связываться с IgG1,когда введены такие мутации. Ward и Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2: 77 и Armour et al. 1999, Eur.NO:29) или VISSHLGQ (SEQ ID NO:30) (патент США 5739277). Два рецептора FcRn могут связывать одну молекулу Fc. Кристаллографические данные свидетельствуют, что каждая молекула FcRn связывает один полипептид гомодимера Fc. В одном варианте связывание FcRn-связывающего партнера, например Fc-фрагмента IgG, с биологически активной молекулой обеспечивает средства доставки биологически активной молекулы пероральным, буккальным, подъязычным, ректальным, вагинальным путем, в виде аэрозоля, вводимого назально, или через легочный путь, или глазным путем. В другом варианте химерный белок может быть введен инвазивно, например подкожно, внутривенно. Специалисту в данной области будет понятно, что части константной области иммуноглобулина для применения в химерном белке согласно изобретению могут включать его мутанты или аналоги, или могут включать химически модифицированные константные области иммуноглобулина (например, пэгилированные), или ее фрагменты (смотрите, например, Aslam and Dent 1998, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London). В одном случае мутант может обеспечивать повышенное связывание FcRn-связывающего партнера по отношению к FcRn. Также для применения в химерном белке согласно изобретению предлагаются пептидомиметики по меньшей мере части константной области иммуноглобулина, например пептидомиметик Fc-фрагмента или пептидомиметик FcRn-связывающего партнера. В одном варианте пептидомиметик идентифицируют, используя фаговый дисплей или посредством скрининга химической библиотеки (см., например, McCafferty et al. 1990, Nature 348: 552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363; EPO 589 877B1). 3. Необязательные линкеры Химерный белок согласно изобретению необязательно может содержать по меньшей мере одну линкерную молекулу. Линкер может состоять из любой органической молекулы. В одном варианте линкером является полиэтиленгликоль (ПЭГ). В другом варианте линкер состоит из аминокислот. Линкер может содержать 1-5 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-20 аминокислот, 10-50 аминокислот, 50-100 аминокислот, 100-200 аминокислот. В одном варианте линкер является восьмиаминокислотным линкером EFAGAAAV (SEQ ID NO:31). Любой из линкеров, приведенных в данном описании, может быть использован в химерном белке согласно изобретению, например гибрид мономер-димер, содержащийEFAGAAAV, независимо от биологически активной молекулы (например, EPO, IFN, фактор IX). Линкер может содержать последовательность Gn. Линкер может содержать последовательность(GA)n (SEQ ID NO:32). Линкер может содержать последовательность (GGS)n(SEQ ID NO:33). Линкер может содержат последовательность (GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO:34). В указанных случаях n может быть целым числом от 1 до 10, т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Примеры линкеров включают, но не ограничены указанным, GGG (SEQ ID NO:35), SGGSGGS (SEQ ID NO:36), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ IDNO:37), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:38), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO:39). Линкер не исключает или не уменьшает биологическую активность химерного белка. Необязательно линкер усиливает биологическую активность химерного белка, например, дополнительного уменьшая влияние стерических помех и делая биологически активную молекулу более доступной для связывающего ее сайта мишени. В одном конкретном варианте линкер для интерферонаимеет длину 15-25 аминокислот. В другом конкретном варианте линкер для интерферонаимеет длину 15-20 аминокислот. В другом конкретном варианте линкер для интерферонаимеет длину 10-25 аминокислот. В другом конкретном варианте линкер для интерферонаимеет длину 15 аминокислот. В одном варианте линкером для интерферона- 16012566 является (GGGGS)n (SEQ ID NO:40), где G означает глицин, S означает серии и n является целым числом от 1 до 10. В конкретном варианте n равно 3. Линкер также может включать в себя остаток, способный расщепляться либо химически (например,гидролиз эфирной связи), ферментативно (например, включение последовательности расщепления протеазой) или фотолитически (например, хромофор, такой как 3-амино-3-(2-нитрофенил)пропионовая кислота (ANP, для того, чтобы высвобождать биологически активную молекулу из Fc-белка. 4. Димеризация химерных белков с использованием специфичных связывающих партнеров В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит первую полипептидную цепь,содержащую по меньшей мере первый домен, при этом указанный первый домен имеет по меньшей мере один специфичный связывающий партнер, и вторую полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере второй домен, где указанный второй домен является специфичным связывающим партнером указанного первого домена. Таким образом, химерный белок содержит полипептид, способный димеризоваться с другим полипептидом в результате взаимодействия первого домена и второго домена. Способы димеризации антител с использованием гетерологичных доменов известны в данной области (патенты США 5807706 и 5910573; Kostelny et al. 1992, J. Immunol. 148 (5): 1547). Димеризация может происходить в результате образования ковалентной связи или, альтернативно,нековалентной связи, например гидрофобного взаимодействия, сил Ван-дер-Ваальса, взаимного расположения амфифильных пептидов, такого как, без ограничения, альфа-спирали, взаимодействия зарядов аминокислот, несущих противоположные заряды, таких как, без ограничения, лизин и аспарагиновая кислота, аргинин и глутаминовая кислота. В одном варианте домен представляет собой спиральный мотив, содержащий спираль, поворот и другую спираль. В другом варианте домен является лейциновым зиппером, содержащим пептид, имеющий несколько повторяющихся аминокислот, в котором каждая седьмая аминокислота является остатком лейцина. В одном варианте специфичным связывающим партнером является fos/jun (смотрите Branden et al. 1991, Introduction To Protein Structure, Garland Publishing,New York). В другом варианте связывание опосредовано химическим связыванием (см., например, Brennan etal. 1985, Science 229: 81). В данном варианте интактные иммуноглобулины или химерные белки, состоящие по меньшей мере из части константной области иммуноглобулина, расщепляют, чтобы создать фрагменты тяжелой цепи. Указанные фрагменты восстанавливают в присутствии агента для образования комплексов дитиолов арсенита натрия, чтобы стабилизировать соседние дитиолы и предотвратить образование межмолекулярных дисульфидов. Созданные фрагменты затем превращают в производные тионитробензоата (TNB). Одно из производных TNB затем снова превращают в тиол фрагмента тяжелой цепи восстановлением меркаптоэтиламином и затем смешивают с эквимолярным количеством другого производного TNB с образованием химерного димера.D. Нуклеиновые кислоты Изобретение относится к первой конструкции нуклеиновой кислоты и второй конструкции нуклеиновой кислоты, каждая из которых содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере часть химерного белка согласно изобретению. В одном варианте первая конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть константной области иммуноглобулина, оперативно связанную со второй последовательностью ДНК, кодирующей биологически активную молекулу, и указанная вторая конструкция ДНК содержит последовательность ДНК, кодирующую константную область иммуноглобулина, без второй последовательности ДНК, кодирующей биологически активную молекулу. Биологически активная молекула может, например, включать, но не в качестве ограничения, ингибитор слияния вирусов, фактор свертывания крови, фактор роста, или гормон, или рецептор, или аналог,или фрагмент любого из указанных выше. Последовательности нуклеиновых кислот также могут включать в себя дополнительные последовательности или элементы, известные в данной области (например, промоторы, энхансеры, поли Апоследовательности, аффинные метки). В одном варианте последовательность нуклеиновой кислоты второй конструкции необязательно может включать в себя последовательность нуклеиновой кислоты,кодирующую линкер, помещенный между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей биологически активную молекулу и часть константной области иммуноглобулина. Последовательность нуклеиновой кислоты второй конструкции ДНК необязательно может включать в себя линкерную последовательность, помещенную перед или после последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей биологически активную молекулу и/или часть константной области иммуноглобулина. В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты состоит из ДНК. В другом варианте конструкция нуклеиновой кислоты состоит из РНК. Конструкция нуклеиновой кислоты может представлять собой вектор, например вирусный вектор или плазмиду. Примеры вирусных векторов включают, но не ограничены указанным, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса или вектор на основе вируса лейкоза мышей. Примеры плазмид включают, но не ограничены указанным,pUC, pGEM и pGEX. В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой- 17012566 кислоты, показанную на фиг. 3 а (SEQ ID NO:7). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3b (SEQ ID NO:9). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3 с (SEQ ID NO:11). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3d (SEQ ID NO:13). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3 е (SEQ ID NO:15). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3f (SEQ ID NO:17). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3g (SEQ IDNO:19). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3h (SEQ ID NO:21). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 3i (SEQ ID NO:23). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты,показанную на фиг. 3j (SEQ ID NO:25). В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на фиг. 17 а (SEQ ID NO:27). Вследствие известной вырожденности генетического кода, в котором более чем один кодон может кодировать одну и ту же аминокислоту, последовательность ДНК может изменяться по сравнению с последовательностями, показанными в SEQ ID NO:7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 или 27, но все еще кодировать полипептид, имеющий соответствующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 или 26, соответственно. Такие варианты последовательности ДНК могут возникать в результате молчащих мутаций (например, происходящих во время ПЦР-амплификации) или могут быть продуктом преднамеренного мутагенеза нативной последовательности. Таким образом изобретение относится к изолированным последовательностям ДНК, кодирующим полипептиды согласно изобретению, выбранным из: (а) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7, 9,11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 или 27; (b) ДНК, кодирующей полипептиды SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20, 22, 24 или 26; (с) ДНК, способной гибридизоваться с ДНК по (а) или (b) в условиях умеренной жесткости, и которая кодирует полипептиды согласно изобретению; (d) ДНК, способная гибридизоваться с ДНК по (а) или (b) в условиях высокой жесткости и которая кодирует полипептиды согласно изобретению, и (е) ДНК, которая является вырожденной в результате генетического кода по сравнению с ДНК,определенной в (а), (b), (с) или (d), и которая кодирует полипептиды согласно изобретению. Конечно,полипептиды, кодируемые такими последовательностями ДНК, входят в объем изобретения. В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательность, кодирующую химерный белок согласно изобретению, также могут содержать нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 80% идентичны нативной последовательности. Также предполагаются варианты, в которых молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательность, кодирующую химерный белок согласно изобретению, содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 98% идентична, по меньшей мере на 99% идентична или по меньшей мере на 99,9% идентична нативной последовательности. Нативная последовательность может включать любую последовательность ДНК, не измененную искусственно человеком. Процент идентичности можно определить визуальным просмотром и математическим расчетом. Альтернативно, процент идентичности двух последовательностей нуклеиновой кислоты можно определить сравнением информации о последовательности с использованием компьютерной программы GAP,версия 6.0, описанной Devereux et al. 1984, Nucl. Acids Res. 12: 387 и доступной из University of WisconsinGenetics Computer Group (UWGCG). Предпочтительные параметры, используемые по умолчанию, в случае программы GAP включают: (1) матрицу унарного сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для неидентичности) нуклеотидов и матрицу взвешивающего сравнения Gribskov and Burgess 1986, Nucl. Acids Res. 14: 6745, которые описаны Schwartz and Dayhoff, eds. 1979, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358; (2) штраф 3,0 за каждый пробел и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом пробеле и (3) отсутствие штрафа за концевые пробелы. Также можно использовать другие программы, используемые специалистом в области сравнения последовательностей. Е. Синтез химерных белков Химерные белки, содержащие по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и биологически активную молекулу, могут быть синтезированы с использованием способов, известных в данной области. Например, химерные белки согласно изобретению могут быть синтезированы рекомбинантно в клетках (см., например, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold SpringAssociates and Wiley Interscience, N. Y.). Альтернативно, химерные белки согласно изобретению могут быть синтезированы с использованием известных способов синтеза, таких как твердофазный синтез. Способы синтеза хорошо известны в данной области (см., например, Merrifield, 1973, Chemical Polypeptides, (Katsoyannis and Panayotis eds.) pp. 335-61; Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis et al. 1985, Biochem. Intl. 10:394; Finn et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:105; Erikson et al. 1976, The Proteins (3ded.) 2:257; патент США 3941763). Альтернативно, химерные белки согласно изобретению могут быть синтезированы с использованием комбинации способов на основе рекомбинации и способов синтеза. В некоторых применениях может быть полезным применение либо способа на основе рекомбинации, либо комбинации способа на основе рекомбинации и способа синтеза. Нуклеиновые кислоты, кодирующие биологически активную молекулу, могут быть легко синтезированы с использованием способов рекомбинации, хорошо известных в данной области. Альтернативно,пептиды как таковые могут быть синтезированы химическим путем. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть синтезированы стандартными способами, известными в данной области, например, посредством применения автоматизированного синтезатора ДНК (такого как коммерчески доступные из Biosearch, Applied Biosystems, и т.д.). В качестве примеров фосфоротиоатные олигонуклеотиды могут быть синтезированы способом Stein et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209, метилфосфонатные олигонуклеотиды могут быть получены в результате применения подложек из полимерного стекла с контролируемым размером пор, как описано в Sarin et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448. Дополнительные способы синтеза нуклеиновых кислот известны в данной области (см., например, патенты США 6015881, 6281331, 6469136). Последовательности ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина или его фрагменты, могут быть клонированы из различных библиотек геномной или кДНК, известных в данной области. Способы выделения таких последовательностей ДНК с использованием основанных на зондах способов являются обычными методиками и хорошо известны специалистам в данной области. Зонды для выделения таких последовательностей ДНК могут быть основаны на опубликованных последовательностях ДНК (см., например, Hieter et al. 1980, Cell 22: 197-207). Можно использовать способ полимеразной цепной реакции (ПЦР), описанный Mullis et al. (патент США 4683195) и Mullis (патент США 4683202). Выбор библиотеки и подбор зондов для выделения таких последовательностей ДНК осуществляется специалистом в данной области. Альтернативно, последовательности ДНК, кодирующие иммуноглобулины или их фрагменты, можно получить из векторов, которые, как известно в данной области, содержат иммуноглобулины или их фрагменты. Для рекомбинантного получения первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую часть химерного белка согласно изобретению (например, часть константной области иммуноглобулина) и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую часть химерного белка согласно изобретению (например, часть константной области иммуноглобулина и биологически активную молекулу),встраивают в соответствующие носители для экспрессии, например, векторы, которые содержат необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности, или в случае вектора на основе РНК-вируса необходимые элементы для репликации и трансляции. Нуклеиновые кислоты, кодирующие химерный белок, встраивают в вектор в правильной рамке считывания. Экспрессирующими носителями затем трансфицируют или котрансфицируют подходящую клеткумишень, которая будет экспрессировать полипептиды. Способы трансфекции, известные в данной области, включают, но не ограничены указанным, осаждение фосфатом кальция (Wigler et al. 1978, Cell 14: 725) и электропорацию (Neumann et al. 1982, EMBO, J. 1: 841) и реагенты на основе липосом. Может быть использовано множество систем хозяин-экспрессирующий вектор, чтобы экспрессировать химерные белки, указанные в данном описании, включая как прокариотические, так и эукариотические клетки. Системы включают, но не ограничены указанным, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е.coli), трансформированные экспрессирующими векторами на основе рекомбинантной ДНК бактериофага или плазмидной ДНК, содержащими соответствующую кодирующую последовательность; дрожжи или нитчатые грибы, трансформированные рекомбинантными экспрессирующими векторами дрожжей или грибов, содержащими соответствующую кодирующую последовательность; системы клеток насекомых,инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, на основе вируса мозаики цветной капусты или вируса мозаики