Штамм дрожжей pichia pastoris ps107(ppic9habil-2), являющийся продуцентом гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и интерлейкина-2 человека, рекомбинантная плазмида ppic9habil-2 и способ ее конструирования

Есть еще 4 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Рекомбинантная плазмида pPIC9HAbIL-2, обеспечивающая биосинтез и секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, трансформированными ею клетками дрожжей, имеющая размер 10148 п.о. и состоящая из следующих элементов:

EcoR1-Xho1 - фрагмента плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора pPIC9 размером 8,00 т.п.о., ограниченного сайтами рестрикции EcoR1-Xho1 и включающего бактериальный ген устойчивости к ампициллину; бактериальную область инициации репликации; ген HIS4 дрожжей; фрагмент 5'-некодирующей области дрожжевого гена АОХ1 размером 0,95 т.п.о., содержащий область, обеспечивающую активацию транскрипции этого гена в присутствии метанола в качестве источника углерода в культуральной среде; препрообласть гена MFa дрожжей Saccharomyces cerevisiae размером 0,27 т.п.о., обеспечивающую секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, в культуральную среду; фрагмент гена АОХ1 размером 0,33 т.п.о., содержащий область терминации транскрипции этого гена; и фрагмент 3'-нетранслируемой области гена АОХ1 размером 0,76 т.п.о.;

Xhol-Bsu36I - фрагмента размером 1749 п.о., содержащего кодирующую часть гена альбумина плазмы крови человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона;

Bsu36I-EcoR1 - фрагмента размером 399 п.о., содержащего кодирующую часть гена ИЛ-2 человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид.

2. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS107(pPIC9HAbIL-2) - продуцент гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, представляющий собой штамм Pichia pastoris PS99 (his4 pep4::PHO85), трансформированный плазмидой pPIC9HAbIL-2 по п.1.

3. Способ конструирования рекомбинантной плазмиды pPIC9HAbIL-2 по п.1, при котором

ген альбумина плазмы крови человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона получают при помощи обратной ПЦР с использованием матрицы мРНК, полученной из гепатоцитов человека, прямого праймера SEQ ID NO: 1, содержащего сайт для рестриктазы Xho1, обратного праймера SEQ ID NO: 2, содержащего сайт для рестриктазы MstII;

ген ИЛ-2 человека за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, получают при помощи ПЦР с использованием матрицы плазмиды pJDB(MSIL), прямого праймера SEQ ID NO: 3, содержащего сайт для рестриктазы Bsu36I, обратного праймера SEQ ID NO: 4, содержащего сайт для рестриктазы EcoR1;

полученный ген альбумина плазмы крови человека обрабатывают рестриктазами Xho1 и MstII;

полученный ген ИЛ-2 человека обрабатывают рестриктазами Bsu36I и EcoR1;

лигируют гены альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, обработанные как указано выше, с плазмидой pPIC9, предварительно обработанной рестриктазами Xho1 и EcoR1, и

полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pPIC9HAbIL-2.

