Способ контроля количества сиаловой кислоты, присутствующей в олигосахаридной боковой цепи гликопротеина, способ получения химерного гликопротеина, препарат, содержащий химерный гликопротеин, и терапевтическая композиция.

1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способам контроля содержания сиаловой кислоты в гликопротеинах, продуцируемых в культуре клеток млекопитающего. Изобретение относится к способам, позволяющим увеличивать и уменьшать содержание сиаловой кислоты в гликопротеинах, продуцируемых в культуре клеток млекопитающего. Кроме того, изобретение относится к способам получения химерного гликопротеина, состоящего из рецептора фактора некроза опухоли (TNFR) и иммуноглобулина(Ig), а также к новым препаратам на основеTNFR-IgG1 и к их применению для диагностики и лечения различных воспалительных заболеваний и иммунных расстройств. Уровень техники В настоящее время различия в характерах гликозилирования гликопротеинов, полученных рекомбинантным путем, являются предметом повышенного интереса ученых, поскольку предполагается, что полученные рекомбинантные протеины могут найти применение в медицине для профилактики и терапии болезней. Олигосахаридные боковые цепи гликопротеинов оказывают воздействие на функцию протеинов (Wittwer А. и Howard S.C., (1990) Biochem., 29: 4175-4180), на внутримолекулярные взаимодействия между частями гликопротеина,определяющие конформацию, и предопределяют третичную структуру гликопротеина (Hart,(1992) Curr. Op. Cell Biol, 4: 1017-1023; Goochee и др., (1991) Biotechnology, 9: 1347-1355; ParekhR.B. (1991) Curr. Op. Struct. Biol, 1:750-754). Олигосахариды также могут служить для ориентации данного полипептида по отношению к определенным структурам с помощью специфичных клеточных углеводных рецепторовImai Y. и др., (1993) Nature 361: 555-557). Концевой компонент - сиаловая кислота - в олигосахаридной боковой цепи гликопротеина оказывает воздействие на абсорбцию, период полувыведения из сыворотки и на клиренс из сыворотки, а также на физические, химические и иммуногенные свойства гликопротеина (Parekh R.B.,см. выше; Varki А., (1993) Glycobiology, 3: 97100; Paulson J., (1989) TIBS, 14: 272-276;Goochee и др; (1991) Biotechnology, 9: 13471355; Kobata A., (1992) Eur. J. Biochem., 209: 483-501). Следовательно, важно поддерживать определенное содержание сиаловой кислоты в гликопротеинах, в частности в таких протеинах,которые предназначены для применения в качестве терапевтических средств. Большое внимание было уделено факторам, влияющим на гликозилирование в процессе продуцирования рекомбинантного протеина, 001215 2 таким, как способ выращивания (адгезивный или суспензионный), наличие в составе среды фетальной бычьей сыворотки, плотность среды,насыщение кислородом, значение рН, схемы очистки и т.п. (Werner R. и Noe W. (1993) DrugFrontiers in Bioprocessing II, под ред. Todd и др.,(1992) American Chemical Society, стр. 199-240; патент США 5096816; Chotigeat W., (1994) Cytotech., 15:217-221). Несколько групп исследователей изучали влияние параметров среды, при культивировании на которой продуцируются рекомбинантные протеины, и, в частности, воздействие состава среды на продуцирование рекомбинантных протеинов (Park и др., (1992)Gros и др., (1985) Lymph. Res., 4(3): 221-227). Известно, что добавление алкановых кислот, таких, как масляная кислота, вызывает неустойчивую экспрессию чужеродной ДНК в рекомбинантной культуре клеток (Prasad и Sinha(1976) In Vitro, 12:125-132; заявка на патент Японии 62-18936; заявка на патент Японии 55150440; Klehr и др., (1992) Biochem., 31: 32223229; Gorman и Howard (1983) Nucleic Acid Res.,11: 7631-7648). Однако бутират натрия по разному действует на экспрессию гена в зависимости от линий клеток и составов среды (D'Anna и др., (1980) Biochem., 19: 2656-2671; HagopianH.K., (1977) Cell, 12: 855-860) и на продуцирование протеина (Milhaud (1980) J. Cell Physiol. 104: 163-170; заявка на патент ВеликобританииGB 2122207A), позволяя предположить, что бутират может модифицировать (Yuan и др.,(1985) J. Biol. Chem., 3778-3783) или ингибировать экспрессию определенных генов (Yuan и др., см. выше). В европейской заявке 0239292 В 1 описан способ усиления продуцирования протеина в присутствии алкановой кислоты, такой, как масляная кислота или ее соли. Однако, в литературе имеется небольшое количество данных о подборе соответствующих концентраций такой добавки, но, однако, отсутствуют данные о воздействии добавки на гликозилирование протеина. В других публикациях описано, что добавление низких концентраций (0-1,5 мМ) бутирата натрия в среду для культивирования клеток, с целью увеличения удельной клеточной продуктивности, приводит к сопутствующему увеличению количества кислых гликоформ (что соответствует увеличению содержания сиаловой кислоты) получаемого рекомбинантного протеина (Chotigeat и др., (1994) Cytotech. 15: 217221). 3 Несколько групп исследователей изучали воздействия осмоляльности на клеточный рост и продуцирование полипептида (Ozturk иWO 89/04867). Были предложены различные диапазоны осмоляльности для роста клеток или для продуцирования полипептида. В целом, осмоляльность среды для культуры клеток увеличивают с помощью добавления NaCl или аминокислот. Стресс, связанный с окружающей средой, например, увеличение концентраций солей, в некоторых случаях приводит к увеличению продуцирования клеточного продукта. Было высказано предположение о том, что повышенная экспрессия в культурах клеток млекопитающего таких продуктов, как протеин млекопитающего, может быть достигнута с помощью стресса, вызванного растворенными веществами, например, путем добавления в питательную среду соли, молочной кислоты, аммиака (международная заявка WO 89/04867). Такие стрессы обычно ингибируют рост, но способствуют удельной клеточной продуктивности. Другие исследователи обсуждали воздействие концентрации глюкозы на рост клеток и/или продуцирование полипептида в рекомбинантной культуре клеток. См., например, Park и др., (1992) Biotechnology and Bioengineering, 40: 686-696; Huang и др., (1991) Journal of Biotechnology, 18: 161-162; ЕР 387840; Reuveny и др.,(1986) Journal of Immunological Methods, 86:5359; Fine и др., (1976) In Vitro, 12(10): 693-701;DECHEMA Biotechnol. Conf., 3: 615-618; заявка на патент Японии JP 1-101882; патент США 3926723; WO 87/00195; и Fleischaker Jr., Ph.D.Thesis, Massachusetts Institute of Technology, стр. 196-229 (июнь 1982). Однако в предыдущих исследованиях не было изучено воздействие различных параметров процесса на содержание сиаловой кислоты в зрелом протеине, т.е. фактора в продуцировании гликопротеина, который равноценен клиническому успеху. Настоящее изобретение относится к способам контроля содержания сиаловой кислоты,присутствующей в олигосахаридной боковой цепи гликопротеинов, продуцируемых культурой клеток млекопитающего. Краткое изложение сущности изобретения Согласно изобретению было установлено,что определенные параметры процесса при 4 культивировании клеток млекопитающего оказывают воздействие на удельную клеточную продуктивность, а также на степень и тип гликозилирования продуцируемых протеинов. В частности, было обнаружено, что определенные факторы, усиливающие удельную клеточную продуктивность, оказывают обратное воздействие на содержание сиаловой кислоты в продуцируемом протеине. Таким образом, согласно настоящему изобретению предлагаются различные способы культивирования клеток, способствующие увеличению определенных гликоформ гликопротеинов, продуцируемых в культуре клеток млекопитающего. Предлагаемый согласно изобретению способ контроля количества сиаловой кислоты,присутствующей в олигосахаридной боковой цепи гликопротеина, продуцируемого культурой клеток млекопитающего, заключается в изменении удельной продуктивности указанной культуры, которое осуществляют следующим образом: во время переходной фазы добавляют к культуре клеток алкановую кислоту с 3-6 атомами углерода или ее соли в интервале концентраций, составляющем примерно от 0,1 мМ до 20 мМ, устанавливают осмоляльность клеточной культуры в интервале значений, составляющем примерно от 250 мОсмолей до 600 мОсмолей, устанавливают температуру культивирования, составляющую приблизительно, от 30 до 35 С, и поддерживают указанные параметры на стадии продуцирования гликопротеина. Для увеличения количества сиаловой кислоты в олигосахаридной боковой цепи гликопротеина, продуцируемого культурой клеток млекопитающих, обычно уменьшают удельную продуктивность культуры клеток следующим образом: во время переходной фазы добавляют к культуре клеток алкановую кислоту с 3-6 атомами углерода или ее соль в интервале концентраций, составляющем примерно от 0,1 мМ до 6 мМ, устанавливают осмомоляльность клеточной культуры в интервале значений, составляющем примерно от 300 мОсмолей до 450 мОсмолей,устанавливают температуру культивирования,составляющую приблизительно от 30 до 35 С, и поддерживают указанные параметры на стадии продуцирования гликопротеина. Предпочтительно культура клеток млекопитающих представляет собой культуру клеток яичника китайского хомячка (СНО), а соль алкановой кислоты представляет собой бутират натрия. При этом предпочтительно, чтобы продуцируемый культурой клеток гликопротеин представлял собой гликопротеин млекопитающего. Указанный гликопротеин обычно представляет собой химерный гликопротеин, со 5 стоящий из рецептора фактора некроза опухоли человека и иммуноглобулина G1. Культура клеток как правило представляет собой линию dp12.CHO, трансфектированную вектором, включающим кДНК, кодирующую химерный протеин, состоящий из растворимой формы рецептора фактора некроза опухоли человека типа 1 и иммуноглобулина G1 (TNFR1IgG1). Изобретение также относится к способу получения химерного протеина, состоящего из растворимой формы рецептора фактора некроза опухоли человека типа 1 и иммуноглобулина G1(TNFR1-IgG1) и имеющего пониженное количество сиаловой кислоты в олигосахаридной боковой цепи. Способ заключается в том, что осуществляют следующие стадии: а) культивируют клетки СНО, экспрессирующие химерный гликопротеин TNFR1-IgG1 при температуре около 37 С, в условиях, обеспечивающих максимальный рост клеток; б) во время переходной фазы добавляют к культуре клеток бутират натрия в интервале концентраций примерно от 6 мМ до 12 мМ, устанавливают осмоляльность клеточной культуры в интервале значений примерно от 450 мОсмолей до 600 мОсмолей, устанавливают температуру культивирования приблизительно от 30 С до 35 С, поддерживают указанные параметры на стадии продуцирования гликопротеина, выделяют гликопротеин из культуральной среды и очищают. (способ А) Изобретение также относится к другому способу получения химерного протеина, состоящего из растворимой формы рецептора фактора некроза опухоли человека типа 1 и иммуноглобулина G1 (TNFR1-IgG1) и имеющего повышенное количество сиаловой кислоты в олигосахаридной боковой цепи. Указанный способ заключается в том, что осуществляют следующие стадии: а) культивируют клетки млекопитающих,экспрессирующие химерный гликопротеинTNFR1-IgG1 при температуре около 37 С, в условиях обеспечивающих максимальный рост клеток; б) во время переходной фазы добавляют к культуре клеток бутират натрия в интервале концентраций, составляющем примерно от 1 мМ до 6 мМ, устанавливают осмоляльность клеточной культуры в интервале значений, составляющем примерно от 300 мОсмолей до 450 мОсмолей, устанавливают температуру культивирования, составляющую приблизительно от 30 С до 35 С, поддерживают указанные параметры на стадии продуцирования гликопротеина, выделяют гликопротеин из культуральной среды и очищают (способ Б). Предпочтительно клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО. Клетки СНО представляют собой обычно линию dp12.CHO. 6 Таким образом, предлагаемый способ контроля содержания сиаловой кислоты, присутствующей в олигосахаридной боковой цепи гликопротеина, продуцируемого культурой клеток млекопитающего, при изменении скорости продуцирования гликопротеина в фазе продуцирования этого протеина культурой клеток приводит к изменениям в содержании сиаловой кислоты в зрелом протеине. В частности, увеличение удельной клеточной продуктивности во время фазы продуцирования гликопротеина приводит к уменьшению содержания сиаловой кислоты в зрелом протеине. И, наоборот, снижение удельной клеточной продуктивности приводит к увеличению содержания сиаловой кислоты в зрелом протеине. Изобретение относится к изменению удельной клеточной продуктивности при использовании в качестве клетки-хозяина, которой является клетка млекопитающего, во время фазы продуцирования протеина в культуре клеток млекопитающего путем контроля за факторами,оказывающими воздействие на удельную клеточную продуктивность. В соответствии с одним из вариантов контролируют концентрацию факторов, которые усиливают транскрипцию ДНК, удельную клеточную продуктивность,поддерживая осмоляльность культуры клеток в определенных пределах. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фактором, усиливающим транскрипцию ДНК, является алкановая кислота или ее соль, такая, как бутират натрия, в концентрации от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 20 мМ, при поддержании осмоляльности культуры клеток приблизительно от 250 до 600 мОсмолей. И температуры культивирования клеток приблизительно на уровне 30-37 С, обычно на уровне 3035 С. Способ увеличения содержания сиаловой кислоты в зрелом гликопротеине, продуцируемом культурой клеток млекопитающего, включающий поддержание пониженной удельной клеточной продуктивности, заключается в контроле всех указанных выше параметров процесса, возможно совместно с другими параметрами,известными в данной области техники. В соответствии с предпочтительным вариантом во время переходной фазы к культуре клеток добавляют алкановую кислоту с 3-6 атомами углерода или ее соль в интервале концентраций, составляющем приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 6 мМ, при одновременном поддержании осмоляльности культуры клеток на уровне приблизительно 300-450 мОсмолей, что приводит к получению протеина с увеличенным содержанием сиаловой кислоты. Способ уменьшения содержания сиаловой кислоты в зрелом гликопротеине, продуцируемом культурой клеток млекопитающего, включает увеличение удельной клеточной продуктивности культуры клеток. В предпочтительном 7 варианте удельную клеточную продуктивность повышают с помощью процесса культивирования клеток, включающего любой из следующих способов: во время переходной фазы к культуре клеток добавляют алкановую кислоту или ее соль, преимущественно бутират натрия, в интервале концентраций от приблизительно 6 мМ до приблизительно 12 мМ при поддержании осмоляльности культуры клеток на уровне приблизительно 450-600 мОсмолей. Согласно изобретению предлагается метод культивирования клеток с использованием трех фаз культуры клеток. Таким образом, изобретение относится к способу контроля содержания гликопротеина,продуцируемого культурой клеток млекопитающего, включающему стадии культивирования клетки млекопитающих, экспрессирующей протеин в фазе роста, в течение такого периода времени и в таких условиях, чтобы обеспечить максимальный рост клеток. В соответствии с этим за фазой роста следует переходная фаза, во время которой выбирают и устанавливают параметры культивирования клеток, необходимые для получения требуемого количества сиаловой кислоты в зрелом гликопротеине. За переходной фазой следует фаза продуцирования протеина культурой клеток, во время которой поддерживают параметры, выбранные в переходной фазе,получают и выделяют целевой продукт в виде гликопротеина. Изменение удельной клеточной продуктивности во время фазы продуцирования культуры клеток путем добавления во время переходной фазы в культуру клеток алкановой кислоты или ее соли в концентрации от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 20 мМ и поддержание осмоляльности культуры клеток на уровне приблизительно 250-600 мOсмолей,необязательно в сочетании этих параметров друг с другом, приводит к получению протеина с разными количествами сиаловой кислоты. Изобретение также относится к способу контроля количества сиаловой кислоты, присутствующей в химерном протеине, включающем рецептор растворимого фактора некроза опухоли типа I (TNPR1) и иммуноглобулин G1 (IgG1)[TNFR1-IgG1]. Согласно изобретению было установлено, что при определенных условиях культивирования в фазе продуцирования могут быть получены новые препараты на основе гликоформы TNFR1-IgG1, которые проявляют требуемые свойства продолжительного клиренса из крови, сохраняя при этом выраженную функциональную активность. Продолжительный период полувыведения этого вещества при сохранении его функциональной активности позволяет использовать упрощенное введение необходимой дозы в виде болюса и способствует эффективности in vivo полученного гликопротеина, что позволяет применять более низкие дозируемые формы гликопротеина. 8 В соответствии с этим способом получают молекулу химерного гликопротеина TNFR1IgG1, которая содержит увеличенное количество остатков сиаловой кислоты. Параметры культивирования клеток в фазе продуцированияTNFR1-IgG1 выбирают таким образом, чтобы получить требуемое количество сиаловой кислоты. В предпочтительном варианте в фазе продуцирования присутствует бутират натрия в концентрации от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 6 мМ, а осмоляльность поддерживают на уровне приблизительно 300-450 мОсмолей. В более предпочтительном варианте концентрация бутирата натрия составляет приблизительно 1 мМ, а осмоляльность поддерживают на уровне приблизительно 350-400 мОсмолей. Настоящее изобретение относится также к препарату на основе химерного гликопротеинаTNFR1-IgG1, полученному с помощью способа Б по настоящему изобретению, в котором использовали для культивирования клетки млекопитающих, представляющих собой линиюdp12.CHO. В соответствии с этим предлагается препарат, включающий TNFR1-IgG1, причем значение рI препарата находится в диапазоне приблизительно 5,5-7,5. Предлагается также препарат, содержащий химерный гликопротеин TNFRl-IgG1, полученный в соответствии со способом А. Изобретение также относится к терапевтической композиции, содержащей химерный гликопротеин TNFR1-IgG1, полученный в соответствии со способом Б, и фармацевтически приемлемый наполнитель. Указанная композиция пригодна для лечения патологических состояний, вызываемых TNF. Предлагается также препарат, содержащий химерный гликопротеин TNFR1-IgG1 полученный в соответствии со способом А или Б, в котором в молекуле TNFR1-IgG1 молярное отношение сиаловой кислоты к белку составляет приблизительно 4-7, предпочтительно приблизительно 5-6. Предлагается согласно изобретению препарат, содержащий химерный гликопротеинTNFR1-IgG1, полученный в соответствии со способом Б, в котором в молекуле TNFR1-IgG1 содержится приблизительно 1-2 моля незащищенных остатков N-ацетилглюкозамина на моль белка. Изобретение также относится к препарату содержащему химерный гликопротеин TNFR1IgG1 полученному в соответствии со способом Б, причем в молекуле TNFR1-IgG1 молярное отношение сиаловой кислоты иNацетилглюкозамина составляет приблизительно от 0,35 до 0,5, предпочтительно молярное отношение сиаловой кислоты иNацетилглюкозамина составляет приблизительно от 0,39 до 0,45. Описание чертежей 9 На фиг. 1 А и 1 Б проиллюстрирован метод,применяемый для вычисления удельной продуктивности при типичном способе культивирования клеток в фазе продуцирования. Удельная продуктивность может быть выражена в виде функции количества жизнеспособных клеток (интеграл по времени (в днях) от жизнеспособных клеток), как показано на фиг. 1 А; либо объема клеточной массы (PCV), как показано на фиг. 1 Б. Удельная скорость продуцирования дана с 90%-ным доверительным интервалом. На фиг. 2 А и 2 Б показана корреляция между удельной продуктивностью, определенной на основе интеграла по времени (в днях) от жизнеспособных клеток (фиг. 2 А) и объема клеточной массы (PCV) (фиг. 2 Б) во время фазы продуцирования, и содержанием сиаловой кислоты(NANA) в полученном продукте. Представлены данные для 9 различных процессов (А-И). Точки на графике представляют собой данные независимых процессов продуцирования, описанных в таблице I. Подробное описание изобретенияI. Определения. В контексте данного описания углеводородные фрагменты следует рассматривать в соответствии с номенклатурой, обычно применяемой для описания олигосахаридов. Обзор по химии углеводов, в котором использована эта номенклатура, опубликован Hubbard и Ivatt,(1981) Ann. Rev. Biochem., 50: 555-583. Эта номенклатура включает, например, обозначениеMan для маннозы; GlcNAc для 2-Nацетилглюкозамина; Gal для галактозы; и Glc для глюкозы. Сиаловые кислоты описаны в соответствии с аббревиатурой NeuNAc для 5-Nацетилнейраминовой кислоты и NeuNGc для 5 гликолилнейраминовой кислоты (J. Biol. Chem.,1982, 257: 3347; J. Biol. Chem., 1982, 257: 3352)."Осмоляльность" представляет собой меру осмотического давления частиц растворенного вещества в водном растворе. Частицы растворенного вещества включают как ионы, так и неионизированные молекулы. Осмоляльность выражают в виде концентрации осмотически активных частиц (т.е. осмолей), растворенных в 1 кг раствора (1 мОсмоль/кг Н 2 О при 38 С эквивалентен осмотическому давлению 19 мм рт.ст.). В противоположность этому "осмолярность" обозначает количество частиц растворенного вещества, растворенных в 1 л раствора. В контексте настоящего описания аббревиатура"мОсмоль" обозначает количество в "миллиосмолях/кг раствора". В контексте настоящего описания понятие"гликопротеин" обычно относится к пептидам и протеинам (белкам), включающим приблизительно более десяти аминокислот и по крайней мере одну олигосахаридную боковую цепь. Гликопротеины могут быть гомологичными клетке-хозяину, или предпочтительно они являются гетер ологичными, т.е. чужеродными по 10 отношению к используемой клетке-хозяину,как, например, в случае протеина человека, продуцируемого клеткой яичника китайского хомячка. Предпочтительно используют гликопротеины млекопитающего (гликопротеины, первоначально выделенные из организма млекопитающего), более предпочтительно такие, которые непосредственно выделяются в питательную среду. Примеры гликопротеинов млекопитающего включают такие молекулы, как цитокины и их рецепторы, а также химерные протеины, включающие цитокины или их рецепторы, в том числе, например, фактор некроза опухоли альфа и бета, их рецепторы (TNFR-1; ЕР 417563, публикация 20 марта 1991; и TNFR-2; ЕР 417014, публикация 20 марта 1991) и их производные; ренин; гормон роста, в том числе гормон роста человека и бычий гормон роста; фактор, высвобождающий гормон роста; паратиреоидный гормон; тиреотропный гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие, как фактор VIIIC,фактор IX, тканевый фактор и фактор фон Виллебрандса; факторы, препятствующие свертыванию крови, такие, как протеин С; предсердный натриуретический фактор; поверхностноактивное вещество, образующее мономолекулярный слой на альвеолярной поверхности легких; активатор плазминогена, такой, как урокиназа или активатор плазминогена мочи человека или тканеспецифический активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; энкефалиназа; RANTES(контролирующий активность экспрессии и секреции у нормальных Т-клеток); воспалительный протеин макрофага человека (MIP-I-альфа); сывороточный альбумин, такой, как сывороточный альбумин человека; муллериан-ингибирующее вещество; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный пептид, связанный с гонадотропином; микробный протеин, такой,как бета-лактамаза; ДНКаза; ингибин; активин; сосудистый эндотелиальный фактор роста(VEGF); факторы роста рецепторов гормонов; интегрин; протеин А или D; ревматоидные факторы; нейротропный фактор, такой, как костный нейротропный фактор (BDNF), нейротропин-3, 4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нерва, такой, как NGF-P; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробласта, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой, как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-1, TGF-2, TGF-3,TGF-4 или TGF-5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); связывающие протеины инсулиноподобного фактора роста des (13) -IGF-I (IGF-I мозга); CD-протеины, такие, какCD-3, CD-4, CD-8 и CD-19; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; морфогенетический протеин кости (BMP); интерферон, такой, как