табака) или трансформированных рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Ti-плазмидой), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; или системы клеток животных, включая клетки млекопитающих (например, клетки СНО, Cos, HeLa). В том случае, когда химерный белок согласно изобретению синтезируют рекомбинантно в прокариотической клетке, может быть желательной укладка химерного белка. Химерный белок, полученный таким способом, может быть подвергнут рефолдингу до биологически активной конформации с использованием условий, известных в данной области, например денатурацией в восстанавливающих условиях и затем медленным диализом в PBS. В зависимости от используемой системы экспрессии экспрессируемый химерный белок затем выделяют способами, хорошо разработанными в данной области (например, аффинной хроматографией,эксклюзионной хроматографией по размеру, ионообменной хроматографией). Экспрессирующие векторы могут кодировать метки, которые дают возможность легко очищать рекомбинантно полученный химерный белок. Примеры включают, но не ограничены указанным, векторpUR278 (Ruther et al. 1983, EMBO J. 2: 1791), в котором последовательности, кодирующие химерный белок, указанный в данном описании, могут быть лигированы в вектор в рамке с областью, кодирующейlac z, так что получается гибридный белок; векторы pGEX могут быть использованы для экспрессии химерных белков согласно изобретению с меткой в виде глутатион-S-трансферазы (GST). Указанные белки обычно растворимы и могут быть легко очищены из клеток посредством адсорбции на глутатионагарозных шариках с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы содержат сайты расщепления (тромбин, или протеаза фактора Ха, или протеаза PreScission (Pharmacia,Peapack, N. J. для простого удаления метки после очистки. Чтобы повысить эффективность получения, могут быть сконструированы полинуклеотиды, кодирующие множественные единицы химерного белка согласно изобретению, разделенные сайтами расщепления ферментами. Полученный в результате полипептид может быть расщеплен (например, обработкой соответствующим ферментом), чтобы получить полипептидные единицы. Это может повысить выход полипептидов, управляемый одним промотором. При использовании в соответствующих вирусных системах экспрессии управление трансляцией каждого полипептида, кодируемого мРНК, осуществляется внутри транскрипта, например, посредством внутреннего сайта присоединения рибосомы, IRES. Таким образом полицистронная конструкция направляет транскрипцию одной большой полицистронной мРНК,которая в свою очередь направляет трансляцию множества отдельных полипептидов. Такой подход исключает продуцирование и ферментативный процессинг полибелков и может значительно увеличить выход полипептида под управлением одного промотора. Векторы, используемые для трансформации, обычно будут содержать селектируемый маркер, используемый для того, чтобы идентифицировать трансформанты. В бактериальных системах он может включать ген резистентности к антибиотику, такому как ампициллин или канамицин. Селектируемые маркеры для применения в культивируемых клетках млекопитающих включают гены, которые придают резистентность к лекарственным средствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер может быть амплифицируемым селектируемым маркером. Одним из амплифицируемых селектируемых маркеров является ген DHFR. Другим амплифицируемым маркером является кДНКDHFR (Simonsen and Levinson 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495). Обзор селектируемых маркеров приведен Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) и выбор селектируемых маркеров может осуществить специалист в данной области. Селектируемые маркеры могут быть введены в клетку в отдельной плазмиде в одно и то же время с представляющим интерес геном или они могут быть введены в одной и той же плазмиде. При введении в одной и той же плазмиде селектируемый маркер и представляющий интерес ген могут быть под контролем разных промоторов или одного и того же промотора, в случае последнего расположения продуцируется дицистронный мессенджер. Конструкции такого типа известны в данной области (например, патент США 4713339). Элементы экспрессии экспрессирующих систем варьируют по своей длине и специфичности. В зависимости от используемой системы хозяин/вектор в экспрессирующем векторе можно использовать любой из ряда подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцируемые промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах можно использовать индуцируемые промоторы, такие как pL бактериофага , plac, ptrp, ptac (гибридный промотор ptrp-lac) и тому подобные; при клонировании в системах клеток насекомых можно использовать такие промоторы, как промотор полиэдрина бакуловируса; при клонировании в системах клеток растений можно использовать промоторы, полученные из генома растительных клеток (например, промоторы теплового шока; промотор для малой субъединицы RUBISCO; промотор для белка, связывающего хлорофилл а/b) или из вирусов растений (например, промотор 35S РНК CaMV; промотор белка оболочки TMV); при клонировании в системах клеток млекопитающих можно использовать промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор 7,5 К вируса вакцинии); при создании линий клеток, которые содержат множественные копии продукта экспрессии, можно использовать векторы, основанные на SV40, BPV иEBV с соответствующим селектируемым маркером. В тех случаях, когда используют экспрессирующие векторы растений, экспрессия последовательностей, кодирующих линейные или нециклические формы химерных белков согласно изобретению, может управляться любым из ряда промоторов. Например, можно использовать вирусные промоторы, такие как промоторы 35S РНК и 19S РНК CaMV (Brisson et al. 1984, Nature 310: 511-514) или промотор белка оболочки TMV (Takamatsu et al. 1987, EMBO J. 6: 307-311); альтернативно, можно использовать промоторы растений, такие как промотор малой субъединицы RUBISCO (Coruzzi et al. 1984, EMBO J. 3: 1671-1680;Broglie et al. 1984, Science 224: 838-843) или промотор теплового шока, например hsp17.5-E или hsp17.3-B сои (Gurley et al. 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 559-565). Указанные конструкции могут быть введены в клетки растений с использованием Ti-плазмид, Ri-плазмид, векторов на основе вирусов растений, прямой трансформацией ДНК, микроинъекцией, электропорацией и т.д. Обзор таких способов смотрите, например, в Weissbach and Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY,- 20012566SectionVIII, pp. 421-463; и Grierson and Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 79. В одной системе экспрессии насекомых, которую можно использовать для получения химерных белков согласно изобретению, используют вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность может быть клонирована в несущественных областях (например, в гене полиэдрина) вируса и помещена под контроль промотора AcNPV (например, промотор полиэдрина). Успешное встраивание кодирующей последовательности приведет к инактивации гена полиэдрина и продукции невкрапленного рекомбинантного вируса (т.е. вируса, у которого отсутствует белковая оболочка, кодируемая геном полиэдрина). Затем указанные рекомбинантные вирусы используют для инфекции клеток Spodoptera frugiperda, в которых встроенный ген экспрессируется (см., например, Smith et al. 1983, J. Virol. 46: 584; патент США 4215051). Дополнительные примеры такой системы экспрессии можно найти в Ausubel et al., eds. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish.Assoc. and Wiley Interscience. Другой системой, которую можно использовать для экспрессии химерных белков согласно изобретению, является система экспрессии гена глутаминсинтетазы, также называемая системой экспрессииGS (Lonza Biologics PLC, Berkshire UK). Указанная система экспрессии подробно описана в патенте США 5981216. В клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать ряд основанных на вирусах систем экспрессии. В тех случаях, когда в качестве экспрессирующего вектора используют аденовирус, кодирующая последовательность может быть лигирована с комплексом регуляции транскрипции/трансляции аденовируса, например поздним промотором и состоящей из трех частей лидерной последовательностью. Затем указанный химерный ген может быть встроен в аденовирусный геном посредством рекомбинацииin vitro или in vivo. Инсерция в несущественную область вирусного генома (например, область Е 1 или Е 3) в результате приведет к рекомбинантному вирусу, который является жизнеспособным и способен экспрессировать пептид у инфицированных хозяев (см., например, Logan and Shenk 1984, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 81: 3655). Альтернативно, можно использовать промотор 7.5K вакцинии (см., например,Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49:857; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927). В тех случаях, когда в качестве экспрессирующего вектора используют аденовирус, кодирующая последовательность может быть лигирована с комплексом регуляции транскрипции/трансляции аденовируса, например поздним промотором и состоящей из трех частей лидерной последовательностью. Затем указанный химерный ген может быть встроен в аденовирусный геном посредством рекомбинации