Долгоживущие производные рилизинг-фактора гормона роста

006484 Область, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к производным рилизинг-фактора ростового гормона (гормона роста, GRF). В частности, данное изобретение относится к пептидным производным с продолжительным временем полужизни для промотирования эндогенной продукции или высвобождения (рилизинга) гормона роста в организме человека или животных. Предпосылки создания изобретения Гормон роста (GH), также известный как соматотропин, является белковым гормоном, содержащим примерно 190 аминокислот, синтезируемым в клетках и секретируемым в аденогипофизе клетками, называемыми соматотропными. Он играет главную роль в регуляции роста и в обмене веществ. Значительный интерес он представляет также в качестве фармацевтического продукта, применяющегося как для людей, так и для животных. Продукция GH модулируется многими факторами, включая стресс, питание,сон и сам GH. Однако его основными регуляторами являются два гормона гипоталамуса:- соматостатин (SS), который ингибирует высвобождение GH в ответ на GRF. Показано, что биологическая активность GRF(l-44) является свойством N-концевой части пептида. Полная внутренняя активность и эффективность также проявляется GRF (1-29) как in vitro, так и in vivo. Кроме того, непрерывное введение GRF индуцирует секрецию GH, носящую такой же эпизодический характер, что и в нормальных физиологических условиях. Синтетические пептиды, такие как рилизинг пептид гормона роста (GHRP), а также пептидомиметики, недавно полученные Merck и другими фармацевтическими компаниями, продемонстрировали свою способность стимулировать рилизинг эндогенного GH. Другой аналог тризамещнного GRF1-29, полученный Hoffmann-La Roche в середине 80-х, [дезамино-Tyr1,D-Ala2,Ala15]-GRF1-29,] является суперагонистом с длительным периодом действия. Известно, что средства, усиливающие секрецию GH (GHS), стимулируют высвобождение GH из гипофиза с помощью орфанного G-протеинсвязанного рецептора (GHS-R). Недавно другой эндогенный лиганд для GHS-R идентифицирован как грелин. Он представляет собой октаноилированный пептид(пептид из 28 остатков с н-октаноилом при Ser3). Рекомбинантный GH (rGH) впервые получен в 1985 г. и сейчас выпускается промышленно как для медицинских целей, так и для целей ветеринарии. Однако не определялась долговременная безопасностьrGH. Кроме того, сообщалось о нескольких побочных эффектах при применении rGH, а именно, об индексе массы левого желудочка, повышении уровня сывороточного липопротеина и странном изменении иммунных параметров. Наконец, известно, что частые болюсные инъекции rGH оказывают прогрессирующее суппрессирующее действие на рецепторы и, следовательно, на понижение их эффективности во времени. Помимо этих практических недостатков, экзогенный GH является видоспецифическим, что ограничивает его преимущества по увеличению роста и другое положительное действие на различные виды, то есть на человека и животных. Найдено, что малые количества GRF вызывают значительное выделение гипофизом GH в кровь животных, подвергаемых лечению. Следовательно, GRF имеет значительное терапевтическое применение в тех случаях, когда показан ростовой гормон. Например, его можно применять при лечении гипофизарного инфантилизма, диабета вследствие нарушения продукции GH и замедления роста. Многие другие заболевания или состояния, при которых помогает эндогенная продукция или высвобождение GRF,приведены ниже. Кроме того, GRF применим в сельском хозяйстве. Примеры применения в сельском хозяйстве включают прирост мяса у свиней, крупного рогатого скота и т.п. Известно также, что GRP стимулирует появление (продукцию) молока у дойных коров. До настоящего времени основным недостатком применения родственных пептидам средств, усиливающих секрецию GH, является отсутствие подходящей технологии, способной обеспечить практически линейную и пролонгированную доставку GH в течение продолжительного периода времени, например от нескольких дней до недель.GRF (1-29), как многие другие пептиды, обладающие терапевтическими свойствами, в высшей степени неустойчивы in vivo, что значительно ограничивает их применение в качестве фармацевтического продукта для промотирования высвобождения GH в организме человека и животных. Из-за того что период полужизни GRF 1-29 обычно не превышает 10-13 мин, его следует вводить в виде болюсных инъекций несколько раз в день или в виде вливаний, чтобы поддерживать измеряемый уровень высвобождения GH. Значительные усилия в последние несколько лет исследователи тратят на то, чтобы получить аналоги GRF длительного действия. Хотя синтезировано несколько новых аналогов с повышенной длительностью действия, ни один из них не отвечает критериям, предъявляемым лекарственным препаратам дляGH-рилизинга. Кроме того, не известно ни одного препарата для высвобождения таких неустойчивых пептидов в течение определнного периода времени в организме животных или человека. В патенте США 5846936 описаны аналоги GRF, которые, как сказано, имеют повышенную эффективность, повышенную стабильность в отношении ферментов и повышенную стабильность в период по-1 006484 лужизни. В патенте указано, что аналоги можно вводить с различными адъювантами, такими как сывороточный альбумин. Единственные результаты по стабильности в период полужизни представлены в патенте in vitro. Отсутствуют данные о действительной стабильности in vivo. В патенте США 4963529 описана композиция GRF либо в тврдой, либо в жидкой форме, содержащая GRF и человеческий сывороточный альбумин или глицин. Композиция также может содержать буфер, и утверждается, что она стабилизирует GRF. В Международной заявке WO 9724445 описано слияние ростового гормона (hGH) с молекулой рекомбинантного альбумина. Утверждается, что такой слитый белок имеет повышенное время полужизни в кровотоке по сравнению с неслитым гормоном роста. Между молекулой альбумина и ростовым гормоном может быть встроен линкер, необязательно расщепляемый для того, чтобы облегчить связываниеhGH с рецептором. В Международной заявке WO 0069900 описан способ продуцирования пептидов, стабилизированных в отношении пептидаз. Ряд пептидов GRF перечислен как потенциальные кандидаты, которые можно стабилизировать по способу, раскрываемому в данной заявке, но ни один из них не приведн конкретно в качестве примеров в описании. Следовательно, существует необходимость в создании соединения, устойчивого в течение длительного времени, способного промотировать высвобождение GH в организме субъекта, животного или человека. Такое промотирование предпочтительно должно быть в течение продолжительного периода времени без нежелательных побочных эффектов rGH. Сущность изобретения Согласно данному изобретению предлагается производное рилизинг-фактора ростового гормона(GRF) с повышенным, по сравнению с соответствующей немодифицированной (или нативной) GRP пептидной последовательностью, периодом полужизни in vivo. Более конкретно, производное представляет собой GRF пептид с присоединнной к нему реакционноспособной группой (реакционноспособным фрагментом), способной реагировать с соответствующими функциональными группами компонентов крови in vivo и in vitro с образованием устойчивой ковалентной связи. Реакционноспособная группа может присоединяться к N-концу пептида, к С-концу пептида или к любому другому подходящему сайту вдоль пептидной цепи. Предпочтительные компоненты крови включают белки, такие как иммуноглобулины, включая IgG и IgM, сывороточный альбумин, ферритин, стероид-связывающие белки, трансферрин, тироксинсвязывающий белок, -2-макроглобулин и т.д., причм более предпочтительными являются сывороточный альбумин и IgG, a наиболее предпочтительным является сывороточный альбумин. Предпочтительные реакционноспособные группы способны образовывать ковалентную связь с компонентами крови, реагируя с находящимися в них аминогруппами, гидроксильными группами или тиольными группами, либо in vivo, либо in vitro (или ex vivo). В наиболее предпочтительном варианте изобретения функциональная группа белка может представлять собой тиольную группу, а реакционноспособный фрагмент может являться акцептором Михаэля, таким как акролеиновые производные, ,ненасыщенные кетоны, ,-ненасыщенные сложные эфиры, ,-ненасыщенные амиды, ,-ненасыщенные тиоэфиры и т.п., причм малеинимид или малеинимидсодержащая группа, такая как малеинимидбутириламид (GMBA) или малеинимидпропионовая кислота (МРА), являются наиболее предпочтительными. Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая производноеGRF по данному изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Такая композиция применима для промотирования продукции или высвобождения эндогенного GH в организме субъекта. Композицию можно также применять для производства фармацевтических препаратов или препаратов для ветеринарии для лечения или предотвращения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продукции GH. Перечень таких заболеваний или состояний датся ниже. Ещ одним вариантом настоящего изобретения предлагается способ промотирования эндогенной продукции или высвобождения GH в организме субъекта, животного или человека. Способ включает введение субъекту эффективного количества производного GRF по данному изобретению, одного или в сочетании с фармацевтическим носителем. Ещ в одном варианте данного изобретения предлагается способ лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продукции GH, заключающийся во введении субъекту эффективного количества производного GRF по данному изобретению, одного или в комбинации с фармацевтическим носителем. В другом аспекте данного изобретения предлагается конъюгат, содержащий производное GRF по данному изобретению, ковалентно связанное с компонентом крови. Ещ в одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ увеличения in vivo периода полужизни пептида GRF в организме субъекта, причм способ включает ковалентное присоединение GRF по данному изобретению к компоненту крови. Ковалентное связывание может происходить in vivo или in-2 006484 Предпочтительные GRF представляют собой