Нуклеиновая кислота, кодирующая il-32, белок il-32, антитело к il-32 и способы применения белка и антитела

012567 Настоящее изобретение относится к композициям и способам, связанным с интерлейкин- 18- индуцибельным цитокином, названным "фактор индукции фактора некроза опухоли-альфа" (TAIF), или интерлейкин-32 (IL-32). В частности, настоящее изобретение включает композиции и способы лечения аутоиммунных заболеваний и рака, частично, регуляцией экспрессии фактора некроза опухоли-альфа. Предпосылки создания изобретения Ревматоидный артрит (RA, РА) представляет собой обычный хронический воспалительный артрит,который поражает около 1% взрослого населения во всм мире, преимущественно женщин, и пик начала заболевания приходится на четвртое десятилетие жизни (См., Firestein, "Rheumatoid Arthritis," in Scientific American Medicine, 2000; и Cohen, "Systemic Autoimmunity," в Paul (ed.) Fundamental Immunology,Lippincott-Raven Publishers: Philadelphia, pp. 1067-1088, 1999). Сильное воспаление наблюдается в синовиальных суставах с инфильтрацией синовиальной мембраны мононуклеарными фагоцитами, лимфоцитами и нейтрофилами, что вызывает значительную боль в суставах. Кроме того, у больных PA (RA) обычно наблюдается утрата хряща и кости вокруг суставов, что ведт к потере подвижности. Хотя причина РА точно не определена, различные признаки заболевания указывают на аутоиммунный компонент в этиологии РА. В частности, цитокины, продуцируемые макрофагами и фибробластами,в большом количестве экспрессируются в ревматоидных суставах (Firestein et al., J. Immunol, 144: 3347,1994). По-видимому, фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-, TNF) и интерлейкин-1 (IL-1) являются основными патогенными факторами, так как они оба могут индуцировать пролиферацию синовиоцитов,коллагенез и высвобождение простагландина, тогда как сверхэкспрессия может индуцировать артрит у животных моделей (Firestein, supra, 2000). IL-18 также присутствует в РА суставах и может непосредственно активировать макрофаги для продуцирования провоспалительных цитокинов (Grade el al, J ClinInvest, 104: 1393, 1999). Современная терапия РА направлена на обезболивание, контроль воспаления и изменение течения болезни. В настоящее время часто выбираются (одобряются) более активные способы лечения, причм РА больным требуется быстрый переход от нестероидных противовоспалительных средств (НСПВС) к реагенту второй линии, такому как метотрексат. К сожалению, один метотрексат не обеспечивает адекватного контроля РА у большинства больных, что заставляет врачей выбирать либо дополнительную терапию, либо ряд единичных агентов (Firestein, supra, 2000), например, лефлюномид, сульфасалазин или ингибитор ФНО (TNF). Ингибиторы ФНО (TNF), которые с определнным успехом применялись для лечения HF, включают ФНО-реактивные моноклональные антитела (инфликсимаб/REMICADE и адалимумаб/HUMIRA) и гибридный (слитый) белок растворимый ФНО (TNF)- рецептор/ иммуноглобулин(этанерцепт/ENBREL). Однако желательно дать клиницистам дополнительные лекарственные средства для самостоятельного использования или применения в виде коктейлей для того, чтобы остановить развитие этого изнурительного заболевания. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к композициям и способам, связанным с интерлейкин- 18- индуцибельным цитокином, названным "фактор индукции фактора некроза опухоли- альфа" (TAIF), или интерлейкин-32 (IL-32). В частности, настоящее изобретение включает композиции и способы лечения аутоиммунных заболеваний и рака, частично, регуляцией экспрессии фактора некроза опухоли- альфа. Настоящее изобретение охватывает очищенные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 15, причм эта последовательность кодирует интерлейкин-32 (IL-32) и эта последовательность содержит экзон 3 и экзон 4 IL-32 практически прилегающие друг к другу (в тесной ассоциации). В некоторых предпочтительных вариантах изобретения IL32 представляет собой: альфа изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7; бета изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 8; или дельта изоформу, содержащую аминокислотную последовательность,представленную как SEQ ID NO: 10. В других вариантах изобретения в последовательности отсутствует интрон 4 IL-32, хотя в особенно предпочтительных вариантах изобретения последовательность по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 15. Также охватываются очищенные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ГО NO: 4 и SEQID NO: 6. В некоторых вариантах изобретения последовательность функционально связана с гетерологичным промотором. В предпочтительных вариантах изобретения последовательность нуклеиновой кислоты помещена в вектор. Кроме того, охватываются клетки- хозяева, содержащие вектор. Помимо этого, настоящее изобретение охватывает очищенные белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 15, отличающуюся тем, что эта последовательность кодирует интерлейкин-32 (IL-32), и тем, что она содержит экзон 3 и экзон 4 IL-32, практически прилегающие друг к другу (в тесной ассоциации). В некоторых предпочтительных вариантах изобретения IL-32 представляет собой: альфа изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7; бета изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 8; или дельта изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 10. В других вариантах-1 012567 изобретения IL-32 не является гамма изоформой, тогда как в предпочтительных вариантах изобретенияIL-32 не содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения IL-32 представляет собой рекомбинантный белок, экспрессируемый в клетке, выбранной из группы, состоящей из бактериальной клетки, клетки дрожжей, клетки насекомого и клетки млекопитающего. В подгруппе этих вариантов изобретения рекомбинантный белок является гибридным (химерным) белком. Также настоящее изобретение охватывает антитела, которые связываются с IL-32. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения антитело является моноклональным антителом, тогда как в другие варианты изобретения включн Fab фрагмент моноклонального антитела. В некоторых вариантах изобретения моноклональное антитело (mAb) выбирают, но без ограничения, из 32-4 и 32-9. Клетки гибридомы, которые продуцируют 32-4 mAb, депонированы в Американской коллекции типовых культур(АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209. Аналогично, клетки гибридомы, которые продуцируют 32-4 mAb, депонированы в АТСС. Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах изобретения моноклональное антитело выбирают, но без ограничения, из химерного моноклонального антитела, гуманизированного моноклонального антитела, человеческого моноклонального антитела. В подгруппе вариантов изобретения моноклональное антитело ингибирует индуцированное IL-32 продуцирование TNF (ФНО-) в клетках-мишенях, ингибирует индуцированную IL- 32 деградацию в клетке- мишени и/или ингибирует индуцированное IL-32 фосфорилирование р 38 МАРК в клетке- мишени. Кроме того, настоящее изобретение охватывает способы индукции продуцирования TNFa, заключающиеся в контактировании по меньшей мере одной клетки с белком EL-32 в условиях, пригодных для индуцирования TNF продукции. В предпочтительных вариантах изобретения белок IL-32 выбирают из группы, состоящей из альфа изоформы, бета изоформы, гамма изоформы и дельта изоформы. В некоторых вариантах изобретения по меньшей мере одна клетка представляет собой лейкоцит, тогда как в подгруппе этих вариантов изобретения лейкоцит выбирают из группы, состоящей из моноцитов и макрофагов. Также настоящим изобретением охватываются способы лечения субъекта, включающие: предоставление субъекта и антитела, которое связывает IL-32; и введение антитела субъекту. В предпочтительных вариантах изобретения IL-32 выбирают из группы, состоящей из альфа изоформы, бета изоформы,гамма изоформы и дельта изоформы. В особенно предпочтительных вариантах изобретения у субъекта наблюдается аутоиммунное заболевание, у субъекта подозревают аутоиммунное заболевание или субъект является лицом с повышенным риском аутоиммунного заболевания. В некоторых вариантах изобретения аутоиммунное заболевание выбирают, но без ограничения, из рассеянного склероза, тяжлой псевдопаралитической миастении, аутоиммунной нейропатии, аутоиммунного увеита, болезни Крона, язвенного колита, первичного билиарного цирроза печени, аутоиммунного гепатита, аутоиммунной гемолитической анемии, пернициозной анемии, аутоиммунной тромбоцитопении, сахарного диабета типа I, болезни Грейвса, тиреоидита Хашимото, аутоиммунного оофорита и орхита, височного артериита, антифосфолипидного синдрома, васкулитидов, болезни Бехчета, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, склеродермии, полимиозита, дерматомиозита, спондилоартропатии, синдрома Шегрена, псориаза, герпетиформного дерматита, обыкновенной пузырчатки и витилиго. Настоящее изобретение включает антитела, выбранные, но без ограничения, из человеческого моноклонального антитела и гуманизированного мышиного моноклонального антитела. В предпочтительных вариантах изобретения введение осуществляют в условиях, пригодных для облегчения по меньшей мере одного симптома аутоиммунного заболевания. Кроме того, настоящее изобретение охватывает способы скрининга на ингибиторы IL-32, включающие: создание белка IL-32 и по меньшей мере одного лекарства-кандидата (предполагаемого лекарства); и анализ действия лекарства-кандидата (предполагаемого лекарства) по меньшей мере на одну активность белка IL-32. В некоторых вариантах изобретения белок IL-32 является рекомбинантным белком, выбранным из группы, состоящей из альфа изоформы, бета изоформы, гамма изоформы и дельта изоформы. В предпочтительных вариантах изобретения предполагаемое лекарство (лекарство-кандидат) выбирают, но без ограничения, из IL-32-реактивного моноклонального антитела и доминант-негативногоIL-32 варианта. В особенно предпочтительных вариантах изобретения по меньшей мере одна активность белка IL-32 представляет собой позитивную регуляцию экспрессии TNFa. Также данным изобретением охватываются способы лечения субъекта, включающие: предоставление субъекта и белка IL-32; и введение белка IL-32 субъекту. В предпочтительных вариантах изобретения белок IL-32 представляет собой рекомбинантный белок, выбранный из группы, состоящей из альфа изоформы. бета изоформы, гамма изоформы и дельта изоформы. В особенно предпочтительных вариантах изобретения у субъекта наблюдается рак, у субъекта подозревают рак или субъект является лицом с повышенным риском заболевания раком. Настоящее изобретение также охватывает способы и наборы для измерения концентрации IL-32 в сыворотке субъекта, включающие предоставление сывороток субъекта и IL-32- реактивного антитела, и-2 012567 скрининг сывороток с помощью антитела в условиях, пригодных для количественного определения IL32. В некоторых вариантах изобретения субъектом является больной аутоиммунным заболеванием, тогда как в других вариантах изобретения субъект находится в состоянии сепсиса. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения скрининг выполняют с помощью электрохемилюминесцентного анализа,тогда как в других вариантах изобретения его осуществляют твердофазным иммуноферментным анализом. IL-реактивное антитело в некоторых вариантах изобретения выбирают, но без ограничения, из поликлонального кроличьего антитела против человеческого IL-32 и моноклонального мышиного антитела против человеческого IL-32. Описание фигур На фиг. 1 показана экспрессия и активность функциональной цепи IL-18R в клетках А 549 рака лгких. На фиг. 1 А приводятся результаты RT-PCR анализа экспрессии IL-18R в трансфецированных и дикого типа клетках А 549. На фиг. 1 В и С графически показана секреция IL-6 и IL-8, соответственно, в ответ на стимуляцию IL-18 (50 нг/мл) в трансфецированных, но не дикого типа, клетках А 549 через 16 ч(N=7). На фиг. 1D показана индукция экспрессии РНК NK4 (IL-32) в трансфецированных клетках в присутствии и в отсутствие IL-18. На фиг. 2 графически изображена индукция экспрессии TNF при обработке макрофагальных клеток мышей Raw 264.7 рекомбинантным IL-32 (TAIF) в присутствии полимиксина В. На фиг. 2 А показан уровень рекомбинантного IL-32 во фракциях, полученных ионообменной хроматографией, коррелирующий с уровнями TNF, секретированного обработанными клетками. Фракции, полученные ионообменной хроматографией, показаны после 10% SDS-PACE с последующим окрашиванием Кумасси синим. На фиг. 2 В показано, что рекомбинантный IL-32, экспрессированный в бактериях, индуцирует экспрессию TNFa в зависимости от дозы. На фиг. 2 С показано, что рекомбинантный IL-32, экспрессированный в клетках млекопитающих, также индуцирует экспрессию TNF. Количество рекомбинантногоIL-32 оценивают иммуноблоттингом. На фиг. 3 показано выравнивание последовательностей (датся сравнительный анализ первичных последовательностей) ДНК с открытой рамкой считывания четырх вариантов сплайсинга IL-32 (IL-32 раскрывается как SEQ ID NO:3, IL-32 раскрывается как SEQ ID NO:4, IL-32 раскрывается как SEQ IDClustalW (доступной на веб-сайте узла Swiss EMBnet) и корректируют вручную. Myr и Gly указывают на возможные сайты N- миристоилирования или N-гликозилирования, соответственно. На фиг. 4 приводится сравнение первичных последовательностей (выравнивание) четырх вариантов сплайсинга человеческого IL-32 (фиг. 4A) (IL-32, раскрываемый как SEQ ID NO:7, IL-32, раскрываемый как SEQ ID NO:8, IL-32, раскрываемый как SEQ ID NO:9, и IL-32, раскрываемый как SEQ IDNO:10), а также выравнивание белковых последовательностей IL-32 некоторых видов млекопитающих(человеческая последовательность раскрывается как SEQ ID NO:8, последовательность белка лошади раскрывается как SEQ ID NO:16 и последовательность бычьего белка раскрывается как SEQ ID NO: 17). Выравнивание осуществляют с помощью программы, доступной на веб- сайте узла Swiss EMBnet, и корректируют вручную. На фиг. 5 изображена структура человеческого гена IL-32 на хромосоме 16 р 13.3, экзоны изображены в виде заштрихованных прямоугольников. Числа над и под схематическим изображением гена IL-32 показывают восемь экзонов, тогда как геномный фрагмент 5 п.