Химерный белок растворимого рецептора интерлейкина-6/лиганда, его аналоги и способы применения

1 Область техники Настоящее изобретение относится к области биологической активности интерлейкина-6(IL-6), которая зависит от агонистического действия растворимого рецептора IL-6 (sIL-6R). В частности, настоящее изобретение относится к новым химерным белкам sIL-6R/IL-6, сконструированным путем слияния природных формsIL-6R и IL-6, и их биологически активным аналогам, которые позволяют эффективно лечить рак путем подавления роста раковых клеток,улучшают приживаемость трансплантата костного мозга, являются полезными для лечения болезней печени и других нарушений, обусловленных IL-6. Предпосылки изобретения и прототип Интерлейкин-6 (IL-6) является хорошо известным цитокином, биологическая активность которого опосредована системой мембранных рецепторов, включающей два разных белка,один из которых определяется как рецептор IL-6(sIL-6R), соответствующие внеклеточному домену gp80, являются естественными продуктами организма человека, обнаруженными в виде гликопротеинов в крови и моче (Novick et al.,1990, 1992). Отличительная особенность молекул sIL-6R состоит в том, что они являются сильнодействующими агонистами IL-6 во многих типах клеток, включая клетки человека(Taga et al., 1989; Novick et al., 1992). Это связано с тем, что даже без интрацитоплазматического домена gp80 sIL-6R способен стимулировать димеризацию gp130 под воздействиемal., 1993). Комплекс активных рецепторов IL-6 фактически представляет собой шестичленную структуру, образованную двумя цепями gp130,двумя IL-6R и двумя лигандами IL-6 (Ward etal., 1994; Paonessa et al., 1995), в которой sIL-6R характеризуется двумя типами взаимодействия с gp130, оба из которых имеют важное значение(Halimi et al., 1995). Обработка sIL-6R приводит к усилению биологической активности IL-6 во многих типах клеток. Примером являются опухолевые клетки,рост которых подавляется IL-6 в гораздо большей степени при добавлении sIL-6R; такими клетками, в частности, являются миелолейкозные клетки Ml мышей (Taga et al., 1989), клеткиT47D карциномы молочной железы человека(Novick. et al., 1992) или немелкие клетки карциномы легкого человека (Ganapathi et al.,1996). IL-6 оказывает антиметастатическое действие in vivo (Katz et al., 1995), sIL-6R также может усиливать in vivo противоопухолевое действие IL-6 (Mackiewicz et al., 1995). Другим действием IL-6, которое усиливается добавле 004793 2 нием sIL-6R, является стимуляция кроветворных стволовых клеток с целью продуцирования смешанных колоний (Sui et al., 1995). Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что жизнеспособность первичных культур олигодендроцитов мозга поддерживается только комбинацией sIL-6R и IL-6 (Oh, 1997), в то время как IL-6 в отдельности проявляет слабую активность в таких культурах (Kahn and De Vellis, 1994). Это открытие показывает, что IL-6 в сочетании с sIL-6R может имитировать активность других нейротропических цитокинов, таких как ресничный нейротропический фактор(CNTF) или фактор подавления лейкоза (LIF),который также действует через gр 130, как это имеет место для IL-11 и онкостатина М (Hiranoet al., 1994). Была предпринята попытка получить молекулу, которая могла бы сочетать вышеуказанные функции IL-6 и sIL-6R, в результате которой было объявлено о продуцировании в рекомбинантных дрожжевых клетках слитого белка из усеченного сегмента последовательности IL-6R человека и IL-6, связанных линкером с высоким содержанием глицина (Fischer et al., 1997). Этот слитый белок включает, по существу, только Nдомен рецептора цитокина IL-6R и С-домен рецептора цитокина; таким образом в нем практически полностью отсутствует иммуноглобулиноподобный (Ig) домен IL-6R и предмембранная область рецептора (область между С-доменом и трансмембранным доменом). В таком виде указанный белок представляет собой усеченную форму sIL-6R, причем усеченный sIL-6R в слитом белке связан вышеуказанным линкером с высоким содержанием глицина практически со всей зрелой формой IL-6. Помимо отсутствия некоторых частей природного sIL-6R этот слитый белок, поскольку он получен в дрожжевых клетках, не имеет структуры гликозилирования,которая должна была бы быть у такого слитого белка, если бы он был получен в клетках млекопитающего, например в клетках человека. Фактически этот продуцированный в дрожжах слитый белок имеет молекулярную массу, равную примерно 57 кДа, в отличие от слитого продукта, содержащего практически все аминокислотные остатки природного sIL-6R и IL-6 и полностью гликозилированного в клетках млекопитающих (например, человека), который должен иметь предполагаемую молекулярную массу около 85 кДа (см. приведенный ниже пример 2). Общепринятая практика конструирования рекомбинантных белков, которые можно использовать для лечения людей, показывает, что такие белки должны как можно ближе соответствовать природным формам белков, обнаруженным в организме человека, во избежание стимуляции антител и других побочных эффектов, характерных для искусственных рекомбинантных продуктов. По этой причине для получения гликозилированных белков желательно 3 использовать рекомбинантные системы клеток млекопитающих, такие как интерферон- или колониестимулирующий фактор гранулоцитов(Chernajovsky et al., 1984, Holloway, 1994), в химической форме, которая в наибольшей степени схожа с естественным продуктом человека. Бактерии или микроорганизмы, например такие,как дрожжи, которые не гликозилируются должным образом, вызывают также неправильную укладку цепей белка, что ведет к возникновению иммуногенных реакций. Это особенно важно для IL-6, который существенно модифицирован посттрансляционно N- и О-гликозилированием, а также фосфорилированием (обзорRevel, 1989), и для природного sIL-6R из крови и мочи человека, являющего гликопротеином, в котором N- и С-концевые аминокислоты являются постоянными и их значения установлены(Novick et al., 1990 и принадлежащий обоим авторам патент США 5216128 и соответствующий европейский патентЕР 413908 В 1). Из вышеизложенного следует, что указанный продукт слияния части sIL-6R и IL-6 должен иметь целый ряд недостатков, в частности,с точки зрения применения для лечения человека из-за отсутствия у него части sIL-6R и продуцирования в дрожжах, что может стать причиной неправильного гликозилирования белка. До сих пор не была описана слитая молекула, которая содержит природный sIL-6R, обнаруженный в жидкостях организма человека, и природный IL-6 и которая получена в клетках человека или других млекопитающих. Поэтому целью настоящего изобретения является получение такой слитой молекулы,содержащей природные sIL-6R и IL-6 (в любом порядке), которая продуцирована в клетках млекопитающих. Еще одной целью настоящего изобретения является применение такого слитого белка (химера sIL-6R/IL-6) для подавления роста сильно метастатических меланомных клеток в очень низких концентрациях, так как эти клетки устойчивы к воздействию в отдельности IL-6 илиsIL-6R. Еще одной целью этого изобретения является применение такого слитого белка (химераsIL-6R/IL-6) для улучшения приживаемости invivo кроветворных стволовых клеток при трансплантации костного мозга. Еще одной целью настоящего изобретения является применение такого слитого белка для лечения других нарушений, обусловленных IL6, например болезней печени или неврологических нарушений. Еще одной целью данного изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие вышеуказанный слитый белок природных sIL-6R-IL-6 (химера sIL-6R/IL-6), для лечения рака, для применения при трансплантации костного мозга и для лечения других наруше 004793 4 ний, обусловленных IL-6, например болезней печени и неврологических нарушений. Другие цели и объекты настоящего изобретения будут рассмотрены ниже или станут очевидными из дальнейшего описания настоящего изобретения. Краткое изложение изобретения В соответствии с настоящим изобретением получено несколько слитых белков (химер),содержащих практически все природные sIL-6R из жидкостей организма человека и практически все зрелые формы природного IL-6 человека,которые соединены короткими линкерными пептидами длиной около 3 аминокислотных остатков или больше, например 13 аминокислотных остатков (см. ниже и примеры 1 и 2). Однако необходимо отметить, что в этих слитых белках линкерные пептиды могут отсутствовать и часть sIL-6R может быть присоединена непосредственно к части IL-6. Так как линкеры,представляющие собой искусственные аминокислотные последовательности, могут быть иммуногенными эпитопами, вызывающими образование антител у нуждающихся субъектов, желательно иметь непосредственно слитую химеруsIL-6R/IL-6, которая обладает требуемой биологической активностью и в то же время максимально уменьшает вероятность индуцирования таких потенциально вредных антител при введении такой химеры. Сохранение всей последовательности sIL6R, включая Ig-подобный домен, обнаруженный в природной молекуле, а также необходимое гликозилирование и другие посттрансляционные модификации, вносимые клетками человека или млекопитающего при продуцировании вышеуказанной химеры в таких клетках, также имеет важное значение для уменьшения потенциальной иммуногенности химерного белкового продукта. Однако можно использовать очень короткий линкер длиной около трех аминокислот в точке соединения частей sIL-6R и IL-6 химерного белка. Такой короткий линкер не должен быть иммуногенным эпитопом. Кроме того,можно использовать более длинные линкеры длиной примерно до 30 аминокислот с целью разделения двух частей, но в этом случае необходимо соблюдать осторожность и произвести экспериментальные исследования биологической эффективности и безопасности полученного продукта для гарантии того, что химерные молекулы с такими линкерами не являются иммуногенными. В действительности при осуществлении настоящего изобретения было установлено, что более длинные линкеры не имеют большого значения для активности химерного белка; это свидетельствует о том, что для правильной укладки химеры не требуется более длинный линкер, особенно