Белок, ингибирующий вич-слияние, кодирующая его нуклеотидная последовательность и способы их применения

006434 Настоящее изобретение относится к обработке с помощью генной терапии ВИЧ-инфекции путем экспрессии заякоренных на мембране пептидов gp41. Для этого впервые доступны векторы, кодирующие слитый белок, который содержит производимый от gp41 ВИЧ пептид и карбоксиконцевой трансмембранный якорь, сцепленный за счет гибкого линкера. Для лечения ВИЧ-инфекций уже были предложены самые различные терапевтические композиции. Однако показано, что доступные биологически активные вещества непереносимы многими пациентами. Для улучшения терапии СПИДа постоянно идет поиск новых точек воздействия и биологически активных веществ с различным профилем токсичности. В этой связи уже были предложены различные композиции для генной терапии в целях ингибирования различных стадий при репликации ВИЧ (см. Т. Sorg и М. Methali, Transfus. Sci., 18, 277-289 (1997.Sci., USA, 91, 9770-9774 (1994 предложили терапевтическую композицию, которая основывается на наблюдении того факта, что пептиды, которые произведены от трансмембранного белка gp41 (см. идентифицированную последовательность 4; соответствует цифровому индексу 400 согласно стандартуWIPO ST. 25: 4) ВИЧ, как, например, прежде обозначаемый как DP178 пептид Т-20, могут эффективно препятствовать ВИЧ-слиянию и попаданию в клетку. В случае Т-20 речь идет о пептиде, который за счет С-концевого семикратного повтора (Heptad repeat) перекрывает один из двух участков последовательности (см. положения 539-589 и 622-662 идентифицированной последовательности 4) в областях эктодоменов gp41 и может эффективно ингибировать in vitro ВИЧ-инфекцию (W. Weissenhborn, A. Dessen,S.C. Harrison, J.J. Skehel и D.C. Wiley, Nature, 387, 426-430 (1997); D.C. Chan, D. Fass, J.M. Berger и P.S.(1998. В рамках клинического исследования (J.M. Kilby, S. Hopkins, T.M. Venetta и др., Nat. Med., 4, 13021307 (1998 пептид Т-20 при кратковременном введении оказался безопасным средством, которое способно эффективно ингибировать репликацию ВИЧ. Так как, однако, для достижения антивирусного эффекта необходимы очень большие количества пептида, и пептиды при оральном введении не являются биодоступными, обладают очень коротким периодом полураспада и получение их в большом масштабе все еще является крайне дорогостоящим, в основу изобретения положена задача сделать возможной внутриклеточную иммунизацию с помощью пептидов, которые производятся от gp41, за счет композиции для генной терапии. Изобретатели поэтому прежде всего клонировали кодирующие Т-20 5'-последовательности IRESNEO-кассеты (IRES: внутренний рибосомальный аминоацильный сайт; NEO: ген устойчивости к неомицину) ретровирусного вектора MPIN (см. фиг. 1; Hildinger и др., Hum. Gene Ther., 9, 33-42 (1998. Для обеспечения секреции Т-20, с одной стороны, пептид экспрессировали прямо за сигнальным пептидом рецептора человеческого фактора роста нервной ткани с низкой аффинностью (LNGFR, Fehse и др., Human Gene Therapy, 8, 1815 (1997 (конструкции М 85 и М 86), с другой стороны, выбирали конструкцию,которая содержала кодирующие последовательности производимого от фактора роста фибробласта Kaposi мембранного транслокационного сигнала (mts) (положения аминокислот 43-58 в белке mts; M. Rojas,J.P. Donahue, Z. Tan, Y.Z. Lin, Nat. Biotechnol., 16, 370-375 (1998 в направлении считывания (в рамке считывания) с Т-20 (см. конструкции М 89 и М 90 на фиг. 1). С помощью этих конструкций получали ретровирусные векторы путем трансфекции упаковывающих клеток Phoenix (F. Grignani, T. Kinsella, A.Mencarelli и др., Cancer Res., 58, 14-19 (1998, и супернатанты использовали для инфицирования Тхелперной клеточной линии РМ-1 (D.C. Bou-Habib и др., J. Virol., 68, 6006-6013 (1994. В качестве контроля использовали вектор MPIN, который содержал исключительно ген резистентности к неомицину в качестве чужеродного гена. После селекции G418, массовые культуры инфицировали с помощью ВИЧ-1,который получали из провирусных клонов NL4-3 (A. Adachi, H.E. Gendelman, S. Koenig, Т. Folks, R. Willey, A. Rabson и М.