о. раскрывается в данном описании какSEQ ID NO: 11. Также показан сплайсинг четырх вариантов IL-32 (, ,и ). На фиг. 6 показано, что rIL-32 индуцирует провоспалительные цитокины как в макрофагальных клетках (Raw), так и в моноцитах (ТНР-1). На фиг. 6 А показано, что rIL-32, продуцированный Е. coli,индуцирует секрецию как MIP-2, так и TNF в зависимости от дозы. Концентрации показаны по оси абсцисс в единицах/мл. На фиг. 6 В показано, что как вариант IL-32 (10 Ед/мл), так и вариант IL-32 (10 Ед/мл) активирует макрофагальные клетки мышей Raw 264.7. На фиг. 6 С дано графическое изображение человеческого и мышиного TNF, индуцированного IL-32 из различных источников. Клетки Raw и РМА-дифференцированные-ТНР-1 клетки обрабатывают с помощью 1 Ед/мл Anjou65 и Cos-7S или 2 Ед/мл Cos7-T. IL-32, продуцированный Е. coli, и IL-32, продуцированный клетками млекопитающих,индуцируют экспрессию TNF в РМА- дифференцированных ТНР-1 в зависимости от дозы. На фиг. 6 Е показано, что концентрации Е. coli rIL-32 (20 Ед/мл) или rIL-32 млекопитающих (Anjou65, 10 Ед/мл) индуцируют секрецию IL-8 в недифференцированных клетках ТНР-1. На фиг. 7 показано, что активности Е. coli rIL-32 и rIL-32 млекопитающих нейтрализуются при обработке антителом Fab против IL-32 (32-4) (среднееSEM из трх отдельных экспериментов). На фиг. 7 А показано зависящее от дозы уменьшение секреции TNF клетками Raw, культивированными в присутствии Е. coli rIL-32 (3 Ед/мл) и Fab против IL-32. На фиг. 7 В показано, что секреция mTNF, индуцированная с помощью rIL-32 млекопитающих (Cos7-S) (2 Ед/мл), ингибируется под действием Fab против IL-32 (40 нг/мл). На фиг. 8 изображена эндогенная экспрессия IL-32 как на уровне мРНК, так и на уровне белка. На-3 012567 фиг. 8 А показана экспрессия мРНК IL-32 в различных человеческих тканях, определнная Нозернблоттингом. Цифры слева указывают на размер мРНК. На фиг. 8 В показано, что растворимый IL-32 присутствует в супернатантах клеточных культур, как определено Вестерн- блоттингом. Стабильный клонA549-R стимулируют в течение 48 ч в присутствии IL-18 (50 нг/мл) или IL-1 (10 нг/мл), как указано, в отсутствие FCS. Супернатанты собирают и гибридизуют с зондом-очищенным аффинной хроматографией антителом против IL-32. На фиг. 9 показано детектирование IL-32 в клеточных лизатах. Показано продуцирование IL-32 клетками Wish (фиг. 9 А), клетками A549-RP (фиг. 9 В) и клетками A549-WT (фиг. 9 С) при стимуляции с помощью IFN (100 Ед/мл), IL-18 (50 нг/мл) или IL-1 (10 нг/мл). Данные представляют один из четырх независимых экспериментов. Экспрессию IL-32 при транзиторной трансфекции клеток Cos7 с помощью кДНК IL-32 и IL-32 обнаруживают в супернатантах клеточных культур (рисунок D) и клеточных лизатах (рисунок Е) иммуноблоттингом. На рисунке F датся сравнение определяемой методом ECL концентрации IL-32 в супернатантах и лизатах. Данные представляют собой среднееSEM из пяти отдельных(независимых) экспериментов. На фиг. 10 показаны данные определения эндогенного IL-32, полученные методом электрохемилюминесценции (ECL). На фиг. 10A IL-32 детектируют методом ECL в тех же образцах, которые используют для иммуноблоттинга на фиг. 9 В. На фиг. 10 В IL-32 детектируют в супернатанте человеческой клеточной линии NK после обработки с помощью IL-12, IL-18 или IL-12, IL+18. Данные представляют собой среднее + SEM из 4 независимых экспериментов. На фиг. 10 С индуцированный с помощью ConA IL32 обнаруживают как в супернатанте, так и в лизате человеческих РВМС (N = 7). На фиг. 11 изображены индуцированная IL-32 деградация IВ (фиг. 10 А) и фосфорилирование р 38 МАРК (фиг. 10 В)после обработки с помощью IL-32 (20 Ед/мл) макрофагальных клеток мышей Raw 264.7. Для нормализации мембрану гибридизуют с антителом козы против актина или с кроличьим антителом против р 38 МАРК. На фиг. 12 показаны аминокислотные последовательности лошадиного IL-32 (SEQ ID NO:18) иIL-32 (SEQ ID NO:16) на фиг. 12 А и С, соответственно, а также последовательности кДНК лошадиногоIL-32 (SEQ ID NO:19) и IL-32 (SEQ ID NO:20) на фиг. 12 В и D, соответственно. На фиг. 13 показаны аминокислотные последовательности бычьего IL-32 (SEQ ID NO:17) и IL-32(SEQ ID NO:22) на фиг. 13 А и С, соответственно, а также последовательности кДНК бычьего IL-32(SEQ ID NO:21) и IL-32 (SEQ ID NO:23) на фиг. 13 В и D, соответственно. На фиг. 14 представлены аминокислотная (SEQ ID NO:24) и кДНК (SEQ ID NO:25) последовательности бычьего IL-32 на фиг. 14 А и В, соответственно. Также представлены аминокислотная (SEQ IDNO:26) и кДНК (SEQ ID NO:27) последовательности IL-32 свиньи на фиг. 14 С и D, соответственно. Определения Для того, чтобы было легче понять настоящее изобретение, ниже датся ряд терминов и выражений: Термин "ген" относится к последовательности нуклеиновой кислоты (например, КДНК), которая содержит кодирующие последовательности, необходимые для продуцирования полипептида, или предшественника, или РНК (например, тРНК, siPHK, рРНК и т.д.). Полипептид может кодироваться полноразмерной кодирующей последовательностью или любым участком кодирующей последовательности,пока сохраняется заданная активность или функциональные свойства (например, ферментативная активность, связывание лиганда, сигнальная трансдукция) полноразмерной последовательности или фрагмента. Термин также охватывает кодирующую область структурного гена и последовательностей, локализованных по соседству (рядом) с кодирующей областью как на 5', так и на 3' конце, так что ген соответствует длине полноразмерной мРНК. Последовательности, которые расположены 5' от кодирующего участка и которые присутствуют на мРНК, называются 5' нетранслируемые последовательности. Последовательности, которые расположены 3' от кодирующего участка и которые присутствуют на мРНК, называются 3' нетранслируемые последовательности. Термин "ген" охватывает как кДНК, так и геномные формы гена. Геномная форма или клон гена содержит кодирующую область, которая может прерываться некодирующими последовательностями, называемыми "нитронами" или "мешающими (intervening) областями", или "мешающими последовательностями". Интроны удаляются или вырезаются при сплайсинге из ядерного или первичного транскрипта и, следовательно, отсутствуют в транскрипте матричной РНК (мРНК). Функцией мРНК в ходе трансляции является определение порядка аминокислот в образующемся полипептиде. В частности, термины "ген TAIF" и ген " IL-32" относятся к полноразмерной нуклеотидной последовательности IL-32. Однако предполагается также, что этот термин охватывает фрагменты нуклеотидной последовательности IL-32, а также другие домены (например, функциональные домены) внутри полноразмерной нуклеотидной последовательности IL-32. Кроме того, термины "ген IL-32", "нуклеотидная последовательность IL-32" и "полинуклеотидная последовательность IL-32" охватывают последовательности ДНК, кДНК и РНК. Термин "плазмида" по данному описанию относится к малому независимо реплицирующему участ-4 012567 ку ДНК. Аналогично, термин "голая" плазмида относится к плазмидной ДНК, не содержащей постороннего материала, обычно применяемого для того, чтобы повлиять на трансфекцию. Применяемое в данном описании выражение "голая плазмида" относится к плазмиде, практически не содержащей фосфата кальция, DEAE- декстрана, липосом и/или полиаминов. Применяемый в данном описании термин "очищенная" относится к молекулам (полинуклеотидов или полипептидов), которые выделяются из естественного окружения, изолируются или отделяются."Практически чистые" молекулы по меньшей мере на 50% свободны, предпочтительно по меньшей мере на 75% свободны и более предпочтительно по меньшей мере на 90% свободны от других компонентов, с которыми они ассоциированы в естественных условиях. Термин "рекомбинантная ДНК" относится к молекуле ДНК, которая состоит из сегментов ДНК, соединнных вместе методами молекулярной биологии. Аналогично, термин "рекомбинантный белок" относится к молекуле белка, которая экспрессируется при использовании рекомбинантной ДНК. Термин "гибридный (химерный, слитый) белок" по данному описанию относится к белку, образованному экспрессией гибридного гена, полученного при объединении двух генных последовательностей. Обычно это выполняют, клонируя кДНК в экспрессирующий вектор в рамке считывания с существующим геном. Партнр по слиянию может вести себя как маркерный (репортрный) ген (например, gal),может обеспечивать средством для изоляции (например, GST) или может повышать период полужизни белка in vivo (например, IgG Fc). Системы пригодные для продуцирования рекомбинантных белков, включают, но без исключения,прокариотическую систему (например, Escherichia coli), дрожжевую систему (например, Saccaromyces(например, кроличий ретикулоцит). Применяемый в данном описании термин "кодирующий участок (область)" относится к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют аминокислотные последовательности, обнаруживаемые в образующемся полипептиде в результате трансляции молекулы мРНК. Кодирующий участок связывается в клетках эукариот на 5' конце (стороне) с помощью нуклеотидного триплета "ATG", который кодирует инициирующий метионин, и на стороне 3' с помощью одного из трх триплетов, которые определяют стоп- кодоны (т.е. ТАА, TAG и TGA). Если аминокислотная последовательность перечисляется (излагается) в данном описании в отношении молекулы природного белка, не предполагается, что термин "аминокислотная последовательность" и подобные термины, такие как "полипептид" или "белок" ограничивают аминокислотную последовательность полной, нативной аминокислотной последовательностью, ассоциированной с молекулой перечисленных белков. Термин "дикого типа" относится к гену или генному продукту, который имеет признаки этого гена или генного продукта, выделенного из природного источника. Ген дикого типа представляет собой такой ген, который наиболее часто наблюдают в популяции и поэтому его произвольно обозначают как "нормальная" или "дикого типа" форма гена. Применяемые в данном описании термины "мутант", "полиморфизм" и "вариант" в отношении гена или генного продукта относятся к изменениям последовательности и/или функциональных качеств(т.е.различных признаков, характеристик) по сравнению с геном дикого типа или с исходным генным продуктом. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения термин мутант относится к гену или генному продукту, который в результате мутации отличается от исходного гена или генного продукта. Как отмечается, природные и индуцированные мутанты можно выделить; их определяют по тому, что они имеют изменнные признаки по сравнению с геном дикого типа или с исходным генным продуктом. Кроме того, мутантные гены можно искусственно (например, с помощью сайт- направленного мутагенеза) или синтетически получать в лаборатории. Термины "интерлейкин-32", "IL-32", "TAIF", "фактор индукции фактора некроза опухоли-альфа","NK4" и "транскрипт 4 природных киллерных клеток" по данному описанию относятся к человеческому гену IL-32 (например, Homo sapiens SEQ ID NO:11) и к его генным продуктам (например, изоформы альфа, бета, гамма и дельта дикого типа и их варианты). Варианты IL-32, которые отличаются от последовательностей IL-32 дикого типа менее, чем в 20% остатков (предпочтительно, в 10% или менее, более предпочтительно, в 5% или менее, и наиболее предпочтительно в 1% или менее), также пригодны для применения в способах и композициях по настоящему изобретению (настоящее изобретение включает,но без ограничения, генный продукт, соответствующий фрагменту мышиной кДНК, раскрываемому какSEQ ID NO:12). Напротив, термины NK4, TAIF и IL-32 по данному описанию не относятся к внутреннему фрагменту фактора роста гепатоцитов (HGF), обозначенный HGF/NK4 (или также просто NK4, что означает N-концевая шпилька и последующие четыре домена "kringle"), который является специфическим антагонистом HGF (Date et al., FEBS Lett, 420:1-6, 1997). Термин "гибридизация" применяется в данном описании к спариванию (объединению) комплементарных нуклеиновых кислот. На гибридизацию и степень (прочность) гибридизации (т.е. прочность ассоциации между нуклеиновыми кислотами) оказывают влияние такие факторы, как степень комплемен-5 012567 тарности между нуклеиновыми кислотами, жсткость условий, Tm образовавшегося гибрида и отношениеG:C в нуклеиновых кислотах. Применяемый в данном описании термин "Tm" относится к "температуре плавления". Температура плавления - это такая температура, при которой популяция молекул двухнитевой нуклеиновой кислоты становится наполовину диссоциированной в одиночные нити. Уравнение для расчта Tm нуклеиновых кислот общеизвестно в уровне техники. Как указывается в стандартных ссылочных материалах, элементарную оценку величины Tm можно определить по уравнению: Tm = 81.5 + 0.41 (% G + С), , когда нуклеиновая кислота находится в водном растворе в 1 М NaCl (См., например, Anderson and Young, "Quantitative Filter Hybridization" in Nucleic Acid Hybridization, 1985). Другие ссылочные материалы включают более усовершенствованные расчты, которые при расчте Tm учитывают структурные характеристики и характеристики последовательности. Применяемый в данном описании термин "жсткость", "жсткие" относится к условиям - температуре, ионной силе и присутствию других соединений, таких как органические растворители, в которых проводят гибридизацию нуклеиновых кислот. Специалисты в данной области техники понимают, что"жсткие" условия могут меняться при изменении описанных показателей (параметров) либо в отдельности, либо вместе. В "очень жстких" условиях ("условиях высокой жсткости") спаривание (объединение) нуклеотидных оснований происходит только между нуклеотидными фрагментами с высокой частотой встречаемости последовательностей комплементарных оснований (например, в "очень жстких" условиях" гибридизация может происходить между гомологами с идентичностью, примерно, 85-100%,предпочтительно, примерно 70-100%). В умеренно жстких условиях спаривание нуклеотидных оснований происходит между нуклеиновыми кислотами с промежуточной частотой встречаемости оснований с комплементарными последовательностями (например, гибридизация в "умеренных условиях" может происходить между гомологами с идентичностью около 50-70%). Следовательно, условия со "слабой" или "низкой" жсткостью часто требуются для нуклеиновых кислот, полученных из генетически отличных организмов, так как в этом случае частота встречаемости комплементарных последовательностей обычно ниже. Термины "условия с высокой жсткостью" или "жсткие условия" в применении к гибридизации нуклеиновых кислот представляют собой условия, эквивалентные условиям связывания или гибридизации при 42 С в растворе, состоящем из 5 Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaH2PO4 H2O и 1,85 г/EDTA, pH доводят до 7,4 с помощью NaOH), 0,5% SDS, 5X реагента Денхардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося, с последующим отмыванием в растворе, содержащем 0,1 Х SSPE, 1,0% SDS при 42 С, когда используют зонд протяжнностью около 500 нуклеотидов."Умеренно жсткие условия", "условия средней жсткости" в применении к гибридизации нуклеиновых кислот представляют собой условия, эквивалентные условиям связывания или гибридизации при 42 С в растворе, состоящем из 5 Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaH2PO4 H2O и 1,85 г/EDTA, pH доводят до 7,4 с помощью NaOH), 0,5% SDS, 5X реагента Денхардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося, с последующим отмыванием в растворе, содержащем 1,0 Х SSPE, 1,0% SDS при 42 С, когда используют зонд протяжнностью около 500 нуклеотидов."Условия с низкой жсткостью", "нежсткие условия" в применении к гибридизации нуклеиновых кислот представляют собой условия, эквивалентные условиям связывания или гибридизации при 42 С в растворе, состоящем из 5 Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaH2PO4 Н 2 О и 1,85 г/EDTA, pH доводят до 7,4 с помощью NaOH), 0,1% SDS, 5 Х реагента Денхардта [раствор Денхардта 50 Х содержит на 500 мл: 5 г фиколла (Туре 400, Pharmacia), 5 г BSA (Фракция V; Sigma)] и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося, с последующим отмыванием в растворе, содержащем 5 Х SSPE, 0,1% SDS при 42 С, когда используют зонд протяжнностью около 500 нуклеотидов. Применяемый в данном описании термин "Нозерн-блоттинг" относится к методам переноса денатурированной РНК на тврдую подложку (тврдый носитель) для использования в последующем гибридизационном анализе. Тотальную РНК или полиА-обогащнную РНК обычно подвергают электрофорезу на агарозном геле, переносят на мембрану и гибридизуют с меченным радиоактивной меткой фрагментом ДНК или РНК для обнаружения специфичных последовательностей РНК. Нозерн-блоттинг обычно применяют в технике (См., например, Thomas, Proc Natl Acad Sci USA 77 5201-5205, 1980; и Ausubel etal. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, Inc., New York, 1994). Термин "Саузерн- блоттинг" по данному описанию относится к методам переноса денатурированной ДНК, фракционированной с помощью электрофореза в агарозном геле, на тврдую подложку (тврдый носитель) для использования в последующем гибридизационном анализе. Эти методы обычно включают расщепление геномной ДНК подходящей рестриктазой перед агарозным гель- электрофорезом, перенос ДНК на мембрану и инкубацию с меченным радиоактивной меткой фрагментом ДНК или РНК для обнаружения специфических последовательностей ДНК. Саузерн-блоттинг обычно применяют в технике (См., например, J Mol Biol 98 503-517, 1975; и Ausubel et al., см. выше, 1994). Применяемый в данном описании термин "полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR)" относится к способу повышения концентрации сегмента целевой последовательности в смеси ДНК без клонирования или очистки (См., например, патенты США 4683195, 4684202 и 4965188). Этот способ амплификации-6 012567 целевой последовательности заключается во введении большого избытка двух олигонуклеотидных праймеров в смесь ДНК, содержащую заданную целевую последовательность, с последующим проведением последовательных термальных циклов в присутствии ДНК полимеразы. Два праймера комплементарны соответствующим нитям двухнитевой целевой последовательности. Для воздействия на амплификацию смесь денатурируют и затем праймеры отжигают с их комплементарными последовательностями с целевой молекулой. После отжига праймеры удлиняют с помощью полимеразы таким образом, чтобы образовать новую пару комплементарных нитей. Стадии денатурации, отжига праймеров и удлинение с помощью полимеразы можно повторять много раз (т.