Текст

Смотреть все

ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS PS107(pPIC9HAbIL-2), ЯВЛЯЮЩИЙСЯ ПРОДУЦЕНТОМ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ АЛЬБУМИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА Настоящее изобретение относится к штамму дрожжей Pichia pastoris PS107(pPIC9HAbIL-2), являющемуся продуцентом гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, рекомбинантной плазмиде pPIC9HAbIL-2 и способу ее конструирования. 014422 Изобретение относится к биотехнологии, к генной инженерии, микробиологической и медицинской промышленности и представляет собой дрожжевой штамм - продуцент гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и интерлейкина-2 (ИЛ-2) человека, содержащий сконструированнуюin vitro плазмиду, которая обеспечивает синтез и секрецию данного гибридного белка. Настоящее изобретение частично основано на обнаружении того факта, что гибридные белки, содержащие альбумин плазмы крови человека, присоединенный к целевому белку, обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как более продолжительное время полужизни (Yeh P. et al. Proc. Natl. Acad.Pharm. Res. 2002. V. 19. P. 1720-1729). ИЛ-2 продуцируется Т-лимфоцитами в ответ на антигенную и митогенную стимуляцию или под влиянием ИЛ-1 (Gillis S. et al. J. Immunol. 1978. V. 120. P. 2027-2032). Основная функция ИЛ-2 состоит в обеспечении клеточной составляющей адаптивного иммунитета. ИЛ-2 является фактором роста и дифференцировки Т-лимфоцитов, NK-клеток, обеспечивает дифференцировку Т-киллеров и способствует проявлению функциональной активности Т-хелперов. Он также воздействует на моноциты, экспрессирующие рецептор ИЛ-2, и усиливает синтез иммуноглобулинов предварительно активированными В-лимфоцитами (Smith K. Science. 1988. V. 240. Р. 1169-1176). Широкий спектр биологических активностей ИЛ-2 явился мощным стимулом для использования его в качестве лекарственного препарата и для создания рекомбинантных штаммов микроорганизмов продуцентов этого цитокина. В настоящее время в России зарегистрированы и применяются два рекомбинантных ИЛ-2 человека:"Пролейкин" (Chiron Corp., США) и "Ронколейкин" (Биотех, Россия). Действующим началом "Пролейкина" является ИЛ-2 человека, синтезированный в клетках Е.coli. Рекомбинантный белок не гликозилирован и является мутеином, у него отсутствует N-концевой аланин и цистеин в 125 положении замещен серином. Значительные побочные эффекты, сопровождающие клиническое применение "Пролейкина", а также высокая стоимость препарата ограничивают его широкое использование.S.cerevisiae. Известными применяемыми штаммами являются ВКПМ Y-791 (Мясников А.Н. и др.,SU 17703359) и ВКПМ Y-3079 (Смирнов М.Н. и др., SU 2230781). Рекомбинантный белок, как и в случае"Пролейкина", накапливается внутри клеток в восстановленном состоянии в виде "телец включения" и не содержит углеводного компонента. Но в отличие от "Пролейкина" в молекуле "Ронколейкина" отсутствуют аминокислотные замены, и он не является мутеином. Существенным недостатком ИЛ-2 является короткий период полужизни, поэтому в процессе лечения необходимы частые инъекции препарата. Это удорожает лечение, может сопровождаться побочными эффектами и отрицательно сказываться на качестве жизни пациентов (Winkelhake J., Gauny S. Pharmacol.Rev. 1990. V. 42. P. 1-28; Nadeau R. et al., Drag Metabol. Dispos. 1995. V. 23. P. 904-909). Для увеличения периода полужизни рекомбинантных белков используют модификацию молекулы белка, которая заключается в ковалентном связывании активного белка с полиэтиленгликолем (ПЭГ) или альбумином. Пегилирование ИЛ-2 сопровождается увеличением периода полужизни препарата, замедлением выведения, понижением токсичности и иммуногенности (Katre N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1987. V. 84.P. 1487-1491; Knauf M. et al. J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 15064-15070; Chapes S. et al. J. Appl. Physiol. 1999. V. 86. P. 2065-2076). Однако ПЭГ-коньюгаты не лишены недостатков, среди которых следует отметить зависимость активности белка от структуры ПЭГ (Veronese F. Biomaterials. 2001. V. 22. Р. 405-417). Особый интерес представляет модификация рекомбинантных белков за счет их слияния с молекулой альбумина человека. Альбумин является основным белком плазмы крови человека. Период полужизни альбумина около 19 дней. Он обладает рядом ценных свойств, главным из которых является его способность связывать и транспортировать эндо- и экзогенные лиганды (в том числе и белки). Альбумин играет роль естественного стабилизатора и переносчика белков плазмы крови. Он широко используется в качестве стабилизирующего агента при формулировании лекарственных препаратов, созданных на основе белков (Peters Т. All about albumin. 1996. Academic Press). Все вышеизложенное свидетельствует о потребности в создания штаммов микроорганизмов - продуцентов гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека. Использование для гетерологичной экспрессии метилотрофных дрожжей Pichia pastoris представляет особый интерес. Гликопротеины, секретируемые дрожжами Pichia pastoris, не содержат маннозных остатков, связанных 1,3-связями и являющихся сильными антигенными детерминантами, что позволяет получать наряду с внутриклеточными аутентичные секреторные формы рекомбинантных белков(Montesino R. et al. Protein Expr. Purif. 