А. Martin, J. Virol., 59, 284-291 (1986 или NL4-3/GFP (R. Welker, M. Harris, В. Cardel и H.G. Krausslich, J. Virol., 72, 8833-8840 (1998. Эти оба клона различаются тем, что в случае NL4-3/GFP экспрессируется флуоресцирующий зеленым белок (GFP) вместо белка nef, так что репликацию ВИЧ-1 можно контролировать с помощью продукции антигена р 24, соответственно, путем проточной цитометрии. Вопреки всем ожиданиям, экспрессия пептида Т-20 при применении вышеуказанных ретровирусных векторных конструкций, однако, неожиданно не привела ни к какой антивирусной активности. В эти конструкции поэтому дополнительно встраивали путем клонирования кодирующую интегринсвязывающий пептид RGD последовательность в рамке считывания с кодирующей Т-20 областью. Получение этих конструкций основано на том соображении, что RGD-мотив может удерживать выделенные пептиды на клеточной мембране. Однако даже с содержащим RGD выделенным пептидом Т-20(см. фиг. 1; М 86) наблюдали репродуцируемую репликацию ВИЧ. В рамках настоящего изобретения неожиданно установлено, что продукция р 24 и распространениеNL4-3/GFP может очень сильно уменьшаться, если экспрессируют слитый белок, который дополнительно к аминоконцевому пептиду gp41 содержит при этом карбоксиконцевой, сцепленный через гибкий линкер трансмембранный якорь. Под термином "пептид gp41" в этой связи понимают фрагмент белкаgp41 ВИЧ или его фрагмент, вариант или мутант.-1 006434 Так, например, установлено, что продукция р 24 может уменьшаться более чем в двадцать раз, если РМ-1 трансдуцируют с помощью ретровирусного вектора, экспрессирующего слитый белок, в котором С-концевой Т-20 связан через гибкий пептидный линкер с трансмембранным пептидом (охватывающий мембрану домен, MSD) (см. фиг. 1; М 87), причем слитый белок имеет последовательность, указанную в идентифицированной последовательности 2. Объектом настоящего изобретения поэтому является нуклеотидная последовательность общей формулы 5' - SP - FI - Hinge - MSD - 3',в которой 5' означает 5'-конец нуклеотидной последовательности; 3' означает 3'-конец нуклеотидной последовательности;SP кодирует сигнальный пептид, который делает возможным перенос экспрессированного пептида в эндоплазматический ретикулум;FI кодирует фрагмент белка gp41 ВИЧ (предпочтительно ВИЧ-1), который содержит участок из области семикратного повтора;MSD кодирует трансмембранный якорь мембранного белка типа I иHinge (шарнир) кодирует белковую последовательность, которая в качестве гибкого линкера связывает кодирующие FI и MSD пептиды. Кодирующая сигнальный пептид последовательность производится от человеческих неиммуногенных белков, предпочтительно ее выбирают из группы, состоящей из последовательностей, кодирующих сигнальные пептиды клеточных мембранных белков, как, например, рецептора (человеческого) фактора роста нервной ткани с низкой аффинностью (LNCFR), рецептора интерлейкина-2 (IL-2R) и рецептора фактора, стимулирующего колонии гранулоцитов макрофагов (GM-CSFR). В качестве трансмембранного якоря мембранного белка типа I (т.