пептиды, такие как GRF (1-44) и его аналоги, такие как GHRP-6, гексарелин, грелин, GHRP-1, IGF-1, IGF-2, B-HT920, GRF (1-29) и их аналоги и фрагменты,перечисленные ниже, при условии, что такой аналог или фрагмент проявляет активность, практически аналогичную активности GRF. Патенты США 4411890; 4517181; 4518586; 4528190; 4529595; 4563352; 4585756; 4595676; 4605643; 4610976; 4626523; 4628043; 4689318; 4734399; 4784987; 4843064; 5756458; Европейская патентная заявка ЕР 0188214; Международные заявки WO 89/07110; WO 89/07111 и WO 93/04081, каждый из этих патентов и каждая из этих заявок включает дополнительные аналоги GRF, пригодные для дериватизации по данному изобретению. Если связывающая группа находится между реакционноспособной группой (фрагментом) и GRF пептидом, она, предпочтительно, определяется, без ограничения, как линейный или разветвлнный С 1-10 алкил; линейный или разветвлнный частично или перфторированный С 1-10 алкил; C1-10 алкил или фторалкил, в котором один или более атомов углерода заменено на О или S с образованием простого эфира или тиоэфира, например, -Z-CH2CH2-, -Z-CF2CH2-, -Z-CH2CF2- или -Z-CF2-CF2-, где Z обозначает О или S; о-,м- или п-дизамещнный фенил, где заместители одинаковы или различны и представляют собой СН 2, О,S, NH, NR, где R обозначает Н, С 1-10 алкил или C1-10 ацил; или дизамещнные гетероциклы, такие как фуран, тиофен, пиран, оксазол или тиазол. Пояснения к чертежам Фиг. 1 иллюстрирует секрецию GH первичными клетками аденогипофиза крыс после инкубации в течение четырх часов с промышленным GRF(l-29) и соединениями из примеров 1 и 2 в различных концентрациях; фиг. 2 иллюстрирует секрецию GH первичными клетками аденогипофиза крыс после инкубации в течение четырх часов с промышленным D-Ala-GRF(l-29) и соединениями из примеров 3 и 4 в различных концентрациях; фиг. 3 иллюстрирует секрецию GH первичными клетками аденогипофиза крыс после инкубации в течение четырх часов с соединениями из примеров 5 и 6 в различных концентрациях; фиг. 4 иллюстрирует секрецию GH первичными клетками аденогипофиза крыс после инкубации в течение четырх часов с соединениями из примеров 7 и 8 в различных концентрациях; фиг. 5 иллюстрирует секрецию GH у нормальных крыс Sprague-Dawley после однократной подкожной болюсной инъекции соединений из примеров 1 и 2; фиг. 6 иллюстрирует секрецию GH у нормальных крыс Sprague-Dawley после однократной подкожной болюсной инъекции соединений из примеров 3 и 4; фиг. 7 иллюстрирует секрецию GH у нормальных крыс Sprague-Dawley после однократной подкожной болюсной инъекции соединений из примеров 5 и 6; фиг. 8 иллюстрирует секрецию GH (общая площадь поверхности под кривой; AUC) у нормальных крыс Sprague-Dawley после однократной подкожной болюсной инъекции; фиг. 9 - фармакокинетические кривые соединений из примеров 5 и 6 у самцов крыс Sprague-Dawley. Подробное описание изобретенияIn vivo биоконъюгация представляет собой процесс ковалентного связывания молекулы, такой как производное GRF по данному изобретению, в организме с нацеленными компонентами крови, предпочтительно с белками, таким способом, который допускает практическое сохранение в нм биологической активности первоначального немодифицированного GRF, но при этом обеспечивается продолжительная биологическая активность, несмотря на то, что производное GRF приобретает биофизические параметры нацеленного компонента крови. Для целей настоящего изобретения предполагается, что термин "аналог" включает пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, являющиеся различными аминокислотными последовательностями нативной последовательности GRF, но со сходной или сравнимой активностью. Такие аналоги,предпочтительно, имеют аминокислотную последовательность по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95%, идентичную либо последовательности GRF, либо последовательности фрагмента GRF, имеющей такое же число аминокислотных остатков. В более предпочтительном варианте изобретения GRF по данному изобретению содержит пептидGRF, который модифицирован присоединением к нему реакционноспособной группы либо непосредственно, либо через связывающую группу, причм реакционноспособная группа может образовывать ковалентную связь с компонентом крови, предпочтительно с белками крови. Реакционноспособная группа должна быть устойчива в водной среде, а е предпочтительные варианты включают карбоксильную группу, фосфорильную группу, имидатную группу, или ацильную группу либо в виде сложного эфира,либо в виде смешанного ангидрида. Ковалентная связь обычно образуется между реакционноспособной группой и аминогруппой, гидроксигруппой или тиольной группой компонента крови. Аминогруппа предпочтительно образует ковалентную связь с реакционноспособными группами, такими как карбоксигруппа, фосфорильная или ацильная группа; гидроксигруппа предпочтительно образует ковалентную связь с реакционноспособными соединениями, такими как активированные сложные эфиры; а тиольная группа предпочтительно образует ковалентную связь с реакционноспособными соединениями, такими-3 006484 как сложные эфиры или смешанные ангидриды. Предпочтительный компонент крови представляет подвижный компонент крови, такой как сывороточный альбумин, иммуноглобулины или их комбинацию, а предпочтительные реакционноспособные группы представляют собой аналогичные ангидридным малеинимидные группы. Компоненты крови предпочтительно являются подвижными, это означает, что они не имеют фиксированного положения в любой продолжительный период времени, обычно не превышающий 5 мин и более обычно одну минуту. Эти компоненты крови не являются мембраносвязанными и присутствуют в крови в течение продолжительного времени в минимальной концентрации по меньшей мере 0,1 мкг/мл. Предпочтительные подвижные компоненты крови включают сывороточный альбумин, трансферрин,ферритин и иммуноглобулины, такие как IgM и IgG. Период полужизни подвижных (несвязанных) компонентов крови составляет по меньшей мере около 12 ч. Так как производное GRP по данному изобретению содержит пептид, то в процессе синтеза производного могут потребоваться защитные группы. Эти защитные группы являются обычными в области пептидного синтеза и в целом могут быть описаны как химические группы, способные защитить пептидное производное от реакции с самим собой. Соединения, содержащие различные защитные группы, выпускаются промышленностью. Типичные примеры подходящих защитных групп включают ацетил,фторфенилметилоксикарбонил (FMOC), трет.-бутилоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (CBZ) и т.д. В табл. 1 приводятся как трхбуквенные, так и однобуквенные аббревиатуры для аминокислот. Таблица 1 Производное GRF по данному изобретению после конъюгации с компонентом крови образует стабилизированное в отношении пептидазы долго живущее соединение. Также рассматривается, что перед присоединением реакционноспособного фрагмента к пептиду можно добавлять одну или более аминокислот. Такое добавление можно делать на С-конце, N-конце или между ними. Полученное таким образом пептидное производное можно вводить субъекту, животному или человеку, таким образом, что invivo происходит конъюгация с компонентами крови или сначала может происходить конъюгация с компонентами крови субъекта, человека или животного in vitro, и образующийся конъюгат или долго живущее стабилизированное в отношении пептидазы пептидное производное по определению ниже вводят субъекту.-4 006484 Аминокислота, присутствующая, заменяемая или добавляемая к последовательности GRF, может быть D-аминокислотой, или L-аминокислотой, или их комбинацией. Обычно предпочтительными являются L-аминокислоты. Следующие замены или мутации в нативной последовательности пептида GRF (129) или (1-44) являются предпочтительными по изобретению либо независимо, либо в комбинациях: Dаланин в положении 2; глутамин в положении 8; D-аргинин в положении 11; (N-Me)Lys в положении 12; аланин в положении 15; и лейцин в положении 27. Изобретение также включает фрагменты GRF, в которых, хотя они и содержат последовательность,практически гомологичную последовательности природного пептида GRF, может на амино и/или карбоксильном конце отсутствовать одна или более дополнительная аминокислота, которая имеется в природе в нативном GRF пептиде. Следовательно, изобретение относится к полипептидным фрагментамGRF, в которых может отсутствовать одна или более аминокислот, которые имеются в природной последовательности GRF, при условии, что такие полипептиды имеют активность высвобождения гормона роста, которая предпочтительно, по меньшей мере, практически равна активности GRF. Изобретение также охватывает очевидные или тривиальные варианты вышеописанных аналогов или фрагментов, которые содержат незначительные аминокислотные замены (и, следовательно, имеют аминокислотные последовательности, которые отличаются от природной последовательности), при условии, что такие варианты имеют активность высвобождения гормона роста, которая практически равна активности GRF. Примеры очевидных или тривиальных замен включают замену одного основного остатка на другой (т.е. Arg на Lys), замену одного гидрофобного остатка на другой (т.е. Leu на Ilе) или замену одного ароматического остатка на другой (т.е. Phe на Туr) и т.