интерферон-альфа, -бета и-гамма; колониестимулирующие факторы (CSF),например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, от IL-1 до IL-10; супероксиддисмутаза; рецепторы Т-клеток; протеины поверхности мембраны; ускоряющий разложение фактор; вирусный антиген, такой как, например, фрагмент оболочки вируса СПИД; транспортные протеины; "хоминг"-рецепторы; аддрессины; регуляторные протеины; антитела; химерные протеины, такие, как иммуноадгезины, и фрагменты любых перечисленных выше полипептидов. Понятие "среда для культуры клеток" и"культуральная среда" относится к питательному раствору, применяемому для роста клеток млекопитающего. Эта среда обычно содержит,по крайней мере, один компонент, выбранный из одной или нескольких следующих категорий: 1) источник энергии, обычно в форме углевода, такого, как глюкоза; 2) все незаменимые аминокислоты и обычно основной набор из двадцати аминокислот плюс цистеин; 3) витамины и/или другие органические соединения, необходимые в низких концентрациях; 4) свободные жирные кислоты; и 5) микроэлементы, причем под понятием"микроэлементы" понимают неорганические соединения или встречающиеся в естественных условиях элементы, которые обычно требуются в очень низких концентрациях, обычно близких к микромолярному уровню. Питательный раствор необязательно может быть дополнен одним или несколькими компонентами, выбранными из одной из следующих категорий: 1) гормоны и другие факторы роста, такие,как, например, инсулин, трансферин и эпидермальный фактор роста; 2) соли и буферы, такие, как, например,включающие кальций, магний и фосфат; 3) нуклеозиды и основания, такие, как, например, аденозин, тимидин и гипоксантин; и 4) белковые и тканевые гидролизаты. Понятие "клетка-хозяин, представляющая собой клетку млекопитающего", "клеткахозяин", "клетка млекопитающего" и т.п. относится к линиям клеток из млекопитающих, которые при помещении их либо в монослойную культуру, либо в суспензионную культуру способны расти и выживать в среде, содержащей соответствующие питательные вещества и факторы роста. Необходимые факторы роста для конкретной линии клеток легко определить эмпирическим путем, не проводя большого количества экспериментов, на основе данных, изложенных, например, в Mammalian Cell CultureBarnes и Sato, (1980) Cell, 22: 649. Обычно клетки способны экспрессировать и секретировать большие количества определенного представляющего интерес гликопротеина в культуральную среду. Примеры пригодной культуры клеток, которыми являются клетки млекопитающих, в контексте настоящего изобретения включают клетки яичника китайского хомячка/DHFR (СНО, Urlaub и Chasin, Proc. Natl. Acad.dp12.CHO (EP 307247, публикация 15 марта 1989); линию почки обезьяны CV1, трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию почки эмбриона человека (293-клетки или 293-клетки, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham и др., J. Gen.Virol., 36: 59 [1977]); клетки почки детеныша хомячка (ВНК, ATCC CCL 10); клетки Сертоли мыши (ТМ 4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251[1980]); клетки почки обезьяны (CV1, ATCCCCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, АТТС CRL-1587); клетки цервикальной карциномы человека (HELA,ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK,ATCC CCL 34); клетки печени крысы-буйвола(BRL ЗА, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Нер G2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, ATCCFS4-клетки; и линию гепатомы человека (НерG2). Предпочтительные клетки-хозяева включают клетки яичника китайского хомячка/DНFR (СНО, Urlaub и Chasin, Proc. Natl. Acad.dp12.CHO (EP 307247, публикация 15 марта 1989). Под понятием "пептон" в контексте настоящего изобретения понимают добавку к среде, представляющую собой сильно гидролизованный животный протеин. Источником этого протеина могут быть животные отходы со скотобоен, очищенный желатин или растительный материал. Протеин обычно гидролизуют, используя кислоту, нагревание или различные ферментные препараты. Предпочтительными пептонными смесями являются, например,"Primatone RL" и "Primatone HS" (обе являются коммерчески доступными (фирма Sheffield, Великобритания."Удельная клеточная продуктивность","удельная скорость продуцирования протеина клеткой" и т.п. в контексте настоящего описания обозначает удельную, т.е. в пересчете на клетку или на единицу клеточной массы или объема, скорость экспрессии продукта. Удельную клеточную продуктивность измеряют, например, в граммах протеина, продуцируемого клеткой в день. Удельную клеточную продук 13 тивность удобно измерять в соответствии со следующим интегральным методом:P=qpXdt,где qp обозначает константу удельной клеточной продуктивности, Х обозначает количество клеток или эквиваленты объема клеток или массы клеток, a dP/dt обозначает скорость продуцирования протеина. Следовательно, величина qp может быть получена из графика зависимости концентрации продукта от интеграла по времени от жизнеспособных клеток (Xdt представляет собой "интеграл по времени (в днях) от жизнеспособных клеток"). В соответствии с этой формулой, если построить график зависимости количества произведенного гликопротеинового продукта от интеграла по времени (в днях) от жизнеспособных клеток, то тангенс угла наклона будет равен удельной скорости экспрессии продукта клеткой. Жизнеспособные клетки можно определить различными измерениями,например, с помощью измерений биомассы,скорости поглощения O2, лактатдегидрогеназы(LDH), объема клеточной массы или мутности."Фаза роста" культуры клеток относится к периоду экспоненциального роста клеток (логарифмическая фаза), во время которой клетки обычно быстро делятся. Во время этой фазы клетки культивируют в течение определенного периода времени, обычно составляющего 1-4 дня, и в таких условиях, при которых происходит максимальный клеточный рост. Определение цикла роста для клетки-хозяина может быть осуществлено для конкретной предполагаемой клетки-хозяина без проведения большого количества экспериментов. "Период времени и такие условия, при которых происходит максимальный клеточный рост" и т.п. относятся к таким условиям культивирования, в отношении которых установлено, что для конкретной линии клеток они являются оптимальными для роста и деления клеток. Во время фазы роста клетки культивируют в питательной среде, содержащей необходимые добавки, обычно при температуре 30-40 С в увлажненной контролируемой атмосфере, при которой достигается оптимальный рост конкретной линии клеток. Клетки выращивают в фазе роста в течение периода времени приблизительно от одного до четырех дней,обычно от двух до трех дней."Переходная фаза" культуры клеток относится к периоду времени, в течение которого задаются условия культивирования для фазы продуцирования. Во время переходной фазы факторы окружающей среды, такие как температура культивирования клеток, осмоляльность среды и т.п., сдвигают от условий, характерных для роста, к условиям, характерным для продуцирования."Фаза продуцирования протеина" культурой клеток относится к периоду времени, в те 001215 14 чение которого рост клеток вышел на плато. Во время фазы продуцирования закончен логарифмический рост клеток, а основным является продуцирование протеина. Во время этого периода времени среду обычно дополняют с целью поддержать непрерывное продуцирование протеина и получить требуемый продукт в виде гликопротеина. Понятие "экспрессия" или "экспрессировать" в контексте настоящего описания относится к транскрипции и трансляции, происходящим в клетке-хозяине. Уровень экспрессии продукта гена в клетке-хозяине может быть определен на основе либо количества соответствующей мРНК, присутствующей в клетке, либо количества протеина, кодируемого геном, который продуцируется клеткой. Например, мРНК,транскрибируемую исходя из гена, целесообразно количественно оценивать с помощью нозерн-гибридизации (см. Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, стр. 7.37.57, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Протеин, кодируемый геном, может быть количественно оценен либо на основе анализа биологической активности протеина, либо с применением методов, которые не зависят от такой активности, такими, как вестерн-блоттинг или радиоиммуноанализ с использованием антител,способных вступать во взаимодействие с протеином (см. Sambrook и др., Molecular Cloning:Harbor Laboratory Press, 1989). Под алкановой кислотой или ее солью понимают алкановую кислоту с прямой или разветвленной цепью с 3-6 атомами углерода, или ее соль. Однако алкановая кислота может иметь и до десяти атомов углерода. Примером алкановой кислоты является масляная кислота, а соответствующая ей соль представляет собой бутират натрия. Используемая кислота или ее соль могут быть также ненасыщенными.II. Методы культивирования клеток. Согласно изобретению было установлено,что факторы, увеличивающие удельную клеточную продуктивность во время фазы продуцирования гликопротеина культурой клеток млекопитающего, оказывают обратное воздействие на содержание сиаловой кислоты в полученном гликопротеине. Поскольку экспрессируемые протеины, содержащие один или несколько остатков сиаловой кислоты на один сложный олигосахаридный фрагмент, характеризуются invivo более длительным временем клиренса, то время клиренса продуцируемого гликопротеина можно изменять в широких пределах, варьируя уровень сиалилирования препарата в целом. Настоящее изобретение относится к способам контроля степени сиалилирования гликопротеина, продуцируемого культурой клеток млекопитающего. По методу, изложенному в данном описании, можно точно определить параметры процесса, которые обеспечивают требуемое со 15 держание сиаловой кислоты в гликопротеине,продуцируемом культурой клеток млекопитающего. В соответствии с настоящим изобретением клетки млекопитающего культивируют для получения высвобождаемого продукта-гликопротеина. Общее содержание сиаловой кислоты в гликопротеине контролируют, изменяя параметры культивирования клеток, оказывающие воздействие на удельную клеточную продуктивность. Факторы, оказывающие воздействие на удельную клеточную продуктивность, хорошо известны в данной области техники и включают, но не ограничены ими, факторы, которые оказывают воздействие на количество копий ДНК/РНК, факторы, которые оказывают воздействие на РНК, такие, как факторы, стабилизирующие РНК, питательные вещества и другие добавки к среде, концентрацию энхансеров транскрипции, осмоляльность культуральной среды, температуру и рН культивирования клеток и т.