е. мембранного белка, N-конец которого находится вне клетки и С-конец которого находится в клетке) служат белки, цитоплазматические домены которых должны были быть подвергнуты делеции для того, чтобы избежать возможной нежелательной сигнальной трансдукции через белок. Согласно предварительным исследованиям можно выяснить, что от экспрессированных областей не исходят никакие действия сигнальной трансдукции и они не олигомеризируются с другими подобными мембранными белками и, таким образом, оказывают косвенное воздействие на функции клеток. Предпочтительно принимают в расчет пептиды из группы, состоящей из трансмембранной области LNGFR или CD34. Нуклеотидная последовательность содержит поэтому предпочтительно в качестве MSD нуклеотидную последовательность, кодирующую эти трансмембранные якори, соответственно фрагменты с подвергнутыми делеции цитоплазматическими доменами. В качестве гибких линкеров согласно изобретению могут служить все гибкие пептиды, которые делают возможным гибкое соединение между пептидом gp41 и трансмембранным якорем, как, например,Hinge (шарнир) иммуноглобулина G (IgG), линкер человеческого Р-гликопротеина (С.А. Нrусуnа и др.,Biochemistry, 37, 13660-13673 (1998, С-концевой линкер человеческого репликационного белка A(hsRPA; см. D.M. Jacobs и др., J. Biomol. NMR, 14, 321-331 (1999 и линкер родственного паратиреоидному гормону белка (М. Weidler и др., FEBS Lett., 444, 239-244 (1999. Линкер предпочтительно имеет длину вплоть до 30 аминокислот. Предлагаемая согласно изобретению нуклеотидная последовательность вышеприведенной формулы содержит поэтому кодирующий такой линкер участок нуклеотидной последовательности, предпочтительно Hinge IgG согласно нуклеотидам 1636-1683 идентифицированной последовательности 1. Как уже упоминалось, FI кодирует пептид (обозначаемый как пептид gp41), который соответствует участку последовательности белка gp41 ВИЧ (см. идентифицированную последовательность 4, включая белки gp41 квазивида ВИЧ ("покрытые", который выбирают из области, включающей оба участка семикратного повтора (см. положения аминокислот 539-589 и 622-662 в идентифицированных последовательностях 3 и 4). В этой связи "ВИЧ" включает все типы ВИЧ, в особенности ВИЧ-1. В этой связи, например, нужно ожидать, что также при применении пептида gp41 ВИЧ-2 приходят к перекрестной реакции с ВИЧ-1 и наоборот. Кодируемые с помощью FI пептиды gp41 предпочтительно имеют минимальную длину в 28 аминокислот, так что FI включает по меньшей мере 84 нуклеотида. В рамках настоящего изобретения, в качестве FI в особенности используют нуклеотидную последовательность, кодирующую представленную положением 31-66 в идентифицированной последовательности 2 аминокислотную последовательность (соответствует пептиду Т-20), предпочтительно последовательность, представленную от нуклеотида 1528 до нуклеотида 1635 в идентифицированной последовательности 1. Согласно особому варианту осуществления кодируемый с помощью FI пептид имеет длину максимально 40 аминокислот, в соответствии с максимальной длиной из 120 оснований для кодирующей области FI. Согласно особому варианту осуществления изобретение относится к нуклеотидной последовательности общей формулы "SP - FI - Hinge - MSD", представленной в идентифицированной последовательности 1 от нуклеотида 1438 до нуклеотида 1773 последовательности, которая кодирует представленный в идентифицированной последовательности 2 слитый белок.