тогда, когда практически все природные последовательности частей sIL-6R и IL 5 6 входят в химерную молекулу (см. пример 3 и фиг. 5, которые относятся также к сравнению химеры sIL-6R/IL-6 с очень коротким (3 аминокислоты) линкером и аналогичной химеры с более длинным линкером из 30 аминокислот). Эти слитые белки или химеры sIL-6R/IL-6 эффективно продуцированы в соответствии с настоящим изобретением в экспрессирующих системах клеток млекопитающих, что позволило получить гликозилированные продукты, оказывающие сильное действие на опухолевые клетки, которые обычно не реагируют в отдельности на IL-6 или sIL-6R, и улучшающие приживаемость трансплантированных клеток костного мозга человека (см. ниже и примеры 1-4). В таких трансплантатах костного мозга химерыsIL-6R/IL-6 имеют важное значение для выживания и пролиферации трансплантированных некоммитированных полипотентных кроветворных стволовых клеток. Кроме того, из приведенных ниже результатов экспериментов и других анализов следует, что можно получить различные аналоги химерного белка sIL-6R/IL-6 по данному изобретению, которые обладают практически такой же биологической активностью, что и химера sIL-6R/IL-6, причем указанные аналоги являются химерами sIL-6R/IL-6, в которых один или несколько аминокислотных остатков, удалены, добавлены или заменены другими, и единственным ограничением таких аналогов является то, что они должны сохранять большую часть природной последовательностиsIL-6R и IL-6. Например, аминокислотные добавления в природные последовательности sIL6R и IL-6 ограничены примерно 20 аминокислотами, и эти добавления желательно произвести на участке соединения между sIL-6R и IL-6, т.е. в молекуле линкера. Аналогичным образом из последовательностей sIL-6R и IL-6 можно удалить не более 20-30 аминокислот. Замены аминокислотных остатков в последовательностяхsIL-6R и IL-6 другими аминокислотными остатками предпочтительно также ограничиваются примерно 20-30 аминокислотами. Все вышеуказанные делеции, добавления и замены являются приемлемыми в соответствии с настоящим изобретением только тогда, когда при экспрессии в клетках млекопитающих модифицированные таким образом аналоги сохраняют биологическую активность химеры sIL-6R/IL-6, состоящей в основном из природных последовательностей,и такую же структуру гликозилирования этой химеры. Таким образом, настоящее изобретение относится к химерному гликозилированному белку растворимого рецептора интерлейкина-6(sIL-6R)-интерлейкина-6 (IL-6)(sIL-6R/IL-6) и к его биологически активным аналогам, которые включают слитый белковый продукт, полученный путем слияния практически всей природной формы sIL-6R и практически всей природной формы IL-6, причем указанный sIL-6R/IL-6 6 и его аналоги гликозилированы аналогично гликозилированию природных sIL-6R и IL-6. Вышеуказанный химерный белок по данному изобретению имеет следующие варианты:(i) химерный белок sIL-6R/IL-6 и его биологически активные аналоги, в которых указанный sIL-6R слит с IL-6 при помощи молекулы пептидного линкера;(ii) химерный белок sIL-6R/IL-6 и его биологически активные аналоги по пункту (i), в которых указанный линкер является очень коротким неиммуногенным линкером длиной около 3-4 аминокислотных остатков;(iii) химерный белок sIL-6R/IL-6 и его биологически активные аналоги по пункту (ii), в которых указанный линкер является трипептидом последовательности E-F-M (Glu-Phe-Met);(iv) химерный белок sIL-6R/IL-6 и его биологически активные аналоги по пункту (i), в которых указанный линкер является пептидом,состоящим из 13 аминокислотных остатков последовательности E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-P-M(v) химерный белок sIL-6R/IL-6, определяемый как sIL-6RVal/IL-6, с трипептидным линкером последовательности E-F-M между Сконцевым остатком Val-356 sIL-6R и Nконцевым остатком Pro-29 IL-6, причем указанный химерный белок имеет последовательность,показанную на фиг. 3;(vi) химерный белок sIL-6R/IL-6, определяемый как sIL-6RVal/L/IL-6, состоящий из 13 аминокислот пептидный линкер последовательности E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M между Сконцевым остатком Val-356 sIL-6R и Nконцевым остатком Pro-29 IL-6R, причем указанный химерный белок имеет последовательность, показанную на фиг. 3, где трипептид последовательности E-F-M в положениях 357-359 на фиг. 3 заменен указанной пептидной последовательностью, состоящей из 13 аминокислот;(vii) химерный белок sIL-6R/IL-6, где указанный белок продуцирован в клетках млекопитающих в полностью процессированной форме;(viii) химерный белок sIL-6R/IL-6, где указанный белок продуцирован в клетках человека;(ix) химерный белок sIL-6R/IL-6, где указанный белок продуцирован в клетках яичника китайского хомячка (СНО);(х) химерный белок sIL-6R/IL-6 и его биологически активные аналоги, где указанный химерный белок и аналоги способны подавлять рост высокозлокачественных раковых клеток;(xi) химерный белок sIL-6R/IL-6 и его биологически активные аналоги, где указанный химерный белок и аналоги способны подавлять рост злокачественных меланомных клеток;(xii) химерный белок sIL-6R/IL-6 и его биологически активные аналоги, где указанный химерный белок и аналоги способны стимули 7 ровать in vivo приживаемость кроветворных клеток человека при трансплантации костного мозга;(xiii) химерный белок sIL-6R/IL-6 и его биологически активные аналоги, где указанный химерный белок и аналоги способны защитить печень от гепатотоксических веществ. Настоящее изобретение относится также к последовательности ДНК, кодирующей химерный белок sIL-6R/IL-6 и его биологически активные аналоги по данному изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору ДНК, включающему последовательность ДНК, кодирующую химерный белокsIL-6R/IL-6 и его биологически активные аналоги по этому изобретению, причем указанный вектор пригоден для экспрессии указанного химерного белка в клетках млекопитающих. Вектор ДНК по этому изобретению включает следующие варианты:(i). Вектор ДНК, который пригоден для экспрессии указанного химерного белка в клетках человека.(ii). Вектор ДНК, где указанный вектор экспрессирован в клетках млекопитающих или человека, экспрессированный химерный белок имеет последовательность, позволяющую полностью процессировать химерный белок клеткой млекопитающего или человека и секретироватъ полностью процессированный химерный белок из клеток в культуральную среду, где выращиваются указанные клетки.(iii). Вышеуказанный вектор ДНК, где указанный вектор определяется как плазмидаpcDNA3, содержащий последовательность ДНК,кодирующую химерный белок sIL-6R/IL-6 под контролем промотора цитомегаловируса (CMV).(iv). Вышеуказанный вектор ДНК, где указанный вектор определяется как плазмидаpcDNA3, содержащий последовательность ДНК,кодирующую химерный белок sIL-6R/IL-6 под контролем промотора цитомегаловируса (CMV),и в котором в указанную последовательность ДНК, кодирующую указанный химерный белокsIL-6R/IL-6, вставлена линкерная последовательность, кодирующая линкерный пептид в сайте EcoRI, расположенном между последовательностью, кодирующей часть sIL-6R, и последовательностью, кодирующей часть IL-6 белка. Аналогичным образом настоящее изобретение относится также к трансформированным клеткам млекопитающих, содержащим вышеуказанный вектор ДНК, который способен экспрессировать последовательность химерного белка sIL-6R/IL-6, переносимую указанным вектором, полностью процессировать экспрессированный белок и секретировать его в культуральную среду, где выращиваются указанные клетки. 8 Одним вариантом этих трансформированных клеток являются описанные здесь клетки почки эмбриона человека 293 (НЕК 293), трансфецированные вектором pcDNA sIL-6R/IL-6,указанные клетки способны экспрессировать химерный белок sIL-6R/IL-6, полностью процессировать и секретировать указанный белок в культуральную среду, где выращиваются указанные клетки, в форме гликопротеина с молекулярной массой около 85 кДа. Другим вариантом трансформированных клеток являются описанные здесь клетки СНО(яичника китайского хомячка), трансфецированные вектором pcDNA sIL-6R/IL-6, указанные клетки способны экспрессировать химерный белок sIL-6R/IL-6, полностью процессировать и секретировать указанный белок в культуральную среду, где выращиваются указанные клетки, в форме гликопротеина с молекулярной массой около 85 кДа. Настоящее изобретение относится также к способу получения химерного белка или его биологически активных аналогов, который включает выращивание вышеуказанных трансформированных клеток в условиях, приемлемых для экспрессии, процессирования и секреции указанного белка или его аналогов в культуральную среду, где выращиваются указанные клетки; и очистку указанного белка или его аналогов от культуральной среды иммуноаффинной хроматографией с использованием моноклональных антител, специфичных в отношенииsIL-6R. Химерный белок по настоящему изобретению имеет ряд применений, которые включают(i) применение химерного белка sIL-6R/IL6 или его аналогов, солей и смесей в качестве ингибиторов раковых клеток;(ii) применение аналогично пункту (i) в качестве ингибитора высоко злокачественных меланомных клеток;(iii) применение химерного белка sIL6R/IL-6 или его аналогов, солей и смесей в качестве активного ингредиента для улучшения приживаемости кроветворных клеток человека при трансплантации костного мозга;(iv) применение химерного белка sIL6R/IL-6 или его аналогов, солей и смесей в качестве активного ингредиента для усиления гемопоэза, лечения болезней печени и неврологических нарушений и для других целей, связанных с использованием IL-6 или sIL-6R. Химерный белок по настоящему изобретению можно аналогичным образом применять для получения лекарственных средств для ряда медицинских показаний, в частности химерный белок sIL-6R/IL-6 или его аналоги, соли и смеси можно применять для получения лекарственных средств, предназначенных для лечения разных видов рака путем подавления роста раковых клеток, или для получения лекарственного средства для стимуляции приживаемости крове 9 творных клеток при трансплантации костного мозга, или для получения лекарственного средства для усиления гемопоэза, или для получения лекарственного средства для лечения неврологических нарушений, или для получения лекарственного средства для других целей, связанных с применением IL-6 или sIL-6R. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента химерный белок sIL-6R/IL-6 или его аналог и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Фармацевтическая композиция по этому изобретению включает следующие варианты:(i) фармацевтическая композиция для лечения разных видов рака млекопитающих;(ii) фармацевтическая композиция для улучшения приживаемости клеток при трансплантации костного мозга;(iii) фармацевтическая композиция для лечения болезней печени и неврологических нарушений или для усиления гемопоэза, или для других целей, связанных с использованием IL-6 или sIL-6R. Настоящее изобретение относится также к способу лечения разных видов рака у млекопитающих, или для улучшения приживаемости клеток при трансплантации костного мозга, или для лечения болезней печени и неврологических нарушений, или для усиления гемопоэза, или для других целей, связанных применением IL-6 или sIL-6R, который заключается в том, что пациенту вводят вышеуказанную фармацевтическую композицию в виде приемлемой лекарственной формы и в соответствии с приемлемым способом введения. Во избежание неясности следует отметить,что настоящее изобретение относится к химере между IL-6 и sIL-6R, расположенным в любом порядке, т.е. N-концевую и С-концевую части можно поменять местами, и тогда химера будет представлять собой белок IL-6-sIL-6R, хотя в этом описании изобретения он определяется как белок sIL-6R/IL-6. Другие цели и варианты осуществления настоящего изобретения рассмотрены ниже или являются очевидными из нижеследующего подробного описания этого изобретения. Краткое описание чертежей На фиг. 1 (А, В) дано схематическое изображение разных векторов, реагентов и стадий процесса, используемых для конструирования химерной молекулы ДНК, кодирующей химерный белок, в котором сохранена структура природной формы sIL-6R, заканчивающейся у остатка Val 356, и следующей за ней последовательности природной, зрелой, процессированной формы IL-6, как это подробно описано в примере 1. На фиг. 2 (А, В) показаны результаты анализа по идентификации химеры sIL-6RVal/IL-6(А) и на основании профиля биологической активности (В), при этом на фиг. 2 А дано изображение геля, окрашенного кумасси, на котором электрофорезом выявлены фракции, очищенные иммуносорбционным методом и элюированные из колонок для аффинной хроматографии, заполненных образцом секретированного белка,полученного из культур клеток, трансфецированных вектором, кодирующим химерный белок; и на фиг. 2 В приведен репрезентативный график биологической активности (подавление роста меланомных клеток F10.9) всех вышеуказанных фракций, элюированных из колонок для аффинной хроматографии, как это подробно описано в примерах 2 и 3. На фиг. 3 показана аминокислотная последовательность (однобуквенный код) химерыsIL-6RVal/IL-6, в которой указаны разные домены молекулы, в том числе N-концевой сигнальный пептид (линия поверх последовательности), иммуноглобулиноподобный (Ig-подобный) домен, N-домен рецептора цитокина (подчеркнут), С-домен цитокина (линия поверх последовательности) и предмембранная область рецептора (область между С-доменом и трансмембранным доменом), вся часть sIL-6R химеры; а также зрелая часть химеры IL-6 (подчеркнута снизу), как это описано в примерах 1 и 2. На фиг. 4 (А, В) показаны фотографии меланомных клеток F10.9 в культуре, необработанные (А) и обработанные (В) химерным белком sIL-6R/IL-6 в течение 4 дней, при этом на фиг. 4 В видны морфологические изменения,вызванные химерой sIL-6R/IL-6 в метастатических меланомных клетках (клетки F10.9), как это описано в примере 3. На фиг. 5 дано графическое изображение результатов, показывающих подавление роста меланомных клеток F10.9 химерным белкомsIL-6R/IL-6, используемым в разных концентрациях от около 0,12 до около 150 нг/мл, где химера IL-6R/IL-6, имеющая линкер длиной около 3 аминокислот, описанная в примере 3, сравнивается с химерой, имеющей линкер длиной 13 аминокислот (IL-6R/IL-6). На фиг. 6 дано графическое изображение результатов, показывающих отсутствие подавляющего рост действия на меланомные клеткиF10.9 отдельно выделенного IL-6 (верхняя пунктирная кривая с незаштрихованными квадратами) в концентрациях 0-40 нг/мл IL-6 и отдельно выделенного sIL-6R (точка схождения всех кривых на вертикальной оси, где концентрация IL-6 равна нулю); а также наблюдаемое действие подавления роста при совместном добавлении IL-6 и sIL-6R в разных концентрациях,где IL-6 имеет концентрацию от 10 до 40 нг/мл и sIL-6R добавлен в трех концентрациях, равных 100, 200 и 400 нг/мл на каждую концентрацию IL-6, как это показано тремя нижними кривыми (две пунктирные кривые с незаштрихо 11 ванными треугольниками и кружками и сплошная кривая с заштрихованными квадратами),аналогично примеру 3. На фиг. 7 представлена авторадиограмма саузерн-блоттинга, показывающая требования,предъявляемые к химерному белку sIL-6R/IL-6 для улучшения приживаемости кроветворных стволовых клеток человека при трансплантации костного мозга мышам SCID-NOD (две расположенные справа полосы, относящиеся к мышам, получавшим химерный белок sIL-6R/IL-6 дополнительно к другим необходимым факторам, SCF, FLT-3, сравниваются с тремя расположенными слева полосами, относящимися к мышам, получавшим только SCF и FLT-3 иSCF, FLT-3, а также отдельно выделенные, т.е. неслитые IL-6 и sIL-6R), как это описывается в примере 4. На фиг. 8 изображен график Скэтчарда,показывающий характеристики сродства химеры sIL-6R/IL-6 по сравнению со смесью IL-6 иsIL-6R, где значения химеры изображены заштрихованными квадратами и значения смеси показаны заштрихованными ромбами, при этом отношение наклонов кривых составляет 4:1. На фиг. 9 показан график более высокой активности химеры sIL-6R/IL-6 в отношении меланомных клеток F10.9, по сравнению с активностью смеси sIL-6R+IL-6 или sIL-6R (безIL-6). На фиг. 10 показаны результаты защиты,обеспечиваемой химерой sIL-6R/IL-6 против токсикоза печени, где цифровые величины представляют среднее значение 4 экспериментов, заштрихованные квадраты относятся к IL-6/-мышам, заштрихованные ромбы относятся кIL-6-/-мышам, получавшим IL-6, и заштрихованные звездочки относятся к IL-6-/-мышам,получавшим химеру. На фиг. 11 изображена аминокислотная последовательность (однобуквенный код) химеры 3 е IL-6-sIL-6RVal, в которой подчеркнут линкер. На фиг. 12 изображен график биологической активности, проявляемой в отношении меланомных клеток F10.9 химерой 3 е (темные заштрихованные звездочки), по сравнению с химерой SIL-6R/IL-6 (заштрихованные квадраты) и двумя мутантами (Mutt 39 (HD) заштрихованные ромбы) и (Mutt NHD - светлые заштрихованные звездочки), как это описывается в примере 9. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к химерному белку sIL-6R/IL-6 и его биологически активным аналогам, содержащим практически все природные формы sIL-6R и практически все природные формы, слитые друг с другом, в которых сайт слияния может быть линкерным пептидом длиной 3 аминокислоты, при этом химерный белок sIL-6R/IL-6 и его аналоги имеют такую же величину и структуру гликозили 004793 12 рования, что и природные sIL-6R и IL-6. Установлено, что химерный белок sIL-6R/IL-6, полученный в соответствии с настоящим изобретением в клетках млекопитающих, в частности в клетках человека (см. нижеследующие примеры 1-4) или в клетках СНО (см. нижеследующий пример 6), эффективно экспрессируется в таких клетках, хорошо гликозилируется и оказывает сильное действие на опухолевые клетки, которые совершенно не реагируют на используемые отдельно IL-6 или sIL-6R. В частности, в соответствии с настоящим изобретением обнаружено (см. нижеследующие примеры 1-3), что вышеуказанный химерный белок sIL-6R/IL-6 по этому изобретению подавляет рост чрезвычайно злокачественных клеток млекопитающих, таких как меланомные клеткиF10.9, в более низких концентрациях по сравнению с теми, которые необходимы при использовании смеси неслитых sIL-6R и IL-6. Это особенно важно с учетом того, что меланомные клетки F10.9 продолжают расти без изменения после их обработки отдельно IL-6 или sIL-6R, и их рост прекращается только под воздействием относительно высоких доз смеси неслитых IL-6 и sIL-6R. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по настоящему изобретению является гораздо более сильнодействующим ингибитором высокозлокачественных меланомных клеток, чем смесь его отдельных частей, т.е. смесь неслитых IL-6 иsIL-6R. Таким образом, химерный белок по настоящему изобретению особенно полезен в качестве активного ингредиента для лечения разных видов рака. Считается, что более высокая активность химерного белка sIL-6R/IL-6 связана с его более высоким сродством к gр 130 по сравнению со смесью неслитых IL-6 и sIL-6R (пример 7). Кроме того, установлено, что (см. нижеследующий пример 4) химерная молекула sIL6R/IL-6 по настоящему изобретению является особенно полезной для усиления приживаемости клеток при трансплантации костного мозга. Действительно, при выполнении известной методики трансплантации клеток костного мозга человека мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), у которых фактор стволовых клеток (SCF) и Flt3-лиганд использованы для стимуляции выживания и пролиферации самых простых полипотентных кроветворных стволовых клеток, способных в течение длительного времени сохранять жизнеспособность в костным мозге реципиента, установлено, что эти два фактора, SCF и Flt3-лиганд, являются недостаточно активными, чтобы стимулировать приживаемость клеток человека в костном мозге мыши-реципиента, и что трансплантация оказывается успешной только при дополнительном использовании химерного белка SIL-6R/IL-6. Это открытие показывает, что химерный белок можно эффективно использовать при осуществлении такой трансплантации. 