п. В соответствии с настоящим изобретением регулирование этих факторов, по отдельности или в комбинации, для увеличения удельной клеточной продуктивности приводит к получению протеина с пониженным содержанием сиаловой кислоты. Регулирование этих факторов, по отдельности или в комбинации, для уменьшения удельной клеточной продуктивности приводит к получению зрелого протеина с повышенным содержанием сиаловой кислоты. Ниже изобретение описано со ссылкой на различные, в том числе хорошо известные, способы и принципы культивирования клеток. В соответствии с настоящим изобретением клетки млекопитающего культивируют с получением целевого гликопротеинового продукта. При выборе клетки-хозяина для получения гликопротеина согласно изобретению важно учитывать, что различные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы трансляционного и посттрансляционного процессинга и модификации (например, гликозилирование, расщепление) экспрессируемого протеина. С целью обеспечить возможность осуществления требуемых посттрансляционных модификаций должны быть выбраны соответствующие линии клеток. В альтернативном варианте клетки-хозяева могут быть модифицированы таким образом, чтобы экспрессировать требуемый генный продукт, необходимый для специфической посттрансляционной модификации. В частности, клетки млекопитающего, экспрессирующие требуемый протеин, должны также экспрессировать ферменты, или же они могут быть видоизменены таким образом, чтобы экспрессировать конкретные ферменты, которые при соответствующих условиях, приведенных в данном описании, могут осуществлять inN-и О-связанных углеводов, таких, как описанные выше у Hubbard и Ivan для N-сцепленных олигосахаридов. Ферменты необязательно включают олигосахарилтрансферазу, альфаглюкозидазу I, альфа-глюкозидазу II, ER-альфа(1,4)галактозилтрансферазу. Кроме того, клетка-хозяин может экспрессировать соответствующую сиалилтрансферазу (как часть генома клетки-хозяина), которая, вероятно, может присоединять концевую сиаловую кислоту в определенном положении и образовывать связь. Клетка-хозяин необязательно может быть сконструирована таким образом, чтобы экспрессировать соответствующие сиалилтрансферазы с помощью, например, трансфекции клеткихозяина ДНК, кодирующей сиалилтрансферазу. Следует ожидать, что описанные выше сиалилтрансферазы могут присоединять остаток концевой сиаловой кислоты к соответствующему олигосахаридному ядру, такому, как Gal14GlcNAc. Соответствующие сиалилтрансферазы в контексте настоящего изобретения включают такие сиалилтрансферазы, которые катализируют комплексное сиалилирование и разветвлениеN- и O-связанных олигосахаридов, но не ограничены ими. Для культивирования клеток млекопитающих, экспрессирующих требуемый протеин и способных добавлять требуемые углеводы в определенном положении и образовывать связь,могут использоваться многочисленные условия культивирования, при этом следует уделять особое внимание тому, какая клетка-хозяин подлежит культивированию. Пригодные условия культивирования для клеток млекопитающего хорошо известны в данной области техники (J. Immunol. Methods (1983), 56: 221-234) или могут быть легко определены; специалистом в данной области техники (см., например, AnimalPress, New York (1992 и варьируются в соответствии с конкретной выбранной клеткойхозяином. Культуру клеток млекопитающего по настоящему изобретению получают в среде, пригодной для конкретной клетки, подлежащей культивированию. Примерами питательных растворов являются коммерчески доступные среды, такие, как среда Хама F10 (НАМ F-10)(фирма Sigma), минимальная поддерживающая среда ([MEM], фирма Sigma), RPMI-1640 (фирма Sigma), модифицированная по способу Дульбекко среда Игла ([DMEM], фирма Sigma). Кроме того, в качестве культуральной среды может использоваться любая из сред, описанных у 17 и Sato, (1980) Anal. Biochem., 102:255; в патентах США 4767704; 4657866; 4927762; 5122469 или 4560655; в WO 90/03430 и WO 87/00195; описание всех указанных публикаций включено в настоящее описание в качестве ссылки. Любая из этих сред при необходимости может быть дополнена гормонами и/или другими факторами роста (такими, как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими,как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат),буферами (такими, как HEPES), нуклеозидами(такими, как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими, как лекарство гентамицин),микроэлементами (под которыми понимают неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях, близких к микромолярному уровню), липидами (такими,как линолеиновая или другие жирные кислоты) и соответствующими им носителями, а также глюкозой или эквивалентным ей источником энергии. Могут быть также включены в соответствующих концентрациях любые другие необходимые добавки, которые известны в данной области техники. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин, которой является культура клеток млекопитающего, представляет собой культуру клеток СНО, предпочтительно линию клеток dp12.CHO, а пригодная среда содержит основной компонент среды, такой, как состав на основе DMEM/HAM F-12 (состав сред DMEM и НАМ F-12 см., например, в разделе о композициях культуральных сред в American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 6-е изд., 1988, стр. 346-349) (наиболее пригоден состав среды, описанный в патенте США 5122469), с измененными концентрациями некоторых компонентов, таких, как аминокислоты, соли, сахара и витамины, и необязательно содержит глицин, гипоксантин и тимидин; рекомбинантный человеческий инсулин; гидролизованный пептон, такой, как PrimatoneHS или Primatone RL (фирма Sheffield, Великобритания) или эквивалентный им; защищающий клетку агент, такой, как Pluronic F68, или эквивалентный плурониевый полиол; гентамицин; и микроэлементы. Гликопротеины по настоящему изобретению могут продуцироваться растущими клетками, которые экспрессируют требуемый протеин в различных условиях культивирования клеток. Например, для осуществления настоящего изобретения потенциально пригодны способы культивирования клеток как для крупномасштабного, так и для маломасштабного получения протеинов. Способы включают, но не ограничены ими, использование биореактора с псевдоожиженным слоем, биореактора с системой полых волокон, культивирование в роллерфлаконе или же может применяться биореакторная система на основе резервуара с мешалкой, причем две последние системы могут быть 18 с микроносителями или без них и их используют для осуществления изобретения либо в периодическом режиме, либо в периодическом режиме с подпиткой, либо в непрерывном режиме. В предпочтительном варианте осуществления культивирование клеток по настоящему изобретению проводят в биореакторной системе на основе резервуара с мешалкой, используя при этом периодический режим с подпиткой. В предпочтительном варианте культивирования в таком режиме клетки-хозяева, которыми являются клетки млекопитающего, и культуральную среду сначала вносят в сосуд для культивирования и в процессе культивирования в культуру непрерывно или дискретными порциями добавляют дополнительные питательные вещества для культуры, осуществляя (или не осуществляя) периодический сбор клеток и/или продукта до окончания культивирования. Культивирование в режиме с подпиткой может включать, например, полунепрерывное культивирование с подпиткой, при котором всю культуру (включая клетки и среду) периодически удаляют и заменяют свежей средой. Культивирование в режиме с подпиткой отличается от культивирования в периодическом режиме, при котором все компоненты для культивирования клеток (включая клетки и питательные вещества культуры) вносят в сосуд для культивирования в начале процесса культивирования. Кроме того, культивирование в режиме с подпиткой отличается от культивирования методом перфузии тем, что супернатант не удаляют из сосуда для культивирования во время процесса (при культивировании методом перфузии клетки иммобилизируют в культуре, например, путем фильтрации,инкапсулирования, связывания с микроносителями и т.д., а культуральную среду непрерывно или периодически вводят и удаляют из сосуда для культивирования). Кроме того, клетки культуры могут быть размножены в соответствии с любой схемой или методом, которые могут быть пригодны для конкретной клетки-хозяина и конкретного предполагаемого плана получения продукта. Следовательно, настоящее изобретение предполагает использование одностадийного или многостадийного процесса культивирования. При одностадийном культивировании клеткихозяева вносят в среду для культивирования, а обработку по настоящему изобретению осуществляют во время единственной фазы продуцирования продукта культурой клеток. В альтернативном варианте предполагается многостадийное культивирование. При многостадийном культивировании клетки можно культивировать с использованием нескольких стадий или фаз. Например, клетки могут быть выращены на первой стадии или в фазе роста, когда клетки,возможно взятые из банка, вносят в среду, пригодную для стимулирования роста и высокой 19 жизнеспособности. Клетки можно поддерживать в фазе роста в течение требуемого периода времени, добавляя свежую среду к культуре клетки-хозяина. В соответствии с предпочтительным вариантом для усиления роста клеток млекопитающего в фазе роста культуры клеток предложены условия культивирования в режиме с подпиткой или в непрерывном режиме. В фазе роста клетки выращивают в таких условиях и в течение такого периода времени, при которых достигается максимальный рост. Условия культивирования,такие, как температура, рН, концентрация растворенного кислорода (dO2) и т.п., должны быть выбраны применительно к конкретному хозяину, и они очевидны специалисту в данной области техники. Обычно значение рН доводят до уровня приблизительно от 6,5 до 7,5, используя либо кислоту (например, СО 2), либо основание(например, Na2CO3 или NaOH). Пригодный диапазон температур для культивирования клеток млекопитающего, таких, как клетки СНО, составляет приблизительно от 30 до 38 С, а пригодная концентрация dO2 составляет от 5 до 90% от насыщения воздухом. На определенной стадии клетки в фазе или на стадии продуцирования продукта культурой клеток могут использоваться для инокуляции среды. В альтернативном варианте, как описано выше, фаза или стадия продуцирования может не прерываться инокуляцией или фазой или стадией роста. В соответствии с настоящим изобретением осуществляют контроль за окружающей клетку средой во время фазы продуцирования продукта клеточной культурой. В соответствии со способом по настоящему изобретению варьируют факторы, оказывающие воздействие на удельную клеточную продуктивность клетки-хозяина,которой является клетка млекопитающего, таким образом, чтобы получить требуемое содержание сиаловой кислоты в образовавшемся гликопротеине. В частности, контролируют факторы, увеличивающие удельную клеточную продуктивность во время фазы продуцирования в процессе культивирования клеток, таким образом, чтобы образовавшийся гликопротеиновый продукт имел требуемое содержание сиаловой кислоты. В предпочтительном варианте фазе продуцирования в процессе культивирования клетки предшествует переходная фаза культуры клеток,в которой задаются параметры для фазы продуцирования продукта культурой клеток. В соответствии с одним из вариантов варьируют концентрацию энхансера транскрипции, такого, как алкановая кислота, с целью воздействовать на удельную клеточную продуктивность и тем самым на получаемое содержание сиаловой кислоты в гликопротеиновом продукте клетки млекопитающего. Алкановая кислота может представлять собой любую из ал 001215 20 кановых кислот с прямой или разветвленной цепью, которая усиливает транскрипцию протеинов млекопитающего. В предпочтительном варианте осуществления алкановая кислота представляет собой масляную кислоту, а ее солью предпочтительно является бутират натрия. В соответствии с настоящим изобретением контролируют концентрацию бутирата натрия с целью контролировать удельную клеточную продуктивность. Используют концентрации бутирата натрия от 0,1 до 20 мМ и изменяют их в зависимости от конкретной культивируемой клетки-хозяина и требуемого содержания сиаловой кислоты в получаемом гликопротеине. Для получения протеина с требуемым содержанием сиаловой кислоты выбирают такую концентрацию бутирата натрия, которая обеспечивает наиболее высокую удельную клеточную продуктивность с наиболее предпочтительным профилем сиаловых кислот. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением концентрации энхансера транскрипции, такого, как бутират натрия, выбирают таким образом, чтобы получить требуемое содержание сиаловой кислоты. Для повышения содержания сиаловой кислоты в зрелом гликопротеине обычно используют более низкие концентрации энхансера транскрипции. Более низкие концентрации приводят к усилению транскрипции, но обеспечивают более низкую удельную клеточную продуктивность, поддерживая однако жизнеспособность культуры клетки-хозяина. Обычно используемые концентрации энхансера транскрипции, такого, как бутират натрия, составляют от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 8 мМ. В более предпочтительном варианте концентрации составляют от приблизительно 1,0 мМ до приблизительно 6,0 мМ. Согласно еще одному варианту осуществления используют концентрацию бутирата натрия приблизительно 6 мМ. В другом варианте осуществления используют концентрацию бутирата натрия приблизительно 1 мМ. Еще в одном варианте осуществления получают гликопротеин с пониженным уровнем сиаловой кислоты. В соответствии с этим вариантом клетки млекопитающего культивируют в условиях, при которых возрастает удельная клеточная продуктивность. Концентрацию алкановой кислоты или другого соответствующего энхансера транскрипции выбирают далее таким образом, чтобы благодаря увеличенной удельной клеточной продуктивности получать протеин с требуемым профилем сиаловых кислот. В предпочтительном варианте концентрация алкановой кислоты или соли составляет приблизительно от 5 до 20 мМ и более предпочтительно приблизительно от 6 мМ до 12 мМ. В другом варианте концентрация бутирата натрия составляет приблизительно 12 мМ. 21 Определение соответствующей концентрации энхансера транскрипции, такого, как алкановая кислота или ее соль, может быть осуществлено в соответствии с фиг. 2, а также с таблицей I, приведенной ниже в примере I. В соответствии с настоящим изобретением более низкие концентрации бутирата натрия обычно приводят к пониженной удельной клеточной продуктивности. В соответствии с изобретением концентрации бутирата натрия выбирают, принимая во внимание другие параметры процесса,такие, как осмоляльность в фазе продуцирования. Как описано более подробно ниже, осмоляльность может влиять на удельную клеточную продуктивность. Концентрации бутирата выбирают с учетом конкретной осмоляльности,которая должна поддерживаться во время фазы продуцирования. В альтернативном варианте для других клеток-хозяев, которыми являются клетки млекопитающего, и других гликопротеинов могут быть получены небольшие тест-культуры, для которых может быть определена скорость продуцирования гликопротеинового продукта, т.