е. денатурация, аннелирование (отжиг) и удлинение составляют один "цикл"), чтобы получить высокую концентрацию амплифицированного сегмента заданной целевой последовательности. Протяжнность амплифицированного сегмента заданной целевой последовательности определяют по положениям праймеров относительно друг друга, и, следовательно, эта протяжнность (длина) представляет собой контролируемый параметр. Из-за повторяемости процесса метод называется "полимеразной цепной реакцией" (далее в данном описании "ПЦР", "PCR"). Так как заданные амплифицированные сегменты целевой последовательности становятся преимущественными последовательностями (с точки зрения концентрации) в смеси, именно они являются "ПЦР амплифицированными" последовательностями. Когда матрица представляет собой РНК, перед циклами амплификации проводят стадию обратной транскрипции (RT). Поэтому этот вариант называют "RT- PCR", "RTПЦР". Термин "антитело" относится к поликлональным и моноклональным антителам. Затем поликлональные антитела, которые образуются в организме животного в результате иммунологической реакции против представляющего интерес белка или его фрагмента, можно легко выделить из крови общеизвестными методами и очистить, например, хроматографией. Моноклональные антитела можно также получать известными методами (См., например, Winter and Milstein, Nature, 349, 293-299, 1991). Применяемый в данном описании термин "антитело" охватывает полученные методом рекомбинантной ДНК и модифицированные антитела и их антиген-связывающие фрагменты, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела, полифункциональные антитела, биспецифические или олигоспецифические антитела, одноцепочечные (однонитевые) антитела и фрагменты F(ab) и F(ab)2. Термин "реактивное"("реакционноспособное") в отношении антитела указывает, что это антитело способно связываться с представляющим интерес антигеном. Например, IL-32-реактивное (реактивное в отношении IL-32) антитело представляет собой антитело, которое связывается с IL-32 или с фрагментом IL-32. Термин "доминант-негативный мутант" относится к молекулам, у которых отсутствует активность дикого типа, но которые эффективно конкурируют с молекулами дикого типа за субстраты, рецепторы и т.д., и тем самым ингибируют активность молекул дикого типа. В предпочтительных вариантах изобретения термин "IL-32 доминант-негативный мутант" относится к мутантному белку IL-32, который конкурирует с белком IL-32 дикого типа за IL-32 рецепторы, но который не может индуцировать дальнейшие эффекты, такие как расщепление (деградацию) IkB, фосфорилирование р 38 МАРК и продуцированиеTNF (ФНО). Подходящие доминант-негативные IL-32 варианты можно выбирать из библиотек произвольных мутантов IL-32 или можно создавать осознанно (рационально), как описано в системе TNF(Steed et ah, Science, 301: 1895-1898, 2003). Термин "участок", "часть" в применении к нуклеотидной последовательности относится к фрагментам этой последовательности протяжнностью от 10 нуклеотидов до полноразмерной (полной) нуклеотидной последовательности минус один нуклеотид. Применяемый в данном описании термин "биологически активный" относится к молекуле, имеющей структурные, регуляторные и/или биохимические функции молекулы IL-32 дикого типа. В некоторых примерах биологически активная молекула является гомологом молекулы IL-32 млекопитающих,тогда как в других примерах биологически активная молекула представляет собой участок молекулы IL32 млекопитающих. Другие биологически активные молекулы, которые находят применение в композициях и способах по настоящему изобретению, включают, но без ограничения мутантные (например, варианты по меньшей мере с одной делецией, инсерцией или заменой) молекулы IL-32 млекопитающих. Биологическую активность определяют, например, измеряя индукцию TNF in vitro, как написано в экспериментальных примерах. Применяемый в данном описании термин "животное" относится к любому представителю животного мира, который включает живые существа с клетками, отличающиеся от растительных клеток отсутствием клеточных стенок и хлорофилла и способности спонтанного движения. Предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся прежде всего к позвоночным (позвоночным или хордовым) представителям животного мира. Термины "пациент" ("больной") и "субъект" относятся к млекопитающему (человеку или животному), кандидату на получение медицинского лечения. Термин "контрольный" относится к субъектам или образцам, с которыми сравнивают опытные субъекты или образцы. Например, применение контрольных субъектов или образцов делает возможным определение эффективности и методик эксперимента. В некоторых вариантах изобретения термин "кон-7 012567 трольный субъект" относится к животным, которые получают мнимое (суррогатное) лечение (например,один PBS или обычный кроличий IgG в физиологическом солевом растворе). Термины "образец" и "проба" применяются в самом широком смысле. С одной стороны, предполагается, что они включают пробу или культуру. С другой стороны, предполагается, что они включают как биологические образцы, так и образцы сред. Эти термины охватывают все типы образцов, взятые у человека и животных, включая, но без ограничения, жидкости в организме, такие как моча, кровь, фекалии,ликвор, семенная жидкость, слюна и раневые экссудаты, а также плотные ткани. Однако эти примеры не рассматриваются как ограничивающие типы образцов, применимые в данном изобретении. Термин "лейкоцит" по данному описанию относится к клеткам, называемым белыми кровяными тельцами, которые помогают организму бороться с инфекциями и другими заболеваниями, и включают,например, гранулоциты (например, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), мононуклеарные фагоциты и лимфоциты (например, В клетки, Т клетки, природные (натуральные, естественные) киллерные клетки). Применяемый в данном описании термин "моноцит" относится к мононуклеарному фагоциту в кровотоке, который позже перемещается в ткань и дифференцирует в макрофаг. Термин "макрофаг" относится к относительно долго живущим фагоцитарным клеткам тканей млекопитающих, образованным из моноцитов крови. Макрофаги из различных частей тела обладают заметно отличающимися свойствами. Основными типами являются перитонеальные и альвеолярные макрофаги, тканевые макрофаги (гистиоциты), клетки Купфера (береговая клетка печени) и остеокласты. Макрофаги играют важную роль в киллинге клеток некоторых бактерий, простейших и опухолей, в высвобождении субстанций, которые стимулируют другие клетки иммунной системы и презентируют процессированный антиген Т лимфоцитам. Термин "воспаление" по данному описанию относится к ответу ткани на травму, характеризующемуся повышенным кровотоком и попаданием лейкоцитов в ткани, вызывая опухание, покраснение, повышенную температуру и боль. Применяемый в данном описании термин "симптом" относится к любому субъективному признаку заболевания или состояния пациента (например, изменение состояния пациента является показателем определнного телесного или умственного состояния). Например, фраза "симптомы воспаления" в контексте воспалительного заболевания кишечника(IBD) по данному описанию включает, но без ограничения, симптомы, такие как абдоминальная боль,диарея, ректальное кровотечение, потеря в весе, лихорадка, потеря аппетита и другие, более серьзные,осложнения, такие как обезвоживание, анемия и нарушение питания. Некоторые такие симптомы поддаются количественному анализу (например, потеря в весе, жар (лихорадка), анемия и т.д.). Некоторые симптомы легко определить по анализу крови (например, анемия) или с помощью теста, который обнаруживает наличие крови (ректальное кровотечение). Аналогично, выражение "в условиях, при которых уменьшаются симптомы" в контексте IBD относится к любой степени качественного или количественного уменьшения обнаруживаемых симптомовIBD, включая, но без ограничения, детектируемое воздействие на скорость исцеления (например, скорость увеличения веса) или уменьшения, по меньшей мере, одного из следующих симптомов: абдоминальная боль, диарея, ректальное кровотечение, потеря в весе, жар (лихорадка), потеря аппетита, обезвоживание, анемия, вздутие (живота), фиброз, воспалнный кишечник и нарушение питания. Термин "аутоиммунное заболевание" включает, но без ограничения, следующие заболевания: рассеянный склероз, тяжлая псевдопаралитическая миастения, аутоиммунные нейропатии (такие как болезнь Гийена- Баре), аутоиммунный увеит, болезнь Крона, язвенный колит, первичный цирроз печени,аутоиммунный гепатит, аутоиммунная гемолитическая анемия, злокачественная анемия, аутоиммунная тромбоцитопения, сахарный диабет типа I, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, аутоиммунный оофорит и орхит, височный артериит, антифосфолипидный синдром (АФС), васкулитиды (такие как гранулматоз Вегенера), болезнь Бехчета, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, склеродермия,полимиозит, дерматомиозит, спондилоартропатия (такие как анкилозирующий спондилит), синдром Шегрена, псориаз, герпетиформный миозит, обыкновенная пузырчатка и витилиго. Применяемый в данном описании термины "ревматоидный артрит" и "РА" относятся к хроническому воспалительному заболеванию, при котором происходит разрушение суставов. РА рассматривается как аутоиммунное нарушение, при котором в суставах образуются иммунные комплексы и возбуждают воспалительный ответ (гиперчувствительность, опосредованная комплексами). Также встречается клеточно-опосредованная (тип IV) гиперчувствительность, которая вызывает аккумуляцию макрофагов и приводит к разрушению синовиальной выстилки. Термины "IBD" и "воспалительное заболевание кишечника" по данному описанию являются общими терминами, которые охватывают несколько болезненных процессов, наиболее часто, язвенный колит и болезнь Крона. Применяемый в данном описании термин "болезнь Крона" относится к аутоиммунному заболеванию желудочно-кишечного тракта. Обычные симптомы включают периодические абдоминальные боли,жар (лихорадку), тошноту, рвоту, потерю в весе и диарею, которая бывает иногда геморрагической. Термины "соединение" и "лекарство-кандидат", "предполагаемое (возможное) лекарство" относятся-8 012567 к любому химическому или биологическому объекту (например, включая фармацевтические препараты,лекарственные вещества и т.п.), которые можно использовать для лечения или предупреждения заболевания, расстройства, слабости или нарушения телесной функции. Соединения включают как известные,так и потенциальные терапевтические соединения. Определить соединение как терапевтическое можно скринингом, например, применяя методы скрининга по настоящему изобретению. "Известное терапевтическое соединение" относится к терапевтическому соединению, которое, как было показано (например, в испытаниях на животных или в предыдущем опыте применения на людях), эффективны для такого лечения или предупреждения. Применяемый в данном описании термин "агонист" относится к молекулам или соединениям, которые имитируют действие "нативного" или "природного" (естественного, натурального) соединения. Агонисты могут быть гомологичны этим природным соединениям в том, что касается конформации, заряда или других характеристик. Так, агонисты могут узнаваться рецепторами, экспрессируемыми на клеточных поверхностях. Это узнавание может привести к физиологическим и/или биологическим изменениям внутри клетки, так что клетка реагирует на присутствие агониста таким же образом, как если бы присутствовало природное соединение. Агонисты могут включать белки, нуклеиновые кислоты, углеводы или любые другие молекулы, которые связываются или взаимодействуют с белком (белками), связывающим(и) IL-32. Применяемые в данном описании термины "антагонист" и "ингибитор" относятся к молекулам или соединениям, которые ингибируют действие "нативного" или "природного (натурального, естественного)" соединения. Антагонисты могут быть или могут не быть гомологичными этим природным соединениям в том, что касается конформации, заряда или других характеристик. Так, антагонисты могут узнаваться теми же самыми, которые узнаются агонистами, или другими рецепторами, антагонисты могут обладать аллостерическими эффектами, которые предупреждают действие агониста (например, предупреждают связывание нативного IL-32 с рецепторами IL-32). В отличие от агонистов, соединения- антагонисты не вызывают физиологических и/или биохимических изменений в клетке, так чтобы клетка реагировала на присутствие антагониста таким же образом, как если бы присутствовало природное соединение. Антагонисты и ингибиторы могут включать белки, нуклеиновые кислоты, углеводы или любые другие молекулы, которые связываются или взаимодействуют с белком (белками), связывающим(и) IL32, или которые предупреждают образование функциональных мультимеров IL-32. Применяемый в данном описании термин "модулирует (регулирует)" относится к изменению биологической активности. Модуляция может представлять собой повышение или понижение активности белка, изменение характеристик связывания или любое другое изменение биологических, функциональных или иммунологических свойств, связанных с активностью белка или другой представляющей интерес структуры. Описание изобретения Интерлейкин- 18 (IL-18) представляет собой полифункциональный цитокин, играющий роль как в во врожднном, так и в приобретнном иммунных ответах. Действие IL-18 изучали в широком спектреTh1 или Th2 родственных аутоиммунных заболеваний (Okamura et al, Nature, 378: 88-91, 1995, NakanishiIL-18 принадлежат к семейству IL-1, имеют общее структурное свойство, требуют для процессирования каспазу-1 (Bazan et al, Nature, 379: 591, 1996; и Gu et al, Science, 275: 206-209, 1997). IL-18 также включает сходные пути передачи сигнала, включая рекрутинг IL-1- рецептор-ассоциированных киназ (IRAK),образование комплексов IRAK с фактором-6, ассоциированным с рецептором фактора некроза опухолиMatsumoto et al, Biochem Biophys Res Commun, 234: 454-457, 1997; и Robinson et al, Immunity, 7: 571-581,1997). Полагают, что члены семейства IL-1 играют патологическую роль в аутоиммунных и воспалительных заболеваниях, так как блокада активностей IL-1 и IL-18 уменьшает тяжесть заболевания у больных ревматоидным артритом и системным воспалением (Arend, Adv Immunol, 54: 167-227, 1993; Dinarello, Blood, 87: 2095-2147, 1996; Novick et al., Immunity, 10: 127-136, 1999; и Banda et al., J Immunol,170: 2100-2105, 2003). Однако существует трудность в изучении IL-18-индуцибельных генов, так как только несколько (малое число) клеточных линий отвечают на IL-18, например, человеческие NK и KG-1 клеточные линии. Кроме того, хотя эти клеточные линии отвечают на IL-18, они требуют костимулирующих факторов, таких как IL-2 или IL-15, соответственно, чтобы проявилась ответная реакция на IL18 (Ahn et al., JImmunol, 159: 2125-2131, 1997; Ohtsuki et al, Anticancer Res, 17: 3253-3258, 1997; Lauweryset al., JImmunol, 165: 1847-1853,2000; и Hoshino et al,. JImmunol 162: 51-59, 1999). Необходимость в костимулирующих факторах мешает независимой оценке IL-18 индукции генной экспрессии.IL-18 имеет две известные рецепторные цепи, лигандсвязывающую IL-18R цепь и цепь сигнальной трансдукции IL-18R. Обе цепи рецептора IL-18 относятся к семейству IL-1 рецептора и состоят из трх Ig- подобных доменов во внеклеточной области (Kato et al, Nat Struct Biol, 10: 966-971, 2003; и Yamamoto et al., Biochem Biophys Res Commun, 317: 181-186, 2004). Дополнительным компонентом, участвующим в IL-18 регуляции, является IL-18- связывающий белок (IL-18BP). IL-18BP не является частью-9 012567 сигнального комплекса IL-18, но скорее антагонистичен IL-18 активности (Kim et al, Proc Natl Acad SciUSA, 97: 