д. Далее, другие тривиальные варианты включают аналоги, в случае которых получают консервативные замены, приводящие к значительной структурной аналогии с первоначальной последовательностью. Примеры таких консервативных замен,без ограничения, включают замену глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту и наоборот; глутамин на аспарагин и наоборот; серии на треонин и наоборот; лизин на аргинин и наоборот; или любой остаток из группы изолейцин, валин или лейцин друг на друга. Стабилизированное в отношении пептидазы GRF производное более устойчиво в присутствии пептидаз in vivo, чем соответствующий нестабилизированный GRP аналог. Устойчивость в отношении пептидаз определяется сравнением периода полужизни нативного GRF аналога в сыворотке или крови с периодом полужизни соответствующего производного, содержащего реакционноспособную группу, в сыворотке или в крови. Период полужизни определяют, отбирая образцы крови или сыворотки после введения производного или немодифицированного пептида и определяя активность каждого компонента. Более подробно, настоящее изобретение направлено на модификацию GRF и родственных пептидов с целью повышения их биодоступности, увеличения in vivo их периода полужизни и распределения за счт селективной конъюгации с компонентом крови без практического изменения их отличительных терапевтических свойств. В более предпочтительном варианте изобретения последовательность пептида GRF, пригодная для дериватизации по данному изобретению, представляет собой следующую последовательность:A21 обозначает Lys, (N-Me)Lys или Asn; А 22 обозначает Tyr или Leu; А 24 обозначает Gln или His; А 25 обозначает Ser или Asp; А 26 обозначает Leu или Ilе; А 27 обозначает Met, Ile, Leu или Nle; А 28 обозначает Ser, Asn, Ala или Asp; А 29 обозначает Lys или Arg; и А 30 отсутствует, обозначает X или Х- Lys, где X отсутствует или обозначает последовательность-5 006484 уменьшен на одну - пятнадцать аминокислот на С-конце; и что один аминокислотный остаток во фрагменте может необязательно быть заменн на остаток лизина; а С-конец может представлять собой свободную карбоновую кислоту или соответствующий амид, при условии, что когда А 2 обозначает Ala, тогда фрагмент не обозначает фрагмент, уменьшенный на 5-8 аминокислот. Изобретение относится к применению производных GRF, имеющих продолжительный период полужизни in vivo, для терапевтических и родственных целей, в частности для повышения уровня гормона роста; диагностики дефицита гормона роста путм введения субъекту аналога производного GRF по данному изобретению и определения ответа гормона роста; лечения гипофизарного инфантилизма; лечения или предупреждения замедления роста; ускорения срастания костей после перелома или заживления ран; ускорения восстановления больных с ожогами или больных, перенесших хирургическую операцию; повышения мышечной силы, подвижности, сохранения кожного слоя, поддержания метаболического гомеостаза или почечного гомеостаза; лечения или предупреждения застойной сердечной недостаточности; лечения или предупреждения слабости, обусловленной старением; лечения или предупреждения остеопороза; лечения или предупреждения ожирения; уменьшения потерь белка в связи с катаболической реакцией после большой хирургической операции; уменьшения кахексии и потери белка вследствие хронического заболевания; улучшения белкового анаболизма (включая сбережение белков); индуцирования липолитического эффекта и/или повышения соматотрофической функции. Все вышеприведнные методы можно применять как в отношении людей, так и в отношении животных. Помимо промотирования эндогенной продукции или высвобождения гормона роста в производныеGRF по данному изобретению может быть введена аминокислотная замена в один или более сайтов остова пептида GRF; или имеется вариант GRF пептида, в котором С-конец или N-конец изменн путм добавления одного или более основных остатков или модифицирован за счт введения блокирующей группы, обычно применяемой в химии пептидов для защиты пептидного конца от нежелательной биохимической атаки и расщепления in vivo. Таким образом, производные GRF по данному изобретению вводят аминокислотную замену в контекст любых GRF пептидов, включая, но без ограничения, человеческий GRF, бычий GRF, крысиный GRF, GRF свиньи и т.д., последовательности которых описаны многими авторами. В более предпочтительном варианте изобретения остаток лизина добавляют на С-конце или N-конце GRF-пептидной последовательности. В предпочтительном варианте изобретения функциональной группой белка является тиольная группа, а реакционноспособной группой (реакционноспособным фрагментом) является малеинимидная группа или малеинимидосодержащая группа, такая как -малеинимидбутириламид (GMBA), малеинимидопропионовая кислота (МРА), (2-амино)этоксиуксусная кислота (АЕА)-МРА, этилендиамин(ЕDА)МРА или [2-(2-амино)этокси)]этоксиуксусная кислота (АЕЕА)-МРА и их комбинации. Примеры комбинаций включают, без ограничения, (АЕЕА- EDA)-MPA; (АЕЕА- АЕЕА)-МРА, (АЕА- АЕЕА)-МРА и т.п. Малеинимидогруппа является наиболее селективной для сульфгидрильньгх групп в пептидах, когда рН реакционной смеси остатся 6,5-7,4. При рН 7,0 скорость реакции малеинимидогрупп с сульфгидрильными группами в 1000 раз быстрее, чем с аминогруппами. При реакции между малеинимидной и сульфгидрильной группами образуется устойчивая тиоэфирная связь, которая не расщепляется в физиологических условиях. Производные GRF по изобретению обеспечивают специфическое мечение компонентов крови. Такое специфическое мечение, в частности, малеинимидом дат ряд преимуществ. Тиольные группы менее распространены in vivo, чем аминогруппы, и, в результате, малеинимидные производные ковалентно связываются с меньшим количеством белков. Например, в молекуле сывороточного альбумина имеется только одна свободная тиольная группа. Поэтому примерное молярное соотношение пептида и альбумина в конъюгате GRF - малеинимид - альбумин составляет 1:1. Помимо альбумина свободные тиольные группы содержат также молекулы IgG (класс II). Так как молекулы IgG и сывороточного альбумина составляет основную часть растворимых белков в крови, они также содержат основную часть тиольных групп, способных ковалентно связываться с малеинимидозамещнными GRF. Далее, даже среди содержащих свободные тиольные группы белков крови специфическое мечение малеинимидом приводит к преимущественному образованию конъюгатов пептидмалеинимид - альбумин вследствие уникальных особенностей самого альбумина. Единственная свободная тиольная группа альбумина, высококонсервативная среди этих групп, расположена в аминокислотном остатке Cys34. Недавно было показано, что Cys34 альбумина обладает повышенной реакционной способностью по сравнению со-6 006484 свободными тиолами других тиолсодержащих белков. Это частично объясняется очень низким значением рК для Cys34 альбумина, равным 5,5. Эта величина значительно ниже, чем типичные значения рК для цистеиновых остатков в целом, равной, как правило, примерно 8. Из-за низкого значения рК Cys34 альбумина в обычных физиологических условиях преимущественно находится в ионизированной форме, которая резко повышает е реакционную способность. Помимо низкого значения рК Cys34 другим фактором, который повышает реакционную способность Cys34 является его локализация в щели около поверхности одной петли области V альбумина. Это местоположение делает Cys34 очень доступным для лигандов всех видов и является важным фактором, определяющим биологическую роль Cys34 в качестве ловушки свободных радикалов и скавенджер свободных тиольных групп. В результате скорость реакции может увеличиваться в 1000 раз по сравнению со скоростью реакции пептид - малеинимидов с другими белками, содержащими свободные тиольные группы. Другим преимуществом конъюгатов пептид - малеинимид - альбумин является воспроизводимость,обусловленная соотношением пептида к альбумину 1:1 специфически по остатку Cys34. Обычные методы активации, например с помощью глутаральдегида, DCC, EDC и других химических активаторов, не дают возможности достичь такой селективности. Например, альбумин содержит 52 остатка лизина, 25-30 из которых локализовано на поверхности альбумина и доступно для конъюгирования. Активирование этих остатков лизина или же модификация пептида в пару за счт этих остатков лизина приводит к гетерогенной популяции конъюгатов. Даже если применяется эквимолярное соотношение (т.е. 1:1), конечный результат - это случайные продукты конъюгации, причм некоторые из них содержат неопределнное число пептидов, связанных с каждой молекулой альбумина, и каждый конъюгат содержит пептиды, произвольно соединнные по любому из 25-30 подходящих сайтов лизина. Соответственно, точная характеристика композиции фактически невозможна, не говоря об отсутствии воспроизводимости. Кроме того,хотя может показаться, что конъюгация за счт лизиновых остатков альбумина дат, по меньшей мере,преимущество при доставке большего количества терапевтического агента на молекулу альбумина, исследования показали, что предпочтительным является соотношение терапевтического агента и альбумина, равное 1:1. В статье Stehle, et al. в Anticancer Drugs, 1997, 8, 677-685, которая вводится в данное описание во всей полноте, сообщается, что отношение противоракового метотрексата к альбумину, конъюгированному через глутаральдегид, дат обещающие результаты. Эти конъюгаты поглощаются опухолевыми клетками, тогда как конъюгаты, несущие молекулы метотрексата от 5:1 до 20:1, изменяют ВЭЖХхроматограмму и быстро поглощаются в печени in vivo. Казалось бы, что при более высоких соотношениях конформационные изменения в альбумине уменьшают его эффективность в качестве носителя терапевтического агента. С помощью регулируемого введения производного GRF по данному изобретению, и в особенностиGRF, содержащего реакционноспособный малеинимидный фрагмент, можно регулировать специфическое in vivo мечение или связывание альбумина и IgG. Показано, что при типичном введении 80-90% вводимых пептидных производных связывается с альбумином и менее 5% связывается с IgG. Также имеются следовые количества связывания свободных тиолов, таких как глутатион. Такое специфическое связывание предпочтительно для применения in vivo, так как оно позволяет точно рассчитывать оцениваемый период полужизни вводимого терапевтического агента. Помимо обеспечения регулируемого специфического in vivo связывания малеинимидзамещнный пептид GRF может обеспечивать специфическое мечение сывороточного альбумина и IgG ex vivo. Такоеex vivo связывание включает добавление малеинимид-пептидов к раствору крови, сыворотки или физиологическому раствору, содержащему очищенные компоненты крови, такие как сывороточный альбумин и/или IgG. В предпочтительном формате в производное вводят заместитель малеинимид, необязательно через связывающую группу, и он реагирует с сывороточным альбумином в физиологическом растворе. После модификации ex vivo с помощью производных GRF по настоящему изобретению кровь, сыворотку или физиологический раствор можно снова вводить в кровь с целью лечения in vivo. Малеинимид - замещнные пептиды GRF, как правило, совершенно устойчивы в водных растворах и в присутствии свободных аминов. Так как малеинимидзамещнные пептиды GRF реагируют со свободными тиолами, для предотвращения их реакции с самими собой не нужны защитные группы. Кроме того, повышенная стабильность пептидного производного позволяет использовать дополнительные стадии очистки, например ВЭЖХ, для получения продуктов высокой степени чистоты, пригодных для применения in vivo. Наконец, повышенная химическая стабильность обеспечивает продукту более длительное время хранения. Требуемые конъюгаты производных GRF с компонентами крови можно получать in vivo, непосредственно введя производные субъекту, который может быть животным или человеком. Введение можно осуществлять в виде болюса или можно вводить медленно во времени с помощью инфузии с определнной скоростью тока и т.