е. удельная клеточная продуктивность, и конечное содержание сиаловой кислоты, что может быть использовано для получения аналогичных таблицы и графика, соответствующих конкретной культивируемой клетке-хозяину, принимая во внимание, что уменьшение удельной клеточной продуктивности приводит к увеличению содержания сиаловой кислоты в получаемом гликопротеине. Алкановую кислоту или ее соль, такую, как бутират натрия, или другой соответствующий энхансер транскрипции добавляют в культуру клетки-хозяина во время или приблизительно во время, когда начинается фаза продуцирования продукта клеточной культурой. Обычно в процессе культивирования до фазы продуцирования применяют переходную фазу,во время которой условия культивирования клеток, как описано выше, задают таким образом,чтобы достичь требуемой удельной клеточной продуктивности и, следовательно, требуемого профиля гликоформ. Алкановую кислоту или ее соль добавляют способом, хорошо известным в данной области техники. В предпочтительном варианте бутират натрия добавляют в виде дозируемой порции к системе для культивирования в полунепрерывном режиме с подпиткой вместе или без других соответствующих питательных веществ, как это указано в настоящем описании или известно специалистам в области культур клеток млекопитающего. В соответствии с изобретением в дополнение к указанным выше факторам осуществляют контроль за осмоляльностью окружающей среды культуры клетки с той целью, чтобы регулировать степень сиалилирования зрелого гликопротеина. В одном из вариантов осуществления осмоляльность контролируют с той целью, что 001215 22 бы контролировать содержание сиаловой кислоты в зрелом протеине независимо от других факторов, которые влияют на удельную клеточную продуктивность. В другом варианте осмоляльность контролируют в дополнение к контролю за другими факторами, которые оказывают воздействие на удельную клеточную продуктивность. В предпочтительном варианте осуществления контролируют как осмоляльность, так и концентрацию алкановой кислоты. Осмоляльность окружающей среды культуры клетки контролируют с целью получить требуемый баланс между удельной клеточной продуктивностью и профилем сиаловых кислот образующегося протеина. В целом, удельная клеточная продуктивность возрастает с увеличением осмоляльности. Осмоляльность, при которой продуцируется протеин с требуемым содержанием сиаловой кислоты, выбирают с учетом того, что увеличение осмоляльности обычно приводит к увеличению скорости продуцирования конкретного протеина. Для снижения скорости продуцирования и повышения содержания сиаловой кислоты в зрелом гликопротеине осмоляльность обычно поддерживают на более низком уровне для конкретного типа культуры, подлежащей культивированию. Для культуры клеток млекопитающего осмоляльность культуральной среды обычно составляет приблизительно 290-330 мОсмолей. Однако увеличение осмоляльности обычно приводит к увеличению скорости продуцирования протеинов. Осмоляльность выбирают таким образом, чтобы скорость продуцирования соответствовала требуемому профилю продукта. Для увеличения количества сиаловой кислоты понижают скорость продуцирования, а осмоляльность обычно поддерживают в более низких пределах, принимая во внимание подлежащую культивированию конкретную клеткухозяина. Осмоляльность в диапазоне от приблизительно 250 мОсмолей до приблизительно 450 мОсмолей пригодна для получения повышенного содержания сиаловой кислоты. Более предпочтительно осмоляльность поддерживают в диапазоне приблизительно от 300 до 450 мОсмолей, еще более предпочтительно приблизительно от 350 до 400 мОсмолей и наиболее предпочтительно на уровне приблизительно 400 мОсмолей. Для уменьшения содержания сиаловой кислоты выбирают такую осмоляльность, которая приводит к повышению скорости продуцирования. Согласно данному варианту осмоляльность поддерживают приблизительно на уровне 350600 мОсмолей, предпочтительно на уровне приблизительно 450-550 мОсмолей. Для специалиста-практика в данной области техники очевидно, что осмоляльность среды зависит от концентрации осмотически активных частиц в культуральной жидкости и что на осмоляльность влияет большое количество пере 23 менных составляющих, входящих в сложную культуральную среду для клетки млекопитающего. Начальную осмоляльность культуральной среды определяют по составу культуральной среды. Осмоляльность может быть измерена с помощью осмометра, например, такого, как поставляемый фирмой Fisher Scientific, Pittsburg,Pennsylvania под маркой OSMETTE (или модельSystems, Inc., Natick MA). Для получения осмоляльности в требуемом диапазоне можно регулировать концентрацию различных составляющих культуральной среды. Растворенные вещества, которые могут быть добавлены в культуральную среду для повышения ее осмоляльности, включают протеины, пептиды, аминокислоты, гидролизованные животные протеины, такие, как пептоны, неметаболизированные полимеры, витамины, ионы,соли, сахара, метаболиты, органические кислоты, липиды и т.п. В одном из вариантов осмоляльность контролируют путем добавления пептона в культуру клетки вместе с другими компонентами культуральной среды при культивировании в периодическом режиме с подпиткой. В соответствии с настоящим изобретением осмоляльность поддерживают или доводят до требуемого диапазона путем добавления, например, основного состава среды, включающего в дополнение к пептону аминокислоты и различные соли (например, NaCl). В предпочтительном варианте осуществления культуральную среду дополняют, например, основной культуральной средой, содержащей избыток аминокислот (см., например, среду "Super" в патенте США 5122469), глюкозу и пептон. Однако очевидно, что концентрацию (и) других составляющих культуральной среды можно изменять с целью получить указанный выше диапазон осмоляльности. Контролируя либо периодически, либо постоянно концентрацию, например, глюкозы (первичного источника энергии) в культуральной среде в процессе культивирования, можно поддерживать осмоляльность среды в требуемом конкретном диапазоне. Контроль за концентрацией глюкозы способствует обеспечению клеток адекватным источником углерода и одновременно контролирует продукцию молочной кислоты клеткамихозяевами. Преимуществом в этом случае является то, что при этом ограничивается уменьшение значения рН в культуральной среде, которое требует добавления нейтрализаторов (например,основания, такого, как Nа 2 СО 3 или NaOH), что приводит к увеличению осмоляльности.; Для поддержания осмомоляльности в требуемом интервале среда может быть дополнена в известных пределах в соответствии с любой схемой, применяемой для поддержания культуры клеток. В предпочтительном варианте система для культивирования представляет собой систему культивирования в периодическом ре 001215 24 жиме с подпиткой и среду дополняют дозируемой подпитывающей порцией во время фазы продуцирования продукта культурой клеток. Кроме того, среда может быть дополнена во время фазы продуцирования, как описано ниже. В альтернативном варианте может быть осуществлен параллельный порционный отбор образцов культуральной среды. Затем при необходимости осмоляльность культуральной среды может быть модифицирована путем модуляции подпитывающего раствора. Для специалиста в данной области техники очевидно, что способы культивирования клетки по настоящему изобретению выбирают таким образом, чтобы достичь требуемого уровня сиалилирования получаемого протеина. В дополнение к приведенным в настоящем описании параметры процесса, оказывающие влияние на степень сиалилирования, включают уровень кислорода и уровень глюкозы. На сиалилирование также влияют плотность культуры, время и условия хранения, такие, как температура. Подразумевается, что настоящее изобретение включает такие дополнительные параметры процесса, которые наиболее важны для увеличения сиалилирования.III. Восстановление гликопротеина. После фазы продуцирования полипептида представляющий интерес полипептид выделяют из культуральной среды с помощью методов,общепринятых в данной области техники. Этот полипептид выделяют из культуральной среды в виде секретированного полипептида, хотя он также может быть выделен из лизатов клетки-хозяина. На первой стадии культуральную среду или лизат центрифугируют для удаления частиц клеточного дебриса. После этого полипептид очищают от загрязнителей - растворимых протеинов и полипептидов - в соответствии с методами, примерами которых являются следующие методы очистки: фракционирование с помощью иммуноаффинной хроматографии или на ионообменных колонках; осаждение этанолом; ЖХВР с обратной фазой; хроматография на силикагеле или на катионообменной смоле, такой,как DEAE; хроматофокусирование; электрофорез в ПААГ-ДСН; осаждение сульфатом аммония; гель-фильтрация с использованием, например, Sephadex G-75; и протеин А-сефарозные колонки для удаления таких загрязнителей, какIgG. Для ингибирования протеолитического разложения в процессе очистки может быть также целесообразным использование протеазного ингибитора, такого, как фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Для специалиста в данной области техники очевидно, что может потребоваться модификация методов очистки полипептида за счет изменений характеристик полипептида при экспрессии в рекомбинантной культуре клеток. 