1190-1195, 2000; и Novick et al, Immunity, 10: 127-136, 1999). IL-18BP представляет собой секретированную рецептороподобную молекулу, состоящую из единственного Ig- подобного домена. IL-18BP имеет общую гомологию с вирусными белками и нейтрализует биологические активности человеческогоEsteban and Buller, Virology, 323: 197-207, 2004; и Esteban et al, J Gen Virol, 85: 1291-1299, 2004). В отсутствие костимуляторов неиммунные клетки не отвечают на IL-18 вследствие малой экспрессии или отсутствия экспрессии цепи IL-18R (Thomassen et al, J lnterferon Cytokine Res, 18: 1077-1088,1998: и Chandrasekar et al, Biochem Biophys Res Commun, 303: 1152-1158, 2003). Следовательно, было необходимо генерировать стабильный клон, экспрессирующий цепь IL-18R, так как этот рецепторный компонент требуется для передачи сигнала IL-18 (Thomassen et al, supra, 1998; и Kim et al, JImmunol, 166: 148-154, 2001). Устойчивую экспрессию цепи IL-28R осуществляют в человеческой клетке А 549 рака лгких (A549-R), что делает эти клетки чувствительными к IL-18 даже в отсутствие костимуляции. Устойчивый клон A549-R используют для идентификации IL-18- индуцибельных генов методом microarray (или микрочип) анализа. Microarray анализ, описанный в примере 1, выявил IL-18 индукцию цитокиноподобной молекулы, которая была описана 12 лет назад как транскрипт 4 природной киллерной клетки, или просто NK4 (Dahl et al., J Immunol, 148: 597-603, 1992). Следует заметить, что термин NK4 в настоящее время используют для описания варианта фактора роста гепатоцитов (Martin et al., J Cell Physiol,192: 268-275, 2002). Гомология последовательностей между вариантом фактора роста гепатоцитов и транскриптом NK4/IL-32 отсутствует. Позднее сообщалось о повышенной экспрессии NK4 в РВМС пациентов, получающих высокие дозы IL-12 для лечения злокачественной меланомы (Panelli et al., GenomeBiol, 3(7): RESEARCH0035, 2002), но функция NK4 оставалась неизвестной до разработки настоящего изобретения. Как подробно описано в экспериментальных примерах, новый воспалительный цитокин, названный интерлейкин-32 (IL-32) или фактор индукции фактора некроза опухоли-альфа (TAIF) определн методомmicroarray анализа клеток A549-R. Кроме того, выявлена генная структура, паттерн экспрессии и функция IL-32. До разработки настоящего изобретения единственная изоформа IL-32 (TAIF/NK4) была описана как транскрипт лимфоцита с неизвестной функцией (Dahl et al., J Immunol, 148: 597-603, 1992), который транскрибируется на человеческой хромосоме 16 р 13.3 в локусе семейной средиземноморской лихорадки или непосредственно рядом с этим локусом (Bernot et al, Genomics, 50: 147-160, 1998). Как показано в данном описании, хотя отсутствует гомология последовательностей IL-32 и известных семейств цитокинов, это, несомненно, цитокин ввиду его способности индуцировать секрецию TNF и передавать сигнал классическими путями известных провоспалительных цитокинов. Кроме того, предполагают, чтоIL-32 является членом семейства IL-1 цитокинов (Ghayur et al., Nature, 386: 619-623, 1997; Cerretti et al,Science, 256: 97-100, 1992, и Kuida et al., Science, 267: 2000-2003, 1995), вследствие сходства в регуляцииIL-32 и отсутствия чткого сигнального пептида. Кроме того, как и IL-1 и IL-18, IL-32 секретируется прежде всего стимулированными клетками. Как впервые показано в данном описании, IL-32 включает сигнальные пути провоспалительных цитокинов, NFB И р 38 МАРК, тем самым индуцируя продуцирование провоспалительного цитокина, TNF. Аналогично, IL-1, IL-18 и LPS индуцируют экспрессию IL32 и, в отличие от первоначального описания NK4 в активированных NK или Т-клетках, экспрессия IL32 наблюдается повсеместно в различных органах. Паттерн экспрессии IL-32 напоминает паттерн экспрессии IL-15, который также продуцируется в совершенно различных тканях. Этим он отличается от IL2, который продуцируется исключительно активированными Т-клетками (Bamford et al, Proc Natl AcadSci USA, 93: 2897-2902, 1996: и Grabstein et al., Science, 264: 965-968, 1994). Индукция TNF при использовании IL-32 указывает на то, что этот цитокин играет важную роль в патологии аутоиммунных/воспалительных заболеваний. Высокий уровень IL-32, наблюдаемый в кровотоке некоторых больных с сепсисом (по сравнению с уровнем IL-32, наблюдаемым в сыворотке здоровых индивидуумов), также до настоящего изобретения не был установлен (подтверждн документально). Поэтому блокирование IL-32 активности рассматривается как высокоэффективный терапевтический подход в различных аутоиммунных заболеваниях, аналогичный успешным способам блокирования TNFa(Davis et al., Ann Rhem Dis, 59Suppl 1:i41- 3, 2000; и Shanahan and St Clair, Clin Immunol, 103: 231-242,2002). Также полагают, что композиции на основе IL-32 найдут применение при лечении рака и других заболеваний, в которых существенной (благотворной) является индукция гибели клеток или апоптоз,включающий продуцирование TNF. Кроме того, полагают, что макрофагальная клеточная линия мышей Raw 264.7 экспрессирует IL-32 рецептор, который активируется при связывании с помощью IL-32 (функция внеклеточного IL-32). Однако также полагают, что IL-32 также имеет внутриклеточную функцию, так как IL-32 также обнаруживают в клеточных лизатах. Поэтому полагают, что IL-32 активен как внутриклеточный, так и как внеклеточный белок, аналогично IL-1 (Stevenson et al, Proc Natl Acad Sci USA, 94: 508-513, 1997) и группе- 1 с высокой подвижностью (Wang et al, Science, 285: 248-251, 1999). Секреция IL-32 в отсутствие чткого сигнального пептида является признаком нескольких семействal., Nature, 386: 619-623, 1997). Аналогично IL-1 и IL-18, IL-32 секретируется в виде растворимого белка в клеточных культуральных средах стимулированных первичных клеток, а также клеточных линий. На основании первичного анализа последовательностей IL-32 не имеет потенциальных сайтов расщепления каспазой-1, и хотя были обнаружены новые варианты, полученные в результате сплайсинга, ни один из них не содержит типичного гидрофобного сигнального пептида на N-конце. Существование IL-32 во множестве видов является доказательством эволюционно консервативной последовательности, которая, как полагают, имеет важную функцию в регуляции воспаления. Меньшее количество изоформ IL-32 идентифицировано в других видах млекопитающих, хотя этот результат может отражать относительную недостаточность EST для этих видов. Аналогично, тщательный поиск гомолога мышиного IL-32 был неудачен. Однако, возможно, предполагаемый ген мышиного IL-32 имеет очень низкую гомологию с человеческим геном, а последовательности гомологов лошадиного и бычьегоIL-32 только на 31.8 - 28.1% идентичны последовательности человеческого IL-32. Некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения описаны в нижеприведнных разделах: (I) IL-32 Полинуклеотиды; (II) IL-32 Полипептиды; (III) IL-32 Антитела; (IV) Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды, полипептиды или антитела IL-32; и (V) Способы идентификации ингибиторов IL-32.I. IL-32 Полинуклеотиды Настоящее изобретение включает нуклеиновые кислоты, кодирующие IL-32 белки, гомологи, варианты и мутанты (например, SEQ ID NO: 3, 4, 6). В некоторых вариантах настоящее изобретение охватывает полинуклеотидные последовательности, способные гибридизоваться с SEQ ID NO: 3, 4, 6 в очень жстких условиях, пока полинуклеотидная последовательность, способная гибридизоваться, кодирует белок, который сохраняет TNF- индуцирующую активность природного IL-32 гена. В некоторых вариантах изобретения белок, который сохраняет TNF-индуцирующую активность природного IL-32, на 80% гомологичен дикого типа IL-32, предпочтительно на 90% гомологичен дикого типа IL-32, более предпочтительно, на 95%, и наиболее предпочтительно на 99% гомологичен дикого типа IL-32. В особенно предпочтительных вариантах изобретения белок, который сохраняет биологическую активностьIL-32, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую непрерывную аминокислотную последовательность LKARMHQAIERFYDKMQNAESGRGQV (SEQ ID NO: 13), и которая на 99% гомологичнаIL-32 дикого типа (IL-32, IL-32, IL-32, IL-32). В некоторых предпочтительных вариантах изобретения нуклеотидная последовательность не кодирует аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14. В подгруппе этих вариантов изобретения нуклеотидная последовательность содержит последовательность, представленную SEQ ID NO: 15 (экзон 3, прилегающий к экзону 4). В предпочтительных вариантах изобретения условия гибридизации основаны на температуре (Tm) комплекса связывания нуклеиновой кислоты, а определнная "жсткость" обеспечивается, как описано выше в разделе"Определения". В других вариантах настоящего изобретения охватываются аллели IL-32. В предпочтительных вариантах изобретения аллели появляются в результате мутации (т.е. изменения нуклеотидной последовательности) и обычно продуцируют изменнные РНК или полипептиды, структура или функция которых может, или не может, быть изменена. Любой данный ген может не иметь ни одной аллельной формы,может иметь одну аллельную форму или много аллельных форм. Обычные мутационные изменения, которые приводят к аллелям, приписывают, как правило, делециям, добавлениям или заменам нуклеиновых кислот. Каждый из этих типов изменений может происходить один или в комбинации с другими и с частотой один или более раз в данной последовательности. В других вариантах настоящего изобретения можно создать нуклеотидные последовательности по данному изобретению, чтобы изменить IL-32 кодирующую последовательность для различных целей (по разным причинам), включая, но без ограничения, изменения, которые модифицируют клонирование,процессирование и/или экспрессию генного продукта. Например, мутации можно вводить, используя общеизвестные в технике методы (например, сайт-направленный мутагенез для инсерции новых сайтов рестрикции, для изменения паттерна гликозилирования, для изменения предпочтения кодонов и т.д.). Можно получать модифицированный пептид, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, изменена, например, с помощью замены, делеции или добавления. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения эти модификации не меняют заметно TNF-индуцирующую активность модифицированного IL-32 (например, IL-32 агонисты), тогда как в других предпочтительных вариантах изобретения эти модификации приводят к утрате TNF-индуцирующей активности модифицированного IL-32 (например, IL-32 антагонисты). Другими словами, любую данную конструкцию можно оценивать, чтобы определить, является ли она членом рода модифицированных или вариантов IL-32 по настоящему изобретению, что определяется скорее функционально, нежели структурно. В предпочтительных вариантах изобретения активность варианта или мутанта IL-32 оценивают методами, описанными в примере 2 (индукция TNF). Кроме того, как описано выше, вариантные формы IL-32 также рассматриваются как эквивалентные- 11012567 тем пептидным и ДНК молекулам, которые представлены более подробно в данном описании. Например,полагают, что изолированная замена лейцина на изолейцин или Валин, аспартат на глутамат, треонин на серин, или аналогичная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту (т.е. консервативные мутации) не оказывает значительного эффекта на биологическую активность результирующей молекулы. Соответственно, некоторые варианты настоящего изобретения охватывают варианты IL-32 по данному описанию, содержащие семейство аминокислот, родственных по своим боковым цепям. Генетически кодированные аминокислоты можно разделить на четыре семейства: (1) кислые (аспартат, глутамат); (2) основные (лизин, аргинин, гистидин); (3) неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин,пролин, фенилаланин, метионин, триптофан); и незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин,цистеин, серин, треонин, тирозин). Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда вместе классифицируют как ароматические аминокислоты. Аналогично набор (популяцию, спектр) аминокислот можно поделить на группы (1)кислые (аспартат, глутамат); (2) основные (лизин, аргинин, гистидин), (3) алифатические(глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин), причм серин и треонин можно объединить в отдельную группу как алифатические- гидроксильные; (4) ароматические (фенилаланин, тирозин,триптофан); (5) амидные (аспарагин, глутамин); и (6) серосодержащие (цистеин и метионин) (например,Stryer ed., Biochemistry. 17- 21, 2nd ed, W H Freeman and Co., 1981). Приводит ли изменение в аминокислотной последовательности к функциональному гомологу, можно легко определить, оценивая способность вариантного пептида функционировать таким же образом, как белок дикого типа. Пептиды,имеющее более одной замены, можно таким же образом легко протестировать. Реже вариант включает "неконсервативные" изменения (например, замену глицина на триптофан). Аналогичные минорные варианты включают также аминокислотные делеции или инсерции, или и те и другие. Руководством для определения, какие аминокислотные остатки можно заменить, ввести или удалить не нарушив биологическую активность, могут служить компьютерные программы (например, программа LAZARGENE, DNASTAR Inc., Madison, WI).II. IL-32 Полипептиды В других вариантах настоящее изобретение охватывает IL-32 полинуклеотидные последовательности, которые кодируют IL-32 полипептидные последовательности. IL-32 полипептиды (например, SEQID NO: 7, 8, 10) описаны на фиг. 4. Другие варианты настоящего изобретения включают фрагменты, гибридные (слитые) белки или функциональные эквиваленты этих IL-32 белков. В других вариантах настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, соответствующие этим различным гомологам и мутантам IL-32, можно использовать для генерирования рекомбинантных молекул ДНК, которые направляют экспрессию гомологов и мутантов IL-32 в соответствующие клетки- хозяева. В некоторых вариантах настоящего изобретения полипептид может быть природным очищенным продуктом, в других вариантах изобретения он может быть продуктом химического синтеза, а в других вариантах изобретения он может быть получен методами рекомбинантной ДНК с применением прокариотического или эукариотического хозяина (например, с применением бактериальных клеток, клеток дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих в культуре). В некоторых вариантах изобретения, в зависимости от хозяина, применяемого в методе рекомбинантной ДНК, полипептид по настоящему изобретению может быть гликозилированным или может быть негликозилированным. В других вариантах изобретения полипептиды по изобретению могут также включать начальный метиониновый аминокислотный остаток. В одном варианте настоящего изобретения, вследствие собственной (внутренней, имманентной) вырожденности генетического кода, последовательности ДНК, отличные от полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 3, 4 и 6, которые кодируют практически такие же или функционально эквивалентные аминокислотные последовательности, могут использоваться для клонирования и экспрессии IL32. А. Векторы для продуцирования IL-32 Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно применять для продуцирования полипептидов методами рекомбинантной ДНК. Так например, полинуклеотид может быть включн в любой из векторов экспрессии для экспрессии полипептида. В некоторых вариантах настоящего изобретения векторы включают, но без ограничения, хромосомные, нехромосомные и синтетические ДНК последовательности(например, производные SV40, бактериальные плазмиды, фаговую ДНК; бакуловирус, дрожжевые плазмиды, векторы, образованные комбинациями плазмид и фаговой ДНК, и вирусная ДНК, например, вируса коровьей оспы, аденовируса, вируса оспы птиц и болезни Ауески). Полагают, что любой вектор можно использовать, пока он остатся реплицируемым и жизнеспособным в организме хозяина. В частности, некоторые варианты настоящего изобретения включают рекомбинантные конструкции, содержащие одну или более последовательностей, так широко представленных выше (например,SEQ ID NO: 3, 4 и 6). В некоторых вариантах настоящего изобретения конструкции содержат вектор,такой как плазмидный или вирусный вектор, в