-2 006434 Объектом изобретения, далее, является кодируемый, смотря по обстоятельствам, указанными векторами, соответственно нуклеотидными последовательностями, слитый белок общей формулыsp означает сигнальный пептид, который делает возможным перенос экспрессированного пептида в эндоплазматический ретикулум;fi означает фрагмент белка gp41 ВИЧ, который содержит участок из области семикратного повтора;msd означает трансмембранный якорь мембранного белка типа I иhinge означает белковую последовательность, которая связывает в качестве гибкого линкера пептиды fi и msd. Относительно определений sp, fi, hinge и msd следует указать на вышеприведенные определения элементов последовательности SP, FI, Hinge и MSD, где уже упомянуты структурные и функциональные признаки слитого белка, соответственно отдельных частичных областей белка. Согласно предпочтительному варианту осуществления слитый белок имеет представленную в идентифицированной последовательности 2 аминокислотную последовательность. Полученный из нее после отщепления сигнального пептида слитый белок (fi - hinge - msd), соответственно этому, имеет последовательность, указанную в идентифицированной последовательности 2 от положения 31 до положения 111. В изобретение включены, далее, гомологи, соответственно варианты и фрагменты указанного слитого белка, которые обладают, по существу, одинаковой фармакологической и биологической активностью и/или иммуногенностью, а также кодирующие эти гомологи и фрагменты нуклеотидные последовательности. Под гомологами, соответственно вариантами, в этой связи понимают такие последовательности, которые отличаются от до сих пор известных природных последовательностей или участков последовательностей за счет замены, делеции или вставки отдельных аминокислот. В этой связи, в особенности включены гомологи, варианты и фрагменты представленного в идентифицированной последовательности 2 белка, а также кодирующие их нуклеотидные последовательности. Объектом изобретения, далее, является вектор, который содержит вышеуказанную нуклеотидную последовательность. В случае вектора речь идет предпочтительно о ретровирусном векторе. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения вектор имеет указанное на фиг. 1 строение. Кодирующая слитый белок согласно изобретению векторная вставка общей формулы SP - FI- Hinge - MSD предпочтительно имеет представленную в идентифицированной последовательности 1 нуклеотидную последовательность. Образец указанного последним вектора депонирован 11.11.1999 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124, Брауншвейг, Германия, под номером DSM 13139 согласно Будапештскому Договору. Вышеуказанный вектор можно использовать для трансфекции in vitro Т-лимфоцитов и гематопоэтических стволовых клеток, причем эти трансфицированные клетки вводят ВИЧ-инфицированным в терапевтических целях. Предлагаемые согласно изобретению векторы особенно пригодны для применения (т.е. для непосредственного (in vivo) применения) в случае обработки путем генной терапии ВИЧинфицированных, причем речь идет предпочтительно о векторах с направленным тропизмом, т.е. со специфичностью по отношению к клеткам-мишеням ВИЧ (клетки CD4+). Изобретение относится поэтому далее к лекарственному средству для генной терапии, которое содержит вышеуказанный вектор. Настоящее изобретение ниже поясняется подробнее с помощью примеров. Примеры Клетки и вирусы.HeLa-, 293- и Phoenix-Ampho-клетки культивировали в среде Дульбекко (Gibco, Paisley, Великобритания), дополненной фетальной телячьей сывороткой (фетальная телячья сыворотка, FCS; Sigma, Deisenhofen, Германия). РМ-1 культивировали в среде RPMI с 10% фетальной телячьей сыворотки. Вирусные клоны NL4-3/GFP, NL4-3env-GFP и pNL4-3 уже были описаны раньше (NL4-3: R. Welker, M. Harris, В.Cardel и H.G. Krausslich, J. Virol., 72, 8833-8840 (1998); NL4-2env-GFP: J. He, Y. Chen, M. Farzan и др.,Nature, 385, 645-649 (1997. Для псевдотипизации лишенного env клона NL4-3env-GFP использовали плазмиды