13 Использование в тех же экспериментах неслитых IL-6 и sIL-6R при раздельном добавлении не позволяет успешно стимулировать трансплантацию костного мозга и при совместном добавлении они оказываются гораздо менее активными, чем химерный белок sIL-6R/IL-6, т.е. при эффективной концентрации, равной 100 нг/мл, химерный белок sIL-6R/IL-6 эффективно стимулирует трансплантацию костного мозга, в то время как два отдельных неслитых sIL-6R иIL-6, добавляемые вместе даже в более высоких концентрациях (sIL-6R в концентрации 1251250 нг/мл, IL-6 в концентрации 50-200 нг/мл),гораздо менее активно стимулируют такую трансплантацию. Вышеуказанный химерный белок sIL6R/IL-6 по данному изобретению предпочтительно является рекомбинантной гликозилированной химерой sIL-6R/IL-6, продуцированной в клетках человека или в любой приемлемой экспрессирующей системе клеток млекопитающих, такой как клетки яичника китайского хомячка (СНО), которая способна гликозилировать белки аналогично клеткам человека и вносит такие же посттрансляционные модификации, что и клетки человека. Важной особенностью является то, что полученный таким образом химерный гликопротеин процессирован и модифицирован так же, как природные родительские молекулы sIL-6R и IL-6, обнаруженные в организме человека, без усечения и добавления чужеродных, не встречающихся в природе, полипептидных последовательностей,за исключением очень короткого трипептида или более длинного линкерного пептида, вводимого между частями sIL-6R и IL-6 химерного белка. Чтобы получить вышеуказанный предпочтительный химерный белок по этому изобретению, необходимо учесть следующие особенности природных sIL-6R и IL-6. Известно, что IL6R, присутствующий в клеточных мембранах человека, продуцируется кДНК, кодирующей 468 аминокислот, образующих сигнальный пептид, иммуноглобулиноподобный (Ig) домен,домен связывания цитокина, трансмембранную область и цитоплазматический домен (YamasakiIL-6R, выделенному из мембран, имеет N-конец,соответствующий остатку Leu-20 (Novick et al.,1990), и С-конец, соответствующий остатку Val356, непосредственно перед трансмембранной областью IL-6R (см. совместный патент США 5216128 и европейский патент 413908 В 1). Чтобы слить последовательность sIL-6R с IL-6,после Val-356 вводят сайт рестрикции EcoRI. Последовательность зрелого IL-6, начинающуюся у остатка Рrо-29 кДНК IL-6 и заканчивающуюся у остатка Met-212 (Zilberstein et al.,1986; Hirano et al., 1986), вводят вслед за сайтом 14 но, ввести линкерный пептид требуемой длины,чтобы отделить части sIL-6R и IL-6 друг от друга в химерном белке. Как описано ниже, в качестве возможных примеров таких химерных белков получены два разных химерных белка, в сайт EcoRI одного из которых введен трипептидный линкер, а в другой введен линкер, состоящий из 13 аминокислотных остатков, при этом оба химерных белка характеризуются практически одинаковой биологической активностью. Настоящее изобретение относится также к аналогам вышеуказанного химерного белка sIL6R/IL-6 по этому изобретению, где аналоги обладают практически такой же биологической активностью химерного белка, так как содержат только природные последовательности sIL-6R иIL-6. Такие аналоги являются белками, в которых может быть удалено, добавлено или заменено до 30 аминокислотных остатков в частяхsIL-6R и/или IL-6 химерного белка с учетом того, что модификации такого типа не должны существенно изменять биологическую активность аналога химерного белка по отношению к самому химерному белку, при этом часть sIL-6R таких аналогов практически полностью сохраняет природную структуру (до процессирования см. фиг. 3) сигнального пептида, Ig-подобного домена, N-домена рецептора цитокина, Сдомена рецептора цитокина и предмембранного домена рецептора. Аналогичным образом, такие аналоги химерного белка должны практически полностью сохранять природную зрелую форму части IL-6. Различные аналоги могут существенно отличаться друг от друга и от основной молекулы химерного белка (содержащего только природные последовательности sIL-6R и IL6) в сайте линкерного пептида, соединяющего части sIL-6R и IL-6 в химерном белке. Такой линкер может иметь длину до 30 аминокислот и служит для отделения частей sIL-6R и IL-6 друг от друга в химерном белке. Что касается такого линкера, то нужно очень внимательно выбрать его последовательность (и затем выполнить биологические испытания каждого такого аналога приемлемыми стандартными методами),чтобы ошибочный выбор не стал причиной неправильной укладки цепей в химерном белке, в результате чего он может потерять активность,или не привел к получению аналога химерного белка, против которого иммуногенный белок начнет вырабатывать антитела в организме пациента, вследствие чего такой аналог окажется неэффективным, по крайней мере, в качестве лекарственного средства среднего или продолжительного лечения. Что касается вышеуказанных аналогов химерного белка по этому изобретению, то этими аналогами являются белки, в которых от одного до около 30 аминокислотных остатков основного химерного белка по этому изобретению заменены другими аминокислотными остатками 15 или удалены, либо один или несколько аминокислотных остатков добавлены к первоначальной последовательности химерного белка по этому изобретению (которая содержит только природные последовательности sIL-6R и IL-6) без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с основным химерным белком по этому изобретению. Эти аналоги получают известными методами синтеза и/или сайтнаправленного мутагенеза или любым другим известным методом, пригодным для этой цели. Любой такой аналог предпочтительно имеет последовательность аминокислот, которая достаточно точно соответствует аминокислотной последовательности основной химеры sIL6R/IL-6, что сообщает ему практически такую же активность. Таким образом, определить у данного аналога наличие такой же активности,что и у основного химерного белка по этому изобретению, можно обычным экспериментированием, в соответствии с которым аналог испытывают на активность в соответствии с нижеследующими примерами 2-4. Аналоги химерного белка, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, или кодирующие их нуклеиновые кислоты, включают ограниченную совокупность соответствующих последовательностей в качестве замещающих пептидов или полинуклеотидов, которые могут быть получены специалистом в этой области без излишнего экспериментирования на основании положений и указаний, приведенных в этом описании изобретения. Для более подробного ознакомления с химией и структурой белков обратитесь к научным работам Schulz G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978 иProperties W.H. FreemanCo., San Francisco,1983, которые включены в это описание изобретения в качестве ссылки. Замены в нуклеотидной последовательности, такие как предпочтительные кодоны, описаны в научных работахal., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience N.Y,6.3 и 6.4 (1987, 1992), в приложениях С и D. Предпочтительные изменения, вносимые в аналоги по настоящему изобретению, известны как "консервативные" замены. Консервативные замены аминокислот в химерном белке, состоящем в основном из природных последовательностей sIL-6R и IL-6, могут включать тождественные аминокислоты, входящие в группу со сходными физико-химическими свойствами,благодаря чему при замене членов этой группы сохраняются биологические функции молекулы,Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974). Очевидно, что инсерции и делеции аминокислот могут также производиться в вышеуказанных последовательностях без изменения их функ 004793 16 ции, особенно, если эти инсерции или делеции включают только несколько аминокислот, например менее тридцати, предпочтительно менее десяти, и не приводят к удалению или изменению положения аминокислот, имеющих важное значение для функциональной конформации,например остатков цистеина, Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains",Science, Vol. 181, pp. 223-230 (1973). Аналоги,полученные в результате таких делеций и/или инсерций, входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительные группы тождественных аминокислот представлены в табл. I. Более предпочтительные группы тождественных аминокислот приведены в табл. II и наиболее предпочтительные группы тождественных аминокислот представлены в табл. III. Таблица I Предпочтительные группы тождественных аминокислот 17 Таблица II Более предпочтительные группы тождественных аминокислот Таблица III Наиболее предпочтительные группы тождественных аминокислот Примеры выполнения замен аминокислот в белках, которые можно использовать для получения аналогов химерного белка по настоящему изобретению, включают любые известные методы, в частности описанные в патентах СШАRE 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, выданных Марку и др.;5116943, 004793 18 выданном Котсу и др.,4965195, выданном Намену и др.,4879111, выданном Чонгу и др., и 5017691, выданном Ли и др.; и белки с замененным лизином, описанные в патенте США 4904584 (Shaw et al.). В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения любой аналог химерного белка по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, которая практически соответствует аминокислотной последовательности вышеуказанного основного химерного белка. Термин "практически соответствует" означает аналоги с незначительными изменениями последовательности основного химерного белка,которые не влияют на его основные характеристики, в частности на его способность подавлять пролиферацию раковых клеток или стимулировать приживаемость клеток при трансплантации костного мозга. Изменения, которые обычно входят в определение "практически соответствует", получают в результате выполнения обычных методов мутагенеза ДНК, кодирующей химерный белок по этому изобретению, которые позволяют получить несколько незначительных модификаций, и тестирования полученных аналогов с целью выявления требуемой активности,как это описывалось выше. Аналоги по настоящему изобретению включают белки, закодированные нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизирует с ДНК или РНК в строгих условиях и кодирует химерный белок по настоящему изобретению, состоящий практически полностью из природных последовательностей, кодирующих sIL-6R и IL-6. Например, такая гибридизирующая ДНК или РНК может кодировать тот же белок по этому изобретению, который имеет,например, последовательность, показанную на фиг. 3, но отличается своей нуклеотидной последовательностью от природной нуклеотидной последовательности вследствие вырожденности генетического кода, т.