который включена последовательность по изобретению, в прямой или обратной ориентации. В других вариантах изобретения гетерологичную структурную последовательность собирают в подходящей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции. В предпочтительных вариантах настоящего изобретения соответствующие ДНК последовательности вводят в вектор различными методами. Как правило, последовательность ДНК известными в технике- 12012567 методами вводят в соответствующий(щие) сайт(ы) расщепления рестритазами. Специалистам в данной области техники известно большое число подходящих векторов. Такие векторы включают, но без ограничения, следующие векторы: 1) Бактериальные - pQE70, pQE60, pQE-9(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); и 2) Эукариотические - pWLNEO,pSV2CAT, pOG44, PXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Любую другую плазмиду или любой другой вектор можно использовать, пока они являются реплицируемыми и жизнеспособными в хозяине. В некоторых предпочтительных вариантах настоящего изобретения экспрессирующие векторы млекопитающих содержат ориджин репликации, промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сайты полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В других вариантах изобретения для создания требующихся нетранскрибируемых элементов можно использовать последовательности ДНК, полученной при сплайсинге SV40, и сайты полиаденилирования. В. Клетки-хозяева для продуцирования IL-32 В другом варианте настоящее изобретение охватывает клетки-хозяева, содержащие вышеописанные конструкции. В некоторых вариантах настоящего изобретения клеткой- хозяином является клетка высших эукариот (например, клетка млекопитающих или насекомых). В других вариантах настоящего изобретения клеткой-хозяином является клетка низших эукариот (например, клетка дрожжей). В других вариантах настоящего изобретения клеткой-хозяином является клетка прокариот (например, бактериальная клетка). Конкретные примеры клеток- хозяев включают, но без ограничения, Escherichia coli, Salmonellatyphimurium, Bacillus subtilis и различные виды клеток рода Pseudomonas, Streptomonas, Streptomyces иStaphylococcus, а также Saccharomyces cerivisiae, Schizosaccharomyces pombe, клетки Drosophila S2, клетки Spodoptera Sf9, клетки яичников китайского хомячка (СНО), линии COS-7 фибробласт печени обезьян, С 127, 3 Т 3, 293, 293 Т, HeLa и ВНК клеточные линии. Для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью, можно обычным образом использовать конструкции в клетках-хозяевах. В некоторых вариантах изобретения введение конструкции в клетку-хозяина можно выполнять трансфекцией с применением фосфата кальция, трансфекцией, опосредованной DEAE- декстраном, или электропорацией. Или же, в некоторых вариантах изобретения полипептиды IL-32 продуцируют в обычных пептидных синтезаторах. С. Очистка IL-32 Настоящее изобретение также охватывает способы выделения и очистки IL-32 от культур рекомбинантных клеток, включая, но без ограничения, осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракция кислотой, аноно- или катионообменная хроматография, хроматография на фосфоцеллюлозе, хроматография с гидрофобным взаимодействием, аффинная хроматография, хроматография на гидроксилапатите и лектин- аффинная хроматография. В других вариантах настоящего изобретения для завершения конфигурации зрелого белка при необходимости можно использовать стадии рефолдинга белка. В других вариантах настоящего изобретения на стадиях конечной очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Далее настоящее изобретение включает полинуклеотиды, имеющие кодирующую последовательность, слитую в рамке считывания с маркерной последовательностью, что позволяет очищать полипептид по настоящему изобретению. Неограничивающим примером маркерной последовательности является гексагистидиновый хвост, который может обеспечиваться вектором, предпочтительно, вектором pQE9, что позволяет очищать полипептид, слитый с маркером, в случае бактериального хозяина, или, например, маркерная последовательность может быть гемагглютининовой меткой (НА), когда используют клетку хозяина- млекопитающего (например, клетки COS-7).D. Гибридные (химерные, слитые) белки IL- 32 Настоящее изобретение также охватывает гибридные белки, включающие весь IL-32 или его часть. Соответственно, в некоторых вариантах настоящего изобретения последовательности, кодирующие полипептид, могут вводиться как часть гибридного гена, включающего нуклеотидную последовательность,кодирующую другой (отличный) полипептид. Предполагается, что этот тип системы экспрессии найдт применение в условиях, когда желательно получить иммуногенный фрагмент белка IL-32. Помимо применения гибридных белков для повышения иммуногенности, хорошо известно, что гибридные белки могут также облегчать экспрессию белков, таких как белок EL-32 по данному изобретению. Поэтому в некоторых вариантах настоящего изобретения IL-32 может генерироваться в виде глутатион-S-трансферазы (т.е. GST-гибридного белка). Предполагают, что GST-гибридные белки способствуют легкой очистке IL-32, так, как с применением матриц на основе производных глутатиона. В другом варианте настоящего изобретения гибридный ген, кодирующий очистку лидерной последовательности,такой как последовательность сайта расщепления поли-(His)/энтерокиназа на N-конце заданного участкаIL-32, может способствовать очистке экспрессированного гибридного белка IL-32 аффинной хроматографией с применением смолы Ni2+ металл. Ещ в одном варианте настоящего изобретения очищенную лидерную последовательность можно затем удалять обработкой энтерокиназой.- 13012567 Е. Варианты IL-32 Другие варианты настоящего изобретения включают мутантные или вариантные формы IL-32. Структуру пептида, имеющего активность IL-32, можно модифицировать для таких целей, как повышение терапевтической или профилактической эффективности или стабильности (например, ex vivo время хранения, и/или резистентность к протеолитическому расщеплению in vivo). Такие модифицированные пептиды рассматриваются как функциональные эквиваленты пептидов, имеющие активность белков IL32 по данному описанию. Модифицированный пептид с изменнной аминокислотной последовательностью можно получать, например, заменой, делецией или добавлением аминокислот. В некоторых вариантах изобретения предпочтительные IL-32 варианты включают агонисты IL-32 (например, варианты IL32, которые обладают TNF-индуцирующей активностью), тогда как другие предпочтительные вариантыIL-32 включают антагонисты IL-32 (например, варианты IL-32, которые не обладают TNFиндуцирующей активностью и которые ингибируют TNF- индуцирующую активность белков IL-32 дикого типа).III. Антитела IL-32 Можно получать антитела для того, чтобы способствовать обнаружению белков IL-32. Антитела можно получать, используя различные иммуногены. В одном варианте изобретения иммуноген для генерирования антител, распознающих (узнающих) IL-32, представляет собой IL-32 пептид. Такие антитела включают, но без ограничения, поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные, фрагменты Fab и библиотеки экспрессии Fab. Для получения поликлональных антител против IL-32 можно использовать различные методики,известные в уровне техники. Для продуцирования антитела различных животных-хозяев, включая, но без ограничения, кроликов, мышей, крыс, овец, коз и т.д., можно иммунизировать, инъецируя пептид, соответствующий IL-32 эпитопу. В предпочтительном варианте изобретения пептид конъюгирован с иммуногенным носителем (например, дифтерийный анатоксин, альбумин бычьей сыворотки или гемоцианин лимфы улитки). Для повышения иммунологического ответа можно добавлять различные адъюванты, в зависимости от вида хозяина, включая, но без ограничения, адъювант Фрейнда (полный и неполный),минеральные гели (например, гидроксид алюминия), поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, поверхностно-активные полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, динитрофенол и потенциально применимые адъюванты человеческого происхождения, такие как Bacille Calmett- Guerin). Предполагается, что для получения моноклональных антител против IL-32 найдт применение по настоящему изобретению любой метод, который обеспечивает получение молекул антитела с использованием непрерывных клеточных линий в культуре (См., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Эти методы включают, но без ограничения, метод гибридом (Khler and Milstein, Nature 256: 495-497, 1975), а также метод триом, метод человеческих В-клеточных гибридом (См., например, Kozbor et al., Lmmunol Today, 4: 72, 1983) и метод EBV-гибридом для получения человеческих моноклональных антител (Cole et al., в MonoclonalAntibody and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77- 96, 1985). Кроме того, полагают, что методы, описанные для получения одноцепочечных антител (патент США 4946778) найдт применение при получении IL-32 специфических одноцепочечных антител. Ещ в одном варианте изобретения используются методы, описанные для создания библиотек экспрессии Fab(Huse et al., Science, 246: 1275-1281, 1989), обеспечивающие быструю и простую идентификацию моноклональных Fab фрагментов с заданной специфичностью в отношении IL-32. Полагают, что любой метод, пригодный для продуцирования фрагментов антител, найдт применение при получении фрагментов антител, которые содержат идиотип (антигенсвязывающую область) молекулы антитела. Например, такие фрагменты включают, но без ограничения: фрагмент F(ab')2, который можно получать расщеплением молекулы антитела под действием пепсина; фрагменты Fab', который можно получать восстановлением дисульфидных мостиков фрагмента F(ab')2, и фрагменты Fab, которые можно получать, обрабатывая молекулу антитела папаином и восстановителем. При получении антител рассматривается, что скрининг на заданное антитело проводится известными в уровне техники методами (например, такими как радиоиммуноанализ, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), "сэндвич"-иммуноанализы, иммунорадиометрические анализы, реакции диффузии-осаждения в геле, иммунодиффузионные анализы, иммуноанализы in situ (например, с применением коллоидного золота, ферментных или радиоизотопных меток), Вестерн-блоттинг, реакции осаждения(преципитации), реакции агглютинации (например, реакции агглютинации в геле, реакции гемагглютинации и т.д.), реакции фиксации комплемента, иммунофлуоресцентные анализы, анализы на протеин А и иммуноэлектрофорез и т.д. В одном варианте изобретения связывание антитела определяют, детектируя метку на первичном антителе. В другом варианте изобретения первичное антитело обнаруживают, детектируя связывание вторичного антитела или реагента с первичным антителом. Ещ в одном варианте изобретения вторичное антитело является меченым. В уровне техники известно много способов детектирования связывания иммуноанализом, и они входят в объм настоящего изобретения. Как общеизвестно в уровне техники,- 14012567 иммуногенный пептид не должен содержать молекулу носителя, применяемого по любому протоколу иммунизации. Например, если пептид конъюгирован с KLH, при скрининге он может быть конъюгирован с BSA или использоваться непосредственно. Вышеуказанные антитела можно использовать в способах, известных в уровне техники, относящихся к локализации и структуре IL-32 (например, для Вестерн-блоттинга), к измерению их уровней в соответствующих биологических образцах и т.д. Антитела можно использовать для детектирования IL32 в биологическом образце индивидуума. Биологический образец может быть биологической жидкостью, такой как, но без ограничения, кровь, сыворотка, плазма, интерстициальная жидкость, моча, ликвор и т.п., содержащая клетки. Биологические образцы можно затем проверять непосредственно на присутствие человеческого IL32 при использовании подходящего метода (например, ELISA или радиоиммуноанализа) и формата (например, микролунки, тест-полоски и т.д.). Или же, белки в образце можно разделять по размеру (например, электрофорезом на акриламидном геле (PAGE), в присутствии или в отсутствие додецилсульфата натрия (SDS), и в присутствии IL-32, детектируемого иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг). Методы иммуноблоттинга обычно более эффективны для антител, полученных против пептида, соответствующего эпитопу белка, и, следовательно, особенно подходят для настоящего изобретения. Особенно предпочтительные варианты настоящего изобретения содержат IL-32 антитела для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит. Считают, что IL-32-реактивные антитела, которые нейтрализуют TNFa-индуцирующую активность IL-32, ослабляют, по меньшей мере, один симптом заболевания PA (RA), и в особенно предпочтительных вариантах изобретения замедляют развитие заболевания РА. Дополнительные указания, относящиеся к получению и применению терапевтических антител, которые, как полагают, применимы к системе IL-32, имеются в патентах США 6277969 и 6448380 (оба вводятся в данное описание в качестве ссылки), относящихся к терапевтическим TNF- реактивным антителам.IV. Фармацевтические композиции, содержащие IL-32 нуклеиновые кислоты, пептиды или антитела Помимо этого, настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, которые могут содержать целую IL-32 полинуклеотидную последовательность или е участки, IL-32 полипептиды, ингибиторы или антагонисты IL-32 биоактивности, включая антитела, одни или в комбинации по меньшей мере с одним отличным агентом, таким как стабилизатор, они могут вводится в любом стерильном биосовместимом фармацевтическом носителе, включая, но без ограничения, физиологический солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстрозу и воду. Способы по настоящему изобретению находят применение при лечении аутоиммунных заболеваний и рака. Пептиды можно вводить пациенту внутривенно в фармацевтически приемлемом носителе,таком как физиологический солевой раствор. Можно использовать стандартные способы внутриклеточной доставки пептидов (например, доставка в липосомах). Такие способы хорошо известны рядовому специалисту в данной области техники. Препараты по данному изобретению применимы для парентерального введения, такого как внутривенное, подкожное, внутримышечное и интраперитонеальное. Используя генную терапию можно также осуществить внутриклеточное введение полипептида. Как хорошо известно в медицине, доза для любого пациента зависит от многих факторов, включая габариты пациента, площадь поверхности тела, конкретное вводимое соединение, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и взаимодействие с другими, одновременно принимаемыми, лекарствами. Соответственно, в некоторых вариантах настоящего изобретения IL-32 нуклеотидную и IL-32 аминокислотную последовательности можно вводить пациенту самостоятельно или в комбинации с другими нуклеотидными последовательностями, лекарствами или гормонами, или в фармацевтических композициях, в которых они смешаны с эксципиентом(ами) или другими фармацевтически приемлемыми носителями. В одном варианте настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель является фармацевтически инертным. В другом варианте настоящего изобретения IL-32 полинуклеотидные последовательности или IL-32 аминокислотные последовательности IL-32 можно вводить самостоятельно(одни) индивидууму, подвергающемуся заболеванию или страдающему от него. В других вариантах фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно приготовить, используя фармацевтически приемлемые носители, общеизвестные в уровне техники, в лекарственных формах, пригодных для орального применения. Такие носители позволяют готовить фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, кашиц, суспензий и т.п., для орального или назального прима пациентами, проходящими лечение. Фармацевтические композиции, пригодные для применения по данному изобретению, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения предполагаемой цели. Например, эффективное количество IL-32 может представлять собой такое количество, которое индуцирует продуцирование TNF. Определение эффективных количеств является компетенцией специалистов в данной области техники, особенно в свете представленной в данном описании информации (раскрытия).