п. Или же конъюгат можно получать также ex vivo, объединяя кровь или промышленные очищенные компоненты крови с производным GRF по данному изобретению, что дат возможность ковалентного связывания производного GRF по функциональным группам компонентов крови, а затем "возвращение" или введение конъюгированной крови или конъюгированного очищенного компонента крови хозяину.-7 006484 Кроме того, вышеописанное можно выполнять, сначала очищая индивидуальный компонент или ограниченное число компонентов, таких как эритроциты, иммуноглобулины, сывороточный альбумин и т.п., и объединение этого компонента или этих компонентов с соединением по данному изобретению ex vivo. Меченая кровь или меченый компонент крови можно затем "возвратить" субъекту, чтобы в условиях invivo иметь терапевтически эффективные конъюгаты. Кровь можно также обработать, чтобы предотвратить коагуляцию во время операций ex vivo. Пептидный синтез Пептиды GRF можно синтезировать стандартными методами твердофазного пептидного синтеза,хорошо известными любому рядовому специалисту в данной области техники. Например, пептид можно синтезировать методами твердофазного пептидного синтеза, описанными Steward et al. в Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, 111., (1984), используя синтезатор Applied Biosystem. Аналогично пептидные фрагменты можно синтезировать, а затем объединить или связать вместе с образованием более протяжнного пептида. Эти синтетические пептидные фрагменты также могут быть получены с аминокислотными заменами в специфических положениях. Обзор многих методов твердофазного пептидного синтеза можно найти в Steward et al. в Solid PhasePeptide Synthesis, W.H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 и Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides,1973, 246. О классическом синтезе в растворе см., например, Schroder et al., в "The Peptides", volume 1,Academic Press (New York). В целом такие методы включают последовательное присоединение одной или более аминокислот или защищенных соответствующим образом аминокислот к наращиваемой пептидной цепи. Обычно либо аминогруппу, либо карбоксильную группу первой аминокислоты защищают с помощью соответствующей защитной группы. Защищенную или дериватизированную аминокислоту затем либо иммобилизуют на инертном тврдом носителе, либо используют в растворе, добавляя следующую аминокислоту в последовательности, содержащую комплементарную (амино или карбоксильную) группу, соответствующим образом защищенную и в условиях, подходящих для образования амидной связи. Затем защитную группу удаляют с этого вновь образованного остатка добавляемой аминокислоты и добавляют следующую аминокислоту (соответствующим образом защищенную) и т.д. После того, как все нужные аминокислоты соединены в соответствующей последовательности, последовательно или одновременно удаляют все оставшиеся защитные группы (и весь тврдый носитель) и получают конечный полипептид. Простой модификацией этой общей методики можно добавлять к наращиваемой цепи более одной аминокислоты за определнное время, например, соединяя (в условиях, в которых хиральные центры не рацемизируются) защищенный трипептид с защищенным соответствующим образом дипептидом, при этом образуется после депротекции пентапептид. Особенно предпочтительным способом получения производных GRF по данному изобретению является твердофазный пептидный синтез, причм аминокислотный -N-конец защищен группой, чувствительной к кислоте или к основанию. Такие защитные группы должны быть устойчивыми к условиям образования пептидной связи, в то же время они должны легко сниматься без нарушения растущей пептидной цепи или рацемизации какого-либо хирального центра, содержащегося в ней. Примеры N-защитных групп и карбоксизащитных групп приведены в монографии Greene, "Protective Groups In Organic Synthesis", (John WileySons, New York pp. 152-186 (1981. Примеры N-защитных групп включают, без ограничения, низшие алканоильные группы, такие как формил, ацетил ("Ас"), пропионил, пивалоил, трет.бутилацетил и т.п.; другие ацильные группы включают 2-хлорацетил, 2-бромацетил, трифторацетил, трихлорацетил, фталил, о-нитрофеноксиацетил, -хлорбутирил, бензоил, 4-хлорбензоил, 4-бромбензоил, 4 нитробензоил и т.п.; сульфонильные группы, такие как бензолсульфонил, п-толуолсулъфонил, онитрофенилсульфонил, 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил (pmc) и т.п.; группы, образующие карбаматы, такие как трет-амилоксикарбонил, бензилоксикарбонил, п-хлорбензилоксикарбонил, п-мето-ксибензилоксикарбонил,п-нитробензилоксикарбонил,2-нитробензил оксикарбонил,п-бромбензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, 2,4-диметоксибензилоксикарбонил, 4-этоксибензилоксикарбонил, 2-нитро-4,5-диметоксибензилоксикарбонил, 3,4,5 триметоксибензилоксикарбонил,1-(п-бифенилил)-1-метилэтоксикарбонил-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонил, бензгидрилилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил (boc), диизопропилметоксикарбонил, изопропилоксикарбонил, этоксикарбонил, метоксикарбонил, аллилоксикарбонил, 2,2,2 трихлорэтоксикарбонил, феноксикарбонил, 4-нитрофеноксикарбонил, фторфенил-9-метоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, фенилтиокарбонил и т.п.; арилалкильные группы, такие как бензил, бифенилизопропилоксикарбонил, трифенилметил, бензилоксиметил, 9-фторфенилметилоксикарбонил (Fmoc) и т.п., и силильные группы, такие как триметилсилил и т.п. Предпочтительными -N-защитньгми группами являются о-нитрофенилсульфенил; 9 фторфенилметилоксикарбонил; трет-бутоксикарбонил(boc),изоборнилоксикарбонил; 3,5 диметоксибензилоксикарбонил; трет-амилоксикарбонил; 2-циано-трет-бутилоксикарбонил и т.п., более предпочтительной группой является 9-фторфенилметилоксикарбонил (Fmoc), тогда как предпочтительными N-защитными группами боковой цепи являются 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил (pmc),нитро, п-толуолсульфонил, 4-метоксибензолсульфонил, Cbz, Boc и адамантилоксикарбонил - для ами-8 006484 ногрупп боковых цепей, таких как лизин и аргинин; бензил, бромбензилоксикарбонил, 2,6-дихлорбензил,изопропил, трет-бутил (трет-Bu), циклогексил, циклопентил и ацетил (Ас) для тирозина; трет-бутил, бензил и тетрагидропиранил для серина; тритил, бензил, Cbz, п-толуолсульфонил и 2,4-динитрофенил для гистидина; формил для триптофана; бензил и трет-бутил для аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; и трифенилметил (тритил) для цистеина. Защитная группа для карбоксильной группы обычно относится к защитной сложноэфирной или амидной группе. Такие карбоксизащитные группы хорошо известны специалистам в данной области техники, они широко применяются для защиты карбоксильных групп в химии пенициллина и цефалоспоринов, как описано в Патентах США 3840556 и 3719667, которые во всей полноте вводятся в данное описание в качестве ссылки. Репрезентативные карбоксизащитные группы включают, без ограничения,низший алкил C1-C8; арилалкил, такой как фенетил или бензил и их замещнные производные, такие как алкоксибензильная или нитробензильная группы; арилалкенил, такой как фенилэтенил; арил и его замещнные производные, такие как 5-инданил; диалкиламиноалкил, такой как диметиламиноэтил; алканоилоксиалкильные группы, такие как ацетоксиметил, бутирилоксиметил, валерилоксиметил, изобутирилоксиметил, изовалерилоксиметил, 1-(пропионилокси)-1-этил, 1-(пивалоилоксил)-1-этил, 1-метил-1(пропионилокси)-1-этил, пивалоилоксиметил, пропионилоксиметил; циклоалканоилоксиалкильные группы, такие как циклопропилкарбонилоксиметил, циклобутилкарбонилоксиметил, циклогексилкарбонилоксиметил; ароилоксиалкил, такие как бензоилоксиметил, бензоилоксиэтил; арилалкилкарбонилоксиалкил, такой как бензилкарбонилоксиалкил, 2-бензилкарбонилоксиэтил; алкоксикарбонилалкил или циклоалкилоксикарбонилалкил, такой как метоксикарбонилметил, циклогексилоксикарбонилметил, 1 метоксикарбонил-1- этил; алкоксикарбонилоксиалкил или циклоалкилоксикарбонилоксиалкил, такой как метоксикарбонилоксиметил, трет-бутилоксикарбонилоксиметил, 1-этоксикарбонил-1-этил, 1-циклогексилоксикарбонилокси-1-этил; арилоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(феноксикарбонилокси)этил, 2(5-инданилоксикарбонилокси)этил; алкоксиалкилкарбонилоксиалкил, такой как 2-(1-метокси-2 метилпропан-2-оилокси)-этил; арилалкоксикарбонилоксиалкил,такой как 2-(бензилоксикарбонилокси)этил; арилалкенилоксикарбонилоксиалкил, такой как 2-(3-фенилпропен-2-илоксикарбонил-окси)этил; алкоксикарбониламиноалкил, такой как трет-бутоксикарбониламинометил; алкиламинокарбониламиноалкил, такой как метиламинокарбониламинометил; алканоиламиноалкил, такой как ацетиламинометил; гетероциклилкарбонилоксиалкил,такой как 4-метилпиперазинилкарбонилоксиметил; диалкиламинокарбонилалкил, такой как диметиламинокарбонилметил, диэтиламинокарбонилметил; (5-(низший алкил)-2-оксо-1,3-диоксоленил)алкил, такой как (5-трет-бутил-2-оксо-1,3 диоксолен-4-ил)метил; и (5-фенил-2-оксо-1,3-диоксолен-4-ил)алкил, такой как (5-фенил-2-оксо-1,3 диоксолен-4-ил)метил. Репрезентативные амидкарбоксизащитные группы включают, без ограничения,аминокарбонильные и низшие алкиламинокарбонильные группы. Из вышеприведнных карбоксизащитных групп предпочтительными являются сложноэфирные группы, содержащие низший алкил,циклоалкил или арилалкил, например, метиловый эфир, этиловый эфир, пропиловый эфир, изопропиловый эфир, бутиловый эфир, вт-бутиловый эфир, амиловый эфир, изоамиловый эфир, октиловый эфир,циклогексиловый эфир, фенилэтиловый эфир и т.