е. несколько отличающаяся последовательность нуклеиновых кислот может по-прежнему кодировать ту же аминокислотную последовательность с учетом указанной вырожденности. Кроме того, как указывалось выше, число изменений аминокислот(делеции, добавления, замены) ограничено примерно 30 аминокислотами, поэтому даже при максимальном числе замен аналоги по настоящему изобретению все же сохраняют лидерную последовательность (до процессирования), Igподобный домен, N- и С-концевые домены рецептора цитокина и предмембранную область рецептора (область между С-концевым доменом и трансмембранным доменом) в части sIL-6R и практически всю часть IL-6. Такая нуклеиновая кислота будет кандидатом номер один для определения, кодирует ли она полипептид, который сохраняет функциональную активность химерного белка по настоящему изобретению. 19 Термин "строгие условия" относится к условиям гибридизации и последующей промывки, которые специалисты в этой области обычно определяют как "строгие". См. Ausubel et al., CurrentSambrook et al., supra. Примеры строгих условий без каких-либо ограничений включают условия промывки при температуре на 12-20 С ниже высчитанной температуры исследуемого гибрида, например 2 х SSC и 0,5% SDS в течение 5 мин, 2 х SSC и 0,1% SDS в течение 15 мин; 0,1 хSSC и 0,5% SDS при 37 С в течение 30-60 мин и затем 0,1 х SSC и 0,5% SDS при 68 С в течение 30-60 мин. Специалистам в данной области должно быть понятно, что строгость условий зависит также от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотиных зондов (10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. В случае смешанных зондов желательно использовать хлорид тетраметиламмония(ТМАС) вместо раствора хлорида и цитрата натрия (SSC). См. Ausubel, выше. Термин "соли" означает как соли карбоксильных групп, так и соли с присоединением кислоты по аминогруппе химерного белка по этому изобретению или его аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть получены известными методами и включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и тому подобные, и соли с органическими основаниями, полученные, например, при взаимодействии с аминами,такими как триэтаноламин, аргинин или лизин,пиперидин, прокаин и тому подобные. Соли с присоединением кислоты включают, например, соли с минеральными кислотами,такими как хлористо-водородная или серная кислоты, и соли с органическими кислотами,такими как уксусная или щавелевая кислоты. Все эти соли должны, конечно, обладать такой же активностью, что и химерный белок по этому изобретению или его аналоги. Настоящее изобретение относится также к последовательностям ДНК, кодирующим вышеуказанный химерный белок по этому изобретению и его аналоги, а также к векторам ДНК,несущим такие последовательности ДНК для экспрессии в клетках подходящих млекопитающих, предпочтительно человека. Одним из вариантов вектора по этому изобретению является плазмида pcDNA sIL-6R/IL-6, включающая вектор pcDNA3 (Invitrogen), содержащий слитые последовательности sIL-6R/IL-6, полученные под контролем промотора цитомегаловируса (CMV). Настоящее изобретение относится также к трансформированным клеткам млекопитающих,предпочтительно человека, клеткам, способным экспрессировать вышеуказанные белки по настоящему изобретению. Одним из вариантов таких трансформированных клеток являются 20 клетки почки эмбриона человека 293 (НЕК 293,АТСС CRL 1573), трансфецированные pcDNASIL-6R/IL-6, которые секретируют слитую химеру sIL-6R/IL-6 в виде гликопротеина с молекулярной массой 85 кДа. Еще один вариант осуществления изобретения включает плазмиду pcDNA sIL-6R/L/IL-6,которая отличается от вышеуказанной pcDNAsIL-6R/IL-6 вставкой в сайт EcoRI коротких линкеров, кодирующих 10 дополнительных аминокислот. Можно ввести целый ряд последовательностей различной длины, чтобы оптимизировать расстояние между sIL-6R и IL-6. В изобретение входит также химерный белок, в котором часть IL-6 предшествует sIL-6R(как это показано на фиг. 11). Настоящее изобретение далее относится к способу получения и очистки химерного белка по этому изобретению или его аналогов, который включает выращивание вышеуказанных трансформированных клеток в условиях, приемлемых для экспрессии и секреции химерного белкового продукта в культуральную среду и последующую очистку секретированного белка иммуноаффинной хроматографией с использованием моноклональных антител 34.4 противsIL-6R, как это описано в нижеследующих примерах 2 и 5. Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента химеру sIL-6R/IL-6, ее аналоги, смеси или соли и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Одним из вариантов фармацевтической композиции по этому изобретению является фармацевтическая композиция для усиления действия IL-6, для лечения разных видов рака,для стимуляции приживаемости клеток при трансплантации костного мозга, для усиления гемопоэза, в частности тромбоцитопоэза, для лечения неврологических нарушений и болезней печени, и для других целей, связанных с использованием IL-6 или родственных цитокинов. Фармацевтические композиции по этому изобретению получают в виде лекарственных форм, смешивая химерный белок или его аналоги с физиологически приемлемыми носителями и/или стабилизаторами, и/или наполнителями, и получают дозированную форму, например, с помощью лиофилизации в дозирующих пробирках. Способом введения может быть любой известный способ введения, приемлемый для аналогичных средств, и зависит от состояния заболевания, которое нужно лечить, например,внутривенно, внутримышечно, подкожно, путем местной инъекции, местного применения или непрерывного вливания и т.д. Количество вводимого активного соединения зависит от способа введения, заболевания и состояния пациента. Местные инъекции, например, требуют меньше 21 го количества белка в расчете на массу тела, чем внутривенное вливание. Настоящее изобретение относится также к применению химерного белка по этому изобретению, его аналогов или смесей для лечения разных видов рака, для стимуляции приживаемости клеток при трансплантации костного мозга, для усиления гемопоэза, особенно тромбоцитопоэза, для лечения неврологических нарушений, для защиты тканей печени у субъектов,страдающих некрозами, вызываемыми химическими веществами (например, тетрахлорметаном, алкоголем, парацетамолом) или другими причинами (например, вирусной инфекцией,хирургическим вмешательством) и для других целей, связанных с использованием IL-6 или родственных цитокинов. Аналогичным образом настоящее изобретение относится также к химерному белку, его аналогам или смесям, применяемым для получения лекарственных средств, предназначенных для лечения вышеуказанных нарушений или в соответствии с рассмотренными выше показаниями. Помимо вышеуказанных способов лечения химеру и/или кодирующую ее ДНК можно также использовать для выполнения процедур exvivo и генотерапии. Настоящее изобретение далее более подробно описывается в нижеследующих примерах,не ограничивающих его объем, и на прилагаемых чертежах. Пример 1. Конструирование экспрессирующего вектора химеры sIL-6RVal/IL-6. На фиг. 1 изображен схематический график последовательности технологических операций, выполняемых для конструирования экспрессирующего вектора, несущего последовательность, кодирующую химерный белок sIL6RVal/IL-6, включая все начальные и промежуточные векторы, разные реагенты и стадии реакции. Эта методика конструирования включает методы, хорошо известные в области конструирования выбранных экспрессирующих векторов (см., например, Sambrook et al., 1989). Суть этой методики можно коротко описать следующим образом. Библиотеку кДНК, полученную из клетокT47D карциномы молочной железы человека,клонируют в бактериофаге лямбдаgtll и тестируют олигонуклеотидными зондами, выделенными из последовательности IL-6R, по методу Ямасаки и др. (Yamasaki et al., 1988). Выделяют один клон кДНК gtll, который имеет полную последовательность, кодирующую IL6R человека. Вставку вырезают из gtll с помощью EcoRI и клонируют в сайте множественного клонирования (MCS) фагимида E.coli BluepBS/SK-IL-6R подвергают полимеразной реакции синтеза цепи (PCR), чтобы амплифицировать фрагмент длиной 368 п.