- 15012567 Для любого соединения, применяемого в способе по изобретению, терапевтически эффективную дозу можно сначала оценить, используя анализы в клеточных культурах. Затем, предпочтительно, дозу можно проверить на животных моделях (предпочтительно, на мышиных моделях) для достижения нужного интервала концентраций в кровотоке, который регулирует уровни TNF."Терапевтически эффективная доза" относится к такому количеству IL-32, которое улучшает по меньшей мере один симптом болезненного состояния (например, рака), или к такому количеству IL-32 антитела или антагониста, которое улучшает, по меньшей мере, болезненное состояние (например, аутоиммунное заболевание, такое как ревматоидный артрит). Токсичность и терапевтическую эффективность таких соединений можно определить стандартными фармацевтическими методами в клеточных культурах или на экспериментальных животных (LD50, доза, смертельная для 50% популяции; и ED50, доза, терапевтически эффективная у 50% популяции). Отношение смертельной (токсической) дозы к дозе, вызывающей терапевтический эффект, у 50% популяции называется терапевтическим индексом, и его можно выразить отношением LD50/ED50. Предпочтительными являются соединения с большим терапевтическим индексом. Данные, полученные в анализах клеточных культур и дополнительных исследованиях на животных, можно использовать при определении интервала доз для применения на людях. Дозировка таких соединений лежит, предпочтительно, в интервале концентраций в кровотоке, которая включает ED50 с малой токсичностью или в отсутствие токсичности. Дозировка в этом интервале меняется в зависимости от применяемой лекарственной формы, восприимчивости пациента и способа введения. Количества в нормальной (обычной) дозе могут варьироваться от 0.1 до 1000000 микрограмм, вплоть до общей дозы около 1 г, в зависимости от способа введения.V. Скрининг лекарств с применением IL-32 Настоящее изобретение охватывает способы и композиции, применяющие IL- 32 в качестве мишени для скрининга лекарств, которые могут изменять ответ провоспалительных цитокинов (например,продуцирование TNF). Метод скрининга лекарств обеспечивает высокопроизводительный скрининг на соединения, обладающие подходящей аффинностью связывания с пептидами IL-32, и подробно описан в Международной заявке WO 84/03564, вводимой в данное описание в качестве ссылки. Коротко говоря, большое число различных малых тестируемых пептидных соединений синтезируют на тврдом субстрате, таком как пластиковые штифты (штырьки), или на другой поверхности. Затем пептидные тестируемые соединения реагируют с IL-32 пептидами и отмываются. Затем связанные IL-32 пептиды детектируют хорошо известными в технике способами. В другом методе используются IL-32 антитела, полученные как обсуждалось выше. Такие антитела,способные специфически связываться с IL-32, конкурируют с тестируемым соединением за связывание сIL-32. Таким образом, антитела можно использовать для обнаружения любого пептида, который имеет одну или более антигенных детерминант, общих с IL-32 пептидом. В настоящем изобретении рассматриваются многие другие способы скрининга соединений. Приведнные ниже примеры представлены только для иллюстрации ряда подходящих методов. Рядовой специалист поймт, что можно использовать множество других методов скрининга. В частности, в настоящем изобретении рассматривается применение клеточных линий, трансфецированных с помощью IL-32 или его вариантов или мутантов, для скрининга соединений на активность, и,в частности, для высокопроизводительного скрининга соединений из комбинаторных библиотек (например, библиотек, содержащих более 104 соединений). Клеточные линии по настоящему изобретению можно использовать в различных методах скрининга. В некоторых вариантах изобретения клетки можно использовать в анализах вторичных мессенджеров, которые контролируют сигнальную трансдукцию после активации рецепторов клеточной поверхности. В других вариантах изобретения клетки можно использовать в анализах репортрных (маркерных) генов, которые мониторируют клеточные ответы на уровне транскрипции/трансляции. В анализах вторичных мессенджеров клетки-хозяева предпочтительно трансфецируют, как описано выше, с помощью векторов, кодирующих IL-32 или его варианты или мутанты. Затем клетки-хозяева обрабатывают соединением или множеством соединений (например, из комбинаторной библиотеки) и анализируют на наличие или отсутствие ответа. Полагают, что, по меньшей мере, несколько соединений из комбинаторной библиотеки могут служить в качестве агонистов, антагонистов, активаторов или ингибиторов белка или белков, кодируемых векторами. Также рассматривают, что, по меньшей мере, некоторые из соединений в комбинаторной библиотеке может служить в качестве агонистов, антагонистов, активаторов или ингибиторов белка, действующего до или после ("апстрим" или "даунстрим") белка, кодируемого вектором, в направлении сигнальной трансдукции. Клетки также применимы в анализах репортрных (маркерных) генов. Анализы репортрных генов включают применение клеток-хозяев, трансфецированных векторами, кодирующими нуклеиновую кислоту, содержащую элементы контроля транскрипции целевого гена (т.е. гена, который контролирует биологическую экспрессию и функцию мишени заболевания), соединнного с последовательностью, кодирующей репортрный (маркерный) ген. Следовательно, активация целевого гена приводит к активации- 16012567 генного продукта репортрного гена. Экспериментальная часть Нижеприведнные примеры даются для того, чтобы продемонстрировать и дополнительно проиллюстрировать некоторые предпочтительные варианты и аспекты настоящего изобретения, а не для ограничения настоящего изобретения. В приведнной ниже экспериментальной части применяются следующие сокращения: eq (эквиваленты); М (полярность); мкМ (микромолярность); N (нормальность); моль (моли); ммоль (миллимоли); нмоль (наномоли); г (граммы); мг (миллиграммы); мкг (микрограммы); нг (нанограммы); л (литры); мл(проценты); kb, тыс. н.о. (тысяча нуклеиновых оснований); п.о. (пара оснований); ПЦР, PCR (полимеразная цепная реакция). Кроме того, применяют следующие клетки и биоанализы. Человеческую NK клеточную линию получают от Dr. Hans Klingerman (Rush Medical Center, Chicago, IL) и культивируют в среде RPMI1640, содержащей 10% FCS, IL-2 (50 пг/мл) и IL-15 (200 пг/мл) (Peprotech, Rocky Hill, NJ). Макрофагальные клетки мышей Raw 264,7, человеческие клетки А 549 рака лгких, печночные клетки Cos7 обезьян, Anjou65 (субклон линии 293 Т человеческих фибробластов), человеческие эпителиальные клетки Wish и человеческую моноцитарную ТНР клеточную линию получают из американской коллекции типовых культур (АТСС) и хранят в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Биоанализы проводят в 96- луночных планшетах. Коротко говоря, клетки Raw (Peprotech, клетки A549-RP (2105/мл, 0.1 мл/лунка) и человеческиеNK клетки (5105/мл, 0.1 мл/лунка) засевают в 96-луночных планшетах и культивируют до тех пор, пока не произойдт адгезия к планшетам. При анализах в клетках Raw использованную среду удаляют и клетки стимулируют свежей средой (0.2 мл), содержащей различные концентрации rIL-32 в присутствии 5 мкг/мл полимиксина В (Bedford Laboratories, Bedford, ОН). При анализах в клетках A549-R использованную среду удаляют и клетки стимулируют свежей средой (0.2 мл), содержащей IL-18 (полученный как описано Kim et al., J Immunol, 166: 148-154, 2001). При анализах в клетках NK клетки стимулируют с помощью IL-12 (Peprotech) или IL-18, или обоих цитокинов. Клетки ТНР (5105/мл, 0.1 мл/лунка) засевают в 96- луночные планшеты в отсутствие FCS, а затем стимулируют с помощью rIL-32 из различных источников. Для анализа дифференцировки ТНР-1 под действием форбол-12-миристат-3 ацетата (РМА) клетки ТНР-1 (0,25105/мл, 0,1 мл/лунка) засевают в 24 х- луночные планшеты, а затем стимулируют с помощью 100 нг/мл РМА (Sigma, St Louis, МО) в течение 48 ч, отмывают в среде, не содержащей FCS, и клетки обрабатывают rIL-32. Планшеты помещают в инкубатор для клеточных культур на 16-20 ч, а затем культуральные супернатанты собирают для измерения цитокинов. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяют из остаточных лейкоцитов после тромбоцитофереза здоровых доноров, используя Histopaque (Sigma), как утверждено Combined Colorado Investigational Review Board. РВМС (1,5107) засевают в 6-луночные планшеты в 3 мл RPMI, содержащей 10% FCS, а затем стимулируют с помощью 20 мкг Con A (Sigma). Планшеты помещают в инкубатор для клеточных культур на 60 ч, после чего культуральный супернатант и клеточный лизат собирают для измерения EL-32.IL-32 оценивают в единицах биологической активности, так как существуют различия в уровнях активности между rIL-32, продуцированным Е. coli, и rIL-32, продуцированным клетками млекопитающих,и так как существуют различия в уровнях активности между различными партиями. Одна единица IL-32 определяется как количество IL-32, которое индуцирует 2-кратную индукцию человеческого или мышиного TNF в РМА-дифференцированных клетках ТНР-1 и мышиных Raw клетках, соответственно, в описанных выше условиях анализа. Приблизительная концентрация 1 единицы rIL-32, продуцированного Е. coli, составляет 20 нг/мл, тогда как приблизительная концентрация 1 единицы rIL-32 млекопитающих составляет 0,1 нг/мл (как найдено методами ECL и Вестерн-блоттинга). Пример 1. Идентификация IL-18 индуцибельных генов, включающих NK4/IL-32 Дикого типа человеческие клетки А 549 рака лгких (А 549- WT) экспрессируют IL-18R, но не IL18R. Поэтому, чтобы экспрессировать функциональный IL-18 рецептор в клетках А 549, клетки А 549 трансфецируют с использованием вектора, экспрессирующего цепь IL-18R. Коротко говоря, человеческие клетки рака лгких А 549 (3105 на лунку) засевают в 6-луночные планшеты за день до трансфекции. Затем клетки отмывают, используя 2 мл среды Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) и инкубируют в течение 25 мин в 1 мл свежей среды. Раствор смеси для трансфекции для каждой лунки готовят, смешивая 5 мкл липофектамина 2000 в 100 мкл Opti-MEM с последующей инкубацией в течение 5 мин под"колпаком" тканевой культуры. После этого добавляют 2 мкг плазмидной ДНК, pTARGET/huIL- 18R(Kim et al., J Immunol, 166: 148-154, 2001), a затем инкубируют в течение 20 мин. Раствор смеси для трансфекции добавляют в лунки и планшет инкубируют ещ в течение 4 ч при 37 С. Трансфекцию заканчивают, добавляя в каждую лунку 2 мл клеточной культуральной среды, содержащей 10% FCS. На следующий день клетки обрабатывают трипсином и переносят в плашку 15 см. После адгезии клеток к- 17012567 плашке культуральную среду заменяют свежей средой, содержащей 800 мкг/мл неомицина (G418, Invitrogen). Среду для селекции каждые три дня заменяют свежей средой до появления индивидуальных колоний ( 10-14 дней). Небольшие бумажные кружочки 3 мм в окружности стерилизуют, смачивают трипсином, а затем используют для отбора отдельных колоний. Колонии переносят в 24-луночный планшет, содержащий в каждой лунке 1 мл среды для селекции. Индивидуальные колонии выращивают до тех пор, пока не получат 10 клеток, а затем каждый клон проверяют на экспрессию трансфецированного гена с помощью RT- PCR, а также биоанализов, с помощью которых измеряют IL-6 и IL-8 в клеточной культуральной среде после IL-18 стимуляции в течение 24 ч. По показаниям как RT-PCR, так и биоанализа, три клона являются позитивными. Для получения единичного клона готовят культуры в ограничивающем разведении. Как показано на фиг. 1, 1 А, клетки А 549, трансфецированные с помощью конструкции IL-18R(A549-R) (Kim et al., J Immunol, 166: 148-154, 2001), экспрессируют как цепь IL-18R, так и цепь IL18R, что определяется с помощью RT-PCR. Стабильный клон (А 549-R)тестируют на индукцию IL-8 после стимуляции под действием IL-18 (100 нг/мл) в течение 16 ч. После экспрессии IL-18R в клетках А 549 клетки A549-R отвечают на IL-18 в отсутствие костимулятора, продуцируя IL-6 и IL-8, тогда как родительская клеточная линия А 549 (A549-WT) по-прежнему не отвечают на IL-18 (См. фиг. 1, рисунки В и С, N=7). Затем клетки A549-R используют для изучения экспрессии IL-18-индуцибельного гена методомmicroarray (или с помощью микрочипов). Коротко говоря, клетки A549-R засевают по 2106 в девятисантиметровые плашки за день до эксперимента. Затем клетки стимулируют с помощью IL-18 (50 нг/мл) в течение 6 ч, после чего обработанные и контрольные клетки собирают. Тотальную РНК выделяют с помощью Tri-Reagent и очищают с применением набора RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Тотальную РНК используют затем для microarray анализа в соответствии с инструкциями от Affymetrix. Тотальную РНК превращают в кДНК первого тяжа (нити), используя Superscript II RT (Invitrogen). кДНК второй нити синтезируют, используя Т 4 ДНК-полимеразу I. После синтеза второй нити реакционную смесь очищают с помощью набора, снабжнного GeneChip. Проводят синтез кРНК для получения меченой биотином кРНК, используя набор для мечения транскрипта РНК. Перед гибридизацией биотинилированную кРНК фрагментируют. Образцы гибридизуют с Affymetrix GeneChip HG- U133 и данные анализируют в лаборатории микрочипов (microarray core) Медицинского Центра Университета Колорадо. Данные, полученные с помощью микрочипов, показывают, что IL-18 индуцирует гены цитокинов,включая IL-6 и IL-8. Некоторые хемокины, включая интерферон-2 и IL-1, экспрессия которых, как было известно ранее, является IL-18- индуцибельной, входят в группу, в которой наблюдается повышенная экспрессия, более чем в 3 раза (log основания 2), в ответ на обработку IL-18 (см. табл. 1, в которой приведены данные двух независимых экспериментов). Интересно отметить, что степень индукции под действием транскрипта 4 природных киллерных клеток (NK4) также очень высока (5,3-кратная). ГенNK4 первоначально описан как продукт активированных NK или Т-клеток (Dahl et al., J Immunol, 148: 597-603, 1992), хотя об этом гене не собрано никаких функциональных данных. Экспрессию мРНК NK4 изучают методом RT-PCR, используя ту же самую тотальную РНК, которую используют в исследовании методом microarray (микрочипа). Первый тяж кДНК синтезируют, приблизительно, из 1 мкг тотальной РНК, используя Superscript II от Invitrogen (Carlsbad, CA). Реакцию ПЦР (PCR) проводят при 94 С в течение 45 с, 70 С в течение 2 мин, 59 С в течение 1 мин, 30 циклов со смысловым праймером 5'CTGTCCCGAGTCTGGACTTT-3' (SEQ ID NO: 1) и антисмысловым праймером 5'GCGGTGGTGGTCAGTATC-3' (SEQ ID NO: 2). NK4 транскрипт детектируют в IL-18, обработанном клетками A549-R, но не в нестимулированных клетках A549-R (См. фиг. 1, 1D). Также изучают экспрессию NK4 в клеточной линии NK92 (Hoshino et al., J Immunol, 162: 51-59,1999). Ген NK 4 конститутивно и с высокими уровнями экспрессируется в этой клеточной линии при выдерживании в кондиционированной среде, содержащей как IL-2, так и IL-15. Полагают, что IL-2 в кондиционированной среде способствует высокому уровню экспрессии гена NK4, наблюдаемому в клеточной линии NK92. Пример 2. Индукция TNFa с помощью NK4/IL- 32 Для определения функции этого мало описанного генного продукта кДНК NK4 (см. фиг. 3, IL-32) клонируют из клеток NK92 (Dahl et al., supra, 1992) в pGEMT-Easy (Promega) для секвенирования, а затем инсерт переносят в pPROEX/Hta (Invitrogen) для экспрессии в Е. coli, или в pTARGET (Promega) для экспрессии в клетках млекопитающих. Рекомбинантный NK4 экспрессируют в Е. coli и очищают на колонке для аффинной хроматографии TALON (Invitrogen), вводя метку (хвост) His6 на N- конце рекомбинантных белков. Очищенный аффинной хроматографией на колонке TALON белок хроматографируют эксклюзионной хроматографией по размеру (Superdex 75, KTAFPLC) и расщепляют с помощью вируса гравировки табака (Invitrogen) в течение 16 ч при 4 С для удаления His6 хвоста. Отщеплнный рекомбинантный белок диализуют в фосфатном буфере (20 мМ, рН 9). Этот материал затем подвергают ионообменной хроматографии (HiTrapQFF, KTAFPLC). Рекомбинантный NK4 белок, очищенный последовательной трхстадийной