invitro или in vivo. Инсерция в несущественную область вирусного генома (например, область Е 1 или Е 3) в результате приведет к рекомбинантному вирусу, который является жизнеспособным и способен экспрессировать пептид у инфицированных хозяев (см., например, Logan and Shenk 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81: 3655). Альтернативно, можно использовать промотор 7.5 K вакцинии (см., например, Mackett etNatl. Acad. Sci. USA 79:4927). Клетки-хозяева, содержащие конструкции ДНК химерного белка, выращивают в подходящей среде для роста. В используемом в данном описании смысле термин подходящая среда для роста означает среду, содержащую питательные вещества, требуемые для роста клеток. Питательные вещества, требуемые для роста клеток, могут включать источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты,витамины, минералы и факторы роста. Необязательно среды могут содержать сыворотку теленка или фетальную сыворотку теленка. В одном варианте среда, по существу, не содержит IgG. Среда для роста,как правило, будет выбираться для клеток, содержащих конструкцию ДНК, например, посредством лекарственной селекции или с использованием дефицита незаменимого питательного вещества, которые комплементируются селектируемым маркером в конструкции ДНК или котрансфицируемым вместе с конструкцией ДНК. Культивируемые клетки млекопитающих обычно выращивают в коммерчески доступной содержащей сыворотку или бессывороточной среде (например, MEM, DMEM). Выбор среды,подходящей для конкретной используемой линии клеток, может осуществить специалист в данной области. Рекомбинантно полученный химерный белок согласно изобретению может быть выделен из культуральной среды. Культуральную среду от соответствующим образом выращенных трансформированных или трансфицированных клеток-хозяев отделяют от клеточного материала и показывают присутствие химерных белков. Одним из способов выявления химерных белков, например, является связывание химерных белков или частей химерных белков со специфичным антителом, узнающим химерный белок согласно изобретению. Антитело против химерного белка может быть моноклональным или поликлональным антителом, вырабатываемым против рассматриваемого химерного белка. Например, химерный белок содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина. Антитела, узнающие константную область многих иммуноглобулинов, известны в данной области и являются коммерчески доступными. Антитело может быть использовано для осуществления ELISA или для вестерн-блота, что- 21012566 бы выявить наличие химерного белка согласно изобретению. Химерный белок согласно изобретению может быть синтезирован в трансгенном животном, таком как грызун, корова, свинья, овца или коза. Термин трансгенные животные относится к животным, отличным от человека, в геном которых был введен чужеродный ген. Так как данный ген присутствует в зародышевых тканях, он передается от родителей потомству. Экзогенные гены вводят в одноклеточные эмбрионы (Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438). Способы получения трансгенных животных известны в данной области, включая трансгенные организмы, которые продуцируют молекулы иммуноглобулина (Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6376; McKnight et al. 1983, Cell 34:335; Brinster et al. 1983, Nature 306:332; Ritchie et al. 1984, Nature 312:517; Baldassarre et al. 2003,Theriogenology 59:831; Robl et al. 2003, Theriogenology 59:107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10(3):267). Химерный белок согласно изобретению также может быть получен при комбинировании способов химического синтеза и способов рекомбинации. Например, часть константной области иммуноглобулина может быть экспрессирована рекомбинантно, как описано выше. Биологически активная молекула может быть получена с использованием известных способов химического синтеза (например, твердофазным синтезом). Часть константной области иммуноглобулина может быть лигирована с биологически активной молекулой с использованием химического лигирования и затем объединена с частью константной области иммуноглобулина, которая не была лигирована с биологически активной молекулой, с образованием химерного белка согласно изобретению. В одном варианте часть константной области иммуноглобулина представляет собой Fc-фрагмент. Fc-фрагмент может быть получен рекомбинантно, чтобы образоватьCys-Fc, и подвергнут взаимодействию с биологически активной молекулой, имеющей тиоэфир, чтобы получить гибрид мономер-димер. В другом варианте получают Fc-тиоэфир и подвергают взаимодействию с биологически активной молекулой, имеющей N-концевой цистеин (фиг. 4). В одном варианте часть константной области иммуноглобулина, лигированная с биологически активной молекулой, будет образовывать гомодимеры. Гомодимеры могут быть разрушены при воздействии на гомодимеры денатурирующих и восстанавливающих условий (например, бета-меркаптоэтанол и 8 М мочевина) и затем объединены с частью константной области иммуноглобулина, не связанного с биологически активной молекулой, с образованием гибридов мономер-димер. Затем гибриды мономердимер подвергают ренатурации и рефолдингу посредством диализа в PBS и выделяют, например, эксклюзионной хроматографией по размеру или аффинной хроматографией. В другом варианте часть константной области иммуноглобулина будет образовывать гомодимеры перед связыванием с биологически активной молекулой. В данном варианте условия реакции для связывания биологически активной молекулы с гомодимером, можно корректировать так, чтобы связывание биологически активной молекулы происходило предпочтительно с одной цепью гомодимера (например,корректируя молярные эквиваленты каждого реагирующего вещества). Биологически активная молекула может быть химически синтезирована с N-концевым цистеином. Последовательность, кодирующая часть константной области иммуноглобулина, может быть субклонирована в векторе, кодирующем интеин, связанный с хитин-связывающим доменом (New England Biolabs,Beverly, MA). Интеин может быть связан с С-концом части константной области иммуноглобулина. В одном варианте часть иммуноглобулина с интеином, связанным с ее С-концом, может быть экспрессирована в прокариотической клетке. В другом варианте часть иммуноглобулина с интеином, связанным с ее С-концом, может быть экспрессирована в эукариотической клетке. Часть константной области иммуноглобулина, связанная с интеином, может быть подвергнута взаимодействию с MESNA. В одном варианте часть константной области иммуноглобулина, связанную с интеином, связывают с колонкой, например,колонкой с хитином, и затем элюируют, используя MESNA. Биологически активная молекула и часть иммуноглобулина могут быть подвергнуты взаимодействию друг с другом так, чтобы происходила нуклеофильная перегруппировка и биологически активная молекула ковалентно связывалась с частью иммуноглобулина посредством амидной связи (Dawsen et al. 2000, Annu. Rev. Biochem. 69: 923). Синтезированный таким образом химерный белок необязательно может содержать линкерный пептид между частью иммуноглобулина и биологически активной молекулой. Линкер можно, например, синтезировать на N-конце биологически активной молекулы. Линкеры могут включать пептиды и/или органические молекулы (например, полиэтиленгликоль и/или короткие аминокислотные последовательности). Указанный комбинированный рекомбинантный и химический синтез позволяет проводить быстрый скрининг биологически активных молекул и линкеров, чтобы оптимизировать требуемые свойства химерного белка согласно изобретению, например ингибирование вирусов, гемостаз, продукция красных кровяных клеток, биологическое время полужизни, стабильность, связывание с белками сыворотки или некоторые другие свойства химерного белка. Способ также позволяет вводить не встречающиеся в природе аминокислоты в химерный белок согласно изобретению, которые могут быть применимы для оптимизации требуемого химерного белка согласно изобретению. При желании химерный белок, полученный таким способом, может быть подвергнут рефолдингу до биологически активной конформации с использованием условий, известных в данной области, например восстанавливающих условий, и затем медленно диа- 22012566 лизован в PBS. Альтернативно, N-концевой цистеин может быть на части константной области иммуноглобулина,например, Fc-фрагменте. Fc-фрагмент может быть создан с N-концевым цистеином, принимая во внимание тот факт, что нативный Fc имеет цистеин в положении 226 (смотрите Kabat et al. 1991, Sequences ofProteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda, MD). Чтобы экспрессировать концевой цистеин, Fc-фрагмент может быть экспрессирован рекомбинантно. В одном варианте Fc-фрагмент экспрессируют в прокариотической клетке, например Е. coli. Последовательность, кодирующую Fc-часть, начиная с Cys 226 (нумерация EU), можно поместить сразу после последовательности, кодирующей сигнальный пептид, например OmpA, PhoA, STII. Прокариотическую клетку можно подвергнуть осмотическому шоку, чтобы высвободить рекомбинантный Fc-фрагмент. В другом варианте Fc-фрагмент продуцируют в эукариотической клетке, например клетке СНО, клетке ВНК. Последовательность, кодирующую фрагмент Fc-части, можно поместить прямо после последовательности, кодирующей сигнальный пептид, например