о. между верхней затравкой 1137-1156 и нижней затравкой 15051488. Нижнюю затравку синтезируют с помощью сайта EcoRI, который расположен сразу же после кодона валина-356 IL-6R (см. фиг. 1), так как ранее было установлено, что этот остаток валина является аминокислотой с карбоксильным концом природной формы растворимогоal., 1990; Oh et al., 1996; принадлежащий обоим авторам патент США 5216128 и европейский патентЕР 413908 В 1). Продукт полимеразной реакции синтеза цепи разрезают EcoRV иEcoRI и лигируют в pBS/SK-sIL-6R-RV между сайтом EcoRV IL-6R и сайтом EcoRI MCS (фиг. 1). Полученную плазмиду pBS-sIL-6R-Val-RI укорачивают, чтобы удалить 5'-концевые нетранслированные последовательности путем лигирования сайта HindIII MCS с сайтом NcoI у пары оснований 410 IL-6R (оба сайта сначала дефосфолируют), что позволяет получить pBSsIL-6R-Val-RI-NcoI (фиг. 1). Последовательность IL-6 выделяют из плазмиды рKK2-7, которая была сконструирована аналогично описанному способу (Chen etal., 1988) путем вставки кДНК IFN-2/IL-6, вырезанной BstNI (Zilberstein et al., 1986), в сайтE.coli (Pharmacia, Uppsala, Sweden), используя синтетический олигонуклеотид с сайтом EcoRI,за которым следует кодон метионина и кодон пролина-29 IL-6, заканчивающийся в сайтеBstNI (EcoRII). кДНК-вставка рKK2-7 IL-6 заканчивается через 7 пар оснований после терминирующего кодона в сайте NlaIV, за которым через 11 пар оснований расположен сайт HindIII вектора рKK-223-3 (фиг. 1). ДНК рKK2-7 разрезают HindIII, дефосфолируют и вновь разрезают EcoRI, после чего кДНК IL-6 вставляют вpBS-sIL-6R-Val-RI-NcoI для слияния зрелой последовательности IL-6 (начинающейся у пролина-29) с IL-6R сразу же после валина-356, при этом они разделены всего 3 кодонами (Glu-PheMet). Полученную плазмиду pBS/SK-sIL-6R/IL6 (фиг. 1) вновь разрезают в сайтах SalI и NotIMCS и эту вставку клонируют в сайте EcoRVpcDNA3 (Invitrogen Corporation, San Diego, California). Полученная плазмида pCDNA3-sIL6R/IL-6 (фиг. 1) содержит вставку внизу от сильного промотора цитомегаловируса (CMV),за которой следует сайт полиаденилирования, 23 обеспечивающий эффективную транскрипцию химеры sIL-6RVal/IL-6. Сохранение 5'-концаsIL-6R в химере гарантирует, что при экспрессии в клетках млекопитающих функция сигнального пептида и процессирование N-конца химерного белка будут такими же, как у природного sIL-6R. Как указывалось выше, преимуществом конструкции SIL-6R-Val/IL-6 является то, что она получена в результате слияния природных форм sIL-6R и IL-6 в том виде, как они существуют в организме человека, без использования чужеродных полипептидных последовательностей. Однако сохранение сайта EcoRI в конструкции sIL-6R5Val/IL-6 (фиг. 1) позволяет легко ввести сегменты линкерного полипептида между частями sIL-6R и IL-6. Кроме того, была сконструирована еще одна конструкция с линкерной последовательностью длиной 13 аминокислот Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-GlyGly-Gln-Phe-Met, введенной между Val-356 sIL6R и Pro-29 IL-6 (sIL-6RVal/L/IL-6). Пример 2. Экспрессия химеры sIL6RVal/IL-6 в клетках человека. Осуществляя стандартные методы культивирования клеток млекопитающих, трансфекции клеток и анализа трансфецированных клеток в отношении экспрессии вновь введенной последовательности ДНК, предназначенной для экспрессии (для ознакомления с этими методами см., например, Sambrook et al., 1989), вышеуказанную плазмидную конструкцию (пример 1) используют для трансфекции клеток человека и оценивают степень ее экспрессии. Вкратце используют следующие методики. Клетки НЕК 293 человека (АТСС CRL 1573, трансформированные первичные клетки почки эмбриона человека) трансфецируют ДНК плазмидной конструкции pCDNA3-sIL-6R/IL-6(описанной в приведенном выше примере 1). Культуры НЕК 293, находящиеся в логарифмической фазе роста, обрабатывают трипсином и высевают в 9 см чашки Нунка (2,5 х 106 клеток/чашку). На следующий день осуществляют трансфекцию 10 мкг ДНК pCDNA3-sIL-6R/IL-6 по способу осаждения СаРO4 (Sambrook et al.,1989), через 1 ч среду заменяют средой DMEM,содержащей 10% фетальную телячью сыворотку(FCS), и продолжают культивирование в течение еще 16 ч. После замены этой среды средойDMEM, содержащей 2% FCS, секретированные белки собирают в течение двух последующих периодов по 48 ч. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием со скоростью 1000 об./мин в течение 10 мин и супернатант анализируют по методу ELISA для sIL-6R, используя поликлонильные антитела кролика против sIL-6R и мыши МсАВ 17.6 (Novick et al., 1991). Установлено, что концентрация, равная 1,2 мкг/мл эквивалентов sIL-6R, является показателем очень 24 эффективной экспрессии химерного белка sIL6R/IL-6 в трансфецированных клетках человека. Иммуносорбционную очистку секретированного химерного белка (sIL-6R/IL-6) осуществляют моноклональным антителом 34.4, специфичным в отношении эпитопа во внеклеточном домене sIL-6R человека (Novick et al., 1991;Halimi et al., 1995). Клетки гибридомы 34.4 выращивают в брюшной полости мышей и иммуноглобулиновую (Ig) фракцию получают из асцитной жидкости осаждением сульфатом аммония. Для иммобилизации МсАВ 34.4 используют Affigel-10 (Bio-Rad Labs, Richmond, California) (15 мг Ig, связанного с 1 мл Affigel-10). Супернатанты, содержащие белки, секретированные из клеток НЕК 293, трансфецированныхpCDNA3-sIL-6R/IL-6, адсорбируют на колонках МсАВ 34.4 (0,3 мл колонка для 15 мл супернатанта). После промывки физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS) связанные белки элюируют 25 мМ лимонной кислоты, рН 2.5, сразу же нейтрализуют 1 М раствором буфера на основе HEPES, рН 8,5 и диализуют в течение ночи (примерно 8-12 ч) против PBS. Анализ подвергнутого иммуносорбционной очистке белка электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия показывает наличие характерной полосы белка,окрашенной кумасси голубым (фиг. 2). Молекулярная масса этого белка равна 85 кДа, как это и предполагалось в результате слияния гликозилированных форм sIL-6RVal (60 кДа по определению Oh et al., 1996) и гликозилированного IL-6 (23-26 кДа по определению Zilberstein etsIL-6R/IL-6 состоит из 543 аминокислот, которые после процессирования сигнальных пептидов позволяют предсказать белок длиной 524 аминокислоты или с молекулярной массой около 58 кДа (фиг. 3). Гораздо больший размер химеры sIL-6R/IL-6, полученный из рекомбинантной ДНК в клетках человека, свидетельствует о том, что гликозилирование охватывает значительную часть молекулы. Пример 3. Подавление химерой sIL-6R/IL-6 роста и дифференциации метастатических меланомных клеток. Клон F10.9, выделенный из меланомных клеток В 16, образует чрезвычайно метастатические опухоли у мышей С 57Black/6, которые вызывают гибель животных от легочных метастазов в течение 2-3 месяцев (Katz et al., 1995). Добавление химерного белка sIL-6R/IL-6 в культуру клеток F10.9 вызывает существенное морфологическое изменение в клетках и подавляет их рост (фиг. 4). Клетки F10.9, обработанные этой химерой, вытягиваются, у них появляются выступающие дендритные выросты, напоминающие веретенообразную дифференцировку меланоцитов или глиальных клеток эмбриона. Рост клеток определяют в количественном отношении через 4 дня после посева 3 х 103 кле 25 ток в лунки 96-луночного микропланшета в 0,2 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% FCS. Клетки выдерживают в 12,5% глутаровом альдегиде в течение 30 мин, промывают в воде и окрашивают 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 30 мин. После тщательной промывки и сушки краситель экстрагируют 10% уксусной кислотой и определяют оптическую плотность при 540 нм. Эта химера подавляет рост клеток в зависимости от дозы до полного подавления их роста даже при такой низкой концентрации, как 10 нг/мл химерного белка(р 85) (фиг. 5). Оба химерных белка sIL6RVal/IL-6 и sIL-6RVal/L/IL-6 (химера с более длинным линкером между частями sIL-6R и IL6, см. пример 1) обладают одинаковой активностью. Этот результат также показывает, что длина линкерного пептида между частями sIL6R и IL-6 в этой химере не оказывает влияния на активность химеры, так как химера sIL6RVal/IL-6 имеет очень короткий линкер длиной 3 аминокислоты, а химера sIL-6RVal/L/IL6 имеет более длинный линкер, состоящий из 13 аминокислот, но обе эти химеры обладают практически одинаковой активностью подавления роста метастатических клеток. В отличие от этого, ни IL-6, ни sIL-6RVal в отдельности не подавляют рост меланомных клеток (фиг. 6),что свидетельствует об уникальной активности химерного белка SIL-6R/IL-6 (р 85). Чтобы получить аналогичный эффект, необходимо использовать смесь 200-400 нг/мл IL-6 и 125 нг/млsIL-6RVal (фиг. 6). При вычислении в молярной концентрации для максимального подавления роста клеток F10.9 необходимо 7,5 пМ IL-6 и 2 nM sIL-6RVal по сравнению всего с 0,12nМ химеры sIL-6R/IL-6. Активность химерного белка sIL-6R/IL-6 р 85 по подавлению роста клеток исследуют во время иммуносорбционной очистки на колонках МсАВ 34.4 (см. пример 2). Характер активности соответствует интенсивности полосы р 85, наблюдаемой в разных фракциях, полученных при выполнении электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, результаты которого приведены на фиг. 2. Пример 4. Роль химеры sIL-6R/IL-6 в приживаемости трансплантированных клеток костного мозга. Приживаемость кроветворных стволовых клеток из костного мозга человека можно исследовать после их трансплантации мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом(SCID) (Vormoor et al., 1994). Мышей SCIDNOD подвергают облучению сублетальными дозами и инъецируют в хвостовую вену 3 х 105 клеток CD34+ костного мозга человека. До инъецирования очищенные клетки CD34+ выдерживают в течение 3 дней в жидких культурах с разными комбинациями цитокинов. Через один месяц мышей умерщвляют и удаляют у них кос 004793 26 ти для получения клеток костного мозга. Приживаемость клеток человека у мышейреципиентов SCID-NOD определяют по методу гибридизации саузерн-блоттингом с повторяющейся ДНК человека. Установлено, что фактор стволовых клеток(лиганд рецептора тирозинкиназы flt3/flk2) имеет важное значение для выживаемости и пролиферации большинства первичных полипотентных кроветворных стволовых клеток, способных в течение длительно действующему приживлению в костном мозге реципиента(McKenna et al., 1995). Как показано на фиг. 7,эти два фактора сами по себе являются недостаточными для стимуляции приживаемости клеток человека в костном мозге мышейреципиентов SCID-NOD. Чтобы обнаружить приживаемость клеток на значимых уровнях,необходимо добавить химерный белок sIL6R/IL-6. Химера sIL-6R/IL-6, добавляемая в количестве 100 нг/мл, является гораздо более активной, чем выделенные отдельно IL-6 (50-200 нг/мл) и sIL-6R (125-1250 нг/мл) (фиг. 7). Необходимость использования химеры sIL-6R/IL-6 указывает на то, что этот белок имеет важное значение для выживаемости и пролиферации некоммитированных полипотентных кроветворных стволовых клеток, которые приживаются в костном мозге и создают в нем новую популяцию клеток, из чего следует, что этот белок может быть полезен в случае клинических операций по трансплантации костного мозга. Впервые продемонстрировано, что химераsIL-6R/IL-6 обладает по крайней мере двумя недавно обнаруженными видами активности:(i) при добавлении вместе с факторамиSCF и Flt3-лигандом в кроветворные первичные недифференцированные клетки человека эта химера стимулирует их выживаемость и пролиферацию; и(ii) эта химера является активной (и, очевидно, основной) в модели in vivo трансплантации костного мозга человека мышам с иммунодефицитом. Пример 5. Химера sIL-6R/IL-6 активна на максимально очищенных первичных кроветворных стволовых клетках. Мононуклеарные кровяные клетки из пуповины человека фракционируют, отделяя мононуклеарные клетки низкой плотности (NMC) в аппарате Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech,Uppsala, Sweden), и обрабатывают мининаборомMACS (Miltney Biotec, Bergisch Glad-bach, Germany) для получения популяции клеток CD34+ 80% чистоты. Эти клетки пассируют на иммобилизованном моноклональном антителе противCD38 или сортируют по методу сортировки активированных флуоресценцией клеток, в результате чего получают популяцию CD34+CD38-,соответствующую примерно 0,1% исходных клеток. Эти очищенные стволовые клетки (20000 27 клеток) помещают в суспензионные культуры в 0,5 мл среды RPMI, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (FCS), 1% бычий сывороточный альбумин с 50 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF) и 100 нг/мл flt3-лиганда (FL)(оба вещества предоставлены фирмой RDSystems, Minneapolis, MN). В половину культур добавляют 100 нг/мл химеры sIL-6R/IL-6, остальные культуры выращивают без этой химеры. Культуры инкубируют при 37 С в 5% СО 2 в течение 6 дней. Количество репопулирующих клеток костного мозга определяют путем инъецирования (внутривенно) всех клеток из культур in vitro мышам NOD-SCID, подвергнутым облучению сублетальными дозами. Мышей содержат в стерильных условиях. Через 6 недель мышей умерщвляют и удаляют костный мозг из длинных костей. Клетки костного мозга (ВМ) культивируют на пластинах из полутвердой 0,9% метилцеллюлозы, содержащих 30% FCS,50 мкМ -меркаптоэтанола, 50 нг/мл SCF, 5 нг/мл IL-3, 5 нг/мл GM-CSF, 6 мк/мл эритропоэтина (все вещества предоставлены фирмойRD Systems). Культуры содержат также сыворотку человека, которая предотвращает рост колоний мышей. Результаты (табл. IV) показывают, что добавление химеры sIL-6R/IL-6 к суспензионным культурам вызывает 30-50-кратное увеличение колониеобразующих клеток (CFU) человека у трансплантированных мышей по сравнению с SCF и FL, используемыми отдельно. Это указывает на большое увеличение количества SCID-репопулирующих стволовых клеток, присутствующих в суспензионных культурах на 6-й день по сравнению с 0-м днем. При отсутствии химеры sIL-6R/IL-6, SCF и FL не вызывают увеличения количества стволовых клеток при нахождении в суспензионной культуре в течение 6 дней. ДНК клеток костного мозга, выделенную у трансплантированных мышей NOD/SCID, анализируют по методу саузерн-блоттинга, как это описано в примере 4. Количество выделенной ДНК человека в 10 раз больше у мышей, которым были введены клетки, культивированные с химерой, по сравнению с мышами, которым были введены клетки без химеры. Колониеобразующие клетки-предшественники из костного мозга мышей NOD/SCID, как показано в табл. IV, увеличивают количество кроветворных клеток разных миелоидных линий (макрофаг и гранулоцит), а также эритроидных и лимфоидных линий (например, CD19+,CD56+), только тогда, когда кровяные клетки человека были культивированы с химерой sIL6R/IL-6 до трансплантации. 28 Таблица IV Стволовые клетки человека, способные репопулировать костный мозг мышей NOD/SCID Добавление в суспензионную культуру клеток CD34+CD38 человека из пуповинной крови Количество колоний кроветворных клеток Дни кульчеловека, образовантивированых из костного мозга,ния трансплантированного мышам NOD/SCID 0 4 6 2-3 б 50-100 В дополнительных экспериментах производится сравнение влияния sIL-6R/IL-6 на популяцию клеток CD34+CD38+ пуповинной крови и на хорошо очищенные стволовые клеткиCD34+CD38-. Размножение in vitro под действием sIL-6R/IL-6 хорошо очищенных клеток происходит гораздо интенсивнее, чем менее очищенных клеток (табл. V). Это свидетельствует о том, что предпочтительной мишенью для размножения sIL-6R/IL-6 являются прежде всего первичные стволовые клетки. Таблица V Размножение in vitro кроветворных стволовых клеток Количество Посеянная попу- Количество клеток на клеток на 6-й ляция клеток 6-й день под действием день под дейст(20000 клеток) Сохранение in vitro репопулирующей активности костного мозга измеряют по увеличению длины суспензии культур хорошо очищенных стволовых клеток CD34+CD38- до инъецирования мышам NOD/SCID. Приживаемость клеток оценивают на основании относительного содержания ДНК человека в костном мозге мышей-реципиентов через 6 недель после внутривенного введения культивированных клеток. При добавлении sIL-6R/IL-6 к SCF и FL в культуры клеток высокая приживаемость (1% ДНК человека) наблюдается даже через две недели культивирования, причем приживаемость является выше, чем в некультивированных клетках,В отличие от этого, эксперименты с культурами,содержащими SCF, FL, GM-CSF, IL-3, показывают, что SCID-репопулирующие клетки не сохраняются через одну неделю культивирования(Bhata M. et al., J.Exp.Med. 186, 619-624, 1997). Эти результаты свидетельствуют о том,что sIL-6R/IL-6 стимулирует размножение и сохранение первичных стволовых клеток человека, способных приживаться в костном мозге реципиента. Стволовые клетки, размножаясь,остаются активными в недифференцированном состоянии. Химера sIL-6R/IL-6 является новым средством культивирования приживающихся 29 кроветворных клеток. Весьма вероятно, что эта химера позволит использовать ретровирусные векторы для введения генов в приживающиеся стволовые клетки в соответствии со схемой генотерапии. До настоящего времени такая обработка стволовых клеток человека была невозможна, так как эти первичные клетки не сохранялись in vitro в фазе клеточного цикла, как это необходимо для интеграции ретровирусной ДНК. Химера sIL-6R/IL-6 позволяет решить эту проблему. Пример 6. Получение химеры IL-6R/IL-6 в клетках СНО. ДНК плазмиды pcDNA3 sIL-6R/IL-6, показанную на фиг. 1, котрансфецируют в клетки яичника китайского хомячка (СНО) вместе с ДНК плазмиды pDHFR по методу Моrу et al.(ДНК 5, 181-193, 1986). Вместе с другими трансфектантами, выращиваемыми в 50 нМ метотрексата, выделяют клон L12-[IL-6R/IL-6]. Установлено, что этот клон остается устойчивым на протяжении нескольких пассирований,поэтому полуконфлюэнтные культуры обычно секретируют в культуральную среду 2,5 мкг/мл химеры IL-6R/IL-6. Для очистки химеры IL-6R/IL-6 3,25 л среды из культур клона L12 в 2% бычьей сыворотки концентрируют до 200 мл. Полученное вещество адсорбируют на 18 мл колонке с моноклональным антителом 34.4 против sIL-6R человека, связанного с гранулами Affigel 10, и элюируют известным способом (Novick et al., Hybridoma, 10, 137-146, 1991). Элюат, содержащий 25 мМ лимонной кислоты, сразу же нейтрализуют буфером на основе HEPES 1, рН 8,6. Белки концентрируют на мембране Amicon для вырезания фрагмента с молекулярной массой 10 кДа до конечной концентрации 1 мг/мл. В результате выполнения электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия обнаружена одна полоса с молекулярной массой 85 кДа,соответствующая химере IL-6R/IL-6. Гликозилирование подтверждено уменьшением размера после обработки гликозидазой (Boehringer,Mannheim). Установлено, что биологическая активность СНО-продуцированной химеры IL6R/IL-6 остается стабильной в течение по крайней мере 5 месяцев при 4 С. Как правило, химеру хранят при -70 С. Пример 7. Сродство химеры IL-6R/IL-6 кgpl30 (sgp 130), которая является второй цепью системы рецепторов для IL-6 (см. раздел "Предпосылки изобретения"). 96-Луночный титрационный микропланшет (Nunc) покрывают моноклональным антителом против gр 130 человека и добавляют 50 нг/мл sgp130 (оба вещества предоставлены фирмой RD Systems, Minneapolis). Химеру IL-6R/IL-6 промывают в физиологиче 004793 30 ском растворе с фосфатным буфером и вводят в разные лунки в разных концентрациях от 0,1 до 50 нг/мл. В отдельные лунки добавляют rhuIL-6(Ares-Serono, Geneva) в количестве 500 нг/мл вместе с sIL-6RVal человека в концентрациях от 2 до 500 нг/мл. Культуры инкубируют в течение ночи при 4 С и добавляют поликлональное антитело кролика против IL-6R (Oh et al.,Cytokine, 8, 401-409, 1996), а затем Ig козы против кролика, конъюгированный с пероксидазой хрена, которую обнаруживают цветной реакцией (Sigma, St.Louis). На фиг. 8 показан график Скэтчарда полученных результатов. Установлено, что сродство химеры IL-6R/IL-6 к gр 130 в 4 раза выше, чем у двух частей молекулы, добавляемых отдельно (6,3 х 10-11 М по сравнению с 2,6 х 10-10 М). Этот результат соответствует ожидаемому и объясняет более высокую активность химеры в отношении меланомных и кроветворных клеток по сравнению с комбинацией(CCl4) вызывает обширный некроз печени, ведущий к гибели животных (Slater T.F. et al.,Philos, Trans.R.Soc.Biol.Sci., 311, 633-645, 1985). Когда мышам с генетическим дефицитом IL-6(JL-6-/-) вводят относительно низкие дозы CCl4(2-3 мл/кг массы тела) в виде внутрибрюшинной инъекции, смертность через 24 ч составляет примерно 70% (фиг. 10). Инъецирование СНО-продуцированной химеры IL-6R/IL6 за 1 ч до введения CCl4 и через 4 ч после введения CCl4 защищает животных, и через 24 ч не наблюдается ни одного случая гибели животных. В отличие от этого, инъецирование свободного rhuIL-6 не оказывает никакого действия(фиг. 10). Химера IL-6R/IL-6 является эффективной в дозах, равных 2-3 мкг/инъекцию, что в молярном отношении в 10 раз меньше, чем неэффективная доза IL-6. При более высоких дозах ССl4 (например, 3,5 мл/кг на фиг. 10) эта химера также оказывает защитное действие,причем смертность в этом случае ниже, чем при введении IL-6 или без введения цитокина. Различие между показателями смертности у мышей, которым была введена эта химера и которым она не была введена, при одинаковом воздействии CCl4, является значимым при р 0,01. Гистологическое исследование срезов печени,окрашенных гематоксиллинэозином, подтверждает, что CCl4 вызвал некроз тканей и что химера IL-6R/IL-6 защищает гепатоциты от токсического действия этого химического вещества(не показано). Химеру IL-6R/IL-6 можно использовать для защиты тканей печени у пациентов, страдающих некрозом вследствие воздействия химических веществ (например, алкоголя, парацетамола) или по другим причинам (например,вирусный гепатит). Пример 9. Конструирование и активность химеры IL-6/sIL-6RVal. Была сконструирована химерная молекула,в которой часть IL-6 расположена в N-концевой области и часть sIL-6R находится в С-концевой области. Плазмиду pBS-sIL-6RVal вырезают в сайте Sau3a (1086 п.