1998. V. 14. P. 197-207). Получение секреторного продуцента гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, было бы особенно актуально. Природный ИЛ-2 является секреторным белком и только в процессе секреции происходит правильное замыкание внутримолекулярной дисульфидной связи и гликозилирование белка. От корректного замыкания дисульфидной связи зависит биологическая активность ИЛ-2, а присоединение углеводных остатков повышает стабильность молекулы и увеличивает время ее циркуляции в кровотоке(Robb R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 6486-6490). Накопление рекомбинантного белка в культуральной жидкости значительно упрощает процедуру его очистки. Таким образом, в задачу настоящего изобретения входило создание штамма, желательно дрожжейPichia pastoris, синтезирующего гибридный белок, состоящий из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, и секретирующего данный гибридный белок в культуральную жидкость, создание плазмиды, которая позволила бы синтезировать упомянутый гибридный белок в дрожжах Pichia pastoris, а также предложение способа конструирования такой плазмиды. Указанная задача решена предложением плазмиды pPIC9HAbIL-2, которая обеспечивает синтез и секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, трансформированными ею клетками дрожжей, состоящей из следующих элементов:EcoRI-XhoI - фрагмент плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектораpPIC9 размером 8,00 т.п.о., включающий бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации, ген HIS4 дрожжей; фрагмент 5'-некодирующей области дрожжевого гена АОХ 1 размером 0,95 т.п.о., содержащий область, обеспечивающую активацию транскрипции этого гена в присутствии метанола в качестве источника углерода в культуральной среде; препрообласть гена MF дрожжей Saccharomyces cerevisiae размером 0,27 т.п.о., обеспечивающую секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, в культуральную среду; фрагмент гена АОХ 1 размером 0,33 т.п.о., содержащий область терминации транскрипции этого гена; фрагмент 3'-нетранслируемой области гена АОХ 1 размером 0,76 т.п.о.;XhoI-Bsu36I - фрагмент размером 1749 п.о., содержащий кодирующую часть гена альбумина плазмы крови человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона;Bsu36I-EcoRI - фрагмент размером 399 п.о., содержащий кодирующую часть гена ИЛ-2 человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид; содержащий уникальные сайты распознавания следующих рестриктаз: XhoI - 1193 п.о.; EcoRI - 3341 п.о.; Bst11071 - 7925 п.о.; PvuI - 9426 п.о.;AatII - 9978 п.о. Схема плазмиды pPIC9HAbIL-2 с рестрикционной картой изображена на фиг. 1. Общий размер плазмиды 10148 п.о. Согласно изобретению также предложен способ конструирования плазмиды pPIC9HAbIL-2. Схема указанного способа приведена на фиг. 2. В предлагаемом способе ген альбумина плазмы крови человека,за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона, получают при помощи обратной ПЦР с использованием матрицы мРНК, полученной из гепатоцитов человека, прямого праймера SEQ ID NO: 1, содержащего сайт для рестриктазы XhoI, обратного праймера SEQ ID NO: 2,содержащего сайт для рестриктазы MstII; ген ИЛ-2 человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, получают при помощи ПЦР с использованием матрицы плазмиды pJDB(MSIL),прямого праймера SEQ ID NO: 3, содержащего сайт для рестриктазы Bsu36I, обратного праймераSEQ ID NO: 4, содержащего сайт для рестриктазы EcoRI; полученный ген альбумина плазмы крови человека обрабатывают рестриктазами XhoI и MstII, полученный ген ИЛ-2 человека обрабатывают рестриктазами Bsu36I и EcoRI и лигируют с плазмидой pPIC9, предварительно обработанной рестриктазамиXhoI и EcoRI, затем лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pPIC9HAbIL-2. Плазмиду pJDB(MSIL) (Мясников и др. А.с. SU 17703359 А 1. - МКИ С 12N 15/26, 1/19. - 1989) используют в качестве матрицы для амплификации гена ИЛ-2 человека при помощи ПЦР. Последовательность фрагмента плазмиды pJDB(MSIL), использованная в качестве матрицы в ПЦР для получения гена ИЛ-2 человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, представлена какSEQ ID NO: 6. Курсивом приведена последовательность гена ИЛ-2 человека, за исключением области,кодирующей сигнальный пептид. Выделены последовательности, комплементарные прямому праймеру(SEQ ID NO: 3) и обратному праймеру (SEQ ID NO: 4) для ПЦР. Подчеркнуты сайты для рестриктазыMstII и для рестриктазы EcoRI. В качестве прямого праймера служит олигонуклеотид 5'-caagctgccttaggcttagcacctacttcaagt (SEQ ID NO: 3), содержащий сайт для рестриктазы Bsu36I. В качестве обратного праймера используют олигонуклеотид 5'-ggaattcttaagtcagtgttgagatg (SEQ ID NO: 4), который содержит сайт для рестриктазы EcoRI. Синтезированный ген ИЛ-2 человека размером 399 п.о. выделяют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле, обрабатывают рестриктазами Bsu36I и EcoRI. Для получения гена альбумина человека применяют метод обратной ПЦР, в качестве матрицы используют мРНК, выделенную из культуры гепатоцитов человека. Последовательность мРНК из гепатоцитов человека, использованная в качестве матрицы в реакции обратной ПЦР для получения гена альбумина плазмы крови человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона, представлена как SEQ ID NO: 5. Выделены последовательности, комплементарные прямому праймеру (SEQ ID NO: 1) и обратному праймеру (SEQ ID NO: 2) для реакции обратной ПЦР. Подчеркнуты сайты для рестриктазы XhoI и для рестриктазы MstII. Прямым праймером является олигонуклеотид 5'-ccgctcgagaaaagagatgcacacaagagt (SEQ ID NO: 1), содержащий сайт для рестриктазы XhoI,обратным праймером служит олигонуклеотид 5'-tgaagtaggtgctaagcctaaggcagcttg (SEQ ID NO: 2), содержащий сайт для рестриктазы MstII. Синтезированный ген альбумина человека размером 1749 п.