сигнальной последовательности легкой цепи Igk мыши или сигнальной последовательности Kb MHC класса I так, чтобы когда рекомбинантный химерный белок синтезировался эукариотической клеткой, сигнальная последовательность отщеплялась, оставляя при этом N-концевой цистеин, затем белок может быть выделен и подвергнут химическому взаимодействию с молекулой, несущей тиоэфир (например, С-концевой тиоэфир, если молекула состоит из аминокислот).N-концевой цистеин на Fc-фрагменте также может быть создан с использованием фермента, который расщепляет свой субстрат у его N-конца, например фактор Ха, энтерокиназы, и продукт может быть выделен и подвергнут взаимодействию с молекулой, имеющий тиоэфирную группу. Рекомбинантно экспрессированный Fc-фрагмент может быть использован для получения гомодимеров или гибридов мономер-димер. В конкретном варианте Fc-фрагмент экспрессируют с сигнальным пептидом интерферона человека,расположенным рядом с Cys в положении 226. Когда конструкцию, кодирующую данный полипептид,экспрессируют в клетках СНО, клетки СНО отщепляют сигнальный пептид в двух разных положениях (уCys 226 и у Val в сигнальном пептиде на 2 аминокислоты выше в направлении N-конца). Это приводит к образованию смеси двух видов Fc-фрагментов (один с N-концевым Val и один с N-концевым Cys). Это в свою очередь приводит к смеси димерных видов (гомодимеры с концевым Val, гомодимеры с концевымCys и гетеродимеры, в которых одна цепь имеет концевой Cys, а другая цепь имеет концевой Val). Fcфрагменты могут быть подвергнуты взаимодействию с биологически активной молекулой, имеющей Сконцевой тиоэфир и полученный в результате гибрид мономер-димер может быть выделен из смеси (например, эксклюзионной хроматографией по размеру). Предполагается, что при использовании других последовательностей сигнального пептида для экспрессии Fc-фрагментов в клетках СНО будет образовываться смесь видов Fc-фрагментов по меньшей мере с двумя разными N-концами. В другом варианте рекомбинантно полученный Cys-Fc может образовывать гомодимер. Гомодимер может быть подвергнут взаимодействию с пептидом, который имеет разветвленный линкер на С-конце,при этом разветвленный линкер имеет два С-концевых тиоэфира, которые могут быть подвергнуты взаимодействию с Cys-Fc. В другом варианте биологически активная молекула имеет один неконцевой тиоэфир, который может быть подвергнут взаимодействию с Cys-Fc. Альтернативно, разветвленный линкер может иметь два С-концевых цистеина, которые могут взаимодействовать с тиоэфиром Fc. В другом варианте разветвленный линкер имеет две функциональные группы, которые могут быть подвергнуты взаимодействию с тиоэфиром Fc, например 2-меркаптоамин. Биологически активная молекула может состоять из аминокислот. Биологически активная молекула может включать малую органическую молекулу или малую неорганическую молекулу.F. Способы применения химерных белков Химерные белки согласно изобретению имеют много применений, которые будут известны специалисту в данной области, включая, но не ограничивая указанным, способы лечения субъекта при заболевании или патологическом состоянии. Заболевание или состояние может включать, без ограничения, вирусную инфекцию, гемостатическое расстройство, анемию, злокачественную опухоль, лейкоз, воспалительное состояние или аутоиммунное заболевание (например, артрит, псориаз, системная красная волчанка, множественный склероз) или бактериальную инфекцию (см., например, патенты США 6086875, 6030613, 6485726; WO 03/077834; US2003-0235536A1). 1. Способы лечения субъекта с недостаточностью красных кровяных клеток Изобретение относится к способу лечения субъекта, имеющего недостаточность красных кровяных клеток, например анемию, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, при этом химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, где первая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере один агент, способный индуцировать пролиферацию красных кровяных клеток, например ЕРО, и вторая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть иммуноглобулина без агента,способного индуцировать пролиферацию красных кровяных клеток, имеющегося в первой цепи. 2. Способы лечения субъекта с вирусной инфекцией- 23012566 Изобретение относится к способу лечения субъекта, имеющего вирусную инфекцию или подвергнутого воздействию вируса, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, при этом химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, где первая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере один противовирусный агент, например ингибитор слияния или интерферон , и вторая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть иммуноглобулина без противовирусного агента, имеющегося в первой цепи. В одном варианте субъект инфицирован вирусом, который можно лечитьIFN, например, вирусом гепатита С. В одном варианте субъект инфицирован ВИЧ, таким как ВИЧ-1 или ВИЧ-2. В одном варианте химерный белок согласно изобретению ингибирует репликацию вирусов. В одном варианте химерный белок согласно изобретению предотвращает или ингибирует проникновение вируса в клетки-мишени, тем самым останавливая, предотвращая или ограничивая распространение вирусной инфекции у субъекта и уменьшая вирусную нагрузку инфицированного субъекта. Благодаря связыванию части иммуноглобулина с ингибитором слияния вирусов изобретение обеспечивает химерный белок с активностью, ингибирующей слияние вирусов, с более высокой стабильностью и более высокой биодоступностью по сравнению с ингибиторами слияния, используемыми отдельно, например Т 20, Т 21,Т 1249. Таким образом в одном варианте ингибитор слияния вирусов уменьшает или предотвращает ВИЧ-инфекцию клетки-мишени, например инфекции ВИЧ-1. а) Состояния, которые можно лечить Химерный белок согласно изобретению можно использовать для ингибирования или предотвращения инфекции клетки-мишени вирусом гепатита, например вирусом гепатита С. Химерный белок может содержать противовирусный агент, который ингибирует репликацию вирусов. В одном варианте химерный белок согласно изобретению содержит ингибитор слияния. Химерный белок согласно изобретению можно использовать для ингибирования или предотвращения инфекции любой клетки-мишени любым вирусом (см., например, патенты США 6086875, 6030613, 6485726; WO 03/077834; US2003-0235536 А 1). В одном варианте вирус является вирусом, покрытым оболочкой, таким как, без ограничения, ВИЧ, SIV, вирус кори, гриппа, вирус Эпштейн-Барра, респираторносинцитиальный вирус или вирус парагриппа. В другом варианте вирус является вирусом, не покрытым оболочкой, таким как риновирус или вирус полиомиелита. Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения субъекта, уже инфицированного вирусом. Субъект может быть иметь острую вирусную инфекцию. Альтернативно, субъект может быть хронически инфицирован вирусом. Химерный белок согласно изобретению также можно использовать для профилактического лечения субъекта, для которого существует риск заражения вирусной инфекцией, например субъекта, который, как известно или предположительно, близко контактирует с вирусом, или субъекта, который предположительно инфицирован или несет вирус. Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения субъекта, который подвергался воздействию вируса, но который еще не имеет позитивного диагноза. В одном варианте изобретение относится к способу лечения субъекта, инфицированного HCV,включающему в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества химерного белка, при этом химерный белок содержит Fc-фрагмент IgG и цитокин, например IFN. В одном варианте изобретение относится к способу лечения субъекта, инфицированного ВИЧ,включающему в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества химерного белка, при этом химерный белок содержит Fc-фрагмент IgG и ингибитор слияния вируса содержит Т 20. 3. Способы лечения субъекта, имеющего гемостатическое расстройство Изобретение относится к способу лечения субъекта, имеющего гемостатическое расстройство,включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, при этом химерный белок содержит первую и вторую цепи, где первая цепь содержит по меньшей мере один фактор свертывания крови и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина. Химерный белок согласно изобретению лечит или предотвращает гемостатическое расстройство,стимулируя образование сгустка фибрина. Химерный белок согласно изобретению может активировать любой член каскада коагуляции. Фактор свертывания крови может быть участником внешнего пути,внутреннего пути или обоих путей. В одном варианте фактором свертывания крови является фактор VII или фактор VIIa. Фактор VIIa может активировать фактор X, который взаимодействует с фактором Va,расщепляя протромбин до тромбина, который в свою очередь расщепляет фибриноген до фибрина. В другом варианте фактором свертывания крови является фактор IX или фактор IXa. В еще одном варианте фактором свертывания крови является фактор VIII или фактор VIIIa. В еще одном варианте фактором свертывания крови является фактор фон Виллебрандта, фактор XI, фактор XII, фактор V, фактор X или фактор XIII. а) Состояния, которые можно лечить Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения любого гемостатического- 24012566 расстройства. Гемостатические расстройства, которые можно лечить введением химерного белка согласно изобретению, включают, но не ограничены указанным, гемофилию А, гемофилию В, болезнь фон Виллебрандта, недостаточность фактора XI (недостаточность РТА), недостаточность фактора XII, а также недостаточности или структурные аномалии фибриногена, протромбина, фактора V, фактора VII,фактора X или фактора XIII. В одном варианте гемостатическое расстройство является наследственным расстройством. В одном варианте субъект имеет гемофилию А и химерный белок содержит фактор VIII или фактор VIIIa. В другом варианте субъект имеет гемофилию А и химерный белок содержит фактор VII или фактор VIIa. В другом варианте субъект имеет гемофилию В и химерный белок содержит фактор IX или фактор IXa. В другом варианте субъект имеет гемофилию В и химерный белок содержит фактор VII или фактор VIIa. В другом варианте субъект имеет ингибирующие антитела к фактору VIII или фактору VIIIa и химерный белок содержит фактор VII или фактор VIIa. В еще одном варианте субъект имеет ингибирующие антитела против фактора IX или фактора IXa и химерный белок содержит фактор VII или фактор VIIa. Химерный белок согласно изобретению можно использовать для профилактического лечения субъекта с гемостатическим расстройством. Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения острого эпизода кровотечения у субъекта с гемостатическим расстройством. В одном варианте гемостатическое расстройство является результатом недостаточности фактора свертывания крови, например фактора IX, фактора VIII. В другом варианте гемостатическое расстройство может быть результатом дефектного фактора свертывания крови, например фактора фон Виллебрандта. В другом варианте гемостатическое расстройство может представлять собой приобретенное расстройство. Приобретенное расстройство может быть результатом лежащего в основе вторичного заболевания или состояния. Неродственным состоянием может быть, например, без ограничения, злокачественная опухоль, аутоиммунное заболевание или беременность. Приобретенное расстройство может быть результатом пожилого возраста или медикаментозного лечения, лежащего в основе вторичного расстройства (например, химиотерапии злокачественной опухоли). 4. Способы лечения субъекта, нуждающегося в общем гемостатическом агенте Изобретение также относится к способам лечения субъекта, который не имеет гемостатического расстройства или вторичного заболевания или состояния, приводящего к приобретению гемостатического расстройства. Таким образом, изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в общем гемостатическом агенте, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, при этом химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, где первая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и по меньшей мере один фактор свертывания крови и вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без фактора свертывания крови, имеющегося в первой полипептидной цепи. а) Состояния, которые можно лечить В одном варианте субъекта, нуждающегося в общем гемостатическом агенте, подвергают или собираются подвергнуть хирургической операции. Химерный белок согласно изобретению можно вводить перед или после операции в качестве профилактического средства. Химерный белок согласно изобретению можно вводить во время или после операции, чтобы контролировать острый эпизод кровотечения. Хирургическая операция может включать, но не ограничена указанным, трансплантацию печени, резекцию печени или трансплантацию стволовых клеток. Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения субъекта, имеющего острый эпизод кровотечения, который не имеет гемостатического расстройства. Острый эпизод кровотечения может быть результатом тяжелой травмы, например хирургической операции, автомобильной аварии, ранения, огнестрельного ранения или любого другого травмирующего события, приводящего к неконтролируемому кровотечению. 5. Средства лечения Химерный белок согласно изобретению можно вводить внутривенно, подкожно, внутримышечно или через любую поверхность слизистой оболочки, например, пероральным, подъязычным, буккальным,подъязычным, назальным, ректальным, вагинальным способом или через легочный путь. Химерный белок может быть имплантирован в твердую подложку на основе биополимера или связан с подложкой,которая обеспечивает возможность медленного высвобождения химерного белка в требуемом месте. Доза химерного белка согласно изобретению будет варьироваться в зависимости от субъекта и конкретного используемого пути введения. Дозы могут быть в диапазоне от 0,1 до 100000 мкг/кг массы тела. В одном варианте пределы доз составляют 0,1-1000 мкг/кг. Белок может вводиться непрерывно или с конкретными временными интервалами. Можно использовать анализы in vitro, чтобы определить оптимальные пределы доз и/или схемы введения. В данной области известно много анализов in vitro, в которых измеряют инфекционность вируса. Например, можно использовать анализ обратной транскриптазы или ОТ-ПЦР-анализ или анализ разветвленной ДНК, чтобы измерить концентрации ВИЧ. Можно использовать анализ StaClot, чтобы измерить свертывающую активность. Кроме того, эффективные дозы- 25012566 можно экстраполировать на основе кривых доза-ответ, полученных в моделях на животных. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей ингибитор слияния вируса, по меньшей мере часть иммуноглобулина и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin. Примеры эксципиентов могут включать крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия,сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция также может содержать реагенты для рН-буферов и увлажнители или эмульгаторы. Для перорального введения фармацевтическая композиция может иметь форму таблеток или капсул, полученных обычными способами. Композиция также может быть получена в виде жидкости, например сиропа или суспензии. Жидкость может содержать суспендирующие агенты (например, сироп сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры), эмульгаторы (лецитин или акациевую камедь), неводные наполнители (например, миндальное масло, маслянистые сложные эфиры,этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-пара-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты также могут содержать корригенты,красители и подсластители. Альтернативно, композиция может быть получена в виде сухого продукта для приготовления с водой или другим подходящим наполнителем. Для буккального и подъязычного введения композиции можно придавать форму таблеток, лепешек или быстро растворяющихся пленок согласно обычным протоколам. В случае введения путем ингаляции соединения для применения согласно настоящему изобретению обычно доставляют в форме аэрозольного спрея из упаковки под давлением или распылителя (например,в PBS) с подходящим газом-вытеснителем, например дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторметаном, углекислым газом или другим подходящим газом. В случае аэрозоля под давлением единицу дозирования можно определять, снабжая клапаном для доставки измеряемого количества. Могут быть приготовлены капсулы и картриджи, например, из желатина, для применения в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошкообразную смесь соединения и подходящую порошкообразную основу, такую как лактоза или крахмал. Фармацевтическая композиция может быть приготовлена для парентерального введения (например,внутривенного или внутримышечного) посредством инъекции болюса. Препараты для инъекции могут быть представлены в дозированной лекарственной форме, например в ампулах или контейнерах, содержащих несколько доз с добавлением консерванта. Композиции могут иметь такие формы, как суспензии или эмульсии в масляных или водных наполнителях, и содержать агенты для приготовления лекарственного средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка для перерастворения с использованием подходящего наполнителя, например апирогенной воды. Фармацевтическая композиция также может быть приготовлена для ректального введения в виде суппозитория или удерживающей клизмы, например, содержащих обычные для суппозиториев основы,такие как масло какао или другие глицериды. 