pSNJG, pSVIIIenvJRFL, pSVIIIenvYU2 и p3VIIIenvHXB2 (R. Welker, M. Harris, B. Cardel и H.G.von Laer, S. Thomsen, B. Vogt и др., J. Virol., 72, 1424-1430 (1998. Эти плазмиды содержат кДНК VSV G,соответственно кДНК оболочек ВИЧ JR, YU2 и НХВ 2. Инфекционные репликационнокомпетентные вирусы получали путем трансфекции NL4-3 или NL43/GFP-ДHK в HeLa-клетки. Псевдотипизированные репликационнокомпетентные ВИЧ получали путем котрансфекции pNL4-3env-GFP и одной из оболочечных экспрессионных плазмид в 293-клетки. Ретровирусные векторы упаковывали в упаковывающие клетки Phoenix как описано раньше (F. Grignani, Т.-3 006434 Клонирование ретровирусных векторов. М 85 и М 86. Последовательность, кодирующую сигнальный пептид рецептора человеческого фактора роста нервной ткани с низкой аффинностью (LNGFR), амплифицировали путем полимеразной цепной реакции (PCR), исходя из вектора dLN, при использовании праймера SPNot+ (идентифицированная последовательность 5) и праймера SPBg12 (идентифицированная последовательность 6), благодаря чему вводили в 5'-конец сайт расщепления NotI и в 3'-конец сайт расщепления BglII (dLN: Fehse и др.,Human Gene Therapy, 8, 1815 (1997. Кодирующую ингибирующий слияние пептид последовательность амплифицировали, исходя из NL4-3, при использовании праймеров T20Bgl+ (M85; идентифицированная последовательность 7) или T20Bgl-RGD+ (M86; идентифицированная последовательность 8) иT20Hind-(идентифицированная последовательность 9), благодаря чему в 5'-конец вводили сайт расщепления BglII и в 3'-конец вводили сайт расщепления HindIII. Фрагменты лигировали с разрезанным с помощью NotI и HindIII вектором pBluescriptKS. М 87 и М 88. Трансмембранные домены dLNGFR амплифицировали, исходя из dLN, при использовании 5'-праймера, который содержал также шарнирную (Hinge) область тяжелой цепи мышиного IgG и сайт расщепления BglII (hingeTMBgl+; идентифицированная последовательность 10), и 3'-праймера ретровирусного вектора dLN (U3-; идентифицированная последовательность 11). Этот продукт PCR вместе с продуктом PCR сигнального пептида (SPNot+/SPBgl-) встраивали в вектор pBluescriptKS (после рестрикции с помощью NotI и HindIII), и последовательность Т-20 затем встраивали (исходя из NL4-3) в виде продукта PCR, который содержал фланкирующие сайты расщепления BglII (путем применения праймеров PCR T20Bgl+, соответственно идентифицированной последовательности 7 (см. выше), иT20Bgl-, соответственно идентифицированной последовательности 12). М 89 и М 90. Кодирующую Т 20 последовательность с мембранным транслокационным сигналом(mts) амплифицировали, исходя из NL4-3, при применении праймеров RGD-T20Not+ (М 89; идентифицированная последовательность 13) или T20Not+ (М 90; идентифицированная последовательность 14) и T20mtsHind- (идентифицированная последовательность 15). В 5'-праймере имеется сайт расщепления NotI и в 3'-праймере находится сайт расщепления HindIII. Мембранный транслокационный сигнал(mts) встраивали с помощью 3'-праймера. Продукт встраивали в разрезанный с помощью NotI и HindIII вектора pBluescriptKS. Кодирующие различные слитые белки Т 20 гены затем в виде фрагментов NotI x HindIII с помощью с polio-IRES из SF1 MIN переносили в вектор MP1N (Hildinger и др., Hum. Gene Ther., 9, 33-42 (1998. Инфекция с помощью ВИЧ. Клетки РМ-1 (5104 в 0,5 мл) инфицировали с помощью 3000-6000 TCID50 (инфекционная для культуры ткани доза 50%) репликационнокомпетентного ВИЧ. Для анализа продукции р 24 среду заменяли в день 5, клетки инкубировали в течение ночи, и не содержащие клеток супернатанты исследовали при использовании твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для р 24, как