о. выделяют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле, обрабатывают рестриктазами XhoI и MstII.-2 014422 Полученные фрагменты ДНК, содержащие ген ИЛ-2 человека и ген альбумина человека, лигируют с плазмидой pPIC9 ("Invitrogen"), предварительно обработанной рестриктазами XhoI и EcoRI. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма DH5 Escherichia coli (F'/endA1hsdR17 (rk- mk+) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr ) relA1 (lacZYA-argF)U169 deoR (80dlac(lacZ)M15), с помощью рестрикционного анализа отбирают трансформанты, содержащие плазмиду pPIC9AbFN. Для доказательства идентичности гена ИЛ-2 и гена альбумина, амплифицированных при помощи ПЦР, природным аналогам проводят определение их нуклеотидной последовательности (Sanger F.S. et al. Proc.Natl. Acad. Sci. 1977. V. 74. P. 5463-5467). Таким образом, плазмида pPIC9HAbIL-2 создана на основе челночного бактериально-дрожжевого интегративного вектора pPIC9 (имеется в продаже ("Invitrogen". В результате трансформации линеаризованной плазмидой и последующей гомологичной рекомбинации происходит встраивание экспрессионной кассеты в хромосому дрожжей Pichia pastoris, что обеспечивает стабильное поддержание клонированного гибридного гена, который состоит из находящихся в одной рамке считывания гена альбумина человека без терминирующего кодона и гена ИЛ-2 человека. Преимуществом такой интегративной системы экспрессии является также отсутствие в геноме дрожжей интегрантов фрагментов бактериальной ДНК и генов устойчивости к антибиотикам, что предотвращает опасность горизонтального переноса этих генов. В состав плазмиды входит ген HIS4 дрожжей, что позволяет селективно отбирать трансформантов при использовании в качестве реципиентов штаммы дрожжей с мутациями в этом гене. Экспрессия гибридного гена, который состоит из находящихся в одной рамке считывания гена альбумина человека без терминирующего кодона и гена ИЛ-2 человека, в составе плазмиды pPIC9HAbIL-2 находится под контролем промотора гена АОХ 1, содержащего области, обеспечивающие активацию транскрипции в присутствии метанола в культуральной среде, а также область инициации транскрипции. Промотор гена АОХ 1 относится к числу наиболее сильных дрожжевых промоторов. Уровень экспрессии генов, находящихся под контролем АОХ 1 промотора, эффективно регулируется источниками углерода. Транскрипция гена AOX1 полностью блокирована при выращивании дрожжей на среде с глюкозой, на среде с глицерином наблюдается только базальный уровень экспрессии гена. Использование метанола в качестве единственного источника углерода значительно усиливает экспрессию гена АОХ 1 и, следовательно, генов, находящихся под контролем АОХ 1 промотора. Это позволяет регулировать синтез гибридного гена, который состоит из находящихся в одной рамке считывания гена альбумина человека без терминирующего кодона и гена ИЛ-2 человека в клетках дрожжей. Регулируемая экспрессия клонированного гена позволяет существенно снизить метаболическую нагрузку на клетку дрожжей. Наличие в составе плазмиды препрообласти гена MF дрожжей Saccharomyces cerevisiae обеспечивает секрецию синтезированного гибридного белка, который состоит из альбумина человека и ИЛ-2 человека, в культуральную жидкость. В качестве продуцента гибридного белка, который состоит из альбумина человека и ИЛ-2 человека,используют штамм PS107(pPIC9HAbIL-2). Штамм PS107(pPIC9HAbIL-2) получен трансформацией штамма дрожжей PS99 (HIS4 PEP4PHO85) плазмидой pPIC9HAbIL-2. Штамм PS99 несет мутацию в гене HIS4, что позволяет селективно отбирать трансформантов, несущих плазмиду pPIC9HAbIL-2. Мутация в гене РЕР 4 приводит к отсутствию активности протеаз А и В, а также карбоксипептидазы Y в клетках дрожжей, что сопровождается повышением стабильности гетерологичных рекомбинантных белков (Hisch H.H. et al. In: Walton E.F., Yarranton G.T., Eds., Molecular and Cell Biology of Yeast. 1989. P. 134200). Штамм дрожжей Pichia pastoris PS107(pPIC9HAbIL-2) характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Клетки округлой, слегка овальной формы размером 5-10 мкм, часть клеток имеет на поверхности почки или соединена с дочерними клетками. Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на полной органической среде YEPD - 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы или 1% глицерина. Кроме того, клетки хорошо растут на минеральной среде SC: 1,34% Yeast Nitrogen Base ("Difco",США), а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих в качестве источника углерода глюкозу (2%) или глицерин (1%). Клетки штамма отличаются слабым ростом на средах, содержащих в качестве источника углерода метанол (0,5-1%). При росте на твердых средах клетки образуют гладкие, круглые колонии с матовой поверхностью,светло-кремового цвета, край неровный. При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную суспензию. Культура имеет характерный запах метилотрофных дрожжей.-3 014422 Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут в пределах от 4 до 37 С. Оптимальной температурой выращивания является 30 С. При росте в аэробных условиях клетки незначительно закисляют среду. Оптимум pH для роста составляет 4,5-6,5. В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые соединения, такие как глюкоза, глицерин, метанол. В качестве источника азота клетки могут использовать минеральные соли в аммонийной форме,аминокислоты, мочевину. Клетки способны к аэробному и анаэробному росту. Существенным признаком штамма является отсутствие потребности в гистидине. Способ получения EcoRI-XhoI - фрагмента плазмидной ДНК pPIC9 проиллюстрирован следующим примером. Пример 1. Клетки бактерий Escherichia coli, содержащие плазмиду pPIC9, выращивают при 37 С в течение ночи в 1 л питательной среды LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% хлористого натрия), содержащей ампициллин в концентрации 50 мг/л. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин при 4 С, суспендируют в 20 мл 25 мМ трис-хлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 10 мМ ЭДТА и 50 мМ глюкозы, добавляют 30 мг лизоцима и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Далее добавляют 40 мл 0,2 М гидроокиси натрия, содержащей 1% додецилсульфата натрия, осторожно перемешивают и инкубируют в течение 10 мин при 4 С. Раствор нейтрализуют добавлением 30 мл 3 М ацетата натрия (pH 5,0) и выдерживают в течение 10 мин при 4 С. После этого центрифугируют при 14000 об/мин в течение 40 мин при 4 С. К супернатанту добавляют 0,6 объема изопропилового спирта, выдерживают 20 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин при 20 С. Полученный осадок промывают 70% этиловым спиртом, высушивают в вакууме и растворяют в 4 мл дистиллированной воды. Далее добавляют 4,2 г хлористого цезия и 0,36 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Полученный раствор выдерживают в течение 1 ч при 4 С, затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант центрифугируют при 70000 об/мин в течение 16 ч в центрифуге TL100 ("Beckman"). После центрифугирования отбирают полосу плазмидной ДНК(нижнюю из двух флюоресцирующих в ультрафиолетовом свете полос), дважды экстрагируют бромистый этидий равным объемом изоамилового спирта, разбавляют в два раза дистиллированной водой и осаждают плазмидную ДНК двумя объемами этилового спирта и 1/15 объема 3 М ацетата натрия (pH 5,0). Осадок собирают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин, промывают 70% этиловым спиртом и растворяют в 0,5-1,0 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-хлоридный буфер, pH 8,0, содержащий 1 мМ ЭДТА). Концентрацию плазмидной ДНК определяют по поглощению раствора при длине волны 260 нм. Чистоту препарата контролируют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле в буфере ТВЕ (0,1 М трис-боратный буфер, pH 8,3, содержащий 1 мМ ЭДТА). Гидролиз полученной плазмиды pPIC9 рестриктазами XhoI и EcoRI проводят в 10 мМ трисхлоридном буфере (pH 7,5), содержащем 50 мМ хлористого натрия, 10 мМ хлористого магния и 1 мМ дитиотреитол. К 5 мкг плазмидной ДНК в объеме 20 мкл добавляют по 5 ед. каждой рестриктазы, после чего пробу инкубируют в течение 25 ч при 37 С. Реакционную смесь вносят в лунки в 0,7% агарозного геля в буфере ТВЕ и проводят разделение полученных фрагментов ДНК. По окончании разделения вырезают полоску геля, содержащую фрагмент ДНК размером 8 т.п.о., соответствующий линеаризованному XhoI-EcoRI фрагменту плазмиды pPIC9. Выделение ДНК из агарозного геля проводят по методике, разработанной фирмой QIAGEN. Полоску геля с фрагментом ДНК помещают в пробирку и добавляют раствор QX1 (300 мкл на 100 мг геля), добавляют реактив QIAEX (10 мкл на 5 мкг ДНК) и инкубируют при 50 С в течение 10 мин, периодически перемешивая. Далее центрифугируют 30 с при 15000 об/мин, супернатант отбрасывают, осадок дважды экстрагируют растворами QX2 и QX3, удаляют супернатант центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 с. Осадок высушивают на воздухе, растворяют в 20 мкл буфера ТЕ, центрифугируют 30 с при 15000 об/мин, супернатант переносят в новую пробирку. Способ получения гена ИЛ-2 человека проиллюстрирован следующим примером. Пример 2. Ген ИЛ-2 человека амплифицируют при помощи ПЦР. В качестве матрицы используют плазмидуpJDB(MSIL). Выделение плазмиды pJDB(MSIL) проводят в условиях, аналогичных для плазмиды pPIC9. К 0,1 мкг плазмиды pJDB(MSIL), растворенной в 5 мкл буфера ТЕ, добавляют 1 мкл 0,5 М NaOH и нагревают при 85C в течение 3 мин. Затем пробу быстро переносят в лед, добавляют 1 мкл 0,5 М HCl и далее используют в ПЦР. В качестве прямого праймера служит олигонуклеотид 5'-caagctgccttaggcttagcacctacttcaagt, содержащий сайт для рестриктазы Bsu36I. В качестве обратного праймера используют олигонуклеотид 5'-ggaattcttaagtcagtgttgagatg, который содержит сайт для рестриктазы EcoRI. Проба для ПЦР содержит 5 мкл матрицы, 30 рМ каждого праймера, 10 мкл 10-кратного раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов(дНТФ), содержащего 1,25 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), 10 мкл 10-кратного буфера для ПЦР (100 мМ KCl, 100 мМ (NH4)2SO4, 200 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 20 мM MgSO4, 1% тритон Х-100). В пробу добавляется дистиллированная Н 2 О до конечного объема 100 мкл. Далее пробу прогревают 5 мин при 95 С, охлаждают, добавляют 2,5 ед. Вент-ДНК-полимеразы("BioLabs") и проводят 50 циклов ПЦР в следующих условиях: 1 мин при 95 С (плавление цепей ДНК),1 мин при 46 С (отжиг праймеров), 1 мин при 72 С (полимеразная реакция). После окончания ПЦР пробу инкубируют при 72 С 5 мин. Реакционную смесь вносят в лунки в 0,7% агарозного геля в буфере ТВЕ и проводят разделение полученных фрагментов ДНК. По окончании разделения вырезают полоску геля, содержащую фрагмент ДНК размером 399 п.