6. Комбинированная терапия Химерный белок согласно изобретению можно использовать для лечения субъекта с заболеванием или состоянием в комбинации по меньшей мере с одним другим известным средством для лечения указанного заболевания или состояния. В одном варианте изобретение относится к способу лечения субъекта, инфицированного ВИЧ,включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, содержащего первую и вторую цепи, в котором первая цепь содержит ингибитор слияния ВИЧ и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и вторая цепь содержит по меньшей мере часть иммуноглобулина без ингибитора слияния ВИЧ, имеющегося в первой цепи, в комбинации по меньшей мере с одним другим агентом против ВИЧ. Указанным другими агентом против ВИЧ может быть любое терапевтическое средство, для которого показана анти-ВИЧ-активность. Указанный другой агент против ВИЧ в качестве примера может включать, но не ограничен указанным, ингибитор протеазы (например, Amprenavir; Crixivan, Ritonivir), нуклеозидный аналог обратной транскриптазы (например, AZT, DDI, D4T, 3 ТС, Ziagen), ненуклеозидный аналог-ингибитор обратной транскриптазы (например, Sustiva), другие ингибиторы слияния ВИЧ, нейтрализующее антитело, специфичное по отношению к ВИЧ, антитело, специфичное по отношению к CD4, миметик CD4, например слитый белокCD4-IgG2 (заявка на выдачу патента США 09/912824) или антитело, специфичное по отношению к CCR5 или CXCR4, или специфичный связывающий партнер CCR5 или CXCR4. В другом варианте изобретение относится к способу лечения субъекта с гемостатическим расстройством, включающему в себя введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного химерного белка, содержащего первую и вторую цепи, в котором первая цепь содержит по меньшей мере один фактор свертывания крови и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без фактора свертыва- 26012566 ния крови, имеющегося в первой цепи, в комбинации по меньшей мере с одним другим фактором свертывания крови или агентом, который стимулирует гемостаз. Указанным другим фактором свертывания крови или агентом, который стимулирует гемостаз, может быть любое терапевтическое средство с показанной свертывающей активностью. В качестве неограничивающего примера фактор свертывания крови или гемостатический агент может включать фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X,фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин или фибриноген или активированные формы любого из указанных выше. Фактор свертывания крови или гемостатический агент также может включать антифибринолитические лекарственные средства, например эпсилон-аминокапроновую кислоту, транексамовую кислоту. 7. Способы ингибирования слияния вирусов с клеткой-мишенью Изобретение также относится к способу in vitro ингибирования слияния ВИЧ с клеткой млекопитающего, включающему в себя комбинирование клетки млекопитающего по меньшей мере с одним химерным белком, при этом химерный белок содержит первую и вторую цепи, где первая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина и ингибитор ВИЧ и вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без ингибитора ВИЧ, имеющегося в первой цепи. Клетка млекопитающего может включать любую клетку или линию клеток, чувствительную к инфекции ВИЧ, включая, без ограничения, первичные Т-клетки CD4+ человека или макрофаги, клеткиG. Способы выделения химерных белков Обычно, когда получают химерные белки согласно изобретению, они находятся в смеси других молекул, таких как другие белки или фрагменты белков. Таким образом, изобретение относится к способам выделения любого из химерных белков, описанных выше, из смеси, содержащей химерные белки. Определено, что химерные белки согласно изобретению связываются с лигандами-красителями в подходящих условиях и что изменение указанных условий после связывания может разрывать связь между лигандомкрасителем и химерным белком, тем самым обеспечивая способ выделения химерного белка. В некоторых вариантах смесь может содержать гибрид мономер-димер, димер и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, например Fc. Таким образом, в одном варианте изобретение относится к способу выделения гибрида мономер-димер. В другом варианте изобретение относится к способу выделения димера. Соответственно в одном варианте изобретение относится к способу выделения гибрида мономердимер из смеси, когда смесь содержитa) гибрид мономер-димер, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая цепь содержит биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, и в котором вторая цепь содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина без биологически активной молекулы или вариабельной области иммуноглобулина;b) димер, содержащий первую и вторую полипептидные цепи, в котором первая и вторая цепи обе содержат биологически активную молекулу и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина; иc) часть константной области иммуноглобулина; при этом указанный способ включает в себя: 1) осуществление контакта смеси с лигандом-красителем, связанным с твердой подложкой в подходящих условиях, так что и гибрид мономер-димер и димер связываются с лигандом-красителем; 2) удаление несвязанной части константной области иммуноглобулина; 3) изменение подходящих условий 1) так, что связь между гибридом мономер-димер и лигандомкрасителем, связанным с твердым подложкой, разрывается; 4) выделение гибрида мономер-димер. В некоторых вариантах перед осуществлением контакта смеси с лигандом-красителем смесь может быть подвергнута контакту с веществом для хроматографии, таким как белок А-сефароза или тому подобным. Смесь элюируют с вещества для хроматографии, используя подходящий элюирующий буфер(например, буфер с низким значением рН) и элюат, содержащий смесь, затем подвергают контакту с лигандом-красителем. Подходящие условия для контактирования смеси с лигандом-красителем могут включать буфер для поддержания смеси при соответствующем рН. Соответствующее значение рН может составлять 3-10, 49, 5-8. В одном варианте соответствующее значение рН равно 8,0. Можно использовать любой буферный агент, известный в данной области, при условии, что он поддерживает рН в соответствующем диапазоне,например Трис, HEPES, PIPES, MOPS. Подходящие условия также могут включать буфер для промывки,чтобы элюировать несвязанные формы с лиганда-красителя. Буфером для промывки может быть любой буфер, который не разрушает связывание связанной формы. Например, буфером для промывки может быть такой же буфер, который используют на стадии контактирования. После того как химерный белок связывают с лигандом-красителем, химерный белок выделяют, из- 27012566 меняя подходящие условия. Изменение подходящих условий может включать добавление соли к буферу. Можно использовать любую соль, например NaCl, KCl. Соль следует добавлять в концентрации, которая является достаточно высокой, чтобы разрушить связывание между лигандом-красителем и требуемой формой, например, гибридом мономер-димер. В некоторых вариантах, когда смесь состоит из Fc, гибрида мономер-димер и димера, обнаружено,что Fc не связывается с лигандом-красителем и следовательно элюируется проходящим потоком. Димер связывается более прочно с лигандом-красителем, чем гибрид мономер-димер. Таким образом, требуется более высокая концентрация соли, чтобы разрушить связь (например, элюировать) между димером и лигандом-красителем, по сравнению с концентрацией соли, необходимой для разрушения связи между лигандом-красителем и гибридом мономер-димер. В некоторых вариантах можно использовать NaCl, чтобы выделить гибрид мономер-димер из смеси. В некоторых вариантах соответствующая концентрация соли, которая разрушает связь между лигандом-красителем и гибридом мономер-димер, составляет 200-700, 300-600, 400-500 мМ. В одном варианте концентрация NaCl, требуемая для разрушения связывания между лигандом-красителем и гибридом мономер-димер, составляет 400 мМ.NaCl также можно использовать для выделения димера из смеси. Обычно гибрид мономер-димер выделяют из смеси до выделения димера. Димер выделяют добавлением соответствующей концентрации соли к буферу, таким образом разрушая связывание между лигандом-красителем и димером. В некоторых вариантах соответствующая концентрация соли, которая разрушает связь между лигандомкрасителем и димером составляет от 800 мМ до 2 М, от 900 мМ до 1,5 М, от 950 мМ до 1,2 М. В одном конкретном варианте используют 1 М NaCl, чтобы разрушить связывание между лигандом-красителем и димером. Лигандом-красителем может быть биомиметик. Биомиметик представляет собой искусственно полученное вещество, устройство или систему, которая имитирует природную. Таким образом, в некоторых вариантах лиганд-краситель имитирует молекулы лигандов, встречающихся в природе. Лигандкраситель может быть выбран из Mimetic Red 1, Mimetic Red 2, Mimetic Orange 1, Mimetic Orange 2, Mimetic Orange 3, Mimetic Yellow 1, Mimetic Yellow 2, Mimetic Green 1, Mimetic Blue 1 иMimetic Blue 2 (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). В одном конкретном варианте лигандомкрасителем является Mimetic Red 2 (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). В некоторых вариантах лиганд-краситель связывают с твердой подложкой, например, из Mimetic Red 1 A6XL, Mimetic Red 2 A6XL, Mimetic Orange 1 A6XL, Mimetic Orange 2 A6XL, Mimetic Orange 3 A6XL, Mimetic Yellow 1 A6XL, Mimetic Yellow 2 A6XL, Mimetic Green 1 A6XL, Mimetic Blue 1 A6XL и MimeticBlue 2 A6XL (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). Лиганд-краситель может быть связан с твердой подложкой. Твердой подложкой может быть любая твердая подложка, известная в данной области (см., например, www.seperationsNOW.com). Примеры твердых подложек могут включать шарик, гель, мембрану, наночастицу или микросферу. Твердая подложка может содержать любой материал, который может быть связан с лигандом-красителем (например,агарозу, полистирол, сефарозу, сефадекс). Твердые подложки могут содержать любой синтетический органический полимер, такой как полиакриловый, виниловый полимеры, акрилат, полиметакрилат и полиакриламид. Твердые подложки также могут содержать углеводный полимер, например агарозу, целлюлозу или декстран. Твердые подложки могут содержать неорганические оксиды, такие как диоксид кремния, диоксид циркония, диоксид титана, оксид церия, оксид алюминия, магнезию (т.