описано раньше (J.Konvalinka, M.A. Litterst, R. Welker и др., J. Virol., 69, 7180-7186 (1995. Результаты представлены на фиг. 2. Инфекцию с помощью NL4-3/GFP контролировали, далее, в указанные моменты времени с помощью анализа путем проточной цитометрии при использовании клеточного сортера с возбуждением флуоресценции в качестве калибратора (Beckton Dickinson, Гейдельберг, Германия). Для этого РМ-1 (с векторами MP1N и М 85-М 87 и без них) инфицировали с moi 0,01 (moi: множественность инфекций; означает количество вирусных частиц, с помощью которых инфицируется клетка) с помощью NL-4/GFP и в дни 4, 7 и 10 анализировали путем проточной цитометрии. Процент EGFP-позитивных и вместе с тем ВИЧ-инфицированных клеток указан на фиг. 3 для различных культур в процессе инфицирования. Предел обнаружения составляет примерно 0,1% позитивных клеток. Исследование механизма действия. Для определения, на какой стадии ингибируется репликация ВИЧ, с помощью клона NL-4-3envGFP осуществляли "одиночные круговые" инфекции. Клон NL-4-3env-GFP на основании мутации в envгене является нарушающим репликации и экспрессирует GFP вместо nef. Для получения инфекционных вирионов вектор псевдотипизировали с помощью оболочек трех различных ВИЧ-клонов (НХВ, YU2 иJR-FL), а также с помощью G-белка везикулярного вируса стоматита (VSV G). НХВ классифицируют как Т-тропический при применении совместного рецептора CXCR4, в то время как YU2 и JR-FL являются М-тропическими и используют CCR-5. Гены env обоих, указанных последними клонов клонируют прямо из первичных изолятов ВИЧ (J. He, Y. Chen, M. Farzan и др., Nature, 385, 645-649 (1997. Эти псевдотипы ВИЧ способны к "одиночным круговым" инфекциям, однако, распространяются не по всей культуре. В клетках РМ 1/М 87 (т.е. в клетках, которые трансфицированы с помощью предлагаемого согласно изобретению кодирующего заякоренный на мембране слитый белок Т-20 вектора) инфекция по трем различным ВИЧ-оболочкам ингибировалась сильнее в 15-30 раз, чем в случае псевдотипов VSV-G, в которых не наблюдали никакого существенного ингибирования (см. фиг. 4). Точно также, как свободный пептид Т-20 (см. С.Т. Wild и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9770-9774 (1994, экспрессированный путем генной инженерии, заякоренный на мембране слитый белок Т-20 ингибировал опосредованное оболочками различных ВИЧ-вариантов проникновение. Эти результаты однозначно показывают, что-4 006434 вирус ингибируется на стадии опосредованного ВИЧ-оболочкой (ВИЧ-env) проникновения вируса, в случае которой речь идет вероятнее всего о слиянии с мембраной. На все следующие за проникновением вируса стадии репликации ВИЧ влияния не оказывалось. Эти исследования показывают, что заякоренный на мембране пептид gp41 эффективно ингибирует репликацию ВИЧ, в то время как выделенный чистый пептид gp41 является неэффективным. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Нуклеотидная последовательность, отличающаяся тем, что она отвечает общей формулеSP - FI - hinge - MSD,в которой SP кодирует сигнальный пептид, который делает возможным перенос экспрессированного пептида в эндоплазматический ретикулум;FI кодирует фрагмент белка gp41 ВИЧ, который содержит участок из области семикратного повтораMSD кодирует трансмембранный якорь мембранного белка типа I иHinge кодирует белковую последовательность, которая в качестве гибкого линкера связывает кодируемые FI и MSD пептиды,причем кодируемый белок ингибирует ВИЧ-слияние и проникновение в клетку. 