хроматографией (аффинная хроматография с His-меткой, эксклюзионная хроматография по размеру частиц и ионообменная хроматография) выходит в виде гомогенной полосы около 20 кДа в 10% геле SDS-PAGE, затем окрашенном кумасси синим (см. фиг. 2, 2 А). Трижды очищенный рекомбинантный белок NK4 испытывают на биологическую активность, измеряя секрецию TNF макрофагальными клетками мышей Raw 264,7 в присутствии полимиксина В (100 Ед/мл). Мышиные макрофагальные клетки Raw 264,7 отвечают на рекомбинантный NK4 и продуцированием большого количества TNF, совпадающего с пиками (максимумами) белковых фракций, вымываемых с ионообменной колонки (см., фиг. 2, 2 А). В связи с распознаванием вновь открытой биологической активности NK4 молекула была переименована и названа IL-32/TNF- индуцирующий фактор (TAIF). Как показано на фиг. 2, 2 В, IL-32 индуцирует значительные количества TNF при таких низких концентрациях IL-32 как 400 пг/мл (27 пикомолей в расчте на вычисленную молекулярную массу IL-32,равную 14,8 кДа), и повышает продуцирование TNF в зависимости от дозы. Общеизвестно, что TNFa обладает многими воспалительными свойствами, которые являются причиной многочисленных воспалительных и аутоиммунных заболеваний (Beutler et al., Blood Cells MolDis, 24:216-230, 1998). Рекомбинантный IL-32 также продуцируется клетками млекопитающих транзиторной трансфекцией клеток Cos-7 (8106) с помощью экспрессирующего вектора pTARGET/IL-32 методом с применением DEAE-декстрана (Sompayrac et al., Proc Natl Acad Sci USA, 78: 7575-7578, 1981). Как показано на фиг. 2, 2 С, рекомбинантный IL-32a (100 пг/мл), полученный из концентрированного супернатанта кле- 19012567 ток, трансфецированных с помощью IL-32, индуцирует продуцирование TNF, тогда как концентрированный супернатант мнимо (суррогатных) трансфецированных клеток не индуцирует продуцированиеTNF. Концентрацию рекомбинантного IL-32 в супернатантах Cos-7 определяют методом ECL и иммуноблоттингом. Кроме того, найдено, что IL-32, продуцированный клетками млекопитающих, обладает более высокой TNF- индуцирующей активностью, чем IL-32, полученный в бактериальных клетках. Пример 3. Идентификация геномной структуры и вариантов сплайсинга IL-32 Анализируют структура гена IL-32 и его локализацию в геноме человека. IL-32 также клонируют методом RT-PCR при использовании человеческой клеточной линии NK92, культивированной в присутствии IL-2 (50 пг/мл) и IL-15 (200 пг/мл). Для этой цели используют следующие праймеры: смысловой 5'CTGTCCCGAG TCTGGACTTT-3' (SEQ ID NO: 1), и антисмысловой 5'-GCGGTGGTGGTCAGTATC- 3'(SEQ ID NO: 2). Как показано на фиг. 3 и 5, три варианта сплайсинга IL-32 (IL-32, раскрываемый какAY495332, и IL-328, раскрываемый как SEQ ID NO: 5 и No. в GENBANK AY495333) идентифицируют при использовании РНК клеток NK92, тогда как в другом варианте сплайсинга (IL-32, раскрываемый как SEQ ID NO: 6 и No. в GENBANK BK004065) сообщалось ранее как о NK4 транскрипте (No. в GENBANK: NM 004221). Таким образом, IL-32 экспрессируется, по меньшей мере, в виде четырх вариантов вследствие альтернативного сплайсинга мРНК. Для того, чтобы определить, что ген IL-32 расположен на хромосоме 16 р 13.3, используют Blast программу с веб-сайта NCBI. Около 5 тыс. н.о. из последовательности, охватывающий ген IL-32 (представлена как SEQ ID NO: 11 и No. в GENBANK AY495334), идентифицируют на участке в 180 тыс. н.о. последовательности человеческой хромосомы 16 (No. в GENBANK AC108134). При сравнении последовательностей вариантов сплайсинга с геномной последовательностью найдено, что ген IL-32 содержит восемь малых экзонов, причм второй и третий экзоны содержат стартовые кодоны ATG. IL-32 содержит дополнительные 46 аминокислот на свом N-конце (SEQ ID NO: 14) вследствие отсутствия сплайсинга между экзонами 3 и 4. Однако в IL-32 второй экзон отсутствует, это приводит к тому, что стартовый кодон ATG используется в третьем экзоне, вместо кодона ATG во втором экзоне. IL-32 является самым распространнным кДНК клоном, поэтому эта изоформа используется во многих экспериментах по данному описании. IL-32a имеет делецию 57 аминокислотных остатков на С- конце вследствие сплайсинга между экзонами 7 и 8, что является отличием от других вариантов, которые содержат единственный большой экзон, кодирующий их С-концы. Анализ IL-32 аминокислотных последовательностей показывает присутствие трх потенциальных сайтов N-миристоилирования и один потенциальный сайт Nгликозилирования (см. фиг. 4 А). Программу Blast используют для поиска базы данных NCBI для гомологов IL-32. Таким способом идентифицируют клоны экспрессируемых ярлыков последовательности (меток экспрессируемой последовательности) (EST) IL-32 лошадиного, бычьего, овцы и свиньи. Последовательность лошадиного белкаIL-32 (No. в GENBANK CD469554 и В 1961524) имеет высокую степень гомологии с человеческой последовательностью (идентичность 31,8%), далее идут последовательность бычьего белка (No. в GENBANK CK834399 и CK832489), белка овцы (No. в GENBANK CO202364) и свиньи (No. в GENBANKCB287292). Выравнивание последовательностей человеческого, лошадиного и бычьего IL-32 показано на фиг. 4 В). В частности, изоформа А овцы и свиней идентифицирована у лошадей, а изоформы В и С идентифицированы у коров. Последовательности лошадиного IL-32 и бычьего IL-32, каждую, объединяют из двух EST клонов, а открытые рамки считывания выводят из объединнной последовательности. Пример 4. Анализ экспрессии IL-32 Экспрессию IL-32 в различных человеческих тканях изучают методом Нозерн-блоттинга. Коротко говоря, инсерты кДНК IL-32 и актина вырезают из плазмидных векторов с помощью подходящих рестриктаз, фракционируют по размеру и очищают с помощью набора GeneClean II (Q- BIO gene, Carlsbad,CA). кДНК метят с помощью 32-dCTP (NEN Life Science, Boston, MA), используя случайное примирование с помощью фермента Клнова (New England Biolabs, Beverly, MA). Мембрану, содержащую человеческую поли(А)+ РНК из различных тканей (человеческие MTN Блот II), инкубируют с зондами кДНК,связывание детектируют методом авторадиографии. Как показано на фиг. 8 А, транскрипт IL-32 протяжнностью 1,2 тыс.п.о. обнаруживают в большинстве тканей, причм более высокие, по сравнению с другими типами клеток, уровни IL-32 наблюдаются в иммунных клетках. Высокая экспрессия мРНК IL32 в иммунных тканях вызвана не разной нагрузкой, что показано с повторной гибридизацией блота с фрагментом актина. Эндогенную экспрессию IL-32 также детектируют на уровне белка. Коротко говоря, клетки А 549R засевают при плотности 106 клеток/лунка в 6-луночные планшеты. После иммобилизации клеток на планшетах культуральную среду F12K удаляют и заменяют бессывороточной средой, которая в некоторых лунках содержит IL 18 (50 нг/мл), IL-1 (100 нг/мл) или LPS (500 нг/мл). Через 48 ч супернатанты собирают и концентрируют в 10 раз в центрифужных патронах для ультрафильтрации Centricon. Как показано на фиг. 8 В, иммуноблоттингом с очищенным аффинной хроматографией кроличьим поликло- 20012567 нальным антителом против человеческого IL-32 обнаруживают продукты протяжнностью около 32 кДа, соответствующие эндогенному IL-32. Полагают, что разница между молекулярной массой rIL-32 из Е coli и эндогенного IL-32 вызвана посттрансляционной модификацией эндогенной молекулы, так как анализ аминокислотной последовательности показывает присутствие потенциальных N-связанных сайтов гликозилирования и миристоилирования. IL-32 секретируют в клеточной культуральной среде клеток, обработанных IL-18 (100 нг/мл), IL-1 (100 нг/мл) или LPS (500 нг/мл), но не в среде нестимулированных клеток (контроль). IL-32 детектируют в среде клеточных культур в виде секретированной молекулы, хотя IL-32 не содержит типичного гидрофобного сигнального пептида на N-конце. IL-18 индуцирует более высокую степень экспрессии IL-32, чем IL-1 и LPS. Также наблюдают полосу 60 кДа (не показана), которую рассматривают как димеризованную форму IL-32. Подобно мономеру полоса 60 кДа обнаруживается в супернатантах обработанных клеток, но отсутствует в супернатантах нестимулированных клеток. Также изучают индукцию IL-32 в человеческих эпителиальных клетках Wish, обработанных IFN,так как клетки Wish обычно используют для антивирусных анализов и для оценки других биологических активностей IFN. Для продуцирования IL-32 клетки Wish, А 549- WT и А 549- R засевают при плотности 5104 клеток/лунка в 6-луночные планшеты и затем стимулируют с помощью IFN (100 Ед./мл), IL18 (50 нг/мл) или IL-1 (10 нг/мл). Очищенные аффинной хроматографией кроличьи антитела против IL32 используют для обнаружения IL-32 в клеточной культуральной среде методом иммуноблоттинга. Конъюгированные с пероксидазой вторичные антитела (Jackson ImmunoResearch Laboratories, WestGrove, PA) используют для проявления блотов, используя повышенную хемилюминесценцию (NEN LifeScience). Для детектирования IL-32 с помощью электрохемилюминесценции (ECL) аликвоту очищенного аффинной хроматографией антитела против IL-32 метят биотином, а другую аликвоту метят рутением в соответствии с инструкциями производителя (Igen, Gaithersburg, MD). Меченные биотином и рутением антитела используют для построения стандартной кривой с применением рекомбинантного IL-32. Для измерения различных цитокинов в клеточных культуральных средах и в сывороточных образцах используют метод жидкофазной ECL. Показатели электрохемилюминесценции определяют на анализаторе Origen (Igen). Как показано на фиг. 9 А, IL-32 индуцируется в клеточных лизатах человеческих эпителиальных клеток в зависимости от времени, уменьшаясь после 46 ч, тогда как в нестимулированных клетках IL-32 не индуцируется. Аналогично, IL-18 и IL-1 повышают экспрессию эндогенного IL-32 в лизатах клеток А 549-R в зависимости от времени (фиг. 9 В), тогда как в клетках A549-WT (фиг. 9 С) IL-32 только индуцируется под действием IL-1. Кроме того, также наблюдается, что IFN индуцирует IL-32 в лизатах клеток А 549- WT (данные не показаны). Чтобы определить, действительно ли рекомбинантные белки, экспрессированные при использовании кДНК IL-32 ив клетках млекопитающих, сравнимы с эндогенным IL-32, клетки Cos7 транзиторно трансфецируют с помощью кДНК IL-32 и . Как показано на фиг. 9D и 9 Е. Как показано на фиг. 9D и 9 Е, рекомбинантный IL-32 и IL-32 присутствует как в культуральных средах, так и в лизатах трансфецированных клеток, что определено иммуноблоттингом. Размер молекул рекомбинантного IL-32 млекопитающих в иммуноблотах идентичен размеру молекул эндогенного IL-32 показан на фиг. 8 В. ECL анализ показывает аналогичное распределение IL-32 и EL-32 в культуральных средах и лизатах, хотяIL-32, по-видимому, секретируется более эффективно по сравнению с IL-32, который преимущественно ассоциирован с клетками. Поликлональное антитело против человеческого IL-32 очищают аффинной хроматографией на колонке, содержащей IL-32, иммобилизованный на агарозных гранулах (Affi-gel 15). Конъюгированные с пероксидазой вторичные антитела против кроличьего иммуноглобулина получают от Jackson ImmunoResearch. Так как антитела против человеческого IL-32 специфично узнают эндогенный IL-32, уровень IL-32 в человеческой сыворотке (здоровых индивидуумов и пациентов с сепсисом) измеряют методом ECL. Хотя IL-32 обнаружен в сыворотке здоровых людей (5 из 42 образцов),уровни IL-32 ниже 70 пг/мл. Напротив, средние уровни IL-32 в сыворотке больных с сепсисом в 35 раз выше, чем в сыворотке здоровых людей. В первый раз в ходе разработки настоящего изобретения показано, что IL-32 является воспалительным цитокином, продуцируемым (прямо или косвенно) в ответ на бактериальную инфекцию. Кроме того, IL-32 обнаруживается у больных активным ревматоидным артритом, это указывает на то, что он также играет роль в аутоиммунитете. Для изучения регуляции продуцирования IL-32 уровни IL-32 измеряют в клеточных культуральных средах различных клеточных линий, а также человеческих РВС. IL-32 обнаружен в клеточной культуральной среде клеток А 549 после стимуляции с помощью IL-18 или IL-1, но не в контрольной среде(фиг. 1A). Так как ген NK (IL-32) выделяют из NK клеток, активированных с помощью IL-2, человеческую NK клеточную линию стимулируют комбинацией IL-12 плюс IL-18. Как показано на фиг. 10 В, наблюдается заметная индукция IL-32 с помощью IL-12 или IL-18 в NK клетках, и, по-видимому, действие комбинации этих двух цитокинов является аддитивным. Для сравнения, когда эта клеточная линия стимулируется с помощью либо IL-12 или IL-18, наблюдается слабая индукция IFN, или не наблюдается- 21012567 индукции вообще, тогда как продуцирование IFN при использовании комбинации IL-12 плюс IL-18 является в высшей степени синергическим (Kim et ah, J. Biol. Chem, 277: 10998-11003, 2002). Индукцию IL32 (под действием IFN) изучают стимуляцией NK клеток с помощью IL-12 и IL-18 в присутствии нейтрализующего антитела против IFN. Эта комбинация не оказывает действия на индукцию IL-32 (данные не показаны). Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) содержат в основном В-клетки с небольшим количеством моноцитов и В-клеток. Свежеприготовленные РВМС стимулируют с использованием LPS или ConA и супернатанты и лизаты собирают и анализируют концентрациюIL-32. У пациентов старше 60 лет в супернатантах или лизатах РВМС, стимулированных LPS, отсутствуют детектируемые количества IL-32 (данные не показаны). Однако СоnА постоянно индуцирует IL-32,который обнаруживается в супернатантах и лизатах. Как показано на фиг. 10 С, лизаты содержат большеIL-32, чем супернатанты. Пример 5. Идентификация IL- 32- реактивных путей сигнальной трансдукции В данном примере подробно описаны эксперименты, проводимые для оценки действия цитокинаIL-32 на молекулы ингибиторов сигнальной трансдукции каппа В (1 кВ) и р 38 митоген-активированную протеинкиназу (МАРК). Коротко говоря, мышиные RAW 264,7 макрофагальные клетки стимулируют с помощью IL-32 (50 нг/мл) в присутствии 5 мкг/мл полимиксина В (Bedford Lab, Bedford, ОН) указанный период времени (в минутах). Клетки лизируют буфером для лизиса киназ (Han et al., J Biol Chem,277: 47167-47174, 2002). Клеточные материалы разделяют в 10% SDS- PAGE геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем блокируют с помощью 3% BSA. Мембрану гибридизуют с кроличьим антителом против 1 кВ и нормализуют антителом козы против актина (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, CA). Как показано на фиг. 11 А, IL-32 индуцирует расщепление 1 кВ в зависимости от времени, начиная через 15 мин после обработки и достигая максимального уровня через 45 мин, с последующим извлечением через 90 мин. Мембрану также гибридизуют с кроличьим антителом против фосфо- р 38 МАРК и нормализуют кроличьим антителом против р 38 МАРК (Cell Signaling, Beverly, MA). Как показано на фиг. 10 В, фосфор 38 МАРК резко увеличивался через 5 мин после стимуляции с помощью IL-32, а затем уменьшался в течение от 15 до 30 мин. Интересно отметить, что второе повышение фосфорилирования р 38 МАРК наблюдается через 45 мин, затем оно снижается более медленно. Пример 6. Идентификация IL-32-связывающих белков Рекомбинантный IL-32 (или IL-32, IL-325 и IL-32) экспрессируют в Е coli и очищают в трх последовательных стадиях, как описано в примере 2. Около 5 мг очищенного IL-32 иммобилизуют на агарозных гранулах Affi-gel 15 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ha IL-32-аффинную колонку подают различные источники потенциальных рецепторов (например, человеческую сыворотку или лизаты клеток, которые секретируют TNF в ответ на IL-32, таких как клетки Raw 264,7). IL-32 аффинную колонку интенсивно отмывают, а затем рецептор IL-32 элюируют буфером для элюции (например, 50 мМ лимонной кислоты, 100 мМ NaCl, pH 2,5). Элюированные фракции сразу же нейтрализуют 2 М трис основанием. Белки, связывающиеся с IL-32, выделенные таким образом, далее характеризуют химическим анализом (например, анализом пептидной последовательности расщеплением по Эдману и/или массспектроскопией) и биоанализом (например, очищенный или рекомбинантный рецептор тестируют на их способность блокировать EL-32-индуцированную секрецию TNF клетками Raw 264,7). Предполагают,что аутентичные связывающие IL-32 белки способны ингибировать биологические активности IL-32(аналогично тому, что наблюдается с TNFBP). Также предполагают, что другие типы аутентичных связывающих IL-32 белков способны повышать биологические активности IL-32 (аналогично тому, что наблюдается IL-6 лигандсвязывающей цепью). Пример 7. Терапевтическое действие IL-32-антител и IL-32-ингибиторов на мышиных моделях артрита В данном примере подробно описаны эксперименты, проводимые для оценки действия IL-32 антител и антагонистов IL-32 (например, растворимых рецепторов IL-32, доминант- негативных вариантов IL-32, малых молекул ингибиторов и т.