п., или алканоилоксиалкиловый эфир, циклоалканоилоксиалкиловый эфир, ароилоксиалкиловый эфир или арилалкилкарбонилоксиалкиловый эфир. Предпочтительными амидкарбоксизащитными группами являются (низший алкил)аминокарбонильные группы. По методу твердофазного пептидного синтеза -С-концевую аминокислоту прикрепляют (иммобилизуют) к соответствующему тврдому носителю или полимеру. Подходящие тврдые носители, применимые для вышеуказанного синтеза, представляют собой материалы, инертные в отношении реагентов и условий постадийного проведения реакций конденсации - снятия защиты, а также не растворимые в применяемых средах. Предпочтительным тврдым носителем (подложкой) для синтеза -С-концевых карбоксипептидов является 4-гидроксиметилфеноксиметил-сополимер(стирол-1% дивинилбензол). Предпочтительным тврдым носителем (подложкой) для синтеза -С-концевых амидопептидов является полимер 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)-феноксиацетамидоэтила, выпускаемый Applied Biosystems (Foster City, Calif.). -C-концевая аминокислота соединяется с полимером в присутствии(ВОРС 1), опосредующих соединение, в течение примерно 1-24 ч при температуре между 10 и 50 С в растворителе, таком как хлористый метилен или ДМФА. Если тврдым носителем является полимер 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)феноксиацетамидоэтила, Fmoc-группа отщепляется вторичным амином, предпочтительно пиперидином, прежде чем полимер соединится с -С-концевой аминокислотой. Предпочтительным методом присоединения к полимеру 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)феноксиацетамидоэтила после снятия защиты является реакция в присутствии О-бензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-9 006484 тетраметилуронийгексафторфосфата (HBTU, 1 экв.), диизопропилэтиламина (DIEA, 1 экв.) и, необязательно, 1- гидроксибензотриазола (НОВТ, 1 эквив.) в ДМФА. Присоединение последовательно защищаемых аминокислот можно проводить в автоматическом синтезаторе полипептидов обычным методом,хорошо известным в технике. Снятие Fmoc-защитной группы с -N-концевой стороны наращиваемого пептида выполняют обычным способом, например обработкой вторичным амином, предпочтительно пиперидином. Каждую защищенную аминокислоту затем вводят примерно в 3 х-кратном молярном избытке и присоединение предпочтительно проводят в ДМФА. Конденсирующим агентом обычно является О-бензотриазол-1-илN,N,N',N'-тетраметалуронийгексафторфосфат (HBTU, 1 экв.), диизопропилэтиламин (DIEA, 1 экв.) и,необязательно, 1- гидроксибензотриазол (НОВТ, 1 эквив.). В конце твердофазного синтеза пептид снимают с полимера и снимают защиту либо последовательно, либо одновременно. Удаление полипептида и снятие защиты можно осуществлять обычным способом в виде одной операции обработкой связанного с полимером полипептида с расщепляющим реагентом, содержащим тиоанизол, триизопропилсилан, фенол и трифторуксусную кислоту. В случаях, когда -С-конец полипептида представляет собой алкиламид, смолу отщепляют аминолизом алкиламином. Или же пептид можно удалять переэтерификацией, например метанолом, с последующим аминолизом или прямым переамидированием. Защищенный пептид можно очищать на этой стадии или непосредственно брать в следующую стадию. Удаление защитных групп боковой цепи выполняют, используя описанную выше смесь для отщепления. Полностью защищенный пептид можно очищать с помощью последовательных хроматографических операций, используя все приведнные ниже виды хроматографии или любой из них: ионообменную хроматографию на слабоосновных смолах (ацетатная форма); гидрофобную адсорбционную хроматографию на недериватизированном полистиролдивинилбензоле (таком как Amberlite XAD); адсорбционную хроматографию на силикагеле; ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе, например на Sephadex G-25, LH-2- или противоточное распределение; высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), в особенности обращнно-фазовую ВЭЖХ на связанной с октил- или октадецилсилил-силикагелем в качестве наполнителя в колонке. Любой рядовой специалист в данной области техники способен легко определить, какие предпочтительные хроматографические стадии или последовательности требуются для получения приемлемой степени очисткиGRF пептида. Молекулярные веса этих пептидов определяют квадрупольной масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением. Процесс синтеза производных GRF по данному изобретению меняется в широких пределах в зависимости от природы различных элементов, т.е. последовательности GRF, связывающей группы и реакционноспособной группы, имеющейся в производном GRF. Методики синтеза выбирают так, чтобы обеспечить простоту, высокий выход и воспроизводимость, а также продукт высокой степени чистоты. Обычно присоединение за счт химически реакционноспособной группы происходит на последней стадии синтеза. Конкретные методы получения производных GRP по данному изобретению приводятся далее. Требованием является то, что химически реакционноспособная группа должна быть расположена в таком сайте, который дат возможность пептиду связываться с компонентом крови, сохраняя при этом основную часть активности и/или полезного действия, если не всю активность и не все полезные свойства, исходного GRF пептида. В более предпочтительном варианте каждое производное GRF синтезируют в соответствии со следующими критериями. Если концевая карбоксильная группа пептида доступна и не является важной для сохранения фармакологической активности и никакой другой чувствительной функциональной группы в пептиде не имеется, тогда в качестве места прикрепления модификации "связывающая группа реакционноспособная группа" выбирают карбоксильную группу. Если концевая карбоксильная группа связана с фармакологической активностью, или ни одна из карбоновых кислот не доступна, тогда в качестве места прикрепления модификации "связывающая группа - реакционноспособная группа" выбирают любую другую чувствительную функциональную группу, не являющуюся важной для сохранения фармакологической активности. Если в пептиде доступными являются несколько чувствительных функциональных групп, сочетание защитных групп используют таким образом, чтобы после соединения связывающей группы/реакционноспособной группы и депротекции всех чувствительных функциональных групп по-прежнему сохранялась фармакологическая активность. Если в пептиде отсутствуют доступные чувствительные функциональные группы, то применяют синтетические методы для такой модификации исходного пептида, которая бы позволила сохранить биологическую активность исходного пептида и рецепторную специфичность и специфичность в отношении мишени. В этом случае модификацию предпочтительно осуществляют на противоположном конце пептида. Производные GRP по данному изобретению можно применять индивидуально или в комбинации с другими лекарственными веществами или фармацевтическими продуктами для оптимизации их терапевтического действия. Их можно вводить в физиологически приемлемой среде, например в деионизиро- 10006484 ванной воде, физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS), физиологическом растворе, водном этаноле или водном растворе другого спирта, плазме, белковых растворах, манните, водной глюкозе,спирте, растительном масле и т.п. Другие добавки, которые могут быть включены, содержат буферы, рН среды которых обычно забуферивают таким образом, чтобы значения их рН были в интервале от 5 до 10,в которых концентрация буфера составляет около 50-250 мМ, в которых концентрация соли обычно находится в интервале около 5-500 мМ, физиологически приемлемые стабилизаторы и т.п. Композиции могут быть лиофилизированы для удобства хранения и транспортировки. Пептидные производные по данному изобретению можно вводить перорально, парентерально, например интраваскулярно (внутрисосудистая инъекция, IV, ВС), внутриартериально (IA, ВА), внутримышечно (IM, ВМ), подкожно (SC) и т.п. В соответствующих ситуациях можно вводить в виде вливания. В некоторых случаях, когда функциональная группа реагирует довольно медленно, можно применять пероральное, назальное, ректальное, трансдермальное введение, введение в виде аэрозолей, если природа конъюгата позволяет перенос в сосудистую систему. Обычно применяют единичную инъекцию, хотя, в случае необходимости, можно делать более одной инъекции. Пептидное производное можно вводить обычными средствами, включая шприц, троакар, катетер и т.п. Конкретный способ введения в большей степени зависит от вводимого количества, от того, нужна ли единичная болюсная инъекция или продолжительное введение, и т.