2. Нуклеотидная последовательность по п.1, отличающаяся тем, что SP представляет собой последовательность, кодирующую сигнальный пептид рецептора фактора роста нервной ткани с низкой аффинностью (LNGFR), рецептора интерлейкина-2 (IL-2R) или рецептора фактора, стимулирующего колонию гранулоцитов макрофагов (GM-CSFR). 3. Нуклеотидная последовательность по п.1 или 2, отличающаяся тем, что MSD представляет собой последовательность, кодирующую трансмембранный якорь LNGFR или CD34 или ее фрагмент. 4. Нуклеотидная последовательность по пп.1-3, отличающаяся тем, что hinge (шарнир) представляет собой последовательность, кодирующую линкер иммуноглобулина G (IgG), человеческого гликопротеина Р, человеческого репликационного белка А и родственного паратиреоидному гормону белка.- 22006434 5. Нуклеотидная последовательность по пп.1-4, отличающаяся тем, что FI кодирует аминокислотную последовательность, представленную в идентифицированной последовательности 2 от положения 31 до положения 66, или ее производные и варианты, полученные, как раскрыто в описании. 6. Нуклеотидная последовательность по п.5, отличающаяся тем, что она имеет последовательность,представленную в идентифицированной последовательности 1 от нуклеотида 1528 до нуклеотида 1635. 7. Нуклеотидная последовательность по п.5, отличающаяся тем, что она имеет последовательность,представленную в идентифицированной последовательности 1 от нуклеотида 1528 до нуклеотида 1773. 8. Вектор, отличающийся тем, что он содержит нуклеотидную последовательность по пп.1-7. 9. Вектор по п.8, отличающийся тем, что он представляет собой ретровирусный вектор. 10. Вектор по п.9, отличающийся тем, что он имеет представленное на фиг. 1 строение. 11. Вектор по п.10, отличающийся тем, что он содержит идентифицированную нуклеотидную последовательность 1. 12. Вектор по п.11 с номером депонирования DSM 13139. 13. Применение вектора по пп.8-12, где кодируемый белок ингибирует ВИЧ-слияние и проникновение в клетку, для трансфекции in vitro Т-лимфоцитов и гематопоэтических стволовых клеток. 14. Применение вектора по пп.8-12 для обработки путем генной терапии ВИЧ-инфицированных пациентов, причем кодируемый белок ингибирует ВИЧ-слияние и проникновение в клетку. 15. Применение Т-лимфоцитов или гематопоэтических стволовых клеток, которые трансфицированы с помощью вектора по пп.8-12, для обработки путем генной терапии ВИЧ-инфицированных пациентов, причем кодируемый белок ингибирует ВИЧ-слияние и проникновение в клетку. 16. Лекарственное средство для генной терапии, содержащее вектор по пп.8-12, где кодируемый белок ингибирует ВИЧ-слияние и проникновение в клетку. 17. Лекарственное средство для генной терапии, содержащее Т-лимфоциты или гематопоэтические стволовые клетки, которые трансфицированы с помощью вектора по пп.8-12, где кодируемый белок ингибирует ВИЧ-слияние и проникновение в клетку. 18. Белок общей формулы sp-fi-hinge-msd, который кодируется нуклеотидной последовательностью по пп.1-7, причем sp, fi, hinge и msd имеют указанное в п.1 значение, а также его производные и варианты, полученные, как раскрыто в описании. 19. Белок по п.18, отличающийся тем, что он имеет идентифицированную аминокислотную последовательность 2. 20. Белок общей формулы fi-hinge-msd, который может быть получен из белка по п.18 путем отщепления сигнального пептида sp и кодируется нуклеотидной последовательностью по пп.1-7, причем fi,hinge и msd имеют указанное в п.1 значение. 21. Белок по п.20, отличающийся тем, что он имеет последовательность, представленную в идентифицированной последовательности 2 от положения 31 до положения 111. 22. Нуклеотидная последовательность, отличающаяся тем, что она кодирует белок по п.18. Фиг. 2 Обнаружение продуцирования ВИЧ в лимфоцитах с различными антивирусными векторами в день 6