о.) и в сайте HindIII вслед за терминирующим кодоном после Val-356 (см. пример 1). Линкер, содержащий три сайта рестрикции: SpeI, SmaI и BamHI, синтезирован следующим образом: Сайт Sau3a sIL-6R лигируют с BamHI линкера и клонируют в сайте множественного клонирования плазмиды Bluescript pBS SK. Последовательность IL-6 амплифицируют полимеразной реакцией синтеза цепи из ДНК рKK2-7,используя затравки (инициирующий кодон подчеркнут)SpeI Верхняя 5' GA СТА GTA GCT ATG ААС ТСС ТТС ТС (SEQ ID3) НаеIII Нижняя 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC С Продукт полимеразной реакции синтеза цепи, вырезанный SpeI и НаеIII, вводят между сайтом SpeI и SmaI вышеуказанного линкера. Другой линкер BamHI-NcoI с внутренним сайтом SmaI синтезируют следующим образом: Эту последовательность клонируют междуSmaI 867 до NcoI 1464 вводят между SmaI второго линкера и NcoI IL-6R. Полученную химерную ДНК секвенируют и вновь клонируют вpCDNA3 для экспрессии в клетках НЕK 293 человека. Аминокислотная последовательность этой химеры 3 е IL-6-IL-6R показана на фиг. 11(линкер подчеркнут). Химеру 3 е очищают аффинной хроматографией на моноклональном антителе против IL-6 (по методу Novick et al.,Hybridoma 8, 561-567, 1989). Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия позволяет выявить полосу, соответствующую молекулярной массе 75 кДа. Биологическая активность химеры 3 е IL-6IL-6R, направленная на подавление роста меланомных клеток F10.9, показана на фиг. 12. Эта химера обладает выраженной активностью при сравнении с химерой IL-6R/IL-6 (препарат 1-3),которое выполняют при осуществлении того же эксперимента, хотя для 50% подавления роста 32 ее необходимо использовать в большем количестве. Были получены два мутанта IL-6R/IL-6, в которых аминокислоты His-280 и Asp-281 частиIL-6R химеры IL-6R/IL-6 (фиг. 3) заменены соответственно Ser и Val путем мутагенеза по методу PCR (мутант 39 или HD) или Asn-230 дополнительно заменена Asp (мутант NHD). Как показано на фиг. 12, эти два мутанта почти не обладают активностью при сравнении с химерами IL-6R/IL-6 и IL-6-IL-6R. Поскольку в IL6R эти аминокислоты взаимодействуют с gр 130,как показывают результаты моделирования молекулы (Halimi et al., 1995), из этого следует,что химера sIL-6R/IL-6 сохраняет этот важный сайт взаимодействия. У химеры 3 е IL-6-IL-6R отсутствует иммуноглобулиноподобный домен IL-6R, который имеется в IL-6R/IL-6. Однако удаление Igдомена из IL-6R/IL-6 не уменьшает биологическую активность этой химеры в отношении клеток F10.9. Связывание химеры 3 е IL-6-IL-6R сgр 130 составляет примерно 30% от аналогичного показателя другой химеры IL-6R/IL-6 (не показано). Такое более низкое связывание соответствует более слабому воздействию на рост меланомных клеток. Эти результаты показывают, что блокирование карбоксильного конца IL-6 путем слияния через линкер с sIL-6R сохраняет хорошую биологическую активность в этих новых химерах. Ссылки 38 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Химерный гликозилированный белок растворимого рецептора интерлейкина-6 (sIL6R) - интерлейкина-6 (IL-6) (sIL-6R/IL-6), включающий слитый белковый продукт, полученный путем слияния природной формы sIL-6R и природной формы IL-6. 2. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по п.1, где указанный sIL-6R слит с IL-6 через молекулу пептидного линкера. 3. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по п.2, где указанный линкер является неиммуногенным линкером, состоящим примерно из 3 аминокислотных остатков. 4. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по п.3, где указанный линкер является трипептидом последовательности E-F-M(Glu-Phe-Met). 5. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по п.2, где указанный линкер является пептидом, состоящим из 13 аминокислотных остатков последовательности E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (GluPhe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-PheMet). 6. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по любому из пп.1-4, обозначаемый здесь как sIL6RVal/IL-6, который включает трипептидный линкер последовательности E-F-M между Сконцевым Val-356 в sIL-6R и N-концевым Рrо 29 в IL-6, причем указанный химерный белок имеет последовательность, показанную на фиг. 3. 7. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по любому из пп.1, 2 и 5, обозначаемый здесь как sIL6RVal/L/IL-6, который включает пептидный линкер, состоящий из 13 аминокислот последовательности E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M, между С-концевым Val-356 в sIL-6R и Nконцевым Рrо-29 в IL-6, причем указанный химерный белок имеет последовательность, показанную на фиг. 3, где трипептид последовательности Е-F-M в положениях 357-359 на фиг. 3 заменен указанной пептидной последовательностью, состоящей из 13 аминокислот. 8. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по п.1, обозначаемый здесь как IL-6/sIL-6R, который включает полную последовательность IL-6,предшествующую последовательности SIL-6R,и пептидный линкер, состоящий из 14 аминокислот последовательности G-G-G-G-D-P-G-GG-G-G-G-P-G (SEQ ID6), между С-концевымMet-212 в IL-6 и Val-112 в sIL-6R, причем указанный химерный белок имеет последовательность, показанную на фиг. 11. 9. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по любому из пп.1-8, который продуцируют в клетках млекопитающих в полностью процессированной форме. 10. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по п.9,который продуцируют в клетках человека. 39 11. Химерный белок sIL-6R/IL-6 по п.9,который продуцируют в клетках яичника китайского хомячка (СНО). 12. Последовательность ДНК, кодирующая химерный белок sIL-6R/IL-6 по любому из пп.111. 13. ДНК-вектор, включающий последовательность ДНК, кодирующую химерный белокsIL-6R/IL-6 по любому из пп.1-11, причем указанный вектор пригоден для экспрессии указанного химерного белка в клетках млекопитающих. 14. ДНК-вектор по п.13, который пригоден для экспрессии указанного химерного белка в клетках человека. 15. ДНК-вектор по п.13, который пригоден для экспрессии указанного химерного белка в клетках СНО. 16. ДНК-вектор по любому из пп.13-15,который является плазмидой, обозначаемый здесь как pcDNAsIL-6R/IL-6, которая включает вектор pcDNA3, содержащий последовательность ДНК, кодирующую химерный белок sIL6R/IL-6 под контролем промотора цитомегаловируса (CMV). 17. Трансформированные клетки млекопитающих, содержащие ДНК-вектор по любому из пп.13-16, которые способны экспрессировать последовательность химерного белка sIL-6R/IL6, носителем которой является указанный вектор, полностью процессировать экспрессированный белок и секретировать его в культуральную среду, в которой выращиваются указанные клетки. 18. Трансформированные клетки по п.17,которые являются вышеописанными клетками почки эмбриона человека 293 (НЕК 293), трансфецированными вектором pcDNAsIL-6R/IL-6,причем указанные клетки способны экспрессировать химерный белок sIL-6R/IL-6, полностью процессировать указанный белок и секретировать указанный белок в культуральную среду, в которой указанные клетки выращиваются в виде гликопротеина с молекулярной массой около 85 кДа. 19. Способ получения химерного белка по любому из пп.1-11, включающий выращивание трансформированных клеток по п.17 или 18 в условиях, пригодных для экспрессии, процессирования и секреции указанного белка в культуральную среду, в которой выращиваются указанные клетки; и очистку указанного белка из указанной культуральной среды. 20. Способ по п.19, где очистку выполняют иммуноаффинной хроматографией, используя моноклональные антитела, специфичные в отношении sIL-6R. 40 21. Применение химерного белка sIL6R/IL-6 по любому из пп.1-11, его солей и смесей в качестве ингибитора раковых клеток. 22. Применение химерного белка по любому из пп.1-11 в качестве ингибитора чрезвычайно злокачественных меланомных клеток. 23. Применение химерного белка sIL6R/IL-6 по любому из пп.1-11, его солей и смесей в качестве активного ингредиента для стимуляции приживаемости гемопоэтических клеток человека при трансплантации костного мозга. 24. Применение химерного белка sIL6R/IL-6 по любому из пп.1-11, его солей и смесей в качестве активного ингредиента для защиты печени от гепатотоксических веществ. 25. Применение химерного белка sIL6R/IL-6 по любому из пп.1-11, его соли и смеси для получения лекарственного средства для лечения рака у млекопитающих путем ингибирования раковых клеток. 26. Применение химерного белка sIL6R/IL-6 по любому из пп.1-11, его соли и смеси для получения лекарственного средства для улучшения трансплантации костного мозга путем стимуляции приживаемости гемопоэтических клеток человека в трансплантанте костного мозга. 27. Применение химерного белка sIL6R/IL-6 по любому из пп.1-11, его соли и смеси для получения лекарственного средства для усиления гемопоэза. 28. Применение химерного белка sIL6R/IL-6 по любому из пп.1-11, его соли и смеси для получения лекарственного средства для лечения заболеваний печени. 29. Применение химерного белка sIL6R/IL-6 по любому из пп.1-11, его соли и смеси для получения лекарственного средства для лечения неврологических нарушений. 30. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента химерный белок sIL-6R/IL-6 по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. 31. Фармацевтическая композиция по п.30 для лечения рака. 32. Фармацевтическая композиция по п.30 для улучшения трансплантации костного мозга. 33. Фармацевтическая композиция по п.30 для усиления гемопоэза. 34. Фармацевтическая композиция по п.30 для лечения заболеваний печени. 35. Фармацевтическая композиция по п.30 для лечения неврологических нарушений.