п. Предпочтительно введение является внутрисосудистым, если место введения не является важным для данного изобретения, предпочтительно в место, где быстрый ток крови, например внутривенно, в периферическую или центральную вену. Могут найти применение другие способы,при которых используют пролонгированное введение или защитную матрицу. Целью является эффективное распределение пептидов в крови, так чтобы они могли реагировать с компонентами крови. Концентрация конъюгата изменяется в очень широких пределах, как правило, около 1 пг/мл - 50 мг/мл. При внутрисосудистом введении количество пептида составляет, как правило, около 0,1-10 мг/мл, более часто около 1-5 мг/мл. Связывание с долгоживущими компонентами крови, такими как иммуноглобулин, сывороточный альбумин, эритроциты и тромбоциты, обеспечивает ряд преимуществ. Активность пептидных производных по данному изобретению пролонгируется до дней, возможно, до недель. В течение этого времени требуется лишь однократное введение. Можно достичь более высокой специфичности, так как активное соединение сначала связывается с большой молекулой, которая с меньшей вероятностью поглощается клеткой, чтобы помешать другим физиологическим процессам. Кровь хозяина - млекопитающего можно проверять на активность пептидов и/или присутствие пептидных производных. Беря часть или пробу крови хозяина в разное время, можно определить, связался ли пептид с долгоживущими компонентами крови в достаточном количестве, чтобы быть терапевтически активным, а затем, уровень пептида в крови. Если требуется, можно также определить, с каким из компонентов крови ковалентно связан пептид. Для конкретных малеинимидзамещнных пептидов просто вычислить период полужизни сывороточного альбумина и IgG. Мониторинг также можно осуществлять,применяя анализ пептидной активности, ВЭЖХ-масс-спектрометрию (MS) или антитела к пептидам. Другой аспект данного изобретения относится к способам определения концентрации GRF пептида или его конъюгата в биологических образцах (таких как кровь) с применением антител, специфических в отношении пептидов, и к применению таких антител для преодоления токсичности, вероятно, обусловленной такими пептидами или конъюгатами. Это является преимуществом, так как продолжительное присутствие и продолжительное существование производных GRF in vivo в организме больного может вызвать новые проблемы, включая повышенную вероятность токсичности. Применение антител "против производных", моноклональных или поликлоналъных, специфических в отношении конкретных производных, может помочь решить эту проблему. Антитело может быть генерировано или получено от хозяина, иммунизированного конкретным модифицированным пептидом, или иммуногенным фрагментом агента, или синтезированным иммуногеном, соответствующим антигенной детерминанте агента. Предпочтительные антитела обладают высокой специфичностью и сродством (аффинностью) к нативной,дериватизированной и конъюгированной формам пептидного производного. Такие антитела можно также метить ферментами, флуорохромами или радиоактивными метками. Антитела, специфические в отношении производных GRF, можно получать, используя очищенные пептиды для индукции антител, специфических в отношении дериватизированных пептидов. Под индукцией антител понимается не только стимуляция иммунного ответа с помощью инъекции животному, но аналогичные стадии при получении синтетических антител или других специфических связывающих молекул, например скрининг библиотек рекомбинантных иммуноглобулинов. Как моноклональные, так и поликлональные антитела можно получать по методикам, хорошо известным в технике. Антитела могут также использоваться для мониторинга присутствия производного в кровотоке. Образцы крови и/или сыворотки можно анализировать методом SDS-PAGE и вестерн-блоттингом. Такие методы позволяют анализировать кровь или сыворотку для определения связывания производного GRF с компонентами крови. Антитела к антитерапевтическому агенту можно также использовать для лечения токсичности, вызванной введением производного GRF, их можно вводить ех vivo или in vivo. Методы ex vivo включают- 11006484 иммунодиализное лечение токсичности с применением антител к антитерапевтическому агенту, иммобилизованных на тврдом носителе. Методы in vivo включают введение антител к антитерапевтическому агенту в количествах, эффективных для индукции клиренса комплексов антитело-агент. Антитела можно использовать для удаления производных GRF и их конъюгатов из крови больныхex vivo при контактировании крови с антителами в стерильных условиях. Например, антитела можно прикреплять или иным образом иммобилизовать в колонке с носителем, у больного можно взять кровь и пропустить через колонку. Производные GRF свяжутся с антителами, и кровь, содержащую небольшую концентрацию производного GRF, можно затем снова ввести в кровоток больного. Количество отбираемого производного GRF можно контролировать, регулируя давление и скорость тока. Предпочтительного удаления производного GRF из компонента плазмы крови больного можно достигнуть, например, используя полупроницаемую мембрану или, иначе, сначала отделяя компонент плазмы от компонентов клетки способами, известными в технике, перед тем как пропускать компонент плазмы через колонку с носителем, содержащим антитерапевтические антитела. Или же предпочтительного удаления производного, конъюгированного с клетками крови, включая эритроциты, можно достичь, собирая и концентрируя клетки крови больного и затем осуществляя контактирование этих клеток с фиксированными антителами против пептида для исключения компонента сыворотки крови больного. Антитела против пептида можно вводить in vivo парентерально больному, который получал в качестве лечения GRP производное или конъюгат. Антитела связываются с GRF производным или конъюгатами. Связывание GRF производного препятствует его активности, если не полностью блокирует е, тем самым уменьшая биологически активную концентрацию производного GRF в кровотоке больного и сводя к минимуму побочные эффекты. Кроме того, связанный комплекс антитело - пептид облегчает клиренс производного GRF и конъюгатов из кровотока больного. Следующие примеры приводятся для иллюстрации предпочтительных вариантов изобретения, и их ни в коей мере нельзя рассматривать как ограничивающие его объм. Если не указано иначе, используют оптически активные защищенные аминокислоты в L-конфигурации. Синтез Синтез производных GRF осуществляют по методике автоматизированной твердофазной реакции в синтезаторе пептидов Symphony с вмешательством при получении производных. Синтез проводят наFmoc - защищенной Ramage амидной линкерной смоле, используя Fmoc-защищенные аминокислоты. Присоединение осуществляют с помощью О-бензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфата (HBTU) и диизопропилэтиламина (DIEA) в качестве активирующей смеси в раствореN, N-диметилформамида (ДМФА). Защитную группу Fmoc удаляют с помощью 20% раствора пиперидина в ДМФА. При необходимости для получения свободного Na-конца после отщепления пептида от полимера используют Boc-защищенную аминокислоту. Если не указано иначе, в синтезе используют кислоты с L-конфигурацией. Для синтеза используют реакционные сосуды из силиконизированного стекла. Пример 1.Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-LeuGln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2 Стадия 1: Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты: Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, FmocMet-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, FmocLys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-Tyr(tBu)ОН. Их растворяют в N,N-диметилформамиде (ДМФА) и в соответствии с последовательностью активируют, используя О-бензотриазол-1-ил-N,N,N',N'тетраметилуроний-гексафторфосфат (HBTU) или диизопропилэтиламин (DIEA). Удаление Fmoc защитной группы осуществляют с помощью 20 об.% раствора пиперидина в N,N-диметилформамиде (ДМФА) в течение 20 мин (стадия 1). Аминогруппу конечной аминокислоты ацилируют уксусной кислотой в присутствии О-бензотриазол-l-ил-N,N,N',N'-тетраметилуроний-гексафторфосфата (HBTU) или диизопропилэтиламина (DIEA). Стадия 2: Пептид снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением ледяным (0-4 С) Et2O. Сырой пептид собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила (40%) с водой (0,1% ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующий сырой продукт, используемый для очистки. Пример 2. Долгоживущее производное GRF пептида из примера 1Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-LeuGln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 1, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Fmoc-Lys(Aloc)-OH.- 12006484 Стадия 2. Селективную депротекцию Lys (Aloc) группы осуществляют вручную и выполняют, обрабатывая полимер раствором 3 экв. Рd(PPh3)4 в 5 мл С 6 Н 6:СНСl3 (1:1): 2,5 об.% NMM : 5 об.% АсОН в течение 2 ч. Затем раствор промывают СНСl3 (6x5 мл), 20% АсОН в DCM (в хлористом метилене, 6x5 мл) DCM (6x5 мл.) и ДМФА (6x5 мл). Стадия 3. Синтез снова автоматизируют для прибавления 3-малеинимидопропионовой кислоты(МРА). Между прибавлениями (присоединениями) смолу три раза промывают N,N-диметилформамидом(ДМФА) и три раза изопропанолом. Стадия 4. Производное снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением ледяным (0-4 С) Et2O. Сырой продукт производное собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила(40%) с водой (0,1% ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующий сырой продукт, используемый для очистки. Пример 3.Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-LeuGln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие зашдщнные аминокислоты:Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, FmocPhe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)ala-OH, Boc-Tyr(tBu)-OH. Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 1, стадия 2. Пример 4. Долгоживущее производное GRF пептида из примера 3Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-LeuGln-Asp-Ile-Met- Ser- Arg-Lys(MPA)-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 3, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Fmoc-Lys(Aloc)-OH. Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 2, стадии 2-4. Пример 5.Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-AIa-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-LeuGln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, FmocPhe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)ala-OH, Boc-Tyr(tBu)-OH. Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 1, стадия 2. Пример 6. Долгоживущее производное GRF пептида из примера 5Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-LeuGln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 5, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Fmoc-Lys(Aloc)-OH. Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 2, стадии 2-4. Пример 7.Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-(D)Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc- Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)Ala-OH,Boc-Tyr(tBu)-OH. Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 1, стадия 2. Пример 8. Долгоживущее производное GRF пептида из примера 7Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-GIn-Ser-Tyr-(D)Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 7, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Fmoc-Lys(Aloc)-OH.Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu- Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2 Стадия 1: Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-(NMe)Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, FmocThr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)Ala-OH, BocTyr(tBu)-OH. Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 1, стадия 2. Пример 10. Долгоживущее производное GRF пептида из примера 9Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 9, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Fmoc-Lys(Aloc)-OH. Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 2, стадии 2-4. Пример 11. Второе долгоживущее производное GRF пептида из примера 9Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-LeuGln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, FmocPhe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)Ala-OH, Boc-Tyr(tBu)-OH. Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 2, стадии 2-4. Пример 13. Долгоживущее производное пептида GRF из примера 12Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-LeuGln-Asp-Ile-Met-Ser-Asn-Lys(MPA)-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят как, описано выше в примере 12, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Fmoc-Lys(Aloc)-OH. Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 2, стадии 2-4. Пример 14 А (Бычий GRF).Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Tbx-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-LeuGln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-GLn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, FmocPhe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)Ala-OH, Boc-Tyr(tBu)-OH. Стадия 2. Эту стадию проводят,как описано в примере 1, стадия 2. Пример 14 В. Долгоживущее производное пептида GRF из примера 14 А- 14006484 Стадия 1. Эту стадию проводят, как в примере 14 А, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Fmoc-Lys(Aloc)-ОН. Стадия 2. Селективную депротекцию Lys (Aloc) группы осуществляют вручную и выполняют, обрабатывая полимер раствором 3 экв. Рd(РРh3)4 в 5 мл С 6 Н 6:СНСl3 (1:1): 2,5 об.% NMM : 5 об.% АсОН в течение 2 ч. Затем раствор промывают СНСl3 (6x5 мл), 20% АсОН в DCM (в хлористом метилене, 6x5 мл) DCM (6x5 мл.) и ДМФА (6x5 мл). Стадия 3. Синтез снова автоматизируют для прибавления Fmoc-AEEA-OH (Fmocаминоэтоксиэтоксиуксусной кислоты). Между прибавлениями (присоединениями) смолу три раза промывают N,N-диметилформамидом (ДМФА) и три раза изопропанолом. После соответствующей депротекпии МРА (3-малеинимидопрошюновую кислоту) прикрепляют к АЕЕА спейсеру и снова смолу три раза промывают N,N-диметилформамидом (ДМФА) и три раза изопропанолом. Стадия 4. Пептид снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением ледяным (0-4 С) Et2O. Сырой продукт - производное собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила (40%) с водой(0,1% ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующий сырой продукт, используемый для очистки. Пример 15 (Бычий GRF).Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu- Asn-Arg-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-(D)Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-GLn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)Ala-OH, Boc-Tyr(tBu)-OH. Стадия 2. Эти стадии проводят, как описано в примере 1, стадия 2. Пример 16. Долгоживущее производное пептида GRF из примера 15Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-(D)arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg- Lys(AEEA-MPA)-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 15, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Fmoc-Lys(Aloc)-OH. Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 14, стадии 2-4. Пример 17 (Бычий GRF).Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-N-Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Fmoc- Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-(NMe)Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-GLn(Trt)-OH, FmocThr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)Ala-OH, BocTyr(tBu)-OH. Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 1, стадия 2. Пример 18. Долгоживущее производное пептида GRF из примера 17Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-N-Me)Lys)-Val-Leu-AIa-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu- Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Lys(MPA)-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 17, за исключением того, что первой добавляемой к полимерной подложке аминокислотой является Fmoc-Lys(Aloc)-OH. Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 2, стадии 2-4. Пример 19. Второе долгоживущее производное пептида GRF из примера 17Tyr-(D)aIa-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gin-Ser-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-CONH2 Стадия 1: Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:His-(D)ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-TyrLeu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc- Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-PheOH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)ala-OH, Boc-His(Boc)-OH. Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 1, стадия 2. Пример 21. Долгоживущее производное пептида GRF из примера 20His-(D)ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-TyrLeu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys(AEEA-MPA)-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано в примере 20, стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 14, стадии 2-4. Пример 22 (GRF лосося). Второе долгоживущее производное пептида GRF из примера 20His-(D)ala-Asp-Gly-Met-Phe-Asn-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysTyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:His-(D)ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-LeuHis-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Met-ОН, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc -Lys(Boc)-OH,Fmoc Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-PheOH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)ala-OH, Boc-His(Boc)-OH. Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 1, стадия 2. Пример 24. Долгоживущее производное пептида GRF из примера 23His-(D)ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-LeuHis-Ser-Leu- Met-Ala-Lys(AEEA-MPA)-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано в примере 23. Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 14, стадии 2-4. Пример 25. Второе долгоживущее производное пептида GRF из примера 23His-(D)ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys(MPA)-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-AsnTyr-Leu- His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2 Стадия 1. Твердофазный пептидный синтез проводят в масштабе 100 мкмоль. К смоле по методике,описанной в примере 1, стадия 1, последовательно добавляют следующие защищенные аминокислоты:Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Met-ОН, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH,Fmoc Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-PheOH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-(D)ala-OH, Boc-His(Boc)-OH. Стадии 2-4. Эти стадии проводят, как описано в примере 2, стадии 2-4. Пример 26. Второе долгоживущее производное пептида GRF из примера 1(N-MPA)-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2 Стадия 1. Эту стадию проводят, как описано выше в примере 1, за исключением того, что в конце синтеза к смоле (полимерной подложке) добавляют последний компонент (МРА). Стадия 2. Производное снимают с полимерной подложки, используя смесь 85% ТФК/5% TIS/5% тиоанизола и 5% фенола, с последующим осаждением ледяным (0-4 С) Et2O. Сырой продукт - 16006484 производное собирают на воронке из полипропилена, сушат, снова растворяют в смеси ацетонитрила(40%) с водой (0,1% ТФК) и лиофилизируют, получая соответствующие сырое производное GRF, используемое в процессе очистки. Пример 27. Третье долгоживущее производное пептида GRF из примера 1(N-AEEA-MPA)-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-AlaArg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2 Стадия 1: Эту стадию проводят, как описано выше в примере 1, за исключением того, что предпоследним добавляемым компонентом является Fmoc-АЕЕА, а последним компонентом является (МРА). Стадия 2. Эту стадию проводят, как описано в примере 26, стадия 2. Методика очистки Каждое соединение очищают препаративной обращнно-фазовой ВЭЖХ, используя систему препаративной бинарной ВЭЖХ Varian (Dynamax). Очистку производят на колонке Phenomenex Luna 10 мк фенил-гексил, 50 мм х 250 мм (частицы 10 мк), уравновешенной смесью вода/ТФК (0,1% ТФК в Н 2 О(растворитель А и ацетонитрил/ТФК (0,1% ТФК в CH3CN (растворитель В. Элюирование проводят,пропуская смесь в градиенте 28-38% растворителя В со скоростью 50 мл/мин в течение 180 мин. Фракции, содержащие пептид, определяют УФ-спектроскопией по поглощению при 214 и 254 нм (Varian Dynamax UVD II). Фракции собирают в виде аликвот по 25 мл. Фракции, содержащие нужный продукт, идентифицируют, определяя массу с помощью непосредственной инъекции в LC/MS. Отобранные фракции последовательно анализируют методом аналитической ВЭЖХ (20-60% В в течение 20 мин; колонка PhenomenexLuna 5 мк фенил - гексил, 50 мм х 250 мм, 0,5 мл/мин), объединяя фракции с чистотой 90%. Пул замораживают в жидком азоте и сушат, а затем лиофилизируют по меньшей мере в течение 2 дней, получая жлтый порошок. Результаты in vitro Эффективность некоторых производных GRF по настоящему изобретению оценивают как их способность значительно повышать секрецию GH в анализе культур первичных клеток аденогипофиза крыс. Свежие первичные клетки гипофиза экспонируют с