д.) в качестве терапевтических веществ для лечения коллагениндуцированного артрита (CLA) у мышей. Коротко говоря, CIA вызывают у 8-1-недельных мышейDBA/1J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) интрадермальной (внутрикожной) инъекцией типа II бычьего коллагена (CII), известного в уровне техники (Banda et al., Arthritis Rheum, 46: 3065, 2002). Каждой мыши вводят инъекции 100 мкл, содержащие 200 мкг CII и 200 мкг инактивированных Mycobacterium tuberculosis (Difco, Detroit, MI) в неполном адъюванте Фрейнда в дни 0 и 21. Между днм 21 и днм 42 мышам дают одно из трх лекарств в виде и.п. (интраперитонеальных) инъекций каждые три дня: 2 мг/мышь обычного кроличьего IgG; 2 мг/мышь нейтрализующего кроличьего антитела против IL-32, полученного с применением HiTrap Protein G HP (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden); и 2 мг/мышь рекомбинантного IL-32 антагониста (например, гибридизованного белка рецептор IL-32-IgG1Fc или доминант- негативного варианта IL-32). Мышей (5 в каждой группе и 5 необработанных мышей) умерщвляют на день 42 цервикальной дислокацией под анестезией. Активность клинического заболевания CIA оценивают каждый день между 21-42 днями слепым ме- 22012567 тодом по "трхточечной" шкале для каждой лапы; 0 = нормальный сустав; 1 = слабое воспаление и краснота; 2 = тяжлая форма эритемы и опухание всей лапы, не дающее возможности ею пользоваться; и 3= деформированная лапа или сустав, с анкилозом, ригидностью сустава и утратой функции. При общей оценке активности клинического заболевания учитывают все четыре лапы, максимальная оценка для каждого животного 12. После умерщвления обе передние и правую заднюю лапы удаляют хирургическим путм на день 42, фиксируют в 10% забуференном формалине, готовя тканевые препараты, и проводят гистологический анализ, известный в уровне техники (Bendele et al., Arthritis Rheum, 43: 2648, 2000). Опытный исследователь (несмотря на обработку) оценит гистологические показания в лапах, коленях и лодыжках. Данные выражают в виде средних оценок воспаления, паннуса, поражения хрящей и поражения костей, а также в общей оценке в баллах от 0 до 5. Используя опубликованные методы (Banda et al, JImmunol, 170: 2100-2105, 2003), определяют различные иммунные характеристики, включая, но без ограничения: CII-специфическую пролиферацию клетками селезнки и лимфатических узлов, продуцирование антител против коллагена, CIIиндуцированную секрецию цитокинов клетками селезнки (например, используя ELISA TNF, IFN, IL1, IL-1Ra и IL-10), и стационарные уровни мРНК цитокинов в суставах (например, TNF, IFN, IL-1,IL-1Ra, IL-6, IL-18, MIF, TNF, LTp, TGF1, TGF2). Некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения содержат антитело против IL-32 (IL-32 антитело) или IL-32 антагонист, которые снижают оценки в баллах активности клинического заболевания и гистологические оценки поражения суставов по меньшей мере на 50% (более предпочтительно по меньшей мере на 75% и, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90%). Другие предпочтительные варианты изобретения содержат IL-32 антитело илиIL-32 антагонист, которые снижают СП-индуцированную пролиферацию лимфоцитов и/или сывороточные уровни связывающих коллаген антител против IgG по меньшей мере на 50% (более предпочтительно по меньшей мере на 75% и, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90%). Особенно предпочтительные варианты изобретения содержат IL-32 антитело или IL-32 антагонист, которые снижают и стационарные уровни мРНК TNF, IFN и/или IL-1 в изолированных суставах по меньшей мере на 50%(более предпочтительно по меньшей мере на 75% и, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90%). Важно, что предпочтительные варианты изобретения, включающие IL-32 антитела или IL-32 антагонисты по данному описанию, как полагают, найдут применение в лечении людей, больных ревматоидным артритом, с применением методов, аналогичных методам, применяемым для введения TNFреактивных антител (инфликсимаб/REMICADE и адалимумаб/HUMIRA) и гибридных белков рецептор растворимого TNF/иммуноглобулин (этанерцепт/ENBREL). Пример 8. Биологическая активность рекомбинантного IL-32IL-32 индуцирует значительные количества TNF и MIP-2 и повышает продуцирование обоих цитокинов в зависимости от дозы (доза-эффект), как показано на фиг. 6. Затем биологическую активностьIL-32 сравнивают с биологической активностью IL-32, имеющим полный С-конец. IL-32 индуцирует уровни TNF и МЕР-2 аналогично IL-32 в мышиной макрофагальной клеточной линии Raw (фиг. 6 В). Хотя все эксперименты проводят в присутствии полимиксина В (5 мкг/мл), нельзя исключить возможность загрязнения (примеси) эндотоксином рекомбинантных белков, продуцированных в Е coli. Рекомбинантный IL-32 также продуцируют в системе млекопитающего для того, чтобы избежать примеси эндотоксина. rIL-32 продуцируют при использовании трх различных источников клеток млекопитающих, устойчивого клона Anjou65, устойчивого клона Cos7 (Cos7-S) и транзиторного трансфектанта Cos7 (Cos7-7). Транзиторно и устойчиво клонированные клетки культивируют в 0,5% FCS в течение 4 дней, затем собирают. Так как максимальный выход rIL-32 млекопитающего составляет только 1 нг/мл, а концентрация IL-32 ниже 100 пг/мл, каждый не содержащий эндотоксин rIL-32 очищают на аффинной колонке, приготовленной иммобилизацией анти-IL-32 mAb на агарозных гранулах (Affi-GelHz, Bio-Rad) в присутствии азида натрия (0.2%) для предупреждения загрязнения микроорганизмами в процессе очистки. Очищенный rIL-32 подвергают диализу против RPMI, содержащей пенициллин/стрептомицин (10 мкг/мл), в течение ночи при 4 С, а затем используют в биоанализе. Все три препарата rIL-32 млекопитающих индуцируют TNF в человеческих РМА- дифференцированных ТНР-1 клетках и мышиных клетках Raw, соответственно (фиг. 6). rIL-32 Е coli и rIL-32 млекопитающих повышают продуцирование TNF продукта в РМА-дифференцированных ТНР-1 клетках в зависимости от дозы (фиг. 6). Кроме того, препараты, содержащие высокую дозу (high unit) rIL-32 Е coli и rIL-32 млекопитающих клона Anjou65, индуцируют человеческий IL-8 в недифференцированных- ТНР-1 клетках,тогда как суррогатные (мнимые) Anjou65 трансфектанты не индуцируют их (фиг. 6 Е). Пример 9. Продуцирование нейтрализующего Fab фрагмента моноклонального антитела против IL-32 Пятимесячную самку мыши Balb/c иммунизируют с помощью 20 мкг антигена rIL-32, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (Sigma). В дни 14 и 21 мыши внутривенно и интраперитонеально инъецируют антиген, эмульгированный в полном адъюванте Фрейнда (Sigma). После трх инъекций мышь умерщвляют, селезнку асептически удаляют и спленоциты готовят для слияния. Коротко говоря,1107 спленоцитов и 1106 NS-1 клеток мышиной миеломы (АТСС) сливают при использовании эти- 23012567 ленгликоля (Roche Applied Science. Indianapolis, IN). Слитые клетки ресуспендируют при плотности 1106 клеток/мл в средах для роста гибридом с 10% FCS и HAT, и засевают в 96-луночные планшеты. Через 2 недели культуральные супернатанты гибридом титруют непрямым методом ELISA. Классы и подклассы моноклональных антител определяют, используя набор для изотипирования мышиных моноклональных антител IMMUNO- TYPE (BD Bioscience, San Diego, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Около 1106 клеток двух гибридом 32-4 (IgG1) и 32-9 (IgG1) инъецируют интраперитонеально 8 недельной самке мыши Balb/c. Через неделю асцитную жидкость отбирают стерильной гиподермической иглой. Антитела из супернатантов асцитной жидкости очищают на колонке с протеином А сефарозой(Bio- Rad) и элюируют 0.1 М глицином-HCl, рН 2,7. Элюированные mAb диализуют против PBS и очищенные антитела концентрируют в центрифужных патронах для ультрафильтрации (YM-50, Life Sciences, Ann Arbor, MI). Концентрацию очищенного антитела определяют, измеряя оптическую плотность при 280 нм. Так как аффинно очищенное моноклональное антитело (32-4) против rIL-32 индуцирует высокий фоновый уровень mTNF, получают Fab фрагмент этого моноклонального антитела (mAb). Коротко говоря, фрагменты Fab очищенного анти- IL-32 mAb (32-4) получают инкубацией с иммобилизированным пепсином (PIERCE, Rockford, IL) при 37 С в течение 4 ч. Фрагменты Fc и остаточные нерасщеплнныеmAbs удаляют, используя протеин G сефарозу (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). Фрагмент Fab диализуют против PBS в течение ночи при 4 С и подвергают SDS-РАСЕ для подтверждения полноты расщепления. Фоновый уровень резко уменьшается после удаления Fc фрагмента, что позволяет оценивать активность нейтрализации IL-32 антителом mAb против rIL-32. Как показано на фиг. 7 А, Fab антитела mAb 32-4 (50 нг/мл) ингибирует биологическую активность Е. coli rIL -32 более чем на 70%. Как показано на фиг. 7 В, тот же самый Fab ингибирует биологическую активность аффинно очищенногоCos7-S rIL-32 более чем на 65%. Более высокие концентрации фрагмента Fab в этих анализах не ингибируют дополнительно продуцирование TNF, индуцированное с помощью IL-32. Пример 10. Терапевтическое действие антител против IL-32 и ингибиторов IL-32 на мышиной модели воспалительного заболевания кишечника В данном примере приводится подробное описание экспериментов, проводимых для оценки действия антител против IL-32 и антагонистов IL-32 (например, растворимых рецепторов IL-32, доминантнегативных IL-32 вариантов, ингибиторов- малых молекул и т.д.) как терапевтических средств для лечения колита у мышей, вызванного действием декстрана сульфата натрия (DSS). Коротко говоря, колит вызывают у 8-10-недельных самок мышей C57BL/6 mice (Taconic Laboratories), вводя 2% (вес/объм) декстрана натрия сульфата (DSS, MW 40000 от ICN Biochemicals) с дня 0 до дня 7 в питьевой воде неограниченно (ad libitum), а затем возврвщаются к обычной, известной в уровне техники (Sivakumar et al., Gut, 50: 812-820, 2002). Мышей взвешивают каждый день, начиная с дня 0, и изменения в весе регистрируют вплоть до дня 13. Изменение веса каждой мыши в процентах вычисляют следующим образом: изменение веса в процентах = (вес в конкретный день - вес в день) /вес в день 0100. Группы мышей обрабатывают: контрольным белком (50 мкг или 500 мкг); мышиным анти-IL-32mAb (50 мкг или 500 мкг); и рекомбинантным IL-32 антагонистом (например, гибридным белком IL-32 рецептор- IgG1 Fc или доминант-негативным IL-32 вариантом при 50 мкг или 500 мкг), каждый в объме 200 мкл на инъекцию (не содержащий эндотоксин PBS). Мышам инъецируют и.п. с дня 0 до дня 7. Мышей умерщвляют в дни 0, 2, 4, 6 или 8 после начала обработки DSS, анестезией и цервикальной дислокацией и ткани (например, толстую кишку, лимфатические узлы) извлекают и готовят для экстракции РНК,гистопатологии и анализа цитокинов методами, известными в уровне техники. Ожидают, что введение антагонистов IL-32 применимо для уменьшения воспаления при DSS-индуцированном колите у мышей и что нейтрализация IL-32 активности способствует уменьшению воспаления, обусловленного кишечными заболеваниями. Пример 11. Терапевтическое действие антител против IL-32 и ингибиторов IL-32 на мышиной модели гепатита В данном примере подробно описаны эксперименты, проводимые для оценки действия антител против IL-32 и антагонистов EL-32 (например, растворимых рецепторов IL-32, доминант- негативных IL32 вариантов, ингибиторов- малых молекул и т.д.) как терапевтических средств для лечения поражения печени, вызванного LPS у мышей, примированных убитыми нагреванием Propioibacterium acnes (модель заболевания печени, опосредуемого Fas/FasL). Коротко говоря, гепатит у 8-10-недельных самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories) вызывают, вводя мышам 500 мкг/мышь IV убитых нагреванием P. acnes (Ribi Immuno- Chem Research), и через 12 дней им вводят 50 мкг/кг LPS IV, известного в уровне техники (Faggioni el al., J Immunol, 167: 5913-5920, 2001). Группы мышей обрабатывают: контрольным белком (50 мкг или 500 мкг); мышиным анти- IL-32 mAb (50 мкг или 500 мкг); и рекомбинантным IL-32 антагонистом (например, гибридным белком IL-32 рецептор- IgG1 Fc или доминант-негативным IL-32 вариантом при 50 мкг или 500 мкг),каждый в объме 200 мкл на инъекцию (не содержащий эндотоксин PBS). Мышей инъецируют и.п. либо- 24012567 во время введения P. acnes, либо за 10 до заражения LPS. Проводят мониторинг мышей на выживаемость или умерщвляют, чтобы вырезать печень для гистологического исследования, измерения мРНК и хемокинов, и собирают кровь для определения сывороточного IFN- и трансаминазы методами, известными в уровне техники. Полагают, что IL-32 антагонисты применимы для предупреждения LPSиндуцированного поражения печени и экспрессии IFN-и Fas лиганда при введении за 10 мин до LPS заражения pf примированных P.acnes мышей. Кроме того, полагают, что введение антагонистов IL-32 применимо для уменьшения вызванного P. acnes образования гранулмы, продуцирования макрофагально-воспалительного белка-1 и макрофагально-воспалительного белка-2, если их вводят в момент примирования с помощью P. acnes. Таким образом, полагают, что для пациентов с заболеваниями печени,такими как вызванный HCV гепатит, аутоиммунный гепатит и первичный цирроз печени, будет благотворной схема лечения, включающая антагонист IL-32. Пример 12. Терапевтическое действие антител против IL-32 и ингибиторов IL-32 на мышиной модели ишемической болезни В данном примере подробно описаны эксперименты, проводимые для оценки действия антител против IL-32 и антагонистов IL-32 (например, растворимых рецепторов IL-32, доминант-негативных IL32 вариантов, ингибиторов-малых молекул и т.д.) как терапевтических средств для стимуляции неоваскуляризации тканей в ответ на ишемическое поражение. Коротко говоря, самцов мышей C57BL/6J подвергают хирургической операции для того, чтобы вызвать одностороннюю ишемию задней лапы методами, известными в уровне техники (Mallat et al., CircRes, 91: 441-448, 2002). Лигатуру накладывают на бедренную артерию, 0,5 см проксимально к бифуркации сафенной и подколенной артерий, а затем помещают в обычные условия на 3-28 дней. Группы мышей обрабатывают контрольным белком (50 мкг или 500 мкг); мышиным анти- IL-32 mAb (50 мкг или 500 мкг); и рекомбинантным IL-32 антагонистом (например, гибридным белком IL-32 рецептор- IgG1 Fc или доминант- негативным IL-32 вариантом в дозе 50 мкг или 500 мкг), каждый в объме 200 мкл на инъекцию (не содержащий эндотоксин PBS). Мышей инъецируют и.п. в день 0 и день 7. Степень ангиогенеза количественно определяют в дни 3 и 10, измеряя плотность сосудов микроангиографией, а вызванные ишемией изменения васкуляризации мониторируют визуализацией перфузии с помощью лазерного Допплер- анализатора. Считают, что введение антагонистов IL-32 применимо для стимуляции неоваскуляризации тканей в ответ на ишемическое поражение. Все публикации и патенты, указанные в вышеприведнном описании, вводятся в это описание в качестве ссылки. Различные модификации и варианты описанного способа и системы по данному изобретению, в объме настоящего изобретения и соответствующие сущности настоящего изобретения, будут очевидны для специалистов в данной области техники. Хотя изобретение описано на конкретных предпочтительных вариантах, следует понимать, что заявляемое изобретение неправильно ограничивать этими конкретными вариантами изобретения. На самом деле, предполагается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, очевидные для специалистов в области молекулярной биологии, генетике, иммунологии и родственных областях, входят в объм формулы изобретения.