о., соответствующий гену ИЛ-2 человека. Выделение ДНК из агарозного геля проводят по описанной выше методике фирмы QIAGEN. Гидролиз фрагмента ДНК, содержащего амплифицированный ген ИЛ-2 человека, рестриктазами Bsu36I и EcoRI проводят в условиях, описанных для расщепления плазмиды pPIC9. Способ получения гена альбумина человека проиллюстрирован следующим примером. Пример 3. Ген альбумина человека получают методом обратной полимеразной цепной реакции, используя в качестве матрицы мРНК, полученную из клеток печени человека. Клетки печени человека(банк клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург) культивируют в среде Игла, содержащей 2-глутамин и 10% эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота, до плотности 0,5-1,0105 клеток/мл. Снимают клетки, используя 0,02% версен, содержащий химотрипсина (0,1 мг/мл),дважды промывают клетки средой Игла, содержащей 2-глутамин, 10% эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота и осаждают клетки центрифугированием (800 об/мин, 10 мин). Далее клетки дважды промывают изотоническим раствором, свободным от РНКаз, и ресуспендируют в 100 мкл раствора, содержащего 4 М гуанидин тиоционат, 25 мМ цитрат натрия, pH 7,0 0,5% саркозил натрия, 0,1 М 2-меркаптоэтанол и 0,3 М ацетата натрия (pH 4,0). Полученную смесь встряхивают на "Vortex" в течение 10 мин, центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин, отбирают водную фазу, добавляют к ней равный объем смеси фенол:хлороформ (1:1), уравновешенной буфером, содержащим 25 мМ цитрат натрия, pH 7,0,0,5% саркозил натрия, 0,1 М 2-меркаптоэтанол и 0,3 М ацетата натрия (pH 4,0), встряхивают на "Vortex" в течение 5 мин, центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин. Отбирают водную фазу и повторяют экстракцию смесью фенол:хлороформ, центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин. К водной фазе добавляют равный объем изопропилового спирта. Для осаждения помещают смесь на -20 С на ночь. После центрифугирования (12000 об/мин, 5 мин) осадок промывают холодным 70% этанолом, подсушивают и растворяют в 20 мкл деионизованной воды, свободной от РНКаз. Полученную РНК используют в качестве матрицы для синтеза кДНК гена альбумина человека при помощи обратной ПЦР с использованием Tth-полимеразы. Прямым праймером служит олигонуклеотид 5'-ccgctcgagaaaagagatgcacacaagagt, содержащий сайт для рестриктазы XhoI, обратным праймером служит олигонуклеотид 5'-tgaagtaggtgctaagcctaaggcagcttg, содержащий сайт для рестриктазы MstII. Проба для проведения ПЦР содержит 1 мкл матрицы (примерно 5 мкг), 30 рМ каждого праймера, 10 мкл 10-кратного раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), содержащего 1,25 мМ каждого дНТФ(дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), 10 мкл 10-кратного буфера (500 мM NaCl, 500 мМ Трис-HCl, pH 9,0,100 мМ MgCl2), 5 ед. Tth-полимеразы. В пробу добавляется дистиллированная Н 2 О до конечного объема 50 мкл. Стадию обратной ПЦР проводят при 70 С в течение 3 мин, затем 50 мин при 42 С и 2 мин при 94 С. Полученную кДНК гена альбумина человека используют как матрицу для амплификации этого гена при помощи ПЦР, которую проводят в следующем режиме: 30 с при 94 С, 30 с при 58 С и 30 с при 72 С. Повторяют этот цикл 45 раз, после чего инкубируют пробу при 72 С 5 мин. Синтезированный ген альбумина человека размером 1749 п.о. выделяют из агарозного геля по описанной выше методике фирмыQIAGEN. Гидролиз фрагмента ДНК, содержащего амплифицированный ген альбумина человека рестриктазами XhoI и MstII, проводят в условиях, описанных для расщепления плазмиды pPIC9.-5 014422 Способ получения плазмиды pPIC9HAbIL-2 проиллюстрирован следующим примером. Пример 4. Для получения плазмиды pPIC9HAbIL-2 проводят лигирование XhoI-EcoRI фрагмента плазмидыpPIC9 (получение которого описано в примере 1), Bsu36I-EcoRI фрагмента гена ИЛ-2 человека (получение которого описано в примере 2) и XhoI-MstII фрагмента гена альбумина человека (получение которого приведено в примере 3). Для этого смешивают эквимолярные количества ДНК плазмиды и амплифицированных генов в 10 мкл 40 мМ трис-хлоридного буфера (pH 7,8), содержащего 10 мМ дитиотреитола, 10 мМ хлористого магния, 0,5 мМ АТФ, добавляют 5 ед. ДНК-лигазы фага Т 4 и инкубируют при 14 С в течение ночи. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма DH5 Escherichia coli (F'/endA1hsdR17 (rk- mk+) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relAl (lacZYA-argF)U169 deoR (80dlac(lacZ)M15). Для этого клетки Escherichia coli выращивают в 100 мл среды LB при 37 С до достижения культурой густоты клеточной суспензии, соответствующей 0,4-0,6 ед. оптической плотности при длине волны 550 нм. Клеточную суспензию охлаждают в ледяной бане, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин при 4 С. Клетки супендируют в 100 мл 10 мМ хлористого натрия, собирают центрифугированием в тех же условиях. Далее клетки суспендируют в 50 мл 75 мМ хлористого кальция, выдерживают в ледяной бане в течение 40 мин, осаждают центрифугированием в тех же условиях и суспендируют в 1 мл 75 мМ хлористого кальция. К суспензии компетентных клеток добавляют глицерин до конечной концентрации 15%,разделяют на аликвоты и хранят при -70. Перед трансформацией суспензию компетентных клеток размораживают в ледяной бане, добавляют лигазную смесь и инкубируют в ледяной бане в течение 40 мин. Далее клетки подвергают действию теплового шока при 42 С в течение 2 мин, после чего инкубируют в 1,5 мл среды LB при 37 С в течение 1 ч. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин и высевают на чашки Петри со средой LB, содержащей 2% агара и 50 мг/л ампициллина. Чашки инкубируют при 37 С в течение 12-16 ч. Из выросших отдельных клонов трансформантов выделяют плазмидную ДНК при помощи методики, использованной для получения плазмиды pPIC9, за исключением того, что клетки Escherichia coli выращивают в 10 мл LB, и соответственно объемы всех растворов уменьшают в 100 раз. Кроме того,вместо стадии центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия проводят обработку ДНК панкреатической РНКазой. Для этого нуклеиновые кислоты, осажденные изопропиловым спиртом, растворяют в 100 мкл буфера ТЕ, добавляют 10 мкл раствора РНКазы (1 мг/мл) и инкубируют 30 мин при 37 С. Далее проводят гидролиз полученной плазмидной ДНК рестриктазами EcoRI и XhoI или BglII. При рестрикции искомой плазмиды pPIC9HAbIL-2 и последующем электрофорезе в 0,7% агарозном геле в первом случае обнаруживаются фрагменты 2,148 п.о. и 8,0 т.п.о., во втором - фрагменты 1911 п.о., 2410 п.о. и 5827 п.о. Из выявленного таким образом клона препаративно выделяют плазмиду pPIC9HAbIL-2 так же, как описано для плазмиды pPIC9, и гидролизуют рестриктазами Bst1107I и AatII в условиях, описанных для расщепления плазмиды pPIC9.Bst1107I-AatII фрагмент плазмиды pPIC9HAbIL-2, размером 8,1 т.п.о, выделяют по описанной выше методике фирмы QIAGEN и используют его для трансформации клеток дрожжей, как описано в примере 5. Пример 5. Для получения штамма дрожжей Pichia pastoris - продуцента гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, клетки дрожжей штамма PS99 трансформируют плазмидой pPIC9HAbIL-2. Клетки дрожжей выращивают в 100 мл среды YEPD при 30 С до достижения культурой оптической плотности, соответствующей 2-4 ед. поглощения при длине волны 600 нм. Клетки дважды промывают стерильной водой, после чего суспендируют в 0,3 мл 100 мМ раствора ацетата лития и инкубируют при 30 С в течение 30 мин. К 50 мкл полученной суспензии клеток добавляют 0,1-1 мкг плазмидной ДНК,50 мкг ДНК спермы лосося, предварительно денатурированной нагреванием (10 мин при 100) и 0,3 мл раствора 100 мМ ацетата лития, содержащего 40% полиэтиленгликоля 4000. Далее пробу инкубируют 30 мин при 30 С и 20 мин при 42 С, помещают на 15 с в ледяную баню и центрифугируют 10 с при 10000 об/мин. Клетки суспендируют в 1 мл стерильной воды и высевают на твердую среду SC. Клоны трансформантов вырастают через 2-3 суток. Выросшие клоны пересевают на чашки со средой SC, содержащей 2% глюкозу, отдельными колониями, затем перепечатывают на среду ММ (1,34% YeastNitrogen Base ("Difco", США), 0,5% метанола, 2% агара ("Difco", США для отбора трансформантов,отличающихся слабым ростом на среде с метанолом, что свидетельствует об интеграции гибридного гена, состоящего из гена ИЛ-2 человека и гена альбумина человека, в локус AOX1 (фенотип Mets). Для анализа продукции гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, клетками трансформантов фенотипа Mets их выращивают при 30 С в 100 мл жидкой средыBMGY (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 1% глицерина, 10 мл 1 М калий-фосфатного буфера, pH 6,0, 1,34% Yeast Nitrogen Base ("Difco", США до стационарной фазы роста в течение 2 суток. Клетки-6 014422 собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, супернатант сливают и переносят всю биомассу в 20 мл жидкой среды BMMY (2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 0,5% метанола, 10 мл 1 М калий-фосфатного буфера, pH 6,0, 1,34% Yeast Nitrogen Base ("Difco", США для индукции экспрессии гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека. Индукцию проводят при 30 С в течение 4 суток. По окончании индукции культуральную среду отделяют от клеточной биомассы центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. В культуральной среде определяют содержание гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека,при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и последующей гибридизации с антителами к ИЛ-2 человека. Разделение белков проводят в 15% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ трис, 192 мМ глицин,0,1% додецилсульфат натрия, pH 8,3; буфер для геля: 375 мМ трис-хлоридный буфер, pH 8,8). Параллельно проводят разделение белков контрольного штамма, выращенного в идентичных условиях. В качестве стандартов молекулярной массы используют -галактозидазу (116,0 кДа), бычий сывороточный альбумин (66,2 кДа), овальбумин (45,0 кДа), лактатдегидрогеназу (35,0 кДа), эндонуклеазу рестрикцииBsp98I (25,0 кДа), -лактоглобулин (18,4 кДа), лизоцим (14,4 кДа). По окончании электрофореза белки ренатурируют, выдерживая гели 15 мин в 10 мМ трис-хлоридном буфере (pH 7,5), содержащем 4 М мочевину, 20 мМ ЭДТА, и переносят на нитроцеллюлозную мембрану в 25 мМ трис-192 мМ глициновом буфере (pH 8,3), содержащем 20% метилового спирта, при 30-40 В, в течение 1,5 ч. Далее мембрану выдерживают в буфере TBST (10 мМ трис-хлоридный буфер (pH 8,0), содержащем 150 мМ хлористого натрия, 0,05% твин-20, 1% бычьего сывороточного альбумина) в течение 2 ч при 37 С. Затем помещают мембрану в тот же буфер, содержащий разведенные в 500 раз кроличьи поликлональные антитела к ИЛ-2 человека, меченные биотином ("NatuTec" Германия), и инкубируют 2 ч при 37 С. Далее трижды промывают мембрану буфером TBST и инкубируют 1 ч при 37 С с разбавленным в 3000 раз конъюгатом стрептавидина со щелочной фосфатазой ("Силекс М", Москва). После отмывки мембраны буфером PBST(58 мМ двузамещенного фосфата натрия, 17 мМ однозамещенного фосфата натрия, 68 мМ хлористого натрия, 0,1% твин-20) добавляют раствор субстратов для щелочной фосфатазы 0,56 мМ BCIP (5-бром-4 хлор-3-индолилфосфата p-толуидиновая соль), 0,48 мМ NBT (нитротетрозолиум синий) в 10 мМ трисхлоридном буфере (pH 9,2), содержащем 59,3 мМ хлористого магния. Параллельно окрашивают гели 0,15% раствором кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывают в 10% уксусной кислоте. При сравнении спектра белков двух штаммов у штамма PS107(pPIC9HAbIL-2) обнаруживают появление дополнительной белковой полосы с молекулярной массой 82 кДа, дающей четкую положительную реакцию с антителами к ИЛ-2 человека. Молекулярная масса этого секретируемого белка совпадает с теоретически ожидаемой молекулярной массой гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека. Уровень синтеза гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, определяют, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой стандартного белка. Согласно полученным данным, клетки дрожжей штамма PS107(pPIC9HAbIL-2) синтезируют и секретируют около 5 мг гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, на литр культуры дрожжей. Гибридный белок обладает биологической активностью, характерной для ИЛ-2 человека. Суммируя вышесказанное можно заключить, что полученный штамм дрожжей Pichia pastorisPS107(pPIC9HAbIL-2) синтезирует и секретирует гибридный белок, состоящий из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, в количестве, достаточном для его очистки в лабораторном масштабе. В результате такой очистки могут быть получены препараты гибридного белка, пригодные для исследования его биологических свойств и терапевтической ценности. Преимуществом данного продуцента является большая стабильность получаемого рекомбинантного белка, содержащего рИЛ-2 человека, по сравнению с продуктом штаммов-прототипов (ВКПМ Y-791, ВКПМ Y-3079), что связано с гликозилированием его молекулы и сшивкой с альбумином плазмы крови человека, а также упрощенная процедура очистки, обусловленная секрецией рекомбинантного белка. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Рекомбинантная плазмида pPIC9HAbIL-2, обеспечивающая биосинтез и секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, трансформированными ею клетками дрожжей, имеющая размер 10148 п.о. и состоящая из следующих элементов:EcoRI-XhoI - фрагмент плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектораpPIC9 размером 8,00 т.п.о., ограниченный сайтами рестрикции EcoRI-XhoI и включающий бактериальный ген устойчивости к ампициллину; бактериальную область инициации репликации; ген HIS4 дрожжей; фрагмент 5'-некодирующей области дрожжевого гена АОХ 1 размером 0,95 т.п.о., содержащий область, обеспечивающую активацию транскрипции этого гена в присутствии метанола в качестве источника углерода в культуральной среде; препрообласть гена MF дрожжей Saccharomyces cerevisiae размером 0,27 т.п.о., обеспечивающую секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, в культуральную среду; фрагмент гена АОХ 1 размером 0,33 т.п.о., содержащий область терминации транскрипции этого гена; и фрагмент 3'-нетранслируемой области гена АОХ 1 размером 0,76 т.п.о.;XhoI-Bsu36I - фрагмент размером 1749 п.о., содержащий кодирующую часть гена альбумина плазмы крови человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона;Bsu36I-EcoRI - фрагмент размером 399 п.о., содержащего кодирующую часть гена ИЛ-2 человека,за исключением области, кодирующей сигнальный пептид. 2. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS107(pPIC9HAbIL-2) - продуцент гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, представляющий собой штамм Pichia pastorisPS99 (HIS4 PEP4PHO85), трансформированный плазмидой pPIC9HAbIL-2 по п.1. 3. Способ конструирования рекомбинантной плазмиды pPIC9HAbIL-2 по п.1, при котором ген альбумина плазмы крови человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона, получают при помощи обратной ПЦР с использованием матрицы мРНК, полученной из гепатоцитов человека, прямого праймера SEQ ID NO: 1, содержащего сайт для рестриктазыXhoI, обратного праймера SEQ ID NO: 2, содержащего сайт для рестриктазы MstII;- 10014422 ген ИЛ-2 человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, получают при помощи ПЦР с использованием матрицы плазмиды pJDB(MSIL), прямого праймера SEQ ID NO: 3, содержащего сайт для рестриктазы Bsu36I, обратного праймера SEQ ID NO: 4, содержащего сайт для рестриктазы EcoRI; полученный ген альбумина плазмы крови человека обрабатывают рестриктазами XhoI и MstII; полученный ген ИЛ-2 человека обрабатывают рестриктазами Bsu36I и EcoRI; лигируют гены альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, обработанные, как указано выше, с плазмидой pPIC9, предварительно обработанной рестриктазами XhoI и EcoRI; и полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pPIC9HAbIL-2. Карта плазмиды pPIC9HabIL-2- единичные сайты рестрикции Фиг. 1 Схема конструирования плазмиды pPIC9HabIL-2

МПК / Метки

МПК: C12N 15/81, C12N 15/62, C12R 1/84, C12N 1/19

Метки: ps107(ppic9habil-2, продуцентом, рекомбинантная, состоящего, штамм, pastoris, способ, альбумина, человека, конструирования, белка, плазмида, крови, дрожжей, плазмы, ppic9habil-2, pichia, являющийся, интерлейкина-2, гибридного

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/12-14422-shtamm-drozhzhejj-pichia-pastoris-ps107ppic9habil-2-yavlyayushhijjsya-producentom-gibridnogo-belka-sostoyashhego-iz-albumina-plazmy-krovi-cheloveka-i-interlejjkina-2-cheloveka-reko.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Штамм дрожжей pichia pastoris ps107(ppic9habil-2), являющийся продуцентом гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и интерлейкина-2 человека, рекомбинантная плазмида ppic9habil-2 и способ ее конструирования</a>

Похожие патенты