различными концентрациями соединений в течение 4 ч и определяют уровни GH в культуральных средах, используя набор RIA, выпускаемый Linco Research(МО). Методология Гипофиз целиком удаляют из нормальных крыс Sprague-Dawley после анестезии и сразу собирают в свежую культуральную среду, содержащую фунгизон и гентамицин сульфат. Клетки готовят для первичной клеточной культуры в течение одного часа после сбора гипофизов. Отдельные гипофизы разрезают и фрагменты гидролизуют в присутствии трипсина при продолжительном осторожном перемешивании. Фрагменты ткани механически разрушают, используя пипетку Пастера, и инкубируют ещ в течение 15 мин. Клетки растирают, дважды отмывают и засевают в 24-луночные планшеты, содержащие свежую среду. После культивирования в течение 72 ч клетки дважды отмывают бессывороточной средой, а затем инкубируют с аналогом или производным GRF или без него в течение 4 ч. После инкубирования собирают супернатанты и анализируют, количественно определяя гормон роста крысы методом радиоиимуноанализа (набор от Linco Research, МО). Как видно на фигурах, результаты показывают, что все производные GRF по данному изобретению способны стимулировать секрецию GH в концентрациях в интервале от 10-6 до 10-13 М. Коэффициент стимуляции сравним с коэффициентом стимуляции, получаемым с помощью промышленного GRF(l-29) и D-Ala-GRF(l-29) (оба реагента от Polypeptide Laboratories, California). Результаты in vivo Эффективность in vivo производных GRF по настоящему изобретению оценивают как их способность значительно повышать секрецию GH в организме свободно движущихся животных. Соединения вводят подкожно в виде болюсной инъекции (1 мкмоль/кг) нормальным катетеризованным крысам Sprague-Dawley. Серийные образцы крови отбирают для экстренного определения выделения GH после введения соединения. Методология Катетеризованных 7-8-недельных катетеризованных самцов крыс Sprague-Dawley подготавливают с помощью приспособлений для фиксации крыс по меньшей мере за 5 дней до эксперимента, чтобы избежать стресса. Эксперимент начинают только между 9 и 11 ч утра. Каждая подопытная группа состоит из 8 крыс. Соединения вводят только подкожной инъекцией в поясничной области. Серийные образцы крови берут перед введением дозы и через 5, 10, 15, 20, 30 и 60 мин после инъекции. Плазму собирают и образцы сразу же посылают в Linco Research (МО) для определения GH радиоиммуноанализом. Статистические определения (t-TECT) осуществляют, используя программное обеспечение Microsoft Excel. Как видно на фигурах, все производные GRF по данному изобретению могут индуцировать секрецию GF на моделях нормальных крыс.- 17006484 Фармакокинетические исследования Фармакокинетические исследования проводят на соединениях из примеров 5 и 6. Каждое соединение инъецируют самцам крыс Sprague-Dawley подкожно (1 мкмоль/кг) или внутривенно (100 нмоль/кг). Серийные образцы крови отбирают перед введением дозы, через 5, 30 и 60 мин и через 2, 4, 8, 24, 48, 72 и 96 ч после введения агента. Плазму собирают и замораживают до момента проведения радиоиммуноанализа (RIA). Для обнаружения соединений используют готовое поликлональное антитело, специфичное к человеческому нативному GRF(l-29). Чувствительность анализа составляет 300-10000 пМ. Соответственно, некоторые образцы следует разбавлять для анализа. Результаты фармакокинетических показателей представлены на фиг. 9. Как можно видеть, соединение из примера 5, т.е. нативный пептид, исчезает очень быстро. Действительно, соединение из примера 5, вводимое подкожно или внутривенно, нельзя обнаружить через 60 мин после введения. Это согласуется с результатами, полученными на крысах Sprague-Dawley, опубликованными в литературе для GRF(l-29) и других его аналогах, относящимися к их конечному периоду полужизни и к процентному соотношению биодоступности (SC/IV) (подкожно/внутривенно) (см., например, Peptides, 9:207-209, и J. Endocr., 107:R5-R8. С другой стороны, соединение из примера 6, которое представляет собой дериватизированный по данному изобретению нативный пептид из примера 5, обнаруживается через 96 ч. Дополнительные данные представлены далее в табл. 2. Таблица 2. Фармакокинетические параметры соединения из примера 6 Хотя данное изобретение описано на конкретных примерах, ясно, что его можно дополнительно модифицировать, и данное изобретение претендует на то, чтобы охватить любые варианты, применения или адаптации данного изобретения, следующие, в основном, принципам данного изобретения и включающие такие отклонения от данного описания, которые соответствуют общеизвестной или обычной практике в области техники, к которой относится данное изобретение, и к которым могут быть приложимы основные особенности, представленные в данном описании, и которые соответствуют формуле изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Производное рилизинг-фактора гормона роста, содержащее пептид с активностью продуцирования или рилизинга гормона роста и реакционноспособную группу, соединнную с пептидом,причм производное способно ковалентно связываться in vivo или in vitro с функциональной группой компонента крови, а пептид содержит GRF последовательностьA29 обозначает Lys или Arg и А 30 отсутствует, обозначает X или Х-Lys, где X отсутствует или обозначает последовательностьGln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu или е фрагмент, причем фрагмент уменьшен на одну-пятнадцать аминокислот на С-конце тем, что один аминокислотный остаток во фрагменте может необязательно быть заменн на остаток лизина; а С-конец может представлять собой свободную карбоновую кислоту или соответствующий амид,при условии, что когда А 2 обозначает Ala, тогда фрагмент не обозначает фрагмент, уменьшенный на 5-8 аминокислот. 2. Производное по п.1, у которого А 30 обозначает X-Lys, a X отсутствует. 3. Производное по п.2, у которого А 2 обозначает D-Ala. 4. Производное по п.1, у которого А 15 обозначает Ala. 5. Производное по п.1, у которого А 2 обозначает D-Ala, А 8 обозначает Gln, A15 обозначает Ala, A27 обозначает Leu, A30 обозначает X-Lys, a X отсутствует. 6. Производное по п.1, у которого последовательность GRF выбирают из группы, состоящей изHis-(D)ala-Asp-Gly-Ile-Phe-Ser-Lys-Ala-Tyr-Arg-Lys-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-LeuHis-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-CONH2,причм каждая последовательность GRF необязательно содержит остаток лизина на N-конце или на С-конце; и отличающееся также тем, что реакционноспособная группа представляет собой малеинимидосодержащую группу. 7. Производное по п.6, у которого последовательность GRF содержит на С-конце дополнительный остаток лизина. 8. Производное по п.1, у которого последовательность GRF выбирают из группы, состоящей из(N-AEEA-MPA)-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-AlaArg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-CONH2. 9. Производное по п.1, отличающееся тем, что компонент крови включает белки крови. 10. Фармацевтическая композиция, содержащая производное GRF по п.1 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 11. Композиция по п.10, предназначенная для стимуляции продуцирования или высвобождения эндогенного GH в организме субъекта. 12. Композиция по п.10, предназначенная для лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования GH. 13. Способ стимулирования эндогенного продуцирования или высвобождения GH в организме субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества производного по п.1, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 14. Способ лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования GH, заключающийся во введении субъекту эффективного количества производного по п.1, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 15. Конъюгат, содержащий производное по п.1, ковалентно связанное с компонентом крови. 16. Способ продления in vivo периода полужизни пептида, проявляющего гормон роста (GH)рилизинг активность, заключающийся в ковалентном связывании пептида с компонентом крови, в котором в качестве пептида используют пептид с последовательностью GRF, определенной в п.1. 17. Способ лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования GH, заключающийся во введении субъекту эффективного количества конъюгата по п.15, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 18. Способ стимулирования эндогенного продуцирования или высвобождения GH в организме субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества конъюгата по п.15, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 19. Производное по п.1, представляющее собой Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(MPA)-CONH2. 20. Конъюгат, содержащий производное по п.19, ковалентно связанное с компонентом крови. 21. Конъюгат по п.20, у которого компонент крови представляет собой белок сыворотки. 22. Фармацевтическая композиция, содержащая производное по п.19 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 23. Композиция по п.22 для стимуляции продуцирования или высвобождения эндогенного GH в организме субъекта. 24. Композиция по п.22, предназначенная для лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования GH. 25. Способ лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования GH, заключающийся во введении субъекту эффективного количества производного по п.19, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 26. Способ стимулирования эндогенного продуцирования или высвобождения GH в организме субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества производного по п.13, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 27. Способ лечения или предупреждения заболеваний или состояний, возникающих в результате нарушения продуцирования GH, заключающийся во введении субъекту эффективного количества конъюгата по п.21, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. 28. Способ стимулирования эндогенного продуцирования или высвобождения GH в организме субъекта, заключающийся во введении субъекту эффективного количества конъюгата по п.21, индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.