25 Особенно предпочтительными в контексте настоящего изобретения являются методы очистки и процессы, подобранные для углеводов по изобретению. Требуемые гликоформы по настоящему изобретению могут быть обогащены в отношении молекул, содержащих сиаловую кислоту, например, путем ионообменной мягкой гель-хроматографии или ЖХВР с использованием катионо- или анионобменных смол, при которых получают более кислые фракции.IV. Анализ гликопротеина. Комплексную углеводную часть гликопротеина, полученного с помощью способов по настоящему изобретению, при необходимости можно легко проанализировать обычными методами анализа углеводов. Так, например, такие методы, как лектин-блоттинг, хорошо известный в данной области техники, позволяет обнаружить пропорции концевой маннозы или других сахаров, таких, как галактоза. Наличие концевых остатков сиаловых кислот у олигосахарида с одной, двумя, тремя или четырьмя боковыми ветвями может быть подтверждена посредством высвобождения сахаров из протеина с использованием безводного гидразина или ферментативных методов и фракционирования олигосахаридов ионообменной хроматографией или гель-фильтрацией или с помощью других методов, хорошо известных в данной области техники. Значение р 1 гликопротеина также можно измерить до и после обработки нейраминидазой для удаления сиаловых кислот. Увеличение значения р 1 после обработки нейраминидазой свидетельствует о присутствии сиаловых кислот в гликопротеине. Углеводные структуры по настоящему изобретению, входящие в состав протеина, экспрессировались в виде N- или O-связанных углеводов. N- и O-связанные углеводные фрагменты в основном отличаются по строению их ядра. N-связанное гликозилирование обозначает присоединение углеводного фрагмента к аспарагиновому остатку в пептидной цепи черезGlcNAc. Все N-связанные углеводы имеют общую структуру ядра Маn1-6(Маn1-3)Маn14GlcNAc1-4GlcNAc-R. При этом в указанной структуре ядра R обозначает аспарагиновый остаток продуцируемого протеина. Последовательность пептидов произведенного протеина должна содержать аспарагин-Х-серин, аспарагин-Х-треонин и аспарагин-Х-цистеин, где Х обозначает любую аминокислоту, за исключением пролина. В противоположность этому Освязанные углеводы характеризуются общим строением ядра, где GalNAc присоединен к гидроксильной группе треонина или серина. Из Nи О-связанных углеводов наиболее важными являются сложные N- и O-связанные углеводы. Такие сложные углеводы должны содержать структуры, состоящие из нескольких ветвей. Для добавления концевых сиаловых кислот 26 важны наружные моно-, би-, три- или четырехразветвленные структуры. Такие наружные цепочечные структуры обеспечивают дополнительные места для присоединения конкретных сахаров и образования связей; их содержат углеводы по настоящему изобретению. Образовавшиеся углеводы могут быть проанализированы любым методом, известным в данной области техники, включая методы,приведенные в настоящем описании. Для анализа гликозилирования известно несколько методов, которые могут применяться согласно изобретению. Такие методы позволяют получить информацию касательно идентичности и состава присоединенного к пептиду олигосахарида. Методы анализа углеводов для применения по настоящему изобретению включают, но не ограничены ими, лектин-хроматографию; HPAECPAD, в котором для разделения олигосахаридов на основе их заряда используется анионобменная хроматография при высоком значении рН; ЯМР; масс-спектрометрия, ЖХВР; гельпроникающая хроматография (ГПХ); анализ состава моносахаридов; последовательное ферментативное разложение. Кроме того, известны методы для высвобождения олигосахаридов. Эти методы включают: 1) ферментативное высвобождение, которое обычно проводят с использованием пептидN-глюкозидазы F/эндогалактозидазы; 2) элиминацию с использованием жестких щелочных условий для высвобождения главным образом O-связанных структур; и 3) химические методы, основанные на использовании безводного гидразина для высвобождения как N-, так и Oсвязанных олигосахаридов. Анализ может быть осуществлен с использованием следующих стадий: 1. Диализ образца по отношению к деионизированной воде для удаления всех буферных солей с последующей лиофилизацией. 2. Высвобождение интактных цепей олигосахарида с помощью безводного гидразина. 3. Обработка интактных цепей олигосахарида безводным метанольным раствором НСl для выделения индивидуальных моносахаридов в виде O-метильных производных. 4. N-ацетилирование любых первичных аминогрупп. 5. Образование производных с полученим пер-O-триметилсилилметильных гликозидов. 6. Разделение этих производных с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на колонке типа CP-SIL8. 7. Идентификация индивидуальных гликозидных производных по времени удерживания при ГЖХ и масс-спектрометрии по сравнению с известными стандартами. 8. Количественная оценка индивидуальных производных с помощью FID с внутренним стандартом (13-О-метил-D-глюкозидом). 27 Нейтральные сахара и аминосахара могут быть определены с помощью анионообменной хроматографии высокого разрешения, объединенной с импульсным амперометрическим определением (HPAE-PAD Carbohydrate System фирмы Dionex Corp.). Например, сахара могут быть высвобождены с помощью гидролиза 20%ной (по объему) трифторуксусной кислотой при 100 С в течение 6 ч. Затем гидролизаты сушат путем лиофилизации или с помощью устройстваSpeed-Vac (фирма Savant Instruments). Затем остатки растворяют в 1%-ном растворе тригидрата ацетата натрия и анализируют на колонке для ЖХВР типа HPLC-AS6, как описано у Anumula и др. (Anal. Biochem. 195: 269-280 (1991). Сиаловая кислота может определена отдельно прямым колориметрическим методомYao и др. (Anal. Biochem. 179: 332-335 (1989 с использованием трех образцов. В предпочтительном варианте применяют тиобарбитуровую кислоту (ТБК) в соответствии с методом WarrenL., J. Biol. Chem., 238: (8) (1959). В альтернативном варианте может быть осуществлен анализ углеводов с помощью иммуноблоттинга. В соответствии с этим способом связанные с протеином углеводы определяют с использованием коммерческой системы определения гликана (фирма Boehringer), которая основана на методе окислительного иммуноблоттинга, описанном у Haselbeck и Hosel [Haselbeck и др., Glycoconjugate J., 7:63 (1990)]. При этом следуют протоколу окрашивания, рекомендованному изготовителем, за исключением того,что протеин переносят на мембрану из поливинилидендифторида, а не на нитроцеллюлозную мембрану, и блокирующий буфер содержит 5% бычьего сывороточного альбумина в 10 мМ трис-буфере с рН 7,4 с 0,9% хлорида натрия. Обнаружение осуществляют с использованием антител против дигоксигенина, связанных с конъюгатом щелочного фосфата (фирма Boehringer) при разбавлении 1:1000 в забуференном трисом физиологическом растворе с использованием таких субстратов для фосфатазы, как хлорид 4-нитроголубого тетразолия (0,03 мас./об.%) и 5-бром-4-хлор-3-индоилфосфата(0,03 мас./об.%) в 100 мМ трис-буфере, рН 9,5,содержащем 100 мМ хлорид натрия и 50 мМ хлорид магния. Протеиновые полосы, содержащие углевод, обычно проявляют в течение примерно 10-15 мин. Углевод обычно также может быть проанализирован путем разложения пептид-Nглюкозидазой F. В соответствии с этим способом остаток суспендируют в 14 мкл буфера,содержащего 0,18% ДСН, 18 мМ бетамеркаптоэтанол, 90 мМ фосфат, 3,6 мМ ЭДТК при рН 8,6, и выдерживают при 100 С в течение 3 мин. После охлаждения до комнатной температуры образец разделяют на две равные части. Одну аликвоту больше не обрабатывают, и она служит контролем. Вторую фракцию доводят до 28 приблизительно 1% детергентом NP-40, а затем обрабатывают 0,2 единицами пептид-Nглюкозидазы F (фирма Boehringer). Оба образца выдерживают при 37 С в течение 2 ч и затем анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН.V. Химерный гликопротеин, состоящий из рецептора фактора некроза опухоли и иммуноглобулина. В предпочтительном варианте способы по настоящему изобретению используют для получения химерного гликопротеина, состоящего из рецептора фактора некроза опухоли (TNFR) и иммуноглобулина (Ig). Особенно предпочтительными из этого класса химерных гликопротеинов является химерный гликопротеин, состоящий из растворимого TNFR типа 1 и IgG1. Полученные химерные гликопротеины TNFR1IgG1 могут применяться при лечении или диагностики многих опосредованных TNF или связанных с TNF болезней и расстройств. Понятие"лечение" в данном контексте включает как профилактику (предотвращение), подавление(например, симптомов), так и лечение существующего патологического состояния. Патологические состояния, связанные с TNF, включают,но не не ограничены ими, бактеремии, обусловленные грамотрицательными и грамположительными бактериями, эндотоксический шок,явление отторжения трансплантата, ревматоидные артриты, системную красную волчанку,болезнь Крона и другие аутоиммунные и воспалительные заболевания, связанные с TNF. Препараты по настоящему изобретению на основе химерного гликопротеина TNFR1-IgG1 обычно пригодны для применения при таких показаниях, при которых ранее использовались моноклональные антитела к TNP. Например,при использовании животных в качестве моделей обнаружено, что моноклональные антитела к TNF-альфа проявляют защитное действие при применении в профилактических целях (TraceyI клинического эксперимента установлено, что мышиное моноклональное антитело к рекомбинантному TNF-альфа человека безопасно для введения пациентам с серьезным септическим шоком. Химерные гликопротеины TNFR1-IgG1 пригодны для лечения ревматоидных артритов,а также септического шока. В способе лечения заболевания или расстройства, связанного с TNF, терапевтически активное количество препарата, содержащего химерный гликопротеин TNFR1-IgG1, вводят субъекту, нуждающемуся в таком лечении. Предпочтительным субъектом является человек. Эффективная доза препарата на основе химерного гликопротеина TNFR1-IgG1 по изобретению для лечения заболевания или расстройства составляет 0,01-100 мг для одного пациента; предпочтительно 1-75 мг и наиболее 29 предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 50 мг. Для введения препарат на основе химерного гликопротеина TNFR1-IgG1 должен быть изготовлен в виде соответствующей фармацевтической или терапевтической композиции. Такая композиция обычно включает терапевтически эффективное количество препарата, содержащего химерный гликопротеин TNFR1-IgG1, и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель, такой, как физиологический раствор,забуференный физиологический раствор, декстроза или вода. Композиции также могут содержать определенные стабилизаторы, такие как сахара, включая маннозу и маннит, и местные анестетики для инъецируемых композиций,включая, например лидокаин. Настоящее изобретение относится к композициям, которые, кроме того, включают терапевтически эффективное количество дополнительного действующего вещества, такого, как моноклональные антитела (например, антитела против TNF, антитела к Маc 1 или LFA 1), или другие рецепторы, связанные с продуцированием TNF, например, IL-1- или IL-2-рецепторы, и т.д. Предпочтительная терапевтическая композиция для индивидуального или комплексного лечения, как указано выше, включает новый химерный гликопротеин TNFR1-IgG1 по настоящему изобретению, который обладает пролонгированным клиренсом из крови, сохраняя при этом высокую функциональную активность. Такой продолжительной период полувыведения этого вещества при сохранении его функциональной активности позволяет использовать,например, введение дозы в виде болюса и способствует эффективности препарата in vivo. Предпочтительные химерные гликопротеиныTNFR1-IgG1 в терапевтической композиции включают химерный гликопротеин TNFR1-IgG1 и препараты, приведенные в настоящем описании, например:(1) препараты, содержащие химерный гликопротеин, TNFR1-IgG1, включающие сложный олигосахарид, заканчивающийся одним или несколькими остатками сиаловой кислоты;(2) препараты, содержащие химерный гликопротеин, TNFR1-IgG1, в которых значение изоэлектрической точки (рI) находится в диапазоне от 5,5 до 7,5, как определено методом хроматофокусирования, и в которых рI чувствительна к обработке нейраминидазой;Nацетилглюкозаминных остатков на моль протеина.(4) препараты, содержащие химерный гликопротеин, TNFR1-IgG1, в которых молярное отношение сиаловой кислоты к протеину со 001215(5) препараты, содержащие химерный гликопротеин, TNFR1-IgG1, в которых молярное отношение сиаловой кислоты кNацетилглюкозамину составляет от приблизительно 0,35 до приблизительно 0,5 и более предпочтительно от приблизительно 0,4 до приблизительно 0,45. Пути введения индивидуальных или комбинированных терапевтических композиций по настоящему изобретению включают стандартные пути, такие, как, например, внутривенная инфузия или быстрое внутривенное введение больших объемов жидкости. Также предлагается применение препарата, содержащего химерный гликопротеин,TNFR1-IgG1 по изобретению, при изготовлении лекарства для лечения человека или животного. Ниже изобретение более подробно поясняется на примерах, которые представлены только с иллюстративной целью и, если не указано иное, не направлены на ограничение объема настоящего изобретения. Примеры Биологические воздействия TNF-альфа иTNF-бета осуществляются через определенные рецепторы (Dembic и др., (1990) Cytokines, 2: 231). Молекулярное клонирование показало существование двух различных типов TNFрецепторов (TNFR) с предполагаемыми молекулярными массами 55 кДа (тип 1) (Shall и др.,(1990) Cell, 61: 361) и 75 кДа (тип 2) (Smith и др., (1990) Science, 248: 1019), каждый из которых в естественных условиях связывается как сUSA 87: 8331). Установлено, что внеклеточные части обоих рецепторов в естественных условиях являются растворимыми,TNFсвязывающими протеинами (Kohno и др., см. выше). Были созданы агонисты TNF, блокирующие вредное воздействие TNF при различных иммунных и воспалительных заболеванияхHoward O.M.Z. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2335-2339; Wooley P.H., (1993) J. ImmunoL,151: 6602-6607). Один такой агонист (Werner и др., (1991) J. Cell. Biochem., Тезисы 20-го ежегодного съезда, стр. 115) объединяет внеклеточный домен человеческого TNFR типа 1 с молекулярной массой 55 кДа с частью шарнирной области и Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина G1 человека. В этом примере культивировали клетки млекопитающего, трансфектированные вектором, содержащим кДНК, кодирующую химерный гликопротеин TNFR1-IgG1. 31 Методы А. Линия клеток. В качестве линии культуры клеток, которой является линия клеток млекопитающего,использовали линию клетки яичника китайского хомячка (СНО), полученную из СНО-К 1 (АТССCCL61 СНО-К 1). Мутантную линию клетки СНО-К 1 с дефицитом дигидрофолатредуктазыNatl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220), затем использовали для получения линии клетки с пониженным потреблением инсулина путем трансфекции вектором, содержащим кДНК для препроинсулина (Sures и др., (1980) Science,208: 57-59). Отобранный клон, обозначенный как dp12.CHO, нуждался для роста в глицине,гипоксантине и тимидине, подтверждая тем самым свой DHFR-генотип. Б. Конструирование химерного гликопротеина, состоящего из растворимого TNFR типа 1 и IgG1. Растворимый химерный гликопротеинTNFR типа 1-IgG1 конструировали путем генного слияния внеклеточного домена человеческогоTNFR типа 1 с шарнирной областью и CH2- и СH3-доменами тяжелой цепи IgG1 (обозначенную далее как TNFR1-IgG1). Последовательность ДНК, кодирующую человеческий растворимый TNFR типа 1 (см. Loetscher и др., см. выше), получали из плазмиды pRK-TNF-R[Schall и др., Cell, 61: 361 (1990)]. Для конструирования этой исходной плазмиды клон плацентарной кДНК длиной 2,1 т.п.н. (Schall и др., см. выше) встраивали в вектор, обеспечивающий экспрессию в клетках млекопитающего pRK5,конструкция которого описана в ЕР 307247,публикация 15 марта 1989. Эта кДНК начинается с нуклеотида в положении 64 последовательности, описанной Loetscher и др., с инициирующим метионином на расстоянии 118 пар оснований ниже (по ходу транскрипции) по отношению к начальному нуклеотиду. Источником последовательности, кодирующей IgG1, служила плазмида pRKCD42Fcl,экспрессирующая CD4-IgG [Capon D.J. и др.,Nature, 337: 525 (1989); Byrn и др., Nature, 344: 668 (1990)], состоящая из последовательности кДНК, кодирующей гибридный полипептид,содержащий 1-180 остатков зрелого человеческого протеина CD4 (два N-концевых вариабельных домена CD4), слитых с последовательностями человеческого IgG1, которые начинаются с аспарагиновой кислоты в 216 положении(если считать аминокислоту в 114 положении в качестве первого остатка константной области тяжелой цепи [Kabat и др., Sequences of Proteinsof Immunological Interest, 4-е изд. (1987)], которая является первым остатком шарнира IgG1 32 после остатка цистеина, участвующего в связывании тяжелой и легкой цепи) и заканчиваются остатком в 441 положении для присоединения СH2- и СH3-доменов Fc-области IgG1.TNFR1-IgG1 конструировали, получая рестрикционные фрагменты плазмид pRK-TNF-R и рРКСD42Fcl и лигируя их с использованием делеционного мутагенеза таким образом, чтобы остаток треонина в положении 171 зрелыхTNFR совмещался с остатком аспарагиновой кислоты в положении 216 тяжелой цепи IgG1(Kabat и др., см. выше). Образовавшаяся плазмида pRKTNFR-IgG содержала полноразмерную последовательность, кодирующую TNFR1IgG1. В. Культура клеток. Ген, кодирующий растворимый TNFR типа 1-IgG1, вводили в клетки линии dp12.CHO путем трансфекции. Это введение осуществляли с помощью метода на основе фосфата кальция для интродукции ДНК в клетки млекопитающего. Через два дня после трансфекции клетки обрабатывали трипсином и пересевали в селективную среду (среда НАМ F-12 без глицинагипоксантина и тимидина/DMEM, 1:1 по объему 2% подвергнутой диализу сыворотки). Полученные изоляты подвергали скринингу на способность секретировать TNFR1-IgG1. Клоны,экспрессирующие TNFR1-IgG1, амплифицировали в метотрексате, получая клоны, обладающие высокой экспрессией, и их последовательно адаптировали к бессывороточной среде. Эти клетки находились под непрерывным селективным давлением до переноса в неизбирательную среду для роста и экспансии (размножения) инокулята. Для получения культур клеток, продуцирующих TNFR1-IgG1, описанную выше популяцию клеток из среды, содержащей метотрексат,размножали путем серийных пересевов в сосуды большего объема в среду для роста, не содержащую метотрексата. На этих стадиях процесса неселективная среда для роста представляла собой композицию на основе DMEM/HAMF-12 (см., например, патент США 5122469) с измененными концентрациями некоторых компонентов, таких, как глюкоза, аминокислоты,соли, сахар, витамины, глицин, гипоксантин и тимидин; рекомбинантный человеческий инсулин; гидролизованный пептон (Primatone HS или Primatone RL); защищающий клетку агент,такой, как Pluronic F68 (плурониевый полиол) или его эквивалент; гентамицин; липиды и микроэлементы. Культуры содержали при контролируемом значении рН 7,20,4, используя газообразный СО 2 (кислота) и/или Nа 2 СО 3 (основание). Температуру во время периода роста поддерживали около 37 С. Содержание растворенного кислорода поддерживали на уровне выше 5% от насыщения воздухом при помощи прямого проду 33 зультате размножения инокулята после стадии селекции, выращивали в фазе роста с исходной осмоляльностью 300 мОсмолей. Среду для роста дополняли микроэлементами, рекомбинантным человеческим инсулином и гидролизованным пептоном. В этих условиях клетки выращивали в течение 2 дней. В начале третьего дня культивирования клеток температуру понижали. Одновременно или после изменения температуры в культуру клеток добавляли бутират натрия и поддерживали необходимую для продуцирования осмоляльность, добавляя различные компоненты среды. Клетки выращивали в этих условиях с подпиткой в течение 9-10 дней. При необходимости клетки подпитывали различными компонентами среды. В таблице I представлены условия для разных способов осуществления процесса продуцирования. Таблица I Конц. бути- Осмоляльность в фазе Удельная продуктив- Содержание сиаловой кислоты продуцирования (мОс- ность клетки между в TNFR1-IgG1 на 10 день рата 5-10 днями (пг/день) (моль/моль) моль/кг) вания воздухом и/или газообразным кислородом. Осмоляльность в течение фазы размножения инокулята поддерживали в диапазоне приблизительно от 250 до 350 мОсмолей. Для каждой культуры за фазой роста следовала вторая фаза или переходная фаза, в которой условия культивирования изменяли от условий, оптимальных для роста, к условиям, соответствующим фазе продуцирования. Во время этой переходной фазы температуру системы для культивирования понижали обычно приблизительно до 30-35 С. Добавляли бутират и осмоляльность поддерживали в определенном диапазоне. Продукт, накапливаемый во время этой фазы продуцирования, анализировали на содержание сиаловой кислоты. При обычной схеме продуцирования приблизительно 1,2 х 106 клеток, полученных в реВариант процесса А Б В Г Д Е Ж З И Г. Выделение TNFR-IgG. Химерный гликопротеин TNFR1-IgG1 очищали до гомогенности более 95% с помощью афинной хроматографии на иммобилизованном протеине А Staphylococcus aureus, как описано у Capon и др., см. выше. Д. Анализ углевода. Содержание сиаловой кислоты анализировали методом Warren L., (1959) J. Biol. Chem.,234: 1971-1975. Результаты. Строили график зависимости удельной клеточной продуктивности для каждой из продуцирующих культур, представленных в таблице I, от содержания сиаловой кислоты полученного продукта. Результаты представлены на фиг. 1. Наиболее высокое содержание сиаловой кислоты наблюдали, когда параметры процесса в фазе продуцирования поддерживали на следующем уровне: осмоляльность приблизительно 360-420 мОсмолей, а концентрация бутирата приблизительно 1 мМ. Содержание сиаловой кислоты может контролироваться в широком диапазоне значений путем регулирования параметров процесса. Пример II. Определяли в плазме фармакокинетические параметры, такие, как время полужизни и/или скорость клиренса для различных препаратов. Препараты, имеющие более высокое содержание сиаловой кислоты, обычно обладали большим периодом полувыведения из плазмы и/или низкой общей скоростью клиренса по сравнению с препаратами, имеющими более низкое содержание сиаловой кислоты. Методики. Семнадцать самцов крыс линии SpragueDawley весом 272-315 г случайным образом распределяли по трем группам (N = 5 или 6 особей в группе), которые подвергали обработке слитым протеином TNFR1-IgG1. Животным внутривенно через канюлю в бедренной вене вводили номинальную дозу 5 мг/кг тестируемого материала. Отобранные тестируемые материалы включали два препарата TNFR1-IgG1,полученные в результате процесса, в котором концентрация бутирата во время фазы продуцирования составляла 6 мМ и осмоляльность во время фазы продуцирования поддерживали на уровне приблизительно 400 мОсмолей (процессI), а третий препарат TNFR1-IgG1 был получен в результате процесса, в котором концентрация бутирата составляла 12 мМ и осмоляльность во время фазы продуцирования составляла приблизительно 500 мОсмолей (процесс II). Образцы крови объемом 2 мл перед обработкой и через 5 35 мин, 2, 6, 10, 24, 34, 48, 56, 72, 96 и 120 ч после обработки вносили в 8,5%-ную ЭДТК. Образцы крови центрифугировали, собирали плазму и образцы анализировали на содержание слитого протеина TNFR1-IgG1. Для количественной оценки содержанияTNFR1-IgG1 в плазме крысы применяли иммуноферментный анализ с использованием биологического связывания (ELIBA). Этот анализ основан на способности TNF-альфа, соединенного с пероксидазой из хрена (TNF-альфа-HRP),который связывался с рецепторной областью слитого протеина TNFR1-IgG1. В этом анализе покрытие лунок планшетов для микротитрования Fab-фрагментами козьего античеловеческого IgGF использовали для иммобилизацииTNFR1-IgG1 путем взаимодействия с Fc-частью молекулы. В лунки добавляли ТNF-альфа-НRР и давали связываться с рецепторной областью иммобилизованного TNFR1-IgG1. Количественную оценку осуществляли путем измерения окраски, полученной в результате реакции пероксидазы с перекисью и ортофенилендиаминовым(ODP) субстратом. Диапазон анализируемых значений составлял от 0,003 до 0,02 мг/мл. Установлено, что присутствие ЭДТК в образцах плазмы не оказывает влияния на качество анализа. Дозы усредняли таким образом, чтобы учесть различия в концентрациях растворов,применяемых для обработки. Все вычисления были сделаны на основе графиков зависимости концентрации от времени вплоть до конечной точки отсчета 120 ч. Усеченную площадь под кривой (AUC0-120) вычисляли с использованием правила трапеции, а усредненное по весу значение усеченного клиренса (CL0-120/W) вычисляли по формуле: доза/AUC0-120 Результаты. Скорости клиренса варьировали в зависимости от использованного варианта процесса(ср. процесс I с процессом II) и от количества сиаловой кислоты, присутствующей в продукте. Скорости клиренса, полученные для отдельных животных, и соответствующее среднее значение и стандартные отклонения, полученные в этом исследовании, представлены ниже в таблице II. При использовании процесса I получена более низкая и более предпочтительная скорость клиренса. 36 Определение состава олигосахаридов углевода и строения химерного гликопротеинаTNFR1-IgG1, полученного согласно примеру I,показало, что содержание сиаловой кислоты при различных вариантах процесса изменяется. Быстрый клиренс из плазмы связан с высоким уровнем незащищенного GlcNAc, пониженным уровнем сиаловой кислоты в цепях олигосахарида и (предположительно) доступностью протеина для рецепторов маннозы или галактозы. Медленный клиренс из плазмы связан с большим количеством концевых остатков сиаловой кислоты. А. Источники тестируемого материала.TNFR1-IgG1 получали в соответствии с методами, изложенными выше в примере I. Материал для процесса I получали из культуры клеток, используя на стадии продуцирования бутират с концентрацией 6 мМ при осмоляльности приблизительно 400 мОсмолей. Материал для процесса II получали из культуры клеток, используя на стадии продуцирования бутират с концентрацией 12 мМ при осмоляльности приблизительно 500 мОсмолей. Б. Методы. Высвобождение интактных нейтральныхcахаров и аминосахаров определяли с помощью анионообменной хроматографии с высоким значением рН, с одновременным импульсным амперометрическим определением. Анализ проводили в соответствии со следующими стадиями: 1. Проводили замену буфера в препаратах с TNFR1-IgG1 (приблизительно 50 мкг/мл) и в соответствующих контрольных образцах таким образом, чтобы конечный образец находился в 1%-ной уксусной кислоте. 