е. оксид магния) или оксид кальция. Твердые подложки также могут содержать комбинации некоторых из указанных выше подложек, включая, без ограничения, декстран-акриламид. ПРИМЕРЫ Пример 1. Молекулярная масса влияет на трасцитоз, опосредованный FcRn. Химерные белки, состоящие из различных представляющих интерес белков и IgG Fc, получали рекомбинантно (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory-gal) (Biodesign International, Saco, ME) и MAB-GH (комплекс моноклонального антитела и гормона роста) (Research Diagnostics, Inc. Flanders, NJ) приобретали из коммерческих источников. Коротко, гены,кодирующие представляющий интерес белок, клонировали посредством ПЦР и затем субклонировали в плазмиде, экспрессирующей слияние Fc. Плазмидами трансфицировали клетки DG44 СНО и отбирали стабильные трансфектанты и размножали с метотрексатом. Гомодимеры химерного белка очищали на колонке с белком А. Тестируемые белки включали интерферон , гормон роста, эритропоэтин, фолликулостимулирующий гормон, фактор IX, бета-галактозидазу, контактин и фактор VIII. Связывание белков с частями иммуноглобулина, включая партнер, связывающий рецептор FcRn, или использование коммерчески доступных комплексов полное антитело (включая FcRn-связывающую область)-антиген позволило исследовать трансгеноз как функцию молекулярной массы (см. патент США 6030613). Химерные белки вводили крысам перорально и измеряли уровни в сыворотке через 2-4 ч после введения, используяELISA для рекомбинантно полученных химерных белков и используя вестерн-блот и ELISA для коммер- 28012566 чески полученных комплексов антител и химерных белков. Кроме того, все коммерчески полученные белки или комплексы, а также контроли фактор VIII-Fc, фактор IX-Fc и Epo-Fc йодировали, используя шарики IODO (Pierce, Pittsburgh, PA). Результаты показали, что уровни в сыворотке Fc и химерных белков моноклональных антител, введенных крысам перорально, непосредственно связаны с размером белка. Вероятная точка отсечения для перорально вводимых химерных белков Fc находится между 200 и 285 кДа (табл. 2). Таблица 2 Пример 2. Клонирование рсДНК 3.1-Flag-Fc. Последовательность для пептида FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), обычной аффинной метки, используемой для идентификации или очистки белков, клонировали в плазмиде рсДНК 3.1-Fc,которая содержит сигнальную последовательность Ig мыши, за которой следует Fc-фрагмент IgG1 человека (аминокислоты 221-447, нумерация EU). Конструкцию создавали ПЦР с перекрыванием, используя следующие праймеры: Затем добавляли матрицу рсДНК 3.1-Fc к двум отдельным реакционным смесям для ПЦР, содержащим 50 пмоль каждой из пар праймеров FlagFc-F1/R1 или FlagFc-F2/R2 в 50 мкл реакционной смеси,используя ДНК-полимеразу Pfu Ultra (Stratagene, CA) согласно стандартному протоколу производителя,в термоциклере MJ, используя следующие циклы: 95 С 2 мин; 30 циклов (95 С 30 с, 52 С 30 с, 72 С 45 с), затем 72 С в течение 10 минт. Затем продукты указанных двух реакций смешивали в другой реакции ПЦР (2 мкл каждый) с 50 пмоль праймеров FlagFc-F1 и FlagFc-R2 в 50 мкл реакционной смеси, используя ДНК-полимеразу Pfu Ultra (Stratagene, CA) согласно стандартному протоколу производителя в термоциклере MJ, используя следующие циклы: 95 С 2 мин; 30 циклов (95 С 30 с, 52 С 30 с, 72 С 45 с) затем 72 С в течение 10 мин. Полученный в результате фрагмент очищали из геля, расщепляли и встраивали в плазмиду рсДНК 3.1-Fc в сайт Nhel-BamHI. Полученная в результате плазмида содержит сигнальную последовательность Ig мыши, продуцируя белок FlagFc. Пример 3. Клонирование конструкции фактор VTI-Fc. Кодирующую последовательность фактора VII получали в ОТ-ПЦР из РНК фетальной печени человека (Clontech, Palo Alto, CA). Клонированная область содержала последовательность кДНК от 36 п.н. до 1430 п.н., заканчивающуюся непосредственно перед стоп-кодоном. В N-конец вводили сайт SbfI. СайтBspEI вводили в С-конец. Конструкцию клонировали посредством ПЦР, используя праймеры Антисмысловой: Смысловой: и следующие условия: 95 С в течение 5 мин, затем 30 циклов (95 С в течение 30 с, 55 С в течение 30 с, 72 С в течение 1 мин и 45 с) и конечный цикл удлинения 12 С в течение 10 мин. Фрагмент расщепляли SbfI-BspEI и встраивали в pED.dC-Fc, плазмиду, кодирующую Fc-фрагментIgG1. Пример 4. Клонирование конструкции фактор IX-Fc. Кодирующую последовательность фактора IX, включая последовательность препропептида, получали амплификацией в ОТ-ПЦР из РНК печени взрослого человека, используя следующие праймеры: 20 нг РНК печени взрослого человека (Clontech, Palo Alto, СА) и 25 пмоль каждого праймера добавляли к реакционной смеси для ОТ-ПЦР, используя одностадийную ОТ-ПЦР Superscript с системой TaqPLATINUM (Invitrogen, Carlsbad, CA) согласно протоколу производителя. Реакцию осуществляли в термоциклере MJ, используя следующие циклы: 50 С 30 мин; 94 С 2 мин; 35 циклов (94 С 30 с, 58 С 30 с, 72 С 1 мин), и конечный 72 С 10 мин. Фрагмент очищали из геля, используя набор для экстракции из геля Qiagen (Qiagen, Valencia, CA), и расщепляли PstI-EcoRI, очищали из геля и клонировали в соответствующим образом расщепленной плазмиде pED.dC.XFc. Пример 5. Клонирование конструкции РАСЕ. Кодирующую последовательность эндопротеазы РАСЕ человека (фермент, расщепляющий спаренные основные аминокислоты) получали посредством ОТ-ПЦР. Использовали следующие праймеры: Праймер PACE-F1 добавляет сайт HindIII к 5'-концу последовательности РАСЕ, начиная с 3 нуклеотида перед стартовым кодоном, тогда как праймер PACE-R2 добавляет стоп-кодон после аминокислоты 715, которая имеет место на конце внеклеточного домена РАСЕ, а также добавляет сайт EcoRI к 3'концу стоп-кодона. Праймеры PACE-R1 и -F2 отжигаются с 3'- и 5'-стороны от внутреннего сайтаBamHI, соответственно. Затем готовили две реакционные смеси для ОТ-ПЦР, используя 25 пмоль каждой из пар праймеров PACE-F1/R1 или PACE-F2/R2 с 20 нг РНК печени взрослого человека (Clontech;Palo Alto, CA) в 50 мкл реакционной смеси для ОТ-ПЦР, используя одностадийную ОТ-ПЦРSuperscript с системой Taq PLATINUM (Invitrogen, Carlsbad, CA) согласно протоколу производителя. Реакцию осуществляли в термоциклере MJ, используя следующие циклы: 50 С 30 мин; 94 С 2 мин; 30 циклов (94 С 30 с, 58 С 30 с, 72 С 2 мин), затем 72 С 10 мин. Каждый из таких фрагментов лигировали в вектор pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) и полностью секвенировали. Затем фрагмент F2-R2 субклонировали в рсДНК 6 V5/His (Invitrogen, Carlsbad, CA), используя сайты BamHI/EcoRI, и затем фрагментF1-R1 клонировали в данной конструкции, используя сайты HindIII/BamHI. Конечная плазмида рсДНК 6 РАСЕ продуцировала растворимую форму РАСЕ (аминокислоты 1-715), так как трансмембранная область была делетирована. Последовательность РАСЕ в рсДНКб-РАСЕ по существу такая, как описано вHarrison et al. 1998, Seminars in Hematology 35: 4. Пример 6. Клонирование конструкции IFN-Fc-восьмиаминокислотный линкер. Кодирующую последовательность интерферона 2b человека (hIFN), включая сигнальную последовательность, получали посредством ПЦР из геномной ДНК человека, используя следующие праймеры: Геномную ДНК получали из линии клеток астроцитомы человека 373MG согласно стандартным способам (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Коротко, примерно 2105 клеток осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 100 мкл фосфатно-солевого буфера, рН 7,4, затем смешивали с равным объемом лизирующего буфера (100 мМ Трис рН 8,0/200 мМ NaCl/2% SDS/5 мМ ЭДТА). Добавляли протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл и образец расщепляли при 37 С в течение 4 ч, время от времени осторожно перемешивая. Затем образец дважды экстрагировали смесью фенол:хлороформ, ДНК преципитировали добавлением ацетата натрия рН 7,0 до 100 мМ и равного объема изопропанола, и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при комнатной температуре. Надосадок удаляли и осадок один раз промывали холодным 70% этанолом и давали возможность высохнуть на воздухе перед ресуспендированием в ТЕ (10 мМ Трис рН 8,0/1 мМ ЭДТА). Затем 100 нг полученной геномной ДНК использовали в реакции ПЦР в объеме 25 мкл с 25 пмоль каждого праймера, используя систему высокоточной Expand (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) согласно стандартному протоколу производителя, в термоциклере MJ, используя следующие циклы: 94 С 2 мин; 30 циклов (94 С 30 с, 50 С 30 с, 72 С 45 с), и наконец 72 С 10 мин. Полосу ожидаемого размера(550 п.н.) очищали из геля, используя набор для экстракции из геля (Qiagen, Valencia, CA), расщеплялиPstl/EcoRI, снова очищали в геле и клонировали в сайте Pstl/EcoRI pED.dC.XFc, которая содержит 8 аминокислотный линкер (EFAGAAAV), за которым следует область Fc IgG1 человека.

МПК / Метки

МПК: A61P 7/00, C07K 19/00, A61K 39/00, C12N 15/63, A61K 39/395, C12P 21/00

Метки: химерный, химерного, белка, получения, способ, белок, применением, заболеваний, лечения

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/30-12566-himernyjj-belok-sposob-ego-polucheniya-i-sposob-lecheniya-zabolevanijj-s-primeneniem-himernogo-belka.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Химерный белок, способ его получения и способ лечения заболеваний с применением химерного белка</a>