2. Замораживали приблизительно 90 мкгTNFR1-IgG1, а также образцы с контрольными материалами в бане с сухим льдом и спиртом, а замороженный образец лиофилизировали в течение ночи. 3. Восстанавливали высушенные замораживанием образцы в 500 мкл трифторуксусной кислоты и инкубировали при 120 С в течение 1 ч. 4. После кислотного гидролиза TNFR1IgG1 и контрольные образцы охлаждали и упаривали их досуха. 5. Восстанавливали образцы водой до конечной концентрации приблизительно 0,6 мг/мл. 6. Проводили разделение моносахаридов при температуре окружающей среды с помощью анионообменной хроматографии с высоким значением рН, с одновременным импульсным амперометрическим определением, используя колонку типа Dionex CarboPac PAI (4 х 250 мм) (фирма Dionex Corp., Sunnyvale, CA). 7. Проводили количественную оценку индивидуальных моносахаридов путем сравнения с моносахаридами в контрольных образцах. Относительное молярное содержание каждого моносахарида в двух препаратах приведено в таблице III ниже. Таблица III. Относительное молярное содержание моносахаридов в двух препаратах TNFR1-IgG1 Моносахарид Процесс I Процесс II Фукоза 4,30,2 4,4 Галактоза 6,50,0 4,7 Манноза 12,20,6 12,5 Приведенные выше результаты показывают, что параметры процесса, выбранные для фазы продуцирования гликопротеина, оказывают воздействие на состав углеводов зрелого гликопротеина. Препараты с более высоким содержанием сиаловой кислоты обычно обладают пролонгированным периодом полувыведения из сыворотки. В представленных ниже таблицах IV и V показан углеводный состав боковых цепей олигосахарида в препаратах на основе химерного гликопротеина TNFR1-IgG1, полученных в условиях, соответствующих процессу I и процессуII. В таблице V приведены данные для углеводов в рецепторной области химерной молекулы за вычетом сайта гликозилирования Fc. Таблица IV Пр. II Пр. IIGal на моль Ветви Gal 4,47 4,72 6,45 6,24 Кол-во сиаловой кислоты на моль 3,5 4,8 5,00 6,5 Данные, приведенные в таблицах IV и V,показывают, что состав TNFR1-IgG1 характерен для комплексных олигосахаридов с одной, двумя и тремя ветвями, оканчивающимися сиаловой кислотой. Можно сделать вывод о том, чтоTNFR1-IgG1, полученный в соответствии с процессом I, имеет существенно большее содержание сиаловой кислоты и существенно меньшее содержание незащищенного GlcNAc. Количество сиаловой кислоты на моль протеина свидетельствует о том, что этот материал имеет более низкую изоэлектрическую точку по сравнению с материалом, полученным в соответствии с про 38 цессом II. При сопоставлении с результатами,представленными в таблице II, эти данные также показывают, что более медленный клиренс из плазмы материала, полученного в соответствии с процессом I, кореллирует с более низким содержанием незащищенного GlcNAc и обычно с более высоким содержанием сиаловой кислоты. В таблицах IV и V представлены данные о препаратах TNFR1-IgG1, содержащих комплексный олигосахарид, оканчивающийся одним или несколькими остатками сиаловой кислоты. Предпочтительные препараты TNFR1IgG1 содержат молекулы TNFR1-IgG1, имеющие приблизительно 1-2 моля незащищенных остатков N-ацетилглюкозамина на моль протеина. Молярное отношение сиаловой кислоты к протеину составляет приблизительно 4-7. Препараты TNFR1-IgG1 имеют молярное отношение сиаловой кислоты к N-ацетилглюкозамину приблизительно от 0,4 до приблизительно 0,45. Пример IV. Значение рI высоко сиалилированного препарата ниже, чем значение рI низко сиалилированного препарата. Методы. Для различных препаратов, описанных в примере II, проводили изоэлектрическое фокусирование. Изоэлектрически фокусирующие гели разделяют гликопротеины препарата в соответствии с их изоэлектрической точкой (рI) при использовании градиента рН, создаваемого с помощью амфолитов с разным значением рН. В этом исследовании анализ препаратов проводили, используя градиент рН от 10 до 4. Результаты. Препараты TNFR1-IgG1 имеют изоэлектрические точки в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5, как установлено методом хроматофокусирования, в котором рI чувствительна к обработке нейраминидазой. Хотя настоящее изобретение включает конкретные примеры вариантов его осуществления, очевидно, что возможны и другие модификации. Данное описание включает любые варианты, применение или модификацию изобретения, вытекающее в целом из основной идеи изобретения, и такие отклонения от описания настоящего описания, которые могут быть сделаны на основе известной или обычной практики в данной области техники, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к существенным признакам изложенного выше изобретения, описанным в прилагаемых пунктах формулы изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ контроля количества сиаловой кислоты, присутствующей в олигосахаридной боковой цепи гликопротеина, продуцируемого культурой клеток млекопитающего, путем из 39 менения удельной продуктивности указанной культуры, который осуществляют следующим образом: во время переходной фазы добавляют к культуре клеток алкановую кислоту с 3-6 атомами углерода или ее соль в интервале концентраций, составляющем примерно от 0,1 мМ до 20 мМ, устанавливают осмоляльность клеточной культуры в интервале значений, составляющем примерно от 250 мОсмолей до 600 мОсмолей, устанавливают температуру культивирования, составляющую приблизительно от 30 до 35 С, и поддерживают указанные параметры на стадии продуцирования гликопротеина. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для увеличения количества сиаловой кислоты в олигосахаридной боковой цепи гликопротеина,продуцируемого культурой клеток млекопитающих, уменьшают удельную продуктивность культуры клеток следующим образом: во время переходной фазы добавляют к культуре клеток алкановую кислоту с 3-6 атомами углерода или ее соль в интервале концентраций, составляющем примерно от 0,1 мМ до 6 мМ, устанавливают осмоляльность клеточной культуры в интервале значений, составляющем примерно от 300 мОсмолей до 450 мОсмолей,устанавливают температуру культивирования,составляющую приблизительно от 30 до 35 С, и поддерживают указанные параметры на стадии продуцирования гликопротеина. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что культура клеток млекопитающих представляет собой культуру клеток яичника китайского хомячка (СНО). 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что соль алкановой кислоты представляет собой бутират натрия. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что продуцируемый культурой клеток гликопротеин представляет собой гликопротеин млекопитающего. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что гликопротеин представляет собой химерный гликопротеин, состоящий из рецептора фактора некроза опухоли человека и иммуноглобулинаG 1. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что культура клеток представляет собой линиюdp12.CHO, трансфектированную вектором,включающим кДНК, кодирующую химерный гликопротеин, состоящий из растворимой формы рецептора фактора некроза опухоли человека типа 1 и иммуноглобулина G1 (TNFR1-IgG1). 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что для уменьшения количества сиаловой кислоты в олигосахаридной боковой цепи гликопротеина,продуцируемого культурой клеток млекопитающих, увеличивают удельную продуктивность культуры клеток следующим образом: 40 во время переходной фазы добавляют к культуре клеток алкановую кислоту с 3-6 атомами углерода или ее соль в интервале концентраций, составляющем примерно от 6 мМ до 12 мМ, устанавливают осмоляльность клеточной культуры в интервале значений от примерно 450 мОсмолей до 600 мОсмолей, устанавливают температуру культивирования, составляющую приблизительно от 30 до 35 С, и поддерживают указанные параметры на стадии продуцирования гликопротеина. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что культура клеток млекопитающих представляет собой культуру клеток яичника китайского хомячка (СНО). 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что соль алкановой кислоты представляет собой бутират натрия. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что продуцируемый культурой клеток гликопротеин представляет собой гликопротеин млекопитающего. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что гликопротеин представляет собой химерный гликопротеин, состоящий из рецептора фактора некроза опухоли человека и иммуноглобулинаG1. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что культура клеток представляет собой линиюdp12.CHO, трансфектированную вектором,включающим кДНК, кодирующую химерный протеин, состоящий из растворимой формы рецептора фактора некроза опухоли человека типа 1 и иммуноглобулина G1 (TNFR1-IgG1). 14. Способ получения химерного гликопротеина, состоящего из растворимой формы рецептора фактора некроза опухоли человека типа 1 и иммуноглобулина G1 (TNFR1-IgG1) и имеющего пониженное количество сиаловой кислоты в олигосахаридной боковой цепи, заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии: а) культивируют клетки СНО, экспрессирующие химерный гликопротеин TNFR1-IgG1 при температуре около 37 С в условиях, обеспечивающих максимальный рост клеток; б) во время переходной фазы добавляют к культуре клеток бутират натрия в интервале концентраций примерно от 6 мМ до 12 мМ, устанавливают осмоляльность клеточной культуры в интевале значений примерно от 450 мОсмолей до 600 мОсмолей, устанавливают температуру культивирования приблизительно от 30 до 35 С, поддерживают указанные параметры на стадии продуцирования гликопротеина и выделяют гликопротеин из культуральной среды и очищают. 15. Способ получения химерного гликопротеина, состоящего из растворимой формы рецептора фактора некроза опухоли человека типа 1 и иммуноглобулина G1 (TNFR1-IgG1) и имеющего повышенное количество сиаловой кислоты в олигосахаридной боковой цепи, заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии: а) культивируют клетки млекопитающих,экспрессирующие химерный гликопротеинTNFR1-IgG1 при температуре около 37 С в условиях, обеспечивающих максимальный рост клеток; б) во время переходной фазы добавляют к культуре клеток бутират натрия в интервале концентраций, составляющем примерно от 1 мМ до 6 мМ, устанавливают осмоляльность клеточной культуры в интервале значений, составляющем примерно от 300 мОсмолей до 450 мОсмолей, устанавливают температуру культивирования, составляющую приблизительно от 30 до 35 С, поддерживают указанные параметры на стадии продуцирования гликопротеина и выделяют гликопротеин из культуральной среды и очищают. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что клетки СНО представляют собой линиюdp12.CHO. 18. Препарат, содержащий химерный гликопротеин TNFR1-IgG1, полученный в соответствии со способом по п.17. 19. Терапевтическая композиция, содержащая химерный гликопротеин TNFR1-IgG1,полученный в соответствии со способом по п.15, и фармацевтически приемлемый наполнитель. 20. Препарат, содержащий химерный гликопротеин TNFR1-IgG1, полученный в соответствии со способом по п.14 или 15, причем в молекуле TNFR1-IgG1 молярное отношение сиаловой кислоты к белку составляет приблизительно 4-7. 21. Препарат, содержащий химерный гликопротеин TNFR1-IgG1, полученный в соответствии со способом по п.15, причем в молекулеTNFR1-IgG1 содержится приблизительно 1-2 моля незащищенных остатков N-ацетилглюкозамина на моль белка. 22. Препарат, содержащий химерный гликопротеин TNFR1-IgG1, полученный в соответствии со способом по п.15, причем в молекулеTNFR1-IgG1 молярное отношение сиаловой кислоты и N-ацетилглюкозамина составляет приблизительно от 0,35 до 0,5. 23. Препарат по п.22, отличающийся тем,что молярное отношение сиаловой кислоты и Nацетилглюкозамина составляет приблизительно от 0,39 до 0,45. Зависимость содержания NANA от